ES2582277T3

ES2582277T3 - Anticuerpo anti-integrina alfa 9 de ser humano

Info

Publication number: ES2582277T3
Application number: ES08867627.5T
Authority: ES
Inventors: Masaharu Torikai; Daisuke Ishikawa; Toshihiro Nakashima; Hirofumi Higuchi; Fumihiko Sakai; Nobuchika Yamamoto; Hirotada Fujita; Katsunari Taguchi
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Priority date: 2007-12-28
Filing date: 2008-12-26
Publication date: 2016-09-12
Anticipated expiration: 2028-12-26
Also published as: JP5371779B2; JPWO2009084671A1; EP2236605A1; WO2009084671A1; US20110014213A1; US8715655B2; EP2236605A4; EP2236605B1

Abstract

Un anticuerpo anti-integrina α9 de ser humano a o fragmento de anticuerpo que reconoce integrina α9 de ser humano e integrina α9 de ratón inhibe la reacción entre las integrinas α9 y ligandos, y que reconoce un epítopo que comprende residuos 104 (Arg) a 122 (Asp) de integrina α9 de ser humano (SEQ ID NO:36), y un epítopo que comprende residuos 105 (Arg} a 123 (Asp) de integrina α9 de ratón (SEQ ID NO:37).

Description

Anticuerpo anti-integrina alfa 9 de ser humano

Campo técnico

La presente invención se refiere a un anticuerpo anti-integrina α9 de ser humano y una aplicación de este. Específicamente, la presente invención se refiere a un anticuerpo anti-integrina α9 de ser humano que se une a una región de bucle de proteína integrina α9 de ser humano y ratón designada LI para inhibir la adhesión celular dependiente de integrina α9, y para exhibir la acción supresora sobre artritis, y un fragmento del anticuerpo, así como en el diagnóstico, prevención o tratamiento de enfermedades autoinmunes tales como artritis reumatoide, enfermedades inmunes tales como alergias y rechazo de injertos, y otras varias enfermedades implicadas por integrina α9 en su patogénesis, usando el anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

Técnica previa

Integrina, una glicoproteína de superficie celular, es una molécula de adhesión que funciona principalmente como un receptor para la adhesión celular a matrices extracelulares (colágeno, laminina y similares) y miembros de la familia de inmunoglobulinas (ICAM-1, VCAM-1 y similares), y media la transducción de señales desde matrices extracelulares. Por lo tanto, las células reciben señales de las matrices extracelulares, y se induce proliferación, proliferación, muerte celular y similar. La integrina es un heterodímero que consiste en dos subunidades cadena α y cadena β; existen diferentes cadenas α y cadenas β que aparecen en una amplia variedad de combinaciones, y existen 24 miembros de la superfamilia de integrina. Los ratones con inactivación de integrina son mortales o están enfermos sin considerar qué subunidad falta, lo que sugiere que las integrinas individuales son necesarias para el mantenimiento de la vida. Entonces, la integrina, que transmite información o condiciones ambientales a las células para estimular sus respuestas, se cree que funciona en todas las situaciones de fenómenos biológicos, y para mediar un amplio espectro de condiciones patológicas.

Como tal, la integrina es indispensable para la supervivencia de organismos, y se cree que cumple una función aun en estados enfermos; se reportaron algunos casos en los que su inhibición ayuda a mejorar las condiciones patológicas. Por ejemplo, un inhibidor de integrina específica de plaquetas αIIbβ3 fue aprobado como un fármaco terapéutico para restenosis PCTA conocido como abciximab (nombre comercial: ReoPro; Eli Lilly). Natalizumab (nombre comercial: Antegren; ELAN Company), un inhibidor α4β1(VLA4), fue aprobado como un fármaco terapéutico para esclerosismúltiple.

El inhibidor α4β3 Vitaxin (MEDIMMUNE Company) está en desarrollo en estudios clínicos para su acción inhibidora de neovascularización, acción inhibidora de activación de osteoclastos y similares.

La integrina α4βl se expresa en macrófagos, células NKT, células dendríticas, y neutrófilos, y según se dice cumple funciones importantes en la infiltración y adhesión de estas células inflamatorias, resorción ósea y similares. Recientemente, se ha reportado que la integrina α4βl está implicada en la formación de osteoclastos, y se sugirió su implicancia en la destrucción ósea (Documento no patentado 1). Ligandos conocidos de estos incluyen osteopontina truncada (OPN de extremo N), VCAM-1, Tenascina-C y similares. Clínicamente, los niveles elevados significativamente de integrina α4βl se observaron en los tejidos sinoviales de pacientes con artritis reumatoide (Documento no patentado 2).

Entonces, un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a proteína integrina α9 para actuar para inhibir la adhesión celular dependiente de integrina α9, si se desarrollar, sería útil en el diagnóstico, prevención o tratamiento de varias enfermedades implicadas por la integrina α9 en su patogénesis.

Anticuerpos que se ha dado a conocer que exhiben acción inhibidora de función sobre integrina α9 de ser humano son el anticuerpo monoclonal de ratón Y9A2 (Documento no patentado 3), y 1K11, 24111, 21C5 y 25B6, que también son anticuerpos monoclonales de ratón (Documento de patente 1). Aunque los resultados experimentales in vitro mostraron que estos anticuerpos son capaces de suprimir la adhesión celular dependiente de integrina α9 de ser humano, no son adecuados para su uso en experimentos para evaluaciones in vivo de efectos farmacológicos y similares porque no exhiben reactividad cruzada con integrina α9 de ratón y rata.

Anticuerpos que se ha dado a conocer que exhiben acción inhibidora de función sobre integrina α9 de ratón son anticuerpos monoclonales de hámster 11L2B, 12C4'58, 18R18D y 55A2C (Documento de patente 1). Los resultados experimentales in vitro mostraron que estos anticuerpos son capaces de suprimir funciones de α9 de ratón, tal como adhesión celular, y los resultados experimentales in vivo mostraron que 11L2B tiene un efecto terapéutico sobre hepatitis; sin embargo, su reactividad contra integrina α9 de ser humano no se confirmó, por lo que es imposible aplicar estos anticuerpos al tratamiento o prevención de enfermedades humanas.

En función de esta situación, aun si se adquiere un anticuerpo de integrina α9 anti-humano y se evalúa funcionalmente in vitro, es difícil evaluar el efecto farmacológico del anticuerpo salvo que exhiba reactividad cruzada con integrina α9 de ratón o rata, dado que los modelos patológicos disponibles de varias enfermedades inflamatorias son para la mayoría sistemas que usan un ratón o rata. Aun si un anticuerpo de integrina α9 anti-ratón se adquiere y

evalúa farmacológicamente usando un sistema de modelo patológico in vivo, y se sabe que es terapéutica o profilácticamente eficaz, es imposible aplicar el anticuerpo como un anticuerpo farmacéutico para condiciones patológicas humanas salvo que exhiba reactividad cruzada contra integrina α9 humana.

Siempre que un anticuerpo monoclonal α9 anti-humano tal como Y9A2 se desarrolla como un anticuerpo farmacéutico en función de datos de efecto farmacológico obtenidos usando un anticuerpo de integrina α9 anti-ratón, es necesario mucho trabajo para demostrar la equivalencia del anticuerpo usado para adquirir los datos farmacológicos y el anticuerpo en desarrollo. Por esta razón, se exige, por ejemplo, un anticuerpo que exhibe acción inhibidora sobre la función de integrina α9 de ratón e integrina α9 de ser humano; a juzgar por los principios, sin embargo, es difícil adquirir dicho anticuerpo cuando se usa un método convencional tal como uno que implica inmunización de ratón.

Aun si se desarrolla un anticuerpo monoclonal α9 anti-humano preparado por cualquier técnica que supera esta dificultad como un anticuerpo farmacéutico, el anticuerpo se reconoce y elimina como una materia extraña dada la alta inmunogenicidad de este cuando se administra a humanos, siempre que el anticuerpo sea un anticuerpo derivado de animal ni humano. Entonces, es difícil usar dicho anticuerpo como un fármaco terapéutico para una enfermedad.

Como una posible solución a este problema, un anticuerpo derivado no humano se puede humanizar usando una técnica de ingeniería de proteína; sin embargo, dado que contiene una porción de la secuencia derivada no humana, administración de múltiples dosis o administración a largo plazo puede provocar que un anticuerpo inhibe la actividad del anticuerpo anti-integrina α9 humanizado administrado para debilitar considerablemente su efecto, y aun provocar una seria reacción adversa. Además, la humanización por lo general resulta en actividad reducida, y un anticuerpo humanizado requiere un gran esfuerzo y costo para su construcción.

En función de esta situación para integrina α9, no hay casi información estructural sobre la estructura estérica, sitio de unión al ligando, epítopo de neutralización y similares; dicha información, si se obtiene, se espera que abra una vía de investigación dela integrina α9 y su aplicación en la prácticamédica, y potencialmente genera un gran aparto.

Además, EP1840135 describe i.a. anticuerpos α humanizados que reconocen integrina α9 de ser humano o de murino. US2002/039745 describe anticuerpos de integrina α9 antagonística.

Documento de patente 1: WO 2006/075784 Documento no patentado 1: Journal of Bone and Mineral Research, 2006, 21: 1657-1665

Documento no patentado 2: The Journal of Clinical Investigation, 2005, 115: 1060-1067

Documento no patentado 3: Am. J. Respir. Cel.1 Mol. Biol., 1996, 15: 664-672

Descripción de la invención

Problemas a ser resueltos por lainvención

Por consiguiente, es un objeto de la presente invención proporcionar anticuerpo anti-integrina α9 que exhibe reactividad específica para integrina α9 de ser humano e integrina α9 de ratón, y reconcilia seguridad y eficacia terapéutica, y proporcionar un medio profiláctico o terapéutico novedoso de varias enfermedades implicadas por integrina α9 en su patogénesis, por medio de acción antiinflamatoria potente y acción supresora de destrucción ósea del anticuerpo de integrina α9 de ser humano en función del bloqueo de la interacción entre integrina α9 y una pluralidad deligandos de esta.

Medios para resolver los problemas

Los inventores de la presente triunfaron en la preparación de anticuerpo anti-integrina α9 deser humano y fragmento de anticuerpo que exhiben reactividad específica contra integrina α9 de ratón e integrina α9 de ser humano preparando una célula de expresión de integrina α9, y reacción de la célula directamente con una biblioteca de fago anticuerpo sobre la cual semuestra un anticuerpo humano. Además, los inventores descubrieron que el anticuerpo y fragmento de anticuerpo inhiben la adhesión celular dependiente de integrina α9, exhiben un efecto terapéutico sobre la pluralidad de modelos de artritis, y suprimen la diferenciación de osteoclastos en los modelos. Entonces los inventores demostraron que el anticuerpo y fragmento de anticuerpo reconcilian seguridad y eficacia terapéutica, y desarrollaron la presente invención.

Por consiguiente, la presente invención comprende los siguientes aspectos 1) a 16) como métodos y sustancias útiles médica e industrialmente.

1) Un anticuerpo anti-integrina α9 de ser humano o fragmento de anticuerpo que reconoce integrina α9 de ser humano e integrina α9 de ratón e inhibela interacción entre los ligandos e integrinas α9.

2) El anticuerpo o fragmento de anticuerpo descrito en 1) anteriormente, que reconoce un epítopo configurado principalmente por la región desde 104 Arg a 122 Asp de integrina α9 de ser humano (SEQ ID NO:36), y un epítopo

configurado principalmente por la región desde 105 Arg a 123 Asp de integrina α9 de ratón (SEQ ID NO:37).

3) El anticuerpo o fragmento de anticuerpo descrito en 1) o 2) anteriormente, que tiene (a) regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada y (b) regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (CDR1, CDR2, CDR3), dichas regiones consisten en las secuencias de aminoácidos mostradas por los siguientes números de identificación de secuencias, respectivamente.

(a): Regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada CDR1 , CDR2, CDR3 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15; SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21; SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27; o SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33;

(b): Regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera CDR1 , CDR2, CDR3 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 4) El anticuerpo o fragmento de anticuerpo descrito en 3) anteriormente, que tiene regiones determinantes de

complementariedad de cadena pesada CDR1 , CDR2, CDR3, dichas regiones consisten en las secuencias de

aminoácidosmostradas por SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, y SEQ ID NO:33, respectivamente. 5) El anticuerpo o fragmento de anticuerpo descrito en 1) o 2) anteriormente, que tiene una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada por cualquiera de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:24, y SEQ ID N0:30, y una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada por SEQ ID NO:6.

6) El anticuerpo o fragmento de anticuerpo descrito en 5) anteriormente, que tiene una región variable de cadena

pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada por SEQ ID NO:30. 7) El anticuerpo anti-integrina α9 de ser humano descrito en cualquiera de 1) a 6) anteriormente, donde el anticuerpo es un anticuerpo completo.

8) El fragmento de anticuerpo anti-integrina α9 de ser humano descrito en cualquiera de 1) a 6) anteriormente, donde el fragmento de anticuerpo es scFv o scFv-Fc. 9) Un gen que codifica el anticuerpo o fragmento de anticuerpodescrito en cualquiera de 1) a 8) anteriormente. 10) Un vector de expresión recombinante que comprende el gen descrito en 9) anteriormente.

11) Un transformante que incorpora el gen descrito en 9) anteriormente. 12) Un método para producir un anticuerpo anti-integrina α9 de ser humano o fragmento de anticuerpo que permite el gen descrito en 9) anteriormente se exprese en un hospedador.

13) Un agente profiláctico o terapéutico para artritis reumatoide que comprende el anticuerpo o fragmento de

anticuerpo descrito en cualquiera de 1) a 8) anteriormente. 14) Un método para prevenir o tratar artritis reumatoide en un sujeto, que comprende el paso de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento de anticuerpo descrito en cualquiera de 1) a 8) anteriormente al sujeto.

15) Un uso del anticuerpo o fragmento de anticuerpo descrito en cualquiera de 1) a 8) anteriormente en la producción de un agente profiláctico oterapéutico par artritisreumatoide. 16) Elanticuerpoofragmentodeanticuerpodescritoencualquierade 1) a 8) anteriormente para prevenir o tratar artritis reumatoide.

Efecto dela invención El anticuerpo monoclonal humano de la presente invención y el fragmento de anticuerpo de este tiene una región variable de anticuerpo anti-integrina α9 derivado de ser humano y posee reactividad específica para integrina α9 de ser humano y ratón, actividad inhibidora contraadhesión celular dependiente de integrina α9 , y acción supresora sobre artritis. Se descubrió que el epítopo de este es una región de bucle que no fue reportada en ninguna otra

familia de integrina (designada LI). Dado que el anticuerpo y fragmento de anticuerpo de acuerdo con la presente invención son anticuerpos humanos completos, se espera que encuentren nuevas aplicaciones como fármacos de diagnóstico, profilácticos o terapéuticos para varias enfermedades implicadas por la integrina α9.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 es una representación gráfica quemuestrala reactividad de un fago de expresión de scFc con α9 de ratón.

La FIG. 2 es una representación gráfica quemuestrala reactividad de MΑ9-413 scFv con α9 de ratón.

La FIG. 3 es una representación gráfica quemuestra el potencial inhibidor de MΑ9-413 scFv contra adhesión celular dependiente de α9 de ratón.

La FIG. 4 es una ilustración quemuestra la estructura de un vector de expresión de scFv-Fc.

La FIG. 5 es una representación gráfica que muestra resultados de un análisis de la reactividad de MΑ9-413 scFv-Fc con α9 deratón y α9 de ser humano por ELISΑ.

La FIG. 6 es una representación gráfica que muestra resultados de un análisis de la reactividad y especificidad de MΑ9-413 scFv-Fc con α9 de ratón y α9 de ser humano por citometría de flujo.

La FIG. 7 es una representación gráfica que muestra el potencial inhibidor de MΑ9-413 scFv-Fc contra adhesión celular dependiente de α9 deratón y humana.

La FIG. 8 es una ilustración que muestra las secuencias de aminoácidos de los dominios de propelente β de regiones α9 y bucle estimados por modelado.

La FIG. 9 es una representación gráfica que muestra resultados de un análisis de la reactividad de MΑ9-413 scFv-Fc con regiones de bucle α9alteradas y dominios de propelenteβ de α9 por citometría deflujo.

La FIG. 10 es una representación gráfica que muestra resultados de un análisis de la reactividad de MΑ9-413 scFv-Fc conregiones de bucle α9alteradas y dominios de propelente β deα9 por ELISA.

La FIG. 11 es una representación gráfica quemuestra el efecto supresor de MΑ9-413 scFv-Fc sobre artritis inducida por anticuerpo de colágeno deratón.

La FIG. 12 es una representación gráfica quemuestra el efecto supresor de MΑ9-413 scFv-Fc sobre artritis inducida por colágeno de ratón. ANM-2 es un nombre alternativo de MΑ9-413.

La FIG. 13 es una representación gráfica que muestra la supresión de diferenciación de osteoclastos por MΑ9-413 scFv-Fc en artritis inducida por anticuerpo de colágeno de ratón.

La FIG. 14 es una ilustración que muestra las secuencias deaminoácidos de MΑ9-413 alterado.

La FIG. 15 es una representación gráfica quemuestra la reactividad de MΑ9-413 scFvalterado con α9 de ratón y α9 de ser humano.

LaFIG.16esunarepresentacióngráficaquemuestralareactividaddeMΑ9-413scFv-Fcalterado conα9 deratón y α9 de ser humano.

La FIG. 17 es una representación gráfica que muestra la acción inhibidora de competencia de MΑ9-413 alterado en la reactividad de MΑ9-413 con α9.

La FIG. 18 es una representación gráfica que muestra la reactividad de MΑ9-413 IgG alterado con α9 de ratón y α9 de ser humano.

Mejor forma para poner en prácticala invención

La presente invención se describe aquí en detalle.

Una biblioteca de fago de expresión de scFv se puede preparar como se describe a continuación. ADNc de cadena pesada (H) y cadena ligera (L) de inmunoglobulina se sintetiza por un método RT-PCR de linfocitos B de sangre periférica recogidos desde una pluralidad de voluntarios sanos. A continuación, amplificando las regiones variables de cadena H (VH) y regiones variables de cadena L (VL) con el uso de una combinación de de varios cebadores, y uniendo ambos con ADN enlazador, se prepara una biblioteca de genes scFv en función de una combinación aleatoria de VH ay VL derivada de linfocitos de los voluntarios sanos. Este gen scFv se puede integrar en un vector de fagémidos (por ejemplo, pCANTAB5E) para construir una biblioteca de fago de expresión de scFv que consiste en alrededor de 108 a 1011 clones de voluntarios sanos.

La preparación de integrina α9, que es un antígeno, se puede realizar como se describe a continuación.

Dado que la integrina α9 (de aquí en adelante, también se denomina simplemente "α9") es una proteína de membrana, es posible clonar el gen α9 y transfectar una célula cultivada con eso para expresar artificialmente el gen e la superficie de la célula cultivada. Se recomienda usar la biblioteca de ADNc o similar como plantilla para la clonación génica. Para expresar el gen en la superficie celular, una secuencia de señales debe estar presente normalmente en la porción de extremo N; por lo tanto, la secuencia de señales poseída intrínsecamente por α9 se puede usar, y una región génica que codifica α9 madura se puede unir con otra secuencia de señales. Con respecto al anticuerpo preparado, es necesario evaluar la especificidad de especie y similares para evaluar la aplicabilidad y potencial del anticuerpo, por lo que es conveniente que el gen sea adquirido para α9 de ser humano y α9 deratón.

El gen α9 así adquirido, que comprende una secuencia de señales,

se clona en un vector de expresión, por ejemplo, el vector pcDNA3.1(-) (Invitrogen) y similares. Aquí, de las cadenas αde la familia de integrina, se sabe que α4 es más altamente homólogo a α9. Por esta razón, convenientemente, se recomienda que integrina α4, para su uso como control de α9, se someta a la misma operación y se clone en el vector de expresión.

El vector de expresión construido se transfiere a una célula cultivada tal como una célula CHO o célula SW480 por transfección usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) y similares. Las células de expresión se pueden seleccionar por medio de un marcador de vector de expresión (neomicina y similares) y las células así obtenidas se pueden usar para posterior análisis y evaluaciones. Para las células de expresión, se recomienda que las células que exhiben alta expresión más establemente se obtengan realizando clonación tal como limitando dilución para proporcionar población celular homogénea.

A continuación se describe cómo preparar un anticuerpo. Cuando se pretende preparar un anticuerpo anti-integrina α9 y dirigir validación diana de α9, se recomienda que un anticuerpo monoclonal que posee actividad inhibidora de función sea adquirido primero con α9 de ratón como una diana y luego el anticuerpo se examine par determinar la presencia o ausencia de un efecto farmacológico usando unsistema demodelo patológico de ratón.

Primero, se describe la separación de un clon específico de una biblioteca de fago de expresión de scFv. Por ejemplo, esto se puede alcanzar mediante procedimientos que se muestran a continuación. Después de que la biblioteca anterior se hace reaccionar con células CHO y se hace la resta, se une a células CHO de expresión de α9 de ratón, recuperadas y concentradas, y se analiza un clon de fago de expresión de scFv anti-α9. El antígeno usado puede no ser la célula tal cual es, pero se puede preparar y usar una fracción de membrana o se puede purificar un antígeno a partir de una fracción demembrana y usarse.

Un scFv del clon así obtenido se prepara, y se verificar su reactividad con células que expresan α9. Como un método la expresión de scFv, scFv se puede expresar en, por ejemplo, Escherichia coli. En el caso de Escherichia coli, el scFv se puede expresar en un estado funcionalmente unido con un promotor útil de uso común, una secuencia de señales para secreción de anticuerpo y similares. Como ejemplos de los promotores, el promotor lacZ, promotor araB y similares se pueden mencionar. Como una secuencia de señales para secreción de scFv, se recomienda que la secuencia de señales pelB (J. Bacterio. R1987, 169: 4379-4383) se use cuando el scFv se expresa en el periplasma de Escherichia coli. Para la secreción en el sobrenadante de cultivo, la secuencia de señales de la proteína g3 de fago M13 también se puede usar.

El scFv expresado fuera de la célula se puede separar del hospedador y se puede purificar hasta homogeneidad. Por ejemplo, el scFv expresado usando el sistema pCANTABSE sepuedepurificar fácilmenteen un corto período de tiempo por cromatografía de afinidad usando un anticuerpo anti-Etag porque tiene una secuencia Etag agregada a un extremo C de este. Además, el scFv también se puede purificar usando una combinación de métodos de separación de purificación de proteínas de uso común. Por ejemplo, combinando ultrafiltración, precipitación por sales, y cromatografías en columna tales como filtración por gel/intercambio de iones/cromatografía hidrofóbica, el anticuerpo se puede separar y purificar. El producto purificado se puede analizar para determinar la forma molecular por análisis de filtración por gel HPLC y similares.

Métodos para medir la actividad de unión del anticuerpo o fragmento de anticuerpo obtenidos para integrina α9, ELISA, FACS y similares están disponibles. Al usar ELISA por ejemplo, una muestra que contiene el anticuerpo o fragmento de anticuerpo deseado, por ejemplo, un sobrenadante de cultivo de Escherichia coli o anticuerpo purificado se agrega a una placa de 96 pocillos sobre la cual se inmovilizaron células de expresión de integrina α9 directamente o mediante un anticuerpo de captura. A continuación, un anticuerpo secundario como un anticuerpo anti-Etag, previamente marcado con una enzima tal como peroxidasa de rábano picante (HRP) o fosfatasa alcalina (AP), una sustancia fluorescente tal como isocianato de fluoresceína o rodamina, una sustancia radioactiva tal como 32P o 125I, una sustancia quimioluminiscente o similar, se agrega y se hace reaccionar, y la placa se lava, después de lo cual se agrega un reactivo de detección (en el caso de marcado de HRP, por ejemplo, sustrato de desarrollo de color TMB y similar) según sea necesario, y se mide la absorbancia, fluorescencia, intensidad, radioactividad, la cantidad de luminiscencia y similares, donde la actividad de unión al antígeno se puede evaluar.

Las secuencias base de ADN de VH y VL de los genes scFv del clon aislado se pueden determinar por el método de didesoxi y similar, y sus secuencias de aminoácidos se pueden estimar a partir de información de secuencia base de

ADN obtenida.

Además, está disponible, como un método para determinar si el clon separado posee actividad inhibidora de función contra α9, el siguiente método con adhesión celular dependiente de α9 como un índice, por ejemplo. La forma alterada de RAA (la secuencia RGD remplazad con RAA para suprimir la reacción con otras integrinas) de un OPN de extremo N (un fragmento de extremo N que resulta de truncar osteopontina con trombina), que es un ligando de α9, se inmoviliza en una placa, y se bloquea. Después de agregar varios anticuerpos, se agregan las células que expresan α9 y se incuban a 37°C durante 1 hora. Después de fijar las células y teñirlas usando violeta cristal y metanol, y lavarlas, el tinte en las células adheridas se extrae con Triton X-100, y su absorbancia de determina a una longitud de onda de 595 nm. Si se confirma así la acción supresora, se entiende que el anticuerpo posee actividad inhibidora contra α9.

Aquí, scFv es un fragmento de anticuerpo monovalente; se sabe que en algunos casos la afinidad o efecto inhibidor se mejora ampliamente por un efecto de avidez cuando scFv se remplaza con un anticuerpo divalente de tipo IgG o de tipo scFv-Fc. Otro hecho conocido es que las formas moleculares de pesos moleculares relativamente grandes, tales como el tipo IgG o tipo scFv-Fc, tienen mejor estabilidad en el cuerpo y mayor semivida que las formas moleculares de pesos moleculares relativamente pequeños, tales como scFv.

Por esta razón, se recomienda, por ejemplo, que el clon separado se convierta en la forma molecular del tipo scFv-Fc y se evalúecomo sedescribea continuación. La región degen scFv del clon separado seamplifica por PCR, y se inserta en un vector de expresión de proteína de fusión Fc de ratón o humano, por el cual se construye un vector de expresión scFv-Fc.

Como un ejemplo de dicho vector de expresión de proteína de fusión Fc de ratón o humano, se puede usar pFUSE-mlgGl-Fc o pFUSE-hlgGl-Fc (InvivoGen Company). En el vector, una secuencia líder que promueve la expresión secretora extracelular, el gen scFv, y la región de gen Fc de ratón o humano, se unieron y la expresión de estos se controla con varios promotores.

El vector de expresión scFv-Fc construido se transfecta a una célula cultivada tal como una célula CHO que usa Lipofeetamine 2000 (Invitrogen) y similares. Es posible realizar un cultivo de expansión usando un medio de selección que contiene un marcador de vector de expresión (neomicina y similares), recupera el sobrenadante de cultivo, y lo purifica por cromatografía de columna de Proteína A y similares. Se recomienda que el estándar de referencia purificado de scFv-Fc obtenido, como scFv, se analice por filtración en gen HPLC, ELISA, FACS o prueba de inhibición de adhesión celular dependiente de α9 y similares. En ELISA, la detección se puede realizar usando un anticuerpo IgG anti-ratón marcado con HRP y similares; en FACS, se puede realizar la detección usando un anticuerpo IgG anti-ratón marcado con FITC y similares. Se recomienda usar como anticuerpo de control Y9A2 (CHEMICON), un anticuerpo monoclonal deratón contra α9de ser humano.

Luego, se describe el análisis de epítopo de anticuerpo.

Si se identifica un epítopo de un clon de anticuerpo que posee actividad inhibidora de función, será posible aclarar un epítopo neutralizante de α9. El análisis de epítopo se puede realizar, por ejemplo, como se describe a continuación. Se construye una forma sustituida con aminoácido de α9, y se analiza la reactividad con el anticuerpo. Si se revela un cambio en la reactividad con el anticuerpo debido a sustitución de aminoácidos, se recomienda que el sitio sustituido pueda ser un epítopo del anticuerpo. Como ejemplos de métodos de sustitución de aminoácidos, están disponibles el intercambio de secuencias α9 de ser humano y α9 de ratón, el intercambio de secuencias α9 y α4, el remplazo de la secuencia α9 con Ala, y similares.

Dado que el dominio propelente β ubicado en el resto de extremo N de una región extracelular es, según se dice, el sitio de interacción con el ligando, que es un rasgo común de las cadenas α de la familia integrina (Science, 296, 151-155, 2002), parece probable que un epítopo neutralizante esté presente en esta región. Entonces, el dominio propelente β puede ser el sujeto de análisis.

Un documento de referencia que analiza el sitio de unión al ligando y epítopo neutralizante de cx4 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 7198-7203, 1997) presenta resultados que muestran que R2 y R4, de los restos de repetición denominados R1 a R5 en el dominio propelente β (que corresponden a la región bucle), son importantes para la unión al ligando, y que R2, R3a y R3c pueden convertirse en epítopos neutralizantes. A juzgar por estos hechos, parece probable que laregión bucle sea un epítopo neutralizante.

Entonces, se puede realizar el análisis mientras se reduce la cobertura de dianas con regiones bucle en el dominio propelente β.

Si se encuentran disponibles a partir de los resultados del análisis finalizado, se pueden usar los datos sobre la especificidad del anticuerpo. Por ejemplo, si se observa una diferencia en la fuerza de reactividad contra α9 de ser humano y α9 de ratón, se cree que la secuencia de aminoácidos de la región de epítopo puede diferir en alguna medida entre humanos y ratones. Dado que α9 de ser humano y α9 de ratón son altamente homólogos entre sí, la cobertura de sitios candidato se puede reducir además para permitir un análisis eficaz, siempre que un sitio cuya secuencia de aminoácidos difiere entre α9 de ser humano y α9 de ratón, se seleccione entre diferentes sitios

candidato a ser analizados.

También se recomienda que una proteína fluorescente tal como EGFP se use como marcador para confirmar la expresión de un α9 de ser humano alterado. Por ejemplo, siempre que se construya un conjugado α9-EGFP con EGFP fusionado con el extremo C (región citoplasmática) de α9, la expresión de α9 se puede confirmar por fluorescencia, y se puede evaluar la reactividad del anticuerpo en proporción con la cantidad expresada, para que sea posible una evaluación más cuantitativa.

Dicha forma sustituida de aminoácido de α9 o conjugado α9-EGFP se construye por mutagénesis dirigida al sitio y similar. Se clonan en un vector de expresión, y cada uno se transfiere a una célula cultivada tal como una célula CHO. Para una población celular expresada de forma transitoria o expresada de forma estable, la expresión de α9 de tipo salvaje o de tipo alterado (o α9-EGFP) y la reactividad de esta con el anticuerpo se puede evaluar usando ELISA o FACS y similares. Por ejemplo, cuando varias formas sustituidas de aminoácido se construyen en función de α9-EGFP, y sus reactividades con el anticuerpo se analizan por FACS, las reactividades con el anticuerpo por cantidad unitaria expresada se puede discutir en términos de la expresión de α9-EGFP indicada en el eje lateral, y la reactividad con el anticuerpo indicado en el eje vertical.

Si el análisis revela un cambio en la reactividad con el anticuerpo debido a una sustitución de aminoácido α9, el sitio sustituido se puede estimar como un epítopo del anticuerpo (o una parte del epítopo).

Luego, se describe una evaluación del efecto farmacológico de un anticuerpo.

Dado que se ha sugerido mucho que α9 esté implicado en inflamación, se recomienda usar artritis inducida por anticuerpo de colágeno de ratón, que es un modelo representativo de artritis, o similares, como un sistema de modelo patológico de ratón. Por ejemplo, el efecto farmacológico de cada clon de anticuerpo sobre artritis inducida por anticuerpo de colágeno deratón se puede evaluar por los procedimientos que semuestran a continuación.

Un cocktail de anticuerpo anti-colágeno se administra a ratones, y 3 días después, se administra LPS, con el cual se induce el comienzo de artritis. El día de la administración de LPS y 3 días después, el scFv-Fc del clon se administra por vía intraperitoneal a 500, 170, y 56 pg/cabeza. El grado de hinchazón en las extremidades de cada ratón se examina y valora en el tiempo, y se grafican cambios en el tiempo en el valor promedio para cada grupo. Como resultado, si se observa un efecto supresor dependiente de dosis de scFv-Fc sobre artritis, se cree que el clon tiene un efecto farmacológico sobre artritis.

De manera alternativa, se recomienda evaluar el efecto supresor sobre artritis inducida por colágeno de ratón, otro modelo representativo de artritis. Se cree que en artritis inducida por anticuerpo de colágeno, se provoca una reaccióninflamatoria en la etapa aguda, mientras en artritis inducida por colágeno,

se provoca una respuesta inflamatoria crónica mediada por una reacción inmunitaria. Por ejemplo, el efecto farmacológico del clon de anticuerpo sobre artritis inducida por colágeno de ratón se puede evaluar por los procedimientos que semuestran a continuación.

Mediante la administración de colágeno de tipo II bovino a ratones con un intervalo de 3 semanas, se induce el comienzo de artritis. 4 días, 6 días, 8 días, 10 días y 12 días después de la segunda administración, el scFv-Fc del clon se administra por vía intraperitoneal a 500, 170, y 56 pg/cabeza. El grado de hinchazón en todas las extremidades de cada ratón se examina y valora en el tiempo para determinar si se observa un efecto supresor dependiente de dosis de scFv-Fc sobre artritis.

La artritis reumatoide es una enfermedad inflamatoria crónica acompañada de destrucción articular, y la destrucción articular priva al paciente de libertad, lo que resulta en un deterioro importante de su QOL. Ninguno de los agentes terapéuticos de artritis reumatoide usados hasta ahora suprimen de manera eficaz la destrucción articular, aunque poseen acción antiinflamatoria; se espera desarrollar un agente terapéutico de artritis reumatoide tenga acción potente antiinflamatoria y acción supresora de destrucción articular. Por lo tanto, por ejemplo, el efecto supresor del clon sobre diferenciación de osteoclastos se puede evaluar como se describe a continuación.

Se recogen células de la médula ósea del ratón artificialmente artrítico descrito anteriormente, y se cultivan en un medio aMEM que contiene RANKL y M-CSF, junto con el scFv-Fc de clon, después de lo cual se cuentan los osteoclastos (células de TRAP positivo), y se evalúa el efecto supresor sobre diferenciación en los osteoclastos. En otro método, el scFv-Fc se administra simultáneamente con inducción de artritis, se recogen células de la médula ósea del ratón al otro día, las células se cultivan en un medio aMEM que contiene RANKL y M-CSF, se cuentan los osteoclastos, y se evalúa el efecto.

Luego, se describe la mejora de afinidad de anticuerpo.

Se reportaron muchos casos donde las alteraciones tales como sustituciones de aminoácidos se realizan en la región variable de un anticuerpo, por la cual la afinidad o especificidad se mejoró o cambió. Aun si el anticuerpo obtenido no posee suficiente afinidad o especificidad, parece posible mejorar la afinidad o especificidad del anticuerpo, por ejemplo, como se describe a continuación.

Como métodos de alteraciones, hay varios métodos comúnmente conocidos en la técnica; por ejemplo, hay un método donde un sitio especificado se sustituye con un aminoácido particular tal como Ala (por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology edit. 1987, 5: Sección 8, 1-8), un método donde se introducen aminoácidos aleatorios (se pueden realizar por mutagénesis dirigida al sitio), un método donde las sustituciones de aminoácidos se introducen aleatoriamente a la región variable del anticuerpo sin especificar un sitio (se puede realizar por mutagénesis aleatoria) (por ejemplo, métodos PCR y Aplicaciones, 1992, 2: 28-33) y similares.

En muchos casos, de las varias regiones variables de anticuerpo, la región CDR3 de VH es el mayor contribuyente al reconocimiento de antígeno, por lo que esta región puede ser sometida al sitio para alteración.

También es posible preparar una biblioteca de fago de expresión de scFv alterada, y analizar un clon alterado con afinidad o especificidadmejorada en comparación con el clon original.

Con respecto al clon alterado adquirido, se recomienda preparar un estándar de referencia en la forma molecular de, por ejemplo, scFv o scFv-Fc, como con el clon original, y evaluar su reactividad, actividad inhibidora de función, y efecto farmacológico. Como resultado, si se confirma una propiedad mejor que el clon original, reactividad a α9 de ser humano, y un efecto farmacológico, se espera que el clon alterado se convierta en un fármaco profiláctico o terapéutico para una enfermedad donde α9 contribuye a la patogénesis.

Los presentes inventores trataron de adquirir scFv de integrina anti-α9 por el método antes descrito y, como un resultado, lograron adquirir MΑ9-413, un clon scFv que posee reactividad específica a integrina α9. Como un resultado de una evaluación después de cambiar la forma molecular de scFv a scFv-Fc, se confirmó que este clon tieneuna propiedad quenunca fuereportada hastala fecha en cuanto exhibereactividad con α9 deser humano y α9 de ratón y actividad inhibidora de función contra ambos.

Además, los presentes inventores dirigieron análisis de epítopo en clon MΑ9-413, y descubrieron que este clon reconoce un epítopo configurado principalmente por la región de 104 Arg a 122 Asp de integrina α9 de ser humano (SEQ ID NO:36: una integrina α9 de ser humano mostrado por Swiss-Prot AC: Q137 97; el extremo N de la secuencia de aminoácidos se enumera 1), y un epítopo configurado principalmente por la región de 105 Arg a 123 Asp de integrina α9 de ratón (SEQ ID NO: 37: una integrina α9 de ratón mostrado por GenBank ACCESSION: AJ344342; el extremo N de la secuencia de aminoácidos se enumera 1). Estas regiones son regiones bucle cuyas funciones y roles no se reportaron en estudios anteriores de otras familias de integrinas, y los presentes inventores las denominaron regiones LI.

Como un resultado de un examen de los efectos farmacológicos del anticuerpo o fragmento de anticuerpo con estas características, se confirmó un efecto para suprimir significativamente inflamación e hinchazón de articulaciones en un modelo de artritis de ratón.

Por lo tanto, el anticuerpo anti-integrina α9 de ser humano y fragmento de anticuerpo de la presente invención tienen una propiedad que no se ha dado a conocer que hasta la fecha en cuanto reconocen un epítopo formado por la región LI de integrina α9 y poseen reactividad a integrina α9 de ratón e integrina α9 de ser humano. Como tal, se espera que el anticuerpo y fragmento de anticuerpo de la presente invención se pueda aplicar industrialmente como fármacos profilácticos o terapéuticos de diagnóstico novedosos para varias enfermedades implicadas por integrina α9.

Dado que el anticuerpo anti-integrina α9 de ser humano y fragmento de anticuerpo de la presente invención poseen reactividad con integrina α9 de ratón e integrina α9 de ser humano, es posible adquirir datos sobre estudios farmacológicos usando ratones con el mismo anticuerpo y dirigir otros estudios clínicos en sujetos humanos para promover el desarrollo de un anticuerpo farmacéutico, como se menciona anteriormente; esto puede ser una ventaja importante en vista de la aplicaciónindustrial.

La presente invención también ofrece un nuevo potencial de aplicaciones de investigación o industriales con relación a integrina α9 y aun la familia de integrina en su totalidad, como un resultado del descubrimiento de un nuevo epítopo neutralizante denominado región LI.

Además, los presentes inventores realizaron alteraciones moleculares al anterior clon MΑ9-413, y lograron obtener una pluralidad de clones con reactividad mejorada extraordinariamente a integrina α9 de ser humano. MΑ9-418, HΑ9-107, HΑ9-143 y HΑ9-212. Se espera que estos clones se conviertan en fármacosmás eficaces que MΑ9-413.

Las secuencias de aminoácidos de las cadenas VH y cadenas VL de los clones scFv adquiridas por los presentes inventores, que tienen las propiedades descritas anteriormente, y las secuencias base que las codifican, se muestran a continuación.

(1) Clon MΑ9-413

La secuencia de aminoácidos de la cadena VH del clon MΑ9-413 se muestra por la SEQ ID NO:1. Las secuencias de aminoácidos de la CDR1 a 3 de la cadena VH se muestran por la SEQ ID NO: 2 a 4. Entonces, en la secuencia de aminoácidos de la cadena VH del clon MΑ9-413 que se muestra por la SEQ ID NO:1, la secuencia de los

aminoácidos 31 a 35 corresponde a la CDR1 (SEQ ID NO:2), la secuencia de los aminoácidos 50 a 66 corresponde a la CDR2 (SEQ ID NO:3), y la secuencia de los aminoácidos 99 a 115 corresponde a la CDR3 (SEQ ID NO:4) . La secuencia base del gen que codificala cadena VH semuestra por la SEQ ID NO: 5.

La secuencia de aminoácidos de la cadena VL del clon MΑ9-413 semuestra por la SEQ ID NO:6. Las secuencias de aminoácidosdelaCDR1a3delacadenaVLsemuestranporlaSEQIDNo:7a9. Entonces,enlasecuenciade aminoácidos de la cadena VL del clon MΑ9-413 que se muestra por la SEQ ID NO:6, la secuencia de los aminoácidos 23 a 35 corresponde a la CDR1 (SEQ ID NO:7), la secuencia de los aminoácidos 51 a 57 corresponde a la CDR2 (SEQ ID NO:8), y la secuencia de los aminoácidos 90 a 96 corresponde a la CDR3 (SEQ ID NO:9) . La secuencia base del gen que codificala cadena VL semuestra por la SEQ ID NO: 10.

(2) Clon MΑ9-418

La secuencia de aminoácidos de la cadena VH del clon MΑ9-418 se muestra por la SEQ ID NO:12. Las secuencias de aminoácidos de la CDR1 a 3 de la cadena VH semuestran por la SEQ ID No: 13 a 15. Entonces, en la secuencia de aminoácidos de la cadena VH que se muestra por SEQ ID NO:12, la secuencia de aminoácidos 31 a 35 corresponde a la CDR1 (SEQ ID NO:13), la secuencia de los aminoácidos 50 a 66 corresponde a la CDR2 (SEQ ID NO:14), y la secuencia de los aminoácidos 99 a 115 corresponde a la CDR3 (SEQ ID NO: 15) . La secuencia base del gen que codificala cadena VH semuestra por la SEQ IDNo:16.

La secuencia de aminoácidos de la cadena VL del clon MΑ9-418 es la misma que la de la cadena VL del clon MΑ9413 (SEQ ID NO:6).

(3) Clon HΑ9-107

La secuencia de aminoácidos de la cadena VH del clon MΑ9-107 se muestra por la SEQ ID NO:18. Las secuencias de aminoácidos dela CDR1 a 3 dela cadenaVH se muestran por SEQ ID NO:19 a 21. Entonces, en la secuencia de aminoácidos de la cadena VH que se muestra por la SEQ ID NO:18, la secuencia de los aminoácidos 31 a 35 corresponde a la CDR1 (SEQ ID NO:19), la secuencia de los aminoácidos 50 a 66 corresponde a la CDR2 (SEQ ID NO:20), y la secuencia de los aminoácidos 99 a 115 corresponde a la CDR3 (SEQ ID NO: 21) . La secuencia base del gen que codificala cadena VH semuestra por la SEQ IDNo:22.

La secuencia de aminoácidos de la cadena VL del clon MΑ9-107 es la misma que la de la cadena VL del clon MΑ9413 (SEQ ID NO:6).

(4) Clon HΑ9-143

La secuencia de aminoácidos de la cadena VH del clon HΑ9-143 se muestra por la SEQ ID NO:24. Las secuencias de aminoácidos dela CDR1 a 3 dela cadenaVH se muestran por SEQ ID NO:25 a 27. Entonces, en la secuencia de aminoácidos de la cadena VH que se muestra por la SEQ ID NO:24, la secuencia de los aminoácidos 31 a 35 corresponde a la CDR1 (SEQ ID NO:25), la secuencia de los aminoácidos 50 a 66 corresponde a la CDR2 (SEQ ID NO:26), y la secuencia de los aminoácidos 99 a 115 corresponde a la CDR3 (SEQ ID NO: 27). La secuencia base del gen que codificala cadena VH semuestra por la SEQ IDNo:28.

La secuencia de aminoácidos de la cadena VL del clon HΑ9-143 es la misma que la de la cadena VL del clon MΑ9413 (SEQ ID NO:6).

(5) Clon HΑ9-212

La secuencia de aminoácidos de la cadena VH del clon HΑ9-212 se muestra por la SEQ ID NO:30. Las secuencias de aminoácidos de la CDR1 a 3 de la cadena VH semuestran por la SEQ ID No: 31 a 33. Entonces, en la secuencia de aminoácidos de la cadena VH que se muestra por la SEQ ID NO:30, la secuencia de los aminoácidos 31 a 35 corresponde a la CDR1 (SEQ ID NO:31), la secuencia de los aminoácidos 50 a 66 corresponde a la CDR2 (SEQ ID NO:32), y la secuencia de los aminoácidos 99 a 115 corresponde a la CDR3 (SEQ ID NO: 33) . La secuencia base del gen que codificala cadena VH semuestra por la SEQ IDNo:34.

La secuencia de aminoácidos de la cadena VL del clon HΑ9-212 es la misma que la de la cadena VL del clon MΑ9413 (SEQ ID NO:6).

En una realización preferida, el anticuerpo anti-integrina α9 de ser humano o fragmento de anticuerpo de la presente invención tiene regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada que consisten en las secuencias de aminoácidos mostradas por la SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15; SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21; SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27; o SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, y SEQ ID NO:33, respectivamente (CDR1, CDR2, CDR3), y regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera que consisten en las secuencias de aminoácidos mostradas por la SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, y SEQ ID NO:9, respectivamente (CDR1, CDR2, CDR3). En una realización más preferida, el anticuerpo anti-integrina α9 de ser humano o fragmento de anticuerpo tiene regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada que consisten en las secuencias de aminoácidos mostradas por la SEQ ID

NO:31, SEQ ID NO:32, y SEQ ID NO:33, respectivamente (CDR1, CDR2, CDR3).

En una realización aun más preferida, el anticuerpo anti-integrina α9 de ser humano o fragmento de anticuerpo de la presente invención tiene una región variable de cadena pesada (VH) que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada por cualquiera de las SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:24, y SEQ ID NO:30, y una región variable de cadena ligera(VL) que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO:6. En una realización más preferida , el anticuerpo anti-integrina α9 de ser humano o fragmento de anticuerpo tiene una región variable de cadena pesada(VH) que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO:30.

Las cadenas VH y/o las cadenas VL descritas en la presente invención fueron obtenidas en la forma de scFv usando el método de anticuerpo fago, y se evaluaron en la forma molecular de scFv o scFv-Fc; como regla, sin embargo, el anticuerpo anti-integrina α9 de ser humano o fragmento de anticuerpo de la presente invención no se limita a estas formas moleculares. Por ejemplo, una forma molecular completa preparada uniendo una cadena VH y/o cadena VL descritas co la región constante de inmunoglobulina humana, como un anticuerpo completo, y no solo scFv y scFv-Fc, sino también Fab, Fab' o F (ab')2 combinado con una porción dela región constantedeinmunoglobulina humana, y otros fragmentos de anticuerpo tales como anticuerpos de cadena simple preparados por unión de scFv con la región constante de la cadena L de inmunoglobulina humana (scAb), como fragmentos de anticuerpo, también son parte dela presente invención.

Además del anticuerpo anti-integrina α9 de ser humano antes descrito de la presente invención o fragmento de anticuerpo de este, la presente invención también comprende anticuerpos de fusión preparados fusionando el anticuerpo o fragmento de anticuerpo con otro péptido o proteína, y anticuerpos modificados preparados uniendo el anticuerpo o fragmento de anticuerpo con un modificador poliméricotal como polietilenglicol.

Al preparar un scFv con los Fv de una cadena H y cadena L

unidos por un enlazador apropiado, por ejemplo, un péptido de cadena simple opcionalmente elegido que consiste en 10 a 25 residuos de aminoácido, se usa como enlazador peptídico.

El anticuerpo anti-integrina α9 de ser humano o un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo fusionado que resulta de fusión de dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo con otro péptido o proteína, o un anticuerpo modificado que consiste en dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo y un agente modificador unido a este (en lo sucesivo denominado “anticuerpo anti-integrina α9 de ser humano etc.”) de la presente invención así obtenido, después de purificarse según es necesario, se puede preparar como una preparación farmacéutica de acuerdo con un método convencional, y se puede usar para la profilaxis y/o tratamiento de enfermedades autoinmunes tales como artritis reumatoide, enfermedades inmunitarias tales como alergia, rechazo a injertos, etc., o enfermedades en las que la integrina α9 está implicada en patogénesis tales como osteoartritis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, cáncer y similares.

El anticuerpo anti-integrina α9 de ser humano etc. de la presente invención se puede usar preferentemente como un agente terapéutico para artritis reumatoide. Como ejemplos de formas de dosificación para dicho agente terapéutico, se puede preparar una preparación parenteral tal como una inyección o infusión por goteo, y preferentemente se administra por administración intravenosa, administración subcutánea y similares (lo mismo se aplica en el caso de un agente terapéutico de enfermedad autoinmunitaria). Al preparar una preparación farmacéutica, portadores y aditivos que concuerdan con estas formas de dosificación se pueden usar dentro de un intervalo farmacéuticamente aceptable.

La cantidad de anticuerpo anti-integrina α9 de ser humano etc. agregada en la preparación descrita anteriormente varía depende de los síntomas, gravedad y edad del paciente, la forma de dosificación de la preparación usada o la titulación de unión el anticuerpo y similares; por ejemplo, se puede usar alrededor de 0,1 mg/kg a 100mg/kg.

La presente invención también proporciona un gen que codifica el anticuerpo de la presente invención o un fragmento de este, y un vector de expresión que comprende el mismo. El vector de expresión de la presente invención no se somete a limitación, siempre que sea capaz de expresar un gen que codifica el anticuerpo de la presente invención o un fragmento de este en varias células hospedadoras de células procariotas y/o células eucariotas, y producir estos polipéptidos. Por ejemplo, se pueden mencionar vectores de plásmido, vectores virales (por ejemplo, adenovirus, retrovirus) y similares.

El vector de expresión de la presente invención también puede comprender un gen que codifica el anticuerpo de la presente invención o un fragmento de este, y un promotor unido funcionalmente al gen. Como el promotor para expresar el polipéptido de la presente invención en una bacteria, cuando es hospedador es una bacteria del género Escherichia, se puede mencionar, por ejemplo, el promotor Trp, promotor lac, promotor recA, promotor A-PL, promotor lpp, promotor tac y similares. Como el promotor para expresar el anticuerpo de la presente invención o un fragmento de esto en levadura, por ejemplo, se puede mencionar promotor PH05, promotor PGK, promotor GAP, y promotor ADH; cuando se puede mencionar el hospedador es una bacteria del género Bacillus, el promotor SL01, promotor SP02, promotor penP y similares. Cuando el hospedador es una célula eucariota tal como una célula de mamífero, se puede mencionar promotor CAG (Niwa H. et ál., Gene, 108, 193-200, 1991), promotor derivado de

SV40, promotor de retrovirus, promotor de choque térmico y similares.

Cuando una bacteria, particularmente Escherichia coli, se usa como la célula hospedadora, el vector de expresión de la presente invención puede comprender además un codón de inicio, un codón de detención,, una región de terminación y una unidad replicable. Cuando una levadura, célula de animal o célula de insecto se usa como el hospedador, el vector de expresión de la presente invención puede comprender un codón de inicio y un codón de detención. En este caso, puede contener una secuencia de potenciador, regiones de no codificación en el lado 5’ y lado 3’ de un gen que codifica el polipéptido de la presente invención, una unión de empalme, un sitio de poliadenilación o una unidad replicable y similares. Puede contener un marcador de selección de uso común (por ejemplo, tetraciclina, ampicilina, kanamicina) de acuerdo conel uso deseado.

La presente invención también proporciona u transformante que incorpora el gen de la presente invención. Dicho transformante se puede preparar mediante, por ejemplo, la transformación de una célula hospedadora con el vector de expresión de la presente invención. La célula hospedadora usada para preparar un transformante no se somete a limitación, siempre que concuerde con el vector de expresión antes mencionado, y se puede transformar; varias células tales como células naturales o líneas artificialmente establecidas de células de uso común en el campo técnico de la presente invención (por ejemplo, bacterias(bacterias del género Escherichia, bacterias del género Bacillus), levaduras (el género Saccharomyces, el género Pichia ay similares), células de animales o células de insectos (por ejemplo, Sf9) y similares) pueden ser mencionados como ejemplos. La transformación se puede realizar por unmétodo conocido propiamente dicho.

La presente invención también proporciona un método para producir el anticuerpo de la presente invención o un fragmento de este, que comprende dejar que una célula hospedadora exprese el gel de la presente invención, es decir, usando dicho transformante.

Al producir el anticuerpo de la presente invención o un fragmento de este, el transformante se puede cultivar en un medio nutritivo. El medio nutritivo contiene preferentemente una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno inorgánica o fuente de nitrógeno orgánica necesaria para el crecimiento del transformante. Como ejemplos de la fuente de carbono, se puede mencionar glucosa, dextrano, almidón soluble, sucrosa y similares; como ejemplos de la fuente de nitrógeno inorgánica o fuente de nitrógeno orgánica, se puede mencionar sales de amonio, nitratos, aminoácidos, licor de maíz, peptona, caseína, extracto de carne, torta de soja, extracto de papa y similares. Si se desea, puede contener otros nutrientes (por ejemplo, sales inorgánicas (por ejemplo, cloruro de calcio, fosfato dihidrógeno de sodio, cloruro de magnesio), vitaminas, antibióticos (por ejemplo, tetraciclina, neomicina, ampicilina, kanamicina y similares) y similares).

El cultivo del transformante se puede realizar por un método conocido propiamente dicho. Las condiciones de cultivo, por ejemplo, temperatura, pH del medio, y tiempo de cultivo se seleccionan según sea apropiado. Por ejemplo, cuando el hospedador es una célula de animal, un medio MEM que contiene alrededor de 5 a 20% de suero bovino fetal (Science, Vol.122, p.501, 1952), medio DMEM (Virology, Vol.8, p.396, 1959), medio RPMI1640 (J. Am. Med. Assoc., Vol.199, p.519, 1967), medio 199 (Proc. Soc. Exp. Biol. Med., Vol.73, p.1, 1950) y similares se pueden usar como el medio. El pH del medio es preferentemente alrededor de 6 a 8, el cultivo de realiza normalmente a alrededor de 30 a 40°C durante alrededor de 15 a 72 horas, y el cultivo se puede airear o agitar según sea necesario. Cuando el hospedador es una célula de insecto, se puede mencionar por ejemplo medio de Grace que comprende suero bovino fetal (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.82, p.8404, 1985) y similares, y el pH de este es preferentemente alrededor de 5 a 8. El cultivo de realiza normalmente a alrededor de 20 a 40°C durante 15 a 100 horas, y el cultivo se puede airear o agitar según sea necesario. Cuando el hospedador es una bacteria, un actinomyces, levadura, o un hongo filamentoso, por ejemplo, es apropiado un medio líquido que comprende las fuentes de nutriente antes mencionadas. Se prefiere un medio con un pH de 5 a 8. Cuando el hospedador es E. coli, se puede mencionar medio LB, medio M9 (Miller et ál., Exp. Mol. Genet, Cold Spring Harbor Laboratory, p.431, 1972) y similares como medio preferente.

En este caso, el cultivo se puede realizar normalmente a 14 a 43°C durante alrededor de 3 a 24 horas, mientras se airea o agita el cultivo según sea necesario. Cuando el hospedador es una bacteria del género Bacillus, el cultivo se puede realizar normalmente a 30 a 40°C durante alrededor de 16 a 96 horas, mientras se airea o agita el cultivo según sea necesario. Cuando el hospedador es levadura, el medio mínimo de Burkholder (Bostian, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.77, p.4505, 1980) se puede mencionar como ejemplos del medio, y el pH es convenientemente 5 a 8. El cultivo de realiza normalmente a alrededor de 20 a 35°C durante alrededor de 14 a 144 horas, y el cultivo se puede airear o agitar según sea necesario.

El anticuerpo de la presente invención o un fragmento de este se puede recuperar, preferentemente se puede aislar y purificar, de un transformante cultivado como se describe anteriormente. Como ejemplos del método de aislamiento y purificación, se pueden mencionar métodos basados en diferencias en solubilidad, tales como precipitación por sales y precipitación por solvente; métodos basados en diferencias en peso molecular, tales como diálisis, ultrafiltración, filtración por gel, y electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida; métodos basados en diferencias de carga eléctrica, tales como cromatografía por intercambio de iones y cromatografía de hidroxil apatita; métodos basados en afinidad específica, tales como cromatografía de afinidad; métodos basados en diferencias de hidrofobicidad, tales como cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa basada en

diferencias de puntoisoeléctrico, tales como enfoqueisoeléctrico; y similares.

La presente invención se explica en detalle a continuación en función delos Ejemplos, que no son taxativos.

Ejemplos

«Ejemplo 1: Preparación de antígeno»

Usando la biblioteca de ADNc humano como plantilla, la región de dominio principal del gen de la integrina α9de ser humano y la región de secuencia de señal del gen de la integrina α5 humana se clonaron. La región de secuencia de señal del gen de la integrina α5 humana y la región de dominio principal del gen de la integrina α9 de ser humano se conectaron e incorporaron en el vector pcDNA3.1 (-) (Invitrogen) para construir un vector de expresión α9 humano.

Usando la biblioteca de ADNc de ratón como plantilla, el gen de la integrina α9 de ratón de longitud completa se clonó e incorporó en el vector pcDNA3.1(+) (Invitrogen) paraconstruir un vector de expresión α9 deratón.

Además, para su uso como control, la integrina α4 de ser humano y la integrina α4 de ratón también se clonaron según el siguiente procedimiento.

Usando la biblioteca de ADNc humana como plantilla, el gen de la integrina α4 humano de longitud completa se clonó e incorporó en el vector pcDNA3.1(+) (Invitrogen) paraconstruir un vector de expresión α4 humano.

Usando ADNc derivado del bazo como plantilla, el gen de la integrina α4 de ratón de longitud completa se clonó e incorporó en el vector pcDNA3.1 (+) (Invitrogen) para construir un vector de expresión α4 de ratón.

En primer lugar, el vector de expresión de integrina α9 de ratón y el vector de expresión de integrina a4 de ratón se introdujeron respectivamente en células CHO, y una célula que expresa integrina α9 de ratón (a la que se hará referencia en lo sucesivo como CHO/mα9) y una célula que expresa integrina α4 de ratón (a la que se hará referencia en lo sucesivo como CHO/mα4) se establecieron respectivamente.

Luego, el vector de expresión de integrina α9 de ser humano y el vector de expresión de integrina α9 de ratón se introdujeron respectivamente en células SW480 y una célula que expresa integrina α9 de ser humano (a la que se hará referencia en lo sucesivo como SW480/hα9) y una célula que expresa integrina α9 de ratón (a la que se hará referencia en lo sucesivo como SW480/mα9) se establecieron respectivamente.

Estas diversas células que expresan integrina se usaron para el siguiente análisis y evaluación.

<<Ejemplo 2: Construcción de biblioteca de fago de voluntarios saludables»

Por referencia al método informado por J. D. Marks et ál. (J. Mol. Biol., 222: 581-597, 1991) y mediante el uso de linfocitos derivados de sangre periférica de veinte voluntarios saludables como material de partida, se construyó una biblioteca de fago. Las sub bibliotecas construidas VH(γ)-VK, VH(γ)-Vλ, VH(μ)-VK y VH(μ)-Vλ se evaluaron para tener una diversidad de 1,1x108, 2,1x108, 8,4x107 y 5,3x107 clones, respectivamente.

«Ejemplo 3: Análisismediante el uso de una célula que expresa integrina α9»

Un anticuerpo específico para α9 se produjo según los siguientes procedimientos. En primer lugar, se construyó un anticuerpo monoclonal con una actividad inhibidora de función con α9 de ratón como diana y se evaluó la presencia

o ausencia de eficaciamediante el uso de un sistema demodelo de patología de ratón.

Mediante el uso de la célula CHO de cepa original, la biblioteca de expresión en fagos se sustrajo y se hizo reaccionar con CHO/mα9. La reacción serealizó durante 1 hy las células se lavaron 3 veces con 1% de BSA/PBS.

La fracción celular después de lavar se suspendió en HCl (10 mM) y se incubó durante 10 min para eluir el fago. El eluído se neutralizó mediantemezcla con 1M Tris-HCl (pH 7,5) y seinfectó con TGI para amplificar el fago.

Como resultado de 4 rondas de cribado, se aisló un clon de fago MΑ9-413 específicamentereactivo con α9 de ratón.

<<Ejemplo 4: Análisis de reactividad de anticuerpo de fago por ELISA»

La reactividad del anticuerpo defago MΑ9-413 a α9se analizó mediante Cell ELISΑ.

CHO/mα9 y CHO se sembraron en una placa de 96 pocillos (costar) a 2x104 células/100 μL/pocillo y se incubó durante la noche a 37 °C, 5% de CO2. El medio se succionó y las células se lavaron con PBS y se hicieron reaccionar con anticuerpo de fago diluido con 1% de BSA/PBS. La detección se llevó a cabo mediante el uso de anticuerpo anti-M13 etiquetado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Amersham) y TMB (SIGMA) en combinación. La absorbancia a longitudes de onda de 450 nm y 650 nm se midió por un lector de microplacas (Molecular Devices). Los resultados se muestran en la Figura 1. Debido a que se confirmó la reactividad específica de α9 de MΑ9-413, se realizaron otros análisis.

«Ejemplo 5: Análisis de secuencia de clon»

Las secuencias base de ADN de VH y VL del gen scFv de clon aislado se determinaron mediante el uso de un kit CEQ DTCS Quick Start (BECKMAN COULTER). La secuencia de aminoácidos se dedujo en función de la información de las secuencias base de ADN obtenidas.

«Ejemplo 6: Expresión y purificación de scFv»

El ADN plásmido se recuperó del clon específico MΑ9-413 y Escherichia coli JM83 se transformó según un método convencional. Escherichia coli se precultivó durante la noche en medio 2xYT que contiene 2% de glucosa y 100 μg/mL de ampicilina y se transfiere parcialmente a medio SB que contiene 2% de glucosa y 100 μg/mL de ampicilina para realizar el cultivo principal. Se agregó IPTG en la fase logarítmica a una concentración final de 1 mM y la mezcla se cultivó durante 3 h para inducir la expresión de scFv. Luego de que se completó el cultivo, las células bacterianas se recuperaron por centrifugación, se suspendieron en 100 mM de solución Tris-HCl (pH 7,4) que contenía 20% de sucrosa y 10 mM de EDTA y las células bacterianas se dejaron en reposo sobre hielo durante 30 min. Luego, las células se centrifugaron a 8.900xg durante 30 min, el sobrenadante se recuperó y la fracción obtenida por filtración a través de un filtro de 0,45 μm se tomó como fracción periplásmica. Usando la fracción como material de partica, scFv se purificó según un método convencional por cromatografía en columna SP (Amersham) o módulo de purificación RPAS (Amersham) y la fracción de elución obtenida se dializó contra PBS para dar un producto estándar de purificación de scFv.

«Ejemplo 7: análisis dereactividad de scFv por ELISA»

La reactividad del producto de purificación de scFv preparado en el Ejemplo 6 a α9 se analizó por Cell ELISΑ para detección, se usó un anticuerpo anti-Etag etiquetado con HRP (Amersham) y el resto se realizó en las mismas condiciones que en el Ejemplo 4. Como resultado, se confirmó una reactividad dependiente de la concentración y específica como semuestra en la Fig. 2.

<<Ejemplo 8: evaluación de actividad inhibidora de la adhesión celular dependiente de α9 de scFv»

Si MΑ9-413 scFv puede inhibir la adhesión celular dependiente de α9 o no se evaluó por el siguientemétodo.

Variante OPN de extremo N (variante OPN con secuencia RGD alterada a RAA) se inmovilizó en una placa y se sometió a bloqueo. Se agregó producto de purificación MΑ9-413 scFv, luego se agregó SW480/mα9 y la mezcla se incubó a 37 °C durante 1 h. Las células se fijaron y tiñeron con violeta Crystal y metanol y se lavaron. El tinte en las células adheridas se extrajo con Triton X-100 y semidióla absorbancia a longitud de onda 595 nm.

Como resultado, se observó una acción supresora dependiente de la concentración como se muestra en la Fig. 3 y se confirmó que MΑ9-413 tenía una actividad inhibidora contra α9 de ratón.

<<Ejemplo 9: construcción del vector de expresión scFv-Fc»

Con la esperanza de mejorar la actividad inhibidora de función al cambiar el clon por un anticuerpo divalente, el clon se convirtió en una forma molecular de scFv-Fc. La región de gen MΑ9-413 scFv se amplificó por PCR y se insertó en el sitio SalI y el sitio BamHI del vector de expresión de proteína de fusión Fc de ratón para construir el vector de expresión scFv-Fc que se muestra en la Fig. 4. En este vector, una secuencia líder que promueve la expresión secretora extracelular, gen scFv y un gen que codifica la región Fc de IgG1 de ratón se conectan y la expresión de estos se regula por un promotor CAG. Además, este vector contiene un gen de resistencia a la neomicina y un gen de resistencia ala ampicilina como genes de resistencia al fármaco.

<<Ejemplo 10: expresión y purificación de scFv-Fc»

Mediante el uso de Lipofectamina 2000 (Invitrogen), el vector de expresión scFv-Fc construido se transfectó a la cepa CHO-DG44. Las células se cultivaron en un medio α-MEM (Invitrogen) o medio EX-CELL302 (Nichirei Biosciences) quecontiene500 μg/mL deneomicina y 10% de suero bovino y el sobrenadantedecultivo serecuperó. La purificación por afinidad se realizó por cromatografía en columna de proteína A según un método convencional y se realizó diálisis con PBS. La solución scFv-Fc obtenida se tomó como el producto purificado.

«Ejemplo 11: análisis dereactividad de scFv-Fc por ELISA»

La reactividad de MΑ9-413 scFv-Fc con α9 de ratón y α9 de ser humano se analizó por Cell ELISΑ. SW480/mα9, SW480/hα9 y SW480 se usaron como antígenos, 1% de BSA/PBS que contiene 5% de FBS se usó como solución de dilución, un anticuerpo IgG anti-ratón etiquetado con HRP (ZYMED) se usó para detección y el resto se realizó en las mismas condiciones que en el Ejemplo 4. Como resultado, se confirmó una reactividad dependiente de la concentración y específica con α9 de ratón y α9 de ser humano como se muestra en la Fig. 5. Por otro lado, anticuerpo Y9A2 evaluado como control reaccionó con α9 de ser humano pero no mostró reactividad alguna con α9 de ratón. A partir de estos resultados, se aclaró que MΑ9-413 es un clon de anticuerpo que tiene reactividad novedosa noinformada antes, que es capaz de reconocer tanto α9 de ratón como α9 de ser humano.

«Ejemplo 12: análisis dereactividad de scFv-Fc por citometría de flujo»

Además, lareactividad de MΑ9-413 scFv-Fc se evaluó por citometría de flujo.

MΑ9-413 scFv-Fc se hizo reaccionar con cada uno de SW480, SW480/mα9 y SW480/hα9 y se realizó análisis de citometría de flujo. Como resultado, la reactividad con α9 de ratón y α9 de ser humano se confirmó. Pese a que la reactividad con cada uno de CHO y CHO/mα4 también se evaluó de la misma forma, la reactividad con α4 de ratón no se observó (Fig. 6). A partir de estos resultados, se confirmó que MΑ9-413 scFv-Fc reacciona con α4 de ratón y humana con alta especificidad.

<<Ejemplo 13: evaluación de actividad inhibidora de la adhesión celular dependiente de α9 de scFv-Fc»

Se evaluó si MΑ9-413 scFv-Fc puede inhibir la adhesión celular dependiente de α9 de ratón y α9 de ser humano.

En cuanto a la adhesión celular cuando el ligando es OPN, se usó SW480/mα9 o SW480/hα9 y el resto se llevó a cabo en lasmismas condiciones que en el Ejemplo 8.

La adhesión celular cuando el ligando es VCAM-1 se evaluópor el siguientemétodo.

VCAM-1/Fc de ratón se inmovilizó en una placa y se sometió a bloqueo. SW480/mα9 se usó como la célula y el resto sellevó a cabo en las mismas condiciones que en el Ejemplo 8.

Como resultado, una acción supresora dependiente de concentración se observó en todos los casos como se muestra en la Fig. 7 y se confirmó que MΑ9-413 tiene actividad inhibidora contra α9 de ratón y α9 de ser humano y una acción similar se observó incluso cuando el ligando es OPN o VCAM-1.

«Ejemplo 14: análisis de epítopo MΑ9-413>>

MΑ9-413 con propiedades no informadas antes en el sentido de que muestra reactividad tanto con α9 de ratón como α9 de ser humano así como actividad inhibidora en ambos se sometió al siguiente análisis en un intento por identificar un epítopo.

Como un rasgo común a las cadenas α de familia de integrina, se dice que el dominio propelente β presente en la porción de extremo N de región extracelular es un sitio de intersección con ligando (Science, 296, 151-155, 2002). Por lo tanto, se planteó una hipótesis de que hay un epítoponeutralizante en esta región.

Luego, por referencia al modelo estructural estérico del dominio propelente β de α4 informado en una publicación (Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 94, 65-72, 1997), se preparó un modelo estructural estérico de dominio propelente β de α9 de ser humano. La región de lámina β y la región de bucle se dedujeron del modelo (para mencionarse posteriormente).

Además, una publicación que analiza un sitio de unión al ligando α4 y que neutraliza epítopos informa los resultados que, entre los sitios de repetición (que corresponden a la región bucle) denominados R1 a R5 en el dominio propelente β, R2 y R4 son importantes para la unión a ligando y R2, R3a y R3c pueden ser epítopos neutralizantes (Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 94, 7198-7203, 1997). A partir de esto se consideró que el epítopo MΑ9-413 es muy posiblemente una región de bucle.

Para aplicar el hallazgo obtenido sobre α4 a α9, por lo tanto, alineamos secuencias de aminoácidos de los dominios propelentes β de α4 de ser humano, α9 de ser humano y α9 de ratón clonados por nosotros, y comparamos las secuencias (Fig. 8). Las secuencias de aminoácidos de los dominios propelentes β respectivos de α4 de ser humano, α9 de ser humano y α9 de ratón mostrada en la Fig. 8 se muestran en SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 40. Entre las regiones de bucle deducidas del modelo, cuatro regiones que no corresponden a R1 a R5 se denominaron L1 a L4. Los resultados del estudio anterior sugieren una reactividad más fuerte de MΑ9-413 con α9 de ratón que α9 de ser humano, lo que sugiere la posible presencia de una pequeña diferencia en las secuencias de aminoácidos de la región de epítopo entre humano y ratón. Por lo tanto, las regiones de bucle con diferentes secuencias de aminoácidos entre α9 de ser humano y α9 de ratón se seleccionaron para dar cuatro regiones de R1, R4, R5 y L1.

Luego, en función de α9 de ser humano,los aminoácidos en cada una de las cuatro regiones de bucle mencionadas anteriormente se sustituyó para construir una variante y la reactividad con MΑ9-413 se evaluó. En primer lugar, se usó EGFP como marcador para la confirmación de la expresión de la variante α9 de ser humano y se construyó un gen de la proteína de fusión de α9 de ser humano y EGFP (al que se hará referencia en lo sucesivo como hα9-EGFP) donde EGFP se fusionó con el extremo C (región citoplasmática) de α9 humana. El gen EGFP se amplificó por PCR usando un vector de pEGFP-N1 (Clontech) como plantilla y además se conectó a gen α9 de ser humano por PCR de ensamblaje. Al usar el sitio de escisión de enzima de restricción, el gen se incorporó en el vector de expresión α9 de ser humano descrito en el Ejemplo 1 para construir el vector de expresión hα9-EGFP.

Usando el vector de expresión de proteína de fusión de α9 de ser humano-EGFP antes mencionado como base, se produjeron vectores de expresión de las variantes de las cuatro regiones de bucle. Para R1, se construyó una

variante dondela 47a Pro (siguiendo la numeración de la Fig. 8, en lo sucesivo la misma) se sustituyó por Ala (al que se hará referencia en lo sucesivo como hα9/mR1-EGFP), para R4 se construyó una variante donde el 243° Lys se sustituyó por Glu (al que se hará referencia en lo sucesivo como hα9/mR4-EGFP), para R5 se construyó una variante done el 286° Gly se sustituyó por Ala (al que se hará referencia en lo sucesivo como hα9/mR5-EGFP) y para L1, se construyó una variante donde el 77° Lys se sustituyó por Arg, el 78° Asn se sustituyó por Thr, el 81° Thr se sustituyó por Ala, el 82° Ser se sustituyó por Pro y el 89° Glu se sustituyó por Gly (al que se hará referencia en lo sucesivo como hα9/mL1-EGFP) cada uno por mutagénesis dirigida al sitio.

Además, para la confirmación de que el dominio propelente β es sin dudas un epítopo, una variante donde todo el dominio propelente β se sustituyó por dominio propelente β de α4 de ser humano (al que se hará referencia en lo sucesivo como hα4/9-EGFP) se construyó de la siguiente manera. Debido a que la región entre el sitio BlpI y el sitio StuI de enzimas de restricción del gen α9 de ser humano corresponde exactamente al dominio propelente β, la región de gen α4 de ser humano que corresponde a la región se amplificó por PCR usando un cebador unido al sitio BlpI y el sitio StuI y vector de expresión de α4 de ser humano como una plantilla, se escindió con BlpI y StuI, y se intercambió con la región antes mencionada entre el sitio BlpI y el sitio StuI del vector de expresión de proteína de fusión de α9 de ser humano-EGFP .

Los vectores de expresión de los tipos antes mencionados de tipo salvaje y 5 de variantes se introdujeron respectivamente en células CHO para dar poblaciones de células expresadas transitoriamente. La expresión del α9-EGFP de tipo salvaje o variante y la reactividad con anticuerpos de este se evaluaron en primera instancia usando FACScan (BECTON DICKINSON).

La poblaciones de células que expresan α9 respectivas se hicieron reaccionar con anticuerpo de control o MΑ9-413 scFv-Fc diluido con 1% de BSA/PBS que contiene 2% de suero de conejo normal y 0,05% de NaN3 sobre hielo durante 30 min. Después del lavado, las poblaciones de células se hicieron reaccionar con anticuerpo IgG1 antiratón etiquetado con PerCP (BECTON DICKINSON) sobre hielo durante 30 min, se lavaron adicionalmente y se analizaron por FACScan. Los resultados se muestran en la Fig. 9. El eje horizontal muestra la expresión de α9-EGFP de tipo salvaje o variante y el eje vertical muestra reactividad con varios anticuerpos. El patrón de reacción de MΑ9-413 scFv-Fc difiere solo en hα9/mL1-EGFP, y la reactividad por cantidad de expresión es alta en comparación con otras variantes como hα9-EGFP. hα9/mL1-EGFP es una variante donde la región L1 se sustituye de una secuencia de ser humano a una secuencia de ratón. Debido a que MΑ9-413 reacciona más sólidamente con α9 de ratón que con α9 de ser humano, losresultadosmuestran claramente que el epítopo de MΑ9-413 es una región L1.

Luego, se llevó a cabo el análisis por Cell ELISA. Varias células después de aproximadamente 24 h desde la transfección genética se recogieron y se sembraron en una placa de 96 pocillos a 2x104 célula/100 μL/pocillo. El resto se llevó a cabo en las mismas condiciones que en el Ejemplo 11. Como resultado, como se muestra en la Fig. 10, solo hα9/mL1-EGFP tendía a reaccionar más con MΑ9-413 scFv-Fc que con hα9-EGFP de tipo salvaje. Los resultados aquí también sugieren que la región L1 es un epítopo de MΑ9-413.

Como se mencionó anteriormente, debido a que la información estructural respecto de la integrina α9 es muy pobre, la importancia de aclarar para la primera vez de un epítopo neutralizante es alta. Además, el impacto de los resultados en este momento que indican la posibilidad de que la región denominada L1, que no atrajo atención en la cadena αde otras familias de integrina, cumpla una función importante o sea capaz de volverse un objetivo para la inhibición funcional se consideramuy grande.

<<Ejemplo 15: Evaluación de eficacia de scFv-Fc paramodelo de artritis deratón -1»

scFv-Fc de MΑ9-413, para el cual se encontró que no solo el patrón de reacción sino también el epítopo eran regiones novedosas, se examinó respecto de si puede mostrar eficacia para el modelo de artritis en ratón o no.

En primer lugar, se examinó el efecto sobre la artritis inducida por anticuerpo de colágeno de ratón, que es uno de los modelos de artritis representativo. Un cóctel de anticuerpo anti-colágeno se administró al ratón y LPS se administró 3 días después para inducir el inicio de la artritis. El día de la administración de LPS y 3 días después, MΑ9-413 scFv-Fc se administró intraperitonealmente a 500, 170 o 56 μg/cabeza y anticuerpo de ratón de control se administró a 500 μg/cabeza (4 -8 ratones por grupo). Todas las patas del ratón se observaron con el tiempo y se puntuó la hinchazón y el perfil de valor promedio de cada grupo se muestra en la gráfica de la Fig. 11. Como resultado, se reconoció un efecto supresor de artritis dependiente de la concentración de MΑ9-413 scFv-Fc. En la puntuación del grupo de administración de 500 μg/cabeza el Día 6, el nivel de supresión fue casi equivalente al del grupo de administración de prednisolona en los grupos de control positivo y se confirmó una eficacia suficientemente fuerte, a saber, acción antiinflamatoria.

<<Ejemplo 16: evaluación de eficacia de scFv-Fc para modelo de artritis deratón -2»

Luego, se evaluó si MΑ9-413 scFv-Fc también mostraba eficacia para la artritis inducida por colágeno de ratón, que es oro modelo de artritis representativo. Mientras que la reacción de inflamación en la etapa agua es inducida en la artritis inducida por anticuerpo de colágeno en el Ejemplo 15, se sabe que la respuesta inflamatoria crónica es inducida en la artritis inducida por colágeno.

El inicio de la artritis fue inducido por la administración de colágeno tipo II de bovino a un ratón dos veces cada 3 semanas. A los 4 días, 6 días, 8 días, 10 días y 12 días de la segunda administración, MΑ9-413 scFv-Fc se administró intraperitonealmente a 500, 170, 56 μg/cabeza, un anticuerpo de ratón de control se administró intraperitonealmente a 500 μg/cabeza y etanercept se administró intraperitonealmente a 500, 150 μg/cabeza (10 ratones por grupo) como control positivo. Todas las patas del ratón se observaron con el tiempo y se puntuó la hinchazón y el perfil de valor promedio de cada grupo se muestra en la gráfica de la Fig. 12. ANM-2 es un nombre alternativo de MΑ9-413. Como resultado, se reconoció un efecto supresor de artritis dependiente de la concentración de MΑ9-413 scFv-Fc. En el grupo de administración de 500 μg/cabeza, se confirmó que el efecto supresor excedía el del grupo de administración de etanercept 500 μg/cabeza en el grupo de control positivo y la eficacia era suficientementefuerte.

«Ejemplo 17: Evaluación de eficacia de scFv-Fc para diferenciación de osteoclastos»

Además, el efecto de la diferenciación de osteoclastos en el modelo de artritis se examinó. En la artritis inducida por anticuerpo de colágeno de ratón usada en el Ejemplo 15 anterior, se recogieron células de médula ósea del fémur de ratón al día siguiente de la administración de LPS que induce artritis y se cultivó en un medio αMEM que contiene RANKL (concentración final de 30 ng/mL) y M-CSF (concentración final de 100 ng/mL) para inducir la diferenciación de osteoclastos. El medio de cultivo se intercambió una vez 3 días desde el inicio. El Día 7 desde el inicio del cultivo, se realizó tinción con TRAP (fosfatasa de ácido resistente al ácido tartárico) y la cantidad de las células teñidas se midió como osteoclastos. Como control negativo, se usó un anticuerpo anti-HBs. Como resultado, cuando se agregó MΑ9-413 (2 μg/ml) a las células de médula ósea de ratón que tienen artritis inducida, se suprimió en gran medida la diferenciación a osteoclastos (Fig. 13 superior). Además, cuando se usaron las células de médula ósea, que se recogieron la siguiente administración intravenosa de MΑ9-413 250 μg/cabeza al ratón simultáneamente con administración de LPS, se suprimióla diferenciación de osteoclastos (Fig. 13 inferior).

A partir de los resultados del Ejemplo 15 y Ejemplo 16 anteriores, se aclaró que MΑ9-413 tiene una acción para suprimir fuertemente las reacciones de inflamación de etapa aguda y etapa crónica. A partir de los resultados del Ejemplo 17 anterior, además, se sugirió fuertemente que MΑ9-413 tiene, junto con un efecto antiinflamatorio, una acción supresora de destrucción articular durante la inflamación. Por lo tanto, se espera que este clon se pueda utilizar comomedicamento más superior quemedicamentos convencionales para el tratamiento o profilaxis de artritis humana.

<<Ejemplo 18: Afinidadmejorada de MΑ9-413»

Debido a que MΑ9-413 es un anticuerpo que reacciona mucho con α9 de ratón en vez de α9 de ser humano, la afinidad puede no ser suficiente para la aplicación a artritis de seres humanos. Por lo tanto, la mejora de la afinidad se probó por alteración molecular de MΑ9-413. En la mayoría de los casos, en la región variable de anticuerpo, la región que contribuye en mayor medida con el reconocimiento de antígeno es la región CDR3 de VH. La secuencia de CDR3 de VH de MΑ9-413 es como se muestra en la SEQ ID NO: 4, donde el grupo de Tyr se configura de manera característica. Un modelo estructural estérico de región variable de este clon se preparó y analizó. Como resultado, se encontró que el 108° Tyr y el 109° Tyr se pueden configurar prominentemente particularmente en la superficie de unión al antígeno. Por lo tanto, para evaluar el papel de Tyr en el reconocimiento de antígenos, los vectores de expresión de scFv variante donde el 108° Tyr se sustituyó por Ala (al que se hará referencia en lo sucesivo como MΑ9-418) y scFv variante donde el 109° Tyr se sustituyó por Ala (al que se hará referencia en lo sucesivo como MΑ9-419) se construyeron por unmétodo demutagénesis dirigida por el sitio.

El scFv expresado por este vector se analizó por Cell ELISΑ. Como resultado, MΑ9-418 mostró una mejor reactividad con α9 de ratón y α9 de ser humano en comparación con MΑ9-413 y la reactividad de MΑ9-419 con α9 de ratón y α9 de ser humano desapareció en gran medida. Estos resultados sugieren que la sustitución del 108° Tyr por un aminoácido óptimo mejora la reactividad con α9 y la sustitución del 109° Tyr por otro aminoácido no se desea debido a que es esencial para el reconocimiento de antígenos.

Por lo tanto, un clon especifico se analizó con la reactividad de α9 de ser humano como índice, por un métodos de ingeniería evolucionaria (ciclo de mutagénesis—>filtrado—>selección —>amplificación) como sustitución de aminoácido específico del sitio del 108° y PCR propensa a errores usando kit de mutagénesis aleatoria de PCR diversificada (Clontech). Al realizar varios pasos de selección, 3 clones de HΑ9-107, HΑ9-143 y HΑ9-212 con mejor reactividad con α9 de ser humano se aislaron en última instancia.

Las secuencias base de ADN de estos clones se analizaron de la misma forma que en el Ejemplo 5 y las secuencias de aminoácidos se dedujeron. Las secuencias de los clone se muestran en la Fig. 14.

«Ejemplo 19: Expresión y purificación de scFv»

Usando los clones mencionados anteriormente MΑ9-418, HΑ9-107, HΑ9-143 y HΑ9-212 y la cepa de Escherichia coli JM83 como hospedadora de ADN plásmido, se expresó y purificó el scFv. El transformante de Escherichia coli se cultivó en medio 2xYT que contiene 2% de glucosa y 100 μg/mL de ampicilina, se agregó IPTG en la fase logarítmica a una concentración final de 1 mM y las células se cultivaron durante la noche para inducir la expresión de scFv. Luego de que se completó el cultivo, las células bacterianas se recuperaron, se suspendieron en 100 mM

de solución Tris-HCl (pH 7,4) que contenía 20% de sucrosa y 10 mM de EDTA y las células bacterianas se dejaron en reposo sobre hielo durante 30min. Luego, las células se centrifugaron a 8.900xg durante 30 min, el sobrenadante se recuperó y la fracción obtenida por filtración a través de un filtro de 0,45 μm se tomó como fracción periplásmica. Usando la fracción como material de partida, scFv se purificó según un método convencional por RPAS Purification Module (Amersham), y la fracción de elución obtenida se dializó contra PBS para dar un producto estándar de purificación scFv.

La reactividad del scFv purificado se analizó por Cell ELISA de la misma forma que en el Ejemplo 11 excepto que el anticuerpo anti-Etag etiquetado con HRP (Amersham) se usó para la detección. Como resultado, como se muestra en la Fig. 15, MΑ9-418, HΑ9-107, HΑ9-143 y HΑ9-212 mostraron mejor reactividad con α9 de ser humano en comparación con MΑ9-413, y particularmente HΑ9-212mostró un nivel notable demejora.

«Ejemplo 20: Construcción, expresión y purificación de scFv-Fc»

Usando MΑ9-418, HΑ9-107, HΑ9-143 y HΑ9-212, los genes scFv-Fc se construyeron de la misma forma que en el Ejemplo 9.

scFv-Fc se expresó por expresión transitoria usando célula Freestyle 293-F (Invitrogen) como hospedador. La transfección se llevó a cabo usando un reactivo de fectina 293 (Invitrogen) y la célula se cultivó en un medio de expresión Freestyle 293 (Invitrogen) durante 2-3 días y el sobrenadante de cultivo se recuperó por centrifugación y filtración con unfiltro de 0,22 μm.

La purificación se realizó por cromatografía en columna de proteína A según un método convencional. La solución scFv-Fc obtenida después de la diálisis con PBS se tomó como un producto purificado.

La reactividad del producto de purificación scFv-Fc preparado con α9 de ratón y α9 de ser humano se analizó por Cell ELISA de la misma manera que en el Ejemplo 11. Como resultado, MΑ9-418, HΑ9-107, HΑ9-143 y HΑ9-212 mostraronmejor reactividad con α9 de ser humano en comparación con MΑ9-413, como semuestra en la Fig. 16.

<<Ejemplo 21: Análisis del clon de variante de epítopo»

Para examinar si MΑ9-418, HΑ9-107, HΑ9-143 y HΑ9-212 reconocen la región L1 de α9 de lamisma manera que en MΑ9-413, se examinó lo siguiente. La concentración de anticuerpo de fago MΑ9-413 se fijó a determinado nivel, se llevó a cabo Cell ELISA de la misma forma que en el Ejemplo 4, donde scFv-Fc de cada variante se diluyó serialmente y se agregó simultáneamente con una muestra y se evaluó la presencia o ausencia de inhibición competitiva de anticuerpo de fago MΑ9-413. Como resultado, como se muestra en la Fig. 17, se confirmó la inhibición competitiva dependiente de la concentración. Por lo tanto, se sugirió firmemente que MΑ9-418, HΑ9-107, HΑ9-143 y HΑ9-212reconocen la región L1 de α9, como MΑ9-413.

«Ejemplo 22: Evaluación de actividad inhibidora de adhesióncelular dependiente de α9 de un clon variante»

Se evaluó scFv-Fc de cada clon variante para determinar la actividad inhibidora contra la adhesión celular dependiente de α9 de ser humano y α9 de ratón de la misma forma que en el Ejemplo 13. La Tabla 1 colectivamente muestra los valores de IC50. Se ha confirmado que todos los clones variantes tienen una actividad inhibidora fuerte contra α9 de ser humano en comparación con MΑ9-413 original. Particularmente, HΑ9-212 mostró una actividad inhibidora de aproximadamente 1000 veces más contra α9 de ser humano en comparación con MΑ9-413.

[Tabla 1]

α9 de ser humano: Α9 de ratón

MΑ9-413: 48,5 0,34

HΑ9-418: >10 0. 96

HΑ9-107: >10 0,067

HΑ9-143: 0,42 2,32

HΑ9-212: 0,053 3,30

unidad: μg/mL

«Ejemplo 23: Producción y preparación deIgG» El clon HΑ9-212 que mostró la mayor reactividad con α9 de ser humano se examinó para determinar la reactividad

en la forma molecular de IgG. La construcción genética de IgG se realizó según los siguientes procedimientos. En primer lugar, la región de gen VH de HΑ9-212 se amplificó por PCR y se insertó en el sitio de clonación del vector de expresión de cadena H humana. En este vector, una secuencia líder que promueve la expresión secretora extracelular, gen VH y un gen de la región constante de IgG1 humana se conectan y la expresión de estos se regula por un promotor CAG. Además, este vector contiene un gen de resistencia a la neomicina y un gen de resistencia a la ampicilina como genes de resistencia al fármaco. Luego, la región de gen VL de MΑ9-212 se amplificó por PCR y se insertó en el sitio de clonación del vector de expresión de cadena L humana. En este vector, una secuencia líder que promueve la expresión secretora extracelular, gen VL y un gen de la región constante de cadena K humana se conectan y la expresión de estos se regula por un promotor CAG. El vector tiene un gen dhfr y un gen de resistencia a la ampicilina.

IgG se expresó por expresión transitoria usando célula COS-7 y célula Freestyle 293-F (Invitrogen) como hospedadores.

La transfección en célula COS-7 se llevó a cabo usando Lipofectamina2000 (Invitrogen), y la transfección en célula Freestyle 293-F se llevó a cabo usando un reactivo de fectina 293 (Invitrogen) y, después del cultivo durante 2-3 días, el sobrenadante de cultivo serecuperó por centrifugación y filtración con un filtro de 0,22 μm.

<<Ejemplo 24: Análisis dereactividad deIgG»

La cantidad de expresión de IgG en el sobrenadante de cultivo se cuantificó por ELISA de cuantificación de IgG y la reactividad con α9 de ser humano y α9 de ratón en cada concentración de IgG se analizó por Cell ELISΑ. Se usó anticuerpo IgG(Fc) antihumano etiquetado por HRP (American Qualex) para la detección y el resto se llevó a cabo en las mismas condiciones que en el Ejemplo 11. Como resultado, como se muestra en la Fig. 18, se confirmó la reactividad dependiente de la concentración y específica con α9 de ser humano y α9 de ratón y particularmente se demostró una fuerte reactividad con α9 de ser humano. A partir de estos resultados, se confirmó que HΑ9-212 muestra reactividad con α9 incluso en la forma molecular de IgG.

De los resultados que anteceden, se confirmó que MΑ9-418, HΑ9-107, HΑ9-143 y HΑ9-212, que se obtuvieron mediante la alteración de MΑ9-413 tienen reactividad tanto con α9 de ratón como con α9 de ser humano, que MΑ9413 tiene, y muestran una reactividad mucho mejor con α9 de ser humano y una actividad inhibidora muy mejorada contra α9 de ser humano, mientras se mantiene la propiedad de reconocimiento de región de L1. Además, HΑ9-212 mostró reactividad fuerte con α9 de ser humano aun en la forma molecular de IgG. A partir de esto, se espera que la variante MΑ9-413 muestre mayor aplicabilidad como un medicamento para el tratamiento o profilaxis de artritis reumatoide, que es superior a MΑ9-413.

Aplicaciónindustrial

Dado que el anticuerpo monoclonal humano y un fragmento de anticuerpo de este de la presente invención tienen regiones variables de anticuerpo anti-integrina α9 derivado de ser humano, así como reactividad específica con integrinas α9 de ratón y humano, actividad inhibidora de adhesión celular dependiente de integrina α9, y además, acción supresora contra artritis, se espera que sean usados como nuevos fármacos para el diagnóstico, profilaxis o tratamiento de varias enfermedades implicadas por integrinas α9.

Esta aplicación se basa en la solicitud de patente n.°2007-340203 presentada en Japón (fecha de presentación: 28 de diciembre de 2007)

Listado de secuencias

<110> Astellas Pharma Inc. Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute

<120> Anticuerpo anti-integrina alpha-9 humano 5 <130> 091333

<150> JP2007-340203

<151> 2007-12-28

<160> 40

<170> PatentIn version 3.4 10 <210> 1

<211> 126

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 3

<211> 17

<212> PRT 25 <213> Homo sapiens

<400> 3

Gly

<210> 4

<211> 17

<212> PRT 5 <213> Homo sapiens

<400> 4

Val

<210> 5 10 <211> 378

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

15 <210> 6

<211> 111

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

<210> 7

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

25 <400> 7

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 9

<211> 7 10 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 10 15 <211> 333

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 10

20 <210> 11

<211> 756

<212> DNA

<213> Artificial

<220> 25 <223>enlazadorqueincluyescFv

<400> 11

<210> 12

<211> 126

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

10 <210> 13

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

<210> 14

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

<210> 15

<211> 17

<212> PRT 10 <213> Homo sapiens

<400> 15

15 <210> 16

<211> 378

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<210> 17

<211> 756

<212> DNA

<213> Artificial

25 <220>

<223> enlazador queincluye scFv

<400> 17

<210> 18

<211> 126

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 18

<210> 19

<211> 5 10 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 19

<210> 20

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 20

<210> 21

<211> 17

<212> PRT 10 <213> Homo sapiens

<400> 21

Val

<210> 22 15 <211> 378

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 22

20 <210> 23

<211> 756

<212> DNA

<213> Artificial

<220> 25 <223>enlazadorqueincluyescFv

<400> 23

<210> 24

<211> 126

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 24

<210> 25 10 <211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15 <210> 26

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 26

<210> 27

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 27

<210> 28

<211> 378

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<210> 29

<211> 756

<212> DNA

<213> Artificial

15 <220>

<223> enlazador queincluye scFv

<400> 29

<210> 30

<211> 126

<212> PRT

<213> Homo sapiens

25 <400> 30

<210> 31

<211> 5

<212> PRT 5 <213> Homo sapiens

<400> 31

<210> 32

<211> 17 10 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 32

<210> 33 15 <211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 33

20 <210> 34

<211> 378

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 34

<210> 35

<211> 756

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> enlazador queincluye scFv

<400> 35

10 <210> 36

<211> 1035

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 36

<210> 37

<211> 1036

<212> PRT

<213> ratón

<400> 37

<210> 38

<211> 430

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 38

<210> 39

<211> 430

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> proteína defusión

<400> 39

<210> 40

<211> 430

<212> PRT

<213> ratón

<400> 40

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un anticuerpo anti-integrina α9 de ser humano a o fragmento de anticuerpo que reconoce integrina α9 de ser humano e integrina α9 de ratón inhibe la reacción entre las integrinas α9 y ligandos, y que reconoce un epítopo que comprende residuos 104 (Arg) a 122 (Asp) de integrina α9 de ser humano (SEQ ID NO:36), y un epítopo que comprende residuos 105 (Arg} a 123 (Asp) de integrina α9 de ratón (SEQ ID NO:37).
2.

El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene (a) regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada y (b) regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (CDR1, CDR2, CDR3), dichas regiones consisten en las secuencias de aminoácidos mostradas por los siguientes números de identificación de secuencias, respectivamente.

(a)

Regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada CDR1, CDR2, CDR3 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15; SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21; SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27; o SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33;

(b)

Regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera CDR1, CDR2, CDR3 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:3
3.

El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada CDR1, CDR2, CDR3, dichas regiones consisten en las secuencias de aminoácidos mostradas por SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, y SEQ ID NO:33, respectivamente.
4.

El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada por cualquiera de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:24, y SEQ ID N0:30, y una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada por SEQ ID NO:6.
5.

El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 4, que tiene una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada por SEQ ID NO:30.
6.

El anticuerpo anti-integrina α9 de ser humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el anticuerpo es un anticuerpo completo.
7.

El fragmento de anticuerpo anti-integrina α9 de ser humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el fragmento de anticuerpo es scFv o scFv-Fc.
8.

Un gen que codifica el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9.

Un vector de expresión recombinante que comprende el gen de acuerdo con la reivindicación 8.
10.

Un transformante que incorpora el gen de acuerdo con la reivindicación 8.
11.

Un método no terapéutico y no diagnóstico para producir un anticuerpo anti-integrina α9 de ser humano o fragmento de anticuerpo permitiendo que el gen de acuerdo con la reivindicación 8 sea expresado en un hospedador.
12.

Un agente profiláctico o terapéutico para artritis reumatoide que comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
13.

Un uso del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en la producción de un agente profiláctico o terapéutico para artritis reumatoide.
14.

El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para el uso en la prevención o tratamiento de artritis reumatoide.

FIG. 8

FIG. 14

FIG. 15

FIG. 16

FIG. 17

Antígeno: SW480/H α 9 Muestras: fago de expresión de scFv-Fc de cada clon Detección: anticuerpo anti-M13 marcado HRP

FIG. 18