KR20070115884A - 항-α9 인테그린 항체와 그 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 항마우스 α9 인테그린 항체, 항 인간 α9 인테그린 항체, 상기 항체를 생성하는 하이브리도마 세포, 상기 항체 및 하이브리도마 세포의 제조 방법, 상기 항체를 함유하는 의약 조성물 등을 제공한다. 본 발명의 항 α9 인테그린 항체는 α9 인테그린 기능 억제에 의해, 암, 예를 들어 암 세포의 증식, 전이, 그리고 염증성 질환, 예를 들어 류머티즘 관절염, 변형성 관절증, 간염, 기관지 천식, 섬유증, 당뇨병, 동맥 경화, 다발성 경화증, 육아종, 염증성 장질환 (궤양성 대장염, 크론병), 그리고 자가면역 질환 등에 대한 치료 효과를 나타낸다.

Description

항-α9 인테그린 항체와 그 용도{ANTI-α9 INTEGRIN ANTIBODY AND THE USE THEREOF}

본 발명은, 인간 α9 인테그린 및 마우스 α9 인테그린을 특이적으로 인식하는 모노클로널항체；상기 모노클로널항체를 생성하는 하이브리도마 세포；상기 모노클로널항체를 함유하는 의약 조성물；상기 모노클로널항체를 함유하는 진단제；상기 모노클로널항체의 제조 방법；상기 하이브리도마 세포의 제조 방법 등에 관한 것이다.

세포는 인테그린이라 불리는 1 군의 세포 표면 수용체를 개재하여 세포외 매트릭스 (extracellular matrix；이하, ECM 라고 약칭한다) 에 결합된다. 인테그린은 α사슬과 β사슬이 1：1 의 헤테로 2량체를 형성함으로써 기능한다. 현재까지 적어도 α사슬 18 종류, β사슬 8 종류 및 αβ헤테로 2량체 24 종류가 동정 확인되어 있다. 각 인테그린은 각각이 특이적인 리간드를 인식하는 것이 알려져 있다. 인테그린은 리간드에 대한 특이성이나 기능면에서 서브 패밀리로 분류되고, 콜라겐 수용체, 라미닌 수용체, 피브로넥틴이나 비트로넥틴 등에 함유되는 Arg-Gly-Asp(RGD) 서열을 인식하는 RGD 수용체, 백혈구에만 존재하는 백혈구 특이적 수용체로 구별된다 (비특허 문헌 1： Hynes RO. 2002. Integrins: Bidirectional, Allosteric Signaling Machines. Cell 110: 673-87；비특허 문헌 2 ： Miyasaka M. 2000. New edition of Adhesion Molecule handbook. Shujunsya). α4 와 α9 인테그린은, 이들 어디에도 속하지 않는 서브 패밀리이고 α4 인테그린 서브 패밀리로 불리고 있다 (비특허 문헌 3： Elise L. Palmer, Curzio Rfiegg, Ronald Ferrando, Robert Pytela, Sheppard D. 1993. Sequence and Tissue Distribution of the Integrin a9 Subunit, a Novel Partner of 131 That Is Widely Distributed in Epithelia and Muscle. The Journal of Cell Biology 123: 1289-97). 한편, 지금까지 ECM 은 세포간의 단순한 충전물로서 밖에 생각되지 않았지만, 인테그린을 개입시킨 ECM 과 세포의 상호작용이 세포의 증식, 부착, 운동 등의 조절에 깊이 관여하고, 암의 진전이나 염증 악화 등의 질환 발증에 관련된 것이 명확해졌다.

ECM 의 일종인 오스테오폰틴 (osteopontin；이하, OPN 이라고 약칭한다) 은 분자량 약 41kDa 의 분비형 산성 인산화 당단백질이고, 유즙, 뇨, 신뇨세관, 파골세포, 골아세포, 매크로퍼지, 활성화 T 세포, 종양 조직 등 널리 발현이 인정되어 있는 분자이다. 분자 중앙부에 세포 부착 서열 GRGDS 와 인간 OPN 에서는 SVVYGLR 서열, 마우스 OPN 에서는 SLAYGLR 서열, 그 직후에는 트롬빈 절단 부위를 갖고 있고, GRGDS 서열을 개재하여 RGD 인테그린과, SVVYGLR 서열 또는 SLAYGLR 서열을 개재하여 α4 (α4β1) 과 α9 (α9β1) 인테그린과 부착된다.

α4β1 은 트롬빈에서 절단되어 있지 않은 OPN (비절단형 OPN) 과 트롬빈에서 절단된 N 말단 프래그먼트 (절단형 OPN) 의 양방에 결합되고, α9β1 은 절단형 OPN 에만 결합된다는 양식의 차이도 발견되었다 (비특허 문헌 4： Y. Yokosaki et al., (1999) The Journal of Biological Chemistry 274, 36328-36334； 비특허 문헌 5： P. M. Green et al., (2001) FEBS Letters 503, 75-79；비특허 문헌 6： S. T. Barry et al., (2000) Experimental Cell Research 258, 342-351).

α4 및 α9 인테그린은, OPN 이외에도 많은 공통되는 리간드를 갖고 있다. 피브로넥틴의 EDA 부위, 프로펩티드-폰 빌러 브란트 팩터-(pp-ｖWF), 조직형 트랜스글루타미나아제 (tTG), 제 XIII 혈액 응고 인자 그리고 Vascular Cell Adhesion Molecule-1 (VCAM-1) 등이 알려져 있다. 또 α4 인테그린이 특이적으로 인식하는 리간드로서 피브로넥틴의 CS-1 도메인, MadCAM-1 (α4β7) 등이 알려져 있다. α9 인테그린이 특이적으로 인식하는 리간드는, Tenascin-C, 플라스민 등이 알려져 있다.

α9, α4 및 β1 의 인테그린 서브 유닛의 아미노산 서열은 공지되어 있다. 예를 들어, 인간 α9 는 NM＿002207, 마우스 α9 는 NM＿133721, 인간 α4 는 NM＿000885, 마우스 α4 는 NM＿010576, 인간 β1 은 X07979, 마우스 β1 은 NM＿010578 로서 GenBank 에 등록되어 있다. 또, 이들 인테그린은 종간 (種間) 에 아미노산 서열간의 유사성이 높은 것이 알려져 있다.

WO02/081522 (특허 문헌 1) 에는, OPN 결손 마우스나 OPN 에 대한 중화 항체를 이용한 OPN 기능 억제에 의한, 류머티즘성 관절염이나 간염의 치유 효과에 대해 개시되어 있다. 또, 이 공보에는, 염증성 질환 발증에는 α9 인테그린, α4 인테그린 인식 서열인 SVVYGLR 서열이 중요한 것, OPN 에 대한 수용체가 면역 담당 세포 등에서 발현되고, 염증성 질환에 관련되어 있는 것이 개시되어 있다.

발명의 개시

현재, 암, 염증성 질환, 자가면역 질환의 치료약은 여러 가지 알려져 있지만, 보다 개선된 치료 효과를 갖는 암, 염증성 질환, 자가면역 질환의 예방약 및/또는 치료약 등을 개발하는 것이 요망되고 있었다.

그래서, 본 발명자들은 인테그린에 착안하여, 여러 가지 연구를 실시한 결과, α9 인테그린에 대한 특이적 저해 항체가 암억제 효과, 항염증 효과를 갖는 것을 알아내어, 본 발명을 완성하였다. 즉, 구체적으로는, 본 발명은 이하에 기재된 모노클로널항체, 하이브리도마 세포, 의약 조성물 등을 제공한다.

(1) 인간 α9 인테그린 및 마우스 α9 인테그린을 특이적으로 인식하는 모노클로널항체.

(2) 인간 및/또는 마우스 α9 인테그린과 α9 인테그린의 리간드의 결합을 저해하는 상기 (1) 에 기재된 모노클로널항체.

(3) α9 인테그린의 리간드가 오스테오폰틴인 상기 (2) 에 기재된 모노클로널항체.

(4) 수탁 번호 FERM ABP-10195, FERM ABP-10196, FERM ABP-10197, 또는 FERM ABP-10198 에 의해 표시되는 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 모노클로널항체.

(5) 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 모노클로널항체를 생성하는 하이브리도마 세포.

(6) 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 모노클로널항체를 함유하는 의약 조성물.

(7) 청구항 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 모노클로널항체 및 항 α4 인테그린 항체의 양자를 함유하는 의약 조성물.

(8) 염증성 질환의 예방 및/또는 치료제인 상기 (6) 또는 (7) 에 기재된 의약 조성물.

(9) 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 모노클로널항체를 함유하는 염증성 질환의 진단제.

(10) α9 인테그린을 과잉 발현시키는 세포를 항원으로서 이용하는 것을 특징으로 하는 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 모노클로널항체의 제조 방법.

(11) α9 인테그린을 과잉 발현시키는 항원으로서 이용한 세포와는 다른 종류의 세포를 이용하는 것을 특징으로 하는 상기 (5) 에 기재된 하이브리도마 세포의 제조 방법.

(12) α9 인테그린 결합성 기능 분자 (예를 들어, OPN, VCAM-1, Tenascin-C, 피브로넥틴, pp-vWF, tTG 등) 를 유효 성분으로서 함유하는 세포 및/또는 조직의 리모델링의 억제 및/또는 촉진제.

(13) α9 인테그린 발현 세포 및/또는 조직 (예를 들어, 종양 세포, 호중구, 평활근 등) 과 α9 인테그린 결합성 기능 분자 (예를 들어, OPN, VCAM-1, Tenascin-C, 피브로넥틴, pp-vWF, tTG 등) 를 접촉시키는 것을 특징으로 하는 세포 및/또는 조직의 리모델링의 억제 및/또는 촉진 방법.

본 발명의 항 α9 인테그린 항체는 α9 인테그린 기능 억제에 의해, 암, 예를 들어 암 세포의 증식, 전이, 그리고 염증성 질환, 예를 들어 류머티즘 관절염, 변형성 관절증, 간염, 기관지 천식, 섬유증, 당뇨병, 동맥 경화, 다발성 경화증, 육아종, 염증성 장질환 (궤양성 대장염, 크론병), 그리고 자가면역 질환 등에 대한 치료 효과를 나타낸다.

또, 본 발명의 항 α9 인테그린 항체와 항 α4 인테그린 항체의 양자를 함유하는 의약 조성물은, 더욱 개선된 염증성 질환의 치료 효과를 나타낸다. 본 발명에서는 마우스 α9 인테그린, 인간 α9 인테그린에 대한 각각의 모노클로널항체를 제조하였다. 항마우스 α9 인테그린 항체에서는, 동물 실험에 사용할 수 있고, 항 인간 α9 인테그린 항체에서는 치료약으로서 사용할 수 있게 된다.

도 1 은 인테그린 유전자 도입 세포에 있어서의 mRNA 발현량의 분석 결과를 나타내는 도면이다.

도 2 는 항마우스 α9 인테그린 항체의 FACS 분석의 결과를 나타내는 도면이다.

도 3 은 항마우스 α9 인테그린 항체에 의한 정상 조직의 염색 이미지를 나타내는 도면이다.

도 4 는 면역 염색의 결과를 일람한 도면이다.

도 5 는 항마우스 α9 인테그린 항체 4 클론의 세포 부착 저해 효과를 나타내는 도면이다.

도 6 은 항마우스 α9 인테그린 항체 클론의 세포 부착 저해 효과를 비교한 도면이다.

도 7 은 경합 저해 시험에 의한 항체의 에피토프 분석의 결과를 나타내는 도면이다.

도 8 은 마우스 멜라노마 세포주에 있어서의 α4 및 α9 인테그린의 발현 분석의 결과를 나타내는 도면이다.

도 9 는 단구계 세포주에 있어서의 α9 인테그린의 발현 분석의 결과를 나타내는 도면이다.

도 10 은 마우스 호중구의 FACS 분석의 결과를 나타내는 도면이다.

도 11 은 마우스 간장 침윤 백혈구의 FACS 분석의 결과를 나타내는 도면이다.

도 12 는 항 α4 인테그린 항체 및 α9 인테그린 항체에 의한 B16-BL6 의 세포 부착 저해 효과를 나타내는 도면이다.

도 13 은 항 α4 인테그린 항체 및 항 α9 인테그린 항체에 의한 간염 치료 효과를 나타내는 도면이다.

도 14 는 건선유아세포 (tendon fibroblast) 의 α9 인테그린 발현을 나타내는 도면이다.

도 15 는 트롬빈 절단형 OPN 에 의해 건선유아세포의 MMP-13 mRNA 의 전사가 증가되는 것을 나타내는 도면이다.

도 16 은 항 α9 인테그린 항체에 의해 건선유아세포로부터의 MMP-13 mRNA 전사가 억제되고 있는 것을 나타내는 도면이다.

도 17 은 B16-BL6 세포의 증식을 항 α9 인테그린 항체로 억제한 것을 나타내는 도면이다.

도 18 은 VCAM-1 자극에 의한 B16-BL6 세포의 증식을 항 α9 인테그린 항체와 항 α4 인테그린 항체와의 병용에 의해 억제한 것을 나타내는 도면이다.

도 19 는 항 인간 α9 인테그린 항체의 FACS 분석의 결과를 나타내는 도면이다.

도 20 은 항 인간 α9 인테그린 항체 4 클론과 Y9A2 의 세포 부착 저해 효과를 나타내는 도면이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

항 인테그린 항체로서 α4 인테그린에 대한 중화 항체는 이미 임상시험으로 진행되고 있다. 예를 들어, 2004년 7월에는 미국 식품의약국 (FDA) 이, 바이오젠ㆍ아이덱 (Biogen Idec Inc., 미국 매사추세츠주) 과 엘란 (Elan Corporation, 아일랜드) 에 의한 다발성 경화증 치료약 Tysabri (등록상표) (natalizumab) 의 승인 신청을 수리하고, Tysabri (등록상표) 는 우선 심사의 대상으로 지정되어 있다. Tysabri (등록상표) 는 또한 크론병, 류머티즘성 관절염 등의 질환을 대상으로 하고 있다. 또, P4C2 라는 항 인간 α4β1 인테그린 모노클로널항체가 실험실 레벨에서 이용되고 있다.

그러나, α9 인테그린에 대한 항체는 인간 α9 인테그린을 항원으로 하고, 인간 및 기니피그의 α9 인테그린에 특이성을 나타내는 Y9A2 로 불리는 중화 항체 (A. Wang et al., (1996) AM. J. Respir., Cell. Mol. Biol. 15, 664-672) 가 실험실 레벨에서 이용되고 있지만, 임상적으로 이용되고 있는 것은 아니다.

한편, 항 인간 α9 인테그린 항체를 인간에 대한 의약으로서 이용하는 경우, 개발 단계에서는 직접 인간에 대한 투여는 할 수 없어, 그 효과를 확인할 수 없다. 즉, 효과를 확인하기 위한 동물 실험이 필요하게 되고, 이 효과를 확인할 수 있으면, 인간화 항체 등을 제조하게 된다. 마우스는 그 유전적 배경이 명확해져 있는 계통이 많고, 또 세대당 시간이 짧은 특징을 갖는다. 또한 마우스는 인간의 질환과 거의 동일한 질환을 관찰할 수 있는 것이 알려져 있으므로, 실험동물로서 적합하지만, 마우스 α9 인테그린과 교차 반응을 나타내는 중화 항체는 지금까지 보고되어 있지 않다.

본 발명에서는, 이하의 4 공정을 주의 깊게 진행함으로써, 인간, 마우스 각각에 대한 α9 인테그린에 특이적으로 반응하는 저해 항체를 얻을 수 있었다.

(1) α9 인테그린 과잉 발현주의 제조

유전자 발현 세포의 스크리닝은 통상이라면, 단백질 레벨이나 유전자 레벨에서 실시하지만, 이번에는, α9 인테그린의 기능인 세포 부착능를 이용한 스크리닝에 의해, 인간 또는 마우스 α9 인테그린을 각각 세포막 상에 과잉 발현하는 세포주를 수립하였다.

인간 또는 마우스 α9 인테그린 발현 세포는, 마우스 또는 햄스터에 각각 면 역화용으로 사용할 수 있었다.

(2) 세포의 선택

마우스 α9 인테그린에 대한 항체를 제조하기 위해서, 시리안 햄스터의 면역화를 생각하였다. 그것을 위해서, 햄스터의 난소 유래 세포인 CHO-K1 세포에 마우스 α9 인테그린의 유전자 도입을 실시하고, 햄스터 내에서 주로 마우스 α9 인테그린에 대한 항체만의 항체가를 증가시키는 실험계를 구축하였다.

인간 α9 인테그린에 대한 항체는, CHO-K1 세포에 인간 α9 인테그린의 유전자 도입을 실시하고, 마우스 내에서 인간 α9 인테그린에 대한 항체를 증가시키는 실험계를 구축하였다.

(3) 항마우스 α9 인테그린 항체를 생성하는 하이브리도마의 스크리닝

각종 하이브리도마로부터 마우스 α9 인테그린에만 반응하는 클론을 효율적으로 얻기 위해서, 면역화된 세포의 친세포 (CHO-K1) 와는 상이한 세포 (NIH3T3) 에 α9 인테그린을 발현시킨 세포를 스크리닝에 사용하였다. 또한 α9 인테그린과 동일한 인테그린 패밀리에 속하는 마우스 α4 인테그린을 NIH3T3 세포에 발현시킨 세포를 이용하여, α9 인테그린 이외의 인테그린과는 교차 반응성을 나타내지 않는 클론을 선발함으로써, 효율적으로 마우스 α9 인테그린에 특이적으로 반응하는 항체를 얻었다.

(4) 항 인간 α9 인테그린 항체를 생성하는 하이브리도마의 스크리닝

각종 하이브리도마로부터 인간 α9 인테그린에만 반응하는 클론을 효율적으로 얻기 위해서, 유전자 도입 CHO-K1 에 반응을 보이고, CHO-K1 세포에 반응하지 않는 클론을 선발하였다. 또, 인간 α4 인테그린 유전자 도입 CHO-K1 세포에 반응하지 않는 것을 확인함으로써, 인간 α9 인테그린에 특이적으로 반응하는 저해 항체를 얻었다.

［α9 인테그린에 대한 모노클로널항체］

본 발명은 α9 인테그린에 대한 모노클로널항체를 제공한다. 본 발명에 있어서 「항체」 란, 항원인 α9 인테그린 또는 그 부분 펩티드에 결합할 수 있는 항체 분자 전체 또는 그 단편 (예를 들어, Fab 또는 F(ab') 2 단편) 을 의미하고, 폴리클로널항체이어도 되고 모노클로널항체이어도 된다. 바람직하게는, 본 발명에 있어서는 모노클로널항체를 의미한다. 또, 본 발명에 있어서 「항체」 는, 인간 항체, 인간형화 항체, 키메라 항체를 포함한다.

상기 「인간형화 항체」 란 마우스 등의 인간 이외의 종에서 유래하는 항체를 개변하여, H사슬과 L사슬의 상보성 결정부 이외의 일차 구조를 인간의 항체가 대응하는 일차 구조로 치환한 항체를 말한다. 또, 「키메라 항체」 란, 이종 항체 유래의 Fab 영역과 Fc 영역을 갖는 항체를 의미한다.

본 발명에 있어서, 「항체 단편」 이란, 전체 길이 항체의 일부를 가리키고, 일반적으로 항원 결합 영역 또는 가변 영역을 말한다. 예를 들어, 항체 단편에는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fｖ 단편이 포함된다. 항체의 파파인 소화 (papain digestion) 에 의해, Fab 단편으로 지칭되는, 각각 1개의 항원 결합 부위를 갖는 2개의 동일한 항원 결합 단편, 및, 나머지가 용이하게 결정화되기 위해서 「Fc」 로 지칭되는 단편이 발생된다. 또, 펩신 소화 (pepsin digestion) 에 의해 2개의 항원 결합 부위를 갖고, 항원을 교차 결합할 수 있는 F(ab') 2 단편, 및, 나머지 다른 단편 (pFc'로 지칭된다) 을 얻을 수 있다.

여기에서, 「Fｖ」 단편은 최소의 항체 단편으로서, 완전한 항원 인식 부위와 결합 부위를 포함한다. 이 영역은 1개의 중사슬 및 경쇄의 가변 도메인이 비공유결합에 의해 강하게 연결된 2량체이다 (VH-VL 2량체). 각 가변 도메인의 3개의 CDR 이 상호 작용하여, VH-VL 2량체의 표면에 항원 결합 부위를 형성한다. 6개의 CDR 은, 항체에 항원 결합 부위를 부여하는 것이다. 그러나, 1개의 가변 도메인 (또는, 항원에 특이적인 3개의 CDR 만을 포함한 Fｖ 의 절반) 이더라도, 전체 결합 부위보다는 낮은 친화성이기는 하지만, 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.

또, Fab 단편 (F(ab) 로도 지칭된다) 는 또한, 경쇄의 정상 도메인, 및, 중사슬의 세포의 정상 도메인 (CH1) 을 포함한다. Fab' 단편은 Fab 단편과 항체의 힌지 영역으로부터의 1 또는 그 이상의 시스테인을 함유한 중사슬 CH1 도메인의 카르복시 말단 유래하는 몇 개의 잔기를 부가적으로 갖는 점에서 상이하다.

본 발명에 있어서의 「모노클로널항체」 란, 실질적으로 균질한 항체의 집단, 즉, 집단을 구성하는 개개의 항체가, 천연에서 일어날 수 있는 소량으로 존재하는 변이체를 제외하고는 균일한 항체 집단으로부터 얻어진 항체를 가리킨다. 모노클로널항체는 고도로 특이적이고, 단일 항원 부위에 대해서 작용하는 것이다. 게다가, 상이한 에피토프에 대한 상이한 항체를 함유한 폴리클로널항체와 비교하여, 각 모노클로널항체는, 항원상의 단일 에피토프로 향해진다. 그 특이성에 추가하여, 모노클로널항체는, 다른 면역 글로불린이 혼재하지 않는 하이브리도마 배양에 의해 합성되는 점에서 유리하다. 「모노클로널」 이라는 수식어는, 실질적으로 균일한 항체의 집단에서 얻어진 항체의 특성을 시사하는 것으로서, 항체가 특정한 방법에 의해 제조되는 것을 한정하는 것은 아니다.

이하, 항 α9 인테그린 모노클로널항체의 제조에 대해 상세하게 서술하겠지만, 그 항체의 제작은 이에 한정되지 않는다.

［α9 인테그린 (항원)］

본 발명에 있어서 항원으로서 사용하는 α9 인테그린은, (1) 인간이나 그 외의 포유동물의 α9 인테그린을 발현하는 모든 세포, 또는 그들 세포가 존재하는 모든 조직에서 유래하는 단백질, (2) α9 인테그린을 코드하는 유전자 DNA, 바람직하게는 cDNA 를 세균, 효모, 동물세포 등의 세포주에 도입, 발현시킨 재조합 단백질이어도 되고, 또 (3) 합성 단백질이어도 된다.

또, 본 발명의 α9 인테그린에는, 각종 포유동물의 α9 인테그린의 아미노산 서열, 특히 바람직하게는 인간 α9 인테그린의 아미노산 서열 (서열 번호：1) 과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드도 포함된다.

여기에서 「실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드」 란, 천연형의 α9 인테그린, 특히 바람직하게는 인간 유래의 α9 인테그린과 실질적으로 동등한 생물학적 성질을 갖는 한, 그 아미노산 서열 중의 복수개의 아미노산, 바람직하게는 1 내지 10개의 아미노산, 특히 바람직하게는 1 내지 수개 (예를 들어, 1 내지 5개) 의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 수식되어 있는 아미노산 서열을 갖는 변이 폴리펩티드, 그리고 그 천연형의 α9 인테그린, 특히 바람직하게는 인간 유래의 α9 인테그린의 아미노산 서열 중에, 복수개의 아미노산, 바람직하게는 1 내지 10개의 아미노산, 특히 바람직하게는 1 내지 수개 (예를 들어, 1 내지 5개) 의 아미노산이 부가된 아미노산 서열을 갖는 변이 폴리펩티드를 의미한다. 또한, 그러한 치환, 결실, 수식 및 부가의 복수를 갖는 변이 폴리펩티드이어도 된다.

본 발명의 α9 인테그린, 특히 인간 유래의 α9 인테그린은, 유전자 재조합 기술 외, 화학적 합성법, 세포 배양 방법 등과 같은 당해 기술 분야에 있어서 공지된 방법 또는 그 수식 방법을 적절하게 이용함으로써 제조할 수 있다.

또, 변이 폴리펩티드의 제조 방법으로서는, 예를 들어, 합성 올리고뉴클레오티드 부위 돌연변이 도입법 (gapped duplex법), 아질산 또는 아황산 처리에 의해 랜덤으로 점돌연변이 (point mutation) 를 도입하는 방법, Ba131 효소 등에 의해 결실 변이체를 제조하는 방법, 카세트 변이법, 링커 스캐닝법, 미스 인코포레이션법, 미스매치 프라이머법, DNA 세그먼트 합성법 등을 들 수 있다.

또, 본 발명의 α9 인테그린에는, 그 α9 인테그린의 「일부」 도 포함된다. 여기서 「일부」 란, α9 인테그린의 리간드, 예를 들어 OPN 이나 VCAM-1, Tenascin-C 등과 결합하기 위해서 필요한 영역을 포함한 부분이고, 구체적으로는 서열 번호：1 로 표시되는 아미노산 서열의 14번째 내지 980번째, 서열 번호：2 로 표시되는 아미노산 서열의 11번째 내지 981번째를 포함한 부분을 말한다. 그 α9 인테그린의 「일부」 는, 후술하는 당해 기술 분야에 있어서 공지된 방법 또는 그 수식 방법에 따라, 유전자 재조합 기술 또는 화학적 합성법에 의해 제조할 수도 있고, 또 세포 배양 방법에 의해 단리된 α9 인테그린, 특히 바람직하게는 인간 유래의 α9 인테그린을 단백 분해 효소 등에 의해 적절히 절단함으로써 제조할 수 있다.

항원으로서는 또한, α9 인테그린을 재조합 기술에 의해 세포막 상에 과잉 발현하는 세포 자체, 또는 그 막 획분 등을 이용할 수 있다.

본 발명의 α9 인테그린에는, 인간 α9 인테그린의 아미노산 서열 (서열 번호：1) 과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드도 포함된다. 서열 번호：1 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로서 구체적으로는, 서열 번호：2 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 마우스 α9 인테그린을 들 수 있다. 본 발명에서는, 질환 모델 동물로서 마우스를 고려하고 있으므로, 본 발명의 항원으로서 마우스 유래의 α9 인테그린이 적합하게 사용된다. 또, 특히 본 발명에서는 α9 인테그린을 재조합 기술에 의해 세포막 상에 과잉 발현하는 세포 자체가 바람직하게 사용되다. 따라서, 후술하는 바와 같은, α9 인테그린을 코드하는 유전자 (예를 들어, cDNA) 를 공지된 유전자 공학 기술을 이용하여 클로닝하고, α9 인테그린을 세포막 상에 과잉 발현하는 세포 자체, 또는 그 세포막 획분을 항원으로서 조제하는 경우도 있다.

［항체 생성 세포의 조제］

항원은, 면역화된 동물에 대해서 투여에 의해 항체 생성이 가능한 부위에 그 자체 또는 담체, 희석제와 함께 투여된다. 투여할 때에 항체 생성능을 높이기 위해, 완전 프로인트 애쥬번트 (Freund's adjuvant) 나 불완전 프로인트 애쥬번트 를 투여해도 된다. 투여는 통상 1∼6주 마다 1회씩, 합계 2∼10회 정도 실시된다. 사용되는 온혈동물로서는, 예를 들어, 마우스, 원숭이, 토끼, 개, 기니피그, 래트, 햄스터, 양, 염소, 닭 등을 들 수 있지만,본 발명에서는 햄스터가 바람직하게 사용된다.

치료의 대상이 인간이고, OPN 저해 항체 생성 동물이 마우스인 경우에는, 인간 마우스 키메라 항체나 인간화 항체를 이용하는 것이 바람직하고, 나아가서는, 항체 생성에 관여하는 인간 유전자를 도입한 마우스 등의 트랜스제닉 동물을 이용하여 인간형 모노클로널항체를 제조하여 이용하는 것이 바람직하다.

［항체 생성 세포와 미엘로마 세포의 세포 융합］

미엘로마 세포로서는, 마우스, 래트, 인간 등에 유래하는 세포가 사용된다. 예를 들어 마우스 미엘로마 P3U1, P3X63-Ag8, P3X63-Ag8-U1, P3NS1-Ag4, SP2/0-Ag14, P3X63-Ag8-653 등을 들 수 있지만, 항체 생성 세포와 미엘로마 세포와는 동종 동물, 특히 동 계통의 동물 유래인 것이 바람직하다. 미엘로마 세포는 동결 보존하거나, 말, 토끼 또는 소 태아 혈청을 첨가한 일반적인 배지에서 계대하여 유지할 수 있다. 세포 융합에는 대수 증식기의 세포를 이용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서는 P3X63-Ag8-653 이 적합하게 이용된다.

항체 생성 세포와 미엘로마 세포를 융합시켜 하이브리도마를 형성시키는 방법으로서는, 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 을 이용하는 방법, 센다이 바이러스를 이용하는 방법, 전기 융합 장치를 이용하는 방법 등을 들 수 있다. 예를 들어 PEG 법의 경우, 약 30∼60% 의 PEG (평균 분자량 1000∼6000) 를 함유한 적당한 배지 또 는 완충액 중에 비장세포와 미엘로마 세포를 1∼10：1, 바람직하게는 5∼10：1 의 혼합비로 현탁하고, 온도 약 25∼37℃, pH6∼8 의 조건하에서, 약 30초∼3분간 정도 반응시키면 된다. 반응 종료후, PEG 용액을 제외하고 배지에 재현탁하고, 셀 웰 플레이트 중에 파종하여 배양을 계속한다.

［하이브리도마 세포의 선별］

모노클로널항체를 생성하는 하이브리도마 세포의 선별은, 공지 또는 거기에 준하는 방법에 따라 실시할 수 있다. 통상, HAT (히포키산틴, 아미노프테린, 티미딘) 를 첨가한 동물세포용 배지에서 실시할 수 있다. 선별 및 육종용 배지로서는, 하이브리도마 세포를 생육할 수 있는 것이라면 어떠한 배지를 이용해도 된다. 예를 들어, 1∼20%, 바람직하게는 10∼20% 의 소태아 혈청을 함유한 RPMI 1640 배지, 1∼10% 의 소태아 혈청을 함유한 GIT 배지 (와코 쥰야꾸 공업 (주)) 또는 하이브리도마 배양용 무혈청 배지 (SFM-101, 닛스이 제약 (주)) 등을 이용할 수 있다. 배양 온도는, 통상 20∼40℃, 바람직하게는 약 37℃ 이다. 배양 시간은, 통상, 5일∼3주일, 바람직하게는 1주일∼2주일이다. 배양은, 통상 5% CO₂ 하에서 실시할 수 있다.

본 발명의 모노클로널항체의 생성은, [신임상 면역 실험 조작법 (part 3), 과학 평론사, 1997] 에 기재된 세포 ELISA 법을 이용해 확인 및 스크리닝할 수 있다. 면역화에 이용한 세포를 스크리닝에 사용하면 백그라운드가 높아지는 것이나 위양성이 많아지는 것이 예상되는 경우, 면역화에 이용한 세포와는 다른 세포에 서 과잉 발현하는 α9 인테그린에 반응하고, 또한, α4 인테그린을 과잉 발현하는 세포에 반응하지 않는 클론을 항 α9 인테그린 항체로 할 수 있다. 이러한 클론으로부터 한계 희석법을 1 내지 5회, 바람직하게는 2 내지 4회 반복함으로써 모노클로널항체를 조제할 수 있다.

［항체의 분리 정제］

얻어진 항체는, 균일하게 될 때까지 정제할 수 있다. 항체의 분리, 정제는 통상의 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제 방법을 사용하면 된다. 예를 들어 어피니티 크로마토그래피 등의 크로마토그래피 칼럼, 필터, 한외 여과, 염석, 투석, SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 등전점 전기영동 등을 적절하게 선택, 조합하면, 항체를 분리, 정제할 수 있지만 (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), 이들로 한정되는 것은 아니다. 어피니티 크로마토그래피에 이용하는 칼럼으로서는, 프로테인 A 칼럼, 프로테인 G 칼럼을 들 수 있다. 예를 들어 프로테인 A 칼럼을 이용한 칼럼으로서 Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Amersham Biosciences) 등을 들 수 있다.

［항체의 표지화］

얻어진 항체를, 공지된 방법 또는 시판되는 키트를 이용하여 각종 표지화 (예를 들어, 비오틴 표지, FITC 표지, APC 표지) 할 수 있다. 본 발명에서는, Biotin Labeling Kit (도진 화학) 을 이용한 비오틴 표지가 적합하게 사용된다.

［본 발명의 모노클로널항체를 함유하는 의약 조성물］

본 발명은 상기의 모노클로널항체를 함유하는 의약 조성물을 제공한다. 본 발명의 모노클로널항체를 유효 성분으로서 함유하여 이루어지는 의약 조성물은, 암, 예를 들어 암 세포의 증식, 전이, 그리고 염증성 질환, 예를 들어 관절 류머티즘, 변형성 관절증, 간염, 기관지 천식, 섬유증, 당뇨병, 동맥 경화, 다발성 경화증, 육아종, 염증성 장질환 (궤양성 대장염, 크론병) 및 자가면역 질환 등의 예방 및/또는 치료제로서 이용할 수 있다.

본 발명의 모노클로널항체를 함유하여 이루어지는 의약 조성물은 또한 장기 이식 후의 만성 거부반응 억제, 전신성 자가면역 질환ㆍ에리테마토서스 (erythematosus)ㆍ포도막염ㆍ베체트병ㆍ다발성 근염ㆍ사상체 증식성 신염ㆍ사르코이도시스 등의 자가면역 질환의 치료에도 이용할 수 있다.

본 발명의 항체를 함유하는 상기 질병의 예방 및/또는 치료제는 저독성이고, 적당한 용매에 배합하여 액제로 하거나, 또는 적당한 제형의 의약 조성물로 하여, 인간 또는 포유동물 (예, 래트, 토끼, 양, 돼지, 소, 고양이, 개, 원숭이 등) 에 대해서 경구적 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 투여량은, 투여 대상, 대상 질환, 증상, 투여 루트 등에 따라서도 상이하지만, 예를 들어, 성인의 관절 류머티즘 환자의 예방 및/또는 치료를 위해서 사용하는 경우에는, 본 발명의 항체를 1회량으로서 통상 0.01∼20㎎/kg 체중 정도, 바람직하게는 0.1∼10㎎/kg 체중 정도, 더욱 바람직하게는 0.1∼5㎎/kg 체중 정도를, 1일 1∼5회 정도, 바람직하게는 1일 1∼3회 정도, 정맥주사에 의해 투여하는 것이 형편상 좋다. 그 밖의 비경구 투여 및 경구 투여의 경우에도 이것에 준하는 양을 투여할 수 있다. 증상이 특히 위중한 경우에는, 그 증상에 따라 증량시켜도 된다.

본 발명의 항체는, 그 자체 또는 적당한 의약 조성물로서 투여할 수 있다. 상기 투여에 사용되는 의약 조성물은, 상기 항체 또는 그 염과 약리학적으로 허용될 수 있는 담체, 희석제 또는 부형제를 함유하는 것이다. 이러한 조성물은, 경구 또는 비경구 투여에 적합한 제형으로서 제공된다.

즉, 예를 들어, 경구 투여를 위한 조성물로서는, 고체 또는 액체의 제형, 구체적으로는 정제 (당의정, 필름 코팅정을 포함함), 환제, 과립제, 산제, 캡슐제 (소프트 캡슐제를 포함함), 시럽제, 유제, 현탁제 등을 들 수 있다. 이러한 조성물은 공지된 방법에 따라 제조되고, 제제 분야에 있어서 통상 사용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 함유하는 것이다. 예를 들어, 정제용의 담체, 부형제로서는, 유당, 전분, 자당, 스테아르산 마그네슘 등이 사용된다.

비경구 투여를 위한 조성물로서는, 예를 들어, 주사제, 좌제 등이 이용되고, 주사제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등의 제형을 포함한다. 이러한 주사제는, 공지된 방법에 따라, 예를 들어, 상기 항체 또는 그 염을 통상 주사제에 사용되는 무균의 수성 또는 유성액에 용해, 현탁 또는 유화함으로써 조제한다. 주사용의 수성액으로서는, 예를 들어, 생리 식염수, 포도당이나 그 외의 보조약을 함유하는 등장액 등이 이용되고, 적당한 용해 보조제, 예를 들어, 알코올 (예, 에탄올), 폴리알코올 (예, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜), 비이온 계면활성제〔예, 폴리소르베이트80, HCO-50 (경화 피마자유의 폴리에틸렌 (50mol) 부가물)〕등과 병용해도 된다. 유성액으로서는, 예를 들 어, 참기름, 콩기름 등이 이용되고, 용해 보조제로서 벤조산 벤질, 벤질 알코올 등을 병용해도 된다. 조제된 주사액은, 통상, 적당한 앰플에 충전된다. 직장 투여에 사용되는 좌제는, 상기 항체 또는 그 염을 통상의 좌약용 기제에 혼합함으로써 조제된다.

상기의 경구용 또는 비경구용 의약 조성물은, 활성 성분의 투여량에 적합한 투약 단위의 제형으로 조제되는 것이 적합하다. 이러한 투약 단위의 제형으로서는, 정제, 환제, 캡슐제, 주사제 (앰플), 좌제 등이 예시되어, 각각의 투약 단위 제형당 통상 5∼500㎎, 특히 주사제에서는 5∼100㎎, 그 외의 제형에서는 10∼250㎎ 의 상기 항체가 함유되어 있는 것이 바람직하다.

상기한 각 조성물은, 상기 항체와의 배합에 의해 바람직하지 않은 상호작용을 발생시키지 않는 한 다른 활성 성분을 함유해도 된다.

또한, 본 발명은, α9 인테그린 결합성 기능 분자 (예를 들어, OPN, VCAM-1, Tenascin-C, 피브로넥틴, pp-vWF, tTG 등) 를 유효 성분으로서 함유하는 세포 및/또는 조직의 리모델링의 억제 및/또는 촉진제； 그리고, α9 인테그린 발현 세포 및/또는 조직 (예를 들어, 종양 세포, 호중구, 평활근 등) 과 α9 인테그린 결합성 기능 분자를 접촉시키는 것을 특징으로 하는 세포 및/또는 조직의 리모델링의 억제 및/또는 촉진 방법에도 관한 것이다. 이러한 치료제의 유효 성분의 투여량, 투여 방법, 제제화 등에 대해서는 상기 항체 함유 의약의 기재를 참조하여 적절하게 결정할 수 있다.

［본 발명의 모노클로널항체를 함유하는 진단제］

본 발명의 모노클로널항체를 함유하여 이루어지는 의약 조성물은, 암, 예를 들어 암 세포의 증식, 전이, 그리고 염증성 질환, 예를 들어 류머티즘 관절염, 변형성 관절증, 간염, 기관지 천식, 선유증, 당뇨병, 암 전이, 동맥 경화, 다발성 경화증, 육아종 등의 진단제, 또 장기 이식 후의 만성 거절반응 억제, 전신성 자가면역 질환ㆍ에리테마토서스ㆍ포도막염ㆍ베체트병ㆍ다발성 근염ㆍ사상체 증식성 신염ㆍ사르코이도시스 등의 자가면역 질환의 진단제로서 이용할 수 있다. 본 발명의 모노클로널항체는, α9 인테그린을 특이적으로 인식할 수 있으므로, 피검액 중의 α9 인테그린의 정량, 특히 샌드위치 면역 측정법, 경합법, 이뮤노메트릭법 또는 네프로메트리 등에 의한 정량, 면역 염색 등에 사용할 수 있다. 이들 개개의 면역학적 측정법을 본 발명의 측정 방법에 적용할 때에는, 특별한 조건, 조작 등의 설정은 필요로 하지 않는다. 각각 방법에 있어서의 통상의 조건, 조작법에 당업자의 통상의 기술적 배려를 부가하여 측정계를 구축하면 된다. 이들 일반적인 기술 수단의 상세한 것에 대하여는, 총설, 서적 등을 참조할 수 있다.

이상과 같이, 본 발명의 항체를 이용함으로써, α9 인테그린을 고감도로 정량할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체를 이용하는 생체 내에서의 α9 인테그린의 정량법을 이용함으로써, α9 인테그린이 관련된 각종 질환의 진단을 할 수 있다. 예를 들어, α9 인테그린의 발현량의 증감이 검출된 경우에는, α9 인테그린이 관련된 질환, 예를 들어 암이나 염증성 질환일 가능성이 높거나 또는 장래 이환될 가능성이 높다고 진단할 수 있다. 또, 본 발명의 모노클로널항체는, 체액이나 조직 등의 피검사체 중에 존재하는 α9 인테그린을 특이적으로 검출하기 위해 사용할 수 있다. 또, α9 인테그린을 정제하기 위해서 사용하는 항체 칼럼의 제조, 정제시의 각 획분에 함유되는 α9 인테그린의 검출, 피검 세포내에 있어서의 α9 인테그린의 거동의 분석 등에 사용할 수 있다.

이하에 실시예를 나타내어 본 발명을 보다 상세하게 설명하겠지만, 이것은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

실시예 1

［마우스 α9, α4 인테그린 cDNA 의 클로닝］

α4 인테그린 유전자는 마우스 12.5일 배 (胚), α9 인테그린은 B16-BL6 세포 (마우스 멜라노마 세포) 의 전체 RNA 로부터 랜덤 프라이머를 이용하여 역전사하고, 얻어진 cDNA 를 주형으로 하여 PCR 법에 의해 클로닝을 실시하였다. 클로닝에 사용한 프라이머를 이하에 나타낸다.

mα4Integin-5':

(서열 번호: 3)

mα4Integin-3':

(서열 번호: 4)

mα9Integin-5':

(서열 번호: 5)

mα9Integin-3':

(서열 번호: 6)

PCR 은 이하의 조성：주형 cDNA 5㎕, GC 버퍼 I 25㎕, dNTPmix 5㎕, 10μM primer1 1㎕, 10μM primer2 1㎕, DW 10.5㎕, LA Taq (TaKaRa LA Taq (등록상표)) 0.5㎕ 의 반응계를 제조하여, 94℃ 2분→(94℃ 30초→68℃ 3분, 30사이클) →4℃ 의 반응 조건에서, 서멀 사이클러 (GeneAmp (등록상표) PCR System 2700 (Applied Biosystems)) 에 의해 반응을 실시하였다. 반응 후, 1% 아가로오스 겔 전기영동에 의해, α4 인테그린의 경우에는 3kb 부근의 밴드를, α9 인테그린의 경우에는 3kb 부근의 밴드를 분리 후, 겔로부터 잘라내어, QIAquick (등록상표) Gel Extraction Kit (QIAGEN) 을 이용하여 PCR 증폭 산물을 정제하였다.

［인간 α9, α4 인테그린 cDNA의 클로닝］

α4 인테그린 유전자는 인간 호중구, α9 인테그린은 인간 말초 단핵구로부터 추출한 전체 RNA 로부터 랜덤 프라이머를 이용하여 역전사하고, 얻어진 cDNA 를 주형으로서 PCR 법에 의해 클로닝을 실시하였다. 클로닝에 이용한 프라이머를 이하에 나타낸다.

hα4Integin-5':

(서열 번호: 11)

hα4Integin-3':

(서열 번호: 12)

hα9Integin-5':

(서열 번호: 13)

hα9Integin-3':

(서열 번호: 14)

상기와 같이, PCR 법에 의해 증폭된 α4 인테그린 및 α9 인테그린 각각의 cDNA 를 pCRII-TOPO (등록상표) 벡터 (Invitrogen) 에 삽입시키고, ABI PRISM (등록상표) 310 (Applied Biosystems) 에 의해 각각의 염기 서열을 확인하였다. 얻어진 cDNA 의 염기 서열은 서열 번호 ： 7 (마우스 α9) 및 서열 번호 ： 8 (마우스 α4), 서열 번호 ： 9 (인간 α9) 및 서열 번호 ： 10 (인간 α4) 의 염기 서열과 각각 일치하였다. 이들 cDNA 를 동물세포에 도입하기 위해서, pcDNA^TM 3.1 (＋) (Invitrogen) 에 삽입시켰다. 그 결과 얻어진 벡터를 각각 마우스 α9 인테그린/pcDNA3.1, 마우스 α4 인테그린/pcDNA3.1, 인간 α9 인테그린/pcDNA3.1, 인간 α4 인테그린/pcDNA3.1 이라고 명명하였다.

실시예 2

［α9 인테그린, α4 인테그린 항상 발현 세포주의 수립］

햄스터를 면역화하기 위해서, 햄스터 난소 유래 세포주인 CHO-K1 세포에 α4 인테그린 cDNA 를 함유한 마우스 α4 인테그린/pcDNA3.1, 또는 마우스 α9 인테그린 cDNA 를 함유한 α9 인테그린/pcDNA3.1 을 도입하여, OPN 의 SVVYGLR 펩티드와의 부착 효과능에 의한 스크리닝에 의해, 마우스 α9 인테그린을 항상적으로 발현하는 CHO-K1 세포 (마우스 α9/CHO-K1 세포) 를 3 클론 (6F1, 12C3, 4N2), NIH3T3 세포 (마우스 α9/NIH3T3 세포) 를 4 클론 (21H, 7A3, 11C3, 21D3) 수립하였다.

마우스 α9 인테그린의 대조군으로서 동일한 인테그린 서브 패밀리인 α4 인테그린을 마우스 태아 12.5일 배로부터 클로닝하여, 마우스 α4 인테그린을 항상적으로 발현하는 NIH3T3 세포 (마우스 α4/NIH3T3 세포) 를 3 클론 (3G1, 4A10, 19F2) 수립하였다.

수립한 마우스 α9 인테그린 발현 세포의 α9 인테그린 발현량을 정량적으로 분석하기 위해서α9/NIH3T3 세포, α9/CHO-K1 세포로부터 추출한 cDNA 를 이용하여 리얼타임 PCR 을 실시하였다. 그 결과, 도 1A 및 도 1B 에 나타내는 바와 같이, α9/NIH3T3 세포에서는 21D3 이, α9/CHO-K1 세포에서는 12C3 이 가장 높은 α9 인테그린의 발현을 나타냈다. 또, α4/NIH3T3 세포는 FACS 에서 단백질 발현량을 분석한 결과를 도 1C 에 나타낸다. 4A10 에서 가장 높은 마우스 α4 인테그린 발현 상승이 보였다.

동일한 방법에 의해, 인간 α9 인테그린을 항상적으로 발현하는 CHO-K1 세포 (인간 α9/CHO-K1 세포) 를 1 클론 (20J1), 인간 α4 인테그린을 항상적으로 발현하는 CHO-K1 세포 (인간 α4/CHO-K1 세포) 를 1 클론 (9A5) 을 수립하였다.

실시예 3

［항 α9 인테그린 항체를 이용한 FACS 분석］

마우스 α9/CHO-K1 세포 자체를 항원으로서 이용하여, 시리안 햄스터 (7-8주령, 암컷) 3마리에게 1×10⁷ 세포/회/마리를 합계 5회 면역화시켰다. 비장세포 를 취출하여, 마우스 미엘로마 세포인 X63-Ag8-653 과 PEG 법으로 세포 융합시키고, HAT 배지에서 선택하였다. 모노클로널항체의 생성은, 세포 ELISA 법으로 스크리닝을 실시하였다. 면역화에 사용한 세포를 스크리닝에 사용하면 백그라운드가 높아지는 것이나 위양성이 많아지는 것이 예상되었으므로, 마우스 α9/NIH3T3 세포에 반응하고, 또한, 마우스 α4/NIH3T3 세포에 반응하지 않는 클론을 항 α9 인테그린 항체로 하였다. 한계 희석법을 2회 반복함으로써 모노클로널항체를 수립하였다. 그 결과, 항마우스 α9 인테그린 항체를 생성하는 하이브리도마 세포 4 클론 (11L2B, 12C4'58, 18R18D, 55A2C) 을 수립하였다.

인간 α9 인테그린에 대한 항체 제조는, subtractive immunization 법 (Williams CV, Stechmann CL, McLoon SC. Biotechniques. (1992) 12:842-7.) 을 참고로 하여 BALB/c 마우스 3마리에 대해서 면역화를 실시하였다. 우선, CHO-K1 세포를 4×10⁶ 세포/마리 복강내 투여하고, 다음날과 그 다음날, 시클로포스파미드를 4㎎/마리, 복강내 투여하였다. 시클로포스파미드 투여 2주일 후, 인간 α9/CHO-K1 세포를 2×10⁶ 세포/마리를 복강내 투여하고, 다시 그 2주일 후, 인간 α9/CHO-K1 세포를 3×10⁶ 세포/마리를 복강내 투여하였다. 인간 α9/CHO-K1 세포에 반응하고, 또한, 인간 α4/CHO-K1 세포에 반응하지 않는 클론을 항 α9 인테그린 항체로 하였다. 그 결과, 항 인간 α9 인테그린 항체를 생성하는 하이브리도마 세포 4 클론 (1K11, 21C5, 24I11, 25B6) 을 수립하였다.

여기서 얻어진 항마우스 α9 인테그린 항체를 생성하는 하이브리도마 세포 11L2B 는, 2004년 12월 28일부터 이바라키현 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1번지 1 중앙 제 6 (우편 번호 305-8566), 독립 행정법인 산업기술 종합연구소 특허 생물 기탁 센터에 수령 번호 FERM ABP-10197 로서 기탁되어 있다.

여기서 얻어진 하이브리도마 세포 12C4'58 은, 2004년 12월 28일부터 이바라키현 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1번지 1 중앙 제 6 (우편 번호 305-8566), 독립 행정법인 산업기술 종합연구소 특허 생물 기탁 센터에 수령 번호 FERM ABP-10196 으로서 기탁되어 있다.

여기서 얻어진 하이브리도마 세포 18R18D 는, 2004년 12월 28일부터 이바라키현 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1번지 1 중앙 제 6(우편 번호 305-8566), 독립 행정법인 산업기술 종합연구소 특허 생물 기탁 센터에 수령 번호 FERM ABP-10195 로서 기탁되어 있다.

여기서 얻어진 하이브리도마 세포 55A2C 는, 2004년 12월 28일부터 이바라키현 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1번지 1 중앙 제 6 (우편 번호 305-8566), 독립 행정법인 산업기술 종합연구소 특허 생물 기탁 센터에 수령 번호 FERM ABP-10198 로서 기탁되어 있다.

항마우스 α9 인테그린 항체가 FACS 에서 사용할 수 있는지를 마우스 α9/NIH3T3 세포, 마우스 α4/NIH3T3 세포를 이용하여 검토하였다. 모두, 세포수는 1.0×10⁵개에서 실시하고, 항체와의 반응은 빙상에서 실시하였다. 또, Fc 수용체와의 비특이 반응을 블록하기 위해서, 항 FcγRII 항체 (2.4G2) 를 첨가한 후 에, 1 차 항체를 첨가하였다. 2.4G2 처리를 한 α9/NIH3T3 세포, α4/NIH3T3 세포 또는, 내재성의 α9 인테그린이 발현되는 마우스 멜라노마 세포주인 B16-BL6 세포에, 제작한 항체 (5μg/㎖) 를 1 차 항체로서 50㎕ 첨가하고 30분 반응시켰다. 다음으로 FITC 라벨한 항햄스터 IgG 항체 50㎕ 를 첨가하고 30분 반응 후, 나일론 메쉬를 통과시킨 후, FACS 분석을 FACSCalibur^TM (벡톤 앤드 디킨슨) 으로 실시하였다. 비오틴화 항체를 사용할 때는, Fc 수용체를 블록하기 위해서 2.4G2 처리를 한 세포에, 비오틴화 항체(5μg/㎖) 50㎕ 를 첨가, 30분 반응 후, APC 라벨, 또는 FITC 라벨한 스트렙토아비딘을 50㎕ 첨가하여 FACS 분석하였다.

그 결과, 도 2 에 나타내는 바와 같이 모든 항마우스 α9 인테그린 항체에서 마우스 α9/NIH3T3 세포와 B16-BL6 세포 상의 α9 인테그린을 검출할 수 있었다. 또 모든 항체는, 마우스 α4/NIH3T3 세포에는 반응하지 않았다. 이들 결과로부터, 모든 항마우스 α9 인테그린 항체가 세포 상에 발현되는 마우스 α9 인테그린 단백질을 FACS 에서 검출할 수 있는 것을 알 수 있었다.

실시예 4

［세포 염색의 검토］

면역 조직화학을 실시하기 위해서 마우스로부터 여러가지 생체 조직을 적출하고, O.C.T. 콤파운드 (Tissue Tech) 로 포매 (包埋) 하여, 액체 질소로 동결 후, 콜드 톰 (사쿠라) 으로 5㎛ 두께로 얇게 잘랐다. 얇게 자른 조직을 하룻 동안 바람에 건조시킨 후, ―20℃ 의 아세톤으로 고정시키고, 정상 염소 혈청에서 비특 이 반응의 블록을 실시하였다. 다음으로 항 α9 인테그린 항체 클론 12C4'58 을 각각 1 차 항체로서 2μg/㎖ 의 농도로 실온 1시간 반응시키고, PBS 에서 500배 희석한 비오틴화 염소 항시리안 햄스터 IgG 항체 (Jackson) 를 2 차 항체로서 첨가하여, 실온에서 30분 반응시켰다. 벡터 스테인 ABC 키트 (Vector Laboratories) 를 이용하여 실온에서 30분간 반응 후, DAB+ 기질 키트 (다코) 를 실온에서 1 내지 5분간 정도 반응시켜 검출을 실시하였다. 조직은 그 후, 헤마톡실린 (와코) 에 의한 핵 염색을 실시하여 커버 유리와 포매제로 마운트하였다. 마우스 뇌, 간장, 폐, 근육의 염색 이미지를 도 3 에 나타낸다. 염색 이미지 일람 (도 4) 에 나타낸 바와 같이, 뇌의 맥락총, 폐의 혈관내피ㆍ평활근ㆍ폐포 매크로퍼지, 간장의 유동세포, 신장의 혈관내피ㆍ평활근ㆍ사구체, 위의 평활근ㆍ점막근판, 근육의 혈관내피ㆍ근섬선유아세포ㆍ임파관 그리고 자궁의 혈관내피ㆍ평활근ㆍ동맥 평활근 등의 세포에서 α9 인테그린의 발현이 보였다. 본 결과로부터 본 발명에서 발견된 항 α9 인테그린 항체는, 면역 염색에 사용할 수 있는 것을 알 수 있고, 진단약으로서의 유용성을 기대할 수 있다.

실시예 5

［세포 부착 저해 효과의 검토］

수립한 4 종류의 항마우스 α9 인테그린 항체가 세포 부착 저해 활성을 갖는지 조사하기 위해서, GRGDS, Tenascin-C, SVVYGLR 펩티드와 마우스 α9/NIH3T3 세포를 이용하여 세포 부착 저해 시험을 실시하였다. GRGDS 펩티드에 함유되는 RGD 서열은 많은 ECM 에 공통적으로 존재하는 세포 부착 부위이다. Tenascin-C 의 세포 부착 부위인 AEIDGIEL 펩티드는, α9 인테그린은 부착할 수 있지만, α4 인테그린은 부착할 수 없다. 인간 OPN 의 SVVYGLR 펩티드는, α4, α9 인테그린과 부착할 수 있다. 이들 3 종류의 펩티드 고상에 의한 마우스 α9/NIH3T3 세포에 대한 세포 부착에 있어서의 각각의 항 α9 인테그린 항체의 부착 저해능을 검토하였다.

OPN 세포 부착 영역 SVVYGLR 서열 (서열 번호：15), GRGDS 서열 (서열 번호：16), Tenascin-C 의 AEIDGIEL 서열 (서열 번호：17) 을 고상화 하고 (10μg/㎖, 50㎕/웰), 블로킹액 (0.5% BSA/PBS) 으로 블로킹한 ELISA 플레이트에, DMEM /0.25% BSA 배지 중의 미리 항체와 반응시킨 α9/NIH3T3 세포 (1.0×10⁵개/㎖) 를 첨가하였다. 37℃ 에서 1시간 배양하여 비부착 세포를 PBS 에서 세정하고, 부착 세포는, 0.5% 크리스탈 바이올렛/20% 메탄올로 고정, 염색하고, 실온 30분 방치, 20% 아세트산 용액을 첨가함으로써 전용 (轉溶) 되고, 부착 활성은 파장 590㎚ 에 있어서의 OD 를 측정함으로써 정량화하였다.

그 결과, 도 5 에 나타내는 바와 같이, GRGDS 펩티드의 고상에 있어서는, α9 인테그린은 RGD 비의존성의 부착이므로, 모든 항 α9 인테그린 항체에서는 저해할 수 없었다. Tenascin-C 기능 부위인 AEIDGIEL 펩티드와 OPN 기능 부위인 SVVYGLR 펩티드를 고상한 경우에는 11L2B, 12C4'58, 55A2C 의 3 종류에서 현저한 세포 부착의 저해가 보였다. 18R18D 는 거의 저해능을 보이지 않았다.

다음으로 도 5 에서 저해 효과가 보인 11L2B, 12C4'58, 55A2C 의 3 종류의 저해 효과를 비교하였다. AEIDGIEL 펩티드와 SVVYGLR 펩티드의 고상을 5μg/㎖ 에서 고정시키고, 저해 항체의 농도를 세포 부착 저해 시험으로 비교 검토하였다. 도 6 에 나타내는 바와 같이 55A2C 가 가장 저해능이 높은 것을 알 수 있었다. 50% 저해 농도 (IC50) 도 도 6 에 나타낸다.

실시예 6

［경합 저해 시험에 의한 에피토프 분석］

실시예 5 의 세포 부착 저해 시험에 의해, 각 항 α9 인테그린 항체의 저해 활성에 차이가 있는 결과가 얻어져 있다. 이것은, 이들 항체는 α9 인테그린 상의 각각 상이한 에피토프를 인식하고 있는 것을 시사하고 있다. 그래서, 항체의 비오틴화를 실시하고, 경합 저해 시험에 의한 에피토프 분석하였다. 비오틴화 항체로서 12C4'58 과 18R18D 를 이용하여, 당해 2 클론과 전체 클론의 에피토프 차이를 검토하였다. 도 7 에 나타낸 바와 같이, 두 항체 모두, 동일 클론에 의한 경합에서는 완전하게 비오틴화 항체의 결합은 저해되었다. 비오틴화 18R18D 를 이용했을 때에는, 전체 클론에서 저해할 수 없었다. 한편, 12C4'58 에서는 55A2C 로부터 일부, 결합이 저해되는 것을 알 수 있고, 12C4'58 과 55A2C 에서는 일부 에피토프가 중복되어 있는 것이 시사되었다.

실시예 7

［배양 세포주에 있어서의 α9 인테그린의 발현 분석］

배양 세포상에서의 α9 인테그린 발현을 조사하기 위해서, 마우스 멜라노마 배양 세포인 B16-F1 과 B16-F10, B16-BL6 에서 FACS 분석하였다. 그 결과, 도 8 에 나타내는 바와 같이, B16-F1, B16-F10, B16-BL6 모든 세포에 있어서 α9 인테그린의 발현을 확인할 수 있었다.

또 인간의 말초혈 단핵구에 있어서 낮은 레벨에서 발현이 확인되었던 점에서, 마우스 골수 단구성 백혈병 세포인 WEHI-3B 세포와 매크로퍼지양 세포인 RAW264.7 세포에 있어서 FACS 분석하였다. 도 9 에 나타내는 바와 같이, WEHI-3B 세포에서는 발현을 검출할 수 없었지만, RAW264.7 세포에서는 강한 발현을 확인할 수 있었다.

실시예 8

［호중구에 있어서의 α9 인테그린의 발현 분석］

α9 인테그린은 인간 호중구에 있어서 고발현되고 있는 것이 이미 보고되어 있다. 그래서, 마우스 호중구 상에 있어서의 α9 인테그린 발현을 분석하기 위해서, 티오글리코레이트 유도 복강 세포를 회수하여 마우스 호중구의 발현 분석에 사용하였다. Mac-1⁺Gr-1⁺ 의 세포를 호중구로 하고, 그 세포군에 있어서의 α9 인테그린의 발현을 FACS 분석하였다. 도 10 에 나타내는 바와 같이, C57BL/6, BALB/c, CBA, C3H 전체 계통 마우스에서 α9 인테그린 발현을 확인할 수는 없었다. 이 결과로부터 마우스 호중구 상에는 통상적으로는 α9 인테그린이 발현되고 있지 않는 것이 분명해졌다.

실시예 9

［α4 인테그린과α9 인테그린의 발현 양식의 분석］

α4 인테그린과 α9 인테그린은 동일한 인테그린 서브 패밀리에 속하고, 많은 리간드를 공유하고 있는 점에서, 유사한 기능을 발휘하는 것이 시사되고 있다. 또, 마우스 간내 백혈구 중에 존재하는 NKT 세포가, α4 와 α9 인테그린을 동시에 발현시키는 것이 mRNA 레벨의 분석에 의해 이미 보고되어 있다 (Diao H, Kon S, Iwabuchi K, Kimura C, Morimoto J, Ito D, Segawa T, Maeda M, Hamuro J, Nakayama T, Taniguchi M , Yagita H, Van Kaer L, Onoe K, Denhardt D, Rittling S, T. U. 2004. Osteopontin as a mediator of NKT cell function in T cell-mediated liver diseases. Immunity 21: 539-50)). 그래서, α4 인테그린과 α9 인테그린은 동일 세포상에 실제로 발현하고 있는지를 확인하기 위해서, 마우스 간 침윤백혈구를 분리하고 두 인테그린 항체에 의한 이중 염색을 실시하였다. 그 결과, 도 11 에 나타내는 바와 같이, α4 인테그린은 전체 간내 백혈구의 약 39% 정도가 발현되었고, α9 인테그린은 전체 간 침윤백혈구의 약 12% 정도가 발현되었다. α9 인테그린은 α4 인테그린 발현 세포의 약 74% 로 발현되어 있는 것을 알 수 있었다.

실시예 10

［OPN의 B16-BL6 세포와의 부착 양식의 검토］

B16-BL6 세포를 비롯해 많은 세포가 α4 인테그린과 α9 인테그린을 동시에 발현시키고 있다. 또 α4 인테그린과 α9 인테그린은 OPN 이나 VCAM-1 등 리간드를 공유하고 있는 점에서, 현재 임상 응용되고 있는 α4 인테그린 기능 억제만으로는, 그 기능이 α9 인테그린에 의해 레스큐 (rescue) 되어 버리는 것이 예상된 다. 그래서, 항 α4 인테그린 항체와 항 α9 인테그린 항체의 병용에 의한 SVVYGLR 펩티드와 B16-BL6 세포의 부착 저해 효과의 상승효과를 검토하였다.

구체적으로는 항 α4, α9 인테그린 항체에 의한 B16-BL6 세포에 대한 부착 저해 효과는, SVVYGLR 서열 고상 (5μg/㎖) 의 세포 부착 시험으로 검토하였다. 부착할 때에, 배지에 1mM MnCl₂ 를 첨가하여 반응시켰다. 항체는 항 α4 인테그린 항체 (클론 R1-2) (Pharmingen) 와 항 α9 인테그린 항체 (클론 11L2B) 를 이용하여 실시하였다. 항 α4 인테그린 항체의 대조군 항체로서 정상 래트 항체 (NRG), 항 α9 인테그린 항체의 대조군 항체로서 정상 햄스터 항체 (NHG) 를 사용하였다. 저해 활성은 항체 50μg/㎖, 2 종 병용할 때에는 항체 각각 25μg/㎖ 에서 검토하였다.

그 결과, 도 12 에 나타내는 바와 같이, 항 α4 인테그린 항체와 항 α9 인테그린 항체 각각 단독으로는, 저해 효과를 거의 발견할 수 없었다. 한편, 항 α4 인테그린 항체와 항 α9 인테그린 항체를 병용했을 때에는 저해 효과를 발견하였다. 이 결과는, α4 인테그린, α9 인테그린은 일방만에서도 SVVYGLR 서열에 대해서 거의 완전한 세포 부착능를 갖는 것을 시사하고 있다. 생체 내에서는, α4 와 α9 의 두 인테그린을 발현시키고 있는 세포 (호중구나 NKT 세포 등) 가 질환 발증에 관련되어 있는 것이 나타나고 있고, 게다가 이들 두 인테그린은 많은 리간드를 공유하는 점에서 생각하면, 항 α9 인테그린 항체와 항 α4 인테그린 항체를 병용함으로써, 보다 효율적으로 질환 치료 효과를 얻을 수 있는 것이 추찰되고, 새로운 치료법이 될 수 있을 가능성을 나타낼 수 있었다.

실시예 11

［항 α9 인테그린 항체에 의한 간염 치료 효과］

지금까지 우리들은, OPN 기능 저해에 의해 간염을 치료할 수 있는 것을 나타내고 있다 (특허 문헌 1). 그래서, 항 α9 인테그린 항체 클론 11L2B 및 항 α4 인테그린 항체 R1-2 (Pharmingen) 를 이용한 치료 실험하였다. 간염은 콘카나발린 A (ConA) (Vector사) 를 200μg 정맥내 투여하고, 12시간 후의 혈중 AST 값, ALT 값을 GPT/ALT-PⅢ 과 GOT/AST-PⅢ (후지 필름) 를 이용하여 측정하였다. 항체는, ConA 를 투여하기 3시간 전에 200μg 를 정맥 내 투여하였다. 도 13 에 나타내는 바와 같이, 항 α9 인테그린 항체에 의해 AST 값, ALT 값의 감소가 보이고 또한 치료 효과를 발견할 수 있었다. 또한 그 치료 효과는 항 α4 인테그린 항체와의 병용에 의해 항진시킬 수 있었다. 항 α9 인테그린 항체에 의해 간염 치료를 할 수 있는 것을 알 수 있었다.

실시예 12

［건선유아세포를 이용한 항 α9 인테그린 항체에 의한 MMP-13의 변화］

마우스 슬개건으로부터, 건선유아세포를 회수하고 α9 인테그린의 발현을 FACS와 세포 염색에 의해 검토하였다. 항 α9 인테그린 항체는 클론 18R18D, 항 α4 인테그린 항체는 R1-2 를 이용하였다. 도 14 에 나타내는 바와 같이 건선유아세포에는 α9 인테그린이 발현되고 있는 것을 알 수 있었다. α4 인테그린은 발현되지 않았다.

리콤비넌트 전체 길이형 OPN 과 트롬빈 절단형 OPN (각각 10μg/㎖) 을 고상하고, 건선유아세포를 48시간 배양하여, MMP-13 mRNA량을 리얼타임 PCR 을 이용하여 정량화하였다. 트롬빈 절단형 OPN 으로 건선유아세포를 자극했을 때에, MMP-13의 전사가 촉진되는 것을 알 수 있었다 (도 15). 다음에 항 α9 인테그린 항체 55A2C 를 30μg/㎖ 가 되도록 배양액 중에 첨가하여, MMP-13 mRNA량 변화를 조사하였다. 도 16 에 나타내는 바와 같이, 항 α9 인테그린 항체 (클론 55A2C) 에 의해 MMP-13 전사량을 억제하는 것을 알 수 있었다. 대조군 항체로서는, 햄스터 IgG 를 이용하였다.

MMP-13 은 콜라게나아제라고도 하고, 마우스에 있어서의 콜라게나아제는 MMP-13이 대표적인 MMP 이지만, 인간에 있어서는 MMP-1 이나 MMP-8, MMP-13 이 관계되어 있다. MMP-13 은 관절염 (특히 관절 류머티즘 (RA) 이나 변형성 관절증 (OA)) 의 악화 증대에 강하게 관여하는 것이 나타나고 있다 (Skotnicki JS, DiGrandi MJ, Levin JI. Design strategies for the identification of MMP-13 and Tace inhibitors. Curr Opin Drug Discov Devel. (2003) 6:742-59. Review). 항 α9 인테그린 항체에 의해 MMP-13 의 전사를 억제할 수 있다는 본 견지에서, 항 α9 인테그린 항체를 이용함으로써, 관절염을 치료할 수 있는 것을 강하게 시사할 수 있다.

실시예 13

［암 세포주의 증식에 있어서의 항 α9 인테그린 항체의 기능］

도 2 에서 나타내는 바와 같이, B16-BL6 는 α9 인테그린이 강하게 발현되어 있다. 또, MMP-13 은 암의 악화에 관여하고 있다 (Ala-aho R, Kahari VM. Collagenases in cancer.Biochimie. (2005) 87:273-86. Review.) 는 보고도 있다. 그래서, 수립한 4 종류의 항마우스 α9 인테그린 항체의 암 세포의 세포 증식 저해 활성을 검토하였다. 세포 배양용의 96 웰 플레이트 (Becton Dickinson) 에 B16-BL6 세포를 10% FCS/DMEM 에서 5x10⁴cells/mL 로 조제하고, 항마우스 α9 인테그린 항체, 항마우스 α4 인테그린 항체를 10μg/㎖ 에서 첨가 후, 세포-항체 현탁액을 100㎕ 씩 웰에 첨가하였다. 37℃, 5% CO₂ 존재하에서 24시간 배양하고, 각 웰에 10㎕ 씩 셀 카운팅 키트 8 (도진 화학 연구소) 을 첨가하고, 다시 37℃, 5% CO₂ 존재하에서 1시간 배양하고, O.D.450 의 흡광도를 계측하여 세포수를 정량적으로 분석하였다. 도 17 에 나타내는 바와 같이, 12C4'58 이 가장 저해 활성이 높고, 35% 정도 B16-BL6 세포의 증식을 억제하였다. 55A2C 와 R1-2 도 20% 정도 증식을 억제할 수 있었다.

다음으로, 보다 생체의 조건에 가까운 조건에 있어서의 세포 증식의 억제 효과를 분석하기 위해서, VCAM-1 을 고상화시키고 동일한 검토를 하였다. VCAM-1은 α9 인테그린의 리간드이며, VCAM-1 의 가용형 리콤비넌트 단백인 rhVCAM-1-Fc chimera (로쉬) 를 사용하였다. rhVCAM-1-Fc chimera 를 10μg/㎖ 에서 고상하여 사용하고, 0.5% BSA/PBS 에서 비특이적 반응의 블록을 실시하였다. 항체 단독의 경우에는 10μg/㎖ 로, 병용의 경우에는 각각 5μg/㎖ 의 농도를 첨가하였다. 그 후에는, 도 17 과 동일한 방법으로 실시하였다. 그 결과, 도 18 에 나타 내는 바와 같이 12C4'58 항체 단독 및 α4 저해 항체인 클론 R1-2 단독 투여에서는 전혀 효과는 얻을 수 없거나 또는 미약한 효과 밖에 얻을 수 없었던 반면에, 12C4'58 과 R1-2 의 동시 투여에서는, 약 20% 정도의 분명한 세포 증식 억제 효과를 보였다.

실시예 14

［항 인간 α9 인테그린 항체의 기능 분석］

항 인간 α9 인테그린 항체가 FACS 에서 사용할 수 있는지를 인간 α9/CHO-K1 세포, CHO-K1 세포, 내재적으로α9 인테그린을 발현시키는 인간 호중구를 이용하여 검토하였다. 인간 호중구는 FACS 의 방법은 도 2 와 동일한 방법으로 실시했지만, Fc 수용체와의 비특이 반응의 블록은, 50% 염소 혈청을 이용하여 실시하였다. 2 차 항체는 FITC 라벨한 항마우스 IgG 항체를 사용하였다. 그 결과, 도 19 에 나타내는 바와 같이 모든 항 인간 α9 인테그린 항체는 인간 α9/CHO-K1 세포와 인간 호중구 상의 α9 인테그린을 검출할 수 있었다. 또 모든 항체는, 인간 α4/CHO-K1 세포에는 반응하지 않았다. 이들 결과로부터, 모든 항 인간 α9 인테그린 항체가 세포 상에 발현되는 인간 α9 인테그린 단백질을 FACS 에서 검출할 수 있는 것을 알 수 있었다.

실시예 15

α9 인테그린의 리간드인, OPN 과 Tenascin-C 기능 펩티드를 이용하여, 세포 부착 시험을 하였다. 세포는, 인간 α9/CHO-K1 세포를 이용하여, 각종 항 α9 인테그린 항체의 저해능을 검토하였다. 펩티드는 5μg/㎖ 에서 고상되고, 항체 는 5μg/㎖ 에서 저해를 실시하였다. 도 20 에 나타내는 바와 같이 OPN 에 대한 부착 저해 시험에서는, 클론 21C5 가 가장 효과적인 저해 활성을 나타냈다. 1K11, 24I11 의 저해 효과는 낮았다. 한편, Tenascin-C 에 대한 부착 저해능은, Y9A2 가 가장 효과적으로 저해 활성을 보였다. 이번에 제조한 항 α9 인테그린 항체 4 클론은 Tenascin-C 에 대해서는 그다지 저해 활성을 보이지 않았다.

이미 인간 α9 인테그린에 대한 중화 항체 Y9A2 는 보고되어, Chemicon 사로부터 제품화되었지만, Y9A2 는, 인간 α9 인테그린을 유전자 도입한 마우스 선유아세포주 L 세포를 통상의 면역화 방법 (복강내 투여) 에 의해 제조하고 있다. 본 발명의 항 인간 α9 인테그린 항체는 subtractive immunization 법에 의해 제조하고 있으며, 면역화 방법이 상이하다. 또한, 도 19 에서 나타내는 바와 같이, 클론 21C5 는, 인간 α9/CHO-K1 세포의 FACS 도의 검출 패턴이 상이하고, 또, 도 20 에서 나타내는 바와 같이, 세포 부착 시험의 저해 효과 양식도 상이한 점에서, 이번에 제조한 항 α9 인테그린 항체 4 클론은 Y9A2 와는 에피토프가 상이하다고 생각된다.

정리

마우스 α9 인테그린의 기능을 저해하는 항체의 제조와 질환ㆍ병태에 있어서의 α9 인테그린의 기능을 해명하는 목적으로, 마우스 α9 인테그린에 대한 4 종의 모노클로널항체와 항 인간 α9 인테그린 항체를 4 종류 제조하였다. 이들 항체를 이용한 연구로 이하를 분명하게 할 수 있었다.

(1) 제조된 4 종의 항마우스 α9 인테그린 항체는, 모두 FACS 분석에 이용할 수 있고, 각각 상이한 세포 부착 저해능을 가졌다.

(2) 항마우스 α9 인테그린 항체 클론 12C4'58 이 면역 염색에 이용할 수 있는 것을 알 수 있었다.

(3) 매크로퍼지양 세포인 RAW264.7 세포, 멜라노마 세포인 B16-F1, B16-F10, B16-BL6 세포에서 α9 인테그린은 발현되고 있었다. 마우스 호중구에서는 α9 인테그린 발현이 관찰되지 않고, 인간에서 발현을 확인할 수 있던 점에서, 호중구 상의 α9 인테그린의 발현에는 종 사이에서 차이가 있는 것이 보였다. 비장세포의 B220^-CD3^-세포군이나 B220⁺CD3⁺세포군에 있어서, 일부 α9 인테그린을 발현시키는 세포군이 존재하였다. 또 간장 침윤 백혈구의 α9 인테그린 발현은, α4 인테그린 발현 세포 상에 많이 보였다.

(4) α9 와α4 인테그린이 동시에 존재하고, 양자가 인식되는 리간드가 존재하는 경우, 그 부착능는 상보적이었다.

(5) 항마우스 α9 인테그린 항체에 의해, 간염 치료 효과를 발견할 수 있고, 그 효과는 항마우스 α4 인테그린 항체에 의해 항진하였다.

(6) 건선유아세포 위에α9 인테그린이 발현되고 있는 것을 알 수 있고, 건선유아세포를 트롬빈 절단형 OPN 으로 자극하면, MMP-13 발현이 항진되는 것을 알 수 있었다. 그 MMP-13 항진은, 항 α9 인테그린 항체에 의해 저해되는 것을 알 수 있었다.

(7) B16-BL6 세포의 증식을 항 α9 인테그린 항체로 억제할 수 있는 것을 알 수 있었다. 또, VCAM-1 자극에 의한 세포 증식은, 항 α9 인테그린 항체와 항 α4 인테그린 항체를 동시에 병용 투여함으로써, 단독 투여와 비교하여, 증식 억제 효과가 항진되었다.

(8) 제조된 4 종의 항 인간 α9 인테그린 항체는, 모두 FACS 분석에 이용할 수 있고, 각각 상이한 세포 부착 저해능을 가졌다. 또, FACS 나 부착 저해 시험에 의해, 기존의 항 인간 α9 인테그린 항체 Y9A2 와 상이한 반응성을 보인 점에서, 에피토프가 상이한 것을 생각할 수 있었다.

본 발명의 모노클로널항체는, α9 인테그린 기능 억제에 의해, 암, 예를 들어 암 세포의 증식, 전이, 그리고 염증성 질환, 예를 들어 관절 류머티즘, 변형성 관절증, 간염, 기관지 천식, 섬유증, 당뇨병, 암 전이, 동맥 경화, 다발성 경화증, 육아종, 염증성 장질환 (궤양성 대장염, 크론병), 자가면역 질환 등에 대한 치료 효과를 나타낸다. 또, 본 발명의 항 α9 인테그린 항체와 항 α4 인테그린 항체의 양자를 함유하는 의약 조성물은, 더욱 개선된 암, 염증성 질환의 치료 효과를 나타낸다. 본 발명의 모노클로널항체는, 마우스 α9 인테그린도 인식하므로, 마우스를 이용한 동물 실험에 이용할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Gene Techno Science Co., Ltd <120> Anti alpha 9 integrin monoclonal antibody <130> PCT05-0103 <150> 2005-6348 <151> 2005-01-13 <160> 17 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1035 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Gly Pro Ala Ala Pro Arg Gly Ala Gly Arg Leu Arg Ala Leu 1 5 10 15 Leu Leu Ala Leu Val Val Ala Gly Ile Pro Ala Gly Ala Tyr Asn Leu 20 25 30 Asp Pro Gln Arg Pro Val His Phe Gln Gly Pro Ala Asp Ser Phe Phe 35 40 45 Gly Tyr Ala Val Leu Glu His Phe His Asp Asn Thr Arg Trp Val Leu 50 55 60 Val Gly Ala Pro Lys Ala Asp Ser Lys Tyr Ser Pro Ser Val Lys Ser 65 70 75 80 Pro Gly Ala Val Phe Lys Cys Arg Val His Thr Asn Pro Asp Arg Arg 85 90 95 Cys Thr Glu Leu Asp Met Ala Arg Gly Lys Asn Arg Gly Thr Ser Cys 100 105 110 Gly Lys Thr Cys Arg Glu Asp Arg Asp Asp Glu Trp Met Gly Val Ser 115 120 125 Leu Ala Arg Gln Pro Lys Ala Asp Gly Arg Val Leu Ala Cys Ala His 130 135 140 Arg Trp Lys Asn Ile Tyr Tyr Glu Ala Asp His Ile Leu Pro His Gly 145 150 155 160 Phe Cys 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15 Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg 5 <210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Gly Arg Gly Asp Ser 5 <210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Ala Glu Ile Asp Gly Ile Glu Leu 5

Claims (13)

1. 인간 α9 인테그린 및 마우스 α9 인테그린을 특이적으로 인식하는 모노클로널항체.
2. 제 1 항에 있어서,

   α9 인테그린과 α9 인테그린의 리간드의 결합을 저해하는 모노클로널항체.
3. 제 2 항에 있어서,

   α9 인테그린의 리간드가 오스테오폰틴 (osteopontin) 인 모노클로널항체.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

   수탁 번호 FERM ABP-10195, FERM ABP-10196, FERM ABP-10197, 또는 FERM ABP-10198 에 의해 표시되는 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 모노클로널항체.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로널항체를 생성하는 하이브리도마 세포.
6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로널항체를 함유하는 의약 조성물.
7. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로널항체 및 항 α4 인테그린 항체를 함유하는 의약 조성물.
8. 제 6 항 또는 7 항에 있어서,

   암, 염증성 질환, 자가 면역 질환의 예방 및/또는 치료제인 의약 조성물.
9. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로널항체를 함유하는 암, 염증성 질환, 자가 면역 질환의 진단제.
10. α9 인테그린을 과잉 발현하는 세포를 항원으로서 이용하는 것을 특징으로 하는 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로널항체의 제조 방법.
11. α9 인테그린을 과잉 발현하는 항원으로서 이용한 세포와는 다른 종류의 세포를 이용하는 것을 특징으로 하는 제 5 항에 기재된 하이브리도마 세포의 제조 방법.
12. α9 인테그린 결합성 기능 분자를 유효 성분으로서 함유하는 세포 및/또는 조직의 리모델링의 억제 및/또는 촉진제.
13. α9 인테그린 발현 세포 및/또는 조직과 α9 인테그린 결합성 기능 분자를 접촉시키는 것을 특징으로 하는 세포 및/또는 조직의 리모델링의 억제 및/또는 촉진 방법.

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