JPWO2019230823A1 - 抗体を取得する方法、抗体の特定方法、抗体の製造方法、及び抗体 - Google Patents
抗体を取得する方法、抗体の特定方法、抗体の製造方法、及び抗体 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2019230823A1 JPWO2019230823A1 JP2020522261A JP2020522261A JPWO2019230823A1 JP WO2019230823 A1 JPWO2019230823 A1 JP WO2019230823A1 JP 2020522261 A JP2020522261 A JP 2020522261A JP 2020522261 A JP2020522261 A JP 2020522261A JP WO2019230823 A1 JPWO2019230823 A1 JP WO2019230823A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- recognizes
- group
- amino acid
- target substance
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 66
- 239000013076 target substance Substances 0.000 claims abstract description 84
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 56
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 9
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 72
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 63
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 claims description 36
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 25
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 6
- 241001416177 Vicugna pacos Species 0.000 claims description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 72
- 239000000178 monomer Substances 0.000 abstract description 5
- 230000008685 targeting Effects 0.000 abstract description 3
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 35
- 229940022353 herceptin Drugs 0.000 description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 21
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 17
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 13
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 9
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 9
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 9
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 8
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 8
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 7
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 7
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 6
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102400000368 Surface protein Human genes 0.000 description 5
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 244000005709 gut microbiome Species 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 4
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 3
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 3
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 description 2
- 241001115402 Ebolavirus Species 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 2
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 241000282842 Lama glama Species 0.000 description 2
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 2
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 2
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 2
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000007159 enucleation Effects 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 2
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 2
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 2
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 description 2
- -1 3-Dimethylaminopropyl Chemical group 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 241000239290 Araneae Species 0.000 description 1
- 101100314454 Caenorhabditis elegans tra-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282828 Camelus bactrianus Species 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108010042653 IgA receptor Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 235000002245 Penicillium camembertii Nutrition 0.000 description 1
- 235000002233 Penicillium roqueforti Nutrition 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102100034014 Prolyl 3-hydroxylase 3 Human genes 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003505 heat denaturation Methods 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DCPMPXBYPZGNDC-UHFFFAOYSA-N hydron;methanediimine;chloride Chemical compound Cl.N=C=N DCPMPXBYPZGNDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
- C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1072—Differential gene expression library synthesis, e.g. subtracted libraries, differential screening
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/005—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies constructed by phage libraries
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1037—Screening libraries presented on the surface of microorganisms, e.g. phage display, E. coli display
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
精製したHer2の注射による、1頭のアルパカにおける免疫応答は、公知の方法に従って実施した。なお、用いたHer2は、ニッケル固相化アフィニティー樹脂(GE healthcare社製)を使用して、Her2を過剰発現した腫瘍細胞から調製した。
ヒトHer2の細胞外領域のN末端624アミノ酸残基と、ヒスチジン(His)タグ(6×His)を使用した。プラスミドは80kDaのHer2−His融合タンパク質を発現させ、培養上清に分泌させた。ヒト胎児腎臓細胞(HEK293)を、Her2−Hisコンストラクトにより一過性にトランスフェクトし、さらに処理するために培養上清を回収した。Her2−His融合体を、ニッケル固相化カラムにより上清から精製した。免疫沈降法によりHer2−His融合体の機能を評価した。
ハーセプチン(Herceptin)は、マウスモノクローナル抗体より誘導された、抗Her2治療用のキメラ抗体(trastuzumab)である(Carter P,
Presta L, Gorman CM, Ridgway JB, Henner
D, Wong WL, Rowland AM, Kotts C, Carver
ME, Shepard HM. Humanization of an anti−p185HER2 antibody for human cancer therapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 May 15;89(10):4285−9.)。ハーセプチンのモノクローナル抗体を公知の方法に従って調製した(Anti−erbB−2(Her−2/neu)[4D5−8(trastuzumab)]Absolute antibody社)。
ヒト胎児腎臓細胞(HEK293)中で産生されたHer2−His融合タンパク質は、ニッケル固相化カラムにより培養液上清から精製された。磁気ビーズの製造業者(Invitrogen)の推奨条件に従い、タンパク質に含まれる第一級アミノ基と磁気ビーズ表面に存在する活性基(Carboxylic acid)を、50mg/mL EDC(1−エチル−3−(−3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩)と50mg/mL NHS(N−ヒドロキシスクシンイミド)試薬を使い共有結合した。
Her2の注射による、免疫応答をおこした1頭のアルパカの血液から、リンパ球を回収した。リンパ球に含まれるVHH抗体の遺伝子配列群(VHH抗体遺伝子ライブラリー)の取得、およびその遺伝子配列群を持つファージ群の作製(VHH抗体ファージライブラリー)は、公知の方法を参照して実施した。
Her2−His融合タンパク質をつけた磁気ビーズ200μL分を、1μgのハーセプチンモノクローナル抗体とともに、1.5mL容量のサンプルチューブに入れ、さらにファージ(10000000個以上)を加えて、ひと晩撹拌することで結合を飽和させた。以下、実施例5と同様の方法で、ハーセプチンモノクローナル抗体が結合したHer2−His融合タンパク質の磁気ビーズに結合してきたVHH抗体の遺伝子配列群を、プラスミドの形で精製した。
実施例5および実施例6で取得したVHH抗体の遺伝子配列群に含まれる遺伝子配列は、次世代シーケンス解析により解読した。たとえば、illumina_MiSeq_Amplicon_Deep_Sequence法によって、10万種類の遺伝子配列を解読することができる。VHH抗体の遺伝子配列のうち、500塩基対以下の部分をターゲット領域として、その部分に含まれる遺伝子配列を解読した。ターゲット領域を増幅するためのプライマーとして5’gaaatacctattgcctacggc(5’側、配列番号1)と5’ggaaccgtagtccggaacgtc(3’側、配列番号2)を設計した。ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)でこれらのプライマーセットを使うことで、VHH抗体の遺伝子配列のうち、500塩基対以下の部分のターゲット領域を増幅した。さらに、次世代シーケンサーに固有の指定配列 5’TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG−(配列番号3)と5’GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG−(配列番号4)を上記プライマーにそれぞれ融合したプライマーセットを用いることで、製造業者(イルミナ社)が推奨する方法でillumina_MiSeq_Amplicon_Deep_Sequence法によるターゲット領域の遺伝子配列を解読した。
遺伝子配列群からアミノ酸配列群への翻訳は、市販の解析ソフトウェアでおこなった(Genetyx社)。これらの遺伝子配列群及びアミノ酸配列群のうち、末端の配列が使用したプライマーと完全に一致するもの、ターゲット領域の塩基長が401塩基対以上であるもの、リードカウント数が2以上であるもの、ベクター配列に含まれるヒスタグ配列(6×His)を含むもの、を選び出した。さらに、遺伝子配列が異なっていてもアミノ酸配列が同一であるものを合算して、出現頻度(リードカウント数)が高いアミノ酸配列の順にまとめた。
実施例8に従い、実施例5で得られたHer2と相互作用するVHH抗体のアミノ酸配列群のリストを作製した。Her2と相互作用するVHH抗体のアミノ酸配列は18640種類であった。
実施例8に従い、実施例6で得られたHer2と相互作用するタンパク質(ハーセプチンモノクローナル抗体)が存在する環境下でHer2と結合するVHH抗体のアミノ酸配列群のリストを作製した。Her2と相互作用するタンパク質(ハーセプチンモノクローナル抗体)が存在する環境下でHer2と相互作用するVHH抗体のアミノ酸配列は13670種類であった。
具体的には、以下の群に含まれるアミノ酸配列を選択し、C群を取得した。
A群に含まれているアミノ酸配列(リード数=2以上)で、かつB群には含まれないアミノ酸配列(リード数=0)を選ぶ(C0群=200種類)。
A群に含まれているアミノ酸配列(リード数=20以上)のうち、B群にはその10分の1以下のリード数しか現れないアミノ酸配列(リード数=2以上)を選ぶ(C1/10群=360種類)。
A群に含まれているアミノ酸配列(リード数=4以上)のうち、B群にはその半分以下のリード数しか現れないアミノ酸配列(リード数=2以上)を選ぶ(C1/2群=5000種類)。
C群はC0群とC1/10群とC1/2群に含まれるアミノ酸配列を合算したのちに、これら3群間で重複するアミノ酸配列を除いたものの集合である(C群=5500種類)。
C0群に含まれるアミノ酸配列はいずれも200アミノ酸残基以下からなり、そのアミノ酸配列をコードする遺伝子配列は、製造業者(ユーロフィン社)が提供する最適化された遺伝子配列(ここでの最適化された遺伝子配列とは、たとえば、合成しやすい、分解されにくい、塩基が偏っていない、配列の繰り返しが少ない、二次構造を取りにくいなどの遺伝子配列のこと)として人工的に合成することができた。人工的に合成された遺伝子は、任意の発現ベクターに組み込むことができた。
発現ベクターに組み込んだ人工遺伝子をプラスミドとして大腸菌(BL21株)に遺伝子導入することで、人工遺伝子がコードするVHH抗体タンパク質を大腸菌に発現させることができた。具体的には、人工遺伝子にコードされたアミノ酸配列の発現は、当該大腸菌が対数増殖期にあるときにIPTGを添加することで行った。発現されたアミノ酸配列(VHH抗体にヒスタグが付加されている)は、製造業者(GE Healthcare)が推奨する方法でニッケル固相化樹脂カラムを使って精製した。
実施例13で得られた精製VHH抗体の一部を使って、細胞組織の蛍光染色を行った。二次抗体としてウサギ抗ヒスタグ抗体(Abcam社)を、三次抗体として赤色蛍光ラベルした抗ウサギIgG抗体(Thermo Fisher社)を使った。同時にハーセプチンモノクローナル抗体でも染色を行った。検出試薬として、二次抗体として緑色蛍光ラベルした抗マウスIgG抗体(Thermo Fisher社)を使った。試料としては、ハーセプチンモノクローナル抗体が結合することが既知のがん患者の組織切片を用いた。
Claims (20)
- 目的物質を認識する抗体群から、対照物質を認識する抗体群をサブトラクトすることを特徴とする、目的物質を特異的に認識する抗体を取得する方法。
- 抗体がVHH抗体である、請求項1に記載の方法。
- サブトラクトが次世代シーケンサーの結果の差異を検出する、請求項1又は2に記載の方法。
- 抗体が哺乳類細胞の分類用である、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
- 抗体が生物の階級の分類用である、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
- 抗体がウイルスの分類用である、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
- 抗体が分子のクラス分類用である、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記目的物質を認識する抗体群から、前記対照物質を認識する抗体群をサブトラクトすることは、前記目的物質を認識する抗体群のアミノ酸配列と、前記対照物質を認識する抗体群のアミノ酸配列と、の比較を行うことを含む、請求項1から7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記目的物質を特異的に認識する抗体は、前記目的物質を認識する抗体群に含まれ、
前記対照物質を認識する抗体群における、前記目的物質を特異的に認識する抗体の数は、所定基準以下である、請求項1から8のいずれか1項に記載の方法。 - 請求項1から9のいずれか1項に記載の方法により取得された抗体。
- 抗体がペプチドである、請求項10記載の抗体。
- 目的物質を認識する抗体群のアミノ酸配列と、対照物質を認識する抗体群のアミノ酸配列と、の比較を行うことにより、前記対照物質と比較して前記目的物質を選択的に認識する抗体を特定する工程を含む、抗体の特定方法。
- 前記特定する工程において特定される抗体は、前記目的物質を認識する抗体群に含まれ、
前記対照物質を認識する抗体群における、前記特定する工程において特定される抗体の数は、所定基準以下である、請求項12に記載の特定方法。 - 前記対照物質は、前記目的物質の標的部位が修飾された構造を有し、
前記特定する工程において特定される抗体は、前記目的物質の前記標的部位を、前記目的物質の他の部位と比較して選択的に認識する、請求項12又は13に記載の特定方法。 - 前記抗体を産生する動物に前記目的物質を投与する工程と、
前記動物において誘導された抗体群のうち、前記目的物質を認識する抗体群のアミノ酸配列を解読する工程と、
前記動物において誘導された抗体群のうち、前記対照物質を認識する抗体群のアミノ酸配列を解読する工程と、
をさらに含む、請求項12から14のいずれか1項に記載の特定方法。 - 前記動物において誘導された前記抗体群を産生する遺伝子配列を解読する工程をさらに含み、
前記目的物質を認識する抗体群のアミノ酸配列を解読する工程は、
前記解読された遺伝子配列を有する遺伝子が導入されたファージを前記目的物質と相互作用させる工程と、
前記目的物質と結合したファージに導入されている遺伝子配列に対応するアミノ酸配列を、前記目的物質を認識する抗体のアミノ酸配列として特定する工程と、
を含み、
前記対照物質を認識する抗体群のアミノ酸配列を解読する工程は、
前記解読された遺伝子配列を有する遺伝子が導入されたファージを前記対照物質と相互作用させる工程と、
前記対照物質と結合したファージに導入されている遺伝子配列に対応するアミノ酸配列を、前記対照物質を認識する抗体のアミノ酸配列として特定する工程と、
を含む、請求項15に記載の特定方法。 - 前記動物において誘導された前記抗体群を産生する遺伝子の遺伝子配列を解読する工程は、前記動物から得られたリンパ球に含まれる抗体の遺伝子の遺伝子配列を解読することを含む、請求項15又は16に記載の特定方法。
- 前記抗体はVHH抗体であり、前記動物はアルパカである、請求項15から17のいずれか1項に記載の特定方法。
- 請求項12から18のいずれか1項に記載の特定方法に従って、前記対照物質と比較して前記目的物質を選択的に認識する抗体のアミノ酸配列を特定する工程と、
前記特定されたアミノ酸配列を有する抗体を製造する工程と、
を含むことを特徴とする、抗体の製造方法。 - 請求項19に記載の製造方法に従って製造された抗体。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2018103024 | 2018-05-30 | ||
JP2018103024 | 2018-05-30 | ||
PCT/JP2019/021353 WO2019230823A1 (ja) | 2018-05-30 | 2019-05-29 | 抗体を取得する方法、抗体の特定方法、抗体の製造方法、及び抗体 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2019230823A1 true JPWO2019230823A1 (ja) | 2021-07-08 |
Family
ID=68698880
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020522261A Pending JPWO2019230823A1 (ja) | 2018-05-30 | 2019-05-29 | 抗体を取得する方法、抗体の特定方法、抗体の製造方法、及び抗体 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20210079385A1 (ja) |
EP (1) | EP3805388A4 (ja) |
JP (1) | JPWO2019230823A1 (ja) |
CN (1) | CN112204142A (ja) |
WO (1) | WO2019230823A1 (ja) |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009084671A1 (ja) * | 2007-12-28 | 2009-07-09 | Astellas Pharma Inc. | ヒト抗α9インテグリン抗体 |
WO2013115425A1 (en) * | 2012-01-31 | 2013-08-08 | Scripps Korea Antibody Institute | Methods for screening an antibody by one-cycle panning |
US20130244883A1 (en) * | 2011-09-27 | 2013-09-19 | The Governing Council Of The University Of Toronto | Molecular Display Method |
JP2015119637A (ja) * | 2013-11-22 | 2015-07-02 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | 低分子化抗体のスクリーニング方法及び製造方法 |
JP2017036258A (ja) * | 2015-08-07 | 2017-02-16 | パナソニックIpマネジメント株式会社 | インフルエンザウィルスに結合する抗体 |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0934953A2 (en) * | 1997-12-03 | 1999-08-11 | Boehringer Mannheim Corporation | Complex specific antibodies, method of preparation and uses thereof |
JP2005289809A (ja) | 2001-10-24 | 2005-10-20 | Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) | 突然変異重鎖抗体 |
WO2005117969A2 (en) * | 2004-04-26 | 2005-12-15 | Centocor, Inc. | Solution phase biopanning method using engineered decoy proteins |
US20080003617A1 (en) * | 2004-12-20 | 2008-01-03 | Xiaomin Fan | Methods for the identification and the isolation of epitope specific antibodies |
CN101086501A (zh) * | 2006-06-09 | 2007-12-12 | 北京大学 | 一种蛋白质芯片 |
JP6324974B2 (ja) * | 2012-10-12 | 2018-05-23 | アリゾナ ボード オブ リージェンツ オン ビハーフ オブ アリゾナ ステート ユニバーシティ | タウの毒性オリゴマー形態を特異的に認識する抗体ベースの試薬 |
DK3072976T3 (da) * | 2013-11-22 | 2020-10-19 | Molcure Inc | Fremgangsmåde til bestemmelse og system til bestemmelse af polypeptid-binding til målmolekyle |
DE102015003503A1 (de) * | 2015-03-20 | 2016-09-22 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Spezifisch Amyloid-Beta bindende Peptide und deren Verwendung für die Therapie und Diagnose der Alzheimerschen Demenz |
JP2017014112A (ja) | 2015-06-26 | 2017-01-19 | 国立大学法人埼玉大学 | 抗サバイビン抗体又は抗体誘導体及びそれらの利用 |
JP6440233B2 (ja) | 2018-04-05 | 2018-12-19 | 株式会社虎の穴 | 人形 |
-
2019
- 2019-05-29 WO PCT/JP2019/021353 patent/WO2019230823A1/ja active Application Filing
- 2019-05-29 CN CN201980035466.6A patent/CN112204142A/zh active Pending
- 2019-05-29 JP JP2020522261A patent/JPWO2019230823A1/ja active Pending
- 2019-05-29 EP EP19811422.5A patent/EP3805388A4/en not_active Withdrawn
-
2020
- 2020-11-30 US US17/106,808 patent/US20210079385A1/en active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009084671A1 (ja) * | 2007-12-28 | 2009-07-09 | Astellas Pharma Inc. | ヒト抗α9インテグリン抗体 |
US20130244883A1 (en) * | 2011-09-27 | 2013-09-19 | The Governing Council Of The University Of Toronto | Molecular Display Method |
WO2013115425A1 (en) * | 2012-01-31 | 2013-08-08 | Scripps Korea Antibody Institute | Methods for screening an antibody by one-cycle panning |
JP2015119637A (ja) * | 2013-11-22 | 2015-07-02 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | 低分子化抗体のスクリーニング方法及び製造方法 |
JP2017036258A (ja) * | 2015-08-07 | 2017-02-16 | パナソニックIpマネジメント株式会社 | インフルエンザウィルスに結合する抗体 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
EXPERIMENTAL CELL RESEARCH, vol. 318, JPN6023018395, 2012, pages 1112 - 1124, ISSN: 0005052060 * |
IMMUNOLOGY, vol. 149, JPN6023018396, 2016, pages 111 - 121, ISSN: 0005052061 * |
PLOS ONE, vol. Vol.5, No.1, e8818, JPN6023018394, 2010, pages 1 - 12, ISSN: 0005052059 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN112204142A (zh) | 2021-01-08 |
EP3805388A4 (en) | 2021-08-18 |
WO2019230823A1 (ja) | 2019-12-05 |
US20210079385A1 (en) | 2021-03-18 |
EP3805388A1 (en) | 2021-04-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4421900B2 (ja) | モチーフ・グラフトされたハイブリッドポリペプチドおよびその使用 | |
US20190391159A1 (en) | Compositions and methods for rapid production of versatile nanobody repertoires | |
KR20130135028A (ko) | 동물로부터 단일클론 항체의 고속 분리 | |
CN105924519A (zh) | 全面单克隆抗体产生 | |
EP4151784A1 (en) | Rapid single-step gradient method for the generation of nanoantibodies | |
EP1746157A1 (en) | Method of proliferating plasma cell | |
CN111848750B (zh) | 一种快速富集和检测2019-nCoV的方法及试剂盒 | |
JPWO2019230823A1 (ja) | 抗体を取得する方法、抗体の特定方法、抗体の製造方法、及び抗体 | |
Xu et al. | scFv antibodies against infectious bursal disease virus isolated from a combinatorial antibody library by flow cytometry | |
US20240002475A1 (en) | Compositions and methods for rapid production of versatile single domain antibody repertoires | |
CN115975015A (zh) | 一种小反刍兽疫病毒(pprv)f蛋白纳米抗体和纳米抗体的制备、纯化及中和试验方法 | |
CN117843766A (zh) | 高亲和力的抗鸡传染性法氏囊病毒的scFv抗体的制备及其应用 | |
CN111925425A (zh) | 甲胎蛋白特异性结合多肽及应用 | |
Paspaltsis et al. | Application of antibody phage display to identify potential antigenic neural precursor cell proteins | |
CN110702913A (zh) | 一种用于定量检测贝氏柯克斯体i相株的单抗组合物 | |
US20020090606A1 (en) | Method and specific phage library for high throughput proteomics | |
CN117683131B (zh) | 一种抗髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(mog)抗体及其应用 | |
CN115058431B (zh) | mEOS纳米抗体及其制备方法和应用 | |
CN108753734B (zh) | 抗树鼩cd8分子单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株与应用 | |
TW201536919A (zh) | 對gfp抗原具有專一性之單株抗體、融合瘤細胞株及其用途 | |
CN107001477A (zh) | 经稳定化且自主的抗体vh结构域 | |
Dorosky et al. | Nanobodies as potential tools for microbiological testing of live biotherapeutic products | |
Zhu et al. | Potential use of single-chain Fv proteins for human and animal health | |
CN117209605A (zh) | 特异性结合il-15的抗体及其应用 | |
AU2003231995B2 (en) | Motif-grafted hybrid polypeptides and uses thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20201208 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20220527 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230509 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230710 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230929 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20231128 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20240325 |