JPS62502590A - Ｔ細胞レセプターの可変領域内の配列に基づく検査試薬及びその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ■　レセプターの可　領域内の非反復配列に基づく、断試薬及びその使用 １」Ｌ立ｗｅ ■細胞は胸腺に由来し、そのためにＴ細胞と呼ばれている。

それらは体の血管やリンパ管を通って自由に循環し、そうして外からの侵入物、 すなわち、ウィルス、アレルゲン、腫瘍及び自己抗原を検出し、それらと反応す ることができる。顕微鏡下での形態は単一であるにもかかわらず、■細胞はヘル パー、サプレッサー及びキラーと呼ばれる数個の異なった機能のサブセットを有 する不均一な細胞集団からなる［にｕｎｇ、　Ｐ、Ｓ、及びＧｏｌｄｓｔｅｉｎ 、　Ｇ、、　Ｖｏｘ　５ａｎｑｕｉｎｉｓ　３９：　１２１　（１９８０）；　 Ｒｅ１ｎｈｅｒｚ、　Ｅ、Ｌ。

及びＳｃｈｌｏｓｓｍａｎ、　Ｓ、Ｆ、、　Ｃｅ１ｌ　１９：８２１　（１９８ ０）］。

Ｔ！ｌｌ胞抗原レセプターと呼ばれる識別系を介して、Ｔ細胞は侵入する病原体 の存在を検出し、Ｂリンパ球に抗体の産生を開始又は抑制するよう指示するＴｍ 胞因子と呼ばれる複数の独特なＴ細胞リンホカインの放出を指令し、白血球系を 調節してより多くの食細胞と他の白血球を産生させて病原体を中和し、腫瘍細胞 やウィルスに感染した細胞を破壊することができる。従って、■細胞による病原 体の検出及び結合はＴｅｌ胞因子の放出の引き金及びこれらの因子により開始す る宿主の防御作用のカスケードに関連している［Ｋｕｎｇ、　Ｐ、Ｓ、及びＧｏ ｌｄｓｔｅｉｎ、　Ｇ、、　ＶｏｘＳａｎｑｕｉｎｉｓ　３９：　１２１　（１ ９８０）：　Ｒｅ１ｎｈｅｒｚ、　Ｅ、Ｌ、及びＳｃｈｌｏｓｓｍａｎ。

Ｓ、Ｆ、、　Ｃｅ１１．１９：８２１　（１９８Ｇ）　］。　゛■細胞抗原レセ プターは他のＴ細胞表面マーカーと２つの主要な点で異なっている：ａ）体内に は疾病との戦いに関係する数百五個のそれぞれ異なるＴ細胞があり、各Ｔ細胞の クローンは非反＠　（ｕｎｉｑｕｅ）のＴ細胞抗原レセプターを有しており［Ｆ ａｔｈｍａｎ。

Ｃ，Ｇ、及びＦｒｅｌｉｎｇｅｒ、Ｊ、Ｇ、、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、Ｉｍａ＋ｕ ｎｏ１．１６３３（１９６３）］、及びｂ）Ｔｌ［ｌ胞抗原レセプターは抗原結 合に公知の機能を有している。市販のｒＯＫＴＪ及びｒＬｌｕＪモノクローナル 抗体で同定しうる他のＴ細胞表面マーカーの機能の多くは未知のままである。こ れらのマーカーはＴ細胞抗原レセプターに見られる構造的な可変性（Ｖａｒｉａ ｂｉｌｉｔｙ）は有していない。さらに、該レセプターのみがＴｉｔ胞に本当に 特異的な分子であるように思われる［Ｈｅｕｅｒ、　Ｓ、Ｃ，等、＾ｎｎ、　Ｒ ｅｖ、　Ｉｓｍｕｎｏｌ、　２：　２３　（１９８４）　］　。

■細胞は種々の調節や防御機能を行うので、免疫応答の中心的な役割を果す。こ れらの応答には、ウィルスにより又は悪性Ｉ！瘍により形質転換された自己細胞 （ｓｅａ−ｃｅｌｌ）を破壊しくＴキラー細胞）、抗体分子を分化させ、その分 泌された遺伝子産物を発現させるＢ細胞を助け（Ｔヘルパー細胞）、免疫応答を 抑制する（Ｔサプレッサー細胞）ことを含んでいる。■細胞のこれらのカテゴリ ーの各々は、高度に特異的であり、この特異性はそれらのＴ細胞抗原のレセプタ ー分子を介して媒介される。

従って、■細胞レセプター分子及びそれらの遺伝子構造について理解することは ヒトの免疫応答の特異性や調節を理解するのに不可欠である。

Ｔ細胞サブセットのタイピング用のモノクローナル抗体試薬の市場は１９８０年 代の半ばからの４年間で０から２０ミリオンドルへと成長した。このような成長 は、直接的に急性及び慢性疾患に関与するＴ細胞免疫の状態をモニターするため のアッセイの必要性を反映している［Ｋｕｎ（１，Ｐ、　Ｓ、等、Ｉｎｔｅｒｎ ａＮｏｎａｌ　Ｊ。

Ｄｅｒａａｔｏｌ、　２２：６７　（１９８３）］　。Ａイブリドーマ手法が出 現する前に、ヘルパー、サプレッサー及びキラーＴ細胞活性を評価しようと試み ていた研究室で一部のバイオアッセイが開発された。

これらのバイオアッセイは、完了するのに通常１週間以上かがるような、時間の かかる、冗長な、非常に骨の折れるものである。結果として、バイオアッセイは 顕著な商業的価１（需要）を生み出さなかった。

非反復的に発現される幾つかの表面マーカーをＴ細胞が有しており、モノクロー ナル抗体はこれらのマーカーに対し生成することを発見した１９７０年代の後半 に突破口が開けた。研究室で精力的に研究が行われた後、モノクローナル抗体は Ｔｌ１８胞全体、ヘルパー細胞及びキラー／サプレッサーＴ細胞を数えるために 使用しうろことが決定された。流動細胞計測計と共に用いるこ・れらのモノクロ ーナル抗体をベースとするＴ細胞のタイピングテストは世界中の研究室で受け入 れられた。

これらのＴ細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体は、Ｊｏｈｎｓｏｎ　 ＆　Ｊｏｈｎｓｏｎ　（Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅｓ　ＯＫＴシリーズの商標で）及 びＢｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　ｃｏＩＩＩＤａｎｙ　（Ｌ　ｅ 　Ｕシリーズの商標で）から市販されている。これらの抗体は、それぞれ全循環 Ｔ細胞の６５％及び３５％に相当する、ヘルパー又はキラー／サプレッサーと呼 ばれる２つの主要なＴ細胞の機能的サブセットを同定しうる。

ＯＫＴ／Ｌｅｔｕモノクローナル抗体の最初の世代には重大な限界があった。そ れらはサプレッサーＴ細胞がらキラーＴ細胞を、クラス■のキラーからクラスエ のキラーを、又は存在することが知られている異なるヘルパー、サプレッサーサ ブタイプをそれ以上区別することができない。ざらに、これらのモノクローナル 抗体は疾病特異的ではない抗原を検出する［Ｋｕｎｇ、　Ｐ。

Ｓｏ等、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊ、　Ｄｅｒａ＋ａｔｏ１．　２２：６ ７　（１９８３）　］。

１９８４年位に、０ｎｔａｒｉＯ癌研究所のＤｒ、　Ｔａｋ　Ｎａｋを中心とす る科学者のチームにより重要な発見が成された［　Ｎａｔｕｒｅ　３０８：１４ ５　（１９８４）　］。このチームはヒトＴ細胞抗原レセプターのβ鎖をコード する遺伝子を単離し、配列決定することに成功した。

本発明は、Ｏｒ、　Ｎａｋらの仕事の延長上から得られた、Ｖβ遺伝子セグメン トの限定されたレパートリ−が存在することと、該遺伝子内に含まれ、それ故に 、それでコードされるレセプターのアミノ酸配列中に含まれる非反復配列はヒト の疾患を診断するのに使用できるという予期しなかった発見の結果によるもので ある。

従っテ、他の人々［例えばＨｉｎｄｅｎ、　Ｈ，Ｄ、、等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ口 。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２１２２４　（１９８４）；　Ｊｏｎｅｓ、 　Ｎ、等、５ｃｉｅｎｃｅ２２７　：　３１１（１９８５）及びＡＣＬｌｔｏ、 　０．等、Ｐｒｏｃ、　Ｗａｔｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

１１ｓＡ　８１３８５１　（１９８４）］がＴ細胞抗原レセプターのβ鎖の可変 領域のＮ−末端付近のアミノ酸配列を含む、該可変領域に対し特異的なモノクロ ーナル抗体又は核酸プローブを製造したにもがかわらず、これらの抗体又はプロ ーブが特定の疾患の状態に関連することは開示ないし又は示唆されてぃなかった 。さらに、これらの可変領域の数が限られていることを理解してぃなかったので 、当業者には上記のような事態は予期できなかったであろう。従って、本発明は 可変領域に特異的な試薬は疾患の診断又は臓器移植の拒絶反応の検出に使用しう るという発見に関連対象とされる特定の疾患は被検体において次のようにして診 断されうる。Ｔ細胞を含有する適当なサンプルを被検者から採取する。適当な条 件下に、■細胞と結合でき、Ｔ細胞レセプターのβ鎖の可変領域内の非反復アミ ノ酸配列の存在を指示しうる試薬とサンプルとを接触させ、正常な被検体中に存 在する該配列を有する細胞数と比較して非反復配列を有する細胞の数が増加して いれば対象の特定疾患と関連づけられる。非反復配列が存在するときには、非反 復配列を含有し、サンプル中に存在するＴｌｌ胞と試薬との間に検出可能な複合 体が形成され、存在する該複合体の量を定量し、そうして測定した量と同じ方法 と使って正常な被検体から測定した量とを比較することにより、対象の疾患を診 断する。

多くの疾患をこうして診断できる。これらには、種々の形態の癌、自己免疫疾患 、感染症及びアレルギーを含んでいる。更に、本発明方法は移植の拒絶反応の検 出にも使用できる。

最後に、本発明はヒトの疾患の診断に有用な血清由来又はモノクローナル抗体及 びＤＮＡ又ＲＮＡプローブのような試薬を提供する。このような試薬は、■細胞 レセプターのβ鎖の可変領域内に含まれる非反復配列に特異性を持つことを特徴 とし、正常な被検体中に存在するコピーの数と比較して非反復配列のコピーがよ り多く存在していれば対象の特定疾患と関連づけら第１ａ図。８個の■β遺伝子 のＤＮＡ配列。ＣＤＮＡライブラリーは全て、Ｈｕｙｎｈ等の方法６３の変法に よりλｇｔｌｏクローニングベクター中に構築した。ライブラリーは３２ｐでラ ベルしたＣＤ　ＣＤＮＡプローブでスクリーニングし、陽性のクローンを単離し 、ＣＤＮＡ挿入物をＭ　１３ｎ＋ｐ８又は−ｐｌｏベクター内にサブクローニン グした。各サブクローンのＶβ遺伝子はジデオキシヌクレオチドブライマーによ り両方の鎖について配列決定した。

配列をＶβ及びＪβ遺伝子セグメント並びにＤ領域をそれぞれ直線で並べて表示 する。Ｌはリーダーペプチドをコードするヌクレオチドを表わす。ＴＢ２３サブ クローンは■β遺伝子セグメントのみを含有していた。１．９．２に使用した■ βセグメントとＢ　Ｗ５１４７との間の一致は点で示している。ＡＲｌから得た ＣＤ　Ｎ　Ａは位＠１６１で始まる■β遺伝子セグメントの部分のみを含んでい た。配列を並べる目的で、前に発表された相同■β遺伝子セグメントの５゛部分 ３３を加えた。

第１ｂ図。１５個の■β遺伝子セグメントの翻訳された蛋白質配列。以前に発表 された７個のＶβ遺伝子セグメントと、第１ａ図に示した８個のＶβ遺伝子セグ メントのＤＮＡ配列を翻訳し、配列の相同性（ｈｏＩＩｌｏｌｏｇｙ）を最大限 にするよう互いに直線に並べた。各配列の源については第１表を参照せよ。

第２図。１５個の■β遺伝子からのＤ領域はたった２つのＤβ遺伝子セグメント から得られる。第１ａ図に示した及び以前に発表されたＤ領域はＤβ１．１　β ２．、に直線に並べた。ど又はＤ ちらかのＤβ遺伝子に相同である領域を直線で示す。生殖系（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ）Ｄβ配列の横の付加ヌクレオチドはＮ−領域多様性（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）に より付加されると推定される。Ｔ　Ｂ　１２に使用されたＤ領域はＤ　及びＤ　 のどちらかからでも由来すβ１．１　β２．す ることができ、そのように示しである。

第３図。３つの全部の翻訳読み取り枠でＶβ遺伝子セグメントにＤβ遺伝子セグ メントを結合させうる。カッコの左の数字は異なる読み取り枠を同定する。

第４図。Ｖβ及び■□セグメントの可変性のプロット。各アミノ酸位置での可変 性Ｎは Ｎで最も通常に発生するアミノ酸の頻度として計算する。

超可変性（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ）の領域は、その平均可変性が配列全体 の平均の可変性より大きい残基位置のセットとして経験的に定義されうる。使用 した配列はすべてＰｒｏｔｅｉｎ　ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＲｅｓｏｕｒｃｅ　 ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｏｕｒｃｅ　 Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎａｎｄ　ＧｅｎＢａｎｋから入手しうるものである。（ａ ）第１ｂ図に示された１０個の異なるＶβ遺伝子セグメントの翻訳した配列。（ ｂ）１８個のαアミノブロックしたヒトＶＨ配列。（Ｃ）αアミノ位置でブロッ クした及びブロックしていない配列を表わす３１個のヒト■、配列。

第５図。Ｖβ、■ｏおより、ｃセグメントの二次構造分析。（ａ）Ｃｈｏｕ及び Ｆａｓｓａ＋ａｎ　５８の方法を使ってのβ−プリーツシートの形成能カブｏ− ７ト。（ｂ）　Ｋｙｔｅ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ　５９のスケールを用いた疎水 性プロット。両方の分析は５５個のＶＨ領領域１００個の■９領域及び１０個の Ｖβ領域についての各位置での平均値にょつた。

第６図。ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）　Ｔリンパ腫セルラインに対するＨＴＬ Ｖ−１結合。Ｍ’Ｔ−２上２１！１１６ＨＴＬＶ−１！得、ウィルスを濃縮し、 前記（３）のように精製した：ｌＡ２６０単位／ｄのウィルス濃度でＯ−ダミン 化オクチルデカン酸（参考文献３９）　１０４／ａｅｔｌ−ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−１ をラベルした。Ｐ　Ｂ　Ｓ　（ｐＨ７，４）中のウィルスをこのローダミン結合 脂肪酸と共に３７℃で１時間インキュベートし、脱脂したＢＳＡ親和性カラムに このウィルス調製物を通すことにより未結合の脂肪酸を除去した。オルトサイト フルオログラフィ（ｃｙｔｏｆ　Ｉｕｏｒｏｏｒａｐｈ）で分析する前に、０． １Ａ２６０単位のこのラベルしたウィルスをジャーカット細胞と共に４℃で１時 間インキュベートした。細胞当りに結合したローダミンでラベルしたウィルスの 量をラベルされていない細胞及び競合剤として等最のラベルしていないＨＴＬＶ −１に露出した細胞と比較した。

第７図。ＪＭ細胞に対するＨＴＬＶ−１結合の抗−Ｍ３Ｖ（クローン４３）阻害 。ローダミンでラベルしたＨＴＬＶ−１の結合及びモノクローナル抗体によるそ の結合の阻害のサイトフルオログラフィ１分析は、ＪＭ細胞ラインについて、第 １図に記載したように実施した。５×１０５のＪＭ細胞を抗−Ｌｅｕ　−１、抗 −Ｌｅｕ−４，抗−Ｍ３Ｖ（りＯ−ン４３）又ハ陰性ノコントロール（γ２Ａ） ラットモノクローナル抗体（５ｏ１１１中各抗体２ｕ）と共に予めインキュベー トした。アジ化ナトリウムが存在しない所で、４℃にてこの群の細胞と共にイン キュベートするローダミンでラベルしたＨＴＬＶ−１０，１Ａ２６０単位を加え る前に、前記ブレインキュベーションをアジ化ナトリウムが存在しない所で、３ ７℃で１時間行った。等ｆｆｉ　（０，１Ａ　２６０単位）のラベルしていない ＨＴＬＶ−１に露出した細胞当りの結合した蛍光の中央値。

発明の詳細な説明 本発明は、被検体における対象となる特定疾患の診断法を提供する。この方法に は次のステップを含む：（ａ）　Ｔ細胞を含む適当なサンプルを被検体から採取 し、（ｂ）　Ｔ細胞に結合可能でありＴ細胞レセプターのβ鎖の可変領域内の非 反復アミノ酸配列の存在を指示する試薬を用い、該非反復配列を含み該サンプル 中に存在するＴ細胞と該試薬との間に検出可能な複合体を形成せしむべく適当な 条件下に該サンプルと該試薬とを接触させ、正常被検体中に存在する該配列を有 する細胞の数に対する該非反復配列を有する細胞の数の増加を対象特定疾患と関 連させ、 （Ｃ）該複合体中に存在する該配列を含むＴ細胞の数を定量的に測定し、この測 定数と、同じ手順で測定した正常被検体の該配列を有するＴｖＡ胞の数とを比較 し、該対象疾患を診断する。

本発明を使用して診断しうる対象特定疾患の例には種々の形態のヒトの癌、例え ば乳癌、結腸癌、肺癌、リンパ腫、肝癌及び白血病：種々の自己免疫疾患、例え ば関節リューマチ、第一型糖尿病、多発性硬化症、全身性紅斑性エリテマトーデ ス、再生不良性貧血、自己免疫性溶血性貧血、免疫性血小板溶解性紫斑病、移植 片（ｇｒａ　ｆ　ｔ　）対宿主疾患又は他のＴ細胞を媒介とする自己免疫疾患及 び重症筋無力症（ｍｙｓｔｈｅｎｉａ　ｇｒａｖｉｓ）又はグレーブス病：腎炎 、脈管炎：心筋炎：筋炎：大腸炎：乾ｇ：アルツハイマー病及び他の神経系の変 性疾患：カボジ肉腫：ホジキン病二毛細管拡張性運動失調（Ａｔａｘｉａ　ｔｅ ｌａｎｇｅｃｔａｓｉａ）；　ＷｉｓｋｏｔｔＡｌｄｒｉｃｈ症候群：ＡＩＬＤ （異常蛋白血症を伴うオージオイムノプラスチック（ａｕｇｉｏ　Ｉａｖｕｎｏ ｂｌａｓｔｉｃ）リンパ節疾患）：ウィルス例えばＨＴＬＶ−１，ＨＴＬＶ−１ ［［（ＬＡＶ又はＡＲＶ）。

Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎及びサイトメガロウィルス、酵母、例えばカンジダ（ｃａｎ ｄｉｄａ　）属の１つ、寄生虫、例えば住血吸虫、フイライア（Ｂｒｕｇｉａ　 ｍａｌａｇｉ）又はマイコバクテリウム、旋毛虫症、睡眠病を起す原虫（トリパ ノゾーマ）及び劃り例えば破ｌｆｆ１の毒素を産生ずるものによる感染性疾患； アレルギー、例えばＴセルが関与する接触性過敏症又は遅延型過敏症を含む。

本発明はヒトだけではなく例えば家畜例えば犬、猫、牛及び豚にも使用すること ができると考えることができるが、本発明は近い将来、特にヒトの疾患の診断に おいても最も価値を持つであろう。同様に、被検体からの適当なサンプルは多く の形態で得られると思われるが、全血及び組織、例えば組織の部分のサンプルが この分野の現在の状態で最も多く使用されるであろう。しかしながら、他の型の サンプル、例えば尿、初乳、骨髄。

脳を髄液又は関節液（ｊｏｉｎｔ　ｆｌｕｉｄ）を使用し得ることも考えられる 。

本発明はＴ細胞レセプター内の、より特定的にはＴ細胞レセプターのβ鎖の可変 領域内の非反復アミノ酸配列（又は、それらをコードする非反復核酸配列）を疾 患診断用のマーカーとして利用する。特に、そのように利用するアミノ酸配列は 、正常被検体に存在する該配列を有する７℃胞の数に比べより多くのＴｉ胞に該 配列が存在することが特定疾患に関連しているようなものである。■細胞を含有 する適当なサンプルを、適当な条件下に、ＴｉＨＩｔ＆と結合しうる、そして非 反復アミノ酸配列をコードする核酸配列の存在を介して直接的に、又は間接的に 該非反復アミノ酸配列の存在を示しうる試薬と接触させる。サンプル中に存在す るＴ細胞と試薬との間に検出しうる複合体が形成されることにより、非反復配列 の存在が示される。そのように形成された複合体中に存在するＴＩＩＩ胞の数を 定量的に測定し、正常被検体について測定した該配列を有するＴｉ［ｌＷｉの数 とその数を比較することによって、対象の疾患を診断しろる。

ある疾患状態で多くのコピー数で、■細胞レセプター内に存在する任意の非反復 アミノ酸配列が本発明の実施に使用しうると思われるが、現在の所好ましい配列 は、既に同定されたか又はこれから同定されるであろうものの両方を含め、Ｔ細 胞レセプターのβ鎖の可変領域内に存在するものである。現在の好ましいアミノ 酸配列はＴｉ１ｌ胞レセプターのβ鎖の可変領域のＮ−末端に位置する初めの約 ３０個のアミノ酸内に存在するものである。しかしながら、正確な位置はきわめ て重要ではなく、むしろ非反復マーカーとして働く配列の能力がきわめて重要な 因子である。一般に、マーカーとして有用であるには、アミノ酸配列は少なくと も１０個の長さのアミノ酸であり、すなわち、ＤＮＡ又はＲＮＡハイブリダイゼ ーションプローブとハイブリットを形成し得る核酸配列（すなわち、少なくとも 約３０塩基対）によりコードされているか、又はそれに対する抗体が産生され得 るだけのエピトープを含むのに充分な長さである。

単に例示のためであるが、このような非反復アミノ酸配列の１つは次のものであ る： Ｇｌｙ−Ｖａｌ−１ｌｅ−Ｇｌｎ−３ｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−旧ｓ−Ｇｌｕ−Ｖ ａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｎｅｔ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｌ ｅｕ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ、この配列は、■細胞の表面上に存在するＴ細胞レセプタ ーのβ鎖の可変領域のＮ−末端に存在し、白血病とリンパ腫に関連する。従って 、正常被検体と比較して被検体において多くのＴ１１［１胞にこの配列が存在す ることは被検体の疾患状態を意味する。

このような非反復配列は当業者に公知の方法を使って血清又はモノクローナルの いずれかの抗体を産生ずるのに使用でき、得られた抗体は、当業者には公知の適 当な条件下で抗体とＴ細胞とを接触させることにより、その表面上に存在するこ のような配列を有するＴ細胞を検出するための試薬とし使用し得る。

あるいは又、化学的又は酵素的合成のような公知の方法を再び使用して、非反復 アミノ酸配列の全部又は一部をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ配列と相補的なりＮ Ａ又はＲＮＡハイブリダイゼーションプローブを製造しうる。ＤＮＡ又はＲＮＡ ハイブリダイゼーションプローブはこれも当業者に公知の適当な条件下でＴ細胞 と接触させることにより、その中にこのようなりＮＡ配列を持つＴ細胞を検出す るための試薬として使用される。

本発明を実施するために、本発明の試薬とＴｉＢ１１とを接触させることにより 得られた複合体が検出しうるちのであることが必要である。このことを達成する ためのよく知られている方法の１つはマーカーとして検出可能な物質（ａ＋ｏｉ ｅｔｙ）を使用することである。つまり、血清又はモノクローナル抗体のための 、検出しうる物質は蛍光色素、放射性の同位体、検出可能生成物を産生する反応 を触媒する酵素、ピオチン又は核磁気共鳴で検出しうる金属イオンでありうる。

同様の検出可能物質はＤＮＡ又はＲＮＡハイブリダイゼーションプローブと共に 使用しうる。

検出可能物質の同一性に依存するが、それでもよく知られている方法を使用して 、検査する被検体からのサンプルと正常被検体からのサンプルの両方の中で形成 された複合体の量を定量することができる。従って、検出可能物質が放射性のと きには、液体シンチレーションカウンターを使用しつる。該物質が標準アッセイ に於ける西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素のときには、分光々度肝を使 用しうる。該物質が蛍光色素であるときに、蛍光計を使用しうる。特に有用な方 法の１つは、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣ３）を含み、それによるとこの方法は 簡便、迅速、正確に実施しうる。

本発明は又、異なる被検体からの臓器を移植した被検体での臓器移植拒絶反応の 検出方法も提供する。この方法は（ａ）Ｔｉ［１ｌｌａを含む適当なサンプ）Ｌ ＜を被検体から採取し、（ｂ）　Ｔ細胞に結合可能でありＴ細胞レセプターのβ 鎖の可変領域内の非反復アミノ酸配列の存在を指示する試薬を用い、該非反復配 列を含み該サンプル中に存在するＴ細胞と該試薬との間に検出可能な複合体を形 成せしむべく適当な条件下に該サンプルと該試薬とを接触させ、正常被検体中に 存在する該配列を有するｌｌ１１１１の数に対する該非反復配列を有するＩｔ！ １の数の増加を臓器移植拒絶と関連させ、 （Ｃ）存在する該複合体の量を定量的に測定し、この測定量と、同じ手順で測定 した正常被検体に対する量とを比較し、臓器移植拒絶反応を検出することを含ん でいる。

例として、以下のものは全て、本明ｉｌｌの目的のために臓器移植として引用す るが、骨髄移植又は皮膚移植片と同様、心臓。

腎臓又は牌臓の移植についての拒絶反応を検出するのに使用しうる。

他の全ての点について、臓器移植の拒絶反応を検出する方法は特定疾患を診断す る方法と同じである。従って、サンプルの形態、検出法等に関する前記のｌｉ論 は臓器移植拒絶反応の検出に際しても適用しうる。

本発明は又、上述の方法に有用な新規の試薬も提供する。つまり、本発明はＴ細 胞と結合でき、■細胞レセプターのβ鎖の可変領域内に含まれる非反復アミノ酸 配列に対する特異性を有する試薬を提供し、正常被検体に存在する該配列を有す るＴｉ胞の数と比較し、被検体での該配列を有するＴｉ１ｌ胞の数が多いことは 対象特定疾患又は移植臓器の拒絶反応と関連している。

本発明は又、配列： Ｇｌｙ−Ｖａｌ−１１ｅ−Ｇｌｎ−３ｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−旧５−Ｇｌｕ−Ｖ ａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｎｅｔ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｖａ　ｌ−Ｔｈｒ− Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｃｙｓを有する新規のポリペプチドも提供する。このポリペプ チドは化学的又は酵素的に合成されえ、それに対する抗体も製造しうる。このよ うな抗体はリンパ腫及び白血病を検出する。更に、このポリペプチドをコードす るＤＮＡ配列に相補的なポリデオキシリボヌクレオチド又はポリリボヌクレオチ ドは化学的又は酵素的に製造しえ、これらの疾患を検出するハイブリダイゼーシ ョンプローブとして使用されうる。

前記の試薬、すなわち、抗体又は核酸ハイブリダイゼーションプローブは、癌、 自己免疫疾患、アレルギー、感染症を含む種々の疾患の患者及び臓器移植の可能 性のある候補者由来のすンパ球をスクリーンするのに使用しうる。１つ以上のこ れらの疾患と特定のＴｉ１ｌ胞■β遺伝子セグメントとの間に見られる相関関係 を使って、これらの疾患の潜在的候補者として正常集団をスクリーンし、疾病中 に患者をモニターするのにこれらの試薬は使用でき、更に、それら試薬を適当な 治療薬を運搬するための治療上の担体としても使用できる。

本質的観察 いくつかの重大な観察が行なわれた。先ず、マウスＴ細胞から無差別に選択した ８個のＶβ遺伝子セグメントのＤＮＡ配列（主としてＣＤＮＡクローン）を決定 した。これらのＴ細胞は機能的ヘルパー及びキラー細胞、Ｔ−細Ｔｍ１！瘍及び 胸腺細胞を含んでいる。文献からの７つの配列と共に得られたこれらのデータか ら、これらの１５の配列は８個の異なるＶβヌクレオチド配列で表されることが 決定された。これらの配列のうちの１つは３回繰り返し、３つの配列は２回繰り 返し、６つの配列は１回線り返す。これらのデータから統計的な問題がでてくる 。即ち、異なる■β配列のプールがあったとして、その全てが同等に表わされる として、上記と同一配列のセットを引き出す確率が９５％であるためにはいくつ の異なる■β配列が存在するか、という問題である。この単純な質問に対する答 えは、９５％の確率でマウス内に２１個の■β遺伝子があることである。

第２に、上記の８つの異なる■β遺伝子セグメント配列のうちの７個をクローン 化し、マウスの肝臓のＤＮＡ中の相同な■β遺伝子セグメントの数を分析するブ Ｏ−ブとして使用した。

文献から他のデーターと共に、得られたこれらのデータから、上記８個のＶβ配 列の内の７つがマウスのゲノム中のたった１つのコピーにより表され、残りのフ ァミリーは３つのメンバーによって表わされるということが出来る。この非常に 小さいファミリーの大きさが重要である。何故ならば、異なるＶβ遺伝子セグメ ントは互いに顕著に異なっており、従って、蛋白質配列に翻訳されると互いに全 く異なるものになることを意味しているからである。これは又、これらの異なる 蛋白質配列からペプチド断片を作ったときには、全く異なる、交差反応性のない 抗体のセットが産生されるだろうということを意味している。

第３に、マウスの異なる血統交配系（ｉｎｂｒｅｄ）の株中に、Ｖβ遺伝子セグ メントの多形性（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）がほとんどないことである。この ことは、全てのマウスが本質的に同じ■β遺伝子セグメントを有しており、した が、それらに対して作った抗体又はＤＮＡプローブはマウスの全ての異なる型と 反応するだろう。同じことがヒトでも真実であると考えられる。

第４に、マウスのＶβ遺伝子中の体細胞の突然変異はＪ及びＤ遺伝子セグメント に完全に限定される。実際、マウスの■β遺伝子セグメントは、どの抗体遺伝子 ファミリーにも見られない体細胞突然変異の全く新しいメカニズムを使用してい る。このことは、マウスＴＩＢ胞しセプター内で、β遺伝子ファミリー中に特異 性の差異を生じさせるために産生されなければならない緻密で深遠な多様性（ｄ ｉｖｅｒｓｉｔｙ）はＪ及びＤ遺伝子セグメント内にあるということを意味して いる。Ｄ及びＪ領域に対し、生じた抗体又はＤＮＡプローブでＴ細胞レセプター のより細密な亜特異性（ｓｕｂｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ）を区別し得ること を意味するので、このことは重大である。従って、例えば、種々の自己免疫疾患 に特異的なプローブを産生させうる。

第５に、免疫グロブリン遺伝子は■遺伝子の全長に亘りその■遺伝子を変化させ るために体細胞の超突然変異（ｈｙｐｅｒｗ＋ｕｔａｔｉｏｎ）のメカニズムを 使用する。Ｖβ遺伝子はこのメカニズムを使用せず、従って、一度Ｖβ遺伝子を 単離し、配列決定すると、■細胞レセプターの不変部分に対するＤＮＡ及び抗体 プローブが作られる。従って、体細胞突然変異が本発明のＤＮＡ抗体試薬を無効 にするだろうと心配する必要はない。

ヒトＴ細胞レセプター系での実験によってマウスの系から導き出された重要な一 般化が確認された。第一は、一連の無作為に選択した腫瘍からｃＤＮＡを作製す る際、同じ■β遺竺子セグメントが繰り返し得られた。このことは、ヒトには比 較的少数の■β遺伝子セグメントしかないであろうことを示す。第二に、研究さ れたヒトのＶβ遺伝子ファミリーのみの大きさは４であり、これは免疫グロブリ ンＨ鎖遺伝子に見られる最小の■□遺伝子ファミリーの大きざである。このよう な観察は改めて、ヒトのＶβ遺伝子ファミリーの大きさが小さいだろうことを示 している。第三に、互いに全く関係のない２人の人間から同じ■βが単離され、 これらの無関係のヒトの両方のヌクレオチドに対しこの■β遺伝子は同じヌクレ オチドであることが発見された。このことは、ヒトＴ細胞レセプター中の多形性 の範囲と程度も又限定されていることを示している。第四に、無作為の腫瘍から のいくつかの異なる■β遺伝子セグメント全てが同じ配列を持つという事実によ っても、ヒト■β遺伝子内には体細胞突然変異メカニズムはないことを示してい る。最後に、ヒトβセグメントに対するＮ−末端ペプチドが作製された。適当な 担体と結合させた後、このペプチドをモノクローナル抗体及びポリクローナル抗 体を産生ずるのに使用した。これらの抗体はインタクトのＴリンパ球の表面上の β−ポリペプチド鎖を特異的に識別する。この重要な観察は、Ｎ−末端ペプチド に対する抗体を作製することができ、特定のＶβセグメントを含有するＴｌｌｌ ｌ上プターを同定するのに使用しうろことを示している。

マウスとヒトとでの観察から、両動物中のＶβ遺伝子セグメントのレパートリ− は非常に限定され、Ｖβ遺伝子のファミリーの大きさは一般に小さく、Ｖβセグ メントを変化させるための超突然変異はないことが示された。

免疫グロブリン遺伝子の研究から予期された特徴と非常に際だった対照を示すマ ウス及びヒトＴ細胞レセプター系に関する５つの特徴がある。第１番目に、９５ ％信頼度で、多分２９以下という非常に少ａの■β遺伝子セグメントがＴＩ胞レ セプターファミリーにあることである。免疫グロブリンのカッパ及びＨＩａ遺伝 遺伝子フリミリは２００〜３００のＶ遺伝子セグメントが考えられている。第２ 番目に、Ｖβ遺伝子セグメントの交差ハイブリダイゼーションファミリーの大き さは非常に小さいことである。同定された８個のファミリーのうち、７個は１つ の遺伝子ファミリーであり、残りの１つはβ遺伝子系に対する３つの遺伝子ファ ミリーである。対照的に、免疫グロブリンのＨ鎖遺伝子ファミリーは４０〜５０ 以上の少なくとも７つの■□遺伝子ファミリーを有し、Ｖ９ファミリーは、１つ のメンバーを持つ１つの■９遺伝子ファミリーを除き、大きさが５〜２５の少な くとも１０個の■５遺伝子ファミリーを有している。第３番目に、■細胞レセプ ターのβ遺伝子ファミリーの■遺伝子セグメントはほとんど多形性を示さないこ とである。■　及びＶ□遺伝子中でに のそれらの対応部分は非常に多形性を示す。第４番目に、Ｊ及びＶ遺伝子セグメ ントでの多様性を大きくする新しい体細胞突然変異機構があることである。実際 、■細胞レセプターは免疫グロブリン遺伝子ファミリーには見られない２つの新 しい組み換えの多様化機構を使用している。従って、Ｔ［１ＩｌｌはそのＤ及び Ｊ遺伝子セグメントを変化させる大きな能力を有している。

Ｒ後に、現在までに研究されていたＶβ遺伝子では体細胞突然変異がないことで ある。対照的に、全ての免疫グロブリン遺伝子ファミリーでの非常に多くの超突 然変異の例がある。

ＴｉＢｆａレセプターの２つの鎖の１つにＶβ遺伝子セグメントの小さなレパー トリ・−が存在するということは、全てのＴ細胞レセプターを見ることができる ようになる一般的な診断試薬が構築されうろことを意味している。２つの方法が 使用され得る。

１つは、５’　Ｖβ遺伝子セグメント配列を蛋白質配列に翻訳し、対応のポリペ プチド断片を合成しうろことである。この断片な適当な担体蛋白質に結合させて 、マウス又はウサギを免疫してモノクローナル及びボリク０−ナル抗体を産生さ せることができる。ヒトの１例で、このようなＮ−末端抗体は細胞表面上のＴＩ ｌ胞レセプターと容易に反応しうろことは既に示されている。

従って、これらの診断抗体は種々のＶβ遺伝子セグメントの各々を有するＴ細胞 の数の比を定急するのに使用しつる。次に、これらＶβ遺伝子セグメントの比を 異なる疾患状態に相関させうる。２つめとしては、異なるＶβ遺伝子セグメント の各々を独自に特徴付けるであろうＤＮＡＮＯ−２を合成するためにＶβ遺伝子 セグメントを使用しうる。次に、末梢血リンパ球からＤＮＡを単離でき、これら の末梢血リンパ球由来のＲＮＡを調べてどの両分が特定の■βセグメントを含有 又は発現するかを決定することができた。

次に、これらの抗体又はＤＮＡ試薬を使って正常人と癌、自己免疫疾患、アレル ギー、感染性疾患の患者や臓器移植の志願者をスクリーニングできる。特定のＶ β遺伝子セグメントと任意のこれらの疾患状態との関連を記録する。次に、−見 正常な患者を同じ試薬でスクリーニングして、将来かかる可能性のある特定の疾 患を予告することができる。特定の疾患状態が特定のＶβセグメントと相関する ために、この疾患状態治療の反応をこれらの試薬でモニターすることもできる。

最後に、これらの試薬を分子運搬系として使用し、特定の疾病状態に関連するＴ 細胞に特異的な治療例を提供しうる。このように、これらの試薬を、正常人をス クリーニングし、病原状態をモニターする診断薬として使用し得、又、治療上に 適用することができる。

原理的には、限られた数の異なる試薬により、■細胞レセプター遺伝子全体を別 々のクラスに分けることができる。Ｖβ遺伝子の多くの多様性はＤ及びＪ遺伝子 セグメント中で発生するため、正確な方法で、疾患の正確な型について、ある種 のＤ−Ｊ遺伝子セグメントと対応するＤＮＡプローブ又はペプチドを厳密な方法 で合成しうる。従って、粗いスクリーニング試薬であるＮ−末端による診断薬を 用いて非常に一般的な一連のカテゴリーに全ての被検体を分け、次に、ＴＩＢＷ ＆レセプターの特異性の型と非常に正確に相関していると思われるＤ−Ｊ領域に 対する同様の試薬を作ることにより診断又は治療手順を微調整すＸ１！Ｉｕ【 １　験シ１−ズ 要」１ マウスＴ細胞レセプターのｖｊｌ遺伝子含む８個のｃＤＮ＾の配列を決定して、 文献に報告されている７個のｖ１遺伝子セグメントと比較した。これら１５個の ｖ１セグメントのうち１個のＶ、遺伝子セグメントは３回現れ、３個は２回繰り 返され、６個は１回だけ現れる。今日までに分析された試料につｂ）で同ＶＪ遺 伝子セグメントの出現頻度を統計的に分析したところによれば、発現ＶＪ遺伝子 セグメントの合計数は２１以下である。この推算値は生殖系列（ｇｅｒｗ＋ｌ　 １ｎｅ）ＶＨ及びＶ、遺伝子セグメトの数よりはるかに少ない、　ＤＮＡプロッ ティングによる試験でもｖ１遺伝子セグメントのレパートリ−が狭ｂ）ことが示 唆されている。この結果から、体細胞超突然変異の頻度が明らかに低いことと考 え合わせて、β鎖体細胞の多様化（ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）がＶａ− Ｄａ−Ｊａ連結（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）に集中していることが想到される。ｖｊｌ 遺伝子びイムノグロブリンＶ遺伝子は互いに極めて類似した構造的特徴を有し、 多様化メカニズムも全部ではないが多くが共通している。

色ｌ Ｔ＋ｉ［ｉｌ胞レセプター遺伝子は顕著な構造的及び機能的異種性を示す細胞表 面糖タンパク質をコードするｌ−３，このような遺伝子の多様性は、無限と思わ れる数の抗原に反応できるというＴ細胞の能力の原因をなす、Ｔ細胞レセプター 分子は膜内在住タンパク質であってα鎖及びβ鎖からなり、各鎖はまた可変部と 不変部とに分割される１−３，各遺伝子の可変部はＴ細胞レセプターの抗原連結 領域を構成すると推測される。マウスの染色体６上に位置するβ遺伝子４−５１ よ、最も十分に研究されたＴ＃１３胞レセプター遺伝子である。

これらの遺伝子は別個の可変遺伝子セグメント（ＶＪ）、多様分割され、これら のセグメントはＴ細胞形成時に再配列されてｖＩｌ遺伝子構成する。このＶβ遺 伝子は２つの不変（Ｃ，、及びＣ，２）遺伝子のいずれかとも結合する！−１２ ゜ｖＪ、ＤＪ及びＪ１遺伝子セグメントハ夫ｔｚ　９３−９５．１−４及ヒ１５ −１７アミノ酸をコードし、完全ｖＩｌ遺伝子組み込まれると完全β鎖可変部を コードする＠−１２．各Ｃｚ遺伝子の５°の位置に集団（クラスター）化された 機能Ｊａ遺伝子セグメントは６つあるｓ　ｓ　ｓ、　２つのＤＩ遺伝子セグメン トは同定された１０−”＊Ｌ１．ｌ遺伝子セグメントはＪｊｌ集団の上流に位置 し、Ｄ１□、、遺伝子セグメントはＪＪ２集団の上流に位置する１０１゜Ｄａ＋ −Ｊａｒ−Ｃ，＋遺伝子集団全体はＤａｚ−Ｊａｚ−Ｃａ２遺伝子集団の５”の 直ぐ近傍に位置する”、　０ａｒ−Ｊａｒ−Ｃａｔ遺伝子集団の上流には未知数 のｖｊ遺伝子セグメントが存在する。これら遺伝子の一般的機構はイムノグロブ リン遺伝子のそれと類似している。イムノグロブリンはＢ−リンパ球系の細胞に よって産生され、可変部と不変部とに折り畳まれるＨ鎖（Ｈ）及びＬ鎖（Ｌ）か らなる、ｖＬ遺伝子はｖＬ遺伝子セグメント及びＪＬ遺伝子セグメントからなり ＋ｉ−＋ｓ、ｙ、ｌ遺伝子はＶｌ、ＤＨ及びＪＩｌ遺伝子セグメントからなる１ ６１７．　’ｌ”細胞レセプターと同様に、イムノグロブリンは極めて多数の異 なる抗原を認識することができる。従ってこれら２種類の分子は互いに類似した 多様化メカニズムを有し得る。抗体の多様性は多くの異なるメ、カニズム、即ち （１）生殖系列遺伝子セグメントの数が多いこと；（２）異なるＶ＝Ｄ及びＪ遺 伝子セグメントの組み換え結合”　”；　（３）遺伝子セグメント連結部位での 連結柔軟性（ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）■−２電；（４ ）結合プロセスにおいてＤ遺伝子セグメントの両側にランダムにヌクレオチドを 付加するＮ−領域の多様性２２；並びに（５）■遺伝子全体を通してヌクレオチ ド置換を１回だけ発生させ得る体細胞超突然変異２１２４によって生起する。

Ｔ細胞抗原認識は、Ｔ細胞がＭＢＣ拘束性と称する現象である主要組紐適合抗原 系（ＭＢＣ）でコードされた細胞表面分子との関係において（連合して）抗原を 認識しなければならないという点で、イムノグロブリンを介する認識と異なる２ ％　２＠、ウィルス感染細胞及び腫瘍細胞を殺すことができる細胞障害Ｔ′細胞 （ＴＣ）は主にＭＨＣのクラスｌ遺伝子産物によって拘束される２フ、ヘルパー Ｔ！ｌｉｔ胞（ＴＩ）はＢ−及びＴ−細胞の応答を促進し得、主としてクラスＩ ＩＭＩＩＣ遺伝子産物により拘束される２＠、Ｂ−又はＴ−細胞の反応を抑制す るサプレッサーＴ細胞（Ｔ、）がＨ）ＩＣエレメントによって拘束されるか否か は不明である２ｇ、　ＭＨＣ分子はマウスにおいては多形性が著しい。

Ｔ細胞によって認識されるＭｌ（Ｃの拘束エレメントは各ＭＨＣ分子上の、対立 遺伝子特異的な多形性の決定基である３０．従って、Ｔ細胞レセプターの多様化 は抗原認識とＭＨＣ認識との両方を備えなければならないことになる。

Ｔ、！胞しセプターの多様性の程度と、抗原／ＭＨＣ認識に対する前記程度の関 係とを決定すべく、機能Ｔ細胞及び胸腺細胞のｃＤＮ＾ＤＮＡラリーからの８つ のｖ１遺伝子を分析した。

これら’Ｊａ遺伝子の配列を文献からの７つと比較した。その結果、１）発現Ｖ 、遺伝子のレパートリ−が小さく、恐らく２１メンバー以下であり、２）ＶＪタ ンパク質上セグメント構造的にイムノグロブリン■セグメントに類似しており、 ３）前述の抗体多様性を生起させる最初の４つのメカニズムがＴ細胞レセプター のｖ１遺伝子によって使用され、４）Ｔ細胞が３つの読み取り枠の総てにおいて Ｄｆｆｌ伝子セグメントを結合し得、その結果Ｖ遺伝子の３′末端で体細胞多様 化が更に生じ、且つ５）抗原及びＭＨＣの特異性と特定β鎖遺伝子セグメントの 使用との間には単純な相関関係は存在しないことが判明した。

ｖＩ遺云公子ァミリーは限られたレパートリ−の　Ｖａ遺伝セグメントを使　す ると戸、われる、胸腺細胞と、ハトのシトクロムＣ反応性ＴＩＩハイブリドーマ １．９．２と、ＭＨＣａｌｌｏ−抗原に特異的な機能Ｔ、細胞系列のｃＤＮ＾ラ イブラリーから得た８つのｖＪ遺伝子のヌクレオチド配列を決定した。これら■ Ａ遺伝子の配列分相瓦間で、且つ文献の７個のｖ、３ｊｉ伝子に対して比較した く第１ａ図、表１）！　３１−３４０分析した１５のＶ、遺伝子のうち６個はＴ Ｉｌ細胞から、２個はＴ、細胞から、６個は胸腺細胞から、１個はＴ細胞腫瘍か ら得たものである（表１）、これら機能細胞の抗原／ＭＨＣ特異性を表１に示し た。特定機能及び胸腺細胞由来の■−遺伝子は不明である。胸腺細胞の９９％は 胸腺から移動しないのであるからｉｓ、胸腺細胞由来遺伝子Ｖｎの一部は非機能 Ｔｍ胞から得られたものであり得る。

１５個のｖＪ遺伝子各々のＶＪ遺伝子セグメントをタンパク配２列に翻訳して第 １ｂ図に示した６分析した１５個のＶ、遺伝子には別個のｖＪ遺伝子セグメント 配列が１０個存在する。後述の理由から、第１ｂ図に示したＶ、遺伝子セグメン トのうち最初の７個はＶＪＩ−７と称し、最後の３個はＶａｔ、＋、ｖ＊ｓ、２ 及びＶｊｌ、２と称する。１つの■１遺伝子セグメントは３回使用され（ＶＪ　 ＋　）　、３つは２回使用され（Ｖａｔ、ＶｎｓＪｎｓ、＋）、６つは１回使用 される（ｖ＃４、Ｌｓ、＋ＪａｓＪＩｙ、ＶＪｓ、２及びＶｊｌ、ｚ）。更に、 我々ノ実験室で６個のＴ、細胞から分離した７個のＶｊ遺伝子の配列及びその他 を含めると、１１個の異なるＶβ遺伝子セグメントが２２の再配列された遺伝子 で使用されることになる。１１の異なるＶａ遺伝子セグメントのうち６つは１回 以上使用されていた。共通ｖｊ遺伝子セグメントは機能Ｔ細胞、胸腺細胞及びＴ 細胞腫瘍Ｂ１１５１４７に現れる。この大きさく数）の試料でｖｊ遺伝子セグメ ントが繰り返し使用されているという事実は、発現ｖｊ遺伝子セグメントのレパ ートリ−が小さいことを示唆する。

この仮定には総てのｖ１遺伝子セグメントがランダムに（ｒａｎｄｏａ＋Ｉｙ） 発現されるという前提が必要である。この前提にたてば、ｖＪ遺伝子セグメント のレパートリ−の大きさに係わる問題を統計的に処理することができる。

氏」 １゛　されたＶ、　−の、び 岨違伝ヱＺ之丞　胆胞珠　創Ｖ皿（４）１ユ　ｋ　販　Ｊａ　ｒｅｆ。

３１１．２５　Ｔ、　Ｃ５７ＢＬ／６　鶏卵リソ゛チーム／Ｉ−＾　３　１．１ 　１．２　３４Ｃ５ＴＩ］　Ｃ５７ＢＬ／６　ＤＮＰ−オネ゛アルア゛ミシ／■ −＾　８．１°２．１　２．５　３３ＥＩ　Ｔ＋＋　ＢＡＬＢ／ｃ　ＴＮＰ＊＊ ／Ｉ−八　２　１．１　２．２　３３ＬＢ２　Ｔ、Ｃ５７ＢＬ／６　鶏ＲＢＣ＊ ＊＊／Ｉ−＾　６　２．１　２．３　３３八ＲＬ　Ｔｃ　Ｃ５７Ｌ　Ｈ−２２１ ，１２，５＊８６ＴＩ　胸ｉ細胞　ＢＡＬＤ／ｃ−１１，１１，３３１ＴＢ２　 胸＋ｉ細胞　Ｃ５７ＢＬ／ｋａ−８，２°２．１　２．５　＊ＴＢ３　胸腺細胞 　Ｃ５７ＢＬ／ｋａ　＝　４　２．１　２．５　＊表１■■ｌ し遺伝子　久之ム　胆胆株　癲り泄（イ）１ユ　Ｖ、販　Ｕ　匹ｆ。

ＴＢ２１　胸腺細胞　ＢＡＬ［！／ｃ−５，１２，１２，６＊ＴＢ２３　胸腺細 胞　ＢＡＬＢ／Ｃ−８，３“　ＮＤ　ＮＤ　零Ｂ厨５１４７　腫瘍　＾ＫＲ−１ ２，１２，５＊＋　ＶＪＩサブファミリーの３つのメンバーはＶＪＩＩ、Ｖｊａ 、２及びＶｊａ−３と称する。

＋十　再配列ｖＪ遺伝子にはＤＩ遺伝子セグメントがほとんど残らないため、と のり、遺伝子セグメントが配列に関与したかはわからない。

零　本明細書 ＊＊トリニトロフェノール 零＊零　赤血球 ＮＯ測定不可 ここにＬ種類のＶＪ遺伝子セグメントがあり、これらがプールから同等の確率で ランダムに選択されるとすれば、観察された結果が得られる確率（ｐ）は 式中、ｍｌ　＝　１回現れた異なる種の数ｍ２＝２回現れた異なる種の数、 ｍＨ＝Ｎ回現れた異なる種の数、 ｉ＝１ 逆に、観察された結果が与えられていれば、正確にＬ個の種がプール中に存在す るという前記仮定の相対的可能性は、前述のデータではＮ＝２２、Ｍ＝１１であ る。Ｌの値レパートリ−を選択し、各値をＮ；２２の場合に値８＝１１に達する 確率に関してテストすれば、９５％の信頼度でｖｊ遺伝子セグメントファミリー の大きさが２１以下であることが判明する。このマウスｖＪ遺伝子セグメントレ パートリ−の大きさの推算値は、マウスイムノグロブ！Ｊ　ンＶＲ（＝１００− ３００）又はＶ　（＝１００−３００）遺伝子セグメントファミリーより小さい が０　ｆｆ？、マウスＶλ（２）レパートリ−よりは大きい目、シかしながら、 マウスλ鎮は成熟Ｂ細胞の数％でしか発現されず、β鎖は分析したＴ、Ｉ及びＴ ｃ細胞の総てにおいて発現されている２＠３９゜各Ｖ、遺伝子セグメントが同一 の確率でＴ細胞集団中に発現されるのか、又はＶβ遺伝子のサンプリングが完全 にランダム的であるのかは不明である。実際、観察されるｖｊ遺伝子セグメント の相対的発生率はＶ、遺伝子セグメントの小さいサブセットの多用によっても説 明がつく、シかしながら、同−ｖＪ遺伝子セグメントが、機能Ｔ細胞と非選択胸 腺細胞との間で差異のみならず抗体認識及びＭＨＣ拘束性においても異なってい るようなＴ細胞によって使用されるという事実（表１）は、発現Ｖ、遺伝子セグ メントの有効レパートリ−が恐らくは極めて小さいことを示す、従って、生殖系 列Ｖｊ遺伝子セグメントの数が極めて多いことはＴ細胞レセプターの多様性の主 要因とは考えられない。

マウスｖ、「−セグメントの　部　は単一　ｆ−ブファミ１−として　る。

ｖＪ遺伝子セグメントのレパートリ−の大きさを計算する別の方法は、分離した ｖ１遺伝子セグメントを特異的ハイブリダイゼーションプローブとして使用して 、マウスゲノム中の交差ハイブリダイズするｖＪ遺伝子セグメントの数を測定す ることからなる。この方法はｖ６遺伝子セグメントに対する大きな相同性を共有 するｖＩ遺伝子セグメントの識別に限定されてはいるが、統計的に予測される前 記数値に比肩する値が得られる。この種の分析をマウスｖＲ及びＶに遺伝子セグ メントプローブを用いて実施したところ、■遺伝子セグメントは総て複数の異な る多重遺伝子サブファミリーの１つに属することが判明した３＠３７゜マウスに はメンバー数２〜４０個分以上の大きさのｖＲサブファミリーが少なくとも７個 あり、メンバー数２〜２０個以上の大きさのｖ９サブファミリーが少なくとも５ つあると思われる０　３？、　７５％以上の類似性を持つ■遺伝子セグメントは 同一サブファミリーに属するものと規定した。この種の分析から、ｖ日及び■に 遺伝子セグメントの合計レパートリ−は各ファミリー毎に約１００〜３００のメ ンバー数に相当することが推定された３１！　２１゜表−ス １０個の■１遺伝子セグメントの相同マトリクスＶａｓ、＋　Ｖｎａ、２ＶＪ１ ．３　Ｖａｉ　ＶＩｔ　Ｖ、＋　Ｖｎｚ　Ｖ、＜　Ｖａｚ　ＶＪＳ■□、−−９ ０”　７７　４７　５２　２９　２６　２８　２７　２９■□、２　９２−８１ 　４５　５２　２９　２４　２８　２６　２６Ｖ□、、　８５　８８−４１　４ ８　２８　２３　２８　２９　２４Ｖ□　５５　５４　５４−４３　２７　２７ 　２９　２５　２２ＶＪ７　６１　６３　６０　５３−２８　２３　２７　２３ 　２９Ｖ、、　４５　４３　４４　４５　４９−３３　５３　２０　３７Ｖｊ、 　４６　４７　４７　４６　４８　５０−３０　１８　３７ＶＩ４４６　４６　 ４６　４７　４７　６２　５０−２０　３３ＶＪ２　４２　４４　４２　３９　 ３９　３４　３８　３８　−−　１８Ｖ、ｓ　４５　４６　４３　４１　４８　 ５３　５４　４７　３８　−＋　Ｔ／＋ｎはサブファミリーを表す。

＋十　対角線の上の数字はタンパク質レベルで比較した時のＸ軸及びＹ軸上の配 列の類似性％を表し、斜線の下の数字はＤＮＡレベルでの類似性％を表す。

表２から明らかなよう？＝　、ＴＢ２．ＴＢ１２、ＴＢ２３ノＶａ遺伝子ニヨり 使用される１０個の異なるｖ１遺伝子セグメントの間の類似性割合は８５〜９２ ％である。これは、これらの遺伝子が同−ｖＩサブファミリーのメンバーである ことを意味する。これらノｖＩ遺伝子−１＝グメントニハ夫’Ｚ　ＶｊＳ、Ｈ１ Ｖｚ＠、２、及びＶｚｍ、ｚトいう呼称を与えたく第１ｂ図）、残りのｖｊ遺伝 子セグメントの間の類似性は３４〜６３％である。従って、これらＶ、遺伝子セ グメントは各々異なるｖ６サブフアミリーに属する０種々のｖｊサブファミリー の大きさを決定すべく　、Ｖｊ、　、Ｖ、、、Ｖ□、ｖｊ、及びＶＪＩサブファ ミリーのＤＮＡ１０−ブを使用してマウス肝臓ＤＮＡをサザンプロット（Ｓｏｕ ｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ）分析にかけた（第２図）、前記■プローブのうち３つは 単一バンドを示すが、これは各ｖＩ遺伝子セグメントが異なる単一遺伝子セグメ ントサブファミリー（Ｌｌ、Ｖａｚ及びＶｊ４）を表すことを意味する。

ＶａＳ及びＬｍサブファミリーはメンバーを夫々２個及び３個有すると思われる （第２図）。

ＴＢ２１Ｖ遺伝子により使用されるＶ、遺伝子セグメントはｖ、ｓサブファミリ ーの最初の分離メンバーであるため、これにはＶｊＳ、Ｉという名称を付けた（ 第１ｂ図）、既に述べたようにｖｊＩ、Ｖａ２．Ｖａ３、Ｖａｂ及びＶ、ｔサブ ファミリーは単一遺伝子である６３１−３４．このようにして、メンバーを１つ 持つ６個の異なるｖＩサブファミリーと、メンバーを２つ持つ１つのｖｊ遺伝子 セグメントサブファミリーと、メンバーを３つ持つ１つのｖ１遺伝子セグメント サブファミリーとが同定された。　Ｍａｌｉｓｓｅｎ他により特徴付けられた他 のｖｊ道伝子セグメント（投稿準備中）も含めて、マウスには少なくとも１２の Ｖ、遺伝子セグメントが存在する。■、遺伝子セグメントファミリーの大きさに 関するこの最小推定値は前述の統計的分析によって示された値の範囲内にあり、 ｖ、ｉ転子セグメントのレパートリ−が小さ、いという前述の仮定と合致する。

６つの単一メンバーサブファミリーを有するＶ、遺伝子セグメントファミリーは 、各々がメンバー数２〜４０以上のサブファミリーを５つ以上有するイムノグロ ブリンｖＩｌ及びＶに遺伝子ファミリーのＶ／遺伝子セグメントファミリーとは 異なる３ｓ　ｓｒ０種々のｖ、１０−ブを用いて分析した複数の譬歯種とウサギ とヒトとからのＤＮＡのサザンプロットは、単一メンバーｖＩサブファミリー配 列が少なくとも１つのＶ、サブファミリーのメンバーより速く拡散（ｄｉｖｅｒ ｇｅ）　したことを示している３３．これは、抗原認識及びＭＨＣ認識の両方を 備えるためには、ｖＩ遺伝子の多形性をイムノグロブリンＶ遺伝子セグメントよ り大きくする必要があることを示すものであることが示唆された３３．別の説明 として我々は、この明らかに速い単一メンバーサブファミリー拡散は、単一コピ ー遺伝子が通常不変的な遺伝子修正（ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）メカニズム、例え ば遺伝子変換及び相同ではあるが不等な交差（クロスオーバー）に関与できない ことに関連しているという説を推奨する４１４２．これらのメカニズムの速度（ ｒａｔｅ）は関与配列間の類似度に左右される。従って、多重遺伝子ファミリー では遺伝子変換及び不等交差の速度が大きくなえする６例えば、マウスＨ−２に 変異細胞の１つのグループは頻度２．２ｘｌＯ−’／座／配偶子で遺伝子変換に より生起するが、典型的変異速度は１Ｏ−５〜１０−　＠／座／配偶子である４ ３．相同ではあるが不等な交差は多重遺伝子ファミリーを周期的に膨張（ｅｘｐ ａｎｓｉｏｎ）及び収縮（ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ）させ、それにより創始者効 果を通してこれらファミリーの同時進化を促進する４４．遺伝子変換及び不等交 差は類似した配列をファミリー内に保持しておこうとする傾向を示すため、これ らのメカニズムは遺伝子ファミリーの拡散速度を単一コピー遺伝子のそれより低 くする上で重要な役割を果たし得る。３メンバーＶｊｌサブファミリーが単一メ ンバーＶａサブファミリーより良く且つＴ１５ｖ、ｌサブファミリーと同程度に 保存され、複数の哺乳動物種の間で大きさに変化を生じるという現象は前述の説 と合致する３３．更に、アミノ酸置換対遺伝情報として発現しない（サイレント ）ヌクレオチド置換の比に基づ＜ＶＪＢサブファミリーのメンバーの間の拡散速 度の計算も行なわれた（データ示さず）、その結果はＴ１５Ｖ□サブフアミリー のメンバーに関する計算値に類似している（Ｇ、ＳＩｕ、未公開報告）、そこで 我々は、単一メンバーＶ、サブファミリーの明らかに速い拡散が恐らくは遺伝子 変換及び不等交差の均一効果（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｉｎｇ　ｅｆｆｅｃｔ）にア クセスできないことに起因するものであって、より大きい変異速度を選択するこ とに起因するのではないと結論する。単一メンバーサブファミリーがＶＪファミ リーにのみ生じたように見える理由は不明である。これに関して更に留意すべき こととして、ｖ１偽遺伝子が全く見出だされなかったのに対し、■、遺伝子セグ メントの少なくとも３０％は偽遺伝子である３６゜これらの観察から、どのよう なメカニズムが他のＶ遺伝子ファミリーに見られる重複プロセスの遅延の原因な のかという問題が生じる。

■、遺伝子ファミリーは種々のタ様イ′メカニズムを　るこれらメカニズムの　 るものはイムノグロブリン遺伝　ファミ１−の　れと　伏してお　るものはみれ と　する。

限られた数のＶ、遺伝子セグメントが同定されたという事実にも拘わらず、テス トした１５のＶ、遺伝子配列は組換え（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ）メカニズ ム及び体細胞突然変異メカニズムに起因して総てが互いに異なる（第１ａ図）　 ｇ　）＋−３４゜■１遺伝子アセンブリに対する生殖系列、組換え及び体細胞突 然変異の作用を下記に述べる。

良１Ｌ片 β遺伝子ファミリーは、生殖系列Ｖ、及びＤβ遺伝子セグメントの数が明らかに 限定されているという点で、それの■８等価物とは異なる。第１に、発現■β遺 伝子セグメントのレパートリ−は２１以下のメンバーから成り立っていると思わ れるが、Ｈ鎖のレパートリ−は１００〜３００の生殖系列ＶＢ遺伝子セグメント を含み、そのうち３０％が偽遺伝子である３６゜第２に、生殖系列Ｄａ遺伝子セ グメントの数は不明であるが、連結柔軟性とＮ−領域多様化とが場合によっては 元の生殖系列Ｄｒ遺伝子セグメントのヌクレオチドを３つしか残さない程十分に 大きいと仮定すれば、再配列ＶＪｉｉ伝子内転子つかったＤセグメントの総てが 先に同定された２つのり、遺伝子セグメントから誘導され得る（第３図）。ｖＨ 遺伝子アセンブリでは生殖系列Ｄセグメント全体の欠失が観察された（Ｆ、＾１ ｔ、私信）、従って、Ｈ鎮座が少なくとも１０〜２０のり、ｌセグメントを有す るのに対し、Ｄ、遺伝子セグメントは少数、恐らくは２つしか存在しないと思わ れる４５．最後に、明らかに機能遺伝子と思われるＪ、３１ｉ！伝子セグメント が各Ｊ。

遺伝子集団毎に６つずつ、合計１２個存在する６　＄　９．　ｖＩｌ遺伝子は４ つのＪＢ遺伝子セグメントを有する１ｇ　４＠　４？。

１Ｌ 組換え結合はいずれかのＤ□遺伝転子グメントを任意の下ｍ　Ｊ　Ｊ　ｍ転子セ グメントに結合せしめる（６個のＤ□１Ｊ□＋６個）Ｄａ＋Ｊｓ２＋６個ノＤａ ２Ｊｚ２＝ｌＳＤｓ　ＪＪ再配列）０個々ノ’Ｖｚ遺伝子セグメントは任意のＤ ａ　ＪＪ再配列に結合すると思われる（　２１　ｘ　１８＝　３７８ＶａＩｔ伝 子）、Ｄ、１配列及びＬ２＋配列は各々分析試料中で試料数のほぼ１／２の割合 で使用され、ＤＪＩ−Ｊ１□結合はＬＩ　ＪＪ＋結合と同じ頻度で生起する（３ 対３）（表１）、８つの異なるＪｊｌ及びＪｊ２遺伝子セグメントが使用され、 Ｊ１□は１４の例のうち１１例に使用される。従って、個々のＶ遺伝子セグメン トが２５％の使用割合でＪｕｌ遺伝子集団と結合し、且つ７５％の使用割合でＪ １□遺伝子集団と結合することが予想される。これは実際に観察される減少であ り、従ってＤａ　Ｊｓ結合がランダムに生起するという主張を支持する。しかし ながら、Ｊ、□、、遺伝子セグメントは１１回のＪＪ２集団使用数のうち６回使 用される。このようなＪａ２．Ｓ遺伝子セグメントへの偏りが抗原の選択効果又 はＤＮＡ再配列プロセスに関与するメカニズムを表すのか否かは不明である。

その他にも２つのメカニズムが存在し得る。Ｄ遺伝子セグメントを包囲する非対 称認識配列が潜在的にＬ　Ｊａ及びＤａ　Ｄａ結合を可能にするというのである １Ｇ−１２，この可能性を裏付けるデータは提出されているが４８、これらのデ ータの解釈は、ｖＩ遺伝転子グメント再配列時にＤ遺伝子配列が損失され得るた め困難である。今までのところ、これらのメカニズムを立証するものはなく、従 ってこれらの結合が生じたとしても頻繁ではないと思われる。

獣」ｌｌ１ 遺伝子セグメントの結合における連結柔軟性を第１ａ図及び第３図に示した。１ 〜６までの個数の付加ヌクレオチドがＤ遺伝子セグメントの両端に見られる。興 味深いことに、イムノグロブリンＮ−領域の多様性に関する報告２２とは対照的 に、このＮ−領域多様化にはに／Ｃ９ｉす（５０％）が存在しないように思われ る。

Ｔ細胞には、それだけに見られる特異な体細胞変異メカニズムが存在する３４． ＤＩ遺伝子セグメントが３つの翻訳読み取り枠の総てにおいてＶβ遺伝子セグメ ントと結合し得るのである。この場合の唯一の必要条件はＬ　Ｊ、及びＶ、ＤＪ 結合がオープンな読み取り枠内にＪ、配列を残すことである（第４図）。これに 対し、公開及び未公開の約６０のｖＩＩ遺伝子を調べると、Ｄ、遺伝子セグメン トは１つの翻訳読み取り枠内でしか結合できない（引例３４及びＴ、Ｈｕｎｋａ ｐ　ｉ　Ｉ　ｌｅｒの未公開報告）、この観察はａｒｓｏｎａｔｅに対する免疫 反応に関与するｖｌＩ遺伝子についても見られた４９．３つのＤａ翻訳読み取り 枠が全部使用されると、Ｖ、Ｄａ結合によって生じる多様性が原則として３倍に なる。

イムノグロブリン遺伝子の体細胞超突然変異はＢ細胞発育（ｄｅｖｅｌｏｐ＋１ ｅｎｔ）の後期に、恐らくは抗原への露出によって生起するｓｏ、生殖系列ＶＩ ３遺伝子セグメントは、シトクロムＣ６に特異的な７Ｍ細胞由来の２８４　Ｖ、 遺伝子セグメント、並びに鶏卵リゾチームに特異的なＴ、細胞由来の３Ｈ，２５ Ｖ、遺伝子セグメントと同じである３４．このように、前述の２つの例における ■−遺伝子セグメントの体細胞超突然変異を立証するものは全くなかった。これ に対し、最近になって、体細胞変異はｉｎ　ｖｉｔｒｏでａｌｌｏ−反応性Ｔ細 胞中に発生し得るという報告がなされた。ただし、この観察の生理学的関連性は 不明である。３つのＶＪＩの間には２つのヌクレオチド置換が見られ、配列決定 された２つのｖ１□遺伝子セグメントの間には２つのヌクレオチド置換が見られ た。これらは配列決定されている（第１ａ図）コ１３コ、　８６ＴＩＶ、＋と１ ．９．２及びＢＷ５１４７ＶＪ＋遺伝子セグメントとの間には単一の遺伝情報と して発現しないヌクレオチド置換が存在し、Ｂｌ’１５１４７Ｖ。

遺伝子セグメントと８６Ｔ１及び１．９．２Ｖ、遺伝子セグメントとの間には単 一のアミノ酸交換置換が存在する（第１ａ図及び第１ｂ図）３１．これらのＶ、 配列は３つとも異なるマウス細胞株から誘導されたものであるため（表１）、こ れらの差異は細胞株の多形性に起因し得る。一方、＾ｒｌＶ、２及びＥＩＶｊａ 配列間のヌクレオチド置換、即ち遺伝情報として発現しない置換１つ及び交換置 換１つ（第１ａ図及び第１ｂ図）３３は細胞株の多形性（表１）又は体細胞超突 然変異に起因し得る。

この問題は、異なるマウス細胞株からの生殖系列ＶＪＩ及びＶＪ２遺伝子セグメ ントの特徴付けによって明らかにされよう、繰り返し発現されるｖｊ３及びｖｌ 、１遺伝子セグメントの間には他に差異は存在しない（第１ａ図及び第１ｂ図） 、更に、関連したＪ１遺伝子セグメントは推定Ｎ−領域の外では体細胞超突然変 異によって説明され得るヌクレオチド置換を全く持たない、九又はＶ、遺伝子に 関して比較の試料分析を実施すれば体細胞超突然変異の例が観察されたであろう 、従って我々は暫定的に、体細胞超突然変異が正常な生理学的条件の下で生起す る場合には、イムノグロブリン遺伝子伝子における前記変異の速度よりｖｊにお ける速度の方がはるかに遅いと結論する。

ＬＩＬｍは　゛告白・にイムノグロブリン■１１りに１伏して匹Ｌ Ｖβ遺伝子は遺伝子機構と多様化メカニズムの多くにおいてイムノグロブリンＶ 遺伝子に類似しているが、■遺伝子セグメントレパートリーと、■遺伝子セグメ ントサブファミリー機構と体細胞超突然変異の相対的使用とにおいてはイムノグ ロブリンと異なるように思われる。我々はこれらの類似点及び相異点がＶ、遺伝 子セグメント及びこれと等価のイムノグロブリンのタンパク質構造にどの程度反 映されるかを測定したいと考えた。

タンパク質レベルでの蒸飯性の％（表２）は異なる■１サブファミリーの間では １８〜５３％、ｖｌ、サブファミリーメンバーの間では７７〜９０％である。こ の値範囲はこれまでにマウスｖｌｌセグメントに関して観察された値（３４％） より低い値（１８％）にまで至るものの、既知のヒトｖＩＩセグメントの間でｔ ！！察された最低値（２４％）に近い（データ明示せず）。

後述のごとく、前記ヒトｖＭセグメントのセットは恐らくマウスｖｌセグメント より適切にｖｌｌファミリー全体を代表する試料である０例えば、異なるｖｊ上 セグメント間総合変化は大きくなり得る（８２％）が、イムノグロブリン■サブ フ間に見られる変化（７６％）を大幅に越えることはない。

Ｖａｍ伝子転子メントファミリー内の配列変化を分析する別の有用な手段はＶセ グメンＩ・間の変化の分布を測定することである。　Ｋａｂａｔ及び−Ｕはイム ノグロブリンＶ領域間の前記分布を、各アミノ酸位置で可変性（ｖａｒｉａｂｉ ｌｉｔｙ）と称す、るパラメータを測定し且つプロットすることによって分析し たト２．この分析から可変性は均等に分布されている野ではないという結論が出 された。即ち３つの領域が相対的「超可変性（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｉｌｉＬ ｙ）　Ｊを有することが発見された５２．これらの領域は■配列の約１７３を占 め、超可変領域と称され且つ抗体分子の結合のための割れ目（ｃｒｅ−ｖｉｃｅ ）を構成するとされてきた５３−５５．これら超可変領域のうち２つは■遺伝子 セグメントによってコードされ、残りの１つはＶｕ　ＤＩＩＪ＋又１．ｔＶｔ、 −ＪＬｍ台６ｉＭ内４ｍ存在ｔル”。

我々は同様の可変性分析を１０個の翻訳されたマウスＶｊ遺伝子セグメントに関 して行った（第１ｂ図）、結果を前記総てのヒトｖＨセグメントセットの可変性 プロット、及びαアミノ酸基をブロックしな１８のヒトｖ８セットからなるセッ トの可変性プロットと比較した（第５図）、この比較にヒトセグメントを選択し た理由は、ヒトｖＨセグメン１−が配列決定されたどのマウス■セグメントセッ トよりもランダムにｖｌｌ配列を表すからである。これはＶ、配列と比較して、 マウスｖＪＩ配列が２つの点で高度に選択されてきたためである。第１の点とし て、マウスｖＩＩ配列は比較的限定された数の抗原を認識するイムノグロブリン から通常誘導されるからである。第２に、技術上の理由からマウスＶヨ配列は、 マウス血清イムノグロブリンの８０％がαアミノ基がブロックされたＨＭを有す るという事実にも拘わらず、はぼ全面的に、αアミノ基ブロックを解除したＨＭ に基づいて決定されるＳ７からである。これに対し、ブロックされたヒトｖＭ配 列は種々の腫瘍と、他の病気にかがった患者とがらランダムに選択したものであ る５６．我々はマウスｖ１セグメントの可変性分布（第５ａ図）がαアミノ基を ブロックしたヒトｖＩＩセグメントセットの可変性分布（第５ｂ図）と著しく類 似していることを発見した。ヒトｖＩｌセグメントの総てのセットの可変性分布 く第５ｃ図）は、マウス配列に関して説明した理由から、αアミノ基をブロック したヒトＶ□セグメントはどランダムな試料ではなく、従来定義された２つの超 可変領域で一層顕著な可変性を示す、ヒトｖＩ！配列の総てのセットはまた、よ り低いバックグランド可変性を示す、その理由の１つはサンプリングの幅がより 大きいことにある。このように、試料の幅と選択とを考慮すると、ｖ１セグメン トの可変性分布とｖＩＩセグメントの可変性分布は互いに余り違わないという結 論に至る。我々はまた、先に示唆されたように、イムノグロブリンＶ領域と比較 してＶＪ領領域新しい超可変領域を有する３３という従来の議論には無理がある と考える。

我々は更に、Ｖ、セグメントとイムノグロブリンセグメントとを、これら分子の 重要な構造特徴を反映すると考えられる２つの特性、即ちβプリーツシート形成 能力の分布Ｓ＠と、予測される疎水性プロフィルＳｇとに関して分析することに よって比較した。これらの分析の結果はマウスｖ４、ｖ８及びＶにセグメントに 関してｃ、ｔはぼ同じである（第６図）。

ｖｊプロットに見られないｖＭとＶにのβプリーツシートプロットにおける付加 ピークは、この領域の種々のｖ、ｌ及びｖ９セグメントの長さ変化に起因する人 為的結果である。ｖＪはまた、イムノグロブリンで鏡開構造相互作用において重 要と考えられる残基と本質的に同じグループの残基を保持する（データ明示せず ）。

これらの結果はＶ、、Ｖ、ｌ及びｖ９領域の一般的な生化学的特徴と予測される 二次構造とが互いに類似しているという説を強く支持するものである。従って、 我々はＴ細胞レセプター及びイムノグロブリン分子が恐らく類似した３次構造に 折り畳まれると予想する。従って配列の可変性及び構造予測の分析からは、イム ノグロブリンＶ遺伝子セグメントとｖｊ上セグメントの間に決定基の認識への係 わり方について何らかの基本的差異が存在することを立証するものは見出だせな い、この結論はＭＨＣ拘束性抗体がインフルエンザ抗原に対して産生されたとい う観察によって裏付けられる６０、この観察は、Ｔ細胞レセ１り一の構造と抗原 及びＭ）ＩＣ拘束エレメントを認識する能力とに間しては、構造的にユニークな ものは一切必要とされないことを意味する。

■１選仁子の　造　びレパートリ−と　原　ＭＨＣｌ　とのｌ」 Ｔ：４胞はある１つの種に存在する多形性ＭＨＣ分子の全領域に関してＢ細胞に より認識される抗原と類似のセットを認諾できる。従って、Ｔ細胞レセプターの レパートリ−は少なくともイムノグロブリンのレパートリ−に等しいことが予想 される。我々の観察は、β鎖遺伝子が限られた数のｖ１遺伝子セグメントを使用 し、体細胞超突然変異が希であるか又は存在さえしないということを示唆してい る。しかしながら、■、遺伝子レパートリーがイムノグロブリンＶ遺伝子のレパ ートリ−と余り変わらないかもしれないという理由は幾つかある。第１に、■、 遺伝子セグメントはほんのわずかしかなくても、それらは通常別個のサブファミ リーとして分布される。これらのｖ１サブファミリーは種々のｖＩＩサブファミ リーと同様の配列多様性の全体範囲を示す、第２に、ｖ１遺伝子セグメントの数 はｖ、Ｉ又はｖＫ遺伝子セグメントの数の１７１０〜１７３であり得るが、■、 ｌ及びＶに遺伝子セグメントの少なくとも３０％は偽遺伝子である。更に、Ｊｚ 遺伝子セグメントの数はＪｌｌ又はＪイセグメントの数の３倍であり、ＤＩ及び Ｄ＋＋遺伝子セグメントの翻訳能力は互いに類似していると思われる。第３に、 イムノグロブリンＶ３１！伝子における体細胞超突然変異の主な役割は、より広 範囲の抗原認識を発生させることではなくて、抗体の抗原結合親和力を増加させ ることにあり得る５１　＆＋、第４に、β鎖及びイムノグロブリンは両方とも連 結柔軟性とＮ−領域多様化とを使用する。これらの連結柔軟性及びＮ−領域多様 化は決定基認識に関与する分子の特異的領域内での多様性発生の主な原因である 。従って我々は、我々の観察によって示唆された、発現Ｖ、遺伝子セグメントの 数が限定されていることと体細胞超突然変異の使用が希であることとは、必ずし もβ鎖レパートリ−が限られていることを反映するものではないと結論する。こ れらの観察はむしろ、β鎖の体細胞多様化が■１遺伝子の３″部分により集中し ていることを意味すると考えるのである。

■ｊ遺伝子の明らかに低い体細胞超突然変異頻度については２つの説明が可能で ある。第１に、ＢｆｌＩ胞の体細胞超突然変異は主としてイムノグロブリンのク ラススイッチに関連し、Ｂ細胞分化の後期に生起する２３．この時の体細胞超突 然変異の役割は主に特定刺激抗原に対する抗体の結合親和力を増加することにあ ると思われる。Ｔ細胞レセプターは、Ｔ細胞反応に必要な親和力が小さいこと、 又はＴ細胞表面上の補助分子（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ）が安定 効果を有することのいずれかに起因して、より低い結合親和力で作用し得る。従 って、Ｔ細胞は体細胞超突然変異によって得られる補足的体細胞変化からは何の 利益も受け得ない、第２に、体細胞超突然変異はＴＭＡ胞に対して選択され得る 。

Ｂ細胞では体細胞超突然変異は発育の後期、抗原刺激の後で生じる。Ｔ細胞では 、末梢での自己反応性調節又は細胞障害Ｔ細胞の発生を阻止すべく、体細胞超突 然変異が発育の後期、免疫担当細胞が胸腺から移動した後で生じるのではないと いう可能性がある。従って体細胞の多様化はＴ細胞発育の早期にのみ生起し得、 その結果体細胞変化から生じる自己反応性細胞が胸腺によって除去されると考え られる。Ｂ細胞は調節Ｔ細胞の強い影響に起因してこのような制限を受けず６２ 、従って抗原刺激に反応してＢリンパ球発育の後期に体細胞超突然変異を生じ得 る。

表１は特定■Ｉ遺伝子セグメントと個々の抗原特異性又はＭＨＣ拘束エレメント との間に単純な相関関係は存在しないことを示している。例えば、ｖｊ！遺伝子 セグメントはＴＮＰに特異的なＴ、細胞と、Ｉ−Ａ　ＭＨＣ分子（Ｅｌ）と、Ｈ −、Ｄ’ａｌｌｏ−抗原（ＡＲＩ）に特異的なＴ、とによって使用される。■□ 及びＶ。領域が、前述の我々の分析によりＶａに関して示唆されたように、それ らのイムノグロブリン等個物と類似の方法で折り畳まれるとすれば、これら２つ の鎖は抗原プラスＭＢＣの結合部位の発生において重要な役割を果たすことにな る。従っていずれかの鎖が抗原又はＭＭＣのいずれかを別個に認識する特定の役 割を持つという説を信じる理由は全くない。

第２実験シリーズ ＨＴＬＶ−１は極めて悪性な形懇のヒトＴ細胞リンパ腫、ヘルパー表現型のヒ） Ｔ細胞リンパ腫（Ｌｅｕ３／Ｔ４及びＬｅｕ３／Ｔ３発現）と関連する。レトロ ウィルスＨＴＬＶ　−１に関する従来の結果は、該ウィルスがＨＴＬＶ関連及び 非ＨＴＬＶ連のＴ細胞リンパ腫及び白血病に結合することを示した。このウィル スの細胞結合部位の決定が望まれでいた。第６図は、■−リンパ腫細胞系Ｊｕｒ ｋａｔに結合するＨＴＬＶ−１のローダミンラベル化ウィルス調製物を示す。ｌ ：１非ラベル化（ｃｏｌｄ）ウィルス阻害後に蛍光の減少が観察された。これら のグラフは細胞当たりの結合ウィルスのＦＡＣＳ分析をバックグラウンド蛍光と の比較として示す。これまでに、この結合が形質転換Ｔリンパ球だけに特有であ り、ＨＴＬＶ−Ｉウィルス粒子を産生ずるときでもｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｔ細胞系 （Ｇ１１）及び末梢血管リンパ球は実質的な量のラベル化ウィルスの結合を示さ ないことが判明している。従って、これまでに試験した大部分のＴ細胞系でウィ ルス結合は形質転換特異的であると考えられる。今日まで試験しに系は、Ｔ細胞 ＡＬＬＳＣＥＭ−ＣＣＲＦ、　８４０２、Ｊａｒｋａｔ、　ＨＰＢ−ＡＬＬ、並 びにｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ＨＴＬＶ−Ｉ発現細胞系、例えばＨＵＴ−１０２、Ｇａ ｎｎ５ｉｎｖｉｔｒｏ形質転換Ｔ細胞系ＭＴ−２及びＣ９２ＰＬである。今日ま で、ＨＴＬＶ−Ｉレセプターを発現しないＴ細胞リンパ腫はＨＵＴ−７８ときの こ状フンゲス細胞系とＭＯＬＴ−４だけであるｅ（ＭｃＧｒａｔｈ、Ｍ、Ｓ、及 びＷｅｉｓｓｍａｎ。

１、Ｌ、、Ｈｕｍａｎ　Ｔ−ｃｅｌｌ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｌｙｍｐｈｏｍａ　 Ｖｉｒｕｓｅｓ％Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ％Ｉ）、２０５〜２１５（１９８４）参照）。

既知のＴ細胞分化抗原がＨＴＬＶ−Ｉの結合に関与するか否かを試験するために 、一連のモノクローナル抗体のＭＴ−２細胞に対するウィルス結合の遮断能を試 験した。得られた結果は、ＨＴＬＶ結合が抗−Ｌｅｕ−１，２，３，４及び抗Ｈ ＬＡ−ＤＲ外郭構造（４ｒａｍｅ＋ｖｏｒｋ）抗体の如きＴ細胞分化マーカーに 対する一連の抗体並びにＩＬ−２レセプター　ＴＡＣに対する抗体によって阻害 されないことが判明した。より最近には、特異的ＭｕＬＶ誘発Ｔ細胞リンパ腫に 結合するマウス白血病ウィルス（ＭｕＬＶ）が、Ｔ細胞抗原レセプターに存在す るか又はその近傍に存在することが判明した。この結論を支持する証拠は、この リンパ腫、Ｔ細胞レセプターに対するｃｌｏｎｏｔｙｐｉｃ抗体、Ｃ６ＶＬ−１ 、が該リンパ腫へのウィルスの結合を完全に阻害し、この抗体の結合がまたリン パ腫細胞の増殖遮断を生じることである。これらの結果は、先に発表されたレセ プター媒介白血病誘発説と一致する（ＭｃＧｒａｔｈ、　Ｍ、Ｓ、及びＹｅｉｓ ｓｍａｎＳｌ、Ｌ、、Ｃｏｌｄ−Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｃｏｎｆ、　Ｃ ｅ１ｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ｓ−５７７（１９７ｇ）；Ｍｃ−Ｇｒａ ｔｈ、　Ｍ、Ｓ、及びＷｅｉｓｓｍａｎ、　１．Ｌ、、Ｃｅ１ｌ　１７：６５（ １９７９））。

Ｔ細胞リンパ腫、ＭＯＬＴ−３からのＴ細胞抗原レセプターのβ鎖をクローニン グし、そのＤＮＡ配列を決定した（Ｙａｇｉｔａ等、Ｎａｔｕｒｅ３０８：１４ ．５（１９８４））。この配列からアミノ酸配列を推定した。β鎖の可変領域の アミノ酸配列とこれをコードするＤＮＡとを同定した。可変領域のアミノ酸配列 に関するこの知識に基づいて、可変領域のＮ−末端に位置する２２個のアミノ酸 に等しい２２個のアミノ酸のペプチド（Ｍ３Ｖ）を公知方法によって調製した。

このペプチドは以下の配列をもつ。

Ｇｌｙ−Ｖａｌ−１ｉｅ−Ｇｉｎ　−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ　−Ｇ　 Ｉｕ−Ｖａｌ　−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ　−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ　−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｖａ ｌ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＣｙｓＭ３ＶペプチドをＫＬＨに結合し、ミョウ バンに沈澱させ、１週１回の割合でＬｅｗｉｓラットに３週間腹膜組織内注射し た。３回目の注射の直前に３匹のラットを瀉血し抗血清を収集し、オボアルブミ ンに結合させたＭ３Ｖペプチドに対する結合活性を検査した。

プレート結合Ｍ３Ｖオボアルブミンに対するラット抗血清の結合活性の滴定曲線 は、ラット抗血清が１：２，５００より多量に滴定され得る抗ペプチド活性をも つことを示した。このラットの１つから得られた抗血清は、非免疫ラット抗血清 とは対照的に、Ｔ細胞ＡＬＬＳＪｕｒｋａｔ細胞系に顕著に結合した。後者はこ のような結合を示さなかった。この間接免疫蛍光分析を前述の一連のＴ細胞新生 物に対して行なった。これらの多くでは各々が抗−Ｍ３Ｖ抗血清と顕著に反応し た。この抗血清は末梢血管リンパ球及びヒト胸腺細胞の少数のサブ集団しか染色 しなかった。幾つかの系列的分析（Ｎ＝１５）によって胸腺細胞又は末梢血管リ ンパ球の約０．５％だけがＭ３Ｖラット抗血清によって認識されることが知見さ れた。

抗Ｍ３Ｖ抗血清が天然β鎖Ｔ細胞レセプター分子に対抗するか否かを決定するた めに、ＪＭ（Ｊｕｒｋａｔ）リンパ腫を細胞表面■ＳＩラベル化し免疫沈降させ た。特徴的な４０〜４５．０００分子量の分子をこのＴ細胞リンパ腫の表面で抗 Ｍ３Ｖ抗血清により認識した。抗Ｍ３Ｖ抗血清は遊離Ｍ３Ｖ−ペプチドによって 特異的に競合状態になった。

非還元条件下ではこのＴ細胞リンパ腫の表面で分子量約８５，０００の分子複合 体がこの抗血清によって認識される。これもまたα−β鎖Ｔ細胞レセプター複合 体に特有である。

抗−Ｍ３Ｖ抗血清によって認識された分子がＴ細胞リンパ腫に対するＨ’ＴＬＶ −１の結合を媒介したか否かを決定するために、この抗血清と細胞とのブレイン キュベーションによってウィルス結合が阻害されるか否かを決定する試験を実施 した。第７図はＪｕｒｋａｔ　Ｔ細胞ＡＬＬ細胞系と抗−Ｍ３Ｖ抗体とのブレイ ンキュベーションによってウィルス結合が顕著に阻害されたことを示す。この阻 害は、飽和量のＨＴＬＶ−１ウイルスよりもはるかに高度な阻害であること、こ れはその他のモノクローナル抗体には見られない特性であることが判明した。幾 つかの実験では、抗Ｌｅｕ−４がウィルス結合を軽度に阻害することが判明した 。前述のＨＴＬＶ−１結合リンパ踵の幾つか（８４０２、ＣＥＭＳＭＴ−２、Ｃ ９１ＰＬ、　ＪＭ）に対してこの実験を繰り返し、常に同様の結果を得た。この ことは、ＨＴＬＶ−１が今日まで試験された多数のヒトＴ細胞悪性腫瘍に結合す るだけでなく、これらリンパ腫がＴ細胞レセプターβ鎖ペプチドに対する抗血清 によって検出される抗原交差反応性に共有していることを示す。

第３実験シリーズ Ｍ３Ｖペプチドに特異的なモノクローナル抗体を産生ずる（免疫ラット牌細胞と マウス非分泌性ミエローマ８６５３との間の）ハイブリドーマを公知方法（Ｇａ ｌｆｒｅ、　Ｇ、等、Ｎａｔｕｒｅ、　２６６：５５Ｇ（１９７７））で調製す る。これらのハイブリドーマを免疫沈降によってスクリーニングし、１１３　Ｖ ペプチドに特異的な抗体を産生ずるハイブリドーマを同定した。この同定ハイブ リドーマをクローン４３と命名した。

このハイブリドーマ、より詳細にはこれによって産生されたモノクローナル抗体 は、ヒト患者のＴ細胞リンパ芽球白血病の診断に使用された。つまり、患者の末 梢血液をＦｉｃｏｌｌ　ｈｙｐ３ｑｕｅ密度遠心処理して調製された単核細胞を 、Ｎ−末端ペプチドＭ３Ｖに対するモノクローナル抗体を含む１００ｕ１のクロ ーン４３ハイブリドーマ培養物上清で染色した（１０”）。混合物を４℃及び０ ．１％のアジドで３０分間インキュベートし、５％血清を含む培地１６４０で洗 浄した。次に１００Ｊのフルオレセイン結合ヤギ抗ラットＩｇＧ（１０ｕｇ　／ 　ｖ、ｆｌ　）を洗浄細胞に添加し、４℃で３０分間インキュベートした。細胞 を繰り返し洗浄して余剰の抗体を除去した。最終の細胞懸濁液の抗体反応性を検 査するために、細胞をフローサイトメーターに通した（Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｏｇ ｒａｆ　５０Ｈ，０ｒｔｈｏ　ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓ、　Ｎｅｗ 　Ｊｅｒｓｅｙ）。

抗体Ｌｅａ　１、Ｌｅｕ　４、Ｌｅｕ５及びＬｅｕ　９はＢｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃ ｋｉｎｓｏｎ　ａｎｄＣｏｍｐａｎｙから購入。０ＫＴ４は０ｒｔｈｏ　Ｄｉａ ｇｎｏｓｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓから購入。

モノクローナル抗体３３．１１ラットＩｇＧ、、はモノクローナル４３のイソタ イプ方法のコントロールとして使用。

結果を表３に示す 幻− モノクローナル抗体　反応細胞の割合（％）Ｌｅｕ　ｌ　６０％ ４　４０−５０％ ５　４０−５０％ ９２５％ ＯＫ７４　６０％ クローン３３　０．５％ ４３　６０−７０％ １５人の正常供血者から得られたリンパ球に関する同様の分析からは、クローン ４３抗体で染色された細胞が０．５％未満であることが判明した。

これらの結果より、Ｔ細胞リンパ腫／白血病のＴ細胞レセプターの可変領域のＮ −末端ペプチドに対するモノクローナル抗体が、ヒトリンパ腫／白血病に対して 高度に特異的な診断試薬として使用し得ることが判明した。

第４実験シリーズ 抗原腫瘍Ｔ細胞りローシから得られたＴ細胞抗原レセプターのβ鎖のＮ−末端ペ プチドに対するモノクローナル抗体の産生抗肺癌踵Ｔ細胞クローンの成長及び増 殖肺腫瘍細胞に対して反応するＴ細胞クローンを単離し、Ｍａｙｅｒ等の方法（ Ｊ、　Ｉｍｍｐｎｏｌ、、１３４：２５８（１９８５））を使用し腫瘍生検サン プルから樹立させた。Ｔ細胞を含む肺腫瘍生検サンプルをインターロイキン−２ （ＩＬ−２）と抗原とを含む培地中で培養した。Ｔリンパ芽球が組織から泳動し その数が増加した。単離したＴリンパ芽球のＴ細胞の種類を０ＫＴ３．０ＫＴ４ 及び０ＫＴ８の如き特徴的細胞表面マーカーによるＴ細胞のタイプ決定によって 確認した。これらリンパ芽球に由来のクローンは限界希釈によって得られた（Ｃ ｅｌｔｓ等、Ｊ、　１ｍｍＬ！ｎｏ１．．１３２：１５１１（１９８４））。こ れらの細胞クローンがもつ機能の分析を、抗原増殖アッセイ、混合リンパ球培養 、ヘルパーアッセイによって行ない細胞媒介細胞傷害を検査した（Ｍａｙｅｒ等 、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１３４：２５８（１９８５）：及びＣｅｌｉｓ等Ｊ 、Ｉｍ−ｍｕｎｏｌ、、Ｈ２：１５１１（１９８４））。多量のＴ細胞クローン の各々を、適当な抗原でＴ細胞を刺激するか（Ｍａｙｅｒ等に記載のごとく細胞 に補充の！Ｌ−２を供給する）、又は薬剤マーカーＴ細胞系を使用するＴ／Ｔハ イブリドーマ融合方法（Ｌｅｅ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、 ＵＳＡ。

７９ニア８５７（１９８２）；ＤｅＦｒｅｉｔａｓ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ ｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、７９：６６４６（１９８２））によって樹立させた 。Ｔ−Ｔハイブリッドのクローンからの体細胞ＤＮＡの制限酵素パターン解析を 使用してこれらＴ細胞のクローニング可能性（ｃｌｏｎａｌｉｔｙ）を確認した 。

Ｔ細胞クローンからのＴ細胞抗原特異的遺伝子の単離グアニジウムイソチオシア ネート−セシウムクロリド法（Ｍａ−ｎｉａｔｉｓ　Ｔ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 　Ｃ１ｏｎｉｎ　、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｒ＋ａａｌ（ＣｏｌｄＳ ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、　ｐ、１９６（１９８２））によっ てＴ細胞クローンから全細胞ＲＮＡを抽出する。オリゴ（ｄＴ）−セルロースク ロマトグラフィーによってｍＲＮＡをａ縮し得る（Ａｖｉｖ、　Ｈ，及びＬｅｄ ｅｒ、　Ｐ、、Ｐ　Ｎ　ＡＳ　、組：　１４０ｇ（１９７２））。

Ｔ細胞クローン中に存在するｍＲ）ｉＡ）５１に基づいて幾つかのレセプターｍ ＲＮＡ単離方法の１つを選択する。ｍＲＮＡの量が少ない場合、以下のステップ を使用してｃＤＮＡライブラリーを構築する。

Ｌａｎｄ等の逆転写方法（Ｎａｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、旦：２２５１（ １９８２））を使用しＲＮＡから二重鎖ｃＤＮＡを形成する。分離用アガロース ゲル電気泳動で測定して０．５〜２ｋｂの長さのＤＮＡ断片を選択し、細菌プラ スミドベクター、例えばＰＰＰ５０２ＥＢ５（Ｃ１ａｒｋ及びＭａｋ、　Ｎａｃ ｌｅｉｃＡｃｉｄ　Ｒｅｓ、、１０：３３１５（１９ｇ２）；Ｍ１３ファージ又 はｐＢＲ３２２（Ｍａｎｉａｔｉｓ等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、 　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｒｖａ１％Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　（１９ｇ２））に、これら文献に記載の公知方 法で挿入する。大腸菌Ｈ８１０１株に形質導入してｃＤＮＡライブラリーを作成 する。ｃＤＮＡの完全スペクトルを含む独立クローンを収集し保存する。又は、 ヒトＢ細胞系Ｈ３Ｃ−５８がらのｌｌｌＲＮＡでＴ細胞ｃＤＮＡを除去した後に のみｃＤＮＡライブラリーを作成する（Ｈｅｄｒｉｃｋ等、Ｎａｔｕｒｅ％３０ ８：１４ｇ（１９８４））。■細胞クローン中のＴ細胞抗原レセプターのα及び β鎖をコードするｍＲＮＡのｃＤＮＡクローンをスクリーニングするために、Ｊ ａｒｋａｔ又はＭｏ１ｔ−３ヒトＴ細胞系中のＴ細胞レセプターのα及びβ鎖不 変領域に対応する放射性ラベル化ＤＮＡプローブを、ｃＤＮＡライブラリー中の 形質導入細菌のレプリカと反応させる。陽性の細菌クローンを収集し、プラスミ ドＤＮＡをレセプター遺伝子の推定アミノ酸配列 レセプター遺伝子をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列をＳａｎｇｅｒ等の チェーンターミネーティングインヒビター法を使用して決定する（Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔ’　１．Ａｃａｄ、ｓｃｉ、、７４：５４６３（１９７７））。α及びβポ リペプチドのＶ、　Ｊ及びＤ領域のアミノ酸配列を決定する（１９１！１４）） 。

Ｔ細胞クローン中に多量のｍＲＮＡが存在する場合には以下の方法を使用する。

プライマーエキステンション法（Ｋｏａｒｔ　１ｎｅｎ等、Ｊ、Ｉｌｌｌｍｕｎ ｏｌ、、１：（Ｏ：９３７（１９８３））によってα又はβ遺伝子ｍＲＮＡの可 変領域のヌクレオチド配列を測定する。ラベル化Ｔ細胞レセプター遺伝子ＤＮＡ の精製小断片を、濃縮ｍＲＮＡ又は全細胞ＲＮＡと混合し、ホルムアミド、Ｎａ Ｃｌ５ＥＤＴＡ及びＨｅｐｅｓを含むバッファ中で８０℃で変性する。低温でハ イブリダイゼーション後、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドをエタノール沈澱によっ て精製し、Ｔｒｉｓバッファに溶解する。逆転写酵素とデオキシリボヌクレオチ ドとをＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドに添加する。インキュベーション後、エキス テンシジン産生物をエタノール沈澱によって精製し、配列決定用ゲルで配列解析 する。

レセプターペプチドの合成 レセプターのＬ　Ｊ及びＤ配列のＮ−末端に対応するペプチドを、Ｍｅｒｒｉｆ ｉｅｌｄ固相法（Ｍａｒｇｌｉｎ及びＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄＳＡｎｎ、Ｒｅｖ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ。

３９：８４１（１９７０）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　Ｊ、Ａｍｅｒ、Ｃｈｅｍ 、Ｓｏｃ、、８５：２１４９（１９６３））によって合成する。ペプチドをタン パク質キャリヤーに結合させるべくペプチドのアミノ−又はカルボキシ末端にシ スティン残基を付加する。次にＨＰＬＣでペプチドを精製する。

１先 モジアニン又はその他のキャリヤータンパク質に合成ペプチドを先ず結合する。

Ａｌｔｍａｎ等（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、８１：２１７ ６（１９８４））に記載の如き手順及び投与量で結合ペプチドを用いウサギとマ ウスとを免疫する。該ペプチドに対する抗血清の力価をＥＬＩＳＡ法（ＡｌｔＩ Ｉｌａｎ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８１：２１７６（１９ ８４））又は細胞免疫蛍光でモニターする。数回の免疫化後に抗体価を示すマウ スを殺す。これら免疫マウスから採取した胛細胞をＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔ ｅｉｎの方法（ＮａｔａｒｅＳ２５６：４９５（１９７５））で薬剤標識したミ エローマ細胞と融合させる。免疫ペプチドと特異的反応性の抗体を分泌するハイ ブリドーマ培養物を選択し限界希釈でクローニングする。これらの選択モノクロ ーナル抗体を更に間接免疫蛍光アッセイ及び免疫沈降（Ａｃｕｔｏ等、Ｃｅ１ｌ 　３４ニア１７（１９８３））の方法によって生存細胞のＴ細胞レセプタータン パク質に対する反応性を試験する。

抗レセプター抗体を使用する臨床試験 杭レセプターモノクローナル抗体を使用して、患者から採取した肺腫瘍サンプル 中のＴ細胞又は患者の生検サンプル又は血液中のＴ細胞及び正常コントロールの Ｔ細胞の各々と該モノクローナルとを反応させることによって、疾患部位又は末 梢リンパ様器官の疾患ｉ異的子細胞のタイプを決定した。免疫ペルオキシダーゼ 染色法及び免疫蛍光染色法の如き種々の方法を使用し得る。（Ｊａｎｏｓｓｅｙ 等、ＮａｔＵｒｅ　２８８：８１（１９８０）：Ｂｈａｎ等、Ｊ、　１ｍｍａｎ ｏｌ。

１２９：１５７８（１９ｇ２））。このように調製されたモノクローナル抗体は 、疾患の限られた時期に肺癌腫を侵すＴ細胞の一部分に特異的に反応する。更に 、モノクローナル抗体は、キラーＴ細胞クローンによる肺腫瘍細胞の死滅と干渉 するか又はヘルパー７４＋Ｔ細胞クローンの増殖応答と干渉する。

え疑に隻 第４シリーズの実験で記載した手順を使用してその他の疾患又は移植抗原に関連 するＴ細胞レセプターのβ鎖に対するモノクローナル抗体を得ることも可能であ る。このために、Ｔ細胞レセプター（抗原特異的）遺伝子を、かかる状況に関係 していることがわかっているＴ細胞クローンから単離する。以下に使用可能なＴ 細胞クローンを記載した文献のリストを示す。

１、Ｂ型肝炎ウィルス Ｅ、Ｃｅ１ｌｓ、　Ｐ、に、Ｋｕｎｇ及びＴ、１．Ｃｈａｎｇ（１９８４）Ｊ、 Ｉｍａｕｎｏｌｏｇｙ　１３２：１５１１「Ｂ型肝炎ウィルス−反応性ヒトＴリ ンパ球クローン：抗原特異性及び抗体合成に対するヘルパー機能」 ２、移植抗原 Ａ、　Ｓ、Ｃ，Ｍｅａｅｒ、Ｓ、Ｆ、Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｎ及びＥ、Ｌ、Ｒｅ１ ｎｈｅｒｚ（１９８２）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、１ＪＳＡ　 ７９：４５９０「ヒト細胞障害性Ｔリンパ球のクローン分析：Ｔ４＋及びＴ８＋ エフェクターＴ細胞による異なる主要組織適合抗原複合体領域産生物の認識」 Ｂ、　Ｔ、Ｇ、ＭａｙｅｒＳＡ、Ａ、Ｆａｌｌｅｒ、　Ｔ、Ｃ，Ｆｕｌｌｅｒ、 Ａ、１．ＬａｚａｒｏｖｉｔｓＬ、Ａ、Ｂｏｙｌｅ及びＪ、Ｔ、Ｋｕｒｎｉｃｋ （１９８５）Ｊ、ｌｌ１ｌｌＩＩＬＩＩＩＯ１１３４：２５８　−［拒絶ヒト腎 アロ移植片生検から増殖したｉｎ　ｖｉｖｏで活性化されたアロ特異的Ｔリンパ 球のキャラクタライゼーション」３、単純ヘルペスウィルス Ｄ、Ｄ、ＥｃｋｅｌｓＳＰ、Ｌａｋｅ、　Ｊ、Ｒ，Ｌａｍ１ｂ等（１９８３）Ｎ ａｔｕｒｅ　３０１ニア１６ 「ヒトＴリンパ球クローンに対するインフルエンザ及び単純ヘルペスウィルス抗 原のＳＢ拘束表現」 ４、腫瘍抗原属 Ｇ、Ｐ、Ｐａｗｅｌｅｅ、　Ｍ、Ｒ，Ｈａｄａｍ、　Ａ、Ｚｉｅｇｌｅｒ、　Ｊ 、Ｌｏｈｍｅｙｅｒ。

Ａ、Ｒｅｈｂｅｉｎ％Ｊ、Ｋｙｎｓｂｉｅｒ及びＰ、Ｖｅｒｎｅｔ（１９８２） Ｊ、１ｍｍａｎｏｌ　１２８：１８９２「混合した白血球培養物由来の天然キラ ー状細胞障害を有するヒトＴリンパ球の長期間培養、クローニング及び表面マー カー」５、関節リューマチ Ｄ、Ｄｐｋｅ％Ｇ、Ｓ、Ｐａｎａｙｉ、　Ｇ、Ｊａｎｏｓｓｙ及びり、Ｗ、Ｐｏ ａｌｔｅｒ（１９８２）Ｃ１ｉｎ、Ｅｘｐ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、４９：２２「モ ノクローナル抗体を使用する関節リューマチ患者の滑液膜のリンパ球サブ集団と それらの微細環境との免疫組織学的分析」６、アレルゲン（Ｒａｇｗｅｅｄ抗原 Ｅ）Ｓ、Ｃ，ＭｅａｅｒＳＤ、Ａ、ＣｏｏｐｅｒｌｌＪ、Ｃ，Ｈｏａｇｏｎ、　 Ｒ，Ｅ、Ｈａｓｓｅｙ。

Ｋ、Ａ、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、　Ｓ、Ｆ、Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｎ及びＥ、Ｌ、 Ｒｅ１ｎｈｅｒｚ（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２２：１２３９ 「ヒト誘発Ｔリンパ球上のＭＨＣ−レセプターの抗原の同定」７、重症筋無力症 のアセチルコリンレセプターＦ、Ｓｉｎｉｇａｇ１ｉｎ％Ｃ，Ｇｏｔｔｉ、Ｐ、 Ｒ４ｃｉｒａｒｄｉ及びＦ、Ｃｌｅｍｅｎｔ　１（１９８４）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ’１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８１ニア５６９「レトロウィルス形質転換Ｔ細胞系か らのアセチルコリンレセプター特異的抑制Ｔ細胞因子」 ８、ヒト寄生虫抗原 Ｔ、Ｂ、Ｎｕｔｍａｎ、　Ｄ、Ｊ、Ｖｏｌｋｍａｎ、　Ｒ，ＨｕｓｓａｉｎＳＡ 、Ｓ、Ｆａｎｃｉ及びＥ、Ａ、０ｔｔｅｓｅｎ（１９８５）Ｊ、Ｂａｒｎｓ、　 Ａ、Ｒｏｓｅｎｚｖｅｉｇ、　Ｂ、Ｚｖｅｉｍａｎ及びＲ，Ｐ、Ｌｉｓａｋ（１ ９ｇ３）Ｆ工Ｇ工２ Ｆ工Ｇ都ε３ Ｄβ１．１ −１−　ぐ 主ｌ邑不　ＧＧＧＡＣＡＧＧＧＧＧＣ ＡＲＩ　ＧＧＴＣＡ ＢＷ５１４７　ＣＡ　Ｇ　Ａ丁Ａ　−Ａ　Ｇ　ＴＬヨ２　Ａ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ｃ ＴＥ３２　Ｇ　Ｇ　Ｔ　Ｇ　Ａ　ＣＴ　Ｔ　ＴＴヨ１２　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ｃ Ｔ己２１　Ｇ　Ｔ　ＣＣＧ　Ｇ Ｆ二ＧロＲＥ　４ ＦＸまＲ：６ Ｆ工ＧＵ三！　５ 了Ｓノ醸イｔ！ 国際調査報告 １＋＋１ｍ１ｌ＋ｅＭａｌ　Ａｅｅｋｏ“′。”′６’　ＰｃＴ１０５８６１０ ０１１８２ｍ＋＊１．、ａｍ−１ａｓｓｂｃａ＋：＊、、Ｎａ、　ｆ’ｃＴ／Ｕ Ｓ８６１００８８）

Claims (57)

【特許請求の範囲】
1. （１）被検体の対象特定疾患を診断するために、（ａ）Ｔ細胞を含む適当なサン プルを被検体から採取し、（ｂ）Ｔ細胞に結合可能でありＴ細胞レセプターのβ 鎖の可変領域内の非反復アミノ酸配列の存在を指示する試薬を用い、該非反復配 列を含み該サンプル中に存在するＴ細胞と該試薬との間に検出可能な複合体を形 成せしむべく適当な条件下に該サンプルと該試薬とを接触させ、正常被検体中に 存在する該配列を有する細胞の数に対する非反復配列を含む細胞の数の増加を対 象特定疾患と関連させ、 （ｃ）該複合体中に存在する該配列を有するＴ細胞の数を定量的に測定し、この 測定数と、同じ手順で測定した正常被検体の該配列を有するＴ細胞の数とを比較 し、該対象疾患を診断することを特徴とする方法。
2. （２）対象特定疾患が癌の形態であることを特徴とする請求の範囲１に記載の方 法。
3. （３）癌の形態がヒト乳癌であることを特徴とする請求の範囲２に記載の方法。
4. （４）癌がヒト結腸癌であることを特徴とする請求の範囲２に記載の方法。
5. （５）癌がヒト肺癌であることを特徴とする請求の範囲２に記載の方法。
6. （６）癌がヒトリンパ腫であることを特徴とする請求の範囲２に記載の方法。
7. （７）癌がヒト肝癌であることを特徴とする請求の範囲２に記載の方法。
8. （８）癌がヒト白血病であることを特徴とする請求の範囲２に記載の方法。
9. （９）対象特定疾患が自己免疫疾患であることを特徴とする請求の範囲１に記載 の方法。
10. （１０）自己免疫疾患が関節リューマチであることを特徴とする請求の範囲９に 記載の方法。
11. （１１）自己免疫疾患が第一型糖尿病であることを特徴とする請求の範囲９に記 載の方法。
12. （１２）自己免疫疾患が多発性硬化症であることを特徴とする請求の範囲９に記 載の方法。
13. （１３）自己免疫疾患が全身性紅斑性エリテマトーデスであることを特徴とする 請求の範囲９に記載の方法。
14. （１４）自己免疫疾患が重症筋無力症、グレーブス病であることを特徴とする請 求の範囲９に記載の方法。
15. （１５）対象特定疾患がアルツハイマー病又はその他の神経系の変性疾患である ことを特徴とする請求の範囲１に記載の方法。
16. （１６）対象特定疾患が感染性疾患であることを特徴とする請求の範囲１に記載 の方法。
17. （１７）感染性疾患の原因がウィルスであることを特徴とする請求の範囲１６に 記載の方法。
18. （１８）ウィルスがＨＴＬＶ−Ｉ又はＨＴＬＶ−ＩＩＩ（ＬＡＶ又はＡＲＶ）で あることを特徴とする請求の範囲１７に記載の方法。
19. （１９）ウィルスがＨＳＷ−Ｉ又はＨＳＶ−ＩＩであることを特徴とする請求の 範囲１７に記載の方法。
20. （２０）ウィルスがＡ型肝炎ウィルス又はＢ型肝炎ウィルスＢであることを特徴 とする請求の範囲１７に記載の方法。
21. （２１）ウィルスがサイトメガロウィルスであることを特徴とする請求の範囲１ ７に記載の方法。
22. （２２）感染性疾患の原因が酵母であることを特徴とする請求の範囲１６に記載 の方法。
23. （２３）酵母がカンジダ属であることを特徴とする請求の範囲２２に記載の方法 。
24. （２４）感染性疾患の原因が寄生虫であることを特徴とする請求の範囲１６に記 載の方法。
25. （２５）寄生虫が住血吸虫であることを特徴とする請求の範囲２４に記載の方法 。
26. （２６）寄生虫がフィラリア又はマイコバクテリウムであることを特徴とする請 求の範囲２４に記載の方法。
27. （２７）寄生虫が旋毛虫であることを特徴とする請求の範囲２４に記載の方法。
28. （２８）寄生虫がマラリア原虫であることを特徴とする請求の範囲２４に記載の 方法。
29. （２９）寄生虫が睡眠病原虫（トリパノソーマ）であることを特徴とする請求の 範囲２４に記載の方法。
30. （３０）感染性疾患が細菌によって誘因されることを特徴とする請求の範囲１５ に記載の方法。
31. （３１）細菌が破傷風毒素を産生することを特徴とする請求の範囲３０に記載に 方法。
32. （３２）対象特定疾患がアレルギーであることを特徴とする請求の範囲１に記載 の方法。
33. （３３）アレルギーが遅延型過敏症又は接触性過敏症でありＴ細胞が関与するこ とを特徴とする請求の範囲３２に記載の方法。
34. （３４）被検体がヒトであることを特徴とする請求の範囲１に記載の方法。
35. （３５）被検体が動物であることを特徴とする請求の範囲１に記載の方法。
36. （３６）サンプルが全血から得られることを特徴とする請求の範囲１に記載の方 法。
37. （３７）サンプルが組織から得られることを特徴とする請求の範囲１に記載の方 法。
38. （３８）非反復配列の長さが少なくとも約１０個のアミノ酸に相当し、Ｔ細胞レ セプターのβ鎖の可変領域のＮ−末端に位置する最初の約３０個のアミノ酸内に 存在することを特徴とする請求の範囲１に記載の方法。
39. （３９）非反復配列が 【配列があります】 であることを特徴とする請求の範囲３８に記載の方法。
40. （４０）試薬が非反復アミノ酸配列に対応するエピトープに対する抗体であるこ とを特徴とする請求の範囲１に記載の方法。
41. （４１）抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求の範囲４０に記 載の方法。
42. （４２）試薬が非反復アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡハ イブリダイゼーションプローブであることを特徴とする請求の範囲１に記載の方 法。
43. （４３）試薬が非反復アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列に相補的なＲＮＡハ イブリダイゼーションプローブであることを特徴とする請求の範囲１に記載の方 法。
44. （４４）モノクローナル抗体が検出可能物質でラベルされていることを特徴とす る請求の範囲４０に記載の方法。
45. （４５）検出可能物質が蛍光色素であることを特徴とする請求の範囲４４に記載 の方法。
46. （４６）検出可能物質が放射性同位体であることを特徴とする請求の範囲４４に 記載の方法。
47. （４７）検出可能物質が検出可能生成物を産生する反応を触媒する酵素であるこ とを特徴とする請求の範囲４４に記載の方法。
48. （４８）検出可能物質がビオチンであることを特徴とする請求の範囲４４に記載 の方法。
49. （４９）検出可能物質が核磁気共鳴によって検出可能な金属イオンであることを 特徴とする請求の範囲４４に記載の方法。
50. （５０）ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブが検出可能物質でラベルされて いることを特徴とする請求の範囲４２に記載の方法。
51. （５１）ＲＮＡハイブリダイゼーションプローブが検出可能物質でラベルされて いることを特徴とする請求の範囲４３に記載の方法。
52. （５２）複合体中に存在する配列を有するＴ細胞の数の定量的測定が蛍光活性化 細胞選別を含むことを特徴とする請求の範囲４５に記載の方法。
53. （５３）異なる被検体から臓器移植を受けた被検体の臓器移植拒絶を検出するた めに、 （ａ）Ｔ細胞を含む適当なサンプルを被検体から採取し、（ｂ）Ｔ細胞に結合可 能でありＴ細胞レセプターのβ鎖の可変領域内の非反復アミノ酸配列の存在を指 示する試薬を用い、該非反復配列を含み該サンプル中に存在するＴ細胞と該試薬 との間に検出可能な複合体を形成せしむべく適当な条件下に該サンプルと該試薬 とを接触させ、正常被検体中に存在する該配列を有する細胞の数に対する非反復 配列を有する要細胞の数の増加を臓器移植拒絶と関連させ、 （ｃ）該複合体中に存在する該配列を有するＴ細胞の数を定量的に測定し、この 測定数と、同じ手順で測定した正常被検体の該配列を有するＴ細胞の数とを比較 し、該臓器移植拒絶を検出することを特徴とする方法。
54. （５４）Ｔ細胞に結合可能でＴ細胞レセプターのβ鎖の可変領域に内包される非 反復アミノ酸配列に特異性をもち、正常被検体中に存在する該配列を有するＴ細 胞の数に対する該非反復配列を有するＴ細胞の数の増加を検出して対象特定疾患 を診断する試薬。
55. （５５）Ｔ細胞に結合可能でＴ細胞レセプターのβ鎖の可変領域に内包される非 反復アミノ酸配列に特異性をもち、正常被検体中に存在する配列を有するＴ細胞 の数に対する非反復配列を有するＴ細胞の数の増加を検出して移植臓器の拒絶を 検出する試薬。
56. （５６）配列 【配列があります】 をもつポリペプチド。
57. （５７）請求の範囲５６のポリペプチドをコードするポリデオキシリボヌクレオ チド。