CN101103044A

CN101103044A - 抗α9整联蛋白抗体及其用途

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Publication number: CN101103044A
Application number: CNA2006800022521A
Authority: CN
Inventors: 黑泷大翼; 金山刚士; 今重之; 上出利光
Original assignee: Gene Techno Science Co Ltd
Current assignee: Kidswell Bio Corp
Priority date: 2005-01-13
Filing date: 2006-01-12
Publication date: 2008-01-09
Anticipated expiration: 2026-01-12
Also published as: EP1840135B1; EP1840135A4; US20080152653A1; JP4871740B2; CA2593777C; WO2006075784A1; EP1840135A1; TW200637575A; JPWO2006075784A1; KR20070115884A; TWI375565B; CA2593777A1; IN266863B; CN101103044B; US7595045B2; KR101316990B1

Abstract

本发明提供抗小鼠α9整联蛋白抗体、抗人α9整联蛋白抗体、产生上述抗体的杂交瘤细胞、上述抗体和杂交瘤细胞的制备方法、含有上述抗体的药物组合物等。本发明的抗α9整联蛋白抗体通过抑制α9整联蛋白功能，对于癌例如癌细胞的增殖、转移、炎症性疾病例如类风湿性关节炎、变形性关节炎、肝炎、支气管哮喘、纤维变性、糖尿病、动脉硬化、多发性硬化症、肉芽肿、炎症性肠疾病(溃疡性结肠炎、克罗恩病)、以及自身免疫性疾病等发挥治疗效果。

Description

抗α9整联蛋白抗体及其用途

技术领域

本发明涉及特异性识别人α9整联蛋白(integrin)和小鼠α9整联蛋白的单克隆抗体；产生上述单克隆抗体的杂交瘤细胞；含有上述单克隆抗体的药物组合物；含有上述单克隆抗体的诊断剂；上述单克隆抗体的制备方法；上述杂交瘤细胞的制备方法等。

背景技术

细胞通过被称为整联蛋白的一组细胞表面受体与胞外基质(extracellular matrix，以下简称为ECM)结合。整联蛋白通过形成α链和β链1∶1的异二聚体来发挥功能。目前至少鉴定了18种α链、8种β链和24种αβ异二聚体。已知各整联蛋白分别识别特异性的配体。按照与配体的特异性以及功能，整联蛋白被分类为亚家族(subfamily)，分成胶原受体、层粘连蛋白受体、识别纤连蛋白或玻连蛋白等中含有的Arg-Gly-Asp(RGD)序列的RGD受体、只存在于白细胞中的白血胞特异性受体(非专利文献1：Hynes RO.2002.Integrins：Bidirectional，Allosteric Signaling Machines.Cell 110：673-87；非专利文献2：Miyasaka M.2000.New edition of AdhesionMolecule handbook.Shujunsya)。α4和α9整联蛋白是不属于上述任何一种的亚家族，被称为α4整联蛋白亚家族(非专利文献3：Elise L.Palmer，Curzio Rfiegg，Ronald Ferrando，Robert Pytela，SheppardD.1993.Sequence and Tissue Distribution of the Integrin a9 Subunit，a Novel Partner of 131 That Is Widely Distributed in Epithelia andMuscle.The Journal of Cell Biology 123：1289-97)。而目前ECM只被认为是细胞间的填充物，不过，已经搞清楚整联蛋白介导的ECM与细胞的相互作用与细胞的增殖、粘附、运动等的调节有很大关系，与癌的进展或炎症的恶化等疾病的发病相关。

作为ECM一种的骨桥蛋白(osteopontin，以下简称为OPN)是分子量约为41kDa的分泌型酸性磷酸化糖蛋白，是在乳汁、尿、肾小管、破骨细胞、成骨细胞、巨噬细胞、活化T细胞、肿瘤组织等中可见广泛表达的分子。分子中央部具有细胞粘附序列GRGDS，在人类的OPN中具有SVVYGLR序列，在小鼠OPN中具有SLAYGLR序列，其后紧接着具有凝血酶切断位点，通过GRGDS序列与RGD整联蛋白粘附，通过SVVYGLR序列或SLAYGLR序列与α4(α4β1)和α9(α9β1)整联蛋白粘附。

还发现α4β1和α9β1有以下的方式差异：α4β1与未被凝血酶切断的OPN(非切断型OPN)和被凝血酶切断的N末端片段(切断型OPN)两者结合，α9β1只与切断型OPN结合(非专利文献4：Y.Yokosaki等人，(1999)The Journal of Biological Chemistry 274，36328-36334；非专利文献5：P.M.Green等人，(2001)FEBS Letters 503，75-79；非专利文献6：S.T.Barry等人，(2000)Experimental Cell Research258，342-351)。

α4和α9整联蛋白除OPN之外还有很多共通的配体。已知有纤连蛋白的EDA位点、前肽-血管性血友病因子(pp-vWF)、组织型转谷氨酰胺酶(tTG)、第XIII凝血因子以及血管细胞粘附分子-1(vascularcell adhesion molecule-1，VCAM-1)等。已知α4整联蛋白特异性识别的配体有纤连蛋白的CS-1结构域、MadCAM-1(α4β7)等。已知α9整联蛋白特异性识别的配体有腱生蛋白C、血纤蛋白溶酶等。

α9、α4和β1的整联蛋白亚单位的氨基酸序列是公知的。例如，在GenBank中，人α9登记为NM_002207、小鼠α9登记为NM_133721、人α4登记为NM_000885、小鼠α4登记为NM0_10576、人β1登记为X07979、小鼠β1登记为NM_010578。还已知这些整联蛋白种间的氨基酸序列间类似性高。

WO02/081522(专利文献1)中公开了使用OPN缺损小鼠或OPN中和抗体的OPN功能性抑制对于类风湿性关节炎或肝炎的治愈效果。该公报中公开了：在炎症性疾病发病中，α9整联蛋白、α4整联蛋白识别序列SVVYGLR序列是重要的，OPN的受体在免疫活性细胞等中表达，与炎症性疾病相关。

发明内容

目前，已知关于癌、炎症性疾病、自身免疫性疾病的治疗药有多种多样，但是人们仍希望开发出具有更好的治疗效果的癌、炎症性疾病、自身免疫性疾病的预防药和/或治疗药等。

本发明人着眼于整联蛋白，进行了各种研究，结果发现：α9整联蛋白的特异性抑制抗体具有癌抑制效果、抗炎症效果，从而完成了本发明。即，具体来说，本发明提供以下单克隆抗体、杂交瘤细胞、药物组合物等。

(1)单克隆抗体，该单克隆抗体特异性识别人α9整联蛋白和小鼠α9整联蛋白。

(2)上述(1)的单克隆抗体，该单克隆抗体抑制人和/或小鼠α9整联蛋白与α9整联蛋白的配体的结合。

(3)上述(2)的单克隆抗体，其中，α9整联蛋白的配体是骨桥蛋白。

(4)上述(1)～(3)中任一项的单克隆抗体，所述单克隆抗体由保藏编号FERM ABP-10195、FERM ABP-10196、FERM ABP-10197或FERM ABP-10198标示的杂交瘤细胞产生。

(5)杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞产生上述(1)～(4)中任一项的单克隆抗体。

(6)药物组合物，该药物组合物含有上述(1)～(4)中任一项的单克隆抗体。

(7)药物组合物，该药物组合物含有权利要求(1)～(4)中任一项的单克隆抗体和抗α4整联蛋白抗体两者。

(8)上述(6)或(7)的药物组合物，该药物组合物是炎症性疾病的预防和/或治疗剂。

(9)炎症性疾病的诊断剂，该诊断剂含有上述(1)～(4)中任一项的单克隆抗体。

(10)上述(1)～(4)中任一项的单克隆抗体的制备方法，其特征在于：使用过量表达α9整联蛋白的细胞作为抗原。

(11)上述(5)的杂交瘤细胞的制备方法，其特征在于，使用与作为过量表达α9整联蛋白的抗原使用的细胞不同种类的细胞。

(12)细胞和/或组织的重塑(リモデリング)的抑制和/或促进剂，该抑制和/或促进剂含有α9整联蛋白结合性功能分子(例如OPN、VCAM-1、腱生蛋白C、纤连蛋白、pp-vWF、tTG等)作为有效成分。

(13)细胞和/或组织重塑的抑制和/或促进方法，其特征在于，使α9整联蛋白表达细胞和/或组织(例如肿瘤细胞、嗜中性粒细胞、平滑肌等)与α9整联蛋白结合性功能分子(例如OPN、VCAM-1、腱生蛋白C、纤连蛋白、pp-vWF、tTG等)接触。

本发明的抗α9整联蛋白抗体通过抑制α9整联蛋白功能，可对癌例如癌细胞的增殖、转移；炎症性疾病例如类风湿性关节炎(リウマチ関節炎)、变形性关节症(変形性関節症)、肝炎、支气管哮喘、纤维变性(線維症)、糖尿病、动脉硬化、多发性硬化症、肉芽肿、炎症性肠病(溃疡性结肠炎、克罗恩病(クロ一ン病))以及自身免疫性疾病等发挥治疗效果。

含有本发明的抗α9整联蛋白抗体和抗α4整联蛋白抗体两者的药物组合物发挥更好的炎症性疾病治疗效果。本发明制备了小鼠α9整联蛋白、人α9整联蛋白各自的单克隆抗体。抗小鼠α9整联蛋白抗体可在动物实验中使用，抗人α9整联蛋白抗体可作为治疗药使用。

附图说明

图1是表示整联蛋白基因导入细胞中mRNA表达量的分析结果图。

图2是表示抗小鼠α9整联蛋白抗体的FACS分析结果图。

图3是通过抗小鼠α9整联蛋白抗体对正常组织进行染色的图像。

图4是免疫染色结果一览图。

图5是表示四个克隆的抗小鼠α9整联蛋白抗体的细胞粘附抑制效果图。

图6是抗小鼠α9整联蛋白抗体克隆的细胞粘附抑制效果的比较图。

图7是表示通过竞争抑制实验对抗体的表位分析结果图。

图8是α4和α9整联蛋白在小鼠黑素瘤细胞株中的表达分析结果图。

图9是α9整联蛋白在单核细胞系细胞株中的表达的分析结果图。

图10是表示小鼠嗜中性粒细胞的FACS分析结果图。

图11是表示小鼠肝脏浸润白细胞的FACS分析结果图。

图12是表示抗α4整联蛋白抗体和α9整联蛋白抗体的B16-BL6细胞粘附抑制效果图。

图13是表示抗α4整联蛋白抗体和抗α9整联蛋白抗体对肝炎的治疗效果图。

图14是表示腱成纤维细胞的α9整联蛋白表达的图。

图15是表示通过凝血酶切断型OPN增加腱成纤维细胞的MMP-13mRNA转录的图。

图16是表示通过抗α9整联蛋白抗体抑制来自腱成纤维细胞的MMP-13mRNA的转录的图。

图17是表示通过抗α9整联蛋白抗体抑制B16-BL6细胞的增殖的图。

图18是表示通过并用抗α9整联蛋白抗体和抗α4整联蛋白抗体抑制VCAM-1的刺激导致的B16-BL6细胞的增殖的图。

图19是表示抗人α9整联蛋白抗体的FACS分析结果图。

图20是抗人α9整联蛋白抗体四个克隆和Y9A2的细胞粘附抑制效果图。

具体实施方式

作为抗整联蛋白抗体，α4整联蛋白的中和抗体已经进入临床实验阶段。例如2004年7月，美国食品药品管理局(FDA)受理了BiogenIdec Inc(美国麻萨诸塞州)和Elan Corporation(爱尔兰)的多发性硬化症治疗药Tysabri(注册商标)(那他珠单抗(natalizumab))的认证申请，Tysabri(注册商标)被指定为优先审查对象。Tysabri(注册商标)还以克罗恩病、类风湿性关节炎等疾病为对象。另外，被称作P4C2的抗人α4β1整联蛋白单克隆抗体已在实验室水平使用。

但是，作为α9整联蛋白抗体，以人α9整联蛋白为抗原、对人和豚鼠的α9整联蛋白显示特异性的被称为Y9A2的中和抗体(A.Wang等人，(1996)Am.J.Respir.，Cell.Mol.Biol.15，664-672)虽然在实验室水平使用，但并未在临床中应用。

另一方面，在将抗人α9整联蛋白抗体作为对人使用的药物时，在开发阶段不能直接施与人，不能确认其结果。即，为了确认效果，必须进行动物实验，如果该效果得到确认，才可以制作成人源化抗体(ヒト化抗体)等。小鼠有很多是遗传背景明确的系统，还具有世代间隔短的特征。并且已知小鼠可以观察到与人的疾病大致相同的疾病，因此适合作为实验动物。但是与小鼠α9整联蛋白显示交叉反应的中和抗体目前尚未有报告。

本发明中，通过小心地进行以下四个步骤，可以获得分别与人、小鼠的α9整联蛋白特异性反应的抑制抗体。

(1)α9整联蛋白过量表达株的制备

基因表达细胞的筛选通常是在蛋白质水平或基因水平进行，但这里是通过利用作为α9整联蛋白的功能的细胞粘附功能进行筛选，由此建立分别在细胞膜上过量表达人或小鼠α9整联蛋白的细胞株。

人或小鼠α9整联蛋白表达细胞可应用于分别对小鼠或仓鼠进行的免疫。

(2)细胞的选择

为了制备小鼠α9整联蛋白的抗体，考虑对金黄仓鼠进行免疫。为此，向来自仓鼠卵巢的细胞CHO-K1细胞导入小鼠α9整联蛋白基因，在仓鼠内构建只使主要抗小鼠α9整联蛋白的抗体的抗体效价(抗体価)增加的实验体系。

人α9整联蛋白的抗体是向CHO-K1细胞中导入人α9整联蛋白的基因，在小鼠内构建使人α9整联蛋白抗体增加的实验体系。

(3)产生抗小鼠α9整联蛋白抗体的杂交瘤的筛选

为了有效地从各种杂交瘤中获得只与小鼠α9整联蛋白反应的克隆，筛选中使用在与免疫的细胞的母细胞(CHO-K1)不同的细胞(NIH3T3)中表达α9整联蛋白的细胞。进一步使用在NIH3T3细胞中表达与α9整联蛋白同样属于整联蛋白家族的小鼠α4整联蛋白的细胞，通过选择与α9整联蛋白以外的整联蛋白不显示交叉反应性的克隆，有效地得到了与小鼠α9整联蛋白特异性反应的抗体。

(4)产生抗人α9整联蛋白抗体的杂交瘤的筛选

为了从各种杂交瘤中有效地获得只与人α9整联蛋白反应的克隆，选择与基因导入CHO-K1反应、不与CHO-K1细胞反应的克隆。另外，通过确认不与导入人α4整联蛋白基因的CHO-K1细胞反应，得到了与人α9整联蛋白特异性反应的抑制抗体。

[α9整联蛋白的单克隆抗体]

本发明提供α9整联蛋白的单克隆抗体。本发明中，“抗体”是指可与作为抗原的α9整联蛋白或其部分肽结合的抗体分子整体或其片段(例如Fab或(Fab’)₂片段)，可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体。本发明中，优选指单克隆抗体。本发明中，“抗体”包含人抗体、人源化抗体(ヒト型化抗体)、嵌合抗体。

上述“人源化抗体(ヒト型化抗体)”是指将来自小鼠等人以外的种的抗体进行改变，将H链和L链的互补决定区以外的一级结构用人的抗体所对应的一级结构替代所得的抗体。另外，“嵌合抗体”是指具有来自不同种抗体的Fab区和Fc区的抗体。

本发明中，“抗体片段”是指抗体总长的一部分，通常为抗原结合区或可变区。例如，抗体片段包含Fab、Fab’、F(ab’)₂和Fv片段。抗体通过木瓜蛋白酶消化，可以生成被称为Fab片段的各具有一个抗原结合部位的两个相同的抗原结合片段、以及其余的因容易结晶而被称为“Fc”的片段。还可以通过胃蛋白酶消化而得到具有两个抗原结合部位、可与抗原交叉结合的F(ab’)₂片段、以及余下的另一片段(被称为pFc’)。

这里，“Fv”片段是最小的抗体片段，包含完全的抗原识别部位和结合部位。该区域是一条重链和轻链的可变结构域通过非共价键紧密连接的二聚体(V_H-V_L二聚体)。各可变结构域的三个CDR相互作用，在V_H-V_L二聚体的表面形成抗原结合部位。六个CDR使抗体具有抗原结合部位。但是，即使是一个可变结构域(或者只含有抗原特异性的三个CDR的半个Fv)，虽然比全部结合部位的亲和性低，但仍具有识别抗原并结合的能力。

Fab片段(也称为F(ab))还包含轻链的恒定结构域、和重链的细胞的恒定结构域(CH1)。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于：Fab’片段附加有多个残基，所述多个残基来自包含抗体铰链区的1个或者1个以上半胱氨酸的重链CH1结构域的羧基末端。

本发明的“单克隆抗体”是指实质上均质的抗体集团，即，构成集团的各个抗体是从除了天然发生的、少量存在的突变体以外为均一的抗体集团得到的抗体。单克隆抗体具有高度特异性，对单一的抗原部位发生作用。并且，与包含相对于不同表位的不同抗体的多克隆抗体相比，各单克隆抗体只面向抗原上的单一表位。除其特异性之外，单克隆抗体可通过不混杂其它免疫球蛋白的杂交瘤培养进行合成，这是有利的。“单克隆”的修饰语显示了由实质上均一的抗体集团得到的抗体的特性，但抗体并不限于通过特定的方法制备。

以下对抗α9整联蛋白单克隆抗体的制备进行详细描述，但该抗体的制备并不限于此。

[α9整联蛋白(抗原)]

本发明中作为抗原使用的α9整联蛋白可以是(1)来自表达人或其它哺乳动物的α9整联蛋白的所有细胞、或者是存在这些细胞的所有组织的蛋白质、(2)将编码α9整联蛋白的基因DNA、优选cDNA导入细菌、酵母、动物细胞等细胞株并使其表达的重组蛋白，还可以是(3)合成蛋白质。

本发明的α9整联蛋白也包括具有与各种哺乳动物的α9整联蛋白的氨基酸序列、特别优选人α9整联蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)基本上相同的氨基酸序列的多肽。

这里，“具有基本上相同的氨基酸序列的多肽”只要是与天然型的α9整联蛋白、特别优选来自人的α9整联蛋白基本上具有同等的生物学性质，是指具有该氨基酸序列中的多个氨基酸、优选1-10个氨基酸、特别优选1～数个(例如1～5个)氨基酸发生取代、缺失和/或修饰的氨基酸序列的突变多肽；以及具有在该天然型的α9整联蛋白、特别优选来自人的α9整联蛋白的氨基酸序列中附加了多个氨基酸、优选1～10个氨基酸，特别优选1～数个(例如1～5个)氨基酸的氨基酸序列的突变多肽。还可以是具有多个上述取代、缺失、修饰和附加的突变多肽。

本发明的α9整联蛋白、特别是来自人的α9整联蛋白除基因重组技术之外，还可以通过采用化学合成法、细胞培养方法等本技术领域公知的方法或其改造方法制备。

突变多肽的制备方法例如有：合成寡核苷酸定点诱变法(缺口双链体法，gapped duplex法)、通过亚硝酸或亚硫酸处理而随机导入点突变的方法、通过Ba131酶等制备缺失突变体的方法、盒式诱变法、接头分区法(リンカ一スキヤニング法)、miss incorporation法、错配引物(mismatch primer)法、DNA片段合成法等。

本发明的α9整联蛋白也包括该α9整联蛋白的“一部分”。这里，“一部分”是包含与α9整联蛋白的配体、例如OPN或VCAM-1、腱生蛋白-C等结合所必需的区的部分。具体来说，是指包含SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列的14-980号、SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的11-981号的部分。该α9整联蛋白的“一部分”可按照后述的本技术领域公知的方法或其改造的方法，通过基因重组技术或化学合成法制备，还可通过蛋白质分解酶等将由细胞培养法分离的α9整联蛋白、特别优选来自人的α9整联蛋白适当切断来制备。

作为抗原，还可以使用通过重组技术使α9整联蛋白在细胞膜上过量表达的细胞本身、或者其膜级分(膜画分)等。

本发明的α9整联蛋白也包括具有与人α9整联蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)基本上相同的氨基酸序列的多肽。作为具有与SEQID NO：1表示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的多肽具体可列举：具有SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的小鼠α9整联蛋白。本发明中，考虑将小鼠作为疾病模型动物，因此优选使用来自小鼠的α9整联蛋白作为本发明的抗原。在本发明中，特别是，优选使用通过重组技术使α9整联蛋白在细胞膜上过量表达的细胞本身。因此，如后所述，可以使用公知的基因工程技术克隆编码α9整联蛋白的基因(例如cDNA)，将α9整联蛋白在细胞膜上过量表达的细胞本身、或者其细胞膜级分作为抗原。

[抗体产生细胞的制备]

抗原是施与要被免疫的动物，将抗原本身或与载体、稀释剂一起施与通过施与可产生抗体的部位。施与时，为了提高抗体产生能力，可以施与完全氟氏佐剂或不完全氟氏佐剂。施与通常是每隔1～6周一次，共进行2～10次左右。所使用的温血动物例如有小鼠、猴、兔、狗、豚鼠、大鼠、仓鼠、绵羊、山羊、鸡等，本发明中优选使用仓鼠。

治疗对象为人，OPN抑制抗体产生动物为小鼠时，优选使用人小鼠嵌合抗体或人源化抗体(ヒト化抗体)，进一步优选使用导入了与抗体产生相关的人基因的小鼠等转基因动物制备人型单克隆抗体(ヒト型モノクロ一ナル抗体)，并使用。

[抗体产生细胞和骨髓瘤细胞的细胞融合]

骨髓瘤细胞使用来自小鼠、大鼠、人等的细胞。例如可列举小鼠骨髓瘤P3U1、P3X63-Ag8、P3X63-Ag8-U1、P3NS1-Ag4、SP2/0-Ag1 4、P3X63-Ag8-653等，优选抗体产生细胞与骨髓瘤细胞来自同种动物、特别是来自同系(同系統)的动物。骨髓瘤细胞可以冷冻保存，或者在添加了马、兔或胎牛血清的常规培养基中继代维持。细胞融合优选使用对数增殖期的细胞。本发明中适合使用P3X63-Ag8-653。

使抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合、形成杂交瘤的方法可列举：使用聚乙二醇(PEG)的方法、使用仙台病毒的方法、使用电融合装置的方法等。例如为PEG法时，在含有约30-60％PEG(平均分子量1000-6000)的适当的培养基或缓冲液中，以1～10∶1、优选5～10∶1的混合比悬浮脾细胞和骨髓瘤细胞，在温度约为25～37℃、pH为6～8的条件下反应约30秒～3分钟左右即可。反应终止后，除去PEG溶液，再悬浮于培养基中，接种于细胞孔板(cell-well plate)中继续培养。

[杂交瘤细胞的筛选]

产生单克隆抗体的杂交瘤细胞的筛选可按照公知或与其近似的方法进行。通常可用添加了HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)的动物细胞用培养基进行。筛选和育种用培养基只要是杂交瘤细胞可生长的培养基，可以使用任何培养基。例如可以使用含有1～20％、优选10～20％胎牛血清的RPMI 1640培养基；含有1～10％胎牛血清的GIT培养基(和光纯药工业(株))或杂交瘤培养用无血清培养基(SFM-101，日水制药(株))等。培养温度通常为20～40C，优选为约37℃。培养时间通常为5天～3周，优选1周～2周。培养通常可在5％CO₂下进行。

本发明的单克隆抗体的产生可使用新临床免疫实验操作法(Part3)、科学评论社、1997中记载的细胞ELISA法进行确认和筛选。预想到将用于免疫的细胞用于筛选，背景增高或假阳性变多的情况，可以将与在和用于免疫的细胞不同的另外的细胞中过量表达的α9整联蛋白反应，且与过量表达α4整联蛋白的细胞不反应的克隆作为抗α9整联蛋白抗体。重复1～5次、优选2～4次有限稀释法(限界希釈法)，可由这样的克隆制备单克隆抗体。

[抗体的分离纯化]

所得抗体可以纯化至均一。抗体的分离、纯化可以使用通常的蛋白质所使用的分离、纯化方法。例如可以适当选择、组合亲和色谱等的色谱柱、过滤、超滤、盐析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电位电泳等分离、纯化抗体(Antibodies：A Laboratory Manual.EdHarlow and David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)，但并不限于此。亲和色谱中使用的柱子可列举蛋白A柱、蛋白G柱。例如作为蛋白A柱使用的柱有Hyper D、POROS、Sepharose F.E.(Amersham Biosciences)等。

[抗体的标记]

使用公知的方法或市售的试剂盒，可以对所得抗体进行各种标记(例如生物素标记、FITC标记、APC标记)。本发明中，优选采用使用生物素标记试剂盒(Biotin Labeling Kit，同仁化学)的生物素标记。

[含有本发明的单克隆抗体的药物组合物]

本发明提供含有上述单克隆抗体的药物组合物。含有本发明的单克隆抗体作为有效成分的药物组合物可用作癌例如癌细胞的增殖、转移，炎症性疾病例如类风湿性关节炎、变形性关节炎、肝炎、支气管哮喘、纤维变性、糖尿病、动脉硬化、多发性硬化症、肉芽肿、炎症性肠病(溃疡性结肠炎、克罗恩病)以及自身免疫性疾病等的预防和/或治疗剂。

含有本发明的单克隆抗体而成的药物组合物还可用于器官移植后的慢性排斥反应的抑制、全身性自身免疫性疾病·红斑狼疮·葡萄膜炎·贝切特病(ベ一チエト病)、多发性肌炎(多発性筋炎)、肾小球增殖性肾炎(糸状体增殖性腎炎)、结节病等自身免疫性疾病的治疗。

含有本发明的抗体的上述疾病的预防和/或治疗剂毒性低，配合在适当的溶剂中制成液体制剂，或者制成适当剂型的药物组合物，可以口服或非口服地施与人或哺乳动物(例如大鼠、兔、羊、猪、牛、猫、狗、猴等)。施与量根据施与对象、对象疾病、症状、给药途径等而不同，例如用于成人的类风湿性关节炎患者的预防和/或治疗时，可以是通常按照一次剂量为0.01-20mg/kg体重左右、优选0.1-10mg/kg体重左右、进一步优选0.1-5mg/kg体重左右，每天1-5次、优选每天1-3次左右，通过静脉注射施与本发明的抗体。其它的非口服施与和口服施与的情形也可以根据该量给药。症状特别严重时，可以根据其症状进行增量。

本发明的抗体可以以其本身或适当的药物组合物的形式给药。上述给药中所使用的药物组合物包含上述抗体或其盐和药理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。所述组合物可以以适合口服或非口服的剂型提供。

即，例如作为适合口服的组合物，可以是固体或液体的剂型，具体可列举片剂(包括糖衣片、薄膜包衣片)、丸剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂(包括软胶囊剂)、糖浆剂、乳剂、混悬剂等。上述组合物可通过公知的方法制备，含有制剂领域中通常使用的载体、稀释剂或赋形剂。例如，作为片剂用的载体、赋形剂，可以使用乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸镁等。

作为用于非口服的组合物，例如可使用注射剂、栓剂等。注射剂包括静脉注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂、肌肉注射剂、输液注射剂等剂型。所述注射剂可按照公知的方法，例如将上述抗体或其盐溶解、悬浮或乳化于通常注射剂所使用的无菌水性或油性液中来制备。注射用的水性液例如使用生理食盐水、含有葡萄糖或其它辅助剂的等渗液等，还可以并用适当的溶解助剂例如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物(adduct))]等。油性液例如可使用芝麻油、大豆油等，可以并用苯甲酸苄酯、苄醇等作为溶解助剂。所制备的注射液通常填充在适当的安瓿瓶中。在直肠给药的栓剂中，可通过将上述抗体或其盐与通常的栓剂用基质混合而制备。

上述口服或非口服用药物组合物优选制备成适合活性成分给药量的给药单位的剂型。作为这种给药单位的剂型，可列举片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂(安瓿瓶)、栓剂等，每个给药单位剂型通常分别含有5-500mg、注射剂为5-100mg、其它剂型中优选10-250mg的上述抗体。

上述各组合物只要不因与上述抗体配合而发生不希望的相互作用即可含有其它活性成分。

本发明涉及含有α9整联蛋白结合性功能分子(例如OPN、VCAM-1、腱生蛋白C、纤连蛋白、pp-vWF、tTG等)作为有效成分的细胞和/或组织重塑的抑制和/或促进剂；以及以使α9整联蛋白表达细胞和/或组织(例如肿瘤细胞、嗜中性粒细胞、平滑肌等)与α9整联蛋白结合性功能分子接触为特征的细胞和/或组织重塑的抑制和/或促进方法。上述治疗剂有效成分的施与量、施与方法、制剂等可参照上述含有抗体的药物中的记载适当确定。

[含有本发明的单克隆抗体的诊断剂]

含有本发明的单克隆抗体的药物组合物可作为癌例如癌细胞的增殖、转移；炎症性疾病例如类风湿性关节炎、变形性关节炎、肝炎、支气管哮喘、纤维变性、糖尿病、癌转移、动脉硬化、多发性硬化症、肉芽肿等的诊断剂，还可以作为器官移植后慢性排斥反应抑制、全身性自身免疫性疾病·红斑狼疮·葡萄膜炎·贝切特病、多发性肌炎、肾小球增殖性肾炎·结节病等自身免疫性疾病的诊断剂使用。本发明的单克隆抗体可特异性识别α9整联蛋白，因此可用于被检液中的α9整联蛋白的定量、特别是利用夹层免疫测定法(サンドイツチ免疫测定法)、竞争法(競合法)、免疫法(イムノメトリツク法)或ネフロメトリ一法等进行的定量、免疫染色等中。将上述各种免疫学测定方法应用于本发明的测定方法时，无需设定特别的条件、操作等。可以在各方法的常规条件、操作方法基础上加入技术人员的通常的技术性考虑，构建测定系统。这些常规技术方法的详细内容可以参照综述、现有书籍(成書)等。

如上所述，通过使用本发明的抗体，可以灵敏度良好地对α9整联蛋白进行定量。并且，通过利用使用本发明的抗体在生物体内进行的α9整联蛋白的定量方法，可以诊断与α9整联蛋白相关的各种疾病。例如，检测出α9整联蛋白的表达量的增减时，可以诊断为与α9整联蛋白相关的疾病、例如癌或炎症性疾病的可能性高或将来罹患该疾病的可能性高。本发明的单克隆抗体可用于特异性检测存在于体液或组织等被检物中的α9整联蛋白。还可用于制备纯化α9整联蛋白时使用的抗体柱、以及纯化时各组分中所含的α9整联蛋白的检测、被检细胞内α9整联蛋白的行为(拳動)的分析等。

实施例

以下给出实施例，进一步详细说明本发明，但这并不限定本发明的范围。

实施例1

[小鼠α9、α4整联蛋白cDNA的克隆]

α4整联蛋白基因是由小鼠12.5天的胚胎、α9整联蛋白是由B16-BL6细胞(小鼠黑素瘤细胞)的总RNA中使用随机引物进行反转录，以所得cDNA为模板，通过PCR法进行克隆。克隆所使用的引物如下所示。

mα4Integin-5′：5′-CGTGGATCCGAGCGCATGGCTGCGGAAGCGAGGTGC-3′(SEQ IDNO：3)

mα4Integin-3′：5′-CAGCTCGAGTCAGTCATCATTGCTTTTGCTGTTGAC-3′(SEQ IDNO：4)

mα9Integin-5′：5′-GTCAAGCTTCTGGGGATGGGCGGCCCGGCTGGGCTG-3′(SEQ IDNO：5)

mα9Integin-3′：5′-CGGTCTAGACACGGTGGGTCACTGGTTTTTCTGGAC-3′(SEQ IDNO：6)

PCR是制备组成：模板cDNA 5μL、GC缓冲液I 25μL、dNTPmix 5μL、10μM引物1 1μL、10μM引物2 1μL、DW 10.5μL、LA Taq(TaKaRa LA Taq(注册商标))0.5μL的反应体系，在94℃2分钟→(94℃30秒→68℃3分钟、30个循环)→4℃的反应条件下，通过热循环仪(GeneAmp(注册商标)PCR System 2700(アプライドバイオシステムズ)进行反应。反应后，通过1％琼脂糖凝胶电泳，为α4整联蛋白时分离3 kb附近的条带，为α9整联蛋白时分离3 kb附近的条带，然后从凝胶中切出，使用QIA quick(注册商标)凝胶回收试剂盒(Gel Extraction Kit)(QIAGEN)纯化PCR扩增产物。

[人α9、α4整联蛋白cDNA的克隆]

α4整联蛋白基因是从人嗜中性粒细胞，α9整联蛋白是从人末梢单核细胞提取总RNA，使用随机引物进行反转录，将所得cDNA作为模板，通过PCR法克隆的。克隆所使用的引物如下所示。

hα4Integin-5′：5′-ACGCTCGAGTGTACCATGTTCCCCACCGAGAGCGCA-3′(SEQ IDNO：11)

hα4Integin-3′：5′-TCATCTAGATTAATCATCATTGCTTTTACT-3′(SEQ ID NO：12)

hα9Integin-5′：5′-TCGAAGCTTCTGGGGATGGGCGGCCCGGCT-3′(SEQ ID NO：13)

hα9Integin-3′：5′-ACCTCTAGATCACTGGTTTTTCTGGACCCA-3′(SEQ ID NO：14)

如上所述，将通过PCR法扩增的α4整联蛋白和α9整联蛋白的cDNA分别整合到pCRII-TOPO(注册商标)载体(Invitrogen)中，通过ABI PRISM(注册商标)310(アプライドバイオシステムズ)确认各碱基序列。所得cDNA的碱基序列分别与SEQ ID NO：7(小鼠α9)和SEQ ID NO：8(小鼠α4)、SEQ ID NO：9(人α9)和SEQ ID NO：10(人α4)的碱基序列一致。为了将这些cDNA导入动物细胞，整合到pcDNA^TM3.1(+)(Invitrogen)中。将所得的载体分别命名为小鼠α9整联蛋白/pcDNA3.1、小鼠α4整联蛋白/pcDNA3.1、人α9整联蛋白/pcDNA3.1、人α4整联蛋白/pcDNA3.1。

实施例2

[α9整联蛋白、α4整联蛋白恒定表达细胞株的构建]

为了对仓鼠进行免疫，向来自仓鼠卵巢的细胞株CHO-K1细胞中导入含有α4整联蛋白cDNA的小鼠α4整联蛋白/pcDNA3.1、或者含有小鼠α9整联蛋白cDNA的α9整联蛋白/pcDNA3.1，通过利用与OPN的SVVYGLR肽的粘附效果的筛选，构建恒定表达小鼠α9整联蛋白的CHO-K1细胞(小鼠α9/CHO-K1细胞)的三个克隆(6F1、12C3、4N2)、NIH3T3细胞(小鼠α9/NIH3T3细胞)的四个克隆(21H、7A3、11C3、21D3)。

作为小鼠α9整联蛋白的对照，将同属整联蛋白亚家族的α4整联蛋白从小鼠12.5天的胚胎克隆，构建恒定表达小鼠α4整联蛋白的NIH3T3细胞(小鼠α4/NIH3T3细胞)的三个克隆(3G1、4A10、19F2)。

为了对构建的小鼠α9整联蛋白表达细胞的α9整联蛋白表达量进行定量分析，使用由α9/NIH3T3细胞、α9/CHO-K1细胞提取的cDNA进行实时PCR。结果，如图1A和图1B所示，在α9/NIH3T3细胞中21D3、在α9/CHO-K1细胞中12C3显示最高的α9整联蛋白表达。另外，通过FACS，对α4/NIH3T3细胞进行蛋白质表达量分析，结果如图1C所示。在4A10中可见最高的小鼠α4整联蛋白表达升高。

按照同样的方法，构建恒定表达人α9整联蛋白的CHO-K1细胞(人α9/CHO-K1细胞)的一个克隆(20J1)、恒定表达人α4整联蛋白的CHO-K1细胞(人α4/CHO-K1细胞)的一个克隆(9A5)。

实施例3

[使用抗α9整联蛋白抗体进行的FACS分析]

使用小鼠α9/CHO-K1细胞本身作为抗原，对3只金黄仓鼠(7-8周龄、雌性)以1×10⁷细胞/次/只共免疫5次。取出脾细胞，通过PEG法与小鼠骨髓瘤细胞X63-Ag8-653进行细胞融合，在HAT培养基上进行选择。单克隆抗体的产生通过细胞ELISA法进行筛选。将在免疫中使用的细胞用于筛选，预想其背景增高或假阳性变多，因此将与小鼠α9/NIH3T3细胞反应且与小鼠α4/NIH3T3细胞不反应的克隆作为抗α9整联蛋白抗体。通过将有限稀释法重复2次，构建单克隆抗体。结果，构建了产生抗小鼠α9整联蛋白抗体的杂交瘤细胞的四个克隆(11L2B、12C4’58、18R18D、55A2C)。

人α9整联蛋白的抗体的制备是参考消减免疫(subtractiveimmunization)法(Williams CV，Stechmann CL，Mcloon SC.Biotechniques.(1992)12：842-7.)，对3只BALB/c小鼠进行免疫。首先，以4×10⁶细胞/只腹腔内施与CHO-K1细胞，第二天和第三天以4 mg/只腹腔内施与环磷酰胺。施与环磷酰胺两周后，以2×10⁶细胞/只腹腔内施与人α9/CHO-K1细胞，再过两周后，以3×10⁶细胞/只腹腔内施与人α9/CHO-K1细胞。以与人α9/CHO-K1细胞反应、且不与人α4/CHO-K1细胞反应的克隆作为抗α9整联蛋白抗体。结果，构建了产生抗人α9整联蛋白抗体的杂交瘤细胞的四个克隆(1K11、21C5、24I11、25B6)。

这里所得的产生抗小鼠α9整联蛋白抗体的杂交瘤细胞11L2B于2004年12月28日保藏在日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)、独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏编号为FERM ABP-10197。

这里所得的杂交瘤细胞12C4’58于2004年12月28日保藏在日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)、独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏编号为FERM ABP-10196。

这里所得的杂交瘤细胞18R18D于2004年12月28日保藏在日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)、独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏编号为FERM ABP-10195。

这里所得的杂交瘤细胞55A2C于2004年12月28日保藏在日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)、独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏编号为FERM ABP-10198。

抗小鼠α9整联蛋白抗体是否可用于FACS，这使用小鼠α9/NIH3T3细胞、小鼠α4/NIH3T3细胞进行了研究。均以细胞数为1.0×10⁵个进行，与抗体的反应在冰上进行。另外，为了阻断与Fc受体的非特异性反应，在添加抗FcγRII抗体(2.4G2)后添加第一抗体。向经2.4G2处理的α9/NIH3T3细胞、α4/NIH3T3细胞或表达内源性α9整联蛋白的小鼠黑素瘤细胞株B16-BL6细胞中添加50μL制备的抗体(5μg/ml)作为第一抗体，反应30分钟。接着添加50μL经FITC标记的抗仓鼠IgG抗体，反应30分钟，然后过尼龙网(nylon mesh)后，用FACSCalibur^TM(ベクトンアンドデイツキンソン)进行FACS分析。使用生物素化抗体时，为了封闭Fc受体向进行了2.4G2处理的细胞中添加50μL生物素化抗体(5μg/ml)，反应30分钟，然后添加50μL经APC标记或FITC标记的链霉亲和素(ストレプトアビジン)，进行FACS分析。

结果如图2所示，用所有的抗小鼠α9整联蛋白抗体均可检测出小鼠α9/NIH3T3细胞和B16-BL6细胞上的α9整联蛋白。另外，所有的抗体均不与小鼠α4/NIH3T3细胞反应。由上述结果可知，所有的抗小鼠α9整联蛋白抗体均可通过FACS检测出在细胞上表达的小鼠α9整联蛋白蛋白质。

实施例4

[细胞染色的研究]

为了进行免疫组织化学，由小鼠摘除各种生物体组织，用O.C.T.复合物(O.C.T.compound)(テイシユ一テツク)包埋，用液氮冷冻后，然后用冷切片刀(コ一ルドト一ム)(サクラ)切成5μm厚。将切薄的组织风干一昼夜，然后用-20℃的丙酮固定，用正常山羊血清进行非特异性反应的阻断。接着，以抗α9整联蛋白抗体克隆12C4’58分别作为第一抗体，以2μg/ml的浓度在室温下反应1小时，添加用PBS稀释500倍的生物素化山羊抗金黄仓鼠IgG抗体(ジヤクソン)作为第二抗体，在室温下反应30分钟。使用vector stain ABC kit(ベクタ一ラボラトリ一)，在室温下反应30分钟，然后在室温下用DAB+底物试剂盒(DAB+基質キツト)(ダコ)反应1-5分钟左右，进行检测。组织在其后通过苏木精(和光)进行核染色，用盖玻片和包埋剂封固。小鼠脑、肝脏、肺、肌肉的染色图像如图3所示。如染色图像一览(图4)所示，在脑的脉络丛、肺的血管内皮·平滑肌·肺泡巨噬细胞、肝脏的窦状隙细胞(類洞細胞)、肾脏的血管内皮·平滑肌·肾小球、胃的平滑肌·粘膜肌层(粘膜筋板)、肌肉的血管内皮·肌成纤维细胞·淋巴管以及子宫血管内皮·平滑肌·动脉平滑肌等细胞中可见α9整联蛋白表达。由本结果可知，本发明所发现的抗α9整联蛋白抗体可应用于免疫染色，有望作为诊断药使用。

实施例5

[细胞粘附抑制效果的研究]

为了调查所构建的四种抗小鼠α9整联蛋白抗体是否具有细胞粘附抑制活性，使用GRGDS、腱生蛋白C、SVVYGLR肽和小鼠α9/NIH3T3细胞进行细胞粘附抑制实验。GRGDS肽中所含的RGD序列是在很多ECM中共同存在的细胞粘附部位。腱生蛋白C的细胞粘附部位AEIDGIEL肽可以与α9整联蛋白粘附，但是不能与α4整联蛋白粘附。人OPN的SVVYGLR肽可以与α4、α9整联蛋白粘附。研究各抗α9整联蛋白抗体在这三种肽固相与小鼠α9/NIH3T3细胞的细胞粘附中的抑制粘附的能力。

将OPN细胞粘附区SVVYGLR序列(SEQ ID NO：15)、GRGDS序列(SEQ ID NO：16)、腱生蛋白C的AEIDGIEL序列(SEQ ID NO：17)固定(10μg/ml、50μL/孔)，在用封闭液(0.5％BSA/PBS)封闭的ELISA板中添加在DMEM/0.25％BSA培养基中预先与抗体反应的α9/NIH3T3细胞(1.0×10⁵个/ml)。在37℃培养1小时，用PBS洗涤未粘附细胞，粘附细胞用0.5％结晶紫/20％甲醇固定并染色，在室温下放置30分钟，添加20％乙酸溶液进行转溶解，粘附活性通过测定波长590nm的OD来定量。

其结果如图5所示，对于GRGDS肽的固相，α9整联蛋白的粘附是RGD非依赖性的，因此所有的抗α9整联蛋白抗体均未能抑制。将腱生蛋白-C功能部位AEIDGIEL肽和OPN功能部位SVVYGLR肽固定在固相时，在11L2B、12C4’58、55A2C三种中可见显著的细胞粘附抑制。18R18D几乎不显示抑制能力。

下面，对在图5中见到抑制效果的11L2B、12C4’58、55A2C这三种的抑制效果进行比较。以5μg/ml将AEIDGIEL肽和SVVYGLR肽的固相进行固定，通过细胞粘附抑制实验对抑制抗体的浓度进行比较研究。如图6所示，55A2C的抑制能力最高。50％抑制浓度(IC50)也示于图6。

实施例6

[通过竞争抑制实验进行表位分析]

通过实施例5的细胞粘附抑制实验，可以得到各抗α9整联蛋白抗体的抑制活性有差异的结论。这显示，这些抗体识别α9整联蛋白上各不相同的表位。因此，进行抗体的生物素化，通过竞争抑制实验进行表位分析。作为生物素化抗体，使用12C4’58和18R18D，研究该两个克隆与全部克隆的表位的差异。如图7所示，两种抗体在利用同一克隆的竞争中，生物素化抗体的结合完全受到抑制。使用生物素化18R18D时，所有克隆都不能抑制。而对于12C4’58，被55A2C部分抑制，这显示12C4’58和55A2C中部分表位重叠。

实施例7

[培养细胞株中α9整联蛋白的表达分析]

为了研究培养细胞上α9整联蛋白的表达，采用小鼠黑素瘤培养细胞B16-F1和B16-F10、B16-BL6进行FACS分析。结果如图8所示，在B16-F1、B16-F10、B16-BL6全部细胞中均可以确认α9整联蛋白的表达。

另外，在人外周血单核细胞中可见低水平的表达，因此对小鼠骨髓单核细胞性白血病细胞WEHI-3B细胞和类巨噬细胞(マクロフア一ジ檬細胞)RAW264.7细胞进行FACS分析。如图9所示，在WEHI-3B细胞中未检测出表达，但在RAW264.7细胞中可见强表达。

实施例8

[嗜中性粒细胞中的α9整联蛋白表达分析]

已有报告指出α9整联蛋白在人嗜中性粒细胞中高表达。因此，为了分析小鼠嗜中性粒细胞中的α9整联蛋白的表达，回收巯基乙酸(チオグチコレ一ト)诱导腹腔细胞，将其用于小鼠嗜中性粒细胞的表达分析。以Mac-1⁺Gr-1⁺细胞作为嗜中性粒细胞，对该细胞群的α9整联蛋白的表达进行FACS分析。如图10所示，在C57BL/6、BALB/c、CBA、C3H整个系统的小鼠中均未见到α9整联蛋白的表达。由该结果可知，在小鼠嗜中性粒细胞上通常α9整联蛋白不表达。

实施例9

[α4整联蛋白和α9整联蛋白的表达方式的分析]

α4整联蛋白和α9整联蛋白同属于整联蛋白亚家族，共有很多配体，因此表明发挥类似的功能。另外，通过mRNA水平分析，已有报告指出：存在于小鼠肝内白细胞中的NKT细胞同时表达α4和α9整联蛋白(DiaoH，Kon S，Iwabuchi K，Kimura C，Morimoto J，Ito D，Segawa T，Maeda M，Hamuro J，Nakayama T，Taniguchi M，Yagita H，Van Kaer L，Onoe K，Denhardt D，Rittling S，T.U.2004.Osteopontin as a mediator of NKT cell function in T cell-mediatedliver diseases.Immunity 21：539-50))。因此，为了确认α4整联蛋白和α9整联蛋白是否实际在同一细胞上表达，分离小鼠肝浸润白细胞，通过两种整联蛋白抗体进行双重染色。结果如图11所示，α4整联蛋白在全部肝内白细胞的约39％左右中表达，α9整联蛋白在全部肝浸润白细胞的约12％左右中表达。α4整联蛋白表达细胞的约74％表达α9整联蛋白。

实施例10

[OPN与B16-BL6细胞的粘附方式的研究]

以B16-BL6细胞为代表，很多细胞都可同时表达α4整联蛋白和α9整联蛋白。另外，α4整联蛋白和α9整联蛋白共同具有OPN或VCAM-1等配体，因此可以预想，如果只是目前正在临床应用的抑制α4整联蛋白功能，该功能可被α9整联蛋白补偿。因此，研究并用抗α4整联蛋白抗体和抗α9整联蛋白抗体对抑制SVVYGLR肽与B16-BL6细胞的粘附效果方面的协同效果。

具体地，α4、α9整联蛋白抗体对B16-BL6细胞的粘附抑制效果通过SVVYGLR序列固相(5μg/ml)的细胞粘附试验进行研究。粘附时，向培养基中添加1mM MnCl₂进行反应。抗体使用抗α4整联蛋白抗体(克隆R1-2)(Pharmingen)和抗α9整联蛋白抗体(克隆11L2B)进行。作为抗α4整联蛋白抗体的对照抗体，使用正常大鼠抗体(NRG)，作为抗α9整联蛋白抗体的对照抗体，使用正常仓鼠抗体(NHG)。抑制活性使用50μg/ml抗体、两种并用时分别使用25μg/ml抗体进行研究。

结果如图12所示，抗α4整联蛋白抗体和抗α9整联蛋白抗体分别单独使用时，几乎未发现抑制效果。而将抗α4整联蛋白抗体和抗α9整联蛋白抗体并用时发现了抑制效果。该结果显示：α4整联蛋白、α9整联蛋白单独即对SVVYGLR序列具有几乎完全的细胞粘附能力。表明在生物体内，表达α4和α9两种整联蛋白的细胞(嗜中性粒细胞或NKT细胞等)与疾病发病相关，并且，考虑到这两种整联蛋白共同具有很多配体，可推测通过将抗α9整联蛋白抗体和抗α4整联蛋白抗体并用，可以更有效地获得疾病治疗效果，有成为新的治疗方法的可能性。

实施例11

[抗α9整联蛋白抗体对肝炎的治疗效果]

目前我们已知通过抑制OPN功能可以治疗肝炎(专利文献1)。因此，使用抗α9整联蛋白抗体克隆11L2B和抗α4整联蛋白抗体R1-2(Pharmingen)进行治疗实验。肝炎是静脉内施与200μg伴刀豆球蛋白A(ConA)(Vector公司)，使用GPT/ALT-PIII和GOT/AST-PIII(富士フイルム)测定12小时后血液中的AST值、ALT值。抗体是在施与ConA 3小时前静脉内施与200μg。如图13所示，通过抗α9整联蛋白抗体可见AST值、ALT值的减少，发现其具有治疗效果。并且，该治疗效果通过并用抗α4整联蛋白抗体而得到促进。可知通过抗α9整联蛋白抗体可以治疗肝炎。

实施例12

[使用腱成纤维细胞的抗α9整联蛋白抗体导致的MMP-13变化]

从小鼠膝腱回收腱成纤维细胞，通过FACS和细胞染色研究α9整联蛋白的表达。抗α9整联蛋白抗体使用克隆18R18D、抗α4整联蛋白抗体使用R1-2。如图14所示，可知在腱成纤维细胞中表达α9整联蛋白。α4整联蛋白未表达。

将重组全长型OPN和凝血酶切断型OPN(分别为10μg/ml)固定于固相，将腱成纤维细胞培养48小时，使用实时PCR对MMP-13mRNA进行定量。可知用凝血酶切断型OPN刺激腱成纤维细胞时，MMP-13的转录得到促进(图15)。接着，将抗α9整联蛋白抗体55A2C添加到培养液中，使其达到30μg/ml，研究MMP-13 mRNA量的变化。如图16所示，抗α9整联蛋白抗体(克隆55A2C)抑制了MMP-13转录量。使用仓鼠IgG作为对照抗体。

MMP-13也被称为胶原酶，对于小鼠中的胶原酶，MMP-13是代表性的MMP，而对于人，为MMP-1、MMP-8和MMP-13。MMP-13显示与关节炎(特别是类风湿性关节炎(RA)、变形性关节炎(OA))的恶化强烈相关(Skotnicki JS，DiGrandi MJ，Levin JI.Designstrategies for the identification of MMP-13 and Tace inhibitors.CurrOpin Drug Discov Devel.(2003)6：742-59.Review.)。由上述抗α9整联蛋白抗体可抑制MMP-13的转录的认识，强烈表明通过使用抗α9整联蛋白抗体，可以治疗关节炎。

实施例13

[癌细胞株增殖中抗α9整联蛋白抗体的功能]

如图2所示，B16-BL6强烈表达α9整联蛋白。还有报告指出MMP-13与癌的恶化相关(Ala-aho R，Kahari VM.Collagenases incancer.Biochimie.(2005)87：273-86.Review.)。因此，对构建的四种抗小鼠α9整联蛋白抗体抑制癌细胞的细胞增殖的活性进行了研究。用10％FCS/DMEM将B16-BL6细胞调制成5×10⁴细胞/ml，以10μg/ml添加抗小鼠α9整联蛋白抗体、抗小鼠α4整联蛋白抗体，然后将细胞-抗体悬浮液分别添加到细胞培养用96孔板中，每孔100μL。在37℃、5％CO₂存在下培养24小时，向各孔中分别添加10μL细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8)(同仁化学研究所)，再在37℃、5％CO₂存在下培养1小时，测定O.D.450的吸光度，定量分析细胞数。如图17所示，12C4’58的抑制活性最高，抑制35％左右的B16-BL6细胞的增殖。55A2C和R1-2可抑制20％左右增殖。

接着，为了对更接近于生物体条件下的细胞增殖抑制效果进行分析，将VCAM-1固定于固相，进行同样的研究。VCAM-1是α9整联蛋白的配体，使用VCAM-1的可溶重组蛋白-rhVCAM-1-Fc chimera(ロシユ)。以10μg/ml将rhVCAM-1-Fc chimera固定于固相使用，用0.5％BSA/PBS阻断非特异性反应。抗体单独使用时以10μg/ml添加，并用时分别以5μg/ml的浓度添加。然后按照与图17相同的方法进行。结果如图18所示，单独施与12C4’58抗体以及单独施与作为α4抑制抗体的克隆R1-2时，完全得不到效果，或者只得到微弱的效果，而将12C4’58和R1-2同时施与时，显示约20％左右的明显的细胞增殖抑制效果。

实施例14

[抗人α9整联蛋白抗体的功能分析]

使用人α9/CHO-K1细胞、CHO-K1细胞、内源性表达α9整联蛋白的人嗜中性粒细胞研究抗人α9整联蛋白抗体是否可用于FACS。对于人嗜中性粒细胞，FACS方法按照与图2同样的方法进行，与Fc受体非特异性反应的阻断使用50％山羊血清进行。第二抗体使用经FITC标记的抗小鼠IgG抗体。结果如图19所示，所有的抗人α9整联蛋白抗体均可以检测出人α9/CHO-K1细胞和人嗜中性粒细胞上的α9整联蛋白。并且所有的抗体均不与人α4/CHO-K1细胞反应。由这些结果可知，所有的抗人α9整联蛋白抗体均可以通过FACS检测出在细胞上表达的人α9整联蛋白蛋白质。

实施例15

使用作为α9整联蛋白的配体的OPN和腱生蛋白-C功能肽进行细胞粘附实验。细胞使用人α9/CHO-K1细胞，对各种抗α9整联蛋白抗体的抑制能力进行研究。将肽以5μg/ml固定于固相，用5μg/ml抗体进行抑制。如图20所示，在抑制对于OPN的粘附实验中，克隆21C5显示了最有效的抑制活性。1K11、24I11的抑制效果低。而关于抑制对于腱生蛋白-C粘附的能力，Y9A2显示最有效的抑制活性。而本次制备的抗α9整联蛋白抗体四个克隆对腱生蛋白-C未怎么显示抑制活性。

已经报道了人α9整联蛋白的中和抗体Y9A2，Chemicon公司将其制成产品，Y9A2是采用通常的免疫法(腹腔内施与)，由导入人α9整联蛋白基因的小鼠成纤维细胞株L细胞(L cell)制备的。本发明的抗人α9整联蛋白抗体通过消减免疫法制备，免疫方法不同。并且如图19所示，克隆21C5的人α9/CHO-K1细胞的FACS图的检测图谱不同，另外如图20所示，细胞粘附试验的抑制效果样式也不同，因此本次制备的抗α9整联蛋白抗体四个克隆与Y9A2的表位不同。

总结

为了制备抑制小鼠α9整联蛋白功能的抗体、以及了解疾病、病态中α9整联蛋白的功能，制备了四种小鼠α9整联蛋白的单克隆抗体和四种抗人α9整联蛋白抗体。使用这些抗体进行的研究中了解到以下内容。

(1)所制备的四种抗小鼠α9整联蛋白抗体全部可以用于FACS分析，具有分别不同的抑制细胞粘附的能力。

(2)抗小鼠α9整联蛋白抗体克隆12C4’58可用于免疫染色。

(3)在类巨噬细胞RAW264.7细胞、黑素瘤细胞B16-F1、B16-F10、B16-BL6细胞中表达α9整联蛋白。在小鼠嗜中性粒细胞中未观察到α9整联蛋白的表达，但在人中可见其表达，这显示嗜中性粒细胞上的α9整联蛋白的表达存在种间差异。脾细胞的B220^-CD3^-细胞群、B220⁺CD3⁺细胞群中存在一部分表达α9整联蛋白的细胞群。另外，肝脏浸润白细胞的α9整联蛋白表达在α4整联蛋白表达细胞上多见。

(4)同时存在α9和α4整联蛋白、并且存在识别两者的配体时，其粘附能力是互补的。

(5)发现抗小鼠α9整联蛋白抗体具有肝炎治疗效果，其效果因抗小鼠α4整联蛋白抗体而亢进。

(6)可知在腱成纤维细胞上表达α9整联蛋白，如用凝血酶切断型OPN刺激腱成纤维细胞，则MMP-13的表达亢进。可知该MMP-13亢进被抗α9整联蛋白抗体抑制。

(7)可知抗α9整联蛋白抗体可抑制B16-BL6细胞的增殖。另外，由于VCAM-1刺激导致的细胞增殖通过同时并用施与抗α9整联蛋白抗体和抗α4整联蛋白抗体，与单独施与相比，增殖抑制效果亢进。

(8)制备的四种抗人α9整联蛋白抗体全部可用于FACS分析，分别具有不同的抑制细胞粘附的能力。另外，通过FACS、粘附抑制实验，显示与现有的抗人α9整联蛋白抗体Y9A2不同的反应性，因此可认为其表位不同。

产业实用性

本发明的单克隆抗体通过抑制α9整联蛋白功能，对癌例如癌细胞的增殖、转移，炎症性疾病例如类风湿性关节炎、变形性关节炎，肝炎、支气管哮喘、纤维变性、糖尿病、癌转移、动脉硬化、多发性硬化症、肉芽肿、炎症性肠疾病(溃疡性结肠炎、克罗恩病)、自身免疫性疾病等发挥治疗效果。另外，含有本发明的抗α9整联蛋白抗体和抗α4整联蛋白抗体两者的药物组合物可发挥更为改善的癌、炎症性疾病的治疗效果。本发明的单克隆抗体也识别小鼠α9整联蛋白，因此也可以利用于使用小鼠的动物实验中。

序列表

<110>Gene Techno Science Co.，Ltd

<120>抗α9整联蛋白单克隆抗体

<130>PCT05-0103

<150>2005-6348

<151>2005-01-13

<160>17

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1035

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

Met Gly Gly Pro Ala Ala Pro Arg Gly Ala Gly Arg Leu Arg Ala Leu

1 5 10 15

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20 25 30

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Gly Asp Ala Gly Gly Ile Val Pro Gln Tyr Ser Met Lys Leu Ser Gly

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565 570 575

Ala Ala Tyr Ser Leu Ser Glu His Val Thr Gly Glu Glu Glu Arg Glu

580 585 590

Leu Pro Pro Leu Thr Pro Val Leu Arg Trg Lys Lys Gly Gln Lys Ile

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<210>2

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<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400> 2

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1 5 10 15

Leu Leu Leu Ala Leu Val Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Ala Tyr Asn

20 25 30

Leu Asp Ala Gln Arg Pro Val Arg Phe Gln Gly Pro Ser Gly Ser Phe

35 40 45

Phe Gly Tyr Ala Val Leu Glu His Phe His Asp Asn Thr Arg Trp Val

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Leu Val Gly Ala Pro Lys Ala Asp Ser Lys Tyr Ser Thr Ser Val Lys

65 70 75 80

Ser Pro Gly Ala Val Phe Lys Cys Arg Val His Thr Asn Pro Asp Arg

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Asn Tyr Asn Leu Thr Ala Asp Val Ala Gln Lys Glu Lys Gly Gln Leu

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Pro Arg Val Tyr Phe Val Leu Phe Gly Glu Thr Ala Gly Gln Val Ser

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Asp Cys Ala Ala Asp Leu Gln Leu Arg Gly Lys Leu Leu Leu Ser Ser

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<212>DNA

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<220>

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cagctcgagt cagtcatcat tgcttttgct gttgac 36

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<212>DNA

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<220>

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gtcaagcttc tggggatggg cggcccggct gggctg 36

<210>6

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<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>6

cggtctagac acggtgggtc actggttttt ctggac 36

<210>7

<211>4941

<212>DNA

<213>小鼠

<400>7

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gggcgctggc ggccgtccct ggccttgctc cggctctcga ctgtagccca tcgccgcgtc 120

ccgggcttag actcgtgagc gtacggctcc cgccccgggc agcggcgtgt cccgggagcc 180

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tccttcttcg gctacgcggt gctggagcac ttccacgaca acacgcgctg ggtcctcgtg 420

ggtgcaccga aggcagattc taaatatagc acttcagtaa agtctcctgg agctgtgttt 480

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aggactcgtg gtgcgccctg tgggaagacc tgcaggggag accgggatga cgagtggatg 600

ggggtgagcc tggcccggca gcccagagca gatggccgtg ttttggcctg tgcccatcgt 660

tggaaaaaca tctactacga agcagaccac atcctgcccc atggattctg ctacctcatc 720

ccttccaacc tccaggccaa aggcaaggtg ctgattccct gctacgaaga gtataagaag 780

aagtatgggg aagaacatgg ctcctgccag gccggaatag caggcttctt cacagaggaa 840

ctggtggtca tgggtgcccc aggctcgttt tattgggctg ggacactcaa ggtgctgaac 900

ctcacggaca acacatattt taagttgaac gatgaagcga ttatgaacag acggtatact 960

tatctgggct atgcagtgac ggctggccac ttctctcatc catccatcac tgatgtggta 1020

gggggtgccc cacaggatga aggcattgga aaggtttata tatttagagc tgaccgaaga 1080

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tcctccttgt gtgcagtcga cctgaacatg gacggcctct ctgacttgct cgtgggggct 1200

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gagagcatcg ccaacctggg cgacattgat gatgacgggt tcccagatgt ggctgtcggg 1380

gcacctaagg aggaggactt tgctggcgca gtctacatct atcatggtga tgccaatggg 1440

attgtcccca agtactcaat gaagctgtct gggaggaggc taaacccgac cctgcggatg 1500

tttgggcagt ccatatcagg gggcattgat atggatggaa atggctatcc tgatgtcacc 1560

atcggagcct tcctgtccga cagcgtggtt ctcctcaggg ccagaccggt catcacggtg 1620

gatgtctcca tcttcctgcc aggctccatc aacatcacag cacctcagtg tcacgatgga 1680

caacagcctg tgaactgcct gaatgtcacc gtgtgcttcc ggttccatgg caagaatgta 1740

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ctgcagctgt cccacatgga cgaagtgtgt catcactacg tggcccacgt caagcggaga 1920

gtccaggatg tcatcagccc cattgtgttt gaagccgcct acagcctgga tgagcatgtg 1980

atgggtgagg aagaccggga gctgccagac ctgacaccag tgcttcgctg gaagaaggga 2040

caaaggatct cccagaagaa tcagacagtt tttgaaagga attgccaatc tgaggactgt 2100

gctgccgacc tgcagcttcg ggggaaactc ctgctttcca gtgttgacga gaaaacccca 2160

cacctggctt tgggggctgt gaaaaatatc tctctaaaca tctccatctc caaccttgga 2220

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catgtggcag aaggaggaga tgggcatttc ctgtgagctg ctggaatcag acttcctcaa 2340

gtgcagtgtg ggatttcctt tcatgaggtc aaagtctaag tatgaattca gtgtcatctt 2400

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tagtgctctt ccgaaagagg agagccgcac catcaaccta tacatgctac tgaacacaga 3000

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gaaatcttct ccagattttt cggaggcccc actgatgctg ttctcttcct catcccgtca 3480

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tatttatgga tgcaacattg cgtggtcaac cctcagggga aaactgttac ctaaaagtat 3660

tttttataaa tgtaagcctt ttatattgat catgtcttta tatttgtatc aatgttttat 3720

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ctgcatacaa attttaaaag agaaggaact tattctactt tggaacttgt tgttagggaa 3840

gaaaaaaaaa acttgcagat aaaacaaact gaagaaacct catgaaatga atccaccaag 3900

ctggaggcac tgggaaagca caaaggacat ggcaaggccg cctaagacat ttattcccca 3960

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<212>DNA

<213>小鼠

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tactatttta aaatgaaata gcttctacct gggtttcaca taatttgtct gtaattacaa 4620

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ttggagaaaa ttttgcatca tgtcaagctg gaatatccag tttttacaca aaggatttaa 1800

ttgtgatggg ggccccagga tcatcttact ggactggctc tctttttgtc tacaatataa 1860

ctacaaataa atacaaggct tttttagaca aacaaaatca agtaaaattt ggaagttatt 1920

taggatattc agtcggagct ggtcattttc ggagccagca tactaccgaa gtagtcggag 1980

gagctcctca acatgagcag attggtaagg catatatatt cagcattgat gaaaaagaac 2040

taaatatctt acatgaaatg aaaggtaaaa agcttggatc gtactttgga gcttctgtct 2100

gtgctgtgga cctcaatgca gatggcttct cagatctgct cgtgggagca cccatgcaga 2160

gcaccatcag agaggaagga agagtgtttg tgtacatcaa ctctggctcg ggagcagtaa 2220

tgaatgcaat ggaaacaaac ctcgttggaa gtgacaaata tgctgcaaga tttggggaat 2280

ctatagttaa tcttggcgac attgacaatg atggctttga agatgttgct atcggagctc 2340

cacaagaaga tgacttgcaa ggtgctattt atatttacaa tggccgtgca gatgggatct 2400

cgtcaacctt ctcacagaga attgaaggac ttcagatcag caaatcgtta agtatgtttg 2460

gacagtctat atcaggacaa attgatgcag ataataatgg ctatgtagat gtagcagttg 2520

gtgcttttcg gtctgattct gctgtcttgc taaggacaag acctgtagta attgttgacg 2580

cttctttaag ccaccctgag tcagtaaata gaacgaaatt tgactgtgtt gaaaatggat 2640

ggccttctgt gtgcatagat ctaacacttt gtttctcata taagggcaag gaagttccag 2700

gttacattgt tttgttttat aacagtagtt tggatgtgaa cagaaaggca gagtctccac 2760

caagattcta tttctcttct aatggaactt ctgacgtgat tacaggaagc atacaggtgt 2820

ccagcagaga agctaactgt agaacacatc aagcatttat gcggaaagat gtgcgggaca 2880

tcctcacccc aattcagatt gaagctgctt accaccttgg tcctcatgtc atcagtaaac 2940

gaagtacaga ggaattccca ccacttcagc caattcttca gcagaagaaa gaaaaagaca 3000

taatgaaaaa aacaataaac tttgcaaggt tttgtgccca tgaaaattgt tctgctgatt 3060

tacaggtttc tgcaaagatt gggtttttga agccccatga aaataaaaca tatcttgctg 3120

ttgggagtat gaagacattg atgttgaatg tgtccttgtt taatgctgga gatgatgcat 3180

atgaaacgac tctacatgtc aaactacccg tgggtcttta tttcattaag attttagagc 3240

tggaagagaa gcaaataaac tgtgaagtca cagataactc tggcgtggta caacttgact 3300

gcagtattgg ctatatatat gtagatcatc tctcaaggat agatattagc tttctcctgg 3360

atgtgagctc actcagcaga gcggaagagg acctcagtat cacagtgcat gctacctgtg 3420

aaaatgaaga ggaaatggac aatctaaagc acagcagagt gactgtagca atacctttaa 3480

aatatgaggt taagctgact gttcatgggt ttgtaaaccc aacttcattt gtgtatggat 3540

caaatgatga aaatgagcct gaaacgtgca tggtggagaa aatgaactta actttccatg 3600

ttatcaacac tggcaatagt atggctccca atgttagtgt ggaaataatg gtaccaaatt 3660

cttttagccc ccaaactgat aagctgttca acattttgga tgtccagact actactggag 3720

aatgccactt tgaaaattat caaagagtgt gtgcattaga gcagcaaaag agtgcaatgc 3780

agaccttgaa aggcatagtc cggttcttgt ccaagactga taagaggcta ttgtactgca 3840

taaaagctga tccacattgt ttaaatttct tgtgtaattt tgggaaaatg gaaagtggaa 3900

aagaagccag tgttcatatc caactggaag gccggccatc cattttagaa atggatgaga 3960

cttcagcact caagtttgaa ataagagcaa caggttttcc agagccaaat ccaagagtaa 4020

ttgaactaaa caaggatgag aatgttgcgc atgttctact ggaaggacta catcatcaaa 4080

gacccaaacg ttatttcacc atagtgatta tttcaagtag cttgctactt ggacttattg 4140

tacttctgtt gatctcatat gttatgtgga aggctggctt ctttaaaaga caatacaaat 4200

ctatcctaca agaagaaaac agaagagaca gttggagtta tatcaacagt aaaagcaatg 4260

atgattaagg acttctttca aattgagaga atggaaaaca gactcaggtt gtagtaaaga 4320

aatttaaaag acactgttta caagaaaaaa tgaattttgt ttggacttct tttactcatg 4380

atcttgtgac atattatgtc ttcatgcaag gggaaaatct cagcaatgat tactctttga 4440

gatagaagaa ctgcaaaggt aataatacag ccaaagataa tctctcagct tttaaatggg 4500

tagagaaaca ctaaagcatt caatttattc aagaaaagta agcccttgaa gatatcttga 4560

aatgaaagta taactgagtt aaattatact ggagaagtct tagacttgaa atactactta 4620

ccatatgtgc ttgcctcagt aaaatgaacc ccactgggtg ggcagaggtt catttcaaat 4680

acatctttga tacttgttca aaatatgttc tttaaaaata taatttttta gagagctgtt 4740

cccaaatttt ctaacgagtg gaccattatc actttaaagc cctttattta taatacattt 4800

cctacgggct gtgttccaac aaccattttt tttcagcaga ctatgaatat tatagtatta 4860

taggccaaac tggcaaactt cagactgaac atgtacactg gtttgagctt agtgaaatga 4920

cttccggaat ct 4932

<210>11

<211>36

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>11

acgctcgagt gtaccatgtt ccccaccgag agcgca 36

<210>12

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>12

tcatctagat taatcatcat tgcttttact 30

<210>13

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>13

tcgaagcttc tggggatggg cggcccggct 30

<210>14

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>14

acctctagat cactggtttt tctggaccca 30

<210>15

<211>7

<212>PRT

<213>智人

<400>15

Ser Aal Val Tyr Gly Leu Arg

5

<210>16

<211>5

<212>PRT

<213>智人

<400>16

Gly Arg Gly Asp Ser

5

<210>17

<211>8

<212>PRT

<213>智人

<400>17

Ala Glu Ile Asp Gly Ile Glu Leu

5

Claims

1.单克隆抗体，该单克隆抗体特异性识别人α9整联蛋白和小鼠α9整联蛋白。

2.权利要求1所述的单克隆抗体，该单克隆抗体抑制α9整联蛋白与α9整联蛋白的配体的结合。

3.权利要求2所述的单克隆抗体，其中，α9整联蛋白的配体是骨桥蛋白。

4.权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体，所述单克隆抗体由保藏编号FERM ABP-10195、FERM ABP-10196、FERM ABP-10197或FERM ABP-10198标示的杂交瘤细胞产生。

5.杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞产生权利要求1～4中任一项所述的单克隆抗体。

6.药物组合物，该药物组合物含有权利要求1～4中任一项所述的单克隆抗体。

7.药物组合物，该药物组合物含有权利要求1～4中任一项所述的单克隆抗体和抗α4整联蛋白抗体。

8.权利要求6或7所述的药物组合物，其是癌、炎症性疾病、自身免疫性疾病的预防和/或治疗剂。

9.癌、炎症性疾病、自身免疫性疾病的诊断剂，其含有权利要求1-4中任一项所述的单克隆抗体。

10.权利要求1～4中任一项所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，使用过量表达α9整联蛋白的细胞作为抗原。

11.权利要求5所述的杂交瘤细胞的制备方法，其特征在于，使用与作为过量表达α9整联蛋白的抗原使用的细胞不同种类的细胞。

12.细胞和/或组织重塑的抑制和/或促进剂，该抑制和/或促进剂含有α9整联蛋白结合性功能分子作为有效成分。

13.细胞和/或组织重塑的抑制和/或促进方法，其特征在于，使α9整联蛋白表达细胞和/或组织与α9整联蛋白结合性功能分子接触。