WO2006075784A1 - 抗α９インテグリン抗体とその用途 - Google Patents

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antibody
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cell
mouse
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Daisuke Kurotaki
Masashi Kanayama
Shigeyuki Kon
Toshimitsu Uede
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Gene Techno Science Co., Ltd.
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    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders

Definitions

  • the present invention relates to a monoclonal antibody that specifically recognizes human ⁇ 9 integrin and mouse 9 integrin; a hybridoma cell that produces the monoclonal antibody; a pharmaceutical composition containing the monoclonal antibody; and the monoclonal antibody.
  • ECM extracellular matrix
  • Integrins function by the formation of a 1: 1 heterodimer between ⁇ and ⁇ chains. To date, at least 8 types of ⁇ chain, 8 types of ⁇ chain and 24 types of 3/3 heterodimer have been identified and confirmed. Each integrin is known to recognize a specific ligand. Integrins are classified into subfamilies based on their specificities and functions for ligands, and RGD receptors that recognize A rg— G 1 y -A sp (RGD) sequences in collagen receptors, laminin receptors, fibronectin and vitronectin. The leukocyte-specific receptor exists only in leukocytes
  • Non-Patent Document 1 Hynes R0. 2002. Integrins: Bidirectional, Allosteric Signaling Machines. Cell 110: 673-87; Non-Patent Document 2: Miyasaka M. 2000. New edition of Adhesion Molecule handbook.
  • Osteopontin (hereinafter, abbreviated as OPN), a type of ECM, is a secreted acidic phosphorylated glycoprotein with a molecular weight of approximately 41 kDa, and is composed of milk, urine, renal tubules, osteoclasts, and osteoblasts. It is a molecule that is widely expressed in cells, macrophages, activated T cells, and tumor tissues.
  • Cell adhesion sequence GR GD S and human OPN have S VVYG LR sequence
  • mouse OPN has SLAYGLR sequence in the center of the molecule, and thrombin cleavage site immediately after that.
  • RGD integrin Via GRGD S sequence, RGD integrin It adheres to ⁇ 4 ( ⁇ 4] 3 1) and.
  • Non-Patent Document 4 Y. Yokosaki et al., (1999) The Journal of Biological
  • Non-Patent Document 5 PM Green et al., (2001) FEBS Letters 503, 75-79;
  • Non-Patent Document 6 ST Barry et al., (2000) Experimental Cell Research 258, 342- 351).
  • a4 and 9 integrins have many common ligands in addition to PN.
  • Fibronectin EDA site propeptide-vonville brand factor 1 (pp—vWF), tissue-type transglutamin ⁇ 1 z (t TG), XIII blood coagulation factor and Vascular Cell Adhesion Molecule-1 (VCAM-1) It has been known.
  • fibronectin CS-1 domain Mad CAM 1 ( ⁇ 4 ⁇ 7), etc. are known as ligands specifically recognized by 4 integrins.
  • the ligands specifically recognized by 9 integrins are known as tenascin C and plasmin.
  • the amino acid sequences of integrin subunits of ct 9, ⁇ 4 and 01 are known.
  • human ⁇ 9 is ⁇ — 002207
  • mouse ⁇ 9 is ⁇ — 13 3721
  • human ⁇ 4 is ⁇ — 000885, mouse ⁇ ; 4 is ⁇ —01057 6, human / 3 1 is ⁇ 07979, mouse j8 1 Is registered with Gen B ank as NM_010578.
  • these integrins are known to have high similarity between amino acid sequences among species.
  • Patent Document 1 discloses the healing effect of rheumatoid arthritis and hepatitis by suppressing OPN function using a neutralizing antibody against OPN-deficient mice and OPN. Further, this publication, the inflammatory disease in the development alpha 9 integrin, alpha 4 integrin sure, it SVVYGLR sequence is ⁇ column is important, receptors expressed in such immunocompetent cells to Omikuronronyu, inflammation It is disclosed to be associated with sexually transmitted diseases. Disclosure of the invention
  • the present invention was completed by finding that a specific inhibitory antibody against icitegulin has a cancer suppressing effect and an anti-inflammatory effect.
  • the present invention provides the following monoclonal antibodies, hybridoma cells, pharmaceutical compositions and the like.
  • a monoclonal antibody that specifically recognizes human ⁇ 9 integrin and mouse 9 integrin (1) A monoclonal antibody that specifically recognizes human ⁇ 9 integrin and mouse 9 integrin.
  • a hybridoma cell that produces the monoclonal antibody according to any one of (1) to (4) above.
  • a pharmaceutical composition comprising the monoclonal antibody according to any one of (1) to (4) above.
  • a pharmaceutical composition comprising both the monoclonal antibody according to any one of claims 1 to 4 and an anti- ⁇ 4 integrin antibody.
  • a diagnostic agent for an inflammatory disease comprising the monoclonal antibody according to any one of (1) to (4) above.
  • Integrin-binding functional molecules for example, 0PN, VCAM-tenacin fibronectin, pp-vWF, tTG, etc. are contained as active ingredients to suppress and promote cell and tissue remodeling Agent.
  • cells or tissues eg, tumor cells, neutrophils, smooth muscle, etc.
  • ⁇ 9 integrin-binding functional molecules eg, 0PN, VCAM-1, tenascin (:, fibronectin) Pp-vWF, tTG, etc.
  • the anti-9 integrin antibody of the present invention suppresses 9 integrin function, thereby causing cancer, such as cancer cell proliferation, metastasis, and inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis, osteoarthritis, hepatitis, bronchial asthma, fibrosis, diabetes, Arteriosclerosis, multiple sclerosis, meat It has therapeutic effects on blastoma, inflammatory bowel disease (ulcerative colitis, Crohn's disease) and autoimmune diseases.
  • the pharmaceutical composition containing both the anti- ⁇ 9 integrin antibody and the anti-4 integrin antibody of the present invention has an improved therapeutic effect on inflammatory diseases.
  • monoclonal antibodies against mouse ⁇ 9 integrin and human ⁇ 9 integrin were prepared.
  • the anti-mouse 9 integrin antibody can be used for animal experiments, and the anti-human ⁇ 9 integrin antibody can be used as a therapeutic agent.
  • Fig. 1 shows the results of analysis of the expression level of mRN N in integrin gene-introduced cells.
  • FIG. 2 shows the results of FACS analysis of anti-mouse ⁇ 9 integrin antibody.
  • FIG. 3 shows a stained image of normal tissue with anti-mouse ⁇ 9 integrin antibody.
  • Figure 4 shows a list of immunostaining results.
  • FIG. 5 shows the cell adhesion inhibitory effect of 4 anti-mouse ⁇ 9 integrin antibody clones.
  • Figure 6 compares the cell adhesion inhibitory effects of anti-mouse cx9 integrin antibody clones. '
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of antibody epitope analysis by competitive inhibition test.
  • FIG. 8 shows the results of expression analysis of a4 and a9 integrin in mouse melanoma cell lines.
  • FIG. 9 shows the results of an expression analysis of ⁇ 9 integrin in a monocytic cell line.
  • FIG. 10 shows the results of F A C S analysis of mouse neutrophils. .
  • Figure 11 shows the results of FACS analysis of mouse liver infiltrating leukocytes.
  • Figure 12 shows the inhibitory effect of B 16-BL 6 on cell adhesion by anti-integrin 4 and 9 integrin antibodies.
  • Fig. 13 shows the therapeutic effect of hepatitis due to anti-integrin 4 and 9 anti-integrin antibodies.
  • Fig. 14 shows ⁇ 9 integrin expression in tendon fibroblasts.
  • Figure 15 shows that thrombin-cleaved type 0 ⁇ increases the transcription of 13-13 mRNA in tendon fibroblasts.
  • FIG. 16 shows that anti- ⁇ 9 integrin antibody suppresses ⁇ P-13 mRNA transcription from tendon fibroblasts.
  • FIG. 17 shows that the proliferation of B16-BL6 cells was inhibited by an anti- ⁇ 9 integrin antibody.
  • FIG. 18 is a graph showing that the proliferation of B16-BL6 cells by VCAM-1 stimulation was suppressed by the combined use of anti- ⁇ 9 integrin antibody and anti- ⁇ 4 integrin antibody.
  • FIG. 19 shows the results of FACS analysis of anti-human 9 integrin antibody.
  • FIG. 20 is a graph showing the cell adhesion inhibitory effect of 4 clones of anti-human 9 integrin antibody and 9-2. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • Tysabri (registered trademark) has been accepted for approval of natalizumab, and Tysabri (registered trademark) has been designated for priority review. Tysabri® is also targeted for diseases such as Crohn's disease and rheumatoid arthritis. In addition, an anti-human 4] 31 integrin monoclonal antibody called P4C2 is used at the laboratory level.
  • the antibody against 9 integrin is human 9 integrin as an antigen, and a neutralizing antibody called Y 9 A 2 has specificity for human and guinea pig 9 integrin (A. Wang et al., (1996) Am. J. Respir., Cell. Ol. Biol. 15, 664-672) are used at the laboratory level, but not clinically.
  • the anti-human 9 integrin antibody when used as a medicine for humans, it cannot be directly administered to humans at the development stage, and its effect cannot be confirmed. In other words, animal experiments are required to confirm the effect, and if this effect is confirmed, a humanized antibody or the like will be produced.
  • mice There are many strains of mice that have a clear background of their communication, and they have a short time per generation. Furthermore, mice are known to be able to observe almost the same diseases as human diseases, so they are suitable as experimental animals, but neutral antibodies that cross-react with mouse ⁇ 9 integrin have been reported so far. It has not been.
  • an inhibitory antibody that specifically reacts with 9 integrins against humans and mice can be obtained by carefully proceeding the following 4 steps. .
  • Screening of gene-expressing cells is usually performed at the protein level or at the gene level, but this time we screened human or mouse 9 integrins by screening using cell adhesion ability, which is a function of 9 integrins. A cell line overexpressed on the cell membrane was established.
  • Human or mouse ⁇ 9 integrin-expressing cells could be used to immunize mice or hamsters, respectively.
  • mouse ⁇ 9 integrin gene was introduced into CHO-K1 cells, which are hamster ovary-derived cells, and an experimental system was constructed to increase the antibody titer of antibodies mainly against mouse ⁇ 9 integrin in the hamster. .
  • An antibody against human ⁇ 9 integrin was constructed by introducing human 9integrin into CHO-K1 cells and increasing the antibody against human ⁇ 9 integrin in mice. (3) Screening of hybridoma producing anti-mouse ⁇ 9 integrin antibody
  • ⁇ 9 integrin is applied to cells (NI ⁇ 3 ⁇ 3) different from the parent cells of immunized cells (CHO—K1). The expressed cells were used for screening.
  • clones that do not cross-react with intedarins other than a 9 integrin are selected using cells that express mouse o 4 integrin belonging to the same integrin family as ⁇ 9 integrin in NI ⁇ 3 ⁇ 3 cells.
  • an antibody that specifically reacts specifically with mouse ⁇ 9 integrin was obtained.
  • antibody means the whole antibody molecule or a fragment thereof (for example, Fab or F (ab ′) 2 fragment) capable of binding to the antigen ⁇ 9 integrin or a partial peptide thereof, It may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. Preferably, in the present invention, it means a monoclonal antibody. Still in the present invention, “antibody” includes human antibodies, humanized antibodies, and chimeric antibodies.
  • humanized antibody is a modification of an antibody derived from a species other than human, such as a mouse, so that the primary structure other than the complementarity determining part of the H and L chains has a primary structure corresponding to that of the human antibody. Structure This refers to the antibody that has been replaced with the manufactured one.
  • chimeric antibody antibody means an antibody having a Fab region and an Fc region derived from a heterologous antibody.
  • antibody fragment refers to a part of a full-length antibody, and generally refers to an antigen-binding region or a variable region.
  • antibody fragments include F ab, F ab ′, F (ab ′) 2 , and F v fragments.
  • Antibody papain digestion yields two identical antigen-binding fragments, each with one antigen-binding site, termed Fab fragments, and a fragment called “Fc” for easy crystallization. Further, by digestion with pepsin, an F (ab ′) 2 fragment that has two antigen-binding sites and can cross-link the antigen, and another fragment (referred to as p F c ′) are obtained.
  • the “F v” fragment is the smallest antibody fragment and contains the complete antigen recognition and binding sites.
  • This region is a dimer in which the variable domains of one heavy chain and light chain are strongly linked by non-covalent bonds (V H — VL dimer).
  • the three CDRs of each variable domain interact to form an antigen binding site on the surface of the V H — VL dimer.
  • Six CDRs confer an antigen binding site to the antibody.
  • even one variable domain (or half of an FV containing only three CDRs specific to the antigen) has the ability to recognize and bind antigen, although with a lower affinity than the entire binding site.
  • the Fab fragment (also referred to as F (ab)) further contains the constant domain of the light chain and the constant domain (CH1) of the heavy chain cell.
  • the F ab ′ fragment differs from the F ab fragment in that it additionally has several residues from the carboxy terminus of the heavy chain CH 1 domain containing one or more cysteines from the antibody hinge region.
  • a “monoglobulin antibody” refers to a substantially homogeneous antibody population, that is, an antibody population in which the individual antibodies constituting the population are homogeneous except for variants that exist in small amounts that may occur in nature. It refers to the obtained antibody.
  • Monoclonal antibodies are highly specific and act against a single antigenic site.
  • each monoclonal antibody is directed against a single epitope on the antigen as compared to polyclonal antibodies containing different antibodies directed against different epitopes. So In addition to its specificity, monoclonal antibodies are advantageous in that they are synthesized by hybridoma cultures that are free of other immunoglobulins.
  • the modifier “monoclonal” indicates the character of the antibody obtained from a substantially homogeneous population of antibodies, and is not intended to limit the production of the antibody by any particular method.
  • the 9 integrin used as an antigen in the present invention is (1) a protein derived from any cell expressing human or other mammalian 9 integrin, or any tissue in which those cells exist, ( 2) It may be a recombinant protein in which a gene DNA encoding ct 9 integrin, preferably cDNA, is introduced and expressed in a cell line such as bacteria, yeast or animal cells, and (3) a synthetic protein. It may be.
  • the ⁇ 9 integrin of the present invention includes an amino acid sequence of ⁇ 9 integrin of various mammals, particularly preferably the amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence of human ⁇ 9 integrin (SEQ ID NO: 1). Polypeptides having the sequence are also included.
  • ⁇ a polypeptide having substantially the same amino acid sequence '' means that a natural ⁇ 9 integrin, particularly preferably a 9 integrin derived from human, has substantially the same biological properties as Amino acids in which a plurality of amino acids in the amino acid sequence, preferably 1 to 10 amino acids, particularly preferably 1 to several (eg 1 to 5) amino acids are substituted, deleted, and / or modified
  • a plurality of amino acids in the amino acid sequence preferably 1 to 10 amino acids, particularly preferably 1 to several (eg 1 to 5) amino acids are substituted, deleted, and / or modified
  • a plurality of 'amino acids preferably 1 to 10 amino acids
  • Particularly preferred is a variant polypeptide having an amino acid sequence to which 1 to several (for example, 1 to 5) amino acids have been added. Means. Further, it may be a variant polypeptide having a plurality of such substitutions, deletions, modifications and additions.
  • the ⁇ 9 integrin of the present invention in particular ⁇ 9 integrin derived from human, is known to be a method known in the technical field such as a chemical synthesis method or a cell culture method, or a modification thereof, in addition to a gene recombination technique. It can be produced by appropriately using the method.
  • mutant polypeptides examples include synthetic oligonucleotide site mutagenesis (gapped duplex method), random mutagenesis by nitrous acid or sulfite treatment, B a 1 3 (1)
  • a method of preparing a deletion mutant with an enzyme, etc., a cassette mutation method, a linker scanning method, a misinco-poration method, a mismatch primer method, a DNA segment synthesis method, and the like can be mentioned.
  • the ⁇ 9 integrin of the present invention also includes “a part” of the ⁇ 9 integrin.
  • the “part” is a portion including a region necessary for binding to a ligand of 9 integrin, such as ⁇ ⁇ ⁇ , VCAM-1, Tenascin-C, etc.
  • SEQ ID NO: 1 The amino acid sequence represented by the 4th to 9800th position, SEQ ID NO: 2 includes the amino acid sequence represented by the 1st to 980th part.
  • the “part” of the ⁇ 9 integrin can be produced by a gene recombination technique or a chemical synthesis method according to a method known in the technical field to be described later or a modification method thereof, and a cell culture method. It can be produced by appropriately cleaving the ⁇ 9 integrin isolated by the above, particularly preferably the human-derived ⁇ 9 integrin with a proteolytic enzyme or the like.
  • the cell itself that overexpresses 9 integrin on the cell membrane by a recombinant technique, or a membrane fraction thereof can be used.
  • the ⁇ 9 integrin of the present invention includes human 9 integrin amino acid sequence.
  • a polypeptide having an amino acid sequence substantially identical to (SEQ ID NO: 1) is also included.
  • Specific examples of the polypeptide having the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include mouse ⁇ 9 integrin having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the disease mode Since mice are considered as Dell animals ⁇ 9 integrin derived from mice is preferably used as the antigen of the present invention.
  • the cell itself that overexpresses 9 integrin on the cell membrane by a recombinant technique is preferably used.
  • ⁇ 9 integrin for example, cDNA
  • cDNA a gene encoding ⁇ 9 integrin as described below is cloned using a known genetic engineering technique, or the cell itself overexpressing the 9 integrin on the cell membrane or a cell membrane fraction thereof.
  • the fraction is prepared as an antigen.
  • the antigen is administered to the animal to be immunized with the carrier itself or a carrier and a diluent at a site where antibody production is possible by administration.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered to increase antibody production at the time of administration. Administration is usually once every 1 to 6 weeks, 2 to 10 times in total. Examples of warm-blooded animals that can be used include mice, monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, rats, hamsters, hidges, goats, and chickens. In the present invention, hamsters are preferably used.
  • the subject of treatment is human and the animal producing the anti-inhibitory antibody is a mouse
  • myeloma cells cells derived from mice, rats, humans and the like are used.
  • mouse myeloma ⁇ 3 U 1, ⁇ 3 ⁇ 63—Ag 8, P 3 X 63 -Ag 8—U l, P 3NS 1—Ag 4, SP 2 / 0—Ag l 4, P 3X63—A g 8 -653
  • the antibody-producing cell and the myeloma cell are preferably derived from the same animal species, particularly from the same strain.
  • Myeloma cells should be kept frozen and passaged in a common medium supplemented with horse, rabbit, or fetus serum. can do.
  • cells in the logarithmic growth phase are preferably used.
  • P 3 X63-Ag 8-653 is preferably used.
  • Examples of methods for forming a hybridoma by fusing antibody-producing cells and myeloma cells include a method using polyethylene glycol (PEG), a method using Sendai virus, and a method using an electrofusion device.
  • PEG polyethylene glycol
  • splenocytes and myeloma cells are placed in an appropriate medium or buffer containing about 30 to 60% PEG (average molecular weight 1000 to 6000), 1 to 10: 1, preferably 5 to 10 : Suspend at a mixing ratio of 1 and react at a temperature of about 25 to 37 ° (for about 30 seconds to 3 minutes under the conditions of pH 6 to 8. After the reaction is complete, remove the PEG solution and add to the medium. Resuspend, inoculate into a cell-well plate and continue culturing.
  • PEG polyethylene glycol
  • hybridoma cells producing a monoclonal antibody can be performed according to known methods or modifications thereof. Usually, it can be performed in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine). Any culture medium may be used as the selection culture medium as long as the hybridoma cells can grow.
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • Any culture medium may be used as the selection culture medium as long as the hybridoma cells can grow.
  • RPM I 1640 medium containing 1-20%, preferably 10-20% fetal calf serum, 1-10% fetal bovine blood ..
  • S FM-101 Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • Culture temperature is usually 20 to 40 D C, preferably about 37 ° C.
  • the culture time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 to 2 weeks. Culture can be
  • Monoclonal antibodies of the present invention can be confirmed and screened using the cell ELISA method described in New Clinical Immunization Experimental Procedures (part 3), Scientific Review, 1997. When cells used for immunization are expected to have higher backrounding or more false positives, they are overexpressed in cells other than those used for immunization. And ⁇ 4 A clone that does not react with cells overexpressing integrin can be used as an anti-a9 integrin antibody. Monoclonal antibodies can be prepared from such clones by repeating the limiting dilution method 1 to 5 times, preferably 2 to 4 times. [Separation and purification of antibodies]
  • the obtained antibody can be purified to homogeneity. Separation and purification methods generally used for proteins may be used for antibody separation and purification. For example, by selecting and combining chromatography columns such as affinity chromatography, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, SDS polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, etc. Can be separated and purified
  • the obtained antibody can be labeled in various ways (eg, biotin labeling, FITC labeling, APC labeling) using known methods or commercially available kits.
  • biotin labeling using Biot in Labeling Kit (Dojindo Laboratories) is preferably used.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition containing the above monoclonal antibody.
  • the pharmaceutical composition comprising the monoclonal antibody of the present invention as an active ingredient is cancer, for example, cancer cell proliferation, metastasis, and inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis, osteoarthritis, hepatitis, bronchi Can be used as a preventive and therapeutic agent for asthma, fibrosis, diabetes, arteriosclerosis, multiple sclerosis, granulomas, inflammatory bowel diseases (ulcerative colitis, Crohn's disease) and autoimmune diseases . .
  • the pharmaceutical composition comprising the monoclonal antibody of the present invention also suppresses chronic rejection after organ transplantation, systemic autoimmune disease ⁇ lupus erythematosus ⁇ uveitis ⁇ Behcet's disease ⁇ polymyositis ⁇ filamentous body Proliferative nephritis. Can also be used to treat autoimmune diseases such as sarcoidosis.
  • the preventive and / or therapeutic agent for the above-mentioned diseases containing the antibody of the present invention has low toxicity, and is mixed with an appropriate solvent as a solution or as a pharmaceutical composition of an appropriate dosage form, such as a human or mammal (eg, , Rats, rabbits, hidges, pigs, rabbits, cats, innu, monkeys, etc.) orally or parenterally.
  • an appropriate solvent such as a solution or as a pharmaceutical composition of an appropriate dosage form, such as a human or mammal (eg, , Rats, rabbits, hidges, pigs, rabbits, cats, innu, monkeys, etc.) orally or parenterally.
  • the dose varies depending on the administration subject, target disease, symptom, administration route, etc.
  • the antibody of the present invention is administered once.
  • the amount is usually about 0.1 to 2 O mg Z kg body weight, preferably about 0:!
  • the dose may be increased according to the symptoms.
  • Antibodies of the present invention the carrier
  • the pharmaceutical composition used in ⁇ the administration is as possible out of administration, the antibody or 'other that may be a salt thereof and a pharmacologically acceptable in itself or as an appropriate pharmaceutical composition, It contains a diluent or excipient.
  • Such compositions are provided as dosage forms suitable for oral or parenteral administration.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coating tablets), pills, granules, powders, capsules (soft Syrups, emulsions, suspensions, etc.).
  • Such a composition is produced by a known method and contains a carrier, diluent or excipient usually used in the pharmaceutical field.
  • a carrier for example, lactose, starch, sucrose, magnesium stearate, etc. are used as carriers and excipients for tablets.
  • a composition for parenteral administration for example, injections, suppositories, etc.
  • injections are agents such as intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, intravenous infusions, etc. Includes shape.
  • Such an injection is prepared according to a known method, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the antibody or a salt thereof in a sterile aqueous or oily liquid usually used for injection.
  • aqueous solution for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants, etc.
  • solubilizers such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant [eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 m
  • a d d u c t o i h y d r o g e nat e d c a s t to r o ⁇ 1)] may be used together.
  • the oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as a solubilizing agent.
  • the prepared injection is usually filled in a suitable ampoule.
  • a suppository used for rectal administration is prepared by mixing the above-described antibody or a salt thereof with an ordinary suppository base. '
  • the above oral or parenteral pharmaceutical composition is preferably prepared in a dosage unit form suitable for the dose of the active ingredient.
  • dosage unit forms include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories, etc., and usually 5 to 500 mg, especially injections, for each dosage unit form. It is preferable that 5 to 100 mg of the above antibody and 10 to 250 mg of the above antibody in other dosage forms.
  • compositions may contain other active ingredients as long as the combination with the above-described antibody does not cause a favorable reaction or interaction.
  • an ⁇ 9 integrin-binding functional molecule (for example, 0PN, VCAM-1, tenascin C, fibronectin, PP-vWF, tTG, etc.) is contained as an active ingredient.
  • the dosage, administration method, formulation and the like of the active ingredient of such a therapeutic agent can be appropriately determined with reference to the description of the antibody-containing drug.
  • the pharmaceutical composition comprising the monoclonal antibody of the present invention comprises cancer, such as cancer cell proliferation, metastasis, and inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis, osteoarthritis, hepatitis, bronchial asthma, fibrosis, diabetes, Diagnostic agents for cancer metastasis, arteriosclerosis, multiple sclerosis, granulomas, etc., suppression of chronic rejection after organ transplantation, systemic autoimmune disease
  • autoimmune diseases such as death, uveitis, Behcet's disease, polymyositis, filamentous proliferative nephritis, sarcoidosis.
  • the monoclonal antibody of the present invention can specifically recognize 9 integrin, the quantitative determination of ⁇ 9 integrin in the test solution, particularly Sandwich immunoassay, competition method, immunometric method, Can be used for quantification by nebrometry and immunostaining.
  • Sandwich immunoassay, competition method, immunometric method Can be used for quantification by nebrometry and immunostaining.
  • a measurement system should be constructed by adding the usual technical considerations of those skilled in the art to the normal conditions and operation methods of each method.
  • ⁇ 9 integrin can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • various diseases associated with ⁇ 9 integrin can be diagnosed by utilizing a method for quantifying ⁇ 9 integrin in vivo using the antibody of the present invention. For example, if an increase or decrease in the expression level of ct9 integrin is detected, it may be diagnosed that the disease is likely to be a disease associated with 9 integrin, such as cancer or inflammatory disease, or likely to be affected in the future. it can.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a subject such as a body fluid or a tissue. It can be used to specifically detect the existing ⁇ 9 integrin. Also included in each fraction during the preparation and purification of antibody columns used to purify 9 integrins.
  • a 4 integrin gene is embryonic from mouse 12.5 days, a9 integrin is reverse transcribed from total RNA of B 16 — BL 6 cells (mouse melanoma cells) using random primers, and the resulting cDNA is used as a cocoon Cloning was performed by the PCR method.
  • the primers used for cloning are shown below.
  • ma4Integin-5 ' 5' -CGTGGATCCGAGCGCATGGCTGCGGAAGCGAGGTGC-3 (SEQ ID NO: 3)
  • ma4Integin-3 ' 5'-CAGCTCGAGTCAGTCATCATTGCTTTTGCTGTTGAC-3 (SEQ ID NO: 4)
  • ma9Integin-5 ' 5'-GTCAAGCTTCTGGGGATGGGCGGCCCGGCTGGGCTG-3 (SEQ ID NO: 5)
  • ma9Integin-3 5'-CGGTCTAGACACGGTGGGTCACTGGTTTTTCTGGAC-3 (SEQ ID NO: 6) '
  • ⁇ 4 integrin gene is human neutrophil
  • ⁇ 9 integrin is reverse transcribed from total RNA extracted from human peripheral mononuclear cells using random primers, and the resulting cDNA is cloned into a cocoon by PCR method Went. Used for closing
  • ha4Integin-5 ' 5' -ACGCTCGAGTGTACCATGTTCCCCACCGAGAGCGCA-3 '(SEQ ID NO: 11)
  • pCR II -TOPO registered trademark
  • Vector I Invitrogen
  • AB I PR I Each base sequence was confirmed by SM (registered trademark) 3 10 (Applied Pio Systems).
  • the nucleotide sequences of the cDNAs thus obtained were SEQ ID NO: 7 (mouse a 9) and SEQ ID NO: 8 (mouse 9), SEQ ID NO: 9 (human 9) and SEQ ID NO: 10 (human a 4). ).
  • SEQ ID NO: 7 mouse a 9
  • SEQ ID NO: 8 mouse 9
  • SEQ ID NO: 9 human 9
  • SEQ ID NO: 10 human a 4).
  • pc DNA TM 3.1 (+) In Vitrogen).
  • the resulting vectors were used for mouse 9 integrin ZpcDNA 3.1, mouse a 4 integrin // pc DN A 3.1, and human a 9 integrin, respectively.
  • Pc DNA3.1 and human ⁇ 4 integrin ZpcDNA3.1 Example 2
  • CHO-K1 cells which are hamster ovary-derived cell lines, contain ⁇ 4 integrin cDNA and 4 integrinno pc DNA3. alpha 9 integrin / / .pc DNA3. 1 was introduced and in screening by bonding effect ability of the SVVYGLR peptide of OPN, C ⁇ - ⁇ 1 cells constitutively expressing mouse ⁇ 9 integrin (mouse a SZCHO- K 1 cells) 3 clones (6 F 1, 1 2 C 3, 4N2), NI H3 T 3 cells (mouse c 9 NI H3 T 3 cells) 4 clones (2 1 H, 7A3, 1 1 C 3, 2 1 D 3) Established.
  • ⁇ 4 integrin As a control for mouse a 9 integrin, ⁇ 4 integrin, which is the same integrin subfamily, was cloned from embryonic mouse embryos 12.5 days and constitutively expressed mouse ⁇ 4 integrin ⁇ ⁇ ⁇ 3 ⁇ 3 cells (mouse ⁇ 3 clones (3G1, 4A10, 19F2) were established.
  • Monoclonal antibodies were established by repeating the limiting dilution method twice. As a result, 4 clones (11 L 2 B, 1 2 C 4 ′ 5 8, 18 R 1 8D, 5 5 A 2 C) that produced anti-mouse ct 9 integrin antibody were established. '
  • mice For antibody production against human ⁇ 9 integrin, three BALB mice were immunized with reference to subtractive immunization 3 ⁇ 4 (Williams CV, Stechmann CL, McLoon SC. Biotechniques. (1992) 12: 842-7). It was. First, administered in 4 X 1 0 6 cells animals intraperitoneally to CH0-K1 cells, the next day and the next day, 41 ⁇ Bruno animals the Shikurohosufa Mi de, was administered intraperitoneally.
  • Hypridoma cells that produce the anti-mouse ⁇ 9 integrin antibody obtained here 1 1 L 2 ⁇ , 1 February 1st, 1st East, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, from February 2, 2008 Postal code 3 0 5— 8 5 6 6), deposited at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology as receipt number F ERM ⁇ ⁇ ⁇ 1 0 1 9 7
  • hybridoma cells obtained here 1 2 C 4 '5 8 are from 1 February 2 8 1 2004 1 1 East 1 Tsukuba City, Ibaraki Prefecture 1 Central 6 (Postal code 3 0 5— 8 5 6 6) Deposited at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology as receipt number F ERM ⁇ ⁇ _ 1 0 1 9 6
  • the high-pridoma cells 1 8 R 1 8 D obtained here are from 1 February 1st, February 2004, 1st East, 1st Street, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture 1st 6th (Postal code 3 0 5— 8 5 6 6 ), Deposited to the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology as receipt number F ERM ⁇ ⁇ _ 1 0 1 9 5
  • hybridoma cells 5 5 A 2 C obtained here are from 1 February 1st, February 2004, 1st East, 1st Street, Tsukuba, Ibaraki Prefecture, 1st 6th (Postal code 3 0 5— 8 5 6
  • FACS analysis was performed using FAC SC a 1 ibur TM (vector and Dickinson )
  • FAC SC a 1 ibur TM vector and Dickinson
  • cells treated with 2.4 G 2 to block the F c receptor Piotinylated antibody (5 x gZml) (50 ⁇ l) was added, and after 30 minutes of reaction, A PC. Label, certain layers were added FITC-labeled streptavidin (501) and FACS analysis was performed.
  • Fig. 3 shows stained images of mouse brain, liver, lung, and muscle. As shown in the list of stained images (Fig.
  • Example 5 the choroid plexus of the brain, the vascular endothelium of the lung ⁇ smooth muscle ⁇ alveolar macrophages, the sinusoidal cells of the liver, the vascular endothelium of the kidney ⁇ smooth muscle ⁇ glomeruli, the smoothness of the stomach Expression of 9 integrin was observed in cells such as muscle, mucosal muscle plate, muscular vascular endothelium, myofibroblast-lymphatic tube and uterine vascular endothelium, smooth muscle, arterial smooth muscle. From these results, it was found that the anti-integrin integrin antibody found in the present invention can be used for immunostaining, and can be expected to be useful as a diagnostic agent.
  • Example 5 the anti-integrin integrin antibody found in the present invention can be used for immunostaining, and can be expected to be useful as a diagnostic agent.
  • a cell adhesion inhibition test was performed using GRGD S, tenascin C, SVVYGLR peptide and mouse 9ZN I H3 T 3 cells. It was.
  • the RGD sequence contained in the GRG DS peptide is a cell attachment site common to many ECMs.
  • AE I DG I E L peptide which is the cell adhesion site of tennessin C, can adhere to c 9 integrin but not ⁇ 4 integrin.
  • the human SVVYGLR peptide can adhere to 4 or 9 integrins.
  • the solid phase of AE IDG I EL peptide and SVVYGL R peptide were fixed at 5 ⁇ g / ml, and the concentration of the inhibitory antibody was compared in the cell adhesion inhibition test. As shown in FIG. 6, it was found that 55A 2 C had the highest inhibitory ability. The 50% inhibitory concentration (IC50) is also shown in FIG. Example 6
  • ⁇ 4 integrin and ⁇ 9 integrin belong to the same integrin subfamily and share many ligands, suggesting that they function in a similar manner. It has already been reported by the analysis of mRN ⁇ levels that existing ⁇ cells simultaneously express 44 and 99 integrins (Diao H, Kon S, Iwabuchi K, Kimura C, Morimoto J, Ito D, Segawa T , Maeda M, Hamuro J, Nakayama T, Taniguchi M, Yagita H, Van Kaer L, Onoe K, Denhardt D, Rittling S, TU 2004. Osteopontin as a mediator of NKT cell function in T cell-mediated liver diseases.
  • the inhibitory effect of anti- ⁇ 4 and ⁇ 9 integrin antibodies on 16-BL6 cells was examined in a cell adhesion test using a SVVYGLR sequence solid phase (5 ⁇ gZm 1). During bonding, it was added I mM Mn C 1 2 to the medium response.
  • the antibodies were used using an anti- ⁇ 4 integrin antibody (clone R 1-2) (Pharmingen) and an anti- ⁇ 9 integrin antibody (clone 11 L 2 B).
  • Normal rat antibody (NRG) was used as a control antibody for anti-integrin 4 integrin antibody
  • normal hamster antibody (NHG) was used as a control antibody for anti- ⁇ 9 integrin antibody.
  • the inhibitory activity was examined at 50 ⁇ g / m 1 of antibody and 25 ⁇ g / m 1 of each antibody when used in combination.
  • anti-9 integrin antibody showed a decrease in AST and ALT levels, and a therapeutic effect was found. Furthermore, the therapeutic effect could be enhanced by the combined use with anti- ⁇ 4 integrin antibody. It was found that anti- ⁇ 9 integrin antibody can treat hepatitis.
  • Example 1 2
  • Recombinant full-length type 0PN and thrombin-cleaved type 0PN were solid-phased, and tendon fibroblasts were cultured for 48 hours, and the amount of MMP-13 mRNA was quantified using real-time PCR.
  • tendon fibroblasts with thrombin-cut 0PN
  • anti-alpha 9 in integrin antibody 55A2C the culture medium so as to 30 g / ml, were examined MMP-13 mRNA amount change.
  • the anti- ⁇ 9 integrin antibody (Kukun 55A2C) suppresses the transcription level of 13-13.
  • Hamster IgG was used as a control antibody.
  • MMP-13 is also called collagenase.
  • MMP-13 is a typical collagenase in mice, but MMP-1, MMP-8, and MMP-13 are involved in humans.
  • ⁇ P-13 has been shown to be strongly involved in the exacerbation of arthritis (especially rheumatoid arthritis (RA) and osteoarthritis (OA)) (Skotnicki JS, DiGrandi MJ, L.evin JI. Design strategies). for the identification of MMP-13 and Tace inhibitors. Curr Opin Drug Di scov Devel. (2003) 6: 742-59. Review. This finding that anti-s9-intedalin antibody can suppress the transcription of MMP-13 strongly suggests that arthritis can be treated by using anti- ⁇ 9-integrin antibody.
  • Example 1 3 This finding that anti-s9-intedalin antibody can suppress the transcription of MMP-13 strongly suggests that arthritis can be treated by using anti- ⁇ 9-integrin antibody.
  • ⁇ 9 integrin is strongly expressed in B16-BL6.
  • 13-13 is involved in cancer progression (Ala-aho R, Kahari VM. Collagenases in cancer. Biochimie. (2005) 87: 273-86. Review.). Therefore, we investigated the cell growth inhibitory activity of the established four anti-mouse 9 integrin antibodies on cancer cells. 96 ° plate for cell culture (Becton and Dickinson) 10 ° / B16-BL6 cells.
  • VCAM-1 was solid-phased and the same study was performed.
  • VCAM-1 is a ligand of ⁇ 9 integrin
  • rhVCAM- ⁇ Fc chimera (Roche), a soluble recombinant protein of VCAM-1, was used.
  • rhVCAM-1-Fc chimera was used in solid phase at 10 ⁇ g / mL, and nonspecific reaction was blocked with 0.5% BSA / PBS.
  • a Cell adhesion test was performed using 0PN, a ligand of 9 integrin, and Tenascin-C functional peptide.
  • human 9-CH0-K1 cells the inhibitory ability of various anti- ⁇ 9 integrin antibodies was examined.
  • the peptide was solidified at 5 / g / ml and the antibody was inhibited at 5 ⁇ g / ml.
  • Fig. 20 Adhesion to 0PN as shown in 0 In the inhibition test, clone 21C5 showed the most effective inhibitory activity.
  • the inhibitory effect of 1K11 and 24111 was low.
  • Y9A2 showed the most effective inhibitory activity on the ability to inhibit adhesion to Tenascin-C.
  • the anti-serum 9 integrin antibody 4 clone prepared this time did not show much inhibitory activity against Tenascin-C.
  • Y9A2 is, human ⁇ 9 integrin gene introduced mouse fibroblast cell line L cell normal Prepared by immunization (intraperitoneal administration).
  • the anti-human ⁇ 9 integrin antibody of the present invention is produced by the subtractive immunization method, and the immunization method is different.
  • clone 21C5 has a different FACS diagram detection pattern of human a9 / CH0-K1 cells, and as shown in Fig. 20, the inhibitory effect of cell adhesion test It is thought that the four anti- ⁇ 9 integrin antibody clones produced this time have different epitopes from ⁇ 9 ⁇ 2. Summary
  • ⁇ 9 integrin is expressed in macrophage-like cells R AW 2 6 4 .7 cells and melanoma cells B 1 6— F 1, B 1 6— F 10, B 1 6— BL 6 cells was. Since mouse 9 integrin expression was not observed in mouse neutrophils and expression was confirmed in humans, it was shown that ⁇ 9 integrin expression on neutrophils varies between species. Among the spleen cells ⁇ 220-CD3-cell group and ⁇ 220 + CD3 + cell group, there were some cell groups that expressed 9 integrin. In addition, a 9 integrin expression of liver infiltrating leukocytes was frequently observed on cells expressing 4 integrin.
  • the anti-mouse 9 integrin antibody was able to find a therapeutic effect on hepatitis, and the effect was enhanced by the anti-mouse ⁇ 4 integrin antibody.
  • the monoclonal antibody of the present invention can suppress cancer, for example, cancer cell proliferation, metastasis, and inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis, osteoarthritis, hepatitis, bronchial asthma, fibrosis, diabetes, It has therapeutic effects on cancer metastasis, arteriosclerosis, multiple sclerosis, granulomas, inflammatory bowel diseases (ulcerative colitis, Crohn's disease), autoimmune diseases and the like. Further, the pharmaceutical composition containing both the anti- ⁇ 9 integrin antibody and the anti- ⁇ 4 integrin antibody of the present invention has further improved therapeutic effects on cancer and inflammatory diseases. Since the antibody also recognizes mouse ⁇ 9 intedarin, it can be used in animal experiments using mice.

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Abstract

本発明は、抗マウスα９インテグリン抗体、抗ヒトα９インテグリン抗体、前記抗体を産生するハイブリドーマ細胞、前記抗体およびハイブリドーマ細胞の製造方法、前記抗体を含有する医薬組成物などを提供する。本発明の抗α９インテグリン抗体はα９インテグリン機能抑制により、癌、例えば癌細胞の増殖、転移、そして炎症性疾患、例えばリウマチ関節炎、変形性関節症、肝炎、気管支喘息、線維症、糖尿病、動脈硬化、多発性硬化症、肉芽腫、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病）、さらには自己免疫疾患等に対する治療効果を奏する。

Description

2006/300676
明細書
抗ひ 9インテグリン抗体とその用途 技俯分野
本発明は、 ヒ ト α 9インテグリンおよびマウス ひ 9インテグリンを特異的 に認識するモノクロ一ナル抗体；前記モノクローナル抗体を産生するハイブリ ドーマ細胞；前記モノクローナル抗体を含有する医薬組成物；前記モノクロ一 ナル抗体を含有する診断剤；前記モノクローナル抗体の製造方法；前記ハイブ リ ドーマ細胞の製造方法などに関する。 背景技術
細胞はィンテダリンとよばれる一群の細胞表面受容体を介して細胞外マトリ ックス （extracellular matrix；以下、 ECMと略称する） に結合する。 イン テグリンは α鎖と β 鎖が 1 ： 1のへテロ二量体を形成することによって機能 する。 現在までに少なくとも α鎖 1 8種類、 β 鎖 8種類およびひ /3 ヘテロ 二量体 24種類が同定確認されている。 各ィンテグリンはそれぞれが特異的な リガンドを認識することが知られている。 ィンテグリンはリガンドに対する特 異性や機能からサブファミリーに分類され、 コラーゲン受容体、 ラミニン受容 体、 ファイブロネクチンゃビトロネクチンなどに含まれる A r g— G 1 y -A s p (RGD) 配列を認識する RGD受容体、 白血球にのみに存在する白血球 特異的受容体に区
別される（非特許文献 1 ： Hynes R0. 2002. Integrins: Bidirectional, Allosteric Signaling Machines. Cell 110: 673-87；非特許文献 2 ： Miyasaka M. 2000. New edition of Adhesion Molecule handbook.
Shujunsya)0 o; 4と a 9インテグリンは、 これらにどれにも属さないサブフ アミ リーであり a 4インテグリンサブファミ リーと呼ばれている （非特許文 献 3 ： Elise L. Palmer, Curzio Rfiegg, Ronald Ferrando, Robert Pytela, Sheppard D. 1993. Sequence and Tissue Distribution of the Integrin a9 Subunit, a Novel Partner of 131 That Is Widely Distributed in Epithelia and Muscle. The Journal of Cell Biology 123: 1289-97) 。 一方、 これまで E CMは細胞間の単なる詰め物としてしか考えられていなかつたが、 インテグリンを介した E CMと細胞との相互作用が細胞の増殖、 接着、 運動な どの調節に深く関与し、 癌の進展や炎症増悪などの疾患発症に関わることが明 らかとなつてきた。
E CMの一種であるォステオポンチン （osteopontin；以下、 O P Nと略称 する） は分子量約 4 1 k D aの分泌型酸性リン酸化糖タンパク質であり、 乳汁、 尿、 腎尿細管、 破骨細胞、 骨芽細胞、 マクロファージ、 活性化 T細胞、 腫瘍組 織など広く発現が認められている分子である。 分子中央部に細胞接着配列 GR GD Sとヒ ト O P Nでは S VVYG L R配列、 マウス O P Nでは S L A Y G L R配列、 その直後にはトロンビン切断部位を有しており、 GRGD S配列を介 して RGDインテグリンと、 S VVYG L R配列あるいは S LAYG L R配列 を介して α 4 (α 4 ]3 1 ) と . α 9 ( α 9 j3 1 ) インテグリンと接着する。
α 4 3 1はトロンビンで切断されていない O P N (非切断型 O P N) と トロ ンビンで切断された N末端フラグメント （切断型 O P N) の両方に結合し、 ひ 9 1は切断型 O P Nにのみ結合するという様式の差も見出されている （非特 許文献 4 ： Y. Yokosaki et al. , (1999) The Journal of Biological
Chemistry 274, 36328-36334；非特許文献 5 ： P. M. Green et al. , (2001) FEBS Letters 503, 75- 79 ;非特許文献 6 ： S. T. Barry et al. , (2000) Experimental Cell Research 258, 342-351) 。
a 4およびひ 9インテグリンは、 〇P N以外にも多くの共通するリガンド を有している。 ファイブロネクチンの E D A部位、 プロペプチド-フォンビル ブラントファクタ一 （p p— vWF) 、 組織型トランスグルタミ^ ^一ゼ （t T G) 、 第 X I I I血液凝固因子そして Vascular Cell Adhesion Molecule-1 (VCAM— 1 ) などが知られている。 また ひ 4インテグリンが特異的に認 ' 識するリガンドとしてファイブロネクチンの C S— 1 ドメイン、 Ma d CAM 一 1 (α 4 β 7) などが知られている。 ひ 9インテグリンが特異的に認識する リガンドは、 テネイシン C、 プラスミンなどが知られている。 ct 9、 α 4および 01のィンテグリンサブュニットのアミノ酸配列は公知 である。 例えば、 ヒ ト α 9は ΝΜ— 002207、 マウス α 9は ΝΜ— 13 3721、 ヒ ト α 4は ΝΜ— 000885、 マウス ο; 4は ΝΜ— 01057 6、 ヒ ト /3 1は Χ07979、 マウス j8 1は NM_010578として Ge n B a n kに登録されている。 また、 これらのインテグリンは種間でアミノ酸 配列間の類似性が髙ぃことが知られている。
WO 02/08 1 522 (特許文献 1 ) には、 O P N欠損マウスや O P Nに 対する中和抗体を用いた OPN機能抑制による、 リゥマチ様関節炎や肝炎の治 癒効果について開示されている。 また、 この公報には、 炎症性疾患発症には α 9インテグリン、 α 4インテグリン認、識配列である SVVYGLR配列が重 要であること、 ΟΡΝに対する受容体が免疫担当細胞などにおいて発現し、 炎 症性疾患に関連していることが開示されている。 発明の開示
現在、 癌、 炎症性疾患、 自己免疫疾患の治療薬は種々知られているが、 より 改善された治療効果を有する癌、 '炎症性疾患、 自己免疫疾患の予防薬および または治療薬等を開発することが望まれていた。
そこで、 本発明者らはインテグリンに着目し、 種々の研究を行った結果、 α
9イシテグリンに対する特異的阻害抗体が癌抑制効果、 抗炎症効果を有するこ とを見出し、 本発明を完成した。 すなわち、 具体的には、 本発明は以下に記載 のモノクローナル抗体、 ハイプリ ドーマ細胞、 医薬組成物等を提供する。
( 1 ) ヒ ト α 9インテグリンおよびマウス ひ 9インテグリンを特異的に認識 するモノクローナル抗体。
(2) ヒ トおよびノまたはマウス a 9インテグリンと ひ 9インテグリンのリ ガンドとの結合を阻害する上記 （1) に記載のモノクローナル抗体。
(3) ひ 9インテグリンのリガンドがォステオボンチンである上記 （2) に記 載のモノクローナル抗体。
(4) 受託番号 FERM ΑΒΡ— 101 95、 FERM ΑΒΡ— 101 9 6、 FERM ABP— 1 0 1 97、 または FERM ABP— 1 01 98で 標示されるハイプリ ド一マ細胞により産生される上記 （1) から （3) のいず れかに記載のモノク口ーナル抗体。
(5) 上記 （1) から （4) のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生す るハイブリ ドーマ細胞。
(6) 上記 （1) から （4) のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含有す る医薬組成物。
(7) 請求項 1から 4のいずれかに記載のモノクローナル抗体および抗 α 4 ィンテグリン抗体の両者を含有する医薬組成物。
(8) 炎症性疾患の予防および/または治療剤である、 上記 （6) または (7) に記載の医薬組成物。
(9) 上記 （1) から （4) のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含有す る、 炎症性疾患の診断剤。
(10) α 9インテグリンを過剰発現する細胞を抗原として用いることを特徴 とする、 上記 （1) から （4) のいずれかに記載のモノクローナル抗体の製造 方法。
(1 1) α 9インテグリンを過剰'発現する抗原として用いた細胞とは別の種の 細胞を用いることを特徴とする、 上記 （5) に記載のハイプリ ドーマ細胞の製 造方法。
(12) ひ 9インテグリン結合性機能分子 （例えば、 0PN、 VCAM- テネイシ ン ファイブロネクチン、 pp-vWF、 tTGなど） を有効成分として含有する、 細胞およびノまたは組織のリモデリングの抑制およびノまたは促進剤。
(1 3) ひ 9インテグリン発現細胞およびノまたは組織 （例えば、 腫瘍細胞、 好中球、 平滑筋など） と α 9インテグリン結合性機能分子 （例えば、 0PN、 VCAM- 1、 テネイシン（：、 ファイブロネクチン、 pp- vWF、 tTGなど） とを接触さ せることを特徴とする細胞および Zまたは組織のリモデリングの抑制および/ または促進方法。
本発明の抗 ひ 9インテグリン抗体は ひ 9インテグリン機能抑制により、 癌、 例えば癌細胞の増殖、 転移、 そして炎症性疾患、 例えばリウマチ関節炎、 変形 性関節症、 肝炎、 気管支喘息、 線維症、 糖尿病、 動脈硬化、 多発性硬化症、 肉 芽腫、 炎症性腸疾患.（潰瘍性大腸炎、 クローン病） 、 さらには自己免疫疾患等 に対する治療効果を奏する。
また、 本発明の抗 α 9インテグリン抗体と抗ひ 4インテグリン抗体の両者 を含有する医薬組成物は、 さらに改善された炎症性疾患の治療効果を奏する。 本発明ではマウス α 9インテグリン、 ヒ ト α 9インテグリンに対するそれぞ れのモノクローナル抗体を作製した。 抗マウス ひ 9インテグリン抗体では、 動物実験に使用することができ、 抗ヒ ト α 9インテグリン抗体では治療薬と して使用することが可能となる。
図面の簡単な説明
図 1はィンテグリン遺伝子導入細胞における m R N Α発現量の解析結果を示 す図である。
図 2は抗マウス α 9インテグリン抗体の FACS解析の結果を示す図である。 図 3は抗マウス α 9インテグリン抗体による正常組織の染色像を示す図で ある。
図 4は免疫染色の結果を一覧した図である。
図 5は抗マウス α 9インテグリン抗体 4クローンの細胞接着阻害効果を示 す図である。
図 6は抗マウス cx 9インテグリン抗体クローンの細胞接着阻害効果を比較 した-図である。 '
図 7は競合阻害試験による抗体のェピトープ解析の結果を示す図である。 図 8はマウスメラノーマ細胞株における a 4および a 9インテグリンの発 現解析の結果を示す図である。
図 9は単球系細胞株における α 9インテグリンの発現解析の結果を示す図 である。
図 1 0はマウス好中球の F A C S解析の結果を示す図である。 .
図 1 1はマウス肝臓浸潤白血球の F A C S解析の結果を示す図である。 図 1 2は抗ひ 4インテグリン抗体およびひ 9インテグリン抗体による B 1 6 — B L 6の細胞接着阻害効果を示す図である。 図 1 3は抗 ひ 4インテグリン抗体および抗ひ 9インテグリン抗体による肝 炎治療効果を示す図である。
図 1 4は腱線維芽細胞の α 9インテグリン発現を示す図である。
図 1 5はトロンビン切断型 0ΡΝにより腱線維芽細胞の ΜΜΡ- 13 mRNAの転写が 増加することを示す図である。
図 1 6は抗 α 9インテグリン抗体により腱線維芽細胞からの匪 P-13 mRNA 転写が抑制されていることを示す図である。
図 1 7は B16-BL6細胞の増殖を抗 α 9インテグリン抗体で抑制したことを 示す図である。
図 1 8は VCAM- 1刺激による B16-BL6細胞の増殖を抗 α 9インテグリン抗体 と抗 α 4インテグリン抗体との併用で抑制したことを示す図である。
図 1 9は抗ヒ ト ひ 9インテグリン抗体の FACS解析の結果を示す図である。 図 2 0は抗ヒ ト ひ 9インテグリン抗体 4クローンと Υ9Α2との細胞接着阻害 効果を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
抗インテグリン抗体として、 α 4インテグリンに対する中和抗体はすでに臨 床試験に進んでいる。 例えば、 2 0 0 4年 7月には米食品医薬品局 （F D A) 力 S、 —バイオジェン .アイデック （Biogen Idee Inc.、 米マサチューセッツ州） とエラン （Elan Corporation アイルランド） による多発性硬化症治療薬
Tysabri (登録商標） （natalizumab) の承認申請を受理し、 Tysabri (登録商 標） は優先審査の対象に指定されている。 Tysabri (登録商標） はまた、 クロ ーン病、 リウマチ様関節炎等の疾患を対象としている。 また、 P 4 C 2という 抗ヒ ト ひ 4 ]3 1インテグリンモノクローナル抗体が実験室レベルで用いられ ている。
しかし、 ひ 9インテグリンに対する抗体はヒ ト ひ 9インテグリンを抗原と し、 ヒ トおよびモルモッ トの ひ 9インテグリンに特異性を示す Y 9 A 2と呼 ばれる中和抗体 （A. Wang et al. , (1996) Am. J. Respir. , Cell. ol. Biol. 15, 664-672) が実験室レベルで用いられてはいるものの、 臨床的に用いられ ているわけではない。
一方、 抗ヒ ト ひ 9インテグリン抗体をヒ トに対 る医薬として用いる場合、 開発段階では直接ヒ トへの投与はできず、 その効果を確認できない。 すなわち、 効果を確認するための動物実験が必要となり、 この効果が確認できれば、 ヒ ト 化抗体等を作製することとなる。 マウスはその遣伝的背景が明らかとなってい る系統が多く、 また世代あたりの時間が短い特徴を有する。 さらに、 マウスは ヒ トの疾患とほぼ同 の疾患を観察することができることが知られているので、 実験動物として好適であるが、 マウス α 9インテグリンと交叉反応を示す中 和抗体はこれまで報告されていない。
本発明では、 以下の 4工程を注意深く進めることにより、 ヒ ト、 マウスそれ ぞれに対する ひ 9インテグリンに特異的に反応する阻害抗体を得ることがで きた。 .
( 1 ) α 9インテグリン過剰発現株の作製
遺伝子発現細胞のスクリーニングは通常であれば、 タンパク質レベルや遺伝 子レベルで行うが、 今回は、 ひ 9インテグリンの機能である細胞接着能を用い たスクリーニングにより、 ヒ トまたはマウス ひ 9インテグリンをそれぞれ細 胞膜上に過剰発現する細胞株を樹立した。
ヒ トまたはマウス α 9インテグリン発現細胞は、 マウスあるいはハムスター へそれぞれ免疫に使用することができた。
( 2 ) 細胞の選択
マウス α 9インテグリンに対する抗体を作製するために、 シリアンハムス タ一に免疫することを考えた。 そのために、 ハムスターの卵巣由来細胞である C H O - K 1細胞へマウス α 9インテグリンの遺伝子導入を行い、 ハムスタ —内で主にマウス α 9インテグリンに対する抗体のみの抗体価を增加させる 実験系を構築した。
ヒ ト α 9インテグリンに対する抗体は、 C H O— K 1細胞へヒ ト ひ 9イン テグリンの遺伝子導入を行い、 マウス内でヒ ト α 9インテグリンに対する抗 体を増加させる実験系を構築した。 (3) 抗マウス α 9インテグリン抗体を産生するハイブリ ドーマのスクリー ニング
種々のハイブリ ドーマからマウス α 9インテグリンのみに反応するクロ一 ンを効率よく得るために、 免疫した細胞の親細胞 （CHO— K 1) とは異なる 細胞 （N I Η3 Τ 3) に α 9インテグリンを発現させた細胞をスクリーニン . グに使用した。 さらに α 9インテグリンと同じインテグリンファミリーに属 するマウス o 4インテグリンを N I Η 3 Τ 3細胞に発現させた細胞を用いて、 a 9インテグリン以外のィンテダリンとは交差反応性を示さないクローンを選 抜することにより、 効率的にマウス α 9インテグリンに特異的に反応する抗 体を得た。
(4) 抗ヒ ト α 9インテグリン抗体を産生するハイブリ ドーマのスクリ一二 ング
種々のハイブリ ドーマからヒ ト α 9インテグリンのみに反応するクローン を効率よく得るために、 遺伝子導入 CHO— Κ 1に反応を示し、 CHO— K 1 細胞に反応しないクローン.を選抜した。 また、 ヒ ト α 4インテグリン遺伝子 導入 CHO— K 1細胞に反応しないことを確認することで、 ヒ ト α 9インテ ダリンに特異的に反応する阻害抗体を得た。
[c- 9インテグリンに対するモノクローナル抗体]
本発明は 9インテグリンに対するモノクローナル抗体を提供する。 本発 明において 「抗体」 とは、 抗原である α 9インテグリンまたはその部分ぺプ チドに結合し得る抗体分子全体またはその断片 （例えば、 F a bまたは F (a b ' ) 2断片） を意味し、 ポリクロ一ナル抗体であってもモノクローナル抗体 であってもよい。 好ましぐは、 本発明においてはモノクローナル抗体を意味す る。 まだ 本発明において 「抗体」 は、 ヒ ト抗体、 ヒ ト型化抗体、 キメラ抗体 を包含する。
上記 「ヒ ト型化抗体」 とはマウス等のヒ ト以外の種に由来する抗体を改変し て、 H鎖と L鎖の相補性決定部以外の一次構造をヒ トの抗体の対応する一次構 造で置き換えた抗体を言う。 また、 「キメラ抗体卜とは、 異種抗体由来の F a b領域と F c領域とを有する抗体を意味する。
本発明において、 「抗体断片」 とは、 全長抗体の一部を指し、 一般に、 抗原 結合領域または可変領域のことである。 例えば、 抗体断片には F a b、 F a b ' 、 F (a b' ) 2、 および F v断片が含まれる。 抗体のパパイン消化によ り、 F a b断片と呼ばれる、 それぞれ 1つの抗原結合部位を有する 2つの同じ 抗原結合断片、 及び、 残りの容易に結晶化するために 「F c」 と呼ばれる断片 が生じる。 また、 ペプシン消化により 2つの抗原結合部位を有し、 抗原を交差 結合し得る F (a b' ) 2断片、 及び、 残りの別な断片 （p F c ' と呼ばれ る） が得られる。
ここで、 「F v」 断片は最小の抗体断片であり、 完全な抗原認識部位と結合 部位を含む。 この領域は 1つの重鎖及び軽鎖の可変ドメィンが非共有結合によ り強く連結された二量体である （VH— VL二量体） 。 各可変ドメインの 3つの CDRが相互作用し、 VH— VL二量体の表面に抗原結合部位を形成する。 6つ の CDRは、 抗体に抗原結合部位を付与するものである。 しかしながら、 1つ の可変ドメイン （または、 抗原に特異的な 3つの CDRのみを含む F Vの半 分） であっても、 全結合部位よりは低い親和性ではあるが、 抗原を認識し結合 する能力を有する。
また、 F a b断片 （F (a b) とも呼ばれる） はさらに、 軽鎖の定常ドメィ ン、 および、 重鎖の細胞の定常ドメイン （CH1) を含む。 F a b' 断片は F a b断片と、 抗体のヒンジ領域からの 1またはそれ以上のシスティンを含む重 鎖 CH 1 ドメインのカルボキシ末端由来する数個の残基を付加的に有する点で 異なる。 '
本発明における 「モノグローナル抗体」 とは、 実質的に均質な抗体の集団、 即ち、 集団を構成する個々の抗体が、 天然において起こり得る少量で存在する 変異体を除いては均一である抗体集団から得られた抗体を指す。 モノクローナ ル抗体は高度に特異的であり、 単一の抗原部位に対して作用するものである。 さらに、 異なるェピトープに対する異なる抗体を含むポリクロ一ナル抗体と比 ベて、 各モノクローナル抗体は、 抗原上の単一のェピトープに向けられる。 そ の特異性に加えて、 モノクローナル抗体は、 他の免疫グロブリンが混在しない ハイプリ ドーマ培養により合成される点で有利である。 「モノクローナル」 と いう修飾語は、 実質的に均一な抗体の集団より得られた抗体の特性を示唆する ものであって、 抗体が特定の方法により製造されることを限定するものではな い。
以下、 抗 α 9インテグリンモノクロ一ナル抗体の作製について詳述する力 該抗体の作製はこれに限定されることはない。
[ α 9インテグリン （抗原） ]
本発明において抗原として使用する ひ 9インテグリンは、 （1 ) .ヒ トやそ の他の哺乳動物の ひ 9インテグリンを発現するあらゆる細胞、 またはそれら の細胞が存在するあらゆる組織に由来するタンパク質、 （2 ) ct 9インテグリ ンをコードする遺伝子 D N A、.好ましくは c D N Aを細菌、 酵母、 動物細胞等 の細胞株に導入、 発現させた組換えタンパク質であってもよく、 また （3 ) 合 成タンパク質であってもよい。
また、 本発明の α 9インテグ!）ンには、 各種哺乳動物の α 9インテグリン のアミノ酸配列、 特に好ましくはヒ ト α 9インテグリンのアミノ酸配列 （配 列番号： 1 ) と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含され る。 - ここで 「実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド」 とは、 天然型 の α 9インテグリン、 特に好ましくはヒ ト由来の a 9インテグリンと実質的 に同等の生物学的性質を有する限り、 該アミノ酸配列中の複数個のアミノ酸、 好ましくは 1ないし 1 0個のアミノ酸、 特に好ましくは 1ないし数個 （例えば、 1ないし 5個） のアミノ酸が置換、 欠失およびノまたは修飾されているァミノ 酸配列を有する変異ポリぺプチド、 ならびに該天然型の a 9インテグリン、 特に好ましくはヒ ト由来の ひ 9インテグリンのアミノ酸配列中に、 複数個の ' アミノ酸、 好ましくは 1ないし 1 0個のアミノ酸、 特に好ましくは 1ないし数 個 （例えば、 1ないし 5個） のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列を有する変 異ポリペプチド を意味する。 さらに、 そのような置換、 欠失、 修飾及び付加の複数を有する変 異ポリべプチドであってもよい。
本発明の α 9インテグリン、 特にはヒ ト由来の α 9インテグリンは、 遺伝 子組換え技術のほか、 化学的合成法、 細胞培養方法等のような当該技術分野に おいて公知の方法あるいはその修飾方法を適宜用いることにより製造すること ができる。
また、 変異ポリべプチドの製造方法としては、 例えば、 合成オリゴヌクレオ チド部位突然変異導入法 （gapped duplex法） 、 亜硝酸あるいは亜硫酸処理に よってランダムに点突然変異を導入する方法、 B a 1 3 1酵素等により欠失変 異体を作製する方法、 カセッ ト変異法、 リンカ一スキャニング法、 ミスインコ 一ポレーシヨン法、 ミスマッチプライマー法、 D N Aセグメント合成法などを 挙げることができる。
また、 本発明の α 9インテグリンには、 該 α 9インテグリンの 「一部」 も 包含される。 ここで 「一部」 とは、 ひ 9インテグリンのリガンド、 例えば Ο Ρ Νや VCAM- 1、 Tenascin- C等と結合するために必要な領域を含む部分であり、 具体的には配列番号： 1で表されるアミノ酸配列の 1 4番目から 9 8 0番目、 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列の 1 1番目から 9 8 1番目を含む部分を いう。 該 α 9インテグリンの 「一部」 は、 後述する当該技術分野において公 知の方法あるいはその修飾方法に従つて、 遺伝子組換え技術または化学的合成 法により製造することもできるし、 また細胞培養方法により単離した α 9ィ ンテグリン、 特に好ましくはヒ ト由来の α 9インテグリンをタンパク分解酵 素等により適切に切断することで製造することができる。
抗原としてはまた、 ひ 9インテグリンを組換え技術により細胞膜上に過剰発 現する細胞自体、 あるいはその膜画分等を用いることができる。
本発明の α 9インテグリンには、 ヒ ト ひ 9インテグリンのアミノ酸配列
(配列番号： 1 ) と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含 - される。 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列 を有するポリペプチドとして、 具体的には 配列番号： 2で表されるアミノ酸 配列を有する、 マウス α 9インテグリンがあげられる。 本発明では、 疾患モ デル動物としてマウスを考慮しているので、 本発明の抗原としてマウス由来の α 9インテグリンが好適に用いられる。 また、 特に本発明では ひ 9インテグ リンを組換え技術により細胞膜上に過剰発現する細胞自体が好適に用いられる。 したがって、 後述するような、 α 9インテグリンをコードする遺伝子 （例えば、 c DNA) を公知の遺伝子工学技術を用いてクローニングし、 ひ 9インテグリ ンを細胞膜上に過剰発現する細胞自体、 またはその細胞膜画分を抗原として調 製する場合もある。
[抗体産生細胞の調製]
抗原は、 免疫される動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自 体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高め るため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与 してもよレ、。 投与は通常 1〜 6週毎に.1回ずつ、 計 2〜10回程度行われる。 用いられる温血動物としては、 例えば、 マウス、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモ ット、 ラット、 ハムスター、 ヒッジ、 ャギ、 ニヮトリ等が挙げられるが、 本発 明ではハムスターが好適に用いられる。
治療の対象がヒ トであり、 ΟΡΝ阻害抗体産生動物がマウスの場合には、 ヒ トマウスキメラ抗体やヒ ト化抗体を用いるのが望ましく、 さらには、 抗体産生. に関与するヒ ト遺伝子を導入したマウス等のトランスジヱニック動物を用いて ヒ ト型モノクローナル抗体を作成して用いるのが望ましい。
[抗体産生細胞とミエ口一マ細胞との細胞融合]
ミエローマ細胞としては、 マウス、 ラット、 ヒ ト等に由来する細胞が用いら れる。 例えばマウスミエローマ Ρ 3 U 1、 Ρ 3Χ63— Ag 8、 P 3 X 63 - Ag 8— U l、 P 3NS 1— Ag 4、 S P 2/0—Ag l 4、 P 3X63— A g 8 - 653等があげられるが、 抗体産生細胞とミエローマ細胞とは同種動物、 特に同系統の動物由来であることが好ましい。 ミエローマ細胞は凍結保存する 力、 ゥマ、 ゥサギまたはゥシ胎児血清を添加した一般的な培地で継代して維持 することができる。 細胞融合には対数增殖期の細胞を用いるのが好ましい。 本 発明では P 3 X63— Ag 8— 653が好適に用いられる。
抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイプリ ドーマを形成させる 方法としては、 ポリエチレングリコール （PEG) を用いる方法、 センダイゥ ィルスを用いる方法、 電気融合装置を用いる方法などがあげられる。 例えば P EG法の場合、 約 30〜60%の PEG (平均分子量 1000〜 6000 ) を 含む適当な培地または緩衝液中に脾細胞とミエローマ細胞を 1〜10 ： 1、 好 ましくは 5〜 10 ： 1の混合比で懸濁し、 温度約 25〜 3 7° ( 、 pH6〜8の 条件下で、 約 30秒〜 3分間程度反応させればよい。 反応終了後、 PEG溶液 を除いて培地に再懸濁し、 セルゥエルプレート中に播種して培養を続ける。 レヽイブリ ド一マ細胞の選別]
モノクローナル抗体を産生するハイブリ ドーマ細胞の選別は、 公知あるいは それに準じる方法に従って行なうことができる。 通常、 HAT (ヒポキサンチ ン、 アミノプテリン、 チミジン） を添加した動物細胞用培地で行なうことがで きる。 選別おょぴ育種用培地としては、 ハイプリ ドーマ細胞が生育できるもの ならばどのような培地を用いても良い。 例えば、 1〜20%、 好ましくは 10 〜20%の牛胎児血清を含む RPM I 1640培地、 1〜10%の牛胎児血.. 清を含む G I T培地 （和光純薬工業 （株） ） あるいはハイプリ ドーマ培養用無 血清培地 （S FM— 101、 日水製薬 （株） ） などを用いることができる。 培 養温度は、 通常 20〜40DC、 好ましくは約 37°Cである。 培養時間は、 通常、 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培養は、 通常 5%じ〇2下 で行なうことができ
る。
本発明のモノクローナル抗体の産生は、 新臨床免疫実験操作法 （part 3) 、 科学評論社、 1997に記載される細胞 EL I S A法を用いて確認およびスクリ— 一二ングできる。 免疫に用いた細胞をスクリーニングに使用するとバックダラ ゥンドが高くなることや偽陽性が多くなることが予想される場合、 免疫に用レ、 た細胞とは別の細胞で過剰発現する ひ 9インテグリンに反応し、 かつ、 α 4 ィンテグリンを過剰発現する細胞に反応しないクロ一ンを抗 a 9インテグ.リ ン抗体とすることができる。 このようなクローンから限界希釈法を 1から 5·回、 好適には 2から 4回繰り返すことによりモノクローナル抗体を調製できる。 [抗体の分離精製]
得られた抗体は、 均一にまで精製することができる。 抗体の分離、 精製は通 常のタンパク質で使用されている分離、 精製方法を使用すればよい。 例えばァ フィニティークロマドグラフィ一等のクロマトグラフィーカラム、 フィルタ一、 限外濾過、 塩析、 透析、 S D Sポリアクリルアミ ドゲル電気泳動、 等電点電気 泳動等を適宜選択、 組み合わせれば、 抗体を分離、 精製することができる
Antibodies： A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold spring Harbor Laboratory, 1988) 、 これらに限定されるものではない。 ァフィ- ティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、 プロテイン Aカラム、 プ ロティン G力ラムが挙げられる。 例えばプロティン A力ラムを用いた力ラムと して、 Hyper D, P0R0S, Sepharose F. F. (Amersham Biosciences) 等力 S挙げ られる。
[抗体の標識化]
得られた抗体を、 公知の方法または市販のキットを用いて各種標識化 （例え ば、 ビォチン標識、 F I T C標識、 A P C標識） できる。 本発明では、 Biot in Label ing Kit (同仁化学） を用いたビォチン標識が好適に用いられる。
[本発明のモノクローナル抗体を含有する医薬組成物]
本発明は上記のモノクローナル抗体を含有する医薬組成物を提供する。 本発 明のモノクロ一ナル抗体を有効成分として含有してなる医薬組成物は、 癌、 例 えば癌細胞の増殖、 転移、 そして炎症性疾患、 例えば関節リウマチ、 変形性関 節症、 肝炎、 気管支喘息、 線維症、 糖尿病、 動脈硬化、 多発性硬化症、 肉芽腫、 炎症性腸疾患 （潰瘍性大腸炎、 クローン病） および自己免疫疾患等の予防およ びノまたは治療剤として用いることができる。 . 本発明のモノクローナル抗体を含有してなる医薬組成物はまた、 臓器移植後の 慢性拒絶反応抑制、 全身性自己免疫疾患 ·エリテマト一デス ·ぶどう膜炎 ·ベ 一チェト病 ·多発性筋炎 ·糸状体増殖性腎炎 .サルコィ ドーシス等の自己免疫 疾患の治療にも用いることができる。
本発明の抗体を含有する上記疾病の予防および または治療剤は低毒性であ り、 適当な溶媒に配合して液剤として、 または適当な剤型の医薬組成物として、 ヒ トまたは哺乳動物 （例、 ラッ ト、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して経口的または非経口的に投与することができる。 投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与ルートなどによっても異なるが、 例えば、 成 人の関節リゥマチ患者の予防およびノまたは治療のために使用する場合には、 本発明の抗体を 1回量として、 通常 0 . 0 1〜2 O m g Z k g体重程度、 好ま しくは 0 . ：!〜 1 O m g Z k g体重程度、 さらに好ましくは 0 . l〜5 m gノ k g体重程度を、 1 日 1〜 5回程度、 好ましくは 1 日 1〜 3回程度、 静脈注射 により投与するのが好都合である。 他の非経口投与および経口投与の場合もこ れに準ずる量を
投与することができる。 症状が特に重い場合には、 その症状に応じて増量して もよい。
本発明の抗体は、 それ自体または適当な医薬組成物として投与することがで きる έ 上記投与に用いられる医薬組成物は、 上記抗体ま'たはその塩と薬理学的 に許容され得る担体、 希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。 このような 組成物は、 経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
すなわち、 例えば、 経口投与のための組成物としては、 固体または液体の剤 形、 具体的には錠剤 （糖衣錠、 フィルムコ一ティング錠を含む） 、 丸剤、 顆粒 剤、 散剤、 カプセル剤 （ソフ トカプセル剤を含む） 、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁 剤などがあげられる。 このような組成物は公知の方法によって製造され、 製剤 分野において通常用いられる担体、 希釈剤もしくは賦形剤を含有するものであ る。 例えば、 錠剤用の担体、 賦形剤としては、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステア リン酸マグネシウムなどが用いられる。 非経口投与のための組成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤などが用い.られ、 注射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射剤など の剤形を包含する。 このような注射剤は、 公知の方法に従って、 例えば、 上記 抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、 懸濁または乳化することによって調製する。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、 適当な 溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン界面活性剤 〔例、 ポリ ソルベート 80、 HCO— 50 (p o l y o x y e t h y l e n e (50 m
o 1 ) a d d u c t o i h y d r o g e n a t e d c a s t o r o ι 1 ) 〕 などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油など が用いられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどを 併用してもよい。 調製された注射液は、 通常、 適当なアンプルに充填される。 直腸投与に用いられる坐剤は、 上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混 合することによって調製される。 '
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、 活性成分の投与量に適合するよ うな投薬単位の剤形に調製されることが好適である。 このような投薬単位の剤 形と-しては、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル） 、 坐剤などが例示 され、 それぞれの投薬単位剤形当たり通常 5〜500mg、 とりわけ注射剤で は 5〜100mg、 その他の剤形では 10〜250mgの上記抗体が含有され ていることが好ましい。
前記した各組成物は、 上記抗体との配合により好ましくなレ、相互作用を生じ ない限り他の活性成分を含有してもよい。
なお、 本発明は、 α 9インテグリン結合性機能分子 （例えば、 0PN、 VCAM-1、 テネイシン C、 ファイブロネクチン、 PP- vWF、 tTGなど） を有効成分として含 有する、 細胞および または組織のリモデリングの抑制および または促進 剤；並びに、 α 9インテグリン発現細胞および/または組織 （例えば、 腫瘍細 胞、 好中球、 平滑筋など） と ひ 9インテグリ 結合性機能分子とを接触させ ることを特徴とする細胞および/または組織のリモデリングの抑制および/ま たは促進方法にも関する。 このような治療剤の有効成分の投与量、 投与方法、 製剤化などについては上記抗体含有医薬の記載を参照して適宜決定することが できる。
[本発明のモノクローナル抗体を含有する診断剤]
本発明のモノクローナル抗体を含有してなる医薬組成物は、 癌、 例えば癌細 胞の増殖、 転移、 そして炎症性疾患、 例えばリウマチ関節炎、 変形性関節症、 肝炎、 気管支喘息、 線維症、 糖尿病、 癌転移、 動脈硬化、 多発性硬化症、 肉芽 腫等の診断剤、 また臓器移植後の慢性拒絶反応抑制、 全身性自己免疫疾患 ·ェ リテマトー
デス ·ぶどう膜炎 ·ベーチェト病 ·多発性筋炎 ·糸状体増殖性腎炎 ·サルコィ ドーシス等の自己免疫疾患の診断剤として用いることができる。 本発明のモノ クロ一ナル抗体は、 ひ 9インテグリンを特異的に認識することができるので、 被検液中の α 9インテグリンの定量、 特にサンドィツチ免疫測定法、 競合法、 ィムノメ トリック法あるレ、はネブロメ トリーなどによる定量、 免疫染色などに 使用することができる。 これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適 用するにあたっては、 特別の条件、 操作等の設定は必要としない。 それぞれの 方法における通常の条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて測定系 を構築すれ
ばよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書などを参照 することができる。
以上のように、 本発明の抗体を用いることによって、 α 9インテグリンを感 度良く定量することができる。 さらに、 本発明の抗体を用いる、 生体内での α 9インテグリンの定量法を利用することにより、 α 9インテグリンが関連す る各種疾患の診断をすることができる。 例えば、 ct 9インテグリンの発現量の 増減が検出された場合は、 ひ 9インテグリンが関連する疾患、 例えば癌や炎症 性疾患である可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することが できる。 また、 本発明のモノクローナル抗体は、 体液や組織などの被検体中に 存在する α 9インテグリンを特異的に検出するために使用することができる。 また、 ひ 9インテグリンを精製するために使用する抗体カラムの作製、 精製時 の各分画に含まれる
ひ 9インテグリンの検出、 被検細胞内における ひ 9インテグリンの挙動の分 析等に使用することができる。 実 施 例
以下に実施例を示して本発明をより詳細に説明するが、 これは本発明の範囲 を限定するものではない。 実施例 1
[マウス a 9、 ひ 4インテグリン c DNAのクローニング]
a 4インテグリン遺伝子はマウス 1 2. 5日胚、 a 9インテグリンは B 1 6 — BL 6細胞 （マウスメラノーマ細胞） の全 RNAからランダムプライマーを 用いて逆転写し、 得られた c DNAを铸型として P CR法によりクローニング を行った。 クローニングに用いたプライマーを以下に示す。
ma4Integin-5'： 5' -CGTGGATCCGAGCGCATGGCTGCGGAAGCGAGGTGC- 3 (配列番 号: 3)
ma4Integin-3'： 5' - CAGCTCGAGTCAGTCATCATTGCTTTTGCTGTTGAC - 3 (配列番 号： 4)
ma9Integin-5'： 5' - GTCAAGCTTCTGGGGATGGGCGGCCCGGCTGGGCTG- 3 (配列番 号: 5)
ma9Integin-3'： 5' - CGGTCTAGACACGGTGGGTCACTGGTTTTTCTGGAC- 3 (配列番 号: 6) '
PCRは以下の組成：鎵型 cDNA 5μ1、 GCバッファー I 25μ1、 dNTPmix 5μ 1、 ΙΟμΜ primerl 1μ 1、 10/iM primer2 1μ 1、 DW 10.5/χ 1、 LA Taq (T a Ka R a LA Ta q (登録商標） ） 0.5 μ 1の反応系を作製し、 94°C 2分 → (94°C 30秒→68°C 3分、 30サイクル） →4°Cの反応条件で、 サ一マルサイ クラ一 （Ge n e Amp (登録商標） PCR . S y s t em 2700 (ァプ ライ ドバイオシステムズ） ） により反応を行った。 反応後、 1。/。ァガロースゲ ル電気泳動により、 α 4インテグリンの場合は 3 k b付近のバンドを、 ot 9ィ ンテグリンの場合は 3 k b付近のバンドを分離後、 ゲルより切り出し、 Q I A q u i c k (登録商標） Ge l E x t r a c t i o n K i t (Q I AGE N) を用いて PC R増幅産物を精製した。
[ヒ ト ひ 9、 ひ 4インテグリン c DNAのクローニング]
α 4インテグリン遺伝子はヒ ト好中球、 α 9インテグリンは'ヒ ト末梢単核 球かち抽出した全 RNAからランダムプライマーを用いて逆転写し、 得られた c DNAを铸型として P CR法によりクローニングを行った。 クロ一エングに 用いた
プライマーを以下に示す。
ha4Integin-5'： 5' -ACGCTCGAGTGTACCATGTTCCCCACCGAGAGCGCA-3' (配列番 号: 11)
ha4Integin-3'： 5' -TCATCTAGATTAATCATCATTGCTTTTACT-3' (配列番号： 12) ha9Integin-5'： 5 ' -TCGAAGCTTCTGGGGATGGGCGGCCCGGCT-3 ' (配列番号： 13) h a 9Integin - 3'： 5' - ACCTCTAGATCACTGGTTTTTCTGGACCCA - 3' (配列番号： 14) 上記のように、 PCR法により増幅した a 4インテグリンおよび a 9イン テグリンそれぞれの c DNAを p CR I I -TOPO (登録商標） ベクタ一 (I n v i t r o g e n) に組み込み、 AB I PR I SM (登録商標） 3 1 0 (アプライドパイオシステムズ） によりそれぞれの塩基配列を確認した。 得 られた c DN Aの塩基配列は配列番号： 7 (マウス a 9) および配列番号： 8 (マウス ひ 4) 、 配列番号： 9 (ヒ ト ひ 9) および配列番号： 10 (ヒ ト a 4) の塩基配列とそれぞれ一致した。 これらの c DN Aを動物細胞へ導入す るために、 p c DNA™3. 1 (+ ) ( I n V i t r o g e n) に組み込んだ。 その結果得られたベクターをそれぞれマウス ひ 9インテグリン Zp c DNA 3. 1、 マウス a 4インテグリン// p c DN A 3. 1、 ヒ ト a 9インテグリ ン /p c DNA3. 1、 ヒ ト α 4インテグリン Zp c DNA 3. 1と命名し た。 実施例 2
[α 9インテグリン、 α 4インテグリン恒常発現細胞株の樹立]
ノ、ムスターに免疫するために、 ハムスター卵巣由来細胞株である CHO— K 1細胞に α 4インテグリン c DNAを含むマウス ひ 4インテグリンノ p c D NA3. 1、 または々ウス a 9インテグリン c DNAを含む α 9インテグリ ン//.p c DNA3. 1を導入し、 OPNのSVVYGLRぺプチドとの接着効 果能によるスクリーニングで、 マウス α9インテグリンを恒常的に発現する C ΗΟ-Κ 1細胞 （マウス a SZCHO— K 1細胞） を 3クローン （6 F 1、 1 2 C 3、 4N2) 、 N I H3 T 3細胞 （マウス c 9 N I H3 T 3細胞） を 4クローン （2 1 H、 7A3、 1 1 C 3、 2 1 D 3) 樹立した。
マウス a 9インテグリンのコントロールとして同じインテグリンサブファ ミリ一である α 4インテグリンをマウス胎児 1 2. 5日胚からクローニング し、 マウス α 4インテグリンを恒常的に発現する Ν Ι Η3 Τ 3細胞 （マウス α 4ノ N I Η 3 Τ 3細胞） を 3クローン （3 G 1、 4A 1 0、 1 9 F 2) 樹立 した。
樹立したマウス ひ 9インテグリン発現細胞の α 9インテグリン発現量を定 量的に解析するために ひ 9 N I Η3 Τ 3細胞、 ひ 9ノ CHO— Κ 1細胞か ら抽出した c DNAを用いてリアルタイム PCRを行った。 その結果、 図 1 A. および図 1 Βに示すように、 ct 9/N I Η 3 Τ 3細胞では 2 1 D 3力 a 9/ CHO— K 1細胞では 1 2 C 3が最も高い ひ 9インテグリンの発現を示した。 また、 ひ 4/N I H3 T 3細胞は F AC Sにてタンパク質発現量の解析を行つ た結果を図 1 Cに示す。 4 A 1 0で最も高いマウス ひ 4インテグリン発現上 昇が見られた。
同様な方法で、 ヒ ト 0；9ィンテグリンを恒常的に発現するじ110— 1：1細胞 (ヒ ト a SZCHO— K 1細胞） を 1クローン （20 J1) 、 ヒ ト α 4インテ ダリンを恒常的に発現する CHO— K 1細胞 （ヒ ト a 4ZCHO— K 1細 胞） を 1クローン （9A5) を樹立した。 実施例 3
[抗 α 9インテグリン抗体を用いた F A C S解析]
マウス a 9/CHO— Κ 1細胞自体を抗原として用い、 シリアンハムスタ 一 （7— 8週齢、 雌） 3匹に 1 X 1 07細胞 Z回ノ匹を合計 5回免疫した。 脾 細胞を取り出し、 マウスミエローマ細胞である X 6 3— A g 8— 6 5 3と PE G法にて細胞融合し、 HAT培地で選択した。 モノクローナル抗体の産生は、 細胞 EL I S A法にてスクリーニングを行った。 免疫に使用した細胞をスクリ 一二ングに使用するとバックグラウンドが高くなることや偽陽性が多くなるこ とが予想されたので、 マウス α 9ZN I H 3 T 3細胞に反応し、 且つ、 マウ ス ひ 4/N I H3 T 3細胞に反応しないクローンを抗ひ 9インテグリン抗体 とした。 限界希釈法を 2回繰り返すことによりモノクローナル抗体を樹立した。 その結果、 抗マウス ct 9インテグリン抗体を産生するハイブリ ドーマ細胞 4 クローン （1 1 L 2 B、 1 2 C 4 ' 5 8、 1 8 R 1 8D、 5 5 A 2 C) を樹立 した。 '
ヒ ト α 9インテグリンに対する抗体作製は、 subtractive immunization ¾ (Williams CV， Stechmann CL, McLoon SC. Biotechniques. (1992) 12： 842- 7.) を参考にして BALBんマウス 3匹に対して免疫を行った。 まず、 CH0-K1細 胞を 4 X 1 06細胞 匹腹腔内投与し、 次の日とその次の日、 シクロホスファ ミ ドを 41^ノ匹、 腹腔内投与した。 シクロホスフアミ ド投与 2週間後、 ヒ ト α 9 CHO— K 1細胞を 2 X 1 06細胞 匹を腹腔内投与し、 さらにその 2週 間後、 ヒ ト ひ 9/CHO— K 1細胞を 3 X 1 06細胞ノ匹を腹腔内投与した。 ヒ ト a 9ZCHO— K 1細胞に反応し、 且つ、 ヒ ト a 4/CHO— K 1細胞 に反応しないクローンを抗ひ 9インテグリン抗体とした。 その結果、 抗ヒ ト ひ 9インテグリン抗体を産生するハイブリ ド一マ細胞 4クローン （1K11、 21C5、 24111、 25B6) を樹立した。 ここで得られた抗マウス α 9インテグリン抗体を産生するハイプリ ドーマ 細胞 1 1 L 2 Βは、 2 0 0 4年 1 2月 2 8日から茨城県つくば市東 1丁目 1番 地 1 中央第 6 (郵便番号 3 0 5— 8 5 6 6) 、 独立行政法人産業技術総合研 究所 特許生物寄託センターに受領番号 F ERM ΑΒ Ρ— 1 0 1 9 7として 寄託されている。
ここで得られたハイブリ ドーマ細胞 1 2 C 4 ' 5 8は、 2 0 04年 1 2月 2 8日から茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 3 0 5— 8 5 6 6) 、 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受領番号 F ERM ΑΒ Ρ_ 1 0 1 9 6として寄託されている。
ここで得られたハイプリ ドーマ細胞 1 8 R 1 8 Dは、 2 0 04年 1 2月 2 8 日から茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 3 0 5— 8 5 6 6) 、 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受領番号 F ERM ΑΒ Ρ_ 1 0 1 9 5として寄託されている。
ここで得られたハイブリ ドーマ細胞 5 5 A 2 Cは、 2 0 04年 1 2月 2 8日 から茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 3 0 5— 8 5 6
6) 、 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受領番号 F ERM ΑΒ Ρ— 1 0 1 9 8として寄託されている。
抗マウス ひ 9インテグリン抗体が F AC Sにて使用可能かをマウス ひ 9 N I H 3 T 3細胞、 マウス α 4ZN I H 3 T 3細胞を用いて検討した。 全て、 細胞数は 1. 0 X 1 05個にて行い、 抗体との反応は氷上にて行った。 また、 F c受容体との非特異反応をブロックするために、 抗 F c y R I I抗体 （2. 4 G 2) を添加した後に、 一次抗体を添加した。 2. 4 G 2処理をした ひ 9 ZN I H 3 T 3細胞、 α 4ZN I H 3 T 3細胞あるいは、 内在性の α 9イン テグリンが発現するマウスメラノーマ細胞株である Β 1 6— B L 6細胞に、 作 製した抗体 （5 gZm 1 ) を一次抗体として 5 0 μ 1 として添加し 3 0分反 応させた。 次に F I TCラベルした抗ハムスター I g G抗体 5 0 μ 1を添加し 3 0分反応後、 ナイロンメッシュを通した後、 F AC S解析を F AC S C a 1 i b u r™ (べク トンアンドディッキンソン） にて行った。 ピオチン化抗体を 使用する際は、 F c受容体をブロックするために 2. 4 G 2処理をした細胞に、 ピオチン化抗体 （5 x gZm l ) 50 μ 1を添加、 30分反応後、 A PC.ラベ ル、 あるレヽは F I TCラベルしたストレプトアビジンを 50 1添加し F AC S解析を行った。
その結果、 図 2に示すようにすベての抗マウス ひ 9インテグリン抗体でマ ウス α 9 N I H3T 3細胞と B 1 6— B L 6細胞上の ひ 9インテグリンを 検出することができた。 またすベての抗体は、 マウス α 4 N I Η 3 Τ 3細 胞には反応しなかった。 これらの結果から、 全ての抗マウス ひ 9インテグリ ン抗体が細胞上に発現するマウス α 9インテグリンタンパク質を F AC Sに て検出できることがわかった。 実施例 4
[細胞染色の検討]
免疫組織化学を行うためにマウスより種々の生体組織を摘出し、 0. T. コン パウンド（ティシューテック）にて包埋し、 液体窒素にて凍結後、 コールドトー ム （サクラ） にて 5μπι厚に薄切した。 薄切した組織を一昼夜風乾した後、 -
20°Cのァセトンにて固定し、 正常ャギ血清にて非特異反応のブロックを行った。 次に抗ひ 9インテグリン抗体クローン 12C4' 58をそれぞれ一次抗体として 2/X g/mlの濃度で室温 1時間反応させ、 PBSで 500倍希釈したピオチン化ャギ抗シ リアンハムスター IgG抗体 （ジャクソン） を二次抗体として添加し、 室温で 3 0分反応させた。 ベクタースティン ABCキット （ベクタ一ラボラトリー） を用 いて室温で 30分間反応後、 DAB+基質キット （ダコ） を室温で 1から 5分間程 度反応させ検出を行った。 組織はその後、 へマトキシリン （和光） による核染 色を行いカバーガラスと包埋剤でマウントした。 マウス脳、 肝臓、 肺、 筋肉の 染色像を図 3に示す。 染色像一覧 （図 4) に示したように、 脳の脈絡叢、 肺の 血管内皮 ·平滑筋 ·肺胞マクロファージ、 肝臓の類洞細胞、 腎臓の血管内皮 · 平滑筋 ·糸球体、 胃の平滑筋 ·粘膜筋板、 筋肉の血管内皮 ·筋繊維芽細胞 - リ ンパ管そして子宮の血管内皮 ·平滑筋 ·動脈平滑筋等の細胞でひ 9インテグリ ンの発現が見られた。 本結果より本発明で見出された抗ひ 9インテグリン抗体 は、 免疫染色に使用できることが分かり、 診断薬としての有用性が期待できる。 実施例 5
[細胞接着阻害効果の検討]
樹立した 4種類の抗マウス α 9インテグリン抗体が細胞接着阻害活性を有 するか調べるために、 GRGD S、 テネイシン C、 SVVYGLRペプチドと マウス ひ 9ZN I H3 T 3細胞を用いて細胞接着阻害試験を行った。 GRG D Sぺプチドに含まれる RGD配列は多くの E CMに共通して存在する細胞接 着部位である。 テネィシン Cの細胞接着部位である AE I DG I E Lぺプチド は、 c 9インテグリンは接着することができるが、 α 4インテグリンは接着す ることができない。 ヒ ト〇ΡΝの SVVYGLRペプチドは、 ひ 4、 ひ 9イン テグリンと接着することができる。 これら 3種類のぺプチド固相によるマウス α 9/N I Η 3 Τ 3細胞に対する細胞接着におけるそれぞれの抗 α·9インテ ダリン抗体の接着阻害能を検討した。
ΟΡΝ細胞接着領塽 SVVYGLR配列 （配列番号： 1 5) 、 GRGD S配 歹 ij (配列番号： 1 6) 、 テネイシン Cの AE I DG I EL配列 （配列番号： 1 7) を固相化し （ 1 0 gZm 1、 50 / Iノゥエル） 、 ブロッキング液 （0. 5% B SA/P B S) でブロッキングした E L I S Aプレートに、 DMEM /0. 25% B S A培地中の予め抗体と反応させた α 9 N I H 3 T 3細 胞 （-1. O X I O lZm l ) を添加した。 3 7°〇で1時間培養し、 非接着細 胞を P B Sで洗浄し、 接着細胞は、 0. 5% クリスタルバイオレットノ 2
0% メタノールで固定、 染色し、 室温 30分放置、 20% 酢酸溶液を添カロ することにより転溶し、 接着活性は波長 5 90 nmにおける ODを測定するこ とにより定量化した。
その結果、 図 5に示すように、 GRGD Sペプチドの固相においては、 α 9 インテグリンは RGD非依存性の接着であるので、 全ての抗 ひ 9インテグリ ン抗体では阻害できなかった。 Tenascin-C機能部位である A E I DG I E L ぺプチドと OPN機能部位である SVVYGLRぺプチドを固相した場合には 1 1 L 2 B、 1 2 C 4 ' 5 8、 5 5 A 2 Cの 3種類で顕著な細胞接着の阻害が見 られた。 1 8 R 1 8 Dはほとんど阻害能を示ざなかった。 次に図 5で阻害効果の見られた 1 1 L 2 B、 1 2 C 4 ' 58、 55A2Cの 3種類の阻害効果の比較を行った。 AE I DG I ELぺプチドと SVVYGL Rぺプチドの固相を 5 μ g/mlで固定し、 阻害抗体の濃度を細胞接着阻害試験 にて比較検討した。 図 6に示すように 55A 2 Cが最も阻害能が高いことが分 かった。 50%阻害濃度（IC50)をも図 6に示す。 実施例 6
[競合阻害試験によるェピトープ解析]
実施例 5の細胞接着阻害試験により、 各抗 α 9インテグリン抗体の阻害活 性に差がある結果が得られている。 このことは、 これらの抗体は α 9インテ ダリン上のそれぞれ異なるェピトープを認識していることを示唆している。 そ こで、 抗体のピオチン化を行い、 競合阻害試験によるェピトープ解析を行った。 ピオチン化抗体として 1 2 C 4 ' 58と 18 R 18 Dを用いて、 当該 2クロ一 ンと全クローンとのェピトープの差異を検討した。 図 7に示したように、 両抗 体とも、 同一クローンによる競合では完全にピオチン化抗体の結合は阻害され た。 ビォチン化 18 R 18Dを用いた際には、 全クローンで阻害することがで きな力つた。 一方で 1 2C4' 58では 55 Α2 Cより一部、 結合が阻害され ることが分かり、 1 2C4' 58と 55 Α2 Cでは一部ェピトープが重複して いる-ことが示唆された。 ' 実施例 7
[培養細胞株における α 9インテグリンの発現解析]
培養細胞上での α 9インテグリン発現を調べるために、 マウスメラノ一マ 培養細胞である Β 1 6— F 1と B 16— F 1 0、 B 16— BL 6で FACS解 析を行った。 その結果、 図 8に示すように、 B 16— F l、 B 16— F 10、 Β·16 -B L 6全ての細胞において ひ 9インテグリンの発現を確認すること ができた。
またヒ トの末梢血単核球において低レ、レベルで発現が確認されていたこと力、 ら、 マウス骨髄単球性白血病細胞である WEH I一 3 B細胞とマクロファージ 様細胞である RAW2 64. 7細胞において F AC S解析を行った。 図 9に示 すように、 WEH I— 3 B細胞では発現を検出できなかったが、 RAW2 64. 7細胞では強い発現を確認できた。 実施例 8
[好中球における ひ 9インテグリンの発現解析]
ひ 9インテグリンはヒ ト好中球において高発現していることが既に報告され ている。 そこで、 マウス好中球上における ひ 9インテグリン発現を解析する ために、 チォグチコレート誘導腹腔細胞を回収しマウス好中球の発現解析に使 用した。 Ma c— 1+G r— 1+の細胞を好中球とし、 その細胞群における α 9 インテグリンの発現を F AC S解析した。 図 1 0に示すように、 C 5 7 B LZ 6、 BALBZc、 CBA、 C 3H全系統マウスで ct 9インテグリン発現を 確認することはできなかった。 .この結果からマウス好中球上には通常では α 9インテグリンが発現していないことが明らかとなった。 実施例 9
[ひ 4インテグリンと a 9インテグリンの発現様式の解析]
α 4インテグリンと α 9インテグリンは同じインテグリンサブファミリ一 に属し、 多くのリガンドを共有していることから、 類似 "る機能を発揮するこ とが示唆されている。 また、 マウス肝内白血球中に存在する ΝΚΤ細胞が、 ひ 4と ひ 9インテグリンを同時に発現する事が mRN Αレベルの解析によって 既に報告されている （ Diao H, Kon S， Iwabuchi K, Kimura C, Morimoto J, Ito D， Segawa T, Maeda M, Hamuro J, Nakayama T, Taniguchi M, Yagita H, Van Kaer L, Onoe K, Denhardt D， Rittling S, T. U. 2004. Osteopontin as a mediator of NKT cell function in T cell-mediated liver diseases.
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ことが分かった。 実施例 1 0
[0?^^の81 6—8 6細胞との接着様式の検討]
Β 1 6— B L 6細胞をはじめ多くの細胞が α 4インテグリンと α 9インテ ダリンを同時に発現している。 また ひ 4インテグリンと ひ 9インテグリンは ΟΡΝや VCAM— 1等リガンドを共有していることから、 現在臨床応用され つつある ひ 4インテグリン機能抑制だけでは、 その機能が α 9インテグリン によりレスキューされてしまうことが予想される。 そこで、 抗ひ 4インテグ リン抗体と抗ひ 9インテグリン抗体の併用による S VVYGLRぺプチドと Β 1 6— B L 6細胞との接着阻害効果の相乗効果を検討した。
具体的には抗 α 4、 α 9インテグリン抗体による Β 1 6— B L 6細胞に対 する接着阻害効果は、 S VVYGLR配列固相 （5 μ gZm 1 ) の細胞接着試 験で検討した。 接着の際に、 培地に I mM Mn C 12を添加し反応させた。 抗体は抗 α 4インテグリン抗体 （クローン R 1— 2) (Pharmingen)と抗 α 9 インテグリン抗体 （クローン 1 1 L 2 B) を用いて行った。 抗 ひ 4インテグ リン抗体のコントロール抗体として正常ラット抗体 （NRG) 、 抗 α 9インテグ リン抗体のコントロール抗体として正常ハムスター抗体 （NHG) を使用した。 阻害活性は抗体 50 / g/m 1 , 2種併用の際は抗体それぞれ 2 5 μ g/m 1 で検討を行った。
その結果、 図 1 2に示すように、 抗 α 4インテグリン抗体と抗ひ 9インテ ダリン抗体それぞれ単独では、 阻害効果をほとんど見出すことができなかった。 一方、 抗 α 4インテグリン抗体と抗 α 9インテグリン抗体を併用した際には 阻害効果を見出した。 この結果は、 ひ 4インテグリン、 α 9インテグリンは片 方のみでも SVVYGL R配列に対してほぼ完全なる細胞接着能を有すること を示唆している。 生体内では、 α 4と ひ 9の両インテグリンを発現している 細胞 （好中球や ΝΚΤ細胞等） が疾患発症に関わっていることが示されており、 さらに、 これら両インテグリンは多くのリガンドを共有することから考えると、 抗 α 9インテグリ ン抗体と抗 ひ 4インテグリ ン抗体とを併用することにより、 より効率
的に疾患治療効果を得ることができることが推察され、 新たな治療法となり う る可能性を示すことができた。 実施例 1 1
[抗 α 9インテグリン抗体による肝炎治療効果]
これまで我々は、 0ΡΝ機能阻害により肝炎が治療できることを示している (特許文献 1 ) 。 そこで、 抗 a 9インテグリン抗体クローン 11L2Bおよび抗 a 4インテグリン抗体 R1-2 (Pharmingen) 'を用いた治療実験を行った。 肝^は コンカナパリン A (ConA) (Vector社） を 2 0 0 g静脈内投与し、 1 2時間後 の血中 AST値、 八 値を0 ? 17 丁一？111と0 0 17八3丁一？]]1 (富士フ イルム） を用いて測定した。 抗体は、 ConAを投与する 3時間前に 2 0 0 μ g を静脈内投与した。 図 1 3に示すように、 抗 ひ 9インテグリン抗体により AST 値、 ALT値の減少が見られ、 治療効果を見出すことができた。 さらに、 その治 療効果は抗 α 4インテグリン抗体との併用により亢進させることができた。 抗 α 9インテグリン抗体により肝炎治療ができることが分かった。 実施例 1 2
[腱線維芽細胞を用いた抗ひ 9インテグリン抗体による匪 P-13の変化] マウス膝蓋腱から、 腱線維芽細胞を回収し α 9インテグリンの発現を FACS と細胞染色により検討した。 抗 ひ 9インテグリ ン抗体はクローン 18R18D、 抗 ひ 4インテグリン抗体は R1-2を用いた。 図 1 4に示すように腱線維芽細胞に はひ 9インテグリンが発現していることが分かった。 ひ 4インテグリンは発 現していなかった。
リコンビナント全長型 0PNと トロンビン切断型 0PN (それぞれ 1 0 μ g/ml ) を固相し、 腱線維芽細胞を 4 8時間培養し、 MMP- 13 mRNA量をリアルタイム PCRを用いて定量化した。 トロンビン切断型 0PNで腱線維芽細胞を刺激した際 に、 匪 P- 13の転写が促進されることが分かった （図 1 5 ) 。 次に抗 α 9イン テグリン抗体 55A2Cを 30 g/mlになるように培養液中に添加して、 MMP-13 mRNA量変化を調べた。 図 1 6に示すように、 抗 α 9インテグリン抗体 （ク口 —ン 55A2C) により ΜΜΡ- 13転写量を抑制することが分かった。 コントロール 抗体としては、 ハムスター IgGを用いた。
MMP-13はコラゲナーゼとも呼ばれ、 マウスにおけるコラゲナーゼは MMP-13が 代表的な MMPであるが、 ヒ トにおいては MMP-1や MMP-8, MMP- 13が関係してい る。 薩 P- 13は関節炎 '（特に関節リウマチ (RA)や変形性関節症 (OA) ) の増悪化 に強く関与することが示されている（Skotnicki JS, DiGrandi MJ， L.evin JI. Design strategies for the identification of MMP - 13 and Tace inhibitors. Curr Opin Drug Di scov Devel. (2003) 6 : 742-59. Review. )。 抗ひ 9インテ ダリン抗体により MMP- 13の転写が抑制できるという本知見から、 抗 α 9イン テグリン抗体を用いることにより、 関節炎が治療できることが強く示唆できる。 実施例 1 3
[癌細胞株の增殖における抗 α 9インテグリン抗体の機能]
囱 2で示すように、 B16-BL6は α 9インテグリンが強く発現している。 また、 ΜΡ- 13は癌の增悪に関与している （Ala- aho R， Kahari VM. Col lagenases in cancer. Biochimie. (2005) 87 : 273-86. Review. ) とい'う報告もある。 そこで、 樹立した 4種類の抗マウスひ 9インテグリン抗体の癌細胞の細胞増殖阻害活性 をを検討した。 細胞培養用の 96ゥエルプレート （べク トンアンドディッキン ソン） に B16- BL6細胞を 10°/。 FCS/DMEMで 5xl04cells/mLに調製し、 抗マウス ひ 9インテグリン抗体、 抗マウスひ 4インテグリン抗体を 1 0 μ g/mlで添加 後、 細胞-抗体懸濁液を ΙΟΟ μ ίずつゥエルに添加した。 37°C、 5% C02存在下 で 24時間培養し、 各ゥエルに 10 しずつセルカウンティングキット 8 (同仁 化学研究所) を添加し、 さらに 37°C、 5% C02存在下で 1時間培養し、 0. D. 450 の吸光度を計測し細胞数を定量的に解析した。 図 1 7に示すように、 12C4' 58 が最も阻害活性が高く、 35%程度 B16-BL6細胞の増殖を抑制した。 55A2Cと R1- 2も 2 0 %程度、 増殖を抑制することができた。 次に、 より生体の条件に近い条件における細胞増殖の抑制効果を解析するた めに、 VCAM-1 を固相化し同様の検討を行った。 VCAM- 1 は α 9インテグリンの リガンドであり、 VCAM-1の可溶型リコンビナントタンパクである rhVCAM-卜 Fc chimera (ロシュ）を使用した。 rhVCAM- 1-Fc chimera を 10 μ g/mLで固相して使 用し、 0. 5% BSA/PBS で非特異的反応のブロックを行った。 抗体単独の場合は 1 0 μ g/ml で、 併用の場合はそれぞれ 5 / g/ml の濃度を添加した。 その後は、 図 1 7と同じ方法で行った。 その結果、 図 1 8に示すように 12C4 ' 58 抗体単 独及び α 4阻害抗体であるクローン R1 - 2単独投与では全く効果は得られない かあるいは微弱な効果しか得られなかったのに対し、 12C4 ' 58 と R1 - 2の同時 投与においては、 約 20%程度の顕明な細胞増殖抑制効果を示した。 実施例 1 4
[抗ヒ ト ひ 9インテグリン抗体の機能解析]
抗ヒ ト α 9インテグリン抗体が F A C Sにて使用可能かをヒ ト ひ 9 ZCH0- K1 細胞、 CH0-K1細胞、 内在的にひ 9インテグリンを発現するヒ ト好中球を用い て検討した。 ヒ ト好中球は FACSめ方法は図 2と同様な方法で行ったが、 F c 受容体との非特異反応のプロックは、 5 0 %ャギ血清を用いて行った。 二次抗 体は F I T Cラベルした抗マウス I g G抗体を使用した。 その結果、 図 1 9に 示すようにすベての抗ヒ ト α 9インテグリン抗体はヒ 卜 a 9 ZCH0-K1細胞と ヒ ト好中球上の ひ 9インテグリンを検出することができた。 またすベての抗 体は、 ヒ ト a 4 /CH0- K1細胞には反応しなかった。 これらの結果から、 全て の抗ヒ ト α 9インテグリン抗体が細胞上に発現するヒ ト ひ 9インテグリンタ ンパク質を F A C Sにて検出できることがわかった。 実施例 1 5
a 9インテグリンのリガンドである、 0PNと Tenascin- C機能べプチドを用い て、 細胞接着試験を行った。. 細胞は、 ヒ ト ひ 9ノ CH0-K1細胞を用いて、 各種 抗 α 9インテグリン抗体の阻害能の検討を行った。 ぺプチドは 5 / g/mlで固 相し、 抗体は 5 μ g/mlで阻害を行った。 図 2 0に示すように 0PNに対する接着 阻害試験では、 クローン 21C5が最も効果的な阻害活性を示した。 1K11， 24111 の阻害効果は低かった。 一方で、 Tenascin-Cに対する接着阻害能は、 Y9A2が 最も効果的に阻害活性を示した。 今回作製した抗ひ 9インテグリン抗体 4ク ローンは Tenascin- Cに対してはあまり阻害活性を示さなかった。
'既にヒ ト α 9インテグリンに対する中和抗体 Y9A2は報告され、 Chemicon社か ら製品化されているが、 Y9A2は、 ヒ ト α 9インテグリンを遺伝子導入したマ ウス線維芽細胞株 L cellを通常の免疫法 （腹腔内投与） で作製している。 本 発明の抗ヒ ト α 9インテグリン抗体は subtractive immunization法で作製し ており、 免疫方法が異なっている。 さらに図 1 9で示すように、 クローン 21C5は、 ヒ ト a 9 /CH0-K1細胞の FACS図の検出パターンが異なっており、 ま た、 図 2 0で示すように、 細胞接着試験の阻害効果様式も異なっていること力 ^ ら、 今回作製した抗 α 9インテグリン抗体 4クローンは Υ9Α2とはェピト一プ が異なっていると考えられる。 . まとめ
マウス ひ 9インテグリンの機能を阻害する抗体の作製と疾患 ·病態におけ る α 9インテグリンの機能を解明する目的で、 マウス ひ 9インテグリンに対 する 4種のモノクローナル抗体と抗ヒ ト α 9インテグリン抗体を 4種類作製 した。- これらの抗体を用いた研究で以下のことを明らかにすることができた。
( 1 ) 作製した 4種の抗マウス ひ 9インテグリン抗体は、 全て F A C S解 析に利用可能であり、 それぞれ異なる細胞接着阻害能を有した。
( 2 ) 抗マウス α 9インテグリン抗体クローン 12C4' 58が免疫染色に利用で きることが分かった。
( 3 ) マクロファージ様細胞である R AW 2 6 4 . 7細胞、 メラノーマ細胞 である B 1 6— F 1 、 B 1 6— F 1 0、 B 1 6— B L 6細胞で α 9インテグ リンは発現していた。 マウス好中球では ひ 9インテグリン発現が観察されず、 ヒ トで発現が確認できたことから、 好中球上の α 9インテグリンの発現には 種間で差があることが示された。 脾細胞の Β 2 2 0—C D 3—細胞群や Β 2 2 0 + C D 3 +細胞群において、 一部 ひ 9インテグリンを発現する細胞群が存在した。 また肝臓浸潤白血球の ' a 9インテグリン発現は、 ひ 4インテグリン発現細胞 上に多く見られた。
( 4 ) ひ 9と α 4インテグリンが同時に存在し、 両者が認識するリガンド が存在する場合、 その接着能は相補的であった。
( 5 ) 抗マウス ひ 9インテグリン抗体により、 肝炎治療効果を見出すこと ができ、 その効果は抗マウス α 4インテグリン抗体により亢進した。
( 6 ) 腱線維芽細胞上に ひ 9インテグリンの発現していることが分かり、 腱線維芽細胞をトロンビン切断型 Ο Ρ Νで刺激すると、 ΜΜΡ- 13発現が亢進す ることが分かった。 その MMP-13亢進は、 抗 ct 9インテグリン抗体で阻害がか かることが分かった。
( 7 ) B16-BL6細胞の増殖を抗ひ 9インテグリン抗体で抑制できることが分 かった。 また、 VCAM- 1刺激による細胞増殖は、 抗 α 9インテグリン抗体と抗 ひ 4インテグリン抗体を同時に併用投与することにより、 単独投与を比べ、 増 殖抑制効果が亢進した。
( 8 ) 作製した 4種の抗ヒ ト ひ 9インテグリン抗体は、 全て F A C S解析 に利用可能であり、 それぞれ異なる細胞接着阻害能を有した。 また、 FACSや 接着阻害試験により、 既存の抗ヒ ト α 9インテグリン抗体 Υ9Α2と異なる反応 性を示したことから、 ェピトープが異なることが考えられた。 産業上の利用可能十生
本発明のモノクローナル抗体は、 ひ 9インテグリン機能抑制により、 癌、 例 えば癌細胞の増殖、 転移、 そして炎症性疾患、 例えば関節リウマチ、 変形性関 節症、 肝炎、 気管支喘息、 線維症、 糖尿病、 癌転移、 動脈硬化、 多発性硬化症、 肉芽腫、 炎症性腸疾患 （潰瘍性大腸炎、 クローン病） 、 自己免疫疾患等に対す る治療効果を奏する。 ま 7"こ、 本発明の抗 α 9インテグリン抗体と抗 α 4イン テグリン抗体の両者を含有する医薬組成物は、 さらに改善された癌、 炎症性疾 患の治療効果を奏する。 本発明のモノクローナル抗体は、 マウス α 9インテ ダリンをも認識するので、 マウスを用いた動物実験に利用できる。

Claims

請求の範囲
1. ヒ ト α 9インテグリンおよびマウス α 9インテグリンを特異的に認識 するモノクローナル抗体。
2. α 9インテグリンと ひ 9インテグリンのリガンドとの結合を阻害する 請求項 1に記載のモノクローナル抗体。
3. α 9インテグリンのリガンドがォステオポンチンである請求項 2に記載 のモノクローナル抗体。
4. 受託番号 FERM ΑΒΡ— 101 95、 FERM ΑΒΡ— 1 01 9 6、 FERM ABP— 101 97、 または FERM ABP— 101 98で 標示されるハイプリ ドーマ細胞により産生される上記 （1) から （3) のいず れかに記載のモノク口一ナル抗体。
5. 請求項 1から 4のいずれかに記載のモノク口一ナル抗体を産生するハイ ブリ ドーマ細胞。
6. 請求項 1から 4のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含有する医薬 組成物。
7. 請求項 1から 4のいずれかに記載のモノクローナル抗体および抗 α 4 ィンテグリン抗体を含有する医薬組成物。
8-. 癌、 炎症性疾患、 自己免疫疾患の予防および Ζまたは治療剤である、 請 求項 6または 7に記載の医薬組成物。
9. 請求項 1から 4のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含有する、 癌、 炎症性疾患、 自己免疫疾患の診断剤。
10. ひ 9インテグリンを過剰発現する細胞を抗原として用いることを特徴 とする、 請求項 1から 4のいずれかに記載のモノクローナル抗体の製造方法。
1 1. ひ 9インテグリンを過剰発現する抗原として用いた細胞とは別の種の 細胞を用いることを特徴とする、 請求項 5に記載のハイプリ ドーマ細胞の製造 方法。
1 2. α 9インテグリン結合性機能分子を有効成分として含有する、 細胞お よび/または組織のリモデリングの抑制および または促進剤。
1 3 . α 9インテグリン発現細胞および/または組織と α 9インテグリン 結合性機能分子とを接触させることを特徴とする細胞および または組織のリ モデリングの抑制および/または促進方法。
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