WO2009084671A1 - ヒト抗α９インテグリン抗体 - Google Patents

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antibody
integrin
human
mouse
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Masaharu Torikai
Daisuke Ishikawa
Toshihiro Nakashima
Hirofumi Higuchi
Fumihiko Sakai
Nobuchika Yamamoto
Hirotada Fujita
Katsunari Taguchi
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Astellas Pharma Inc.
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Definitions

  • the present invention relates to a human anti- ⁇ 9 integrin antibody and use thereof.
  • a human anti- ⁇ 9 integrin antibody that binds to a loop region designated L1 of human and mouse ⁇ 9 integrin protein, inhibits ⁇ 9 integrin-dependent cell adhesion, and has an inhibitory effect on arthritis, and the antibody fragment
  • the present invention relates to the diagnosis, prevention or treatment of autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, immune diseases such as allergies and graft rejection, and other diseases in which ⁇ 9 integrin is involved in pathogenesis using the antibody and antibody fragment.
  • Integrin is one of the cell surface glycoproteins and functions mainly as a cell adhesion to extracellular matrix (collagen, laminin, etc.) and as a receptor for immunoglobulin family members (ICAM-1, VCAM-1, etc.). It is an adhesion molecule involved in signal transmission from the extracellular matrix. Thereby, the cell receives a signal from the extracellular matrix, and differentiation, proliferation, cell death, etc. are induced. Integrins are heterodimers composed of two subunits, ⁇ chain and ⁇ chain, there are different ⁇ chains and ⁇ chains, various combinations, and 24 types of integrin superfamily. Integrin knockout mice are fatal or pathological in all subunits, suggesting that individual integrins are required to maintain life. This suggests that integrins that convey the surrounding environment to cells and promote responses are functioning in all aspects of life phenomena and are involved in various pathological conditions.
  • integrins that are essential for survival are thought to play a role in pathological conditions, and there are cases where the inhibition works to improve pathological conditions.
  • an inhibitor of integrin ⁇ IIb ⁇ 3 specific for platelets is approved as PCTA restenosis drug abciximab (trade name: ReoPro; Eli Lilly).
  • the ⁇ 4 ⁇ 1 (VLA4) inhibitor natalizumab (trade name: Antegren; ELAN) is approved as a therapeutic agent for multiple sclerosis.
  • the ⁇ v ⁇ 3 inhibitor Vitaxin (MEDIMMUNE) is currently undergoing clinical trials due to its angiogenesis inhibitory action, osteoclast activation inhibitory action, and the like.
  • Integrin ⁇ 9 ⁇ 1 is expressed in macrophages, NKT cells, dendritic cells (Dendritic® cells), and neutrophils, and is said to play an important role in infiltration and adhesion of these inflammatory cells, bone resorption, and the like. Recently, the involvement of integrin ⁇ 9 ⁇ 1 has been reported in the formation of osteoclasts, suggesting the involvement in bone destruction (Non-patent Document 1). As the ligand, truncated osteopontin (N-terminal OPN), VCAM-1, Tenascin-C and the like are known. Also in clinical practice, a significant increase in integrin ⁇ 9 ⁇ 1 has been observed in the synovial tissue of rheumatoid arthritis patients (Non-patent Document 2).
  • a monoclonal antibody that specifically binds to ⁇ 9 integrin protein and has an activity to inhibit ⁇ 9 integrin-dependent cell adhesion can be developed, it can be used for diagnosis, prevention or treatment of various diseases in which ⁇ 9 integrin is involved in pathogenesis. Expected to be useful.
  • Non-patent Document 3 mouse monoclonal antibody Y9A2
  • Mouse monoclonal antibodies 1K11, 24I11, 21C5 and 25B6 Patent Document 1
  • these antibodies have been shown by in vitro experiments to be able to suppress human ⁇ 9 integrin-dependent cell adhesion, they do not have cross-reactivity with mouse or rat ⁇ 9 integrin. It is not suitable for use in experiments such as in vivo drug efficacy evaluation.
  • hamster monoclonal antibodies 11L2B, 12C4'58, 18R18D and 55A2C have been reported as antibodies exhibiting a function-inhibiting action against mouse ⁇ 9 integrin.
  • Patent Document 1 hamster monoclonal antibodies 11L2B, 12C4'58, 18R18D and 55A2C
  • mice Even if an anti-human ⁇ 9 integrin antibody is obtained and functional evaluation is performed in vitro, if it does not show cross-reactivity with mouse or rat ⁇ 9 integrin, models of various inflammatory diseases are mice. Since most systems use rats and rats, it is difficult to evaluate the efficacy of the antibody. In addition, even if anti-mouse ⁇ 9 integrin antibody is obtained and drug efficacy is evaluated using a pathological model system of in vivo, and a therapeutic or prophylactic effect is found, if it does not show cross-reactivity with human ⁇ 9 integrin, It cannot be applied to human pathologies as an antibody drug.
  • an anti-human ⁇ 9 monoclonal antibody such as Y9A2 is developed as an antibody drug based on the drug efficacy data obtained using the anti-mouse ⁇ 9 integrin antibody, it is an antibody and development product used for acquiring pharmacological data.
  • a great deal of effort is required to prove equivalence with antibodies. Therefore, for example, it is desirable to have an antibody that exhibits a function-inhibiting action on both mice and humans.
  • obtaining such an antibody can be said to be difficult in principle by conventional methods for immunizing mice. .
  • an anti-human ⁇ 9 monoclonal antibody prepared by some technique is developed as an antibody drug to overcome such difficulties, if the antibody is an antibody derived from a non-human animal, it is administered to humans Because of its high immunogenicity, it is recognized and excluded as a foreign substance. Therefore, it is difficult to use such antibodies as therapeutic agents for diseases.
  • ⁇ 9 integrin has little structural information such as three-dimensional structure, ligand binding site, and neutralizing epitope. If such information is obtained, it can be used for research on ⁇ 9 integrin and its application to medicine. It is expected that new paths will be opened and the contributions can be enormous.
  • an object of the present invention is to provide a human anti- ⁇ 9 integrin antibody that has specific reactivity with both human ⁇ 9 integrin and mouse ⁇ 9 integrin and has both safety and therapeutic effects.
  • the novel prevention or treatment of various diseases in which ⁇ 9 integrin is involved in pathogenesis by utilizing the anti- ⁇ 9 integrin antibody's strong anti-inflammatory action and bone destruction inhibiting action by blocking the interaction between ⁇ 9 integrin and its multiple ligands Is to provide a means.
  • the present inventors prepared ⁇ 9 integrin-expressing cells and directly reacted with an antibody phage library displaying human antibodies on the cells, thereby allowing humans having specific reactivity to mouse ⁇ 9 integrin and human ⁇ 9 integrin.
  • the present inventors have found that the antibodies and antibody fragments inhibit ⁇ 9 integrin-dependent cell adhesion, have a therapeutic effect on a plurality of arthritis models, and suppress osteoclast differentiation in the models. That is, the present invention has been completed by demonstrating that the antibody and the antibody fragment have both safety and therapeutic effects.
  • the present invention includes the following 1) to 16) as medically or industrially useful methods and substances.
  • a method for preventing or treating rheumatoid arthritis in a subject comprising the step of administering to the subject a therapeutically effective amount of the antibody or antibody fragment described in any one of 1) to 8) above.
  • the human monoclonal antibody and the antibody fragment of the present invention have the variable region of a human-derived anti- ⁇ 9 integrin antibody, specific reactivity with human and mouse ⁇ 9 integrin, and inhibitory activity against ⁇ 9 integrin-dependent cell adhesion, Has an inhibitory effect on arthritis.
  • the epitope was a loop region (named L1) that has not been reported in other integrin families.
  • the antibody and the antibody fragment according to the present invention are fully human antibodies, they can be expected to be used as new diagnostic, preventive or therapeutic agents for various diseases involving ⁇ 9 integrin.
  • the scFv display phage library can be prepared as follows. Immunoglobulin heavy (H) chain and light (L) chain cDNA is synthesized from peripheral blood B lymphocytes collected from a plurality of healthy subjects by RT-PCR. Next, various primers are combined to amplify the H chain variable region (VH) and L chain variable region (VL), and bind them together with linker DNA, thereby randomly combining VH and VL derived from healthy lymphocytes. To create a library of scFv genes. By incorporating this scFv gene into a phagemid vector (eg, pCANTAB5E), a healthy person-derived scFv display phage library consisting of about 10 8 to 10 11 clones can be constructed.
  • a phagemid vector eg, pCANTAB5E
  • the ⁇ 9 integrin that is an antigen can be prepared as follows. Since ⁇ 9 integrin (hereinafter also simply referred to as “ ⁇ 9”) is a membrane protein, the ⁇ 9 gene can be cloned, introduced into cultured cells, and artificially expressed on the surface of cultured cells. A cDNA library or the like may be used as a gene cloning template. In order to express it on the cell surface, it is usually necessary to have a signal sequence at the N-terminal portion. Therefore, the signal sequence inherent in ⁇ 9 may be used, or the gene region encoding mature ⁇ 9 may be used as another signal. It may be linked to an array. Regarding the antibody to be produced, it is necessary to evaluate the species specificity and the like to determine the use and possibility of the antibody. Therefore, it is desirable to obtain genes for both human ⁇ 9 and mouse ⁇ 9.
  • the ⁇ 9 gene containing the signal sequence obtained as described above is cloned into an expression vector such as a pcDNA3.1 (-) vector (Invitrogen).
  • a pcDNA3.1 (-) vector Invitrogen
  • ⁇ 4 is said to have the highest homology with ⁇ 9. For this reason, it is desirable to perform the same operation for ⁇ 4 integrin and clone it into an expression vector for use as a control for ⁇ 9.
  • the constructed expression vector is introduced into cultured cells such as CHO cells and SW480 cells by transfection using Lipofectamine 2000 (Invitrogen) or the like. Only expression cells can be selected using an expression vector marker (neomycin or the like), and the obtained cells can be used for subsequent screening and evaluation. About the expression cell, it is good to obtain the cell which shows a high expression level more stably by cloning by a limiting dilution method etc. and making it a uniform cell population.
  • the library is reacted with CHO cells and subtracted, and then bound to mouse ⁇ 9-expressing CHO cells, collected and concentrated, and screened for anti- ⁇ 9 scFv display phage clones.
  • an antigen not a cell itself but a membrane fraction can be prepared and used, or an antigen can be purified from a membrane fraction and used.
  • the scFv of the clone thus obtained is prepared and the reactivity with ⁇ 9 expressing cells is confirmed.
  • an expression method of scFv for example, it can be expressed in E. coli.
  • Escherichia coli it can be expressed by functionally binding scFv to be expressed such as a commonly used useful promoter and a signal sequence for antibody secretion.
  • the promoter include lacZ promoter and araB promoter.
  • a signal sequence for secretion of scFv a pelB signal sequence (J. Bacterio R1987, 169: 4379-4383) may be used when expressed in the periplasm of E. coli.
  • the signal sequence of g13 protein of M13 phage can also be used.
  • the scFv expressed inside and outside the cell can be separated from the host and purified to homogeneity.
  • scFv expressed in the pCANTAB5E system has an Etag sequence added to its C terminus and can be easily purified in a short time using affinity chromatography using an anti-Etag antibody.
  • it can be purified by a combination of separation and purification methods used in ordinary proteins.
  • antibodies can be separated and purified by combining column chromatography such as ultrafiltration, salting out, gel filtration / ion exchange / hydrophobic chromatography.
  • the purified preparation can be analyzed for molecular morphology by HPLC gel filtration analysis or the like.
  • Methods for measuring the binding activity of the obtained antibody or antibody fragment to ⁇ 9 integrin include methods such as ELISA and FACS.
  • ELISA a sample containing the antibody or antibody fragment of interest, such as a culture supernatant of Escherichia coli or a purified antibody, is added to a 96-well plate in which ⁇ 9 integrin-expressing cells are immobilized directly or via a capture antibody.
  • enzymes such as horseradish peroxidase (HRP) and alkaline phosphatase (AP), fluorescent substances such as fluorescein isocyanate and rhodamine, radioactive substances such as 32 P and 125 I, anti-Etag antibodies labeled with chemiluminescent substances, etc.
  • HRP horseradish peroxidase
  • AP alkaline phosphatase
  • fluorescent substances such as fluorescein isocyanate and rhodamine
  • radioactive substances such as 32 P and 125 I
  • anti-Etag antibodies labeled with chemiluminescent substances etc.
  • a detection reagent for example, chromogenic substrate TMB in the case of HRP labeling
  • VH and VL DNA base sequences of the scFv gene of the isolated clone can be determined by the dideoxy method and the amino acid sequence can be estimated from the obtained DNA base sequence information.
  • ⁇ 9-dependent cell adhesion As a method for evaluating whether or not the isolated clone has a function inhibitory activity against ⁇ 9, for example, there are the following methods using ⁇ 9-dependent cell adhesion as an index.
  • RAA variant of N-terminal OPN N-terminal fragment after osteopontin is cleaved by thrombin
  • ⁇ 9 ligands RGD sequence modified to RAA to suppress reaction with other integrins
  • the cells are fixed and stained with Crystal violet and methanol, washed, and the dye in the adhered cells is extracted with Triton X-100, and the absorbance at a wavelength of 595 nm is measured. If the suppressive action is confirmed thereby, it is determined that the antibody has a function inhibitory activity against ⁇ 9.
  • scFv is a monovalent antibody fragment, but it is known that the affinity and inhibitory effect may be greatly improved by the effect of Avidity by making it an IgG type or scFv-Fc type bivalent antibody. It has been.
  • molecular forms with relatively large molecular weight, such as IgG type or scFv-Fc type have better in vivo stability and longer half-life than those with relatively small molecular weight, such as scFv. This is also well known.
  • isolated clones may be evaluated by converting the molecular form to scFv-Fc type as follows.
  • the scFv-Fc expression vector is constructed by PCR amplification of the scFv gene region of the isolated clone and inserting it into a mouse or human Fc fusion protein expression vector.
  • mouse or human Fc fusion protein expression vectors include pFUSE-mIgG1-Fc or pFUSE-hIgG1-Fc (InvivoGen).
  • a leader sequence that promotes secretory expression to the outside of the cell, the scFv gene, and a mouse or human Fc gene region are linked, and the expression is controlled by various promoters.
  • the constructed scFv-Fc expression vector is introduced into cultured cells such as CHO cells using Lipofectamine® 2000 (Invitrogen) or the like. Extended culture is performed in a selective medium containing an expression vector marker (neomycin or the like), and the culture supernatant is collected and purified by Protein A column chromatography or the like. The obtained purified scFv-Fc sample may be analyzed by HPLC gel filtration, ELISA, FACS, ⁇ 9-dependent cell adhesion inhibition test, or the like, similar to scFv.
  • Detection can be performed with an HRP-labeled anti-mouse IgG antibody in ELISA, and with a FITC-labeled anti-mouse IgG antibody in FACS.
  • a mouse monoclonal antibody Y9A2 (CHEMICON) against human ⁇ 9 may be used as a control antibody.
  • epitope analysis will be described. If the epitope of the antibody clone having the function inhibitory activity can be identified, the neutralizing epitope of ⁇ 9 can be clarified.
  • Epitope analysis can be performed, for example, as follows. An ⁇ 9 amino acid substitution product is constructed, and the reactivity with the antibody is analyzed. If a change in the reactivity with the antibody is observed due to the amino acid substitution, the possibility that the substituted site is an epitope of the antibody is strongly suggested.
  • amino acid substitution for example, there are methods such as exchanging the sequences of human ⁇ 9 and mouse ⁇ 9, exchanging the sequences of ⁇ 9 and ⁇ 4, or replacing the sequence of ⁇ 9 with Ala.
  • the ⁇ -propeller domain located at the N-terminal part of the extracellular region is a site that interacts with the ligand as a feature common to the ⁇ chain of the integrin family (Science, 296, 151-155, 2002) Therefore, it is likely that a neutralizing epitope is present in this region. Therefore, the ⁇ propeller domain may be analyzed.
  • the knowledge about the species specificity of the antibody is obtained from the analysis results so far, it can be used. For example, if there is a difference in the reactivity between human ⁇ 9 and mouse ⁇ 9, the amino acid sequence of the epitope region may be slightly different between human and mouse. Since human ⁇ 9 and mouse ⁇ 9 are highly homologous, if a site whose amino acid sequence is different between human ⁇ 9 and mouse ⁇ 9 is selected from the candidate sites to be analyzed, further candidates The site is narrowed down, and analysis can be performed efficiently.
  • a fluorescent protein such as EGFP may be used as a marker for confirming the expression of the human ⁇ 9 variant.
  • EGFP fluorescent protein
  • the expression of ⁇ 9 can be confirmed by fluorescence, and the reactivity of the antibody according to the expression level can be evaluated. Therefore, more quantitative evaluation is possible.
  • Such an ⁇ 9 or ⁇ 9-EGFP fusion amino acid substitution product is constructed by site-directed mutagenesis method or the like. They are cloned into expression vectors and introduced into cultured cells such as CHO cells. For transiently or stably expressed cell populations, the expression of wild type or modified ⁇ 9 (or ⁇ 9-EGFP) and their reactivity with the antibody can be evaluated using ELISA or FACS. . For example, when various amino acid substitutions are constructed based on ⁇ 9-EGFP and the reactivity with the antibody is analyzed by FACS, the expression level can be expressed by indicating the expression of ⁇ 9-EGFP on the horizontal axis and the reactivity with the antibody on the vertical axis. It becomes possible to discuss the reactivity with the antibody of interest.
  • mouse collagen antibody-induced arthritis which is a typical arthritis model
  • mouse collagen antibody-induced arthritis may be used as a mouse disease state model system.
  • efficacy of each antibody clone against mouse collagen antibody-induced arthritis can be evaluated by the following procedure.
  • the anti-collagen antibody cocktail is administered to mice and LPS is administered 3 days later to induce the onset of arthritis.
  • scFv-Fc of the clone is intraperitoneally administered at 500, 170, 56 ⁇ g / head. Observe and score the degree of swelling of all limbs over time, and graph the transition of the average value of each group. As a result, if a scFv-Fc concentration-dependent arthritis inhibitory effect is observed, the clone is judged to have a medicinal effect on arthritis.
  • mouse collagen-induced arthritis which is another typical arthritis model
  • Collagen antibody-induced arthritis is known to induce an acute inflammatory response
  • collagen-induced arthritis is known to cause a chronic inflammatory response via an immune response.
  • efficacy of the clone against mouse collagen-induced arthritis can be evaluated by the following procedure.
  • the onset of arthritis is induced by administering bovine type II collagen to mice twice at 3-week intervals. Four, six, eight, ten, and twelve days after the second administration, the clones are intraperitoneally administered with 500, 170, 56 ⁇ g / head of scFv-Fc of the clone. The degree of swelling of all limbs over time is observed and scored to evaluate whether scFv-Fc concentration-dependent arthritis suppression is observed.
  • rheumatoid arthritis is a chronic inflammatory disease accompanied by joint destruction, and joint destruction deprives patients of freedom and leads to a significant decrease in QOL.
  • the anti-rheumatoid arthritis drugs used to date have anti-inflammatory effects, but there are no effective anti-inflammatory effects. In the future, they have both strong anti-inflammatory effects and joint destruction-inhibiting effects. Development of a therapeutic agent for rheumatoid arthritis is desired. Therefore, for example, the inhibitory effect on osteoclast differentiation of the clone may be evaluated as follows.
  • Bone marrow cells were collected from the above arthritis-induced mice, cultured in ⁇ MEM medium containing RANKL and M-CSF together with scFv-Fc of the clone, and then counted for osteoclasts (TRAP positive cells). The inhibitory effect on differentiation into bone cells is evaluated.
  • the scFv-Fc is administered simultaneously with the induction of arthritis, and the next day, bone marrow cells are collected from the mouse and cultured in an ⁇ MEM medium containing RANKL and M-CSF. Are counted and evaluated.
  • modification method For example, a site is identified and a specific amino acid such as Ala is substituted (for example, Current Protocols in Molecular Molecular Biology edit 1987, 5: Section 8, 1-8), random amino acid introduction methods (both can be performed by site-directed mutagenesis method), and random amino acid substitution introduction into the variable region of the antibody without specifying the site ( (for example, PCR methods and applications, 1992, 2: 28-33).
  • a specific amino acid such as Ala is substituted
  • random amino acid introduction methods both can be performed by site-directed mutagenesis method
  • random amino acid substitution introduction into the variable region of the antibody without specifying the site for example, PCR methods and applications, 1992, 2: 28-33.
  • this region may be used as a site to be modified.
  • a preparation may be prepared in the molecular form of scFv or scFv-Fc, and the reactivity, function inhibitory activity, and drug efficacy may be evaluated.
  • ⁇ 9 can be a preventive or therapeutic drug for diseases contributing to pathogenesis.
  • the present inventors conducted epitope analysis for clone MA9-413, and performed human ⁇ 9 integrin as described in the region from 104th Arg to 122nd Asp of human ⁇ 9 integrin (SEQ ID NO: 36: Swiss-Prot AC: Q13797).
  • SEQ ID NO: 37 GenBankJACCESSION: described in AJ344342
  • the mouse ⁇ 9 integrin amino acid sequence numbered from the N-terminus of the amino acid sequence as 1 recognizes mainly the epitope.
  • This region is a loop region for which no function or role has been reported so far in other integrin family studies, and the present inventors have designated this region as the L1 region.
  • the human anti- ⁇ 9 integrin antibody and antibody fragment of the present invention recognizes an epitope formed by the L1 region of ⁇ 9 integrin and is reactive to both mouse ⁇ 9 integrin and human ⁇ 9 integrin. It has no nature.
  • the antibodies and antibody fragments of the present invention having such properties are expected to be industrially applicable as novel diagnostic, prophylactic or therapeutic agents for various diseases involving ⁇ 9 integrin.
  • the present invention provides a new possibility for research on ⁇ 9 integrin and by extension, the whole integrin family or application to industry by finding a new neutralizing epitope called L1 region.
  • the present inventors obtain a plurality of clones MA9-418, HA9-107, HA9-143, and HA9-212, which have undergone molecular modifications to the above clone MA9-413 and have greatly improved reactivity to human ⁇ 9 integrin. succeeded in. These clones are expected to be more effective drugs than MA9-413.
  • amino acid sequences of the VH chain and VL chain of the scFv clone having the above properties obtained by the present inventors and the base sequences encoding them are as follows.
  • Clone MA9-413 The amino acid sequence of the VH chain of clone MA9-413 is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequences of CDR1-3 of the VH chain are shown in SEQ ID NOs: 2-4. That is, in the amino acid sequence of the VH chain shown in SEQ ID NO: 1, the 31st to 35th amino acid sequences are CDR1 (SEQ ID NO: 2), the 50th to 66th amino acid sequences are CDR2 (SEQ ID NO: 3), and the 99th to 115th amino acids.
  • the second amino acid sequence corresponds to CDR3 (SEQ ID NO: 4).
  • the base sequence of the gene encoding the VH chain is shown in SEQ ID NO: 5.
  • the amino acid sequence of the VL chain of clone MA9-413 is shown in SEQ ID NO: 6.
  • the amino acid sequences of CDRs 1-3 of the VL chain are shown in SEQ ID NOs: 7-9. That is, in the amino acid sequence of the VL chain shown in SEQ ID NO: 6, the 23rd to 35th amino acid sequence is CDR1 (SEQ ID NO: 7), the 51st to 57th amino acid sequence is CDR2 (SEQ ID NO: 8), and the 90th to 96th amino acids.
  • the second amino acid sequence corresponds to CDR3 (SEQ ID NO: 9).
  • the base sequence of the gene encoding the VL chain is shown in SEQ ID NO: 10.
  • the amino acid sequence of the VH chain of clone MA9-107 is shown in SEQ ID NO: 18.
  • the amino acid sequences of CDR1 to CDR3 of the VH chain are shown in SEQ ID NOs: 19 to 21, respectively. That is, in the amino acid sequence of the VH chain shown in SEQ ID NO: 18, the 31st to 35th amino acid sequences are CDR1 (SEQ ID NO: 19), the 50th to 66th amino acid sequences are CDR2 (SEQ ID NO: 20), and 99th to 115th.
  • the second amino acid sequence corresponds to CDR3 (SEQ ID NO: 21).
  • the base sequence of the gene encoding the VH chain is shown in SEQ ID NO: 22.
  • the amino acid sequence of the VL chain of clone MA9-107 is identical to the VL chain of clone MA9-413 (SEQ ID NO: 6).
  • the amino acid sequence of the VH chain of clone HA9-143 is shown in SEQ ID NO: 24.
  • the amino acid sequences of CDR1 to CDR3 of the VH chain are shown in SEQ ID NOs: 25 to 27. That is, in the amino acid sequence of the VH chain shown in SEQ ID NO: 24, the 31st to 35th amino acid sequence is CDR1 (SEQ ID NO: 25), the 50th to 66th amino acid sequence is CDR2 (SEQ ID NO: 26), and the 99th to 115th amino acids.
  • the second amino acid sequence corresponds to CDR3 (SEQ ID NO: 27).
  • the base sequence of the gene encoding the VH chain is shown in SEQ ID NO: 28.
  • the amino acid sequence of the VL chain of clone HA9-143 is the same as the VL chain of clone MA9-413 (SEQ ID NO: 6).
  • Clone HA9-212 The amino acid sequence of the VH chain of clone HA9-212 is shown in SEQ ID NO: 30.
  • the amino acid sequences of CDR1 to CDR3 of the VH chain are shown in SEQ ID NOs: 31 to 33. That is, in the amino acid sequence of the VH chain shown in SEQ ID NO: 30, the 31st to 35th amino acid sequence is CDR1 (SEQ ID NO: 31), the 50th to 66th amino acid sequence is CDR2 (SEQ ID NO: 32), and the 99th to 115th
  • the second amino acid sequence corresponds to CDR3 (SEQ ID NO: 33).
  • the base sequence of the gene encoding the VH chain is shown in SEQ ID NO: 34.
  • the amino acid sequence of the VL chain of clone HA9-212 is identical to the VL chain of clone MA9-413 (SEQ ID NO: 6).
  • the human anti- ⁇ 9 integrin antibody or antibody fragment of the invention comprises SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20.
  • CDR1, CDR2, CDR3 heavy chain complementarity determining regions
  • the human anti- ⁇ 9 integrin antibody or antibody fragment comprises a heavy chain complementarity determining region (CDR1, CDR2, CDR3) consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, and SEQ ID NO: 33, respectively.
  • CDR1, CDR2, CDR3 heavy chain complementarity determining region
  • the human anti- ⁇ 9 integrin antibody or antibody fragment of the present invention comprises a heavy sequence consisting of the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 24, and SEQ ID NO: 30. It has a chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • the human anti- ⁇ 9 integrin antibody or antibody fragment has a heavy chain variable region (VH) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 30.
  • VH chain and / or VL chain disclosed in the present invention was obtained in the form of scFv using the phage antibody method, and the evaluation was also performed in the molecular form of scFv or scFv-Fc.
  • the human anti- ⁇ 9 integrin antibodies or antibody fragments of the present invention are not limited to their molecular forms.
  • a complete antibody a complete molecular form in which the disclosed VH chain and / or VL chain is linked to a human immunoglobulin constant region, and as an antibody fragment, in addition to scFv and scFv-Fc, human immunoglobulin constants
  • Other antibody fragments such as Fab, Fab ′ or F (ab ′) 2 combined with a part of the region, and a single chain antibody (scAb) in which scFv is bound to the constant region of the light chain of human immunoglobulin, It is included in the present invention.
  • the present invention also includes a fusion antibody obtained by fusing the antibody or antibody fragment with another peptide or protein, or a polymer modifier such as polyethylene glycol. Included modified antibodies are also included.
  • any single chain peptide consisting of 10 to 25 amino acids is used as the peptide linker.
  • a modifying agent is bound to the thus obtained human anti- ⁇ 9 integrin antibody or antibody fragment of the present invention, a fusion antibody obtained by fusing the antibody or antibody fragment with another peptide or protein, or the antibody or antibody fragment.
  • the modified antibody (hereinafter referred to as “human anti- ⁇ 9 integrin antibody etc.”) is further purified as necessary, and then formulated in accordance with a conventional method, such as autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, allergy, graft rejection, etc.
  • ⁇ 9 integrin such as immune disease, osteoporosis, chronic obstructive pulmonary disease, cancer and the like can be used for the prevention and / or treatment of diseases related to pathogenesis.
  • the human anti- ⁇ 9 integrin antibody of the present invention can be preferably used as a prophylactic / therapeutic agent for rheumatoid arthritis.
  • dosage forms of these therapeutic agents can be parenterals such as injections and infusions, and are preferably administered by intravenous administration, subcutaneous administration, etc. (as therapeutic agents for autoimmune diseases) This can be applied to the case).
  • carriers and additives corresponding to these dosage forms can be used within a pharmaceutically acceptable range.
  • the amount of human anti- ⁇ 9 integrin antibody or the like added in the formulation varies depending on the patient's symptom level, age, dosage form of the formulation to be used, antibody binding titer, etc., for example, 0.1 mg / kg to 100 mg / Kg or so may be used.
  • the present invention also provides a gene encoding the antibody of the present invention or a fragment thereof, and an expression vector containing the gene.
  • the expression vector of the present invention is not particularly limited as long as it can express the gene encoding the antibody of the present invention or a fragment thereof in various prokaryotic and / or eukaryotic host cells and produce these polypeptides.
  • a plasmid vector, a viral vector (for example, adenovirus, retrovirus) and the like can be mentioned.
  • the expression vector of the present invention may contain a gene encoding the antibody of the present invention or a fragment thereof and a promoter operably linked to the gene.
  • the promoter for expressing the polypeptide of the present invention in bacteria include Trp promoter, lac promoter, recA promoter, ⁇ PL promoter, lpp promoter, tac promoter and the like when the host is Escherichia.
  • Examples of the promoter for expressing the antibody of the present invention or a fragment thereof in yeast include PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, and ADH promoter.
  • the host is Bacillus, SL01 promoter, SP02 promoter , PenP promoter and the like.
  • the host is a eukaryotic cell such as a mammalian cell
  • the CAG promoter Niwa (H. Et al., Gene, 108, 193-200, 1991)
  • SV40-derived promoter SV40-derived promoter
  • retrovirus promoter heat shock promoter Etc.
  • the expression vector of the present invention may further contain a start codon, a stop codon, a terminator region, and a replicable unit.
  • yeast, animal cells or insect cells are used as the host, the expression vector of the present invention may contain a start codon and a stop codon.
  • an enhancer sequence, 5 ′ and 3 ′ untranslated regions of the gene encoding the polypeptide of the present invention, a splicing junction, a polyadenylation site, or a replicable unit may be included.
  • the selection marker (For example, tetracycline, ampicillin, kanamycin) normally used according to the objective may be included.
  • the present invention also provides a transformant into which the gene of the present invention has been introduced.
  • a transformant can be produced, for example, by transforming a host cell with the expression vector of the present invention.
  • the host cell used for the preparation of the transformant is not particularly limited as long as it is compatible with the above expression vector and can be transformed.
  • Natural cells or artificially used usually in the technical field of the present invention can be used. Examples include various cells such as established cells (for example, bacteria (Escherichia, Bacillus), yeasts (Saccharomyces, Pichia, etc.), animal cells, insect cells (eg, Sf9), etc.). Transformation can be performed by a method known per se.
  • the present invention also provides a method for producing the antibody of the present invention or a fragment thereof comprising expressing the gene of the present invention in a host cell, that is, using such a transformant.
  • the transformant can be cultured in a nutrient medium.
  • the nutrient medium preferably contains a carbon source, an inorganic nitrogen source or an organic nitrogen source necessary for the growth of the transformant.
  • the carbon source include glucose, dextran, soluble starch, and sucrose.
  • the inorganic or organic nitrogen source include ammonium salts, nitrates, amino acids, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, large extract, and the like. Examples include soybean cake, potato extract and the like.
  • nutrients for example, inorganic salts (for example, calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride), vitamins, antibiotics (for example, tetracycline, neomycin, ampicillin, kanamycin, etc.)
  • inorganic salts for example, calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride
  • antibiotics for example, tetracycline, neomycin, ampicillin, kanamycin, etc.
  • the culture of the transformant is performed by a method known per se.
  • the culture conditions such as temperature, medium pH and culture time are appropriately selected.
  • the medium includes MEM medium (Science, Vol. 122, p. 501, 1952) containing about 5-20% fetal bovine serum, DMEM medium (Virology, Vol. 8, p. 396, 1959), RPMI 1640 medium (J. Am. Med. Assoc., Vol. 199, p. 519, 1967), 199 medium (proc. Soc. Exp. Biol. Med., Vol. 73, p. 1). , 1950) or the like.
  • the pH of the medium is preferably about 6 to 8, and the culture is usually carried out at about 30 to 40 ° C. for about 15 to 72 hours, and if necessary, aeration and agitation can be performed.
  • the host is an insect cell, for example, Grace's medium containing fetal bovine serum (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 82, p. 8404, 1985) and the like can be mentioned, and its pH is about 5-8. Is preferred.
  • the culture is usually carried out at about 20 to 40 ° C. for 15 to 100 hours, and if necessary, aeration or agitation can be performed.
  • a liquid medium containing the above nutrient source is suitable.
  • a medium having a pH of 5 to 8 is preferable.
  • the host is E. coli.
  • preferred media include LB medium, M9 medium (Miller et al., Exp. Mol. Genet, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 431, 1972) and the like.
  • the culture can be performed usually at 14 to 43 ° C. for about 3 to 24 hours with aeration and agitation, if necessary.
  • the treatment can be performed usually at 30 to 40 ° C.
  • examples of the medium include Burkholder minimum medium (Bostian, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 77, p. 4505, 1980), and the pH is 5 to 8. desirable.
  • the culture is usually carried out at about 20 to 35 ° C. for about 14 to 144 hours, and if necessary, aeration or agitation can be performed.
  • the antibody of the present invention or a fragment thereof can be recovered from the transformant as described above, and preferably isolated and purified from the transformant.
  • Isolation and purification methods include, for example, methods using solubility such as salting out, solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and other methods utilizing molecular weight differences, Methods using charges such as ion exchange chromatography and hydroxylapatite chromatography, methods using specific affinity such as affinity chromatography, methods using hydrophobic differences such as reversed-phase high-performance liquid chromatography, isoelectricity Examples thereof include a method using a difference in isoelectric point such as point electrophoresis.
  • Example 1 Preparation of antigen Using the human cDNA library as a template, the main domain region of the human ⁇ 9 integrin gene and the signal sequence region of the human ⁇ 5 integrin gene were cloned.
  • a human ⁇ 9 expression vector was constructed by ligating the signal sequence region of the human ⁇ 5 integrin gene and the main domain region of the human ⁇ 9 integrin gene and incorporating it into the pcDNA3.1 ( ⁇ ) vector (Invitrogen).
  • mouse cDNA library As a template, the full length of mouse ⁇ 9 integrin gene was cloned and incorporated into pcDNA3.1 (+) vector (Invitrogen) to construct a mouse ⁇ 9 expression vector.
  • human ⁇ 4 integrin and mouse ⁇ 4 integrin were also cloned by the following procedure.
  • the full length of the human ⁇ 4 integrin gene was cloned and incorporated into a pcDNA3.1 (+) vector (Invitrogen) to construct a human ⁇ 4 expression vector.
  • the full length of the mouse ⁇ 4 integrin gene was cloned and incorporated into a pcDNA3.1 (+) vector (Invitrogen) to construct a mouse ⁇ 4 expression vector.
  • mouse ⁇ 9 integrin expression vector and mouse ⁇ 4 integrin expression vector were introduced into CHO cells, respectively, and mouse ⁇ 9 integrin expression cells (hereinafter referred to as CHO / m ⁇ 9) and mouse ⁇ 4 integrin expression cells (hereinafter referred to as CHO / m ⁇ 4). Each was established.
  • human ⁇ 9 integrin expression vector and mouse ⁇ 9 integrin expression vector were introduced into SW480 cells, respectively, and human ⁇ 9 integrin expression cells (hereinafter referred to as SW480 / h ⁇ 9) and mouse ⁇ 9 integrin expression cells (hereinafter referred to as SW480 / m ⁇ 9). ) was established. These various integrin-expressing cells were used for subsequent screening and evaluation.
  • Example 2 Construction of phage library from healthy subjects >> Based on the method reported by JD Marks et al. (J. Mol. Biol., 222: 581-597, 1991), a phage library was constructed using lymphocytes from peripheral blood derived from 20 healthy subjects as starting materials. .
  • the constructed VH ( ⁇ ) -V ⁇ , VH ( ⁇ ) -V ⁇ , VH ( ⁇ ) -V ⁇ , and VH ( ⁇ ) -V ⁇ sub-libraries are 1.1 ⁇ 10 8 , 2.1 ⁇ 10 8 , and 8.4 ⁇ 10 7, respectively. It was evaluated to have a diversity of 5.3 ⁇ 10 7 clones.
  • Example 3 Screening using ⁇ 9 integrin-expressing cells >> A specific antibody against ⁇ 9 was prepared according to the following procedure. First, a monoclonal antibody having a function inhibitory activity was constructed targeting mouse ⁇ 9, and the presence or absence of a drug effect was evaluated using a mouse disease state model system. First, subtraction of the phage display library was performed using the parent strain, CHO cells, and then reacted with CHO / m ⁇ 9. The reaction was performed for 1 hour and washed 3 times with 1% BSA / PBS. The washed cell fraction was suspended in 10 mM HCl and incubated for 10 minutes to elute the phage.
  • the eluate was neutralized by mixing with 1M Tris-HCl (pH 7.5), and then infected with TG1 to amplify the phage. This panning was performed for 4 rounds, and a phage clone MA9-413 that specifically reacts with mouse ⁇ 9 was isolated.
  • Example 4 Analysis of reactivity of phage antibody by ELISA
  • the reactivity of MA9-413 phage antibody to ⁇ 9 was analyzed by Cell ELISA.
  • CHO / m ⁇ 9 and CHO were seeded at 2 ⁇ 10 4 cells / 100 ⁇ L / well in a 96-well plate (costar) and cultured overnight at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the medium was aspirated and washed with PBS, and then reacted with a phage antibody diluted with 1% BSA / PBS.
  • Detection was performed by combining horseradish peroxidase (HRP) -labeled anti-M13 antibody (Amersham) and TMB (SIGMA). Absorbance at wavelengths of 450 nm and 650 nm was measured using a microplate reader (Molecular Devices). The result is shown in FIG. Since ⁇ 9-specific reactivity of MA9-413 was confirmed, the subsequent analysis was performed.
  • Example 5 Sequence analysis of clone >> The DNA base sequences of VH and VL of the scFv gene of the isolated clone were determined using CEQ DTCS Quick Start Kit (BECKMAN COULTER). The amino acid sequence was estimated based on the obtained DNA base sequence information.
  • Example 6 Expression and purification of scFv Plasmid DNA was recovered from the specific clone MA9-413 and transformed into E. coli JM83 according to a conventional method.
  • the Escherichia coli was pre-cultured overnight in 2 ⁇ YT medium containing 2% glucose and 100 ⁇ g / mL ampicillin, and partly transplanted into SB medium containing 2% glucose and 100 ⁇ g / mL ampicillin for main culture.
  • IPTG was added to a final concentration of 1 mM, and cultured for 3 hours to induce scFv expression.
  • the cells were collected by centrifugation, suspended in a 100 mM Tris-HCl solution (pH 7.4) containing 20% Sucrose and 10 mM EDTA, and the cells were allowed to stand in ice for 30 minutes. Subsequently, the mixture was centrifuged at 8,900 ⁇ g for 30 minutes, the supernatant was collected, and the fraction obtained after filtration through a 0.45 ⁇ m filter was used as the periplasm fraction.
  • scFv was purified by SP column chromatography (Amersham) or RPAS Purification Module (Amersham) according to a conventional method, and the resulting eluted fraction was dialyzed against PBS to obtain a scFv purified sample.
  • Example 7 Reactivity analysis of scFv by ELISA
  • the scFv purified product prepared in Example 6 was analyzed for reactivity against ⁇ 9 by Cell ELISA.
  • an HRP-labeled anti-Etag antibody (Amersham) was used, and the others were performed under the same conditions as in Example 4. As a result, as shown in FIG. 2, concentration-dependent and specific reactivity was confirmed.
  • Example 8 Evaluation of scFv's ability to inhibit ⁇ 9-dependent cell adhesion >> Whether MA9-413 scFv can inhibit ⁇ 9-dependent cell adhesion was evaluated by the following method.
  • An N-terminal OPN variant OPN variant in which the RGD sequence was altered to RAA
  • SW480 / m ⁇ 9 was subsequently added and incubated at 37 ° C. for 1 hour.
  • the cells were fixed and stained with Crystal violet and methanol, washed, the dye in the adhered cells was extracted with Triton X-100, and the absorbance at a wavelength of 595 nm was measured.
  • FIG. 3 a concentration-dependent inhibitory action was observed, confirming that MA9-413 has a function inhibitory activity against mouse ⁇ 9.
  • Example 9 Construction of scFv-Fc expression vector
  • scFv-Fc was converted to a molecular form.
  • the scFv-Fc expression vector shown in FIG. 4 was constructed by PCR amplification of the scFv gene region of MA9-413 and inserting it into the SalI site and BamHI site of the mouse Fc fusion protein expression vector.
  • a leader sequence that promotes extracellular secretion, the scFv gene, and a gene encoding the Fc region of mouse IgG1 are linked, and its expression is controlled by the CAG promoter.
  • this vector has a neomycin resistance gene and an ampicillin resistance gene as drug resistance genes.
  • Example 10 Expression and purification of scFv-Fc >> Using Lipofectamine 2000 (Invitrogen), the constructed scFv-Fc expression vector was introduced into the CHO-DG44 strain. Culturing was performed in ⁇ -MEM medium (Invitrogen) or EX-CELL302 medium (Nichirei Bioscience) containing 500 ⁇ g / mL neomycin and 10% bovine serum, and the culture supernatant was collected. Affinity purification was performed by Protein A column chromatography according to a conventional method, followed by dialysis with PBS. The obtained scFv-Fc solution was used as a purified sample.
  • Example 11 Reactivity analysis of scFv-Fc by ELISA >> The reactivity of MA9-413 scFv-Fc to mouse ⁇ 9 and human ⁇ 9 was analyzed by Cell ELISA. SW480 / m ⁇ 9, SW480 / h ⁇ 9 and SW480 are used as antigens, 1% BSA / PBS containing 5% FBS is used as a diluent, and HRP-labeled anti-mouse IgG antibody (ZYMED) is used for detection. The same conditions were used. As a result, as shown in FIG. 5, concentration-dependent and specific reactivity to mouse ⁇ 9 and human ⁇ 9 was confirmed.
  • MA9-413 is an antibody clone having a novel reactivity that has not been reported so far, and can recognize both mouse ⁇ 9 and human ⁇ 9.
  • Example 12 Reactivity analysis of scFv-Fc by flow cytometry >> Furthermore, the reactivity of MA9-413 scFv-Fc was evaluated by flow cytometry. When MA9-413 scFv-Fc was reacted with each of SW480, SW480 / m ⁇ 9 and SW480 / h ⁇ 9 and subjected to flow cytometry analysis, reactivity to mouse ⁇ 9 and human ⁇ 9 was confirmed. Moreover, although the reactivity was similarly evaluated with respect to each of CHO and CHO / m ⁇ 4, reactivity to mouse ⁇ 4 was not confirmed (FIG. 6). From these results, it was confirmed that MA9-413 scFv-Fc reacted with high specificity to mouse and human ⁇ 9.
  • Example 13 Evaluation of scFv-Fc's ability to inhibit ⁇ 9-dependent cell adhesion >> It was evaluated whether MA9-413 scFv-Fc can inhibit mouse ⁇ 9 and human ⁇ 9-dependent cell adhesion.
  • the ligand is OPN
  • SW480 / m ⁇ 9 or SW480 / h ⁇ 9 was used, and the others were performed under the same conditions as in Example 8.
  • cell adhesion when the ligand was VCAM-1 was evaluated by the following method. Mouse VCAM-1 / Fc was immobilized on a plate and blocked. The cells were SW480 / m ⁇ 9, and other conditions were the same as in Example 8.
  • FIG. 7 a concentration-dependent inhibitory action was observed in all cases, MA9-413 has a function inhibitory activity against mouse ⁇ 9 and human ⁇ 9, and the ligand is OPN. It was shown that VCAM-1 can work in the same way.
  • Example 14 Epitope analysis of MA9-413 >> For the purpose of identifying epitopes for MA9-413, which has reactivity not only in mouse ⁇ 9 and human ⁇ 9, but also exhibits functional inhibitory activity against both, and has no properties reported so far. The following analysis was performed. As a feature common to the ⁇ chain of the integrin family, the ⁇ propeller domain located in the N-terminal part of the extracellular region is said to be an interaction site with a ligand (Science, 296, 151-155, 2002). Therefore, it was first hypothesized that neutralizing epitopes exist within this region.
  • R2 and R4 are important for ligand binding among repeat parts (corresponding to loop regions) called R1 to R5 in the ⁇ propeller domain, and Results have shown that R2, R3a and R3c can be neutralizing epitopes (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 7198-7203, 1997). From these facts, it was considered that the epitope of MA9-413 is also likely to be a loop region.
  • EGFP is used as a marker for confirming the expression of a human ⁇ 9 variant
  • a human ⁇ 9-EGFP fusion (hereinafter referred to as h ⁇ 9-EGFP) in which EGFP is fused to the C-terminus (cytoplasmic region) of human ⁇ 9. ) Gene was constructed.
  • the EGFP gene was amplified by the PCR method using the pEGFP-N1 vector (Clontech) as a template, and further assembly-PCR was performed to link with the human ⁇ 9 gene. Using the restriction enzyme cleavage site, it was incorporated into the human ⁇ 9 expression vector described in Example 1 to construct an h ⁇ 9-EGFP expression vector.
  • the modified product (hereinafter referred to as h ⁇ 9 / mR4-EGFP), the modified product in which 286th Gly is substituted with Ala for R5 (hereinafter referred to as h ⁇ 9 / mR5-EGFP), and the 77th Lys for L1 Modified with Arg, 78th Asn as Thr, 81st Thr as Ala, 82nd Ser as Pro, and 89th Glu as Gly (hereinafter referred to as h ⁇ 9 / mL1-EGFP) was constructed by site-directed mutagenesis method.
  • h ⁇ 4 / 9-EGFP a variant in which the entire ⁇ propeller domain is replaced with the ⁇ propeller domain of human ⁇ 4 (hereinafter referred to as h ⁇ 4 / 9-EGFP) is as follows. And built. Since the region between the restriction enzyme BlpI site and the StuI site of the human ⁇ 9 gene corresponds to the ⁇ -propeller domain, the human ⁇ 4 gene region corresponding to that region was added to the human ⁇ 4 gene using primers added with the BlpI site and the StuI site, respectively. PCR amplification was carried out using the expression vector as a template, digested with BlpI and StuI, and then replaced with the region between the BlpI site and the StuI site of the human ⁇ 9-EGFP fusion expression vector.
  • the MA9-413 scFv-Fc reaction pattern is different only in h ⁇ 9 / mL1-EGFP, and the reactivity per expression level is higher compared to h ⁇ 9-EGFP and other variants.
  • h ⁇ 9 / mL1-EGFP is a variant in which the L1 region is substituted from the human sequence to the mouse sequence, and MA9-413 reacts more strongly with mouse ⁇ 9 than with human ⁇ 9. This strongly suggests that it is the L1 region.
  • Example 15 Evaluation 1 of scFv-Fc efficacy against mouse arthritis model >> It was examined whether scFv-Fc of MA9-413, in which not only the reaction pattern but also the epitope was a novel region, could be effective against a mouse arthritis model. First, the effect on mouse collagen antibody-induced arthritis, one of representative arthritis models, was examined. Anti-collagen antibody cocktail was administered to mice and LPS was administered 3 days later to induce the development of arthritis. On the day and 3 days after LPS administration, MA9-413 scFv-Fc was intraperitoneally administered at 500, 170, 56 ⁇ g / head, and control mouse antibody was intraperitoneally administered at 500 ⁇ g / head (4 to 8 mice in each group).
  • Example 16 ScFv-Fc efficacy evaluation 2 for mouse arthritis model >> Next, it was evaluated whether MA9-413 scFv-Fc shows efficacy against mouse collagen-induced arthritis, which is another typical arthritis model. It is known that the collagen antibody-induced arthritis of Example 15 induces an acute inflammatory response, whereas the collagen-induced arthritis causes a chronic inflammatory response. Onset of arthritis was induced by administering bovine type II collagen to mice twice at 3-week intervals.
  • Example 17 Evaluation of drug efficacy of scFv-Fc for osteoclast differentiation >> Furthermore, the effect on osteoclast differentiation in an arthritis model was examined.
  • bone marrow cells were collected from the femur of the mouse the day after administration of LPS causing arthritis, and RANKL (final concentration 30 ng / mL) and M-CSF (final concentration 100 ng).
  • osteoclast differentiation was induced by culturing in an ⁇ MEM medium containing (/ mL). The culture change was performed once on the third day after the start.
  • MA9-413 has an action of strongly suppressing both inflammatory reactions in the acute phase and the chronic phase.
  • the results of Example 17 above strongly suggested that MA9-413 has an anti-inflammatory effect as well as a joint destruction-inhibiting action under inflammation. Therefore, it is expected that this clone can be used as a drug superior to conventional drugs for treating or preventing human arthritis.
  • Example 18 Affinity improvement of MA9-413 Since MA9-413 is an antibody that reacts more strongly with mouse ⁇ 9 than with human ⁇ 9, there is a possibility that the affinity is not sufficient to aim at application to human arthritis. Therefore, an attempt was made to improve affinity by molecular modification of MA9-413. In many cases, the CDR3 region of VH contributes most strongly to antigen recognition among antibody variable regions.
  • the sequence of CDR3 of VH of MA9-413 is as shown in SEQ ID NO: 4, but a Tyr cluster is characteristically arranged.
  • a modified scFv in which the 108th Tyr is replaced with Ala (hereinafter referred to as MA9-418) and a modified scFv in which the 109th Tyr is replaced with Ala ( (Hereinafter referred to as MA9-419) was constructed by the site-directed mutagenesis method.
  • MA9-418 showed improved reactivity to mouse and human ⁇ 9 compared to MA9-413, and MA9-419 responded to mouse and human ⁇ 9. Sex was almost lost. From these results, substitution of the 108th Tyr with an optimal amino acid improves the reactivity to ⁇ 9, and the 109th Tyr is essential for antigen recognition, so substitution with other amino acids is not desirable. It has been suggested.
  • Example 19 Expression and purification of scFv
  • the plasmid DNA host was changed to E. coli strain JM83, and scFv expression and purification were performed.
  • Expression of scFv by culturing E. coli transformant in 2 ⁇ YT medium containing 2% glucose and 100 ⁇ g / mL ampicillin, adding IPTG to a final concentration of 1 mM in the logarithmic growth phase, and culturing overnight Induced.
  • the cells were collected, suspended in a 100 mM Tris-HCl solution (pH 7.4) containing 20% Sucrose and 10 mM EDTA, and the cells were allowed to stand in ice for 30 minutes. Subsequently, the mixture was centrifuged at 8,900 ⁇ g for 30 minutes, the supernatant was collected, and the fraction obtained after filtration through a 0.45 ⁇ m filter was used as the periplasm fraction.
  • scFv was purified by RPASPurification Module (Amersham) according to a conventional method, and the obtained elution fraction was dialyzed against PBS to obtain a purified scFv preparation.
  • the reactivity of the purified scFv was analyzed by Cell ELISA in the same manner as in Example 11 except that an HRP-labeled anti-Etag antibody (Amersham) was used for detection.
  • an HRP-labeled anti-Etag antibody Amersham
  • FIG. 15 compared to MA9-413, MA9-418, HA9-107, HA9-143 and HA9-212 have improved reactivity to human ⁇ 9, especially HA9-212. The degree was remarkable.
  • Example 20 Construction, expression and purification of scFv-Fc
  • the scFv-Fc gene was constructed in the same manner as in Example 9 for MA9-418, HA9-107, HA9-143, and HA9-212.
  • the expression of scFv-Fc was performed by transient expression using freestyle 293-F cells (Invitrogen) as a host. Gene transfer was performed using 293fectin reagent (Invitrogen), and after culturing for 2 to 3 days in a freestyle 293 expression medium (Invitrogen), the culture supernatant was collected by centrifugation and 0.22 ⁇ m filter filtration. Purification was performed according to a conventional method using Protein A column chromatography.
  • the scFv-Fc solution obtained after PBS dialysis was used as a purified sample.
  • the reactivity of the prepared scFv-Fc purified product to mouse ⁇ 9 and human ⁇ 9 was analyzed by Cell ELISA in the same manner as in Example 11. As a result, as shown in FIG. 16, the reactivity of MA9-418, HA9-107, HA9-143, and HA9-212 to human ⁇ 9 was improved compared to MA9-413.
  • Example 21 Epitope analysis of variant clones >> In order to examine whether MA9-418, HA9-107, HA9-143, and HA9-212 recognize the ⁇ 9 L1 region in the same manner as MA9-413, the following examination was performed. In the Cell ELISA performed in the same manner as in Example 4 with the MA9-413 phage antibody at a constant concentration, each variant scFv-Fc was serially diluted and added simultaneously with the sample, so that the MA9-413 phage antibody was added. It was evaluated whether or not competitive inhibition was applied. As a result, as shown in FIG. 17, it was confirmed that competitive inhibition was applied in a concentration-dependent manner. Therefore, it was strongly suggested that MA9-418, HA9-107, HA9-143, and HA9-212 also recognize the ⁇ 1 L1 region as in MA9-413.
  • Example 22 Evaluation of ⁇ 9-dependent cell adhesion inhibitory ability of modified clones >> The scFv-Fc of each variant clone was evaluated in the same manner as in Example 13 for its ability to inhibit human ⁇ 9 and mouse ⁇ 9-dependent cell adhesion. Table 1 summarizes the IC50 values. All of the mutant clones were confirmed to have a strong inhibitory ability against human ⁇ 9 compared to the original MA9-413. In particular, HA9-212 had about 1000 times the inhibitory ability against human ⁇ 9 compared to MA9-413.
  • Example 23 Production and preparation of IgG With regard to clone HA9-212 that showed the highest reactivity with human ⁇ 9, the reactivity of IgG in the molecular form was examined.
  • IgG gene construction was carried out by the following procedure. First, the VH gene region of HA9-212 was PCR amplified and inserted into the cloning site of a human H chain expression vector. In this vector, a leader sequence that promotes secretory expression to the outside of the cell, the VH gene, and the human IgG1 constant region gene are linked, and the expression is controlled by the CAG promoter. Moreover, this vector has a neomycin resistance gene and an ampicillin resistance gene as drug resistance genes.
  • the VL gene region of MA9-212 was PCR amplified and inserted into the cloning site of the human L chain expression vector.
  • a leader sequence that promotes secretory expression to the outside of the cell, a VL gene, and a human ⁇ chain constant region gene are linked, and the expression is controlled by the CAG promoter.
  • This vector has a dhfr gene and an ampicillin resistance gene.
  • IgG was expressed by transient expression using COS-7 cells and freestyle 293-F cells (Invitrogen) as hosts.
  • COS-7 cells use Lipofectamine 2000 (Invitrogen), and for Freestyle 293-F cells, use 293 fectin reagent (Invitrogen) for gene transfer. After culturing for 2-3 days, culture supernatant was recovered by centrifugation and 0.22 ⁇ m filter filtration.
  • Example 24 IgG reactivity analysis
  • the IgG expression level in the culture supernatant was quantified by human IgG quantitative ELISA, and the reactivity to human ⁇ 9 and mouse ⁇ 9 at each IgG concentration was analyzed by Cell ELISA.
  • an HRP-labeled anti-human IgG (Fc) antibody (American Qualex) was used, and the other conditions were the same as in Example 11.
  • Fc horseradishin-labeled anti-human IgG
  • FIG. 18 concentration-dependent and specific reactivity to human ⁇ 9 and mouse ⁇ 9 was confirmed, and particularly strong reactivity to human ⁇ 9 was shown. From these results, it was confirmed that HA9-212 exhibits reactivity with ⁇ 9 even in the molecular form of IgG.
  • MA9-418, HA9-107, HA9-143 and HA9-212 obtained by modifying MA9-413 react with both mouse ⁇ 9 and human ⁇ 9 possessed by MA9-413. It was confirmed that the reactivity and inhibitory ability to human ⁇ 9 were greatly improved while maintaining the property of recognizing the L1 region. Furthermore, HA9-212 showed strong reactivity with human ⁇ 9 even in the molecular form of IgG. From these facts, the MA9-413 variant is highly expected to be useful as a drug for the treatment or prevention of human arthritis superior to MA9-413.
  • the human monoclonal antibody and the antibody fragment of the present invention have the variable region of a human-derived anti- ⁇ 9 integrin antibody, specific reactivity with human and mouse ⁇ 9 integrin, and inhibitory activity against ⁇ 9 integrin-dependent cell adhesion, Since it has an inhibitory action against arthritis, it can be expected to be used as a new diagnostic, preventive or therapeutic agent for various diseases involving ⁇ 9 integrin.
  • This application is based on Japanese Patent Application No. 2007-340203 filed in Japan (filing date: December 28, 2007), the contents of which are incorporated in full herein.

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Abstract

　本発明は、ヒトα９インテグリンおよびマウスα９インテグリンを特異的に認識し、それらのリガンドとの相互作用を阻害するヒト抗α９インテグリン抗体または抗体フラグメント、特に、ヒトおよびマウスα９インテグリンのループ領域を認識する該抗体または抗体フラグメント、該抗体または抗体フラグメントをコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換え発現ベクター、該遺伝子が導入された形質転換体、該形質転換体を用いたヒト抗α９インテグリン抗体または抗体フラグメントの生産方法、並びに、該抗体または抗体フラグメントを含む関節リウマチの予防・治療剤を提供する。

Description

ヒト抗α９インテグリン抗体
　本発明は、ヒト抗α９インテグリン抗体及びその用途に関する。詳細には、ヒト及びマウスα９インテグリン蛋白質のＬ１と命名したループ領域に結合して、α９インテグリン依存の細胞接着を阻害し、かつ関節炎に対する抑制作用を有するヒト抗α９インテグリン抗体及び該抗体フラグメント、並びに、当該抗体及び抗体フラグメントを用いた、関節リウマチ等の自己免疫疾患、アレルギーや移植片拒絶反応等の免疫疾患、及びその他のα９インテグリンが病態形成に関与する各種疾患の診断、予防または治療に関する。
　インテグリン（integrin）は細胞表面糖タンパク質のひとつで、主に細胞外マトリックス（コラーゲン、ラミニンなど）への細胞の接着やイムノグロブリンファミリーのメンバー(ICAM-1、VCAM-1など)の受容体として機能し、細胞外マトリックスからの情報伝達に関与する接着分子である。それにより、細胞は細胞外マトリックスよりシグナルを受け取り、分化、増殖、細胞死などが誘導される。インテグリンはα鎖とβ鎖の２つのサブユニットからなるヘテロダイマーであり、異なるα鎖、β鎖が存在し、多様な組み合わせがあり、インテグリンスーパーファミリーは２４種類存在する。インテグリンノックアウトマウスは、全てのサブユニットで致死的あるいは病的で、生命の維持に個々のインテグリンが必要であることが示唆されている。このことから、周辺の環境を細胞に伝え対応を促すインテグリンは、生命現象のあらゆる場面で機能しており、様々な病態に関与していると考えられる。
　このように生存に不可欠なインテグリンは病的状態でも役割を演じていると考えられ、その阻害が病態改善に働くケースが示されている。例えば、血小板に特異的なインテグリンαIIｂβ３の阻害薬は、PCTA再狭窄治療薬アブシキシマブ（商品名：ReoPro；Eli Lilly社）として認可されている。また、α４β１（VLA4）阻害剤ナタリツマブ（商品名：Antegren;ELAN社）は多発性硬化症治療薬として認可されている。さらに、αｖβ３阻害剤Vitaxin（MEDIMMUNE社)も、その血管新生阻害作用、破骨細胞活性化阻害作用などから、現在治験が進んでいる状況にある。
　インテグリンα９β１はマクロファージ、NKT細胞、樹状細胞（Dendritic Cell）、好中球に発現しており、これら炎症細胞の浸潤や接着、骨吸収などに重要な役割を果しているとされる。また最近、破骨細胞の形成においてインテグリンα９β１の関与が報告されており、骨破壊への関与が示唆されている（非特許文献１）。そのリガンドとしては、切断型オステオポンチン（Ｎ末OPN）、VCAM-1、Tenascin-Cなどが知られている。臨床においても、関節リウマチ患者の滑膜組織においてインテグリンα９β１の有意な上昇が認められている（非特許文献２）。
　したがって、α９インテグリン蛋白質に特異的に結合し、α９インテグリン依存の細胞接着を阻害する活性を有するモノクローナル抗体を開発することができれば、α９インテグリンが病態形成に関与する各種疾患の診断、予防または治療に有用であることが期待される。
　これまで、ヒトα９インテグリンに対して機能阻害作用を示す抗体としては、マウスモノクローナル抗体であるY9A2（非特許文献３）、同じくマウスモノクローナル抗体である1K11、24I11、21C5及び25B6（特許文献１）が報告されている。これらの抗体は、ヒトα９インテグリン依存の細胞接着を抑制し得ることがin vitroの実験結果より示されているものの、マウスやラットのα９インテグリンに対しては交差反応性を有さないため、in vivoでの薬効評価等の実験に用いるには不向きである。
　また、マウスα９インテグリンに対して機能阻害作用を示す抗体としては、ハムスターモノクローナル抗体である11L2B、12C4'58、18R18D及び55A2C（特許文献１）が報告されている。これらの抗体はマウスα９の細胞接着等の機能を抑制し得ることがin vitroの実験結果より示されており、また11L2Bについては肝炎に対する治療効果を有することがin vivoの実験結果より示されているものの、ヒトα９インテグリンに対する反応性は確認されていないため、これらの抗体をヒトの疾患の治療や予防に適用することは出来ない。
　このように、抗ヒトα９インテグリン抗体を取得してin vitroでの機能評価を行っても、マウスやラットのα９インテグリンに対して交差反応性を示さなければ、各種炎症性疾患の病態モデルはマウスやラットを用いた系がほとんどであるため、その抗体の薬効を評価することは困難である。また、抗マウスα９インテグリン抗体を取得してin vivoの病態モデル系を用いて薬効評価を行い、治療または予防効果を見出したとしても、ヒトのα９インテグリンに対して交差反応性を示さなければ、抗体医薬品としてヒトの病態に適用することは出来ない。
　仮に、抗マウスα９インテグリン抗体を用いて得られた薬効のデータを基に、Y9A2等の抗ヒトα９モノクローナル抗体を抗体医薬品として開発するとしても、薬理データの取得に用いた抗体と開発品である抗体との同等性を証明するのに多大な労力を要することとなる。よって、例えばマウスとヒトとの両方に対して機能阻害作用を示す抗体があれば望ましいが、そのような抗体の取得は、従来のマウスを免疫する方法等では、原理的に困難であると言える。
　また、そのような困難を克服し、何らかの手法で作製した抗ヒトα９モノクローナル抗体を抗体医薬品として開発するとしても、その抗体がヒト以外の動物由来の抗体であれば、ヒトに対して投与した場合、その高い免疫原性によって、異物として認識・排除される。従って、そのような抗体を疾患の治療薬剤として用いることは困難である。
　この問題を解決する方法として、蛋白工学的手法を用いて非ヒト由来抗体をヒト化することが考えられるが、非ヒト由来の配列を一部含むため、反復投与や長期投与により、投与するヒト化抗α９インテグリン抗体の活性を阻害するような抗体が作られ、その効果を著しく減弱するだけでなく、重篤な副作用を招く可能性がある。また、ヒト化により活性が低下することも多く、構築には多大な労力とコストを要する。
　また、α９インテグリンについては、立体構造やリガンド結合部位、中和エピトープなどの構造学的な情報もほとんどないという状況であり、それらの情報が得られれば、α９インテグリンに関する研究や医療への応用に新たな道が開かれ、その貢献度は多大なものになり得ると期待される。
WO 2006/075784 Journal of Bone and Mineral Research, 2006, 21: 1657-1665 The Journal of Clinical Investigation, 2005, 115: 1060-1067 Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 1996, 15: 664-672
　したがって、本発明の目的は、ヒトα９インテグリンとマウスα９インテグリンの両方に特異的な反応性を有し、かつ安全性と治療効果を兼ね備えたヒト抗α９インテグリン抗体を提供することであり、該ヒト抗α９インテグリン抗体の、α９インテグリンとその複数のリガンドとの相互作用の遮断による強力な抗炎症作用と骨破壊抑制作用を利用して、α９インテグリンが病態形成に関与する各種疾患の新規予防または治療手段を提供することである。
　本発明者らは、α９インテグリン発現細胞を作製し、該細胞にヒト抗体を提示した抗体ファージライブラリーをダイレクトに反応させることにより、マウスα９インテグリン及びヒトα９インテグリンに特異的な反応性を有するヒト抗α９インテグリン抗体及び抗体フラグメントを作製することに成功した。さらに、該抗体及び抗体フラグメントが、α９インテグリン依存性の細胞接着を阻害し、複数の関節炎モデルに対して治療効果を示し、該モデルにおける破骨細胞の分化を抑制することを見出した。即ち、該抗体及び抗体フラグメントが、安全性と治療効果とを兼ね備えたものであることを実証して、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、医学上または産業上有用な方法・物質として下記１）～１６）の発明を含むものである。
１）ヒトα９インテグリン及びマウスα９インテグリンを認識し、該α９インテグリンとリガンドとの相互作用を阻害する、ヒト抗α９インテグリン抗体または抗体フラグメント。
２）ヒトα９インテグリン（配列番号３６）の104番目のArgから122番目のAspまでの領域が主として構成するエピトープ、及びマウスα９インテグリン（配列番号３７）の105番目のArgから123番目のAspまでの領域が主として構成するエピトープを認識する、上記１）に記載の抗体または抗体フラグメント。
３）以下の配列番号に各々示されるアミノ酸配列からなる（ａ）重鎖相補性決定領域及び（ｂ）軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）を有する、上記１）または２）に記載の抗体または抗体フラグメント。
（ａ）重鎖相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３
　　　配列番号２、配列番号３、配列番号４；
　　　配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５；
　　　配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１；
　　　配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７；または
　　　配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３；
（ｂ）軽鎖相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３
　　　配列番号７、配列番号８、配列番号９
４）配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３に各々示されるアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を有する、上記３）に記載の抗体または抗体フラグメント。
５）配列番号１、配列番号１２、配列番号１８、配列番号２４、配列番号３０のいずれかに示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有する、上記１）または２）に記載の抗体または抗体フラグメント。
６）配列番号３０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を有する、上記５）に記載の抗体または抗体フラグメント。
７）当該抗体が、完全抗体である上記１）から６）のいずれかに記載のヒト抗α９インテグリン抗体。
８）当該抗体フラグメントが、scFvまたはscFv-Fcである上記１）から６）のいずれかに記載のヒト抗α９インテグリン抗体フラグメント。
９）上記１）から８）のいずれかに記載の抗体または抗体フラグメントをコードする遺伝子。
１０）上記９）に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
１１）上記９）に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
１２）上記９）に記載の遺伝子を宿主に発現させることによって、ヒト抗α９インテグリン抗体または抗体フラグメントを生産する方法。
１３）上記１）から８）のいずれかに記載の抗体または抗体フラグメントを含む、関節リウマチの予防または治療剤。
１４）上記１）から８）のいずれかに記載の抗体または抗体フラグメントの治療有効量を対象に投与する工程を包含する、該対象における関節リウマチを予防または治療する方法。
１５）関節リウマチの予防または治療剤の製造における、上記１）から８）のいずれかに記載の抗体または抗体フラグメントの使用。
１６）関節リウマチを予防または治療するための、上記１）から８）のいずれかに記載の抗体または抗体フラグメント。
　本発明のヒトモノクローナル抗体及び該抗体フラグメントは、ヒト由来抗α９インテグリン抗体の可変領域を有し、ヒト及びマウスのα９インテグリンに対する特異的な反応性と、α９インテグリン依存の細胞接着に対する阻害活性、更に関節炎に対する抑制作用を有する。また、そのエピトープはこれまでに他のインテグリンファミリーでも報告例のないループ領域（Ｌ１と命名）であった。また、本発明による抗体及び該抗体フラグメントは完全ヒト抗体であるので、α９インテグリンが関与する各種疾患に対する新たな診断、予防または治療薬としての利用が期待できる。
scFv display phageのマウスα９との反応性を示す図である。 MA9-413 scFvのマウスα９との反応性を示す図である。 MA9-413 scFvのマウスα９依存性細胞接着に対する阻害能を示す図である。 scFv-Fc発現ベクターの構造を示す図である。 MA9-413 scFv-Fcのマウスα９及びヒトα９との反応性をELISAにより解析した結果を示す図である。 MA9-413 scFv-Fcのマウスα９及びヒトα９との反応性及び特異性をフローサイトメトリーにより解析した結果を示す図である。 MA9-413 scFv-Fcのマウスα９及びヒトα９依存性細胞接着に対する阻害能を示す図である。 α９のβプロペラドメインのアミノ酸配列とモデリングより推定されたループ領域を示す図である。 MA9-413 scFv-Fcのα９ループ領域改変体及びα９βプロペラドメイン改変体との反応性をフローサイトメトリーにより解析した結果を示す図である。 MA9-413 scFv-Fcのα９ループ領域改変体及びα９βプロペラドメイン改変体との反応性をELISAにより解析した結果を示す図である。 MA9-413 scFv-Fcのマウスコラーゲン抗体誘導関節炎に対する抑制効果を示す図である。 MA9-413 scFv-Fcのマウスコラーゲン誘導関節炎に対する抑制効果を示す図である。 MA9-413 scFv-Fcのマウスコラーゲン抗体誘導関節炎に対する破骨細胞分化抑制を示す図である。 MA9-413改変体のアミノ酸配列を示す図である。 MA9-413改変体scFvのマウスα９及びヒトα９との反応性を示す図である。 MA9-413改変体scFv-Fcのヒトα９及びマウスα９との反応性を示す図である。 MA9-413のα９反応性に対するMA9-413改変体の競合阻害作用を示す図である。 MA9-413改変体IgGのヒトα９及びマウスα９との反応性を示す図である。
　以下に本発明について詳述する。
　scFvディスプレイファージライブラリーは、以下のようにして作製することができる。複数の健常者から採取した末梢血Bリンパ球より、RT-PCR法にて免疫グロブリン重（Ｈ）鎖、軽（Ｌ）鎖cDNAを合成する。次に各種プライマーを組み合わせて、Ｈ鎖可変領域（ＶＨ）とＬ鎖可変領域（ＶＬ）を増幅させ、両者をlinker DNAで結合させることにより、健常者リンパ球由来のＶＨとＶＬのランダムな組み合わせによるscFv遺伝子のライブラリーが作製される。このscFv遺伝子をファージミドベクター（例、pCANTAB5E）に組込み、約108～1011クローンからなる健常者由来scFvディスプレイファージライブラリーを構築することができる。
　抗原であるα９インテグリンの調製は、以下のようにして行うことができる。
　α９インテグリン（以下、単に「α９」ともいう）は膜蛋白質であるため、α９遺伝子をクローニングして培養細胞に遺伝子導入を行い、人為的に培養細胞表面に発現させることができる。遺伝子クローニングの鋳型としては、cDNA library等を用いるとよい。細胞表面に発現させるためには、通常Ｎ末端部分にシグナル配列が存在する必要があるので、α９が本来有するシグナル配列を利用してもよいし、成熟型α９をコードする遺伝子領域を他のシグナル配列と連結させてもよい。作製する抗体については、種特異性等を評価し、抗体の用途や可能性を見極めることが必要であるため、遺伝子の取得はヒトα９とマウスα９の両方について行うのが望ましい。
　以上のようにして取得した、シグナル配列を含むα９の遺伝子を、例えばpcDNA3.1(-)ベクター（Invitrogen）などの発現ベクターにクローニングする。ここで、インテグリンファミリーのα鎖の内、α９と最も相同性が高いと言われているのはα４である。このことから望ましくは、α９のコントロールとして用いるために、α４インテグリンについても同様の操作を行い、発現ベクターにクローニングするとよい。
　構築した発現ベクターを、CHO細胞やSW480細胞等の培養細胞に、Lipofectamine 2000（Invitrogen）等を用いたトランスフェクションにより導入する。発現ベクターのマーカー（ネオマイシン等）を利用して発現細胞のみを選択し、得られた細胞を以降のスクリーニングや評価に使用することができる。発現細胞については、限界希釈法等によりクローニングを行い、均一の細胞集団にすることによって、より安定的に高発現量を示す細胞を得るとよい。
　以下に抗体作製について述べる。抗α９インテグリン抗体を作製して、α９のターゲットバリデーションを行うことを目的とする場合には、まずマウスα９をターゲットとして機能阻害活性を有するモノクローナル抗体を取得し、マウスの病態モデル系を用いて抗体の薬効の有無を評価するとよい。
　まずは、scFvディスプレイファージライブラリーからの特異クローン分離について述べる。例えば次のような手順で行うことが出来る。上記のライブラリーを、CHO細胞と反応させてサブトラクションを行った後、マウスα９発現CHO細胞に結合させて回収、濃縮し、抗α９ scFvディスプレイファージクローンをスクリーニングする。抗原としては、細胞そのものではなく、膜画分を調製して用いたり、或いは膜画分から抗原を精製して用いたりすることもできる。
　このようにして得られたクローンのscFvを調製し、α９発現細胞との反応性を確認する。scFvの発現方法としては、例えば大腸菌で発現させることができる。大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列等、発現させるscFvを機能的に結合させて発現させることが出来る。例えばプロモーターとしては、lacZプロモーター、araBプロモーター等を挙げることができる。scFvの分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに発現させる場合、pelBシグナル配列（J. BacterioR1987, 169: 4379-4383）を用いるとよい。培養上清中に分泌させるにはM13ファージのg3蛋白のシグナル配列を用いることもできる。
　細胞内外に発現されたscFvは、宿主から分離し均一にまで精製することができる。例えば、pCANTAB5Eの系で発現されるscFvは、そのＣ末端にEtag配列が付加されているので、抗Etag抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて、容易に短時間で精製することができる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を組み合わせて精製することも可能である。例えば、限外濾過、塩析、ゲル濾過／イオン交換／疎水クロマト等のカラムクロマトグラフィーを組み合わせれば抗体を分離・精製することができる。精製した標品については、HPLCゲルろ過分析等で分子形態を分析することができる。
　得られた抗体や抗体フラグメントのα９インテグリンに対する結合活性を測定する方法としては、ELISAやFACS等の方法がある。例えばELISAを用いる場合、α９インテグリン発現細胞を直接またはcapture抗体を介して固相化した96穴プレートに目的の抗体や抗体フラグメントを含む試料、例えば大腸菌の培養上清や精製抗体を加える。次に西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリフォスファターゼ（AP）等の酵素、フルオレセインイソシアネート、ローダミン等の蛍光物質、32P、125I等の放射性物質、化学発光物質などで標識した抗Etag抗体等の二次抗体を添加して反応させ、洗浄した後、必要に応じて検出試薬（例えばHRP標識の場合、発色基質TMBなど）を加えて、吸光度、蛍光強度、放射活性、発光量等を測定することで、抗原結合活性を評価することが出来る。
　また単離したクローンのscFv遺伝子のＶＨ及びＶＬのDNA塩基配列については、ジデオキシ法等により決定でき、得られたDNA塩基配列情報からアミノ酸配列を推定できる。
　更に、分離クローンがα９に対する機能阻害活性を有しているか否かを評価する方法としては、例えばα９依存性の細胞接着を指標とした以下の方法がある。α９のリガンドの一つであるＮ末OPN（オステオポンチンがトロンビンにより切断された後のＮ末端側フラグメント）のRAA改変体（他のインテグリンとの反応を抑えるためにRGD配列をRAAに改変したもの）をプレートに固定化し、ブロッキングを行う。各種抗体を添加した後、α９発現細胞を添加し、37℃で１時間インキュベートする。細胞をCrystal violetとメタノールを用いて固定・染色して、洗浄後、接着した細胞中の色素をTriton X-100で抽出し、波長595nmにおける吸光度を測定する。それにより抑制作用が確認されれば、当該抗体はα９に対する機能阻害活性を有しているものと判断される。
　ここで、scFvは一価の抗体フラグメントであるが、IgG型またはscFv-Fc型の二価の抗体にすることで、Avidityの効果により親和性や阻害効果が大きく向上する場合のあることが知られている。また、IgG型またはscFv-Fc型のように分子量の比較的大きな分子形態の方が、scFv等のような分子量の比較的小さな分子形態よりも、体内安定性に優れており、半減期が長いこともよく知られたことである。
　よって、例えば分離クローンについて以下のようにscFv-Fc型に分子形態を変換させ、評価を行うとよい。分離クローンのscFv遺伝子領域をPCR増幅し、マウスまたはヒトFc融合蛋白質発現ベクターに挿入することにより、scFv-Fcの発現ベクターを構築する。このようなマウスまたはヒトFc融合蛋白質発現ベクターの例としては、例えば、pFUSE-mIgG1-FcまたはpFUSE-hIgG1-Fc(InvivoGen社)が使用可能である。当該ベクターにおいては、細胞外への分泌発現を促すリーダー配列とscFv遺伝子、及びマウスまたはヒトFc遺伝子領域が連結されており、その発現は各種プロモーターにより制御される。
　構築したscFv-Fc発現ベクターは、Lipofectamine 2000（Invitrogen）等を用いることにより、CHO細胞等の培養細胞に遺伝子導入される。発現ベクターのマーカー（ネオマイシン等）を含む選択培地で拡張培養を行い、培養上清を回収して、Protein Aカラムクロマトグラフィー等により精製を行うことができる。得られたscFv-Fc精製標品は、scFvと同様に、HPLCゲルろ過やELISA、FACS、或いはα９依存性細胞接着阻害試験等により分析するとよい。ELISAにおいては、HRP標識抗マウスIgG抗体等で、FACSにおいてはFITC標識抗マウスIgG抗体等で検出を行うことができる。コントロール抗体としてヒトα９に対するマウスモノクローナル抗体Y9A2（CHEMICON）を用いるとよい。
　次に、抗体のエピトープ解析について述べる。
　機能阻害活性を有する抗体クローンのエピトープを同定できれば、α９の中和エピトープを明らかにすることができる。エピトープの解析は、例えば以下のようにして行うことができる。α９のアミノ酸置換体を構築して、当該抗体との反応性を解析する。アミノ酸置換により、抗体との反応性に変化が認められれば、置換した部位が抗体のエピトープである可能性が強く示唆される。アミノ酸置換の方法としては、例えば、ヒトα９とマウスα９の配列を入れ替える、α９とα４の配列を入れ替える、或いはα９の配列をAlaに置換する等の方法がある。
　インテグリンファミリーのα鎖に共通する特徴として、細胞外領域Ｎ末端部分に位置するβプロペラドメインが、リガンドとの相互作用部位であると言われている（Science, 296, 151-155, 2002）ことから、この領域内に中和エピトープが存在する可能性は高いと思われる。よって、βプロペラドメインを解析の対象としてもよい。
　また、α４のリガンド結合部位及び中和エピトープを解析した文献（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 7198-7203, 1997）で、βプロペラドメイン内のR1からR5と呼ばれるリピート部分（ループ領域に対応）の内、R2とR4がリガンド結合に重要であり、またR2、R3a及びR3cが中和エピトープになりうるとの結果が示されている。これらのことから、ループ領域が中和エピトープになっている可能性は高いと思われる。よって、βプロペラドメイン中のループ領域に対象を絞って解析を行ってもよい。
　更に、それまでの解析結果より、当該抗体の種特異性に関する知見が得られていれば、それを利用することも可能である。例えば、ヒトα９及びマウスα９に対する反応性の強さに違いが認められていれば、エピトープ領域のアミノ酸配列がヒトとマウスとでは多少異なっている可能性が考えられる。ヒトα９とマウスα９とは高い相同性を有していることから、解析の対象とする部位の候補の内、ヒトα９とマウスα９とでアミノ酸配列が異なっている部位を選択すれば、更に候補部位が絞られ、効率的に解析を行うことが可能となる。
　また、ヒトα９改変体の発現を確認するためのマーカーとしてEGFP等の蛍光蛋白質を用いるとよい。例えば、α９のＣ末端（細胞質領域）にEGFPを融合させたα９-EGFP融合体を構築すれば、蛍光によりα９の発現を確認でき、その発現量に応じた抗体の反応性を評価することができるため、より定量的な評価が可能となる。
　そのようなα９或いはα９-EGFP融合体のアミノ酸置換体をsite-directed mutagenesis法等により構築する。それらを発現ベクターにクローニングし、CHO細胞等の培養細胞にそれぞれ導入する。一過性発現または安定発現させた細胞集団について、野生型または改変型α９（或いはα９-EGFP）の発現と、それらの当該抗体との反応性をELISA或いはFACS等を用いて評価することができる。例えばα９-EGFPをベースとして各種アミノ酸置換体を構築し、抗体との反応性をFACSにより解析した場合、横軸にα９-EGFPの発現、縦軸に抗体との反応性を示せば、発現量あたりの抗体との反応性を議論することが可能となる。
　このようにして解析した結果、α９のアミノ酸置換により、当該抗体との反応性に変化が認められれば、置換した部位が当該抗体のエピトープ（或いはエピトープの一部）であると推察される。
　次に、抗体の薬効評価について述べる。
　α９については炎症への関与が強く示唆されていることから、マウス病態モデル系としては、代表的な関節炎モデルであるマウスコラーゲン抗体誘導関節炎等を用いるとよい。例えば以下のような手順で、各抗体クローンのマウスコラーゲン抗体誘導関節炎に対する薬効を評価することができる。
　抗コラーゲン抗体カクテルをマウスに投与して、３日後にLPSを投与することにより、関節炎の発症を誘導する。LPS投与の当日と３日後に、当該クローンのscFv-Fcを500、170、56μg/headで腹腔内投与する。経時的にマウス全肢の腫脹の程度を観察・スコア化し、各群の平均値の推移をグラフ化する。その結果として、scFv-Fcの濃度依存的な関節炎抑制効果が認められれば、当該クローンは関節炎に対する薬効を有しているものと判断される。
　或いは、もう一つの代表的な関節炎モデルであるマウスコラーゲン誘導関節炎に対する抑制効果を評価するとよい。コラーゲン抗体誘導関節炎では急性期の炎症反応が惹起されるのに対し、コラーゲン誘導関節炎では免疫反応を介した慢性的な炎症応答が引き起こされることが知られている。例えば以下のような手順で、当該クローンのマウスコラーゲン誘導関節炎に対する薬効を評価することができる。
　ウシＩＩ型コラーゲンを３週間隔で２回マウスに投与することにより、関節炎の発症を誘導する。２回目の投与の４日後、６日後、８日後、１０日後及び１２日後に当該クローンのscFv-Fcを500、170、56μg/headで腹腔内投与する。経時的にマウス全肢の腫脹の程度を観察・スコア化し、scFv-Fcの濃度依存的な関節炎抑制効果が認められるかどうかを評価する。
　また、関節リウマチは関節破壊を伴う慢性の炎症性疾患であり、関節破壊は患者の自由度を奪いQOLの大きな低下をもたらす。現在までに使用されている関節リウマチ治療剤には、抗炎症作用は有するものの、関節破壊を効果的に抑制するものは存在せず、今後は、強い抗炎症作用と共に、関節破壊抑制作用を併せ持つ関節リウマチ治療剤の開発が望まれている。従って、例えば、以下のように当該クローンの破骨細胞分化に対する抑制効果を評価してもよい。
　上記の関節炎誘導マウスから骨髄細胞を採取し、当該クローンのscFv-Fcと共にRANKL及びM-CSFを含んだαMEM培地で培養を行った後、破骨細胞（TRAP陽性細胞）数を計数し、破骨細胞への分化に対する抑制効果を評価する。また、別の方法としては、関節炎の誘導と同時に当該scFv-Fcを投与し、翌日に該マウスから骨髄細胞を採取してRANKL及びM-CSFを含んだαMEM培地で培養し、破骨細胞数を計数して評価する。
　次に、抗体の親和性向上について述べる。
　抗体の可変領域について、アミノ酸置換等の改変を行うことにより、親和性や特異性が向上或いは変化した例は数多く報告されている。得られた抗体が十分な親和性や特異性を有していない場合、当該抗体についても、例えば以下のようにして親和性や特異性を向上させることは可能と思われる。
　改変の方法としては、当該分野で公知の種々の方法が存在し、例えば、部位を特定してAla等の特定のアミノ酸に置換する方法（例えば、Current Protocols in Molecular Biology edit. 1987, 5: Section 8, 1-8）やランダムアミノ酸を導入する方法（いずれもsite-directed mutagenesis法により行うことができる）、更には部位を特定せずに抗体の可変領域にランダムにアミノ酸置換を導入する方法（random mutagenesis法により行うことができる）（例えば、PCR methods and Applications, 1992, 2: 28-33）等がある。
　多くの場合、抗体可変領域の内、抗原認識に最も大きく寄与しているのはＶＨのCDR3領域であることから、本領域を改変の対象部位としてもよい。
　また、scFv改変体ディスプレイファージライブラリーを作製し、元のクローンよりも親和性または特異性が向上した改変体をスクリーニングすることもできる。
　取得した改変体クローンについては、元のクローンと同様に、例えばscFvやscFv-Fcの分子形態で標品を調製し、反応性や機能阻害活性、更には薬効について評価するとよい。その結果、元のクローンより優れた性状とヒトα９への反応性、そして薬効が確認されれば、α９が病態形成に寄与する疾患に対する予防または治療薬となりうる可能性が大いに期待されることとなる。
　本発明者らは、上記の方法により抗α９インテグリンscFvの取得を試みた結果、α９インテグリンに対して特異的な反応性を有するscFvクローンMA9-413を取得することに成功した。scFvからscFv-Fcの形に分子形態を変換させて評価した結果、本クローンは、ヒトα９及びマウスα９の両方に対する反応性と、両方に対する機能阻害活性を有するという、これまでに報告されたものとは全く異なる性状であることが確認された。
　さらに本発明者らは、クローンMA9-413についてエピトープ解析を行ない、ヒトα９インテグリンの104番目のArgから122番目のAspまでの領域（配列番号３６：Swiss-Prot AC：Q13797に記載のヒトα９インテグリン アミノ酸配列のＮ末端を１として番号付けを行った）が主として構成するエピトープ、及び当該マウスα９インテグリンの105番目のArgから123番目のAspまでの領域（配列番号３７：GenBank ACCESSION：AJ344342に記載のマウスα９インテグリン アミノ酸配列のＮ末端を１として番号付けを行った）が主として構成するエピトープを認識することを明らかにした。この領域はこれまでに他のインテグリンファミリーの研究でその機能や役割についての報告がなされていないループ領域であり、本発明者らはここをＬ１領域と命名した。
　この様な特性を有する抗体及び抗体フラグメントが有する薬効を調べた結果、マウス関節炎モデルにおいて炎症や関節腫脹を有意に抑制するという効果が確認された。
　すなわち、本発明のヒト抗α９インテグリン抗体及び抗体フラグメントは、α９インテグリンのＬ１領域が形成するエピトープを認識し、マウスα９インテグリンとヒトα９インテグリンの両方に反応性を有するという、これまでに報告例のない性質を有するものである。このような性質を有する本発明の抗体及び抗体フラグメントは、α９インテグリンが関与する各種疾患に対する新規な診断、予防または治療薬として産業利用が可能であることが期待される。
　また、本発明のヒト抗α９インテグリン抗体及び抗体フラグメントは、マウスα９インテグリンとヒトα９インテグリンの両方に反応性を有するので、上述したように、同一抗体で、マウスを用いた薬理試験のデータを取得し、更にヒトを対象とした臨床試験を実施して、抗体医薬の開発を進めることが可能であり、この点は産業上非常に大きなメリットであると言える。
　また本発明は、Ｌ１領域という新たな中和エピトープを見出したことにより、α９インテグリンひいてはインテグリンファミリー全般に関する研究或いは産業への応用に対して、新たな可能性を提供するものである。
　更に、本発明者らは、上記クローンMA9-413に対する分子改変を行い、ヒトα９インテグリンに対する反応性が大きく向上した複数のクローンMA9-418、HA9-107、HA9-143及びHA9-212を得ることに成功した。これらのクローンは、MA9-413より更に有効な薬剤となりうるものと期待される。
　本発明者らによって取得された、上記性質を有するscFvクローンのＶＨ鎖及びＶＬ鎖のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列は、下記の通りである。
（１）クローンMA9-413
　クローンMA9-413のＶＨ鎖のアミノ酸配列を配列番号１に示した。当該ＶＨ鎖のCDR1～3のアミノ酸配列を配列番号２～４に示した。すなわち、配列番号１に示すＶＨ鎖のアミノ酸配列において、３１番目～３５番目のアミノ酸配列がCDR1（配列番号２）、５０番目～６６番目のアミノ酸配列がCDR2（配列番号３）、９９番目～１１５番目のアミノ酸配列がCDR3（配列番号４）に対応している。また、当該ＶＨ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号５に示した。
　また、クローンMA9-413のＶＬ鎖のアミノ酸配列を配列番号６に示した。当該ＶＬ鎖のCDR1～3のアミノ酸配列を配列番号７～９に示した。すなわち、配列番号６に示すＶＬ鎖のアミノ酸配列において、２３番目～３５番目のアミノ酸配列がCDR1（配列番号７）、５１番目～５７番目のアミノ酸配列がCDR2（配列番号８）、９０番目～９６番目のアミノ酸配列がCDR3（配列番号９）に対応している。また、当該ＶＬ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１０に示した。
（２）クローンMA9-418
　クローンMA9-418のＶＨ鎖のアミノ酸配列を配列番号１２に示した。当該ＶＨ鎖のCDR1～3のアミノ酸配列を配列番号１３～１５に示した。すなわち、配列番号１２に示すＶＨ鎖のアミノ酸配列において、３１番目～３５番目のアミノ酸配列がCDR1（配列番号１３）、５０番目～６６番目のアミノ酸配列がCDR2（配列番号１４）、９９番目～１１５番目のアミノ酸配列がCDR3（配列番号１５）に対応している。また、当該ＶＨ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１６に示した。
　また、クローンMA9-418のＶＬ鎖のアミノ酸配列は、クローンMA9-413のＶＬ鎖と同一である（配列番号６）。
（３）クローンHA9-107
　クローンMA9-107のＶＨ鎖のアミノ酸配列を配列番号１８に示した。当該ＶＨ鎖のCDR1～3のアミノ酸配列を配列番号１９～２１に示した。すなわち、配列番号１８に示すＶＨ鎖のアミノ酸配列において、３１番目～３５番目のアミノ酸配列がCDR1（配列番号１９）、５０番目～６６番目のアミノ酸配列がCDR2（配列番号２０）、９９番目～１１５番目のアミノ酸配列がCDR3（配列番号２１）に対応している。また、当該ＶＨ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号２２に示した。
　また、クローンMA9-107のＶＬ鎖のアミノ酸配列は、クローンMA9-413のＶＬ鎖と同一である（配列番号６）。
（４）クローンHA9-143
　クローンHA9-143のＶＨ鎖のアミノ酸配列を配列番号２４に示した。当該ＶＨ鎖のCDR1～3のアミノ酸配列を配列番号２５～２７に示した。すなわち、配列番号２４に示すＶＨ鎖のアミノ酸配列において、３１番目～３５番目のアミノ酸配列がCDR1（配列番号２５）、５０番目～６６番目のアミノ酸配列がCDR2（配列番号２６）、９９番目～１１５番目のアミノ酸配列がCDR3（配列番号２７）に対応している。また、当該ＶＨ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号２８に示した。
　また、クローンHA9-143のＶＬ鎖のアミノ酸配列は、クローンMA9-413のＶＬ鎖と同一である（配列番号６）。
（５）クローンHA9-212
　クローンHA9-212のＶＨ鎖のアミノ酸配列を配列番号３０に示した。当該ＶＨ鎖のCDR1～3のアミノ酸配列を配列番号３１～３３に示した。すなわち、配列番号３０に示すＶＨ鎖のアミノ酸配列において、３１番目～３５番目のアミノ酸配列がCDR1（配列番号３１）、５０番目～６６番目のアミノ酸配列がCDR2（配列番号３２）、９９番目～１１５番目のアミノ酸配列がCDR3（配列番号３３）に対応している。また、当該ＶＨ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号３４に示した。
　また、クローンHA9-212のＶＬ鎖のアミノ酸配列は、クローンMA9-413のＶＬ鎖と同一である（配列番号６）。
　好ましい実施形態においては、本発明のヒト抗α９インテグリン抗体または抗体フラグメントは、配列番号２、配列番号３、配列番号４；配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５；配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１；配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７；または配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３に各々示されるアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）、及び配列番号７、配列番号８、配列番号９に各々示されるアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）を有する。より好ましい実施形態においては、該ヒト抗α９インテグリン抗体または抗体フラグメントは、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３に各々示されるアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）を有する。
　さらに好ましい実施形態においては、本発明のヒト抗α９インテグリン抗体または抗体フラグメントは、配列番号１、配列番号１２、配列番号１８、配列番号２４、配列番号３０のいずれかに示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域（ＶＬ）を有する。最も好ましい実施形態においては、該ヒト抗α９インテグリン抗体または抗体フラグメントは、配列番号３０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域（ＶＨ）を有する。
　本発明で開示されるＶＨ鎖及び／またはＶＬ鎖は、ファージ抗体法を用いてscFvの形で得られたものであり、その評価もscFv或いはscFv-Fcの分子形態で行ったが、原則として、本発明のヒト抗α９インテグリン抗体または抗体フラグメントは、それらの分子形態に限定されることはない。例えば、完全抗体としては、開示したＶＨ鎖及び／またはＶＬ鎖をヒト免疫グロブリンの定常領域と連結した完全分子型、また、抗体フラグメントとしては、scFv及びscFv-Fcのほか、ヒト免疫グロブリンの定常領域の一部と組み合わせたFab、Fab'またはF(ab')２、さらにscFvをヒト免疫グロブリンのＬ鎖の定常領域と結合させた一本鎖抗体（scAb）などの他の抗体フラグメントも、本発明に含まれる。
　本発明はまた、上記の本発明の抗ヒトα９インテグリン抗体またはその抗体フラグメントのほか、該抗体または抗体フラグメントに他のペプチドやタンパク質と融合させた融合抗体や、ポリエチレングリコールなどの高分子修飾剤を結合させた修飾抗体をも包含する。
　Ｈ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたscFvを調製する場合、ペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸10～25残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
　このようにして得られた本発明のヒト抗α９インテグリン抗体または抗体フラグメント、当該抗体または抗体フラグメントを他のペプチドまたはタンパク質と融合させた融合抗体、または当該抗体または抗体フラグメントに修飾剤が結合されてなる修飾抗体（以下、「ヒト抗α９インテグリン抗体等」と称する）は、必要によりさらに精製された後、常法に従って製剤化され、関節リウマチ等の自己免疫疾患、アレルギー、移植片拒絶反応等の免疫疾患、骨粗鬆症、慢性閉塞性肺疾患、癌等のα９インテグリンが病態形成に関与する疾患の予防および／または治療に用いることができる。
　本発明のヒト抗α９インテグリン抗体等は、好ましくは、関節リウマチの予防・治療剤として用いることができる。これらの治療剤の剤型の例としては、注射剤、点滴用剤等の非経口剤とすることができ、静脈内投与、皮下投与等により投与することが好ましい（自己免疫疾患治療剤とする場合もこれに準じればよい）。また、製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた担体や添加剤を使用することができる。
　上記製剤化に当たってのヒト抗α９インテグリン抗体等の添加量は、患者の症状の程度、年齢や使用する製剤の剤型あるいは抗体の結合力価等により異なるが、例えば、０．１ｍｇ／ｋｇないし１００ｍｇ／ｋｇ程度を用いればよい。
　本発明はまた、本発明の抗体又はそのフラグメントをコードする遺伝子、及びそれを含む発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターは、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主細胞中で本発明の抗体又はそのフラグメントをコードする遺伝子を発現し、これらポリペプチドを産生できるものであれば特に制限されない。例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）等を挙げることができる。
　本発明の発現ベクターは、本発明の抗体又はそのフラグメントをコードする遺伝子、及び当該遺伝子に機能可能に連結されたプロモーターを含み得る。細菌中で本発明のポリペプチドを発現させるためのプロモーターとしては、宿主がエシェリキア属菌の場合、例えば、Ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔａｃプロモーターなどが挙げられる。酵母中で本発明の抗体又はそのフラグメントを発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターが挙げられ、宿主がバチルス属菌の場合は、ＳＬ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが挙げられる。また、宿主が哺乳動物細胞等の真核細胞である場合、ＣＡＧプロモーター（Niwa H. et al., Gene, 108, 193-200, 1991）、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが挙げられる。
　宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン、終止コドン、ターミネーター領域および複製可能単位をさらに含み得る。一方、宿主として酵母、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン、終止コドンを含み得る。また、この場合、エンハンサー配列、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の５’側および３’側の非翻訳領域、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、または複製可能単位などを含んでいてもよい。また、目的に応じて通常用いられる選択マーカー（例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン）を含んでいてもよい。
　本発明はまた、本発明の遺伝子が導入された形質転換体を提供する。このような形質転換体は、例えば、本発明の発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより作製できる。形質転換体の作製に用いられる宿主細胞としては、前記の発現ベクターに適合し、形質転換されうるものであれば特に限定されず、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞あるいは人工的に樹立された細胞など種々の細胞（例えば、細菌（エシェリキア属菌、バチルス属菌）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）、動物細胞または昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）など）が例示される。形質転換は、自体公知の方法により行われ得る。
　本発明はまた、本発明の遺伝子を宿主細胞に発現させること、即ち、このような形質転換体を用いることを含む、本発明の抗体又はそのフラグメントの生産方法を提供する。
　本発明の抗体又はそのフラグメントの生産において、形質転換体は、栄養培地中で培養され得る。栄養培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養素（例えば、無機塩（例えば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよい。
　形質転換体の培養は自体公知の方法により行われる。培養条件、例えば温度、培地のｐＨおよび培養時間は、適宜選択される。例えば、宿主が動物細胞の場合、培地としては、約５～２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１２２，ｐ．５０１，１９５２）、ＤＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．８，ｐ．３９６，１９５９）、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１９９，ｐ．５１９，１９６７）、１９９培地（ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．７３，ｐ．１，１９５０）等を用いることができる。培地のｐＨは約６～８であるのが好ましく、培養は通常約３０～４０℃で約１５～７２時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。宿主が昆虫細胞の場合、例えば胎児牛血清を含むＧｒａｃｅ’ｓ培地（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８２，ｐ．８４０４，１９８５）等が挙げられ、そのｐＨは約５～８であるのが好ましい。培養は通常約２０～４０℃で１５～１００時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。宿主が細菌、放線菌、酵母、糸状菌である場合、例えば上記栄養源を含有する液体培地が適当である。好ましくは、ｐＨが５～８である培地である。宿主がＥ．ｃｏｌｉの場合、好ましい培地としてＬＢ培地、Ｍ９培地（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｐ．４３１，１９７２）等が例示される。かかる場合、培養は、必要により通気、撹拌しながら、通常１４～４３℃、約３～２４時間行うことができる。宿主がＢａｃｉｌｌｕｓ属菌の場合、必要により通気、撹拌をしながら、通常３０～４０℃、約１６～９６時間行うことができる。宿主が酵母である場合、培地として、例えばＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最小培地（Ｂｏｓｔｉａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．７７，ｐ．４５０５，１９８０）が挙げられ、ｐＨは５～８であることが望ましい。培養は通常約２０～３５℃で約１４～１４４時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。
　本発明の抗体又はそのフラグメントは、上述のような形質転換体を培養し、該形質転換体から回収、好ましくは単離、精製することができる。単離、精製方法としては、例えば塩析、溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動など分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーやヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。
　以下、本願発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本願発明は何らこれらに限定されるものではない。
《実施例１：抗原の調製》
　ヒトcDNA libraryを鋳型に用い、ヒトα９インテグリン遺伝子の主要ドメイン領域、及びヒトα５インテグリン遺伝子のシグナル配列領域をクローニングした。ヒトα５インテグリン遺伝子のシグナル配列領域とヒトα９インテグリン遺伝子の主要ドメイン領域を連結し、pcDNA3.1(-)ベクター（Invitrogen）に組み込んだ、ヒトα９発現ベクターを構築した。
　マウスcDNA libraryを鋳型に用い、マウスα９インテグリン遺伝子の全長をクローニングし、pcDNA3.1(+)ベクター（Invitrogen）に組み込み、マウスα９発現ベクターを構築した。
　また、コントロールとして用いるために、ヒトα４インテグリンとマウスα４インテグリンについても以下の手順でクローニングを行った。
　ヒトcDNA libraryを鋳型に用い、ヒトα４インテグリン遺伝子の全長をクローニングし、pcDNA3.1(+)ベクター（Invitrogen）に組み込み、ヒトα４発現ベクターを構築した。
　マウス脾臓由来cDNAを鋳型に用い、マウスα４インテグリン遺伝子の全長をクローニングし、pcDNA3.1(+)ベクター（Invitrogen）に組み込み、マウスα４発現ベクターを構築した。
　まず、CHO細胞にマウスα９インテグリン発現ベクター及びマウスα４インテグリン発現ベクターをそれぞれ導入し、マウスα９インテグリン発現細胞（以後、CHO/mα９と呼ぶ）及びマウスα４インテグリン発現細胞（以後、CHO/mα４と呼ぶ）をそれぞれ樹立した。
　次に、SW480細胞にヒトα９インテグリン発現ベクター及びマウスα９インテグリン発現ベクターをそれぞれ導入し、ヒトα９インテグリン発現細胞（以後、SW480/hα９と呼ぶ）及びマウスα９インテグリン発現細胞（以後、SW480/mα９と呼ぶ）をそれぞれ樹立した。
　これらの各種インテグリン発現細胞を、以降のスクリーニングや評価に使用した。
《実施例２：健常者からのファージライブラリーの構築》
　J. D. Marks ら（J. Mol. Biol., 222: 581-597, 1991）により報告されている方法を参考にし、健常者20名由来末梢血由来リンパ球を出発材料とし、ファージライブラリーを構築した。構築したVH(γ)－Vκ、VH(γ)－Vλ、VH(μ)－Vκ、VH(μ)－Vλの各サブライブラリーはそれぞれ1.1×108、2.1×108、8.4×107、5.3×107クローンの多様性を有すると評価された。
《実施例３：α９インテグリン発現細胞を用いたスクリーニング》
　以下の手順でα９に対する特異抗体の作製を行ったが、まずはマウスα９をターゲットとして機能阻害活性を有するモノクローナル抗体を構築し、マウスの病態モデル系を用いて薬効の有無を評価することとした。
　まず親株であるCHO細胞を用いて、ファージディスプレイライブラリーのサブトラクションを行った後、CHO/mα９に反応させた。反応は１時間行い、１％BSA/PBSで３回洗浄した。
　洗浄後の細胞画分を10mM HClで懸濁し、10分間インキュベートしてファージを溶出させた。溶出液を１M Tris-HCl (pH7.5)と混ぜて中和した後、TG1に感染させ、ファージを増幅させた。
　このパンニングを４round行い、マウスα９に特異的に反応するファージクローンMA9-413を単離した。
《実施例４：ファージ抗体のELISAによる反応性解析》
　MA9-413ファージ抗体のα９に対する反応性をCell ELISAにより解析した。
　96ウェルプレート（costar）にCHO/mα９及びCHOを2×104cells/100μL/wellで播種し、37℃、５％CO2で一晩培養した。培地を吸引し、PBSで洗浄した後、１％BSA/PBSで希釈したファージ抗体を反応させた。検出は、西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）標識抗M13抗体（Amersham）とTMB（SIGMA）を組み合わせて行った。波長450nm及び650nmにおける吸光度を、マイクロプレートリーダー（Molecular Devices）を用いて測定した。その結果を図１に示す。MA9-413のα９特異的な反応性が確認されたため、以降の解析を行った。
《実施例５：クローンの配列解析》
　単離したクローンのscFv遺伝子のＶＨ及びＶＬのDNA塩基配列をCEQ DTCS Quick Start Kit（BECKMAN COULTER）を用いて決定した。得られたDNA塩基配列の情報をもとに、アミノ酸配列を推定した。
《実施例６：scFvの発現と精製》
　特異クローンMA9-413からプラスミドDNAを回収して、常法に従って大腸菌JM83を形質転換した。この大腸菌を２％グルコース及び100μg/mLのアンピシリンを含む2×YT培地で一夜前培養を行い、２％グルコース及び100μg/mLのアンピシリンを含むSB培地に一部移植して本培養を行った。対数増殖期に終濃度１mMになるようにIPTGを添加し、3時間培養してscFvの発現誘導を行った。培養終了後菌体を遠心回収し、20%Sucrose及び10mM EDTAを含む100mM Tris-HCl溶液（pH7.4）に懸濁して氷中で30分菌体を静置した。次いで8,900×gで30分間遠心し、上清を回収して0.45μmフィルター濾過後に得られた画分をペリプラズム画分とした。これを出発材料とし、SPカラムクロマトグラフィー（Amersham）またはRPAS Purification Module（Amersham）で常法に従ってscFvを精製し、得られた溶出画分をPBSで透析してscFv精製標品とした。
《実施例７：scFvのELISAによる反応性解析》
　実施例６で調製したscFv精製品について、α９に対する反応性をCell ELISAにより解析した。検出にはHRP標識抗Etag抗体（Amersham）を用い、その他は実施例４と同様の条件で行った。その結果、図２に示すように、濃度依存的かつ特異的な反応性が確認された。
《実施例８：scFvのα９依存性細胞接着阻害能の評価》
　MA9-413 scFvがα９依存性の細胞接着を阻害しうるかを、以下の方法で評価した。
　Ｎ末OPN改変体（RGD配列をRAAに改変したOPN変異体）をプレートに固定化し、ブロッキングを行った。MA9-413 scFv精製品を添加した後、続けてSW480/mα９を添加し、37℃で１時間インキュベートした。細胞をCrystal violetとメタノールを用いて固定・染色して、洗浄後、接着した細胞中の色素をTriton X-100で抽出し、波長595nmにおける吸光度を測定した。
　その結果、図３に示すように、濃度依存的な抑制作用が認められ、MA9-413はマウスα９に対する機能阻害活性を有していることが確認された。
《実施例９：scFv-Fc発現ベクターの構築》
　次に、本クローンを二価の抗体にすることで、より機能阻害活性が向上することを期待して、scFv-Fcの分子形態への変換を実施した。MA9-413のscFv遺伝子領域をPCR増幅し、マウスFc融合蛋白質発現ベクターのSalＩサイト及びBamHＩサイトに挿入することにより、図４に示すscFv-Fcの発現ベクターを構築した。本ベクターにおいては、細胞外への分泌発現を促すリーダー配列とscFv遺伝子、及びマウスIgG1のFc領域をコードする遺伝子が連結されており、その発現はCAGプロモーターにより制御されている。また本ベクターは、薬剤耐性遺伝子として、ネオマイシン耐性遺伝子とアンピシリン耐性遺伝子とを有している。
《実施例１０：scFv-Fcの発現及び精製》
　Lipofectamine 2000（Invitrogen）を用いて、構築したscFv-Fc発現ベクターをCHO-DG44株に遺伝子導入した。500μg/mLのネオマイシンと10%ウシ血清を含むα-MEM培地（Invitrogen）またはEX-CELL302培地（ニチレイバイオサイエンス）で培養を行い、培養上清を回収した。常法に従ってProtein Aカラムクロマトグラフィーでアフィニティー精製を行い、PBSで透析を行った。得られたscFv-Fc溶液を精製標品とした。
《実施例１１：scFv-FcのELISAによる反応性解析》
　MA9-413 scFv-Fcのマウスα９及びヒトα９に対する反応性をCell ELISAにより解析した。抗原にはSW480/mα９、SW480/hα９及びSW480を、希釈液には５％FBSを含む１％BSA/PBSを、検出にはHRP標識抗マウスIgG抗体（ZYMED）を用い、その他は実施例４と同様の条件で行った。その結果、図５に示すように、マウスα９及びヒトα９に対する濃度依存的かつ特異的な反応性が確認された。一方、コントロールとして評価したY9A2抗体は、ヒトα９には反応したがマウスα９には全く反応性を示さなかった。この結果より、MA9-413はマウスα９とヒトα９のいずれをも認識しうるという、これまでに報告例のない新規な反応性を有する抗体クローンであることが確認された。
《実施例１２：scFv-Fcのフローサイトメトリーによる反応性解析》
　さらに、MA9-413　scFv-Fcの反応性についてフローサイトメトリーによる評価を行った。
　MA9-413 scFv-FcをSW480、SW480/mα９及びSW480/hα９のそれぞれに対して反応させ、フローサイトメトリー解析を行ったところ、マウスα９及びヒトα９に対する反応性が確認された。また、CHO及びCHO/mα４のそれぞれに対しても同様にして反応性を評価したが、マウスα４に対する反応性は確認されなかった（図６）。これらの結果から、MA9-413 scFv-Fcはマウス及びヒトのα９に対して高い特異性をもって反応していることが確かめられた。
《実施例１３：scFv-Fcのα９依存性細胞接着阻害能の評価》
　MA9-413 scFv-Fcがマウスα９及びヒトα９依存性の細胞接着を阻害しうるかを評価した。
　まず、リガンドがOPNの場合の細胞接着について、SW480/mα９またはSW480/hα９を用い、その他は実施例８と同様の条件で行った。
　また、リガンドがVCAM-1の場合の細胞接着について、以下の方法で評価した。
　マウスVCAM-1/Fcをプレートに固定化し、ブロッキングを行った。細胞はSW480/mα９を用い、その他は実施例８と同様の条件で行った。
　その結果、図７に示すように、いずれにおいても濃度依存的な抑制作用が認められ、MA9-413はマウスα９及びヒトのα９に対して機能阻害活性を有し、またリガンドがOPNの場合もVCAM-1の場合も同様に作用しうることが示された。
《実施例１４：MA9-413のエピトープ解析》
　マウスα９及びヒトα９のいずれにも反応性を有し、いずれに対しても機能阻害活性を示すという、これまでに報告例のない性状を有するMA9-413について、エピトープを同定することを目的として、以下の解析を行った。
　インテグリンファミリーのα鎖に共通する特徴として、細胞外領域Ｎ末端部分に位置するβプロペラドメインが、リガンドとの相互作用部位であると言われている（Science, 296, 151-155, 2002）。そこでまず、中和エピトープはこの領域内に存在するという仮説を立てた。
　次に、文献報告されていたヒトα４のβプロペラドメインの立体構造モデルを参考にして（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 65-72, 1997）、ヒトα９のβプロペラドメインの立体構造モデルを作製した。そのモデルから、βシート領域及びループ領域を推定した（後述）。
　また、α４のリガンド結合部位及び中和エピトープを解析した文献で、βプロペラドメイン内のＲ１からＲ５と呼ばれるリピート部分（ループ領域に対応）の内、Ｒ２とＲ４がリガンド結合に重要であり、またＲ２、Ｒ３ａ及びＲ３ｃが中和エピトープになりうるとの結果が示されている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 7198-7203, 1997）。これらのことから、MA9-413のエピトープもループ領域である可能性が高いと考えた。
　そこで、α４について得られている知見をα９に応用するために、我々がクローニングしたヒトα４、ヒトα９及びマウスα９について、βプロペラドメインのアミノ酸配列をアラインメントし、配列比較を行った（図８）。図８に示したヒトα４、ヒトα９及びマウスα９それぞれのβプロペラドメインのアミノ酸配列を、配列番号３８、配列番号３９及び配列番号４０に示した。モデルから推定されたループ領域の内、Ｒ１からＲ５に該当しない４つについては、Ｌ１～Ｌ４と命名することとした。これまでの検討結果より、MA9-413はヒトα９に対する反応性よりもマウスα９に対する反応性の方が強いことが示唆されており、そのことはエピトープ領域のアミノ酸配列がヒトとマウスとでは多少異なっている可能性を示唆している。そこで、ループ領域の内、ヒトα９とマウスα９とでアミノ酸配列が異なっているものを選択したところ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５及びＬ１の４つに絞られた。
　次に、ヒトα９をベースとして上記４つのループ領域それぞれについてアミノ酸置換した改変体を構築し、MA9-413との反応性を評価することとした。まず、ヒトα９改変体の発現を確認するためのマーカーとしてEGFPを用いることとし、ヒトα９のＣ末端（細胞質領域）にEGFPを融合させたヒトα９-EGFP融合体（以後、hα９-EGFPと呼ぶ）の遺伝子を構築した。EGFP遺伝子はpEGFP-N1ベクター（Clontech）を鋳型としたPCR法により増幅し、更にassembly PCRを行ってヒトα９遺伝子と連結した。制限酵素切断部位を利用して、実施例１に記載したヒトα９発現ベクターに組み込み、hα９-EGFP発現ベクターを構築した。
　上記ヒトα９-EGFP融合体発現ベクターをベースとして、４つのループ領域改変体の発現ベクターを作製した。Ｒ１については47番目のPro（図８の番号付けに従う。以下、同様）をAlaに置換した改変体（以後、hα９/mR1-EGFPと呼ぶ）を、Ｒ４については243番目のLysをGluに置換した改変体（以後、hα９/mR4-EGFPと呼ぶ）を、Ｒ５については286番目のGlyをAlaに置換した改変体（以後、hα９/mR5-EGFPと呼ぶ）を、Ｌ１については77番目のLysをArgに、78番目のAsnをThrに、81番目のThrをAlaに、82番目のSerをProに、89番目のGluをGlyに置換した改変体（以後、hα９/mL1-EGFPと呼ぶ）をsite-directed mutagenesis法により構築した。
　更に、βプロペラドメインが確かにエピトープであることを確認するために、βプロペラドメイン全体をヒトα４のβプロペラドメインと置換した改変体（以後、hα4/9-EGFPと呼ぶ）を次のようにして構築した。ヒトα９遺伝子の制限酵素BlpＩサイトとStuＩサイト間の領域がちょうどβプロペラドメインに相当するため、その領域に相当するヒトα４遺伝子領域をBlpＩサイトとStuＩサイトをそれぞれ付加したプライマーを用いて、ヒトα４発現ベクターを鋳型にPCR増幅し、BlpＩとStuＩで切断後、上記ヒトα９-EGFP融合体発現ベクターのBlpＩサイトとStuＩサイト間の領域と置換した。
　上記の野生型及び5種の改変体の発現ベクターをCHO細胞にそれぞれ導入し、一過性発現させた細胞集団を得て、野生型または改変型α９-EGFPの発現と、それらの抗体との反応性を、まずはFACScan（BECTON DICKINSON）を用いて評価した。
　各種α９発現細胞集団を、２％正常ウサギ血清と0.05％NaN3とを含む１％BSA/PBSで希釈したMA9-413 scFv-Fcまたはコントロール抗体と、氷上で30分間反応させた。洗浄後、PerCP標識抗マウスIgG1抗体（BECTON DICKINSON）と氷上で30分間反応させ、更に洗浄した後、FACScanに取り込み解析を行った。その結果を図９に示す。横軸は野生型または改変型α９-EGFPの発現を示しており、縦軸は各種抗体との反応性を示している。MA9-413 scFv-Fcの反応パターンに関しては、hα９/mL1-EGFPのみで異なるという結果になっており、hα９-EGFPをはじめ他の改変体と比較して、発現量当たりの反応性が高くなっている。hα９/mL1-EGFPはＬ１領域をヒトの配列からマウスの配列に置換した改変体であり、MA9-413はヒトα９よりもマウスα９に強く反応することから、この結果はMA9-413のエピトープがＬ１領域であることを強く示唆するものである。
　次に、Cell ELISAによる解析を行った。遺伝子導入後約24時間が経過した各種細胞を回収して、96ウェルプレートに2×104cells/100μL/wellで播種した。その他は実施例１１と同様の条件で行った。その結果、図１０に示すように、hα９/mL1-EGFPのみが野生型hα９-EGFPよりもMA9-413 scFv-Fcと高く反応する傾向を示し、ここでもＬ１領域がMA9-413のエピトープであることを示唆する結果が得られた。
　上述したように、これまでα９インテグリンに関する構造学的な知見は非常に乏しい状況であったことから、今回初めて中和エピトープが明らかにされたことの意義は大きい。また、これまで他のインテグリンファミリーのα鎖でも注目されていなかったＬ１と名付けた領域が、重要な機能を担っている、或いは機能阻害のためのターゲットとなり得る可能性を見出した今回の結果が、関連分野に与えるインパクトは多大であると思われる。
《実施例１５：マウス関節炎モデルに対するscFv-Fcの薬効評価１》
　反応パターンのみならず、エピトープも新規な領域であることが分かったMA9-413のscFv-Fcについて、マウス関節炎モデルに対して薬効を示しうるかを検討した。
　まず、代表的な関節炎モデルの一つであるマウスコラーゲン抗体誘導関節炎に対する効果を調べた。抗コラーゲン抗体カクテルをマウスに投与して、3日後にLPSを投与することにより、関節炎の発症を誘導した。LPS投与の当日と３日後に、MA9-413 scFv-Fcを500、170、56μg/headで、コントロールマウス抗体を500μg/headで腹腔内投与した（各群４～８匹ずつ）。継時的にマウス全肢の腫脹の程度を観察・スコア化し、各群の平均値の推移をグラフ化したものを図１１に示した。その結果、MA9-413 scFv-Fcの濃度依存的な関節炎抑制効果が認められた。500μg/head投与群の６日目のスコアにおいては、ポジティブコントロール群のプレドニゾロン投与群とほぼ同等にまで抑制されており、十分に強い薬効つまり抗炎症作用を有することが確認された。
《実施例１６：マウス関節炎モデルに対するscFv-Fcの薬効評価２》
　次に、もう一つの代表的な関節炎モデルであるマウスコラーゲン誘導関節炎に対してもMA9-413 scFv-Fcが薬効を示すかを評価した。実施例１５のコラーゲン抗体誘導関節炎では急性期の炎症反応が惹起されるのに対し、コラーゲン誘導関節炎では慢性的な炎症応答が引き起こされることが知られている。
　ウシＩＩ型コラーゲンを３週間隔で２回マウスに投与することにより、関節炎の発症を誘導した。２回目の投与の４日後、６日後、８日後、10日後及び12日後にMA9-413 scFv-Fcを500、170、56μg/headで、コントロールマウス抗体を500μg/headで、ポジティブコントロールとしてエタネルセプトを500、150μg/headで腹腔内投与した（各群10匹ずつ）。継時的にマウス全肢の腫脹の程度を観察・スコア化し、各群の平均値の推移をグラフ化したものを図１２に示した。その結果、MA9-413 scFv-Fcの濃度依存的な関節炎抑制効果が認められた。500μg/head投与群においては、ポジティブコントロール群のエタネルセプト500μg/head投与群を上回る抑制効果であり、十分に強い薬効を有することが確かめられた。
《実施例１７：破骨細胞分化に対するscFv-Fcの薬効評価》
　さらに、関節炎モデルにおける破骨細胞分化に対する効果を調べた。上記実施例１５で使用したマウスコラーゲン抗体誘導関節炎において、関節炎を惹起するLPSの投与翌日のマウスの大腿骨より骨髄細胞を採取し、RANKL（最終濃度30ng/mL）およびM-CSF（最終濃度100ng/mL）を含んだαMEM培地にて培養することにより破骨細胞の分化を誘導した。培養交換は開始後3日目に１度行った。培養開始後7日目にTRAP（酒石酸抵抗性酸フォスファターゼ）染色を行い、染色された細胞を破骨細胞として細胞数を計測した。なお、ネガティブコントロールとして、抗HBs抗体を使用した。その結果、関節炎を誘導したマウスの骨髄細胞にMA9-413を2μg/mL加えておくと破骨細胞への分化を強く抑制した（図１３上）。また、LPS投与と同時にマウスにMA9-413　250μg/headを静脈内投与した翌日に採取した骨髄細胞を用いた場合においても破骨細胞の分化を抑制した（図１３下）。
　上記の実施例１５と実施例１６の結果から、MA9-413は急性期と慢性期のいずれの炎症反応をも強く抑制する作用を有することが明らかとなった。また、上記の実施例１７の結果から、MA9-413が抗炎症効果と共に、炎症下における関節破壊抑制作用を併せ持つことが強く示唆された。従って、本クローンについては、従来のヒトの関節炎の治療或いは予防のための薬剤よりも優れた薬剤として利用可能であることが期待される。
《実施例１８：MA9-413の親和性向上》
　MA9-413はヒトα９よりもマウスα９に強く反応する抗体であるため、ヒトの関節炎への適用を目指すには、親和性が十分でない可能性が考えられる。そこで、MA9-413の分子改変による親和性の向上を試みた。多くの場合、抗体可変領域の内、抗原認識に最も強く寄与しているのはＶＨのCDR3領域である。MA9-413のＶＨのCDR3の配列は配列番号４に示した通りであるが、Tyrのクラスターが特徴的に配置されている。本クローンの可変領域について立体構造モデルを作製し解析した結果、108番目のTyr及び109番目のTyrが特に抗原結合面において突出して配置されている可能性が見出された。そこで、これらのTyrの抗原認識における役割を評価するため、108番目のTyrをAlaに置換した改変体scFv（以後、MA9-418と呼ぶ）及び109番目のTyrをAlaに置換した改変体scFv（以後、MA9-419と呼ぶ）の発現ベクターを、site-directed mutagenesis法により構築した。
　本ベクターより発現させたscFvについてCell ELISAにより解析した結果、MA9-413に比べてMA9-418ではマウス及びヒトのα９に対する反応性が向上しており、MA9-419ではマウス及びヒトのα９に対する反応性がほとんど消失していた。これらの結果より、108番目のTyrを至適なアミノ酸と置換することにより、α９に対する反応性が向上すること、109番目のTyrは抗原認識に必須であるため他のアミノ酸への置換は望ましくないことが示唆された。
　そこで、108番目への部位特異的なアミノ酸置換やDiversify PCR Random Mutagenesis Kit（Clontech）を用いたerror-prone PCRといった進化工学的手法（変異→淘汰→選択→増殖のサイクル）により、ヒトα９との反応性を指標に特異クローンのスクリーニングを行った。複数回の選択ステップを行い、最終的にヒトα９への反応性が向上した３クローンHA9-107、HA9-143及びHA9-212を単離した。
　それらのクローンについて実施例５と同様にDNA塩基配列を解析し、アミノ酸配列を推定した。クローンの配列を図１４に示す。
《実施例１９：scFvの発現及び精製》
　上記のクローンMA9-418、HA9-107、HA9-143及びHA9-212について、プラスミドDNAの宿主を大腸菌株JM83に変えて、scFvの発現と精製を行った。大腸菌形質転換体を2%グルコース及び100μg/mLのアンピシリンを含む2×YT培地で培養を行い、対数増殖期に終濃度１mMになるようにIPTGを添加して一夜培養することにより、scFvの発現を誘導した。培養終了後菌体を回収し、20%Sucrose及び10mM EDTAを含む100mM Tris-HCl溶液（pH7.4）に懸濁して氷中で30分菌体を静置した。次いで8,900×gで30分間遠心し、上清を回収して0.45μmフィルター濾過後に得られた画分をペリプラズム画分とした。これを出発材料とし、RPASPurification Module（Amersham）で常法に従ってscFvを精製し、得られた溶出画分をPBSで透析してscFv精製標品とした。
　精製したscFvについて、検出にHRP標識抗Etag抗体（Amersham）を用いるほかは実施例１１と同様にして、Cell ELISAにより反応性を解析した。その結果、図１５に示すように、MA9-413に比べてMA9-418、HA9-107、HA9-143及びHA9-212はヒトα９に対する反応性が向上しており、特にHA9-212では向上の程度が顕著であった。
《実施例２０：scFv-Fcの構築、発現及び精製》
　MA9-418、HA9-107、HA9-143及びHA9-212についてscFv-Fc遺伝子の構築を、実施例９と同様にして行った。
　scFv-Fcの発現は、フリースタイル293-F細胞（Invitrogen）を宿主とした一過性発現により行った。293フェクチン試薬（Invitrogen）を用いて遺伝子導入を行い、フリースタイル293発現培地（Invitrogen）で２～３日培養後、培養上清を遠心及び0.22μmフィルター濾過により回収した。
　精製はProtein Aカラムクロマトグラフィーを用いて常法に従って行った。PBS透析後に得られたscFv-Fc溶液を精製標品とした。
　調製したscFv-Fc精製品のマウスα９及びヒトα９に対する反応性を、実施例１１と同様にCell ELISAにより解析した。その結果、図１６に示すように、MA9-413に比べてMA9-418、HA9-107、HA9-143及びHA9-212はヒトα９に対する反応性が向上していた。
《実施例２１：改変体クローンのエピトープ解析》
　MA9-418、HA9-107、HA9-143及びHA9-212がMA9-413と同様にα９のＬ１領域を認識しているかどうかを調べるために、以下の検討を行った。MA9-413のファージ抗体を一定濃度にして、実施例４と同様に行ったCell ELISAにおいて、各改変体のscFv-Fcを段階希釈してサンプルと同時に添加することにより、MA9-413のファージ抗体に対して競合阻害がかかるか否かを評価した。その結果、図１７に示すように、濃度依存的に競合阻害がかかることが確認された。よって、MA9-418、HA9-107、HA9-143及びHA9-212についてもMA9-413と同様にα９のＬ１領域を認識していることが強く示唆された。
《実施例２２：改変体クローンのα９依存性細胞接着阻害能の評価》
　各改変体クローンのscFv-Fcについて、ヒトα９及びマウスα９依存性の細胞接着に対する阻害能を、実施例１３と同様に評価した。表１にIC50値をまとめた。いずれの改変体クローンも、オリジナルのMA9-413と比較して、ヒトα９に対して強い阻害能を有することが確かめられた。特に、HA9-212については、MA9-413と比較して、約1000倍のヒトα９に対する阻害能を有していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
《実施例２３：IgGの作製と調製》
　ヒトα９に対して最も高い反応性を示したクローンHA9-212について、IgGの分子形態における反応性を検討した。IgGの遺伝子構築は以下の手順で行った。まず、HA9-212のVH遺伝子領域をPCR増幅し、ヒトH鎖発現ベクターのクローニングサイトに挿入した。本ベクターにおいては、細胞外への分泌発現を促すリーダー配列とVH遺伝子、及びヒトIgG1定常領域の遺伝子が連結されており、その発現はCAGプロモーターにより制御されている。また本ベクターは、薬剤耐性遺伝子として、ネオマイシン耐性遺伝子とアンピシリン耐性遺伝子とを有している。次に、MA9-212のVL遺伝子領域をPCR増幅し、ヒトL鎖発現ベクターのクローニングサイトに挿入した。本ベクターにおいては、細胞外への分泌発現を促すリーダー配列とVL遺伝子、及びヒトκ鎖定常領域の遺伝子が連結されており、その発現はCAGプロモーターにより制御されている。また本ベクターは、dhfr遺伝子とアンピシリン耐性遺伝子とを有している。
　IgGの発現は、COS-7細胞及びフリースタイル293-F細胞（Invitrogen）を宿主とした一過性発現により行った。COS-7細胞に対してはLipofectamine2000（Invitrogen）を用いて、フリースタイル293-F細胞に対しては293フェクチン試薬（Invitrogen）を用いて遺伝子導入を行い、２～３日培養後、培養上清を遠心及び0.22μmフィルター濾過により回収した。
《実施例２４：IgGの反応性解析》
　培養上清中のIgG発現量をヒトIgG定量ELISAにより定量し、各IgG濃度におけるヒトα９及びマウスα９に対する反応性をCell ELISAにより解析した。検出にはHRP標識抗ヒトIgG(Fc)抗体（American Qualex）を用い、その他は実施例１１と同様の条件で行った。その結果、図１８に示すように、ヒトα９及びマウスα９に対する濃度依存的かつ特異的な反応性が確認され、特にヒトα９に対しては強い反応性を示した。この結果より、HA9-212はIgGの分子形態においてもα９に対する反応性を示すことが確認された。
　以上の結果より、MA9-413に改変を加えることにより得られたMA9-418、HA9-107、HA9-143及びHA9-212は、MA9-413が有する、マウスα９とヒトα９のいずれにも反応性を有し、また、Ｌ１領域を認識するという性質はそのままに、ヒトα９に対する反応性及び阻害能が大きく向上することが確認された。さらに、HA9-212についてはIgGの分子形態においてもヒトα９に対する強い反応性を示した。これらのことからMA9-413改変体については、MA9-413より優れたヒトの関節炎の治療或いは予防のための薬剤としての利用可能性が大いに期待される。
　本発明のヒトモノクローナル抗体及び該抗体フラグメントは、ヒト由来抗α９インテグリン抗体の可変領域を有し、ヒト及びマウスのα９インテグリンに対する特異的な反応性と、α９インテグリン依存の細胞接着に対する阻害活性、更に関節炎に対する抑制作用を有することから、α９インテグリンが関与する各種疾患に対する新たな診断、予防または治療薬としての利用が期待できる。
　本出願は、日本で出願された特願２００７－３４０２０３（出願日：平成１９年１２月２８日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。

Claims (16)

  1. 　ヒトα９インテグリン及びマウスα９インテグリンを認識し、該α９インテグリンとそれらのリガンドとの相互作用を阻害する、ヒト抗α９インテグリン抗体または抗体フラグメント。
  2. 　ヒトα９インテグリン（配列番号３６）の104番目のArgから122番目のAspまでの領域が主として構成するエピトープ、及びマウスα９インテグリン（配列番号３７）の105番目のArgから123番目のAspまでの領域が主として構成するエピトープを認識する、請求項１に記載の抗体または抗体フラグメント。
  3. 　以下の配列番号に各々示されるアミノ酸配列からなる（ａ）重鎖相補性決定領域及び（ｂ）軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）を有する、請求項１または２に記載の抗体または抗体フラグメント。
    （ａ）重鎖相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３
    　　　配列番号２、配列番号３、配列番号４；
    　　　配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５；
    　　　配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１；
    　　　配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７；または
    　　　配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３；
    （ｂ）軽鎖相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３
    　　　配列番号７、配列番号８、配列番号９
  4. 　配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３に各々示されるアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を有する、請求項３に記載の抗体または抗体フラグメント。
  5. 　配列番号１、配列番号１２、配列番号１８、配列番号２４、配列番号３０のいずれかに示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有する、請求項１または２に記載の抗体または抗体フラグメント。
  6. 　配列番号３０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を有する、請求項５に記載の抗体または抗体フラグメント。
  7. 　当該抗体が、完全抗体である請求項１から６のいずれかに記載のヒト抗α９インテグリン抗体。
  8. 　当該抗体フラグメントが、scFvまたはscFv-Fcである請求項１から６のいずれかに記載のヒト抗α９インテグリン抗体フラグメント。
  9. 　請求項１から８のいずれかに記載の抗体または抗体フラグメントをコードする遺伝子。
  10. 　請求項９に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
  11. 　請求項９に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
  12. 　請求項９に記載の遺伝子を宿主に発現させることによって、ヒト抗α９インテグリン抗体または抗体フラグメントを生産する方法。
  13. 　請求項１から８のいずれかに記載の抗体または抗体フラグメントを含む、関節リウマチの予防または治療剤。
  14. 　請求項１から８のいずれかに記載の抗体または抗体フラグメントの治療有効量を対象に投与する工程を包含する、当該対象における関節リウマチを予防または治療する方法。
  15. 　関節リウマチの予防または治療剤の製造における、請求項１から８のいずれかに記載の抗体または抗体フラグメントの使用。
  16. 　関節リウマチを予防または治療するための、請求項１から８のいずれかに記載の抗体または抗体フラグメント。
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