JPH10510988A - 腫瘍−特異的細胞毒性ｔ細胞のインビボ活性化 - Google Patents

腫瘍−特異的細胞毒性ｔ細胞のインビボ活性化

Info

Publication number
JPH10510988A
JPH10510988A JP8519293A JP51929396A JPH10510988A JP H10510988 A JPH10510988 A JP H10510988A JP 8519293 A JP8519293 A JP 8519293A JP 51929396 A JP51929396 A JP 51929396A JP H10510988 A JPH10510988 A JP H10510988A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cells
peptide
ctl
polypeptide
molecule
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
JP8519293A
Other languages
English (en)
Inventor
リンダ エイ シャーマン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Scripps Research Institute
Original Assignee
Scripps Research Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Scripps Research Institute filed Critical Scripps Research Institute
Publication of JPH10510988A publication Critical patent/JPH10510988A/ja
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4746—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used p53
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464403—Receptors for growth factors
    • A61K39/464406—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ ErbB4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464448—Regulators of development
    • A61K39/46445—Apoptosis related proteins, e.g. survivin or livin
    • A61K39/464451—Apoptosis related proteins, e.g. survivin or livin p53
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G01N33/505—Cells of the immune system involving T-cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56972—White blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/49—Breast
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は、特定の抗原ペプチドに対する特異性をもつ、インビボでCTL を活性化するのに有用な方法、組成物およびペプチドに関する。本発明は、また種々の疾患状態の診断および治療するための、活性化されたCTL のインビボでの使用およびこれら用途用に適した組成物をも開示する。診断装置、成分および方法もここに記載される。

Description

【発明の詳細な説明】 腫瘍−特異的細胞毒性Ｔ細胞のインビボ活性化 技術分野 本発明は、特定の抗原性ペプチドに対して特異性をもつCTL を活性化するのに 有用な方法、組成物およびペプチドに関する。本発明は、また種々の疾患状態の 治療のための、インビボでのCTL の活性化の利用およびこれらの利用に適した組 成物をも開示する。診断用のキット、成分および方法もここに記載する。 背景 免疫系による、個体の感染性諸疾患からの治癒、もしくは防禦の効率が、変わ ることのない科学者の興味をひいてきた。というのは、該免疫系を活性化するこ とにより、他の型の疾患を根絶できるかもしれないと、考えられているからであ る。このような疾患は癌、AIDS、肝炎および免疫抑制患者における感染性疾患を 包含する。抗体の利用を含む種々の手順が、これら型の諸疾患に対して適用され ているが、細胞毒性Ｔリンパ細胞を使用した上首尾の試みは、これまでに殆ど報 告されていない。理論的には、細胞毒性Ｔリンパ細胞は、上記のような型の疾患 を治療するための好ましい手段であろうと思われる。しかしながら、細胞毒性Ｔ リンパ細胞をインビボにて特異的に活性化するのに利用できる有用な手順は、今 のところ知られていない。 細胞毒性Ｔ細胞またはCD8 細胞とも呼ばれている、細胞毒性Ｔリンパ細胞(CTL s)は、ウイルス感染に対する主要な防禦系を表す。CTL は、ウイルスに感染した 細胞を特異的に認識し、かつこれを殺す。従って、ウイルス感染を排除すること により、感染した細胞を喪失するという犠牲を伴う。CTL の表面上のＴ細胞レセ プタは、直接外来抗原を認識することはできない。抗体とは対照的に、抗原がま ず該レセプタに提示される必要がある。 Ｔ細胞に対する抗原の提示は、クラスＩ型の主な組織適合錯体(MHC)分子によ って達成される。この主な組織適合錯体(MHC)とは、免疫応答において重要な役 割を演じている糖タンパクの広範囲に渡る群をコードする、大きな遺伝子座を意 味する。HLA(ヒト白血球抗原)錯体とも呼ばれる、このMHC 遺伝子は、ヒトでは 染色体６に位置している。MHC 遺伝子によりコードされる分子は、細胞表面に存 在し、組織移植体を「非−自己」として識別する上で重大な役割を担う。かくし て、膜結合MHC 分子は、Ｔ細胞による抗原の認識と、密接に関連している。 MHC 生成物は、主な３つの群に分類され、それぞれＩ、IIおよびIII と呼ばれ ている。主としてヘルパー細胞として機能するＴ細胞は、CD4 を発現し、主とし てクラスIIの分子により抑制され、一方で多くの場合、細胞毒性エフェクタ細胞 を表す、CTL-(CD8-)発現細胞は、クラスＩの分子と相互作用する。 クラスＩの分子は、主として内在性タンパクの細胞内分解により誘導されるペ プチドと結合する能力をもつ、膜糖タンパクである。MHC 分子と、ウイルス、バ クテリアおよび他の外来タンパクとの錯体は、Ｔ細胞の抗原応答性を誘発するリ ガンドを含む。対照的に、MHC と正常な細胞生成物由来のペプチドとの錯体は、 胸腺において、該Ｔ細胞に自己ペプチドを免疫寛容すべく教示する上である役割 を演じている。クラスＩ分子は、全体的に完全な抗原を提示せず、寧ろ「ペプチ ド結合溝(groove)」上に「担持された(loaded)」、そのペプチドフラグメントを 提示する。 長年に渡り、免疫学者は、ウイルス、レトロウイルスおよび癌細胞をターゲッ トとする特異的細胞毒性細胞を樹立しようとの希望を抱いていた。一般的に、ウ イルス疾患に対する治療（予防）は、生または弱毒化ワクチンによる免疫性付与 によりインビボで達成できるが、同様な首尾は、レトロウイルスまたは癌細胞に ついては達成されていない。その上、このワクチン法は、免疫抑制状態にある患 者では、所定の効果を達成しなかった。この難点を回避する一方法は、健康な個 体を免疫化し、この個体からCTL を単離し、これらのCTL を該疾患に冒されたヒ トに注入することであろう。 しかしながら、この実験的プロトコールは常に有用という訳ではない。という のは、多くの情況の下において、健康な個体を腫瘍細胞で免疫しようとすること は、実施可能でも（倫理的に可能でも）ないからである。更に、最良の場合であ っても、正常な健康的個体では、少量で正常細胞上に発現されるペプチドを、異 常に高い濃度で発現する異常細胞を認識するために、CTL を活性化することも問 題がある。 活性化されたCTL を発生させる目的での、（トランスジェニック系統を包含す る）マウス系統の使用は、特に該マウス系統が該免疫原に対して免疫学的応答を 引き起こすことができない場合には、常に実施可能である訳ではない。免疫学的 応答誘発の失敗は、該マウス免疫系が、該抗原を認識できないか、あるいは該免 疫系が、治療の目的で、活性化されたCTL の意図されたレシピエントと相容性の 活性化された細胞を発生できないことによるものと考えられる。 例えば、ペプチドは所定のMHC に対して固有である、即ち「好ましい」MHC 分 子の不在下においてさえ、ある抗原ペプチドが特定のMHC 系列に対して優先的に 結合し、かつ他のものには十分には結合しないことが観測されている。更に、MH C 分子は高度に多形であり、この事実は少なくとも２つの問題点を生ずる。第一 に、個体のCTL は、正確に該個体中に存在する３〜６個のクラスＩ分子に結合し たペプチドのみと相互作用できるにすぎない。第二に、CTL は、該クラスＩ分子 が如何なるペプチドを含有するかとは無関係に、該CTL を得た個体中で発現され るものとは異なる、全てのクラスＩ分子と激しく反応する。この反応性はしばし ば観測されており、またアロー反応性と呼ばれている。これは、移植された器官 の免疫拒絶反応の第一の理由である。 かくして、一個体が他の個体に対する活性化されたCTL のドナーとして利用さ れる、寧ろ思い切った実験的プロトコールから離れて、クラスＩ分子の正確に同 一の構成をもつ、無関係の二人のヒトを見出すことは困難である。そのために、 少なくとも一人の研究者は、寧ろ既存のCTL を、Ｔ細胞に対する増幅因子である IL-2と共にインビトロでインキュベートすることにより、「追加免疫操作」する 非−特異的な方法を採用した。しかしながら、このプロトコール(LAK細胞療法と して知られる)は、既に活性化されているこれらCTL の拡張を可能とするに過ぎ ない。該免疫系は、常にある理由または他の理由から、活性化されているので、 IL-2刺激細胞の殆どは、該疾患を根絶する目的にとっては、無意味であろう。事 実、この型の治療が所定の特異性をもつ任意の細胞を活性化するという文献はな い。従って、LAK 細胞療法の利益は最良の場合でも、論争の的となり、また典型 的には多くの研究が中断される程に、副作用が非常に重大である。 クラスＩ分子は特異的な様式でペプチドと結合する。全てのペプチドは、その 長さにおいて約８〜11個のアミノ酸をもつ必要があり、またその配列は、該クラ スＩ分子のペプチド結合ポケットに適合している必要がある。このことに関連し て、クラスＩ分子は、抗体に対して幾つかの類似性を示す。しかしながら、ある 与えられた抗体がただひとつの抗原と結合する傾向がある一方で、ある与えられ たクラスＩ分子は数百の異なるペプチドと結合できる。ウイルス数および他の病 原体数は非常に大きいので、我々が単一のクラスＩ分子しかもたないとすれば、 たとえこれが多くの異なるペプチドと結合またはこれを変更できるとしても、我 々の免疫防禦は貧弱なものとなるであろう。そのため、全てのヒトは３〜６のク ラスＩ分子をもち、その各々は多くの異なる型のペプチドと結合することができ る。従って、該CTL は、１または他のクラスＩ分子に結合したペプチド数千を識 別できる。 選択性が進化において支配的な力であると考えられるので、該免疫系によって 効果的に識別できない病原体が出現する。かくして、例えば種々のクラスＩ分子 と効率的に結合するペプチドを生ずるウイルス配列は、一個体中に存在する３〜 ６のクラスＩ分子の何れによっても識別されないように、変異することが可能で ある。従って、このウイルスは該免疫系により認識できず、かつ結果として感染 した個体の死を招く恐れがある。全ての個体が同一の群のクラスＩ分子を有する 場合には、このようなウイルスは、多分全種を排除してしまう可能性がある。 しかしながら、個々の変異が、このような可能性に対する防禦手段となってい る。というのは、該集団中には、約100 の異なる型のクラスＩ分子が存在するか らである。 クラスＩ分子が、我々自身の細胞タンパク由来のペプチドを包含する種々のペ プチドと結合できる場合、該免疫系の該CTL が、何故我々自身の細胞を認識せず かつ破壊しないかを不思議に思うであろう。この問題に対する回答は、完全に明 らかという訳ではないが、現時点においては２つのことなるメカニズムが作用し ていると考えられている。その第一は、自己ペプチドと反応できるCTL が、胸腺 において排除されることである。その第二は、CTL が、該免疫系の周辺器官にお いて、自己ペプチドに対して非−応答性(アネルギー性(anergic))となることで ある。細胞タンパクの何れの可能な型またはエピトープも、胸腺中の細胞により 合成されることはないので、該第二のメカニズムがより確からしい説明であると 思われる。このメカニズムは、通常遭遇する自己ペプチドの濃度に対して利用可 能であると考えられる。この濃度をある手段によって増大された場合に、個体が 実際に、自己ペプチドを発現する細胞を認識し、かつ破壊できるCTL をもつこと を示すことができる。この後者の観測は、腫瘍細胞を排除する目的で該免疫系を 利用するという概念については重要である。 最近、細胞性癌遺伝子タンパク由来の変異型および野性型ペプチドがCTL によ り識別できることが、明らかになった。このことは、変異遺伝子によりコードさ れるペプチドの他に、非−変異遺伝子によりコードされる自己ペプチドが、腫瘍 細胞に対するＴ細胞応答のための、潜在的なターゲットであり得ることを示唆す る（例えば、メリーフ＆カスト(Melief and Kast)，Curr．Op．Immunol.，1993, 5 : 709-713;ブーン(Boon)，Adv．Cancer Res.，1992，58: 177-210;ファンデア ブルーゲン(Van der Bruggen)等，Curr．Op．Immunol.，1992，4: 608-612を参 照のこと）。 活性のモードとは無関係に、種々の腫瘍抗原に関する該CTL 応答が、多くの場 合において不十分であることが、明らかになっている。これら個体における免疫 応答を、適当な腫瘍抗原に対して応答するように刺激して、冒された該細胞およ び組織を除去することが望ましい可能性がある。更に、乳癌等の悪性癌に対して 通常入手可能なワクチンはないので、このようなワクチン、好ましくはある範囲 の抗原決定基に基づくワクチンを確立することが望ましい。 従って、本発明の目的の一つは、該細胞性免疫系が腫瘍およびその他の悪性癌 と戦う能力を強化し、あるいは上昇させる、薬物を提供することにある。本発明 の更なる目的は、治療並びに予防的用途両者について、腫瘍−関連疾患状態と戦 う、該細胞性免疫系を増強し、もしくは上昇させる薬理組成物を提供することに ある。 これらのおよび他の本発明の目的並びに本発明の利点、並びに付随的な発明と しての特徴は、ここに与えられる本発明の説明から明らかとなろう。 本発明の概要 本発明は、腫瘍の成長または増殖、あるいはその他の悪性癌の成長または増殖 と戦い、もしくはこれらを阻害するように、該細胞免疫系を強化し、もしくは上 昇させる薬物を提供する。本発明の種々の態様において、治療すべき症状は癌、 腫瘍、腫瘍形成、ウイルスまたはレトロウイルス感染、自己免疫または自己免疫 型症状を含むことができる。 例えば、本発明は、LLPENNVLSPL(SEQ ID NO 1); RMPEAAPPV(SEQ ID NO 2); ST PPPGTRV(SEQ ID NO 3); LLGRNSFEV(SEQ ID NO 4); KIFGSLAFL(SEQ ID NO 10); T LQGLGISWL(SEQ ID NO 11); VMAGVGSPYV(SEQ ID NO 12); VLQGLPREYV(SEQ ID NO 13); およびILVVVLGV(SEQ ID NO 14)からなる群から選ばれるCTL エピトープと 実質的な相同性をもつポリペプチド、またはこのようなポリペプチドまたはその 類似体もしくはその配列サブセットを含有する分子を意図する。 更に、本発明は、p53 またはHer-2/Neu 抗原に対する免疫応答を誘発する方法 を提供し、該方法は適当な細胞毒性Ｔリンパ細胞と、上記のエピトープ群からな る群から選ばれるペプチドを含有する、免疫応答誘発性の有効量の分子とを接触 させることを含む。本発明は、更にここに記載するCTL-特異的エピトープの少な くとも１種を含有する薬理組成物をも提供する。 かくして、一態様において、本発明はインビボで細胞毒性Ｔリンパ細胞を特異 的に活性化することのできるポリペプチドを意図し、ここで該細胞毒性Ｔリンパ 細胞(CTL)は、悪性細胞を特異的にターゲットとする。一変法において、該ポリ ペプチドはヒトp53 タンパクを由来とする。種々のp53 ポリペプチドが、この点 に関連して有用であり、アミノ酸残基配列、例えばSTPPPGTRV 、LLGRNSFEV 、LL PENNVLSPL 、RMPEAAPPV 、およびこれらの配列サブセットをもつポリペプチドを 包含する。 もう一つの変法において、該ポリペプチドは、ヒトHer-2/Neu タンパク由来の ものである。種々のHer-2/Neu ポリペプチドが、この点に関連して有用であり、 アミノ酸残基配列、例えばKIFGSLAFL 、VMAGVGSPYV、TLQGLGISWL、VLQGLPREYV、 ILLVVVLGV 、およびこれらの配列サブセットをもつポリペプチドを包含する。 CTL エピトープと実質的な相同性をもつポリペプチドをも、本明細書に記載す る。腫瘍−関連抗原により同定されたCTL エピトープが、特に好ましい。好まし い本発明のCTL エピトープは、p53 およびHer-2/Neu エピトープを包含する。エ ピトープの例は、STPPPGTRV 、LLGRNSFEV 、LLPENNVLSPL 、RMPEAAPPV 、KIFGSL AFL 、VMAGVGSPYV、TLQGLGISWL、VLQGLPREYVおよびILLVVVLGV を包含する。以下 に列挙するCTL エピトープが幾分かより好ましい：STPPPGTRV 、LLGRNSFEV 、KI FGSLAFL 、VMAGVGSPYVおよび同族体、類似体並びにこれらの配列サブセット。 本発明は、また種々の薬理組成物をも開示する。この種の組成物の一態様は、 CTL エピトープとの実質上の相同性をもつポリペプチドを含み、例示的かつ好ま しいエピトープは上記したものである。本発明の組成物は、更に製薬上許容され る担体をも含むことができる。 特異的ペプチドを表示する腫瘍細胞を溶解し得る、特異的細胞毒性Ｔ細胞の集 団も、本発明に包含される。一態様では、該ペプチドは外因的に表示される。も う一つの態様においては、該ペプチドは内因的に表示される。 ここに開示される集団の一態様において、該CTL はインビボ免疫化を介して発 生する。一変法においては、該特異的ペプチドはp53 を由来とし、もう一つの変 法では、該特異的ペプチドはHer-2/Neu を由来とする。本発明において有用なペ プチドの例は、上に既に提示したものである。 本発明は、更に種々の有用な抗−腫瘍ワクチンをも意図する。一態様において は、該ワクチンは、免疫原的に有効な量の細胞毒性Ｔリンパ細胞を刺激するペプ チドを含有する。別の態様においては、該ペプチドは内因的にまたは外因的に表 示される、あるいはプロセッシングされるタンパク、類似体もしくはその一部を 由来とするものであり得、好ましくはかかるタンパク、類似体およびその一部は 腫瘍−関連物質である。例えば、p53 およびHer-2/Neu タンパク、類似体および その一部（または配列サブセット）が本発明にとって好ましいものである。 様々な態様において、ワクチンにおいて（またはワクチンとして）使用するた めの該ペプチドはSTPPPGTRV 、LLGRNSFEV 、LLPENNVLSPL 、RMPEAAPPV 、KIFGSL AFL 、VMAGVGSPYV、TLQGLGISWL、VLQGLPREYVおよびILLVVVLGV から選択される。 別の変法においては、該ペプチドは担体と結合させることが可能である。ホモポ リマーまたはヘテロポリマーとして哺乳動物中に導入することも可能である。 本発明は、またインビボで、活性化されたCTL 細胞を発生する方法をも開示す る。一態様において、該方法はインビボにて、CTL 細胞と、真核細胞、例えば哺 乳動物細胞およびより好ましくはマウス細胞上で表面−発現される抗原担持クラ スＩ分子とを、抗原−特異的様式で、該CTL 細胞を活性化するのに十分な期間接 触させる工程を含む。一変法では、該クラスＩ分子はヒトクラスＩMHC 分子であ る。もう一つの変法においては、該クラスＩ分子はキメラヒト−マウスクラスＩ MHC 分子である。適当な抗原は、既に上に列挙したタンパク、ポリペプチド、類 似体およびその配列サブセットから選択できる。 本発明の方法は、更に該活性化されたCTL 細胞を、該抗原担持クラスＩMHC 分 子から分離し、該活性化CTL 細胞を許容される担体または賦形剤中に懸濁し、か つ治療を必要とする個体に該懸濁液を投与する各工程を含む。 本発明は、更に患者中のターゲット細胞を特異的に殺す方法をも意図する。一 態様において、このような方法は、動物に、該ターゲット細胞に対して特異的な 免疫原性ポリペプチドを投与して、細胞表面上に該ポリペプチドを表示する、一 群の抗原担持クラスＩ分子を発生せしめ、インビボにて一群のCTL 細胞と該一群 の抗原担持クラスＩ分子とを、抗原−特異的様式で、該CTL 細胞を活性化するの に十分な期間接触させ、該活性化されたCTL 細胞を該動物から収穫し、かつ該活 性化CTL 細胞を患者に投与する諸工程を含む。 前に述べたように、種々のタンパク、ポリペプチド、その一部および配列サブ セットは、このような用途に対して入手可能である。例えば、有用なペプチドは 以下の配列、即ちLLPENNVLSPL 、RMPEAAPPV 、STPPPGTRV 、LLGRNSFEV 、KIFGSL AFL 、VMAGVGSPYVおよびその配列サブセットを含む。種々の態様において、該ク ラスＩ分子は、ヒトクラスＩMHC 分子である。その他の態様においては、該クラ スＩ分子は、キメラヒト−マウスクラスＩMHC 分子である。 前に述べたように、本発明では、ターゲット細胞を特異的に殺す種々の方法を 意図している。もう一つの例示的方法では、以下の諸工程に従って調製された、 特異的かつ活性化されたCTL を使用する。該方法とは、治療を必要とする個体由 来の、Ｔ細胞を含有する流体サンプルを得る工程、エンプティー(empty)クラス ＩMHC 分子に、少なくとも１種の抗原性ペプチドを担持せしめる工程、ここで該 ペプチドは、該ターゲット細胞由来のペプチドの少なくとも一部と実質的に相同 であり、該Ｔ細胞とペプチド−担持クラスＩMHC 分子の一定量とを、活性化CTL を生成するのに十分な時間混合する工程、該活性化されたCTL を収穫する工程、 および該活性化されたCTL を該個体に投与する工程を含む。有用な抗原分子は、 既に上に列挙した。 同様に本発明で意図しているのは、腫瘍−関連抗原に対して、免疫応答を誘発 する方法である。一方法においては、細胞毒性Ｔリンパ細胞を、免疫応答を誘発 する量の、腫瘍−関連タンパク由来のペプチドを含有する分子と接触させる。例 示的タンパク、ポリペプチド、類似体、同族体およびその配列サブセットは、上 に列挙したものであり、これらは本発明の方法の種々の態様において利用するこ とができる。例えば、本発明の方法において有用な幾つかのペプチドは、アミノ 酸残基配列STPPPGTRV 、LLGRNSFEV 、KIFGSLAFL 、VMAGVGSPYVまたはその配列サ ブセットを含む。 上記方法の一変法において、該接触工程は、インビボで、好ましくは哺乳動物 中で実施する。もう一つの態様においては、該接触工程を、インビトロで実施す る。もう一つの変法では、該方法は、該接触させた細胞毒性Ｔ細胞を、宿主に戻 す工程を含む。もう一つの態様は、一つのポリペプチドを、Ｔヘルパー応答を誘 発する第二のポリペプチドと共に同時に投与することを記載する。一変法におい ては、該ポリペプチドおよび該Ｔヘルパー−誘発ポリペプチドは、相互に複合化 される。 同様に、本明細書では、特定のＴ細胞エピトープに対して応答性の、特異的細 胞毒性Ｔ細胞(CTL)を同定する方法を開示する。このような方法の一つは、個体 からリンパ細胞のテストサンプルを入手する工程と、ここで該テストサンプルは 該特異的CTL の存在についてアッセイされ、ターゲット細胞と、STPPPGTRV 、LL GRNSFEV 、KIFGSLAFL 、VMAGVGSPYVおよびその配列サブセットからなる群から選 ばれるペプチドを含有する分子とを接触させる工程と、ここで該ターゲット細胞 は該特異的CTL についてテストすべき該リンパ細胞と同一のHLA クラスの細胞で あり、該テストサンプルと、該工程ｂの分子とを、該特異的CTL と適当なター ゲット細胞との反応を再刺激するのに十分な条件下で、接触させる工程と、該リ ンパ細胞のテストサンプルが該ターゲット細胞に対して細胞毒性作用を及ぼすか 否かを決定し、結果として該特異的CTL の存在を確認する工程を包含する。 組織サンプル中の特異的Ｔ細胞エピトープと結合できるレセプタをもつ、特異 的細胞毒性Ｔ細胞(CTL)を検出する方法をも、本明細書に記載する。このような 方法の一つは、個体からリンパ細胞のテストサンプルを入手する工程と、ここで 該テストサンプルは該特異的CTL の存在についてアッセイされ、該テストサンプ ルと、標識および腫瘍関連ペプチドを含有する分子とを接触させて、混合物を生 成する工程と、該テストサンプル中の任意の特異的CTL が、適当なターゲット細 胞と反応するように再刺激するのに十分な、所定の期間、所定のアッセイ条件下 に、該混合物を維持する工程と、このような接触させた細胞を収穫し、かつ該標 識分子を含まない培地で洗浄して、あらゆる未結合標識分子を十分に除去する工 程と、適当な測定手段を使用して、該結合標識分子を測定する工程とを含む。 ここに記載した方法で使用する腫瘍−関連タンパクおよびポリペプチドを、本 明細書に詳しく記載する。本発明は、また上記本発明の方法で利用するための種 々の代用手順をも提供する。例えば、該細胞は標識分子を含有するまたは含まな い、低張液を使用して、あるいは当分野で公知の他の手段を介して溶解し、かつ 未結合の標識分子を含まない膜画分を調製することができる。 本発明は、また個体中の抗-p53抗体を検出する方法をも開示する。このような 方法の一つは、テストすべき個体から流体サンプルを得る工程と、所定量のp53 ポリペプチドを該サンプルに添加して、混合物を生成する工程と、該p53 ポリペ プチドが該サンプル中に存在する任意の抗-p53抗体と免疫反応するのに十分な期 間、生物学的アッセイ条件下で、該混合物を維持する工程と、免疫反応生成物の 存在についてアッセイして、抗-p53抗体の存在を確認する工程とを含む。前と同 様に、有用なp53 タンパク、ポリペプチド、類似体、同族体およびその配列サブ セットは、本明細書に記載される。例示的p53 ポリペプチドは以下のアミノ酸残 基配列(またはその配列サブセット)、即ちSTPPPGTRV 、LLGRNSFEV 、KIFGSLAFL 、VMAGVGSPYVを含むことができる。該p53 ポリペプチドが２以上の異なるポリペ プチド、例えばSTPPPGTRV 、LLGRNSFEV 、KIFGSLAFL 、VMAGVGSPYVおよびその配 列 サブセットからなる群から選ばれる配列を含有するポリペプチドをも意図する。 更に、本発明は、診断用アッセイ装置を包含する種々のアッセイ装置をも提供 する。キット形状のこのようなアッセイ装置の一例は、少なくとも１回のアッセ イを実施するのに十分な量の、約50個程度のアミノ酸残基を含み、かつ腫瘍−関 連タンパク由来のアミノ酸残基配列を包含する少なくとも１種のポリペプチドを 含むパッケージで構成される。例えば、一態様において、該腫瘍−関連タンパク はp53 であり、従って有用なポリペプチドは１種以上の以下のアミノ酸残基配列 またはその配列サブセットを１種以上含むことができる：LLPENNVLSPL 、RMPEAA PPV 、STPPPGTRV またはLLGRNSFEV 。これらと実質的に相同性のポリペプチドも 以下に記載するように有用である。 種々の態様において、該ポリペプチドは固体マトリックスに固定することがで きる。他の変法においては、該ポリペプチドは１種以上のポリペプチドを含み、 ここで該種は混合物として存在する。一つのアッセイ装置は、更に別のパッケー ジとして、ポリペプチド−含有免疫反応生成物の存在をシグナル化するための標 識された特異的結合試薬を含むことができる。 本発明のもう一つのアッセイ装置は、キット形状の、少なくとも１回のアッセ イを実施するのに十分な量で、腫瘍−関連抗原と免疫反応性の、抗体結合サイト −含有分子を含むパッケージを含有するアッセイ装置を包含する。前に述べたよ うに、広範囲の有用な抗原を本明細書に記載する。 一態様において、該抗体結合サイト−含有分子は固体マトリックスに固定され る。もう一つの変法では、該分子は標識されている。 本発明の抗体結合サイト−含有分子は、抗体分子または免疫学的に活性なその 一部を含み、その例は完全な免疫グロブリン分子、実質的に完全な免疫グロブリ ン分子および免疫グロブリン分子のパラトープを含有する部分、例えば当業者に はFab 、Fab'、F(ab')2およびF(v)として公知のものを包含する。一つの例示的 態様においては、本発明の抗体分子は、上記のようなポリペプチドと免疫反応で きる。一態様において、該抗体分子はモノクローナル抗体である。もう一つの態 様において、該抗体分子はポリクローナル抗体である。本発明は、更に本明細書 に記載するような抗体分子を１以上含有する組成物をも提供する。更に、本発明 は抗体結合サイトを含有する分子を分泌することのできるハイブリドーマをも記 載する。 本発明は、更にCTL エピトープと実質的な相同性をもつポリペプチドを含有す る分子をも提供する。種々のCTL エピトープを上に記載した。一つの例示的態様 においては、CTL エピトープはSTPPPGTRV 、LLGRNSFEV 、KIFGSLAFL 、VMAGVGSP YVおよびその配列サブセットからなる群から選ばれる。 一変法において、該分子は、少なくとも約８個のアミノ酸および約50個に満た ないアミノ酸を含む。他の態様において、該分子は少なくとも約８個のアミノ酸 および約13に満たないアミノ酸を含む。更に別の態様において、該ポリペプチド は、該CTL エピトープの何れかのアミノ酸残基配列と実質的に相同性のアミノ酸 残基配列をもつ。 提供されるもう一つの変法では、該ポリペプチドが、ある物質と結合されてお り、ここで該物質は放射性標識、酵素、蛍光標識、固体マトリックス、担体、お よび第二のCTL エピトープからなる群から選ばれる。一態様において、該物質は 第二のCTL エピトープであり、もう一つの態様において、該第二のエピトープは Ｔヘルパーエピトープである。更に、該担体が免疫原性脂質またはタンパクを含 むことのできる態様を提供する。更に、該ポリペプチドはリンカーにより間接的 に該物質に結合できる。 上記のおよび以下に記載する種々の態様を適当に組み合わせて、ここに記載す る発明の範囲内の、更に別の態様も本明細書に開示されているものと理解すべき である。 図面の簡単な説明 第１図は、実施例1A2eに記載されるような結合阻害アッセイにおける、ターゲ ット細胞の表面上での、テストペプチドのA2.1との結合能力を示す図である。％ 特異的溶解（EA2/Kbターゲットの％特異的溶解）が、X-軸に与えられ、またテス トしたペプチドをY-軸に与えた。ペプチドM1(1)、FLU NP 365-373(2)、VSV-N-52 -59(3)、HIV-Pol 510-518(4)、p53 264-272(5)、p53 149-157(6)、p53 65-73(7) 、p53 25-35(8)およびペプチドなし(9)の結果が与えられている。 第２図は、実施例1B1 に記載されるような、細胞表面に結合したp53-特異的ペ プチドを有するターゲット細胞のCTL-媒介溶解を例示する図である。％特異的溶 解(%-SL)がY-軸に与えられ、またエフェクタ対ターゲット細胞の比(E:T)がX-軸 に与えられている。 第2A図は、ターゲット細胞の、CTL による溶解を示す図であり、該CTL はp53. 25-35 ペプチド(CTL A2Kb25)により免疫処理したトランスジェニックマウスによ り生成されたものであった。EA2Kb細胞(それぞれEA2Kb+p53.25-35（白丸）およ びEA2Kb+p53.149-157(白抜きの三角))の表面上でA2.1/Kbと結合したp53 ペプチ ド p53.25-35およびp53.149-157 ペプチドの結果、ペプチドをもたないEA2Kb細 胞(EA2Kb：黒丸)およびp53.25-35細胞（EL-4+p53.25-35: 黒三角）の存在下でイ ンキュベートしたEL-4細胞の結果が与えられている。 第2B図は、ターゲット細胞の、CTL による溶解を示す図であり、該CTL はp53. 65-73 ペプチド(CTL A2Kb65)により免疫処理したトランスジェニックマウスによ り生成されたものであった。EA2Kb細胞(EA2Kb+p53.65-73(白丸); EA2Kb+p53.149 -157(白抜きの三角); EA2Kb(黒丸))の表面上でA2.1/Kbと結合したp53 ペプチドp 53.65-73の結果、および p53.65-73細胞（EL-4+p53.65-73: 黒三角）の存在下で インキュベートしたEL-4細胞の結果が与えられている。 第2C図は、ターゲット細胞の、CTL による溶解を示す図であり、該CTL はp53. 149-157 ペプチド(CTL A2Kb149)により免疫処理したトランスジェニックマウス により生成されたものであった。EA2Kb+p53.149-157(白丸); EA2Kb細胞(EA2Kb+p 53.264-272（白抜きの三角）の表面上でA2.1/Kbと結合したp53.264-272; EA2Kb( 黒丸);および p53.149-157細胞（EL-4+p53.149-157: 黒三角）の存在下でインキ ュベートしたEL-4細胞の結果が与えられている。 第2D図は、ターゲット細胞の、CTL による溶解を示す図であり、該CTL はp53. 264-272 ペプチド(CTL A2Kb264)により免疫処理したトランスジェニックマウス により生成されたものであった。本図にはEA2Kb+p53.264-272(白丸); EA2Kb+p53 .149-157(白抜きの三角); EA2Kb(黒丸);およびp53.264-272細胞（EL-4+p53.264- 272:黒三角）の存在下でインキュベートしたEL-4細胞の結果が与えられている。 第３図は、ターゲット細胞のを示す図であり、実施例1B2bに記載するように、 細胞表面上でA2と結合した内因性p53 特異的ペプチドを表す。％特異的溶解(%-S L)がY-軸に与えられ、またエフェクタ対ターゲット細胞の比(E:T)がX-軸に与え られている。 第3A図は、CTL A2Kb25によるターゲット細胞の溶解を示す図である。EA2Kb（ 白丸）およびアミノ酸配列273 に変異を含む、ヒトp53 遺伝子により発現された 、A2/Kb−結合内因性p53 ペプチドをもつEA2Kb（EA2Kb.1 p53 (273);黒丸）の結 果が与えられている。 第3B図は、CTL A2Kb65によるターゲット細胞の溶解を示す図である。EA2Kb（ 白丸）およびEA2Kb.1 p53(273)(黒丸)の結果が与えられている。 第3C図は、CTL A2Kb149 によるターゲット細胞の溶解を示す図である。EA2Kb （白丸）、EA2Kb.1 p53(273)(黒丸)、EA2Kb細胞(EA2Kb+p53.149-157（白抜きの 三角）の表面上でA2.1/Kbと結合したp53 ペプチドp53.149-157 ペプチドおよびE A2Kb.1 p53(273)(EA2Kb.1 p53(273)+p53.149-157;黒三角)の表面上でA2.1/Kbと 結合したp53 ペプチドp53.149-157 ペプチドをもつ、EA2Kb.1 p53(273)細胞につ いての結果が与えられている。 第3D図は、CTL A2Kb264 によるターゲット細胞の溶解を示す図である。EA2Kb （白丸）、EA2Kb.1 p53(273)(黒丸)、EA2Kb細胞(EA2Kb+p53.264-272（白抜きの 三角）の表面上でA2.1/Kbと結合したp53 ペプチドp53.264-272 ペプチドおよびE A2Kb細胞(EA2Kb.1 p53(273)+p53.264-272;黒三角)の表面上でA2.1/Kbと結合した EA2Kb.1 p53(273)p53.264-272ペプチドについての結果が与えられている。 第3E図は、HIV pol510-518ペプチド(CTL CD8xA2KbHIV-pol)によって免疫化処 理したトランスジェニックマウス由来の、CTL によるターゲット細胞の溶解を示 す図である。EA2Kb（白丸）およびEA2Kb.1 p53(273)(黒丸)の結果が与えられて いる。 第４図は、実施例1B2bに記載するように、Saos-2ターゲット細胞のCTL-媒介溶 解を示す図である。％特異的溶解(%-SL)がY-軸に与えられ、またエフェクタ対タ ーゲット細胞の比(E:T)がX-軸に与えられている。 第4A図は、CTL A2Kb25によるターゲット細胞の溶解を示す図である。Saos-2タ ーゲット細胞のみ（Saos-2;白丸）およびアミノ酸残基175 に変異をもつヒト変 異体p53 遺伝子を発現するSaos-2ターゲット細胞(Saos-2/175;黒丸)を使用した 結果が示されている。第4B図には、CTL A2Kb65によるターゲット細胞の溶解が示 されている。Saos-2（白丸）およびSaos-2/175（黒丸）を使用した結果が示され ている。 第4C図は、CTL A2Kb149 によるターゲット細胞の溶解を示す図である。Saos-2 （白丸）および細胞表面上でA2と結合したp53.149-157 ペプチドをもつSaos-2/1 75ターゲット細胞(Saos-2/175+p53.149-157;黒三角)を使用して得た結果が示さ れている。第4D図は、CTL A2Kb149 によるターゲット細胞の溶解を示す図である 。Saos-2（白丸）およびSaos-2/175（黒丸）ターゲット細胞の結果が示されてい る。 第4E図は、CTL A2Kb264によるターゲット細胞の溶解を示す図である。Saos-2 （白丸）およびSaos-2/175（黒丸）ターゲット細胞の結果が示されている。第4F 図は、CTL CD8xA2KbHIV-pol によるターゲット細胞の溶解を示す図である。Saos -2（白丸）およびSaos-2/175（黒丸）ターゲット細胞に関する結果が示されてい る。 第５図は、実施例2A3 に記載されるように、細胞表面に結合したHer-2/Neu 由 来の特異的ペプチドをもつ、ターゲット細胞の、CTL-媒介溶解を示す図である。 ％特異的溶解(%51Cr放出)がY-軸に与えられ、またエフェクタ対ターゲット細胞 の比(クローン12(E/T))がX-軸に与えられている。このCTL(クローン12)は、実施 例1A2cに記載されるように、インフルエンザG-マトリックスペプチド(SEQ ID NO 8)により免疫処理したトランスジェニックマウスにより生成されたものであっ た。このG-マトリックスおよびM1(58-66)ペプチドは、同一のアミノ酸配列をも つ。該EA2Kbターゲット細胞の表面上でA2.1/Kbと結合した、このG-マトリックス ペプチド(G-MATRIX;白丸)、Her-2/Neu ペプチドHer-3(黒丸)、Her-6(白角)、Her -7(黒角)、Her-8(白三角)、Her-9(黒三角)に関する結果が与えられている。 第６図は、実施例2A3 に記載されるように、細胞表面に結合したHer-2/Neu 由 来の特異的ペプチドをもつ、ターゲット細胞の、CTL-媒介溶解を示す図である。 ％特異的溶解(%51Cr放出)がY-軸に与えられ、またエフェクタ対ターゲット細胞 の比(E/T)がX-軸に与えられている。Her-3 またはHer-7 ペプチド（それぞれH3- popおよびH7-pop）により免疫化されたトランスジェニックマウス(A2KbxCD8)に より生成されたCTL によるターゲット細胞のCTL-媒介溶解が示されている。EA2Kb 細胞の表面上でA2.1/Kbと結合したHer-3(それぞれEA2Kb+Her-3pep（黒丸）およ びEA2Kb＋Her-7pep(白丸))およびペプチドを含まないEA2Kb細胞(EA2Kb(黒三角)) の結果が与えられている。EA2Kb細胞の表面上でA2.1/Kbと結合したHer-7 の結果 (それぞれEA2Kb+Her-3-pep（黒角）およびEA2Kb+Her-3-pep(黒三角))およびペプ チドを含まないEA2Kb細胞(EA2Kb(黒三角))の結果が与えられている。 第７図は、実施例2B2に記載されるように、細胞表面上でA2.1/Kbと結合した内 因性Her-2/Neu 特異的ペプチドを発現するターゲット細胞の、CTL-媒介溶解を示 す図である。％特異的溶解(%51Cr放出）がY-軸に与えられ、またエフェクタ対タ ーゲット細胞の比(E/T)がX-軸に与えられている。CTL はHIV 由来のペプチド(SE Q ID NO 5)(HIV-pop)によって免疫化したトランスジェニックマウス(A2KbxCD8) により生成されたものであった。ターゲット細胞EA2Kb（EA2Kb；白丸）およびHe r-2/Neu 遺伝子により発現されたA2/Kb結合内因性Her-2/Neu ペプチドをもつEA2 Kb(EA2Kb-Her-2; 黒丸)のHer3(H3-pop)CTL-媒介溶解、ターゲット細胞EA2Kb（EA 2Kb；白角）およびA2/Kb結合内因性Her-2/Neu ペプチドをもつEA2Kb(EA2Kb-Her- 2; 黒角)のHer7(H7-pop)CTL-媒介溶解、ターゲット細胞EA2Kb（EA2Kb；白三角） およびA2/Kb結合内因性Her-2/Neu ペプチドをもつEA2Kb（EA2Kb-Her-2; 黒三角 ）のHIVpol(HIV-pop)CTL-媒介溶解に関する結果が与えられている。 第８図は、実施例3A2aに記載するような、乳癌細胞系の、Her-3 、Her-7 およ びHIV CTL-媒介溶解を示す図である。％特異的溶解(%51Cr放出)がY-軸に与えら れ、またエフェクタ対ターゲット細胞の比(E/T)がX-軸に与えられている。ター ゲット細胞MCF-7 、MDA 23.1およびMDA 435(MCF-7-A2+Neu+（白丸）、MAD 23.1- A2+Neu+（黒角）およびMDA 435A2+Neu+(白角))のHer-3 CTL-媒介溶解およびHer- 2/Neu 遺伝子(EA2Kb-Her-2)を発現するターゲット細胞MCF-7 （黒丸）、MDA 23.1（白三角）およびMDA 435(黒三角)のHer-7 CTL-媒介溶解に 関する結果を与えた。 第９図は、実施例３に記載するような、乳癌細胞系MDA-23.1のHer-7 およびHI V CTL-媒介溶解能力に及ぼすA2濃度および抗−A2モノクローナル抗体の効果を示 す図である。％特異的溶解(%51Cr放出)がY-軸に与えられ、またエフェクタ対タ ーゲット細胞の比(E/T)がX-軸に与えられている。抗-A2の不在下および存在下に おけるターゲット細胞MDA-23.1のHer-7 CTL-媒介溶解(Her2-7 CTL+anti-A2(Her2 -7 CTL)(それぞれ白角および黒角))および抗−A2の不在下および存在下における ターゲット細胞MDA-23.1のHIVpolCTL-媒介溶解(HIVpol CTL +anti-A2(HIVpol CT L)(それぞれ白丸および黒丸))に関する結果が与えられている。 第10A-H 図は、A2.1/Kb-Tg およびA2.1-Tg マウスからp53-特異的CTL によっ て内因的に合成したp53 エピトープのA2.1−制限認識を示す図である。エフェク タCTL はTgマウスのペプチド−刺激により生成した。第10ＡおよびＢ図では、該 CTL 細胞系はA2Kb149-感作されており、第10ＣおよびＤ図では、該CTL はA2Kb26 4 で感作されている。第10ＥおよびＦ図では、該CTL 細胞系は、A2 149−感作さ れており、第10ＧおよびＨ図では、該CTL はA2 264で感作されている。第10A-H 図では、エフェクタ：ターゲット(E:T)比は、特異的51Cr放出(%)に対してプロッ トされている：第10ＡおよびＣ図：T2A2/Kb（白丸，○）またはT2A2/Kb+p53.149 -157（黒丸，●）またはT2A2/Kb+p53.264-272(黒角，■);第10ＥおよびＧ：T2（ ○）またはp53.149-157(●)またはp53.264-272(■)でパルスしたT2；第10Ｂ、Ｄ 、ＦおよびＨ：Soas-2（白抜きの三角，△）またはヒトp53、Soas-2/175により トランスフェクションした同一の細胞(黒三角，▲)(例えば、ディットマー(Ditt mer)等，Nature Genet.1993，4: 42-6; マスダ(Masuda)等，PNAS USA，1987，84 : 7716-9; ヒンズ(Hinds)等，Cell Growth Diff.，1990，1: 571-580 を参照の こと)。両細胞系共に、フローサイトメトリーにより検出されるように、同一濃 度のA2.1を発現した。（例えば、イルビン(Irwin)等，J．Exp．Med.，1989，170 : 1091-1101を参照のこと）。 第11ＡおよびＢ図は、p53-特異的CTL 細胞系によるペプチド識別効率を表す図 である。hu-wt-p53 .149-157 および264-272 に対して特異的なCTL 細胞系は、 A2.1-Tg(CTL A2 149およびCTL A2 264)並びにA2.1/Kb-Tg マウス(CTL A2/Kb149 およびCTL A2/Kb264)から樹立し、非−ペプチドおよびp53.149-157-パルスT2タ ーゲット（第11Ａ図）または非−ペプチドおよびp53.264-272-パルスT2ターゲッ ト（第11Ｂ図）に対する溶解活性につき、10:1のE:T 比にてアッセイした。51Cr 標識後、ペプチドを指定濃度で使用して、T2をパルス処理した。エフェクタ細胞 はCTL A2 149（黒丸，●）、CTL A2/Kb149（白丸，○）、CTL A2 264（黒角，■ ）およびCTL A2/Kb264（白，□）であった。データは４時間の51Cr放出アッセイ の結果を表し、従って特異的51Cr放出(％)を、ペプチド濃度(M)に対してプロッ トした。 第12図は、ペプチドのA2.1/Kbへのインビトロ結合を示す図である。A2.1/Kbと 結合したHer-2/Neu-特異的ペプチド各々は、以下の実施例５に記載するような競 合的結合アッセイで測定した。該テストペプチドの該ターゲット細胞への結合は 、インフルエンザA-特異的ペプチドの結合の競合的阻害により検出でき、これは 該インフルエンザA-特異的CTL の、該ターゲット細胞の溶解能力における減少に より証拠付けられた。該競合ペプチドは縦軸上に示されており、溶解の％阻害は 横軸に示されている。データは、該ペプチドの各々による溶解の％阻害率で与え られている。阻害なしは71% の溶解を表す。 第13ＡおよびＢ図は、Her-2/Neu-特異的CTL 細胞系によるペプチド識別効率を 示す図である。A2.1-Tg またはA2/Kb-Tg マウスから樹立した、該H7- およびH3 −特異的CTL を、それぞれH7およびH3ペプチドに対する溶解活性についてアッセ イした。ペプチドを指定した濃度で使用して、T2標識したターゲットをパルス処 理した。％特異的溶解を、ペプチド濃度（モル）に対してプロットした。第13Ａ 図において、白丸（○）はH7-A2.1/KbxCD8を表し、一方黒丸（●）はH7-A2.1を 表す。第13Ｂ図において白丸（○）はH3-A2.1/KbxCD8を表し、一方黒丸(●)はH3 -A2.1 を表す。データは４時間のアッセイにおける、1:1 のエフェクタ対ターゲ ット比(E:T)での溶解を表す。 第14Ａ-D図は、抗-A2抗体による特異的殺傷の阻害を表す。抗-A2 mAb(PA2.1) を使用して、CTL 溶解がA-2 に制限されるか否かを確認した。エフェクタ細胞の 添加前に、腫瘍細胞を、0.5mg/mlのPA2.1 mAb の存在下または不在下でインキュ ベートした。第14Ａ-D図の各々においては、％特異的溶解を比E:T に対してプロ ットした。第14Ａ図においては、黒丸（●）はNCI-H1355を表し、一方黒角(■) はNCI-H1355-PA2.1 を表す。第14Ｂ図において、黒丸（●）はMDA-231 を表し、 一方黒角（■）はMDA-231-PA2.1 を表す。第14Ｃ図において、黒丸（●）はSAOS -175を表し、一方黒角（■）はSAOS-175-PA2.1を表す。第14Ｄ図において、黒丸 （●）はT98Gを表し、一方黒角（■）はT98G-PA2.1を表す。 第15Ａ-D図は、H3およびH7ペプチドが腫瘍細胞表面上に提示されることを示す 図である。MDA.MB.231およびMCF-7 腫瘍細胞系由来のペプチドを、酸溶出により 抽出し、実施例５に記載のようにして、Ｃ18分析カラムを使用して分画した。HP LC分画後、これらサンプルを凍結乾燥し、100 μｌのPBS 中に再懸濁させた。MD A.MB.231（第15Ａおよび15Ｃ図）およびMCF-7(第15Ｂおよび15Ｄ図)からの各画 分50μｌを使用して、T2-A2Kbターゲット細胞をパルス処理し、かつH3（第15Ａ および15Ｂ図）およびH7（第15Ｃおよび15Ｄ図）CTL 集団による識別についてア ッセイした。データは４時間のアッセイにおける、E:T 比10:1での溶解を表す。 第15Ａ-D図の各々において、％特異的溶解はHPLC−画分に対してプロットしてあ る。 発明の詳細な説明 A．定義 アミノ酸残基：アミノ酸、例えばポリペプチドのペプチド結合部分において、 該ポリペプチドを化学的に消化（加水分解）した際に形成されるアミノ酸。本明 細書に記載するアミノ酸残基は、好ましくは“L”アイソマー型のものである。 しかしながら、所定の機能特性が、該ポリペプチドにより保持される限り、“D ”アイソマー型の残基を任意のL-アミノ酸残基と置換できる。NH2は、ポリペプ チドのアミノ末端に存在する遊離のアミノ基を表す。COOHは、ポリペプチドのカ ルボキシ末端において存在する遊離のカルボキシル基を表す。標準的なポリペプ チド命名法(J．Biol．Chem.，1969，243:3552-59に記載されており、かつ37 C.F .R.§1.822(b)(2)において採用されている)に従って、アミノ酸残基の略号を、 以下の対照表に示す。 本明細書に式で表示されるアミノ酸残基配列全ては、アミノ末端からカルボキ シ末端への公知の向きで、左から右への配向をもつことに注意すべきである。更 に、「アミノ酸残基」とは上記対照表に掲載されたアミノ酸および修飾されたお よび馴染みでないアミノ酸、例えば37 C.F.R．§1.822(b)(4)(これを本発明の参 考文献とする)に列挙されているものを包含すべく広義で定義される。更に、ア ミノ酸残基配列の開始点または終点におけるダッシュは、１またはそれ以上のア ミノ酸残基をもつ更なる配列またはアミノ末端基、例えばNH2またはカルボキシ 末端基、例えばCOOHに対するペプチド結合を示すことに注意すべきである。 本明細書で使用する用語「保存性置換」とは、一個のアミノ酸残基が、他の生 物学的に類似の残基により置換されていることを意味する。保存性置換の例は、 １個の疎水性残基、例えばIle、Val、Leu またはMet の、その他の疎水性残基へ の置換、または１つの極性残基の他の極性残基への置換、例えばArg とLys との 間、Glu 5-Asp との間またはGln とAsn との間の置換等を包含する。この「保存 性置換」なる用語は、また未置換の親アミノ酸の代わりに、置換アミノ酸を使用 することを包含するが、但しこのようなポリペプチドは、必要条件として結合活 性を示す必要がある。 幾つかの例において、イオン性の残基の反対電荷をもつイオン性残基、例えば Asp のLys による置換は、当分野において、これらのイオン性の基が単に補助的 な溶解性を与えるに過ぎないと考えられている点で、保存性であると称されてい る。しかしながら、一般的には、ここで論じる置換は、全タンパクに比して、比 較的短い合成ポリペプチド抗原に関連するので、イオン性残基の反対電荷をもつ イオン性残基による置換は、非イオン性残基とイオン性残基との間、および嵩高 い残基、例えばPhe 、Tyr またはTrp と、余り嵩高くない残基、例えばGly 、Il e およびVal との間の置換と同様に、本発明においては「ラジカル置換」である と考えられる。 種々の文法上の形態での「抗体」なる用語は、本発明では、免疫グロブリン分 子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、即ち抗体結合サイトまた はパラトープを含む分子を表すのに使用する。例示的抗体分子は完全な免疫グロ ブリン分子、実質的に完全な免疫グロブリン分子および、Fab、Fab'、F(ab')2お よびF(v)として当分野で公知の部分を包含する、該パラトープを含む、免疫グロ ブリン分子の一部である。 「抗体結合サイト」なる用語は、抗原と特異的に結合（免疫反応）する、重鎖 および軽鎖可変および超可変部領域で構成される抗体分子の当該構造部分を意味 する。 本明細書および請求の範囲で、ポリペプチド配列との関連で使用する、種々の 文法上の形態での「対応」なる用語は、アミノ−およびカルボキシ−末端の何れ かまたは両者における±３個までのアミノ酸残基をもつ、記載されたポリペプチ ド配列であって、特に該ポリペプチド配列に沿った保存性の置換のみを含む該ポ リペプチド配列を意味する。 「ポリペプチド」および「ペプチド」なる用語は、本明細書では互換性ある用 語として使用し、α−アミノ酸と隣接残基のカルボキシ基との間のペプチド結合 により相互に結合された一連の約50程度のアミノ酸残基をもつものを表す。 「タンパク」：タンパクとは、ポリペプチドにおけると同様に相互に結合した 一連の50を越えるアミノ酸残基を表すのに、本明細書で使用する用語である。 「レセプタ」および「レセプタタンパク」とは、他の分子に特異的に結合する 生物学的に活性なタンパク質性分子を表すのに本発明で使用する用語である。 「実質的に相同性」とは、特定の対象となる配列または分子、例えば変異配列 が、基準となる配列から、一以上の置換、欠失または付加だけ変更され、その正 味の効果が、該基準と対象の配列との間の、負の機能的な異化性をもたらさない ことを意味する。本発明の目的にとって、90％を越える類似性、等価な生物学的 活性、および等価な発現特性をもつアミノ酸配列は、実質的に相同であると考え られ、かつ用語「PBS 」および「Her-2/Neu 」により定義されるタンパクの範囲 内に含まれる。40％を越える類似性をもつアミノ酸配列は、実質的に類似すると 考えられる。相同性または類似性を決定するためには、後に例えばグリコシル化 により該分子を修飾すべきことから、該基準配列の切頭または内部欠失は無視す べきである。より低い相同性および匹敵する生物活性をもつ配列が等価であると 考えられる。 本発明で使用する用語「トランスフェクション」とは、真核細胞中に添加され たDNA の組み込みによる、新たな遺伝的マーカーの獲得を意味し、一方で「形質 転換」とは、原核細胞中に添加されたDNA の組み込みによる、新たな遺伝的マー カーの獲得を意味する。本明細書で使用する用語「ベクター」とは、自己複製可 能なDNA 分子を意味し、かつDNA セグメント、例えば遺伝子またはポリヌクレオ チドを、機能可能に結合して、該付着したセグメントの複製をもたらすことので きるDNA 分子である。 １以上のタンパクをコードするDNA セグメント（遺伝子）の発現を誘発できる ベクターは、本明細書では「発現ベクター」という。同様に、逆転写酵素を使用 して製造したmRNA由来のcDNA(相補DNA)のクローニングをも可能とするベクター をも包含する。 B．詳細な説明 1．腫瘍特異的抗原を使用した、腫瘍免疫原性の増強 a. p53 タンパク 正常なp53 タンパクは細胞サイクルの調節剤として機能する。DNA に損傷を与 える影響、例えばUV光等に応答して、正常なp53 タンパクが、細胞核中に蓄積さ れ、G1段階における細胞サイクルの停止を生じ、かくして細胞が該DNA 損傷を修 復することを可能とする。p53 のこの機能は腫瘍細胞中では喪失されており、該 細胞中でp53 は、該遺伝子の変異によりまたはウイルスまたは細胞性癌遺伝子に よりコードされるタンパクのp53 への結合によって不活性化されている。結果と して、遺伝子の改変が、冒された細胞中で急速に蓄積され、悪性形質転換に導か れる（例えば、レーン(Lane)，Nature，1992，358: 15-16; ウルリッヒ(Ullrich )等，J．Biol．Chem.，1992，267:15259-15262; ハートウエル(Hartwell)，Cell ,1992，71: 543-546を参照のこと）。 どの程度のp53 の過剰発現（p53 の発現はDNA 損傷に対する正常な応答として 理解されている）が、該p53 タンパクに対する免疫応答に導くかについては、未 知である。何れにしろ、該p53 遺伝子(p53)の変異は、ヒトの癌に関連した最も 高い頻度の遺伝的変化である。更に、p53 において変異をもつ多くの腫瘍細胞に おいては、該p53 タンパクは、また低い破壊によっても過剰発現される。 更に、この過剰発現は、しばしば抗−p53 抗体の形成と関連している。例えば 最近の一研究においては、このp53 タンパクに対する立証可能な血清抗体をもつ 全ての小細胞肺癌患者が、p53 にミスセンス突然変異を有し、かつその腫瘍細胞 系に過剰発現されたp53 抗原を有していた。一研究は、抗−p53 抗体が、他の多 価のp53 突然変異をもつ患者由来の血清中には検出されないことを報告した（ウ インター(Winter)等，Cancer Res.，1992，52: 4168-74）。 また、乳癌患者中のp53 に対する抗体応答が、突然変異「ホットスポット」と は関係のない免疫優勢エピトープに向けられることが報告されている(シュリッ ヒトルツ(Schlichtholz)等，Cancer Res.，1992，52: 6380-4)。これらの抗体は 該突然変異「ホットスポット」領域外の、該タンパクのカルボキシ−およびアミ ノ−末端に位置する２つの免疫優勢領域と反応性であった（同上）。 免疫優勢エピトープに向けられた抗体の検出は、このような抗体が実際に自己 抗体であることを示唆している。というのは、これらが正常なp53 配列に向けら れているからである。順に、この発見は、正常な細胞中のp53 の低濃度は、該免 疫系により「無視されて」いることを示し、これはp53 に向けられた免疫療法が 正常な細胞に殆どまたは全く損傷を与えないであろうことを意味している。 可能な治療原理としての、p53 に対する自己免疫性の概念は、HLA A2.1 MHCク ラスＩ分子によって提示される野性型のp53 ペプチドに対する、CTL 応答のイン ビトロ刺激によっても支持されている。関連する研究においては、HLA A2.1によ り提示される、変異p53 ペプチドに対するCTL も得られた。両ペプチドに対する 応答は、健常なドナー由来の応答するＴリンパ細胞によって得られた。これらの CTL が、p53 を過剰発現する変異体により、HLA-適合腫瘍細胞を認識できる程度 をテストしたが、興味あることに、より高いアフィニティーでHLA A2.1に結合す る、p53 自己−ペプチドによる刺激では、CTL が得られず、このことは該ペプチ ドが免疫寛容を誘発できることを示唆している（メリーフ＆カスト(Melief and Kast)，Curr．Op．Immunol.，1993，5: 709-13を参照のこと）。 b. Her-2/Neu c-erbB-2としても知られる、Her-2/Neu はプロトオンコジーヌの１種であり、 これはチロシン−特異的キナーゼ活性をもつ、185kDaの貫膜レセプタ糖タンパク をコードする。このタンパクの発現は、幾つかの胸部および卵巣腫瘍において増 強され、かつ腫瘍の攻撃性と相関し、腫瘍の増殖において重要な役割を演じてい る可能性があることを示唆している（例えば、ローニデス(loannides)等，Cellu lar Immunol.，1993，151: 225-234 を参照のこと）。このHer-2/Neu タンパク は、また増殖因子レセプター様タンパクとしても記載されている（例えば、ディ フィオレ(Difiore)等，Science，1987，237: 178-182;バーグマン(Bargmann)等 ，Nature，1986，319: 226-230; ヤマモト(Yamamoto)等，Nature，1986，319: 2 30-234を参照のこと）。 Her-2/Neu は、構造並びに配列の点で、表皮増殖因子レセプタに類似している （クッセンズ(Coussens)等，Science，1985，230: 1132）。Her-2/Neu 癌遺伝子 （erbB-2とも呼ばれる）は、ヒトの胸部および卵巣腫瘍の約30％において増幅さ れ、かつ過剰発現され、しかもこのHer-2/Neu タンパクのこの過剰発現は、これ ら疾患における貧弱な予後と相関付けられる（スラモン(Slamon)等，Science，1 989，244: 707）。 最近のインビトロ実験は、少なくとも３つの抗原性エピトープが、腫瘍−関連 CTL により、卵巣癌細胞上で認識されたことを報告している（ローニデス(loann ides)等，J．Immunol.，1991，146: 1700）。別の研究は、卵巣表皮腫瘍細胞のC TL-媒介溶解に対する感受性が、Her-2/Neu の発現レベルと関連しており、この 癌遺伝子生成物は腫瘍−関連抗原の源として、またはかかるペプチドの誘導物質 として機能する可能性があることをほのめかしている（ヨシノ(Yoshino)等，J.I mmunol.，1994，152: 2393）。これら腫瘍−関連抗原(TAA)の同一性および起源 は未知であるが、これらの癌遺伝子生成物は、論理的な候補物質であると思われ る。Her-2/Neu 発現と卵巣癌に対する免疫応答との間の潜在的関連性は、明確で はないが、Her-2/Neu 発現はリンホカイン−活性化キラー細胞−媒介殺傷と逆に 関連している可能性があることが報告されている(リヒテンシュタイン(Lichtens tein)等，Cancer Res.，1990，50: 7364)。 別の研究は、HLA-A2+およびHer-2/Neu+腫瘍を含む腫瘍−関連リンパ細胞由来 のCTL が、Her-2/Neu タンパクのアミノ酸971-980 に相当する合成ペプチドを特 異的に識別することを報告している(ローニデス(loannides)等，Cellular Immun ol.，1993，151: 225-234)。 2．ポリペプチド 本発明のポリペプチドまたはペプチドは、好ましくは「ターゲット」細胞また は組織、例えば腫瘍細胞または他の悪性癌細胞または組織によって発現されるタ ンパク由来のものである。一態様において、有用なペプチドを誘導できるかかる タンパクは、ターゲット細胞または組織に対して固有のものである。また、例示 的ペプチドは「正常」な細胞中で発現されるタンパク由来のものであり得るが、 腫瘍細胞等の「異常な」細胞中で過剰発現される。 例えば、本発明のポリペプチドは、p53 タンパク、Her-2/Neu タンパク、また はその他の候補（即ち、腫瘍−関連）タンパク由来のものであり得る。用語「ポ リペプチド」および「ペプチド」は、本明細書では互換性あるものとして使用で きる。 かくして、本発明の例示的ポリペプチドは、好ましくはそのアミノ酸残基配列 が、正常なp53 タンパク、p53 タンパクの変異型、p53 タンパク類似体、または これらの誘導体の１以上のアミノ酸残基配列に対応するものである。例えば、p5 3-由来のポリペプチドは、式STPPPGTRV またはその配列サブセットに対応するア ミノ酸残基配列を含むことができる。 もう一つの本発明の例示的ポリペプチドは、そのアミノ酸残基配列において、 正常なHer-2/Neu タンパク、Her-2/Neu タンパクの変異型、Her-2/Neu タンパク 類似体、またはこれらの誘導体の１以上のアミノ酸残基配列に対応するものであ る。例えば、Her-2/Neu-由来のポリペプチドは、式KIFGSLAFL 、VMAGVGSPYVまた はその配列サブセットに対応するアミノ酸残基配列を含むことができる。 本発明のポリペプチドは、またその配列において、ターゲット細胞または組織 中で発現される、または異常に発現されるタンパクのポリペプチド部分に対する 相同性を示すことができる。好ましくは、本発明のポリペプチドは、p53 タンパ クまたはHer-2/Neu タンパクの配列サブセットに対応し、ここで「配列サブセッ ト」とは、ポリペプチドが、大きなタンパクまたはポリペプチドのアミノ酸残基 配列のサブセットの配列に対応する、アミノ酸残基配列をもつという事実を意味 する。例えば、“ABCDEFGH”がポリペプチドのアミノ酸残基配列を表すとすると 、 その例示的配列サブセットは、“ABC”、“BCDE”、“DEFGH”、“ABCDEFG”等 を含むであろう。 本発明は、幾つかの腫瘍抗原（特に、このような抗原が、該抗原を発現できる 宿主細胞中で発現された場合に）に対する、HLA クラスI制限細胞毒性Ｔリンパ 細胞(“CTL”)の応答を刺激する幾つかのポリペプチドを提供する。このような ポリペプチドは腫瘍および悪性癌、例えば乳癌の治療、予防並びに診断用の組成 物並びに方法において有用である。例えば、本発明の刺激されたCTL は、抗原− 発現細胞を特異的に攻撃し、かつこれを殺すことができ、結果として関連する疾 患過程を阻害し、妨害し、もしくは逆転することができる。本発明の範囲内では 、エピトープの新規な組み合わせについては、上で簡単に説明し、以下に更に詳 細に説明される該CTL 応答を、T-ヘルパー応答または例えば種々の抗原に向けら れた多重CTL 応答と組み合わせることが意図されている。 本発明のポリペプチドは腫瘍関連タンパクまたはこれをコードするヌクレオチ ド配列の種々の領域由来のものである。例えば、以下のアミノ酸残基配列（また はその配列サブセット）を有する、p53 ペプチドが本発明において意図されてい る。即ち、p53.25-35，LLPENNVLSPL(SEQ ID NO 1)、p53.65-73，RMPEAAPPV(SEQ ID NO 2)、p53.149-157，STPPPGTRV(SEQ ID NO 3)、p53.264-272，LLGRNSFEV(SE Q ID NO 4)である。更に、以下のアミノ酸残基配列（またはその配列サブセット ）を有する、Her-2/Neu ペプチドも、本発明において意図されているペプチドで ある。即ち、HER-3，KIFGSLAFL(SEQ ID NO 10)、HER-6，TLQGLGISWL(SEQ ID NO 11)、HER-7，VMAGVGSPYV(SEQ ID NO 12)、HER-8，VLQGLPREYV(SEQ ID NO 13)、 およびHER-9，ILLVVVLGV（SEQ ID NO 14）である。 本発明の幾つかの態様においては、興味アルブミンポリペプチドはここに列挙 した配列並びに以下に列挙されるその他の配列をもち、あるいはこれらに実質的 に相同の配列をもつであろう。２つのポリペプチドは、アミノ酸(“aa”)残基の 少なくとも50％が同一で、同一または類似の位置にある場合に、実質的に相同で あると言われる。類似位置とは、対象としているポリペプチドに付着できる任意 のフランキングポリペプチドまたは他の化学的要素とは無関係に、該対象とする ポリペプチド自身の相対的位置を意味する。 本発明において使用する好ましいペプチドは、従って以下のペプチドと同一で ある必要はないが、少なくとも実質的に相同である必要がある：LLPENNVLSPL(SE Q ID NO 1)、RMPEAAPPV(SEQ ID NO 2)、STPPPGTRV(SEQ ID NO 3)、LLGRNSFEV(SE Q ID NO 4)、KIFGSLAFL(SEQ ID NO 10)、TLQGLGISWL(SEQ ID NO 11)、VMAGVGSPY V（SEQ ID NO 12)、VLQGLPREYV（SEQ ID NO 13）およびILLVVVLGV(SEQ ID NO 14 )。 本発明は、上記のポリペプチド群と同一の群からなる群から選ばれるCTL エピ トープと実質的な相同性をもつポリペプチドに関する。好ましいポリペプチドは LLPENNVLSPL(SEQ ID NO 1)、RMPEAAPPV(SEQ ID NO 2)、STPPPGTRV(SEQ ID NO 3) 、LLGRNSFEV(SEQ ID NO 4)、KIFGSLAFL(SEQ ID NO 10)、TLQGLGISWL（SEQ ID NO 11）、VMAGVGSPYV（SEQ ID NO 12）、VLQGLPREYV（SEQ ID NO 13）およびILLVV VLGV(SEQ ID NO14)を包含する。 特に、本発明は、上記CTL エピトープの一つと実質的な相同性をもつポリペプ チドを含む適当な分子に関連する。本発明の分子は、少なくとも約５個のアミノ 酸および約50個程度のアミノ酸を含む。本発明の分子にとって好ましいアミノ酸 の範囲は、約７個のアミノ酸から、約25個に満たないアミノ酸までである。より 好ましいアミノ酸の範囲は、約８個のアミノ酸から、約15個に満たないアミノ酸 までである。アミノ酸のより好ましい範囲は、約８個のアミノ酸から、約13個未 満の範囲内である。 本発明のペプチドの長さを、約8〜12個のアミノ酸残基相当にまで最適化する ことが望ましく、これは該細胞表面上の、主な組織適合性錯体(“MHC”)クラス Ｉ分子に結合している、内在的にプロセッシングされたペプチドと、サイズにお いて釣り合っている。一般的には、シューマッハ(Schumacher)等，Nature，1991 ，350: 703-706; ファンブリーク(Van Bleek)等，Nature，1990，348: 213-216; ロッツシュケ(Rotzschke)等，Nature，1990，348: 252-254; およびフォーク(F alk)等，Nature，1991，351: 290-296を参照のこと。クラスＩMHC 分子の選別並 びに生成法は、米国特許第5,314,813 号にも記載されている。その開示を本発明 の参考とする。 以下により詳細に記載するように、通常本発明のペプチドは、少なくとも上記 のp53 またはHer-2/Neu 配列の対応する連続的な残基部分に対して相同性である 大部分のアミノ酸をもち、かつCTL-誘発エピトープを含むであろう。 本発明のペプチドは、任意の適当な手段、例えば標準的なペプチド合成化学を 利用した、あるいは組み換えDNA 技術を利用した合成法により調製できる。該ペ プチドは、好ましくは他の天然に発生するp53 またはHer-2/Neu タンパクおよび そのフラグメントを実質的に含まないが、幾つかの態様においては、該ペプチド は、天然のフラグメントまたは粒子もしくは非−タンパク質性の他の化合物と合 成的に結合することができる。ペプチドなる用語は、本明細書においては、ポリ ペプチドまたはオリゴペプチドと互換性あるものとして使用して、隣接するアミ ノ酸のα−アミノとα−カルボキシとの間のペプチド結合によって相互に結合さ れた一連のアミノ酸を表す。本発明のポリペプチドまたはペプチドは、その中性 型（実際には両性イオン型）または塩の形状で任意の適当な長さをもつことがで き、および修飾、例えばグリコシル化、側鎖の酸化、またはホスホリル化等によ る修飾を含まず、あるいは本明細書に記載されるような、該ポリペプチドの生物 学的な活性を該修飾が破壊しないような条件下で、これらの修飾を含むことがで きる。 望ましくは、該ペプチドはできる限り小さく、かつ初めに本明細書に記載した ような大きなペプチドのもつ生物学的活性の実質的全てを、依然として維持して いるものである。生物学的活性なる用語は、適当なMHC 分子と結合する能力およ びp53 またはHer-2/Neu 抗原もしくは抗原模擬体に対する細胞毒性Ｔリンパ細胞 応答を誘起する能力を意味する。細胞毒性Ｔリンパ細胞応答なる用語は、対象と する抗原に対して特異的なCD8+Ｔリンパ細胞応答を意味し、ここでCD8+、MHC ク ラスＩ制限Ｔリンパ細胞は活性化されている。この活性化されたＴリンパ細胞は リンホカイン（例えば、γ−インターフェロン）を分泌し、かつ細胞を殺傷し、 または殺傷することなく、感染した自己細胞または移植細胞中でのウイルスの複 製を阻害する他の生成物（例えば、セリンエステラーゼ）を遊離する。 種々の修飾を、該対象とするポリペプチド内の余り重要でないアミノ酸部分に おいて、その生物学的活性を実質上妨害することなしに、行うことができる。こ のような修飾は、本明細書に記載され、かつ当分野において理解されているよう に、置換、欠失および他のペプチド残基、C1-C7アルキルまたはC1-C10アラルキ ル基の付加を包含するが、これらに制限されない。 本発明のポリペプチドは、合成手段に依存して、グリコシル化されていてもさ れていなくともよい。例えば、非−グリコシル化ポリペプチドが好ましい場合に は、標準的なペプチド合成技術によって直接、あるいは本発明の組み換えDNA 分 子の原核宿主発現によって合成することができる。本発明の真核生物により生成 されたポリペプチドは、典型的にはグリコシル化されていない。 本発明のポリペプチドは、また種々の変更、例えば生成するポリペプチド分子 が所定の特性を示す限りにおいて、保存性または非−保存性の、アミノ酸残基の 挿入、欠失および置換を組み込むことができる。本明細書でいう「所定の特性」 とは、該ポリペプチドが適当な宿主中で免疫原性であり、かつ細胞中またはその 上で発現されるような、所定のタンパク、該タンパク由来のポリペプチド、また は該所定のタンパクに対して実質的に相同なタンパクまたはポリペプチド（変性 された状態（SDS-PAGEゲル中で見られるような）であれ、未変性状態であれ）に 対して抗体を生成することができるものであることを意味する。種々の態様にお いて、該所定のタンパクは、p53 、Her-2/Neu 、または腫瘍または他の悪性癌と 関連した他のタンパクであり得る。 本発明のポリペプチドのアミノ酸の大部分は、上で同定した天然産のp53 また はHer-2/Neu タンパクまたはエピトープの対応する部分のアミノ酸に対して同一 または実質的に相同であろう。ここで、該選択されたポリペプチドは、本明細書 に記載するように、末端の一方または両者においてフランキング処理および／ま たは修飾処理されていてもよい。 従って、一態様において、本発明の分子は上記のようなポリペプチドを含み、 該ポリペプチドにはある物質が結合されており、ここで該物質は放射性標識、酵 素、蛍光性標識、固体マトリックス、担体および第二のCTL エピトープからなる 群から選ばれる。この物質は、対象とするポリペプチドの構成アミノ酸の側鎖に おいて適当な反応性基が利用できるか否かに依存して、ＮおよびＣ末端およびそ の間の種々の点を包含する、任意の適当な位置において、該ポリペプチドと結合 できる。更に、該物質は該ポリペプチドと直接またはリンカーを介して間接的に 結合できる。好ましい放射性標識は3H、14C、32P、35S、125Iおよび種々のラジ オイムノアッセイ等において使用するための、他の適当な放射性標識を包含する 。好ましい蛍光性標識は、フルオレセイン、ローダミン、および蛍光アッセイ等 で使用するための他の適当な蛍光性標識を包含する。 好ましい酵素は、アルカリホスファターゼおよび例えばアッセイ手順における マーカー等を包含する、任意の適当な目的で使用する他の適当な酵素を含む。好 ましい固体マトリックスはガラス、プラスチックまたはセファデックス(Sephade x:登録商標)等の種々の樹脂、クロマトグラフィー用媒体等を含む他の適当な表 面である。好ましい担体は免疫原性脂質、タンパクおよび他の適当な化合物、例 えばリポソームまたはウシ血清アルブミンを含む。好ましい第二のCTL エピトー プはT-ヘルパー特異的抗原、Ｂ細胞応答を助長するであろう抗原、およびCTL を 刺激する他の適当な抗原を包含する。 付随的なアミノ酸を、本発明のペプチドの末端に添加して、ペプチドの相互の 結合、担体、支持体または大きなペプチドとの結合（本明細書に記載する理由に より）、または該ペプチドの物理的または化学的特性の改良等を容易にする。適 当なアミノ酸、例えばチロシン、システイン、リジン、グルタミンまたはアスパ ラギン酸等を、該ペプチドのC-またはN-末端に導入できる。更に、本発明のペプ チドは、例えばアシル化による末端NH2-アシル化、またはアンモニア、メチルア ミンによるチオグリコール酸アミド化、末端カルボキシルアミド化等によって修 飾することにより、天然の配列とは異なっていてもよい。幾つかの例において、 これらの修飾は、支持体または他の分子との結合用のサイトを与え、結果として リンカー機能を与えることができる。 本発明のp53 またはHer-2/Neu ペプチドまたは細胞毒性Ｔリンパ細胞刺激活性 をもつその類似体または同族体は、必要に応じて修飾して、幾つかの他の所定の 機能、例えば改良された薬理的諸特性を与え、一方で該未修飾のペプチドの生物 学的活性を増大するか、もしくは少なくとも実質的に維持することができる。例 えば、本明細書に記載されるペプチドは、そのペプチド配列中のアミノ酸を、例 えばここに記載する配列由来のペプチドのアミノ末端、カルボキシ末端またはそ の両者に、適当なアミノ酸を付加またはその除去によって、該ペプチド配列中の アミノ酸を延長、減少または置換させることにより、修飾できる。 本発明のポリペプチドを、該p53 またはHer-2/Neu もしくは上記のポリペプチ ドに対応する配列の保存性の置換を組み込む場合、該置換されるアミノ酸残基は 他の生物学的に類似のアミノ酸残基によって置換されて、得られるポリペプチド はp53 またはHer-2/Neu の配列とは異なる（該配列以外の）アミノ酸酸基配列を もつことになる。保存性の置換の幾つかの例は、疎水性の残基、例えはイソロイ シン、バリン、ロイシンまたはメチオニンの、他の疎水性残基による置換を包含 する。また、極性残基、例えばアルギニン、グリシン、グルタミン酸、アスパラ ギン酸グルタミン、アスパラギン等は、この群の他の構成員により保存性の置換 を行うことができる。 保存性の置換を組み込むポリペプチドの更に別の局面は、置換されたアミノ酸 残基が未置換の親アミノ酸残基と置換する場合に起こる。置換アミノ酸の例は、 37C.F.R.§1.822(b)(4)に見出すことができる。これを本発明の参考とする。 これらのペプチドを修飾して、該CTL 誘起活性を、該修飾したペプチド類似体 が野性型の配列をもつペプチドよりも高いCTL 活性をもつように、実質的に増強 することができる。例えば、特に該N-末端の第二の残基が疎水性であり、しかも 該HLA 制限分子に対する結合に関与している場合には、ペプチドのN-末端の疎水 性を増大することが望ましい場合がある。該N-末端における疎水性を増大するこ とにより、Ｔ細胞に対する提示の効率は高められる可能性がある。他の疾患に関 連した抗原から調製されたペプチド、特に宿主が有意なCTL 活性をもたない可能 性のある、CTL 誘起エピトープを含有するものは、該第二の残基が通常は疎水性 である場合には、該ペプチドのN-末端における疎水性残基を置換することによっ て、CTL-誘起性とすることができる。 従って、本発明のペプチドは、上記のような修飾がその用途におけるある利点 を達成するためである場合には、種々の修飾、例えば保存性または非−保存性の 挿入、欠失および置換に付すことができる。「保存性置換」なる用語によって、 一個のアミノ酸残基を、生物学的および／または化学的に類似する他のアミノ酸 残基で置換、例えば一個の疎水性残基を別の疎水性残基で、または一個の極性残 基を別の極性残基で置換することを意味する。これらの置換は、Gly，Ala; Val, Ile，Leu; Asp，Glu; Asn，Gln; Ser，Thr; Lys，Arg;およびPhe，Tyrの組み合 わせを包含する。好ましくは、p53 またはHer-2/Neu 細胞毒性Ｔリンパ細胞−刺 激性エピトープに実質的に模倣せんとする該配列の部分は、p53 またはHer-2/Ne u タンパクの少なくとも一つの部分またはそのセグメントの配列から約20% を越 えて異なることはないはずである。但し、例えば結合またはカップリング等を簡 略化するために、該ペプチドの物理的または化学的特性を改善する目的で、何れ かの端部に、付随的なアミノ酸を付加する場合を除く。 上記の代表的なペプチドを包含する、本発明によって同定された該ペプチド配 列の範囲内には、特定のペプチドがその生物学的活性、即ちp53 またはHer-2/Ne u 抗原を発現する細胞に対する、クラスI-制限細胞毒性T-リンパ細胞の応答を刺 激する能力を保持することを可能とする残基(または実質上機能的に等価な残基) が存在する。これらの残基は、単一の適当なアミノ酸置換、欠失または挿入、こ れに引き続く適当なアッセイ、例えばこのようにして刺激されたCTL による細胞 毒性活性についてのテストによって同定できる。 更に、該残基の側鎖による寄与は、個々の残基の適当なアミノ酸、例えばGly またはAla による系統的な置換を通して立証できる。本発明のペプチドの特徴の 一つである、特異的なMHC タンパクへの結合のために、線形アミノ酸配列のどの 残基が必要とされるかを決定するための体系的な方法は公知である。例えば、ア レン(Allen)等，Nature，327: 713-717;セット(Sette)等，Nature，328: 395-39 9; タカハシ(Takahashi)等，J．Ex．Med.，1989，170: 2023-2035;およびマリア ンスキー(Maryanski)等，Cell，1990，60: 63-72を参照のこと）。 多重アミノ酸置換を許容するペプチドは、一般的に少量の比較的中性の分子、 例えばAla、Gly、Pro または同様な残基を組み込む。置換し、付加し、もしくは 抜き取ることのできる残基の数および型は、本質的にエピトープ性の点と、求め られる幾つかの立体構造および機能上の属性との間で必要とされる距離に依存す るであろう。ここで、残基の型とは、例えば他の属性とは無関係に、疎水性と親 水性とを区別することを意図するものである。必要ならば、細胞毒性T-リンパ細 胞に対する提示のための、類似ペプチドのMHC 分子に対する高い結合アフィニテ ィーが、このような変更によって達成できる。一般的に、エピトープ性および ／または立体構造性において重要な残基間の任意の空間的置換、付加または欠失 は、結合を妨害する恐れのある、立体的および帯電による妨害を回避するように 選択されるアミノ酸または部分を利用するであろう。 所定の生物学的活性を維持しつつ、多重置換を可能とするペプチドも、D-アミ ノ酸含有ペプチドとして合成することができる。このようなペプチドは「インベ ルソ(inverso)」または「レトロインベルソ」型として、即ちある配列のL-アミ ノ酸をD-アミノ酸で置換し、あるいは該アミノ酸の配列を逆転させ、かつL-アミ ノ酸をD-アミノ酸で置換することにより合成できる。D-ペプチドは、そのかたわ れであるL-ペプチドと比較して、ペプチダーゼに対して実質的により耐性が高く 、かつ結果として血清および組織中でより安定であるので、生理的条件下でのD- ペプチドの安定性は、対応するL-ペプチドと比較して、アフィニティーにおける 差異を保証して余りある程であり得る。更に、置換をもつまたはもたないL-アミ ノ酸含有ペプチドを、D-アミノ酸でキャップして、該抗原性ペプチドのエキソペ プチダーゼ分解を阻害することができる。 本明細書に記載した例示的ペプチドに加えて、本発明は、腫瘍細胞または組織 に対する、MHC-制限細胞毒性Ｔリンパ細胞応答を誘発することのできる、該ペプ チド領域に関連した他のエピトープ性領域を同定するための方法を提供する。こ の方法は、感染したまたは未感染の個体から末梢血リンパ細胞(PBL)を得、該PBL 細胞を、ペプチド領域(例えば、p53 誘導体、例えばp53.25-35，LLPENNVLSPL(S EQ ID NO 1)、p53.65-73，RMPEAAPPV(SEQ ID NO 2)、p53.149-157，STPPPGTRV(S EQ ID NO 3)、およびp53.264-272，LLGRNSFEV(SEQ ID NO 4))由来のポリペプチ ドフラグメントまたは合成ペプチドに暴露（即ち、これで刺激）する工程を含む 。この点に関しては、Her-2/Neu タンパク由来のペプチドも有用であり、その例 示的ペプチドは、例えばHER-3，KIFGSLAFL（SEQ ID NO 10）、HER-6，TLQGLGISW L(SEQ ID NO 11)、HER-7，VMAGVGSPYV(SEQ ID NO 12)、HER-8，VLQGLPREYV(SEQ ID NO 13)、およびHER-9，ILLVVVLGV（SEQ ID NO 14）を包含する。 各々典型的には約８〜20個の残基、好ましくは8-12残基に相当する長さの、p5 3 またはHer-2/Neu タンパクのアミノ酸残基配列からなる群から無秩序に選ばれ るオーバーラッピング合成ペプチドのプールを使用して、細胞を刺激すること ができる。また、以下に例示するように、特定のHLA クラスＩ対立遺伝子（フォ ーク(Falk)等，Nature，1991，351: 290-296）のCTL-指向性抗原に対する結合モ チーフに適合するペプチドを、テストのために選択した。他のHLA クラスＩ対立 遺伝子に対する類似の結合モチーフに適合するペプチドが、ここに記載する方法 に従って同定できる。従って、これは本発明の一部と見做される（例えば、グオ (Guo)等，Nature，1992，360: 364-366;ヤルデッツキー(Jardetzky)等，Nature ，1991，353: 326-329を参照のこと）。 活性ペプチドを、細胞毒性Ｔリンパ細胞の活性を誘発するプールから選択する ことができる。該ペプチドの特異的細胞毒性活性を誘起する能力は、該刺激され たPBL 細胞を、p53 またはHer-2/Neu タンパク、ポリペプチドまたはその誘導体 （あるいはそのサブゲノムフラグメント）を発現する、オートロガス標識された （例えば、51Cr）ターゲット細胞（例えば、HLA 適合マクロファージ、Ｔ細胞、 繊維芽細胞またはＢリンパ芽球細胞）と共に、該ターゲット抗原が、該細胞によ って内因的に合成される（または該細胞を対象とするペプチドでパルス処理する ）ようにインキュベートし、次いで標識の特異的放出を測定することにより決定 される。 細胞毒性Ｔリンパ細胞応答を刺激するエピトープ領域をもつペプチドが一旦同 定されると、該応答のMHC 制限要素が、測定および／または確認される。これは 該刺激されたPBLまたはその短期(short term)細胞系と、（標識された）ターゲ ット細胞または対象とするペプチドでパルス化処理した公知のHLA 型のパネル、 または適当なコントロールとをインキュベートすることを含む。該CTL により溶 解される、該パネル中の細胞の該HLA 対立遺伝子は、溶解されなかった細胞と比 較され、また対象とする抗原に対する該細胞毒性Ｔリンパ細胞の応答に対する該 HLA 制限要素を同定する。 カルボン(Carbone)等(J．Exp．Med.，1988，167:1767)は、ペプチドによる刺 激が、対応する内在性のタンパクに対する低いアフィニティーをもつ細胞毒性Ｔ リンパ細胞を誘起して、反復的なペプチド刺激が細胞毒性Ｔリンパ細胞を生成で き、該細胞毒性Ｔリンパ細胞がペプチドを識別するが、天然の抗原を識別しない ことを報告した。例えば、刺激された細胞毒性Ｔリンパ細胞が天然のHer-2/Ne u タンパクを識別できないことは、抗-Her-2/Neu ペプチド療法およびワクチン 組成物の開発においては望ましくないであろうから、この潜在的な限界を克服す るための方法を利用することが好ましい。例えば、細胞毒性Ｔ細胞の周期的刺激 を、本発明に従って利用して、合成ペプチドに対するよりも、自然にプロセッシ ングされた抗原に対してより高いアフィニティーをもつＴ細胞を同定し、かつ選 択することができる。短期細胞毒性Ｔリンパ細胞系は、活性化PBL の再刺激によ って樹立される。 ペプチドにより刺激された細胞は、ペプチドおよび組み換えまたは天然のp53 またはHer-2/Neu 抗原、例えばHer-2/Neu-由来のペプチドで再刺激することが好 ましい。活性をもつ細胞も、また適当なＴ細胞マイトジェン、例えばフィトヘマ グルチニン(PHA)で刺激することも可能である。この刺激された細胞は、ヘルパ ーＴ細胞の非特異的源たる抗原としての照射された同種異系PBL および適当な抗 原を備えている。 例えば、自然のHer-2/Neu 抗原を識別する細胞毒性Ｔリンパ細胞の集団を選択 的に増殖させ、かつ長期(long term)細胞系を樹立するために、患者からのPBL サンプルを、まずペプチドおよび組み換えまたは天然の腫瘍関連抗原で刺激し、 引き続き該対応する腫瘍関連抗原ポリペプチドを安定に発現する、HLA-適合Ｂリ ンパ芽球細胞で再度刺激した。該細胞系は、オートロガスおよび同種異系B-リン パ芽球または該適当な抗原を生成するようにトランスフェクションされまたは感 染された他の細胞を使用して、内在的に合成された抗原を識別する能力につき再 確認された。 １以上の患者またはHLA 型において、抗−腫瘍細胞毒性Ｔリンパ細胞応答を誘 起するのに寄与する本発明の種々のペプチドを同定した後には、幾つかの例にお いては、一組成物中で２種以上のペプチドを、化学的に結合するか、あるいは物 理的に混合することにより、組み合わせることが望ましい場合がある。この組成 物中の該ペプチドは同一または異なっていてもよく、組み合わせた場合には、元 のペプチドと同等またはこれよりも高い生物学的活性を与えるはずである。例え ば、本明細書に記載の方法を利用して、２種以上のペプチドを、特定の領域、例 えばp53-由来のペプチドSTPPPGTRV およびLLGRNSFEV から種々のまたはオーバー ラッピング細胞毒性Ｔリンパ細胞エピトープを規定することができ、これらのペ プチドを「カクテル」中で組み合わせて、細胞毒性Ｔリンパ細胞応答に対する高 い免疫原性を得ることができる。更に、特に第二のまたは後のペプチドが、第一 のペプチドと異なるMHC 制限要素をもつ場合には、同一または異なるタンパク由 来の、一方のp53 またはHer-2/Neu 領域の適当なペプチドを、他方のp53 または Her-2/Neu 領域の適当なペプチドと組み合わせることができる。かくして、本発 明の開示は、種々のp53 またはHer-2/Neu 領域由来の例示的タンパク、ポリペプ チド、およびエピトープ配列を包含する。 このペプチド組成物は、多様な集団の便宜のために、本発明の治療、予防、ま たは診断法および組成物により与えられる免疫学的な応用範囲を拡大するのに効 果的に利用できる。例えば、広範な民族集団（コーカサス、アジアおよびアフリ カ黒色人種）における、HLA 対立遺伝子の異なる頻度を、以下の表に示した。本 発明の治療またはワクチン組成物を処方して、出来るかぎり高い集団の割合まで 高い治療または免疫性を与えることができる。 広範な民族集団におけるHLA 対立遺伝子の頻度 本発明のペプチドは、更に結合を通して組み合わせて、ポリマー（多量体）を 生成することができ、あるいは結合なしに、混合物として組成物を処方すること ができる。同一のペプチドを自身に結合して、ホモポリマーを形成した場合、複 数の繰り返しエピトープ性単位が提示される。該ペプチドが異なる場合、繰り返 し単位をもつヘテロポリマーが与えられ、これは例えば、種々の腫瘍抗原セグメ ントに対して特異的なエピトープ、同一のタンパクまたは遺伝子領域に対する種 々のエピトープ、異なるタンパクまたは遺伝子領域に対する種々のエピトープ、 種々のHLA 制限特異性および／またはＴヘルパーエピトープを含むペプチドのカ クテルを形成する。共有結合に加えて、分子間および構造内結合を形成できる非 共有結合も包含される。 ホモまたはヘテロポリマーのためのまたは担体に対するカップリングのための 結合は、種々の方法で与えることができる。例えば、システイン残基は、アミノ −およびカルボキシ−末端両者において付加でき、ここで該ペプチドは、該シス テイン残基の制御された酸化により共有結合される。同様に有用なのは、一方の 官能基端部においてジスルフィド結合をおよび他方においてペプチド結合を生成 する、多数のヘテロ二官能性試薬であり、N-サクシンイミジル-3-(2-ピリジル− ジチオ)プロピオネート(SPDP)を包含する。この後者の試薬は、一方のタンパク におけるシステイン残基とそれ自体との間にジスルフィド結合を、および他方の タンパクにおけるリジンまたは遊離のアミノ基を介してアミド結合を生成する。 このようなジスルフィド／アミドを生成する種々の試薬が公知である。例えば、 Immun．Rev.，1982，62: 185を参照のこと。 他の二官能性カップリング剤はジスルフィド結合よりも寧ろチオエーテルを形 成する。これらチオエーテル形成試薬の多くは、市販品として入手することがで き(例えば、WI州、ミルウォーキーのアルドリッチケミカル社(Aldrich Chemical Company))、またその例としては、6-マレイミドカプロン酸、2-ブロモ酢酸、2- ヨード酢酸、4-(N- マレイミド−メチル)シクロヘキサン-1- カルボン酸等の反 応性エステルが含まれる。該カルボキシル基は、これらをサクシンイミドまたは 1-ヒドロキシ-2- ニトロ-4- スルホン酸、ナトリウム塩と組み合わせることによ り活性化できる。特に好ましいカップリング剤は、サクシンイミジル-4-(n-マレ イミドメチル)シクロヘキサン-1- カルボキシレート(SMCC)である。適当な結合 は、記載されたように機能する結合基、例えば抗−腫瘍細胞毒性Ｔ細胞決定基／ 刺激剤、ペプチド類似体またはＴヘルパー決定基／刺激剤として機能する結合基 の何れをも実質的に妨害しないことが理解されよう。 本発明のもう一つの局面においては、本発明のペプチドは、抗−腫瘍Ｔヘルパ ー細胞エピトープ、即ちp53 またはHer-2/Neu タンパクを由来とするもの等の、 腫瘍抗原に対して、細胞毒性Ｔ細胞の誘起において協働する、Ｔ細胞を刺激する エピトープを提示する、他の適当なペプチドと結合またはカップリングできる。 該Ｔヘルパー細胞は、例えばT-ヘルパー１またはT-ヘルパー２表現型の何れかで あり得る。 本発明のペプチドは、任意の適当な手段を用いて調製できる。該ペプチドは、 その比較的短いサイズ（一般的には、50アミノ酸未満、好ましくは20アミノ酸未 満）のために、公知のペプチド合成技術に従って、溶液中で、または固体担体上 で合成できる。様々な自動合成装置が市販品として入手でき（例えば、アプライ ドバイオシステムズ(Applied Biosystems)から入手できる)、かつ公知のプロト コールに従って使用できる。例えば、スチュアート＆ヤング(Stewart and Young ),Solid Phase Peptide Synthesis，第２版ピアースケミカル社(Pierce and Che mical Co.，1984);タム(Tam)等，J．Am．Chem．Soc.，1983，105: 6442; メリフ ィールド(Merrifield)，Science，1986，232: 341-347およびバラニー＆メリフ ィールド(Barany and Merrifield)，The Peptides，(グロス＆マイエンホーファ ー(Gross and Meienhofer)編，アカデミックプレス，N.Y.，1979)，1-284を参照 のこと。 また、適当な組み換えDNA 技術が、本発明のペプチドの合成に利用でき、ここ で対象とするペプチドをコードするヌクレオチド配列は、発現ベクター中に挿入 されるか、適当な宿主細胞中に形質転換されるかあるいはトランスフェクション され、かつ発現に適した条件下で培養される。これらの手順は、一般的に当分野 で公知であり、例えばサンブロック(Sambrook)等，Molecular Cloning，A Labor atory Manual（第２版，コールドスプリングハーバープレス，コールドスプリン グハーバー，N.Y.，1989）およびCurrent Protocols in Molecular Biology（ア ウスベル(Ausubel)等編、ジョンウイリー＆サンズ社、N.Y.，1991）および米国 特許第4,237,224 号、同第4,273,875 号、同第4,431,739 号、同第4,363,877 号 および同第4,428,941 号に一般的に記載されている。 かくして、本発明のペプチド配列を１種以上含有する、組み換えDNA-由来のタ ンパクまたはペプチドは、本発明において同定されたあるいは本明細書に記載の 方法を利用して同定された抗−腫瘍細胞毒性Ｔ細胞エピトープを調製するのに利 用できる。例えば、本発明の組み換えp53-由来のペプチドが調製でき、ここで該 p53 アミノ酸配列は、ここに記載するペプチドのエピトープをより効果的に提示 するように変更し、細胞毒性Tリンパ細胞応答を刺激することができる。この手 段によって、ポリペプチドを使用し、幾つかのＴ細胞エピトープを単一のポリペ プチドに組み込む。 本発明で意図した長さのペプチドに対するコード配列は、化学的技術、例えば マシューチ(Matteucci)等，J．Am．Chem．Soc.，1981，103: 3185のホスホトリ エステル法により合成でき、修飾は単に適当な塩基を、天然のペプチド配列をコ ードするもので置換することにより行うことができる。次いで、このコード配列 に適当なリンカーを与え、しかも当分野で通常入手可能な発現ベクター中に連結 し、該ベクターを適当な宿主を形質転換するのに利用して、所定の融合タンパク を生成する。このようなベクターの幾つかおよび適当な宿主系は、今や利用可能 である。 融合タンパクの発現のために、該コード配列に、機能的に結合した開始および 停止コドン、プロモータおよびターミネータ領域、および通常は複製系を与え、 かくして適当な細胞宿主内で発現するための発現ベクターを与える。例えば、バ クテリア宿主と相容性のプロモータ配列を、所定のコード配列の挿入用の便利な 制限サイトを含むプラスミド中に与える。得られた発現ベクターを、適当なバク テリア宿主中に形質転換する。適当なベクターおよび制御配列を使用することに より、酵母または哺乳動物宿主をも使用できる。 また、該ポリペプチドが、細胞上で発現された場合、あるいは変性状態にある 場合には、抗原性であって、所定のタンパク分子と免疫反応性の抗体が本発明の ポリペプチドに対しても免疫反応することが好ましい。従って、本発明のポリペ プチドは、また本明細書に記載の手段によって種々の有用な抗体を生成するのに 利用することができる。本発明のポリペプチドは、免疫反応を特異的に開始する のに、例えば特異的細胞毒性Ｔリンパ細胞(CTLs)を生成するのに利用することも できる。該ポリペプチドのこれらおよびその他の用途は以下に与えられる議論に より明らかとなろう。 本発明のポリペプチドは、当業者には公知の任意のペプチド合成技術により合 成できる。利用可能な該技術の概要の幾つかは、J.M.スチュアード(Stuard)＆J. D.ヤング(Young)，“Solid Phase Peptide Synthesis”,W.H.フリーマン(Freema n)社，サンフランシスコ(1969)，J.メインホーファー(Meinhofer)，“Hormonal Proteins and Peptides”，Vol．2，pp．46,アカデミックプレス(N.Y.)，1983; および米国特許第4,631,211 号に記載されている。これらの開示内容を本発明の 参考とする。本発明で使用することが望ましいポリペプチドが、比較的短い（長 さにおいてアミノ酸残基約50個未満）場合、直接的ペプチド合成技術が、一般的 に好ましく、通常はメリフィールド(JACS，1963，85: 2149)に記載の技術等の固 相技術を使用する。 本発明のポリペプチドは、また組み換えDNA 技術によっても合成できる。この ような組み換え技術は、特に該所定のポリペプチドが、比較的長い（長さにおい てアミノ酸残基約50個を越える）場合には好ましい。組み換えDNA 技術を利用し て、本発明のポリペプチドを調製する場合、該所定のポリペプチドをコードする DNA セグメントを、予め選択されたベクター中に組み込み、該ベクターを後に適 当な宿主中で発現させる。上に同定した、p53 またはHer-2/Neu タンパクまたは ポリペプチドに対応するアミノ酸残基配列の少なくとも一つを含有する、該発現 されたポリペプチドは、ゲル電気泳動法、免疫吸着クロマトグラフィー等のルー チン法によって精製することが好ましい。 3．ハイブリドーマおよび抗体組成物 a. ハイブリドーマ 本発明のハイブリドーマは、モノクローナル抗体を含む本発明の抗体の産生能 をもつものとして特徴付けられるものである。所定の免疫特異性をもつ、即ち特 定のタンパク、特定のタンパクおよび／またはポリペプチド上の同定可能なエピ トープと免疫反応性を有する抗体分子を生産（分泌）するハイブリドーマを製造 する方法は、一般的に当分野で周知である。例えば、有用な方法はナイマン(Nim an)等，PNAS USA，1983，80: 4949-4953 およびガルフレ(Galfre)等，Meth．Enz ymol.，1981，73: 3-46に記載されている。他の方法は、米国特許第5,180,806 号、同第5,114,842 号、同第5,204,445 号およびRE32,011に記載されている。こ れらの開示事項を本発明の参考とする。 ハイブリドーマ細胞は、典型的には抗体産生細胞とミエローマまたは他の自己 永続性細胞系とを融合することにより形成される。このような手順は、ケーラー ＆ミルシュタイン(Kohler and Milstein)，Nature，1975，256: 495-497 に記載 されている。 典型的には、本発明のハイブリドーマは、上記技術において、免疫原として実 質的に純粋なp53 またはHer-2/Neu タンパク、ポリペプチド、同族体または本発 明のポリペプチドの配列サブセットを使用することにより製造される。 b. 接種材料 もう一つの態様において、本発明のタンパクまたはポリペプチド、抗原的に関 連したその変異型、または本明細書で同定したp53 またはHer-2/Neu タンパクま たはポリペプチドの少なくとも一部と少なくとも75% の相同性をもつタンパクま たはポリペプチドを、製薬上許容される水性希釈組成物中で使用して、接種材料 を形成する。該接種材料は、有効量で投与した場合に、p53 またはHer-2/Neu タ ンパクまたはポリペプチドと免疫反応する抗体を誘導できる。 種々の文法上の形態での「接種材料」なる用語は、本明細書において、本発明 のp53 またはHer-2/Neu タンパクまたはポリペプチドを、p53 またはHer-2/Neu タンパクまたはポリペプチドに対する抗体を調製するのに使用する活性成分とし て含有する組成物を記載するのに使用する。 ポリペプチドを抗体の誘導のために使用する場合、該ポリペプチドは単独で使 用でき、あるいは担体に結合して複合体として、もしくはポリペプチドポリマー として使用できるが、表現の簡略化のために本発明のポリペプチドの種々の態様 を、本明細書では集合的に「ポリペプチド」およびその種々の文法上の表現で表 すものとする。 約35未満のアミノ酸残基を含有するポリペプチドについては、既に述べたよう に、抗体生産を誘発するために、担体に結合したペプチドを使用することが好ま しい。 前に述べたように、１以上の付随的なアミノ酸残基を、該ポリペプチドのアミ ノ−またはカルボキシ−末端に付加して、該ポリペプチドの該担体への結合を補 助することができる。該ポリペプチドのアミノ−またはカルボキシ−末端に付加 されたシステイン残基は、ジスルフィド結合をとおして複合体を形成するのに特 に有用であることが分かっている。しかしながら、複合体を調製するための当分 野で周知の他の方法を使用することも可能である。例示的なこれ以外の結合手順 は、ミカエル付加反応生成物、ジ−アルデヒド、例えばグルタルアルデヒドの使 用（クリプシュタイン(Klipstein)等，J．Infect．Dis.，1983，147: 318-326等 ）、または担体に対するアミド結合を形成するための水溶性カルボジイミドの使 用におけるような、カルボジイミド技術の利用を包含する。活性化された官能基 によるタンパクの複合化またはカップリングの概説については、オーラメアス(A urameas)等，Scand．J．Immunol.，1987，8(追録7): 7-23を参照のこと。 有用な担体は、当分野で公知であり、一般的にはタンパク自体である。このよ うな担体の例はキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、エデスチン、チログ ロブリン、アルブミン、例えばウシ血清アルブミン(BSA)またはヒト血清アルブ ミン(HSA)、赤血球細胞、例えばヒツジ赤血球(SRBC)、破傷風毒素およびコレラ 毒素、並びにポリアミノ酸、例えばポリ（D-リジン :D-グルタミン酸）、等であ る。 担体の選択は該接種材料の最終的な用途に大きく依存し、種々の基準に基づい ている。例えば、接種すべき特定の動物中に、不都合な反応を生じない担体を選 択すべきである。 この接種材料は、本発明のp53 またはHer-2/Neu タンパクまたはポリペプチド を、有効かつ免疫原性量で含有する。上記のように、より小さなポリペプチドを 複合体として使用（即ち、担体に結合）することができる。単位投与量当たりの ポリペプチドまたはタンパクの該有効量は、当分野において周知である如く、特 に接種すべき動物の種、該動物の体重、および選択された接種様式に依存する。 接種材料は、典型的には接種（投与量）当たり約10μｇ〜約500 mgの濃度、好ま しくは投与量当たり約50μｇ〜約50mgの濃度でポリペプチドまたはタンパクを含 有する。 用語「投与（服用）量」または「単位投与（服用）量」とは、本発明の接種材 料に関しては、動物に一回の投与物として適した、物理的に分離した単位を意味 し、各単位は必要な希釈剤、即ち担体またはビヒクルとの関連で、所定の免疫原 効果を生成するように計算された、活性物質の所定量を含有する。本発明の接種 材料の新規な単位服用量に関する明細は、(a)該活性物質の固有の諸特徴および 達成すべき特定の免疫学的効果、および(b)ここで詳細に説明するように、動物 の免疫において使用するためのかかる活性物質の配合分野に固有の制限により指 定され、かつこれらに直接依存している。これらは本発明の特徴である。 接種材料は、典型的にはポリペプチド、ポリペプチド−複合体、またはタンパ クを、水性組成物を調製するための生理的に許容される（利用可能な）希釈剤ま たはビヒクル、例えば水、塩水または燐酸緩衝塩水中に分散することにより調製 される。例えば、p53 またはHer-2/Neu ペプチドを含有する接種材料は、それぞ れ実質的に純粋なp53 またはHer-2/Neu タンパクから、同一の生理的に許容され る希釈剤中に分散することにより調製できる。このような希釈剤は当分野におい て周知であり、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences，1980，pp．1465- 1467，第16版，マック出版社、PA州、イーストンにおいて論じられている。 接種材料は、また該希釈剤の成分としてアジュバントをも含有する。アジュバ ント、例えば完全フロインドアジュバント(CFA)、不完全フロインドアジュバン ト(IFA)およびミョウバンは、当分野で周知の材料であり、幾つかの製造元から 市販品として入手できる。 c. 抗体および組成物 同様に本発明の意図するものは、当該タンパクまたはポリペプチドと免疫反応 する抗体組成物である。抗体組成物は、細胞表面と結合するか、あるいは細胞構 造とは無関係に、該タンパクまたはポリペプチドと免疫反応する。かくして、抗 体組成物は細胞の外表面上に該タンパクまたはポリペプチドにより提示される１ 種以上のエピトープまたは細胞とは無関係のタンパクまたはポリペプチドのエピ トープと結合する。 本発明の好ましい抗体組成物は、好ましくは細胞表面に提示される、p53 また はHer-2/Neu タンパクまたはポリペプチド分子と免疫反応する。この点に関連し て、好ましい抗体組成物はモノクローナル抗体(mAbs)であるが、ポリクローナル 抗体も好ましい。 簡単に言えば、好ましい抗体組成物はマウスを本発明のタンパクまたはポリペ プチドで免疫することにより生成できる。生成する該抗体は、本発明のポリペプ チド、例えばここに記載するp53 またはHer-2/Neu ポリペプチドに対する結合ア フィニティーについてスクリーニングされる。現時点において開示したポリペプ チドおよびタンパクも、該抗体のスクリーニングのために使用できる。ここに記 載される抗体は、関連タンパクの配列サブセット並びに完全な該タンパク自体両 者と免疫反応することが予想される。 本発明で意図する好ましい抗体組成物は、典型的には哺乳動物を、ヒトp53 タ ンパク、Her-2/Neu タンパク、または本発明のポリペプチドで免疫することによ り製造され、結果として該哺乳動物中に、該免疫原性ポリペプチドに対する適当 な免疫特異性を有する抗体分子を誘発する。次いで、該抗体分子を、該哺乳動物 から回収し、公知の技術、例えば固体担体上に固定化された免疫原を使用したイ ムノアフィニティー精製を利用して、所定の程度までスクリーニングし、かつ精 製する。このようにして製造した該抗体組成物は、特に本発明の診断法および装 置において、細胞、例えば小細胞肺癌に罹った患者中の腫瘍細胞の表面上の該当 するポリペプチドの発現を検出するのに利用できる。 前に述べた如く、本発明はモノクローナル抗体組成物(mAb)をも意図する。種 々の文法上の形態での「モノクローナル抗体組成物」とは、抗体分子の一集団を 意味し、該抗体分子は、特定の抗原と免疫反応できる、一種のみの抗体結合サイ トを含むものである。かくして、当該mAb 組成物は、典型的には該組成物と免疫 反応する任意の抗原に対して、単一の結合アフィニティーを示す。しかし、与え られたあるモノクローナル抗体組成物は２つの異なる抗体結合サイトをもつ抗体 分子を含み、各々は異なる抗原決定基に対して免疫特異性であり、即ち生物学的 に特異的なモノクローナル抗体である。本発明の好ましい一つの抗体組成物は、 典型的には一種類の抗体分子を分泌（生成）する単一の細胞（即ち、ハイブリド ーマ）をクローニングすることにより生成された抗体で構成される。 本発明は、本発明の腫瘍−関連（例えば、p53 またはHer-2/Neu ）タンパクま たはポリペプチドと免疫反応するモノクローナル抗体分子を生成する方法をも意 図する。該方法は以下の諸工程を含む： (a) 動物を、本発明の腫瘍−関連タンパクまたはポリペプチド、もしくはこれ らに相同なタンパクで免疫処理する工程。該免疫原として、腫瘍−関連タンパク の少なくとも一部（例えば、配列サブセット）を使用することが好ましい。該免 疫原は、対象の動物種から直接採取したタンパクであり得る。しかしながら、特 に抗原が、本明細書に記載されるようなアミノ酸残基配列の配列サブセットから 本質的になるポリペプチド等の小さなものである場合には、キーホールリンペッ トヘモシアニン等の担体タンパクと結合することも可能である。免疫化は、典型 的には該サンプルをその免疫学的に有効な量、即ち免疫応答を引き起こすのに十 分な量で、免疫担当哺乳動物に投与することにより達成される。好ましくは、該 哺乳動物はウサギ、ラットまたはマウス等の囓歯動物である。該哺乳動物を、次 に該動物が該免疫原と免疫反応する抗体分子を分泌する細胞を生成するのに十分 な時間維持する。 (b) 次に、該免疫処理した哺乳動物から取り出した抗体−産生細胞の懸濁液を 調製する。これは、典型的には該哺乳動物の脾臓を取り出し、生理的に許容され る媒体中で、当分野で周知の方法を利用して、個々の脾細胞を機械的に分離する ことにより達成される。 (c) この懸濁した抗体−産生細胞を、形質転換（不死化）された細胞系を製造 できる、形質転換試薬で処理する。不死化細胞系を製造するための形質転換試薬 およびその使用は、当分野で周知であり、DNA ウイルス、例えばエプシュタイン バール(Epstein-Barr)ウイルス(EBV)、シミアンウイルス40(SV40)、ポリオーマ ウイルス等、RNA ウイルス、例えばモロニー(Moloney)マウスロイケミアウイル ス(Mo-MuLV)、ルス(Rous)ザルコーマウイルス等、ミエローマ細胞、例えばP3X63 -Ag8.653、Sp2/O-Ag14等を包含する。 好ましい態様において、該形質転換剤による処理は、懸濁された脾細胞と、適 当な細胞系、例えばSP-2由来のマウスミエローマ細胞とを、適当な融合促進剤を 使用して、融合することにより、「不死化」されたハイブリドーマの製造をもた らす。好ましい比は、約108個の脾細胞を含有する懸濁液中に、ミエローマ細胞 当たり約５個の脾細胞である。好ましい融合促進剤は、平均分子量約1000〜約40 00をもつポリエチレングリコール（PEG 1000等として市販品として入手可能であ る）であるが、当分野で公知の他の融合促進剤を使用することも可能である。 使用する該細胞系は、好ましくは所謂「薬物耐性」型のものであり、従って非 融合ミエローマ細胞は選択培地中では生存できず、一方ハイブリッドは生存する であろう。最も一般的な組は、8-アザグアニン耐性細胞系であり、これは酵素、 ハイポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを欠き、従って HAT(ハイポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン)培地により維持されな いであろう。また、該使用するミエローマ細胞系が所謂「非−分泌」型のもので あることが一般的に好ましい。該「非−分泌」型のものそれ自体は、何等抗体を 生成しない。幾つかの場合には、しかしながら分泌型ミエローマ細胞系が好まし い場合もある。 (d) 次いで、該形質転換した細胞を、好ましくはモノクローナルとなるまで、 クローニングする。このクローニングは、好ましくは非−形質転換細胞を維持（ 生存）させない組織培養培地内で実施する。該形質転換細胞がハイブリドーマで ある場合、該クローニングは、典型的には別々の容器内で、選択培地中の未融合 の脾細胞、未融合のミエローマ細胞、および融合細胞（ハイブリドーマ）の混合 物を希釈しかつ培養する。該選択培地は該未融合のミエローマ細胞を維持しない であろう。これら細胞をこの培地中で、該未融合細胞が死滅するのに十分な時間 （約１週間）培養する。該希釈は限界希釈であり得、ここでは希釈剤の体積を統 計的に計算して、各別個の容器（例えば、マイクロタイタープレートのウエル） 内のある数の細胞(例えば、0.3-0.5)を単離する。 (e) 該クローニングした形質転換体の組織培養培地を分析（免疫学的にアッセ イする）して、本発明の腫瘍−関連タンパクまたはポリペプチド、もしくは該関 連するレセプタ分子を担持する細胞と選択的に反応する抗体分子を存在を検出す る。この検出は、周知の免疫学的技術を利用して達成できる。 (f) 次いで、所定の形質転換体を選別し、適当な時間に渡り、適当な組織培養 培地内で育成し、次に周知の技術によって該培養上澄から所定の抗体を回収（収 穫）する。適当な培地および培養時間の長さも、周知であるか、あるいは容易に 決定できる。 僅かに低い純度のモノクローナル抗体をより高い濃度で製造するためには、該 所定のハイブリドーマを、マウス、好ましくは同系または準同系マウス内に注射 することにより移す。このハイブリドーマは、適当なインキュベーション時間後 に、抗体産生腫瘍を形成し、これは宿主マウスの血流および腹腔滲出（腹水）中 に所定の抗体を高濃度(約5-20mg/ml)で生ずる。 これら組成物の調製に有用な媒体および動物は、両者ともに当分野で周知であ り、市販品として入手可能であり、合成培養培地、近交マウス等を包含する。例 示的な合成培地は、4.5 mg/lのグルコース、20mMのグルタミンおよび20% の子牛 血清を補充した、ドゥルベコ(Dulbecco's)最小基本培地(DMEM;ドゥルベコ(Dulbe cco)等，Virol.，1959，8: 396)である。好ましい近交マウスはBALB/cマウスで ある。 本発明の抗体分子を分泌（生成）するハイブリドーマを製造する方法は、当分 野で周知であり、ここに更に詳細に説明する。関連するハイブリドーマ技術の特 に利用可能な記載はナイマン(Niman)等，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，1983 ，80: 4949-4953およびガルフレ(Galfre)等，Meth．Enzymol.，1981，73: 3-46 により提示されている。これら説明を本発明の参考とする。 モノクローナル抗体は、またキメラ抗体製造技術における当業者には周知の方 法により製造することも可能である。これらの方法は、免疫グロブリンの可変領 域全体または一部をコードする核酸の単離、操作および発現工程を含み、該可変 領域は、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を含む該可変領域部分および免疫グロブ リン重鎖の可変領域を含む該可変領域部分両者を含む。該原核および真核生物宿 主内で、該可変領域をコードする核酸を単離し、操作しおよび発現する方法は、 以下の文献に記載されている。これら文献を本発明の参考とする。ロビンソン(R obinson)等，PCT 公開No．WO 89/0099; ウインター(Winter)等，欧州特許公開 No．0239400;リーディング(Reading),米国特許第4,714,681 号; カビリー(Cabil ly)等，欧州特許公開No．0125023;ソージ(Sorge)等，Mol．Cell Biol.，1984，4 : 1730-1737;ベイハー(Beher)等，Science，1988，240: 1041-1043;スケラ(Sker ra)等，Science，1988，240: 1030-1041;およびオルランディ(Orlandi)等，PNAS U.S.A.，1989，86: 3833-3837。典型的には、該核酸は、予め選択された抗原（ リガンド）と結合する免疫グロブリン可変領域全体またはその一部をコードする 。このような核酸の起源は当業者には周知であた、例えば予め選択された抗原と 結合するモノクローナルを生産するハイブリドーマから得ることができ、あるい は該予め選択された抗原を使用して、免疫グロブリン可変領域の複数をコードす る発現ライブラリーをスクリーニングし、かくして該核酸を単離することも可能 である。 本発明の抗体組成物を形成するための更に好ましい方法は、ヒューズ(Huse)等 ，Science，1989，246: 1275の方法を利用して、Fab 分子のライブラリーを作成 する工程を含む。この方法において、重および軽抗体鎖に対するmRNA分子は、該 免疫処理した動物から単離される。これらのmRNAはポリメラーゼ連鎖反応(PCR) 技術を利用して増幅される。次いで、該核酸をλファージ内でランダムにクロー ニングして、組み換えファージ粒子のライブラリーを作成する。該ファージは、 発現宿主、例えばE.コリを感染するのに使用する。該E.コリコロニーおよび対応 するファージ組み換え体を、次に該所定のFab フラグメントを生産するものにつ いてスクリーニングすることができる。好ましいλファージベクターは、λgt11 およびλzap2である。 本発明の抗体分子−含有組成物は、溶液または懸濁液の形状をとることができ る。活性成分として抗体分子を含む組成物の調製は、当分野においては十分に理 解されている。典型的には、このような組成物は液状の溶液または懸濁液として 調製されるが、液体中に溶解または懸濁できる固体形状のものも調製できる。該 処方は乳化することも可能である。該活性治療成分は、しばしば賦形剤と混合さ れ、該賦形剤はアッセイを妨害せず、かつ該活性成分と相容性のものである。適 当な賦形剤は、例えば水、塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等 およびその組み合わせである。更に、該組成物は、必要に応じて、該活性成分の 有効性を高める、少量の補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤等を含 むことができる。 抗体分子組成物は、更に中和された許容される塩の形状で処方してもよい。許 容される塩は、塩酸または燐酸等の無機酸あるいは酢酸、酒石酸、マンデル酸等 の有機酸と共に形成される酸付加塩類（該抗体分子の遊離アミノ基と共に生成さ れる）を包含する。遊離のカルボキシ基により生成される塩も、水酸化ナトリウ ム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは鉄等の無機塩基またはイソプロ ピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロ カイン等の有機塩基から誘導することができる。 4．治療組成物 如何なる形状であれ、CTL エピトープ（上記第２章参照）の好ましい処方は、 薬理組成物である。同様に、宿主に再度導入される、本発明のインビトロまたは インビボ−刺激CTL の好ましい処方も、薬理組成物である。特に、本発明の薬理 組成物は、上記のエピトープ群から選択されるCTL エピトープと実質的な相同性 をもつポリペプチド、または該ポリペプチド自体、および製薬上許容される担体 または賦形剤を含有する1種以上の分子で構成される。 当業者は、腫瘍または他の悪性疾患状態の治療のために、哺乳動物（例えば、 ヒト患者）に化合物を投与するための、例えば本発明の方法において有用であろ うと思われる適当な方法が利用できることを理解するであろう。特定の化合物ま たは組成物を投与するのに１以上の経路を利用できるが、ある特定の投与経路が 他の投与経路よりも一層迅速かつ一層効果的を反応をもたらす可能性がある。従 って、ここに与えられる方法は、単に例示的なものであって、何等限定的なもの ではない。 一般的に、本発明の上記のペプチド(または活性化CTL)は、腫瘍または悪性疾 患状態にある個体に、薬理組成物として投与されるであろう。本発明の方法並び に組成物を介して治療を受けるものは、現時点において記載されたペプチドおよ び組成物によって、あるいは必要ならば他の治療と組み合わせて、該組成物によ り治療できる。 治療上の用途において、組成物は、特定の腫瘍抗原または抗原類に対する効果 的な細胞毒性Ｔリンパ細胞応答を誘発し、もしくは腫瘍−関連症状および／また は合併症を治癒もしくは少なくとも部分的に阻害するのに十分な量で、患者に投 与する。これを達成するに十分な量は、「治療的または予防的に有効な投与（服 用）量」として定義され、あるいは「免疫応答を誘発する量」と記載することも できる。治療または予防的使用に有効な量は、種々の因子に依存するであろう。 例えば、このような因子は治療すべき疾患の段階および重度、年齢、体重、およ び患者の一般的な健康状態、および指示する医師の判断を包含する。該服用量の サイズも、ペプチド組成物、投与法、投与の磁気および頻度、並びに所定の化合 物(または活性化されたCTL)の投与に伴うと考えられるあらゆる副作用の存在、 性質および程度および所定の生理的効果により決定されるであろう。当業者は、 種々の条件および疾患状態が、多重投与を含む長期の治療を必要とするであろう ことを理解するであろう。 適当な投与量および服用量は、当業者には公知の範囲決定技術(range-finding technique)によって決定できる。一般的に、治療は該化合物の最適投与量未満 であるより少量の投与範囲から開始される。その後、該投与量は、該情況下で最 適の効果に達するまで、しばしば少量づつ増大される。本発明の方法は、典型的 には該個体の体重１kg当たり、上記化合物の１種以上を約0.1μｇ〜約50mgの量 の投与を含むであろう。体重70kgの患者については、ペプチド約10μｇ〜約100 mgの服用量が、より一般的に利用され、次いで約１μｇ〜約１mgのペプチドを数 週間〜数カ月、患者から得られるPBL 中の腫瘍−特異的CTL 活性を測定すること により決定されるような、該患者のCTL 応答に依存して、追加投与される。好ま しくは、該患者由来のものである、刺激されたCTL の再導入のためには、典型的 には投与量は、除去される細胞の集団（数）の1%からその全体（即ち、100%）ま での範囲内であろう。 本発明のペプチドおよび組成物は、一般的に重度の疾患状態、即ち生命に係わ るあるいは潜在的に生命に係わる情況において使用することができることを心に 止めておくべきである。このような場合には、外因性物質を最小化し、かつ該ペ プチドの相対的な非−毒性の観点から、これらペプチド組成物の実質的な過剰量 を投与することが可能であり、治療医師によって望ましいと考えられる。本明細 書に記載の組成物の単一回または多数回の投与は、治療に携わる医師により選択 される投与レベルおよびパターンで実施することができる。何れにしろ、好まし い薬理処方物は、該患者を効果的に治療するのに十分な量の、本発明の細胞毒性 Ｔリンパ細胞−刺激ペプチドを与えるべきである。 治療上の用途に対しては、投与は、腫瘍または悪性疾患状態の最初の徴候が見 られた時点で、あるいは診断後の短期間内に開始し、および該患者の症状が実質 的に軽減されるまで、かつその後の所定の期間継続すべきである。十分に確立さ れたまたは慢性状態においては、持続的投与または追加投与を伴う過重投与量が 必要とされる可能性がある。罹患した個体の、本発明の組成物による治療は、急 性罹患個体の状態の迅速な軽減を可能とする。 本明細書に記載するような、治療処置用の薬理組成物は、一般的には非経口、 局所、経口または局部投与を意図しており、また典型的には製薬上許容される担 体と、一定量の、例えば該腫瘍または他の悪性組織を縮小または死亡させるのに 十分な該活性成分とを含む。該担体は従来使用されていた任意のものであり得、 かつ物理化学的考察、例えば溶解度および該化合物との反応性の欠如および投与 経路によってのみ制限される。 本発明の薬理組成物で使用するための製薬上許容される酸付加塩類は無機酸、 例えば塩酸、臭化水素酸、燐酸、メタ燐酸、硝酸および硫酸、および有機酸例え ば酒石酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマール酸、安息香酸、グリコー ル酸、グルコン酸、琥珀酸、p-トルエンスルホン酸およびアリールスルホン酸等 から誘導されるものを包含する。 本明細書に記載する製薬上許容される賦形剤、ビヒクル、アジュバント、担体 または希釈剤の例は、当業者には周知であり、容易に市場から入手できる。該製 薬上許容される担体は、該活性成分に対して化学的に不活性であり、かつ使用条 件下で、有害な副作用または毒性をもたないモノクローナルである。 賦形剤の選択は、一部には特定のエピトープ、および選択されたエピトープの 処方並びに該組成物を投与する特定の方法により決定される。従って、本発明に よる薬理組成物の、広範囲に渡る適当な処方が存在する。以下の経口、エーロゾ ル、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経直腸および経膣投与用の処方物 は単なる例示であり、本発明を何等制限するものではない。 好ましくは、本発明の薬理組成物は、非経口経路、例えば静脈内、皮下、表皮 内または筋肉内投与される。かくして、本発明は非−経口投与用の組成物を提供 し、該組成物は水性剤、非−水性剤、等張性滅菌注射溶液を包含する、非経口投 与に適した許容される担体中に溶解または懸濁された、細胞毒性Ｔリンパ細胞刺 激性ペプチドの溶液を含む。 結局、非経口組成物用の有効な製薬担体に対する要件は、当業者には周知であ る（例えば、バンカー＆カルマーズ(Banker and Chalmers)(編)，Pharmaceutics and Pharmacy Practice，J.B.リッピンコット社(Lippincott Company)，フィラ デルフィア，PA，pp．238-250(1982)およびトイセル(Toissel)，ASHP Handbook on Injectable Drugs(第４版)，pp．622-630(1986)を参照のこと）。このような 溶液は、酸化防止剤、バッファー、静菌剤および意図したレシピエントの血液に 対して等張性処方とするための溶質を含むことができ、また水性および非水性懸 濁液は懸濁剤、溶解剤、増粘剤、安定化剤および保存剤を含むことができる。該 化合物は、生理的に許容される希釈剤、製薬担体、例えば水、塩水、水性デキス トロース溶液および関連糖溶液、エタノール、イソプロパノール、またはヘキサ デシルアルコール等のアルコール、プロピレングリコールまたはポリエチレング リコール等のグリコール、ジメチルスルホキシド、グリセロールケタール類、例 えば2,2-ジメチル-1,3- ジオキソラン-4- メタノール、ポリ（エチレングリコー ル）400 等のエーテル、油、脂肪酸、グリセライドの脂肪酸エステル、アセチル 化脂肪酸グリセライドを含む、滅菌液体または液体混合物に分散された状態（こ れらは製薬上許容される界面活性剤、例えば石鹸または洗浄剤、懸濁剤、例えば ペクチン、カーボマー(carbomers)、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメ チルセルロース、カルボキシメチルセルロース、または乳化剤および他の製薬ア ジュバントを含んでいても、含まなくてもよい）で投与できる。 非経口処方物において有用な油類は、石油、動物、植物または合成油を包含す る。このような処方物において有用な油類の具体的な例は、落花生油、大豆油、 胡麻油、綿実油、コーン油、オリーブ油、ペトロレータム、および鉱物油を包含 する。非経口処方物において使用する適当な脂肪酸類は、オレイン酸、ステアリ ン酸、およびイソステアリン酸を含む。エチルオレエートおよびイソプロピルミ リステートは適当な脂肪酸エステルの例である。 非経口処方物において使用する適当な石鹸は、脂肪酸のアルカリ金属塩、アン モニウム塩およびトリエタノールアミン塩、並びに適当な洗浄剤は(a)カチオン 性洗浄剤、例えばジメチルジアルキルアンモニウムハライド、およびアルキルピ リジニウムハライド、(b)アニオン性洗浄剤、例えばアルキル、アリールおよび オレフィンスルホネート、アルキル、オレフィンエーテル、およびモノグリセラ イドサルフェート、およびスルホサクシネート、(c)非イオン性洗浄剤、例えば 脂肪アミンオキサイド、脂肪酸アルカノールアミン、およびポリオキシエチレン ポリプロピレンコポリマー、(d)両性洗浄剤、例えばアルキル−β−アミノプロ ピオネートおよび2-アルキルイミダゾリン四級アンモニウム塩、および(e)これ らの混合物を包含する。 該非経口処方物は、典型的には溶液中に約0.5 〜25重量％の該活性成分を含む であろう。保存剤およびバッファーを使用することができる。注射部位における 刺激を最小化または排除するために、このような組成物は、親水性-親油性バラ ンス(HLB)約12〜約17を有する１種以上の非イオン性界面活性剤を含むことがで きる。このような処方物中の界面活性剤の量は、典型的には約５〜約15重量％の 範囲内にある。適当な界面活性剤は、ポリエチレンソルビタン脂肪酸エステル、 例えばソルビタンモノ−オレエートおよびプロピレンオキサイドとプロピレング リコールとの縮合により形成される、疎水性塩基とエチレンオキサイドとの高分 子量付加生成物を包含する。この非経口処方物は、単位投与または多重投与用の 密封された容器、例えばアンプルおよびバイアル内に収容することができ、また 使用の直前に、例えば注射用の水等の滅菌した液状賦形剤の添加のみを必要とす る、凍結乾燥状態で保存することも可能である。その場での注射溶液または懸濁 液は、前に記載した類の滅菌した粉剤、顆粒剤および錠剤から調製することがで きる。 経皮薬物放出のために有用な処方物を含む、局所投与用の処方物は当業者には 周知であり、皮膚への適用のために本発明において適している。 経口投与用に適した処方物は、該エピトープのペプチド性の特徴およびかかる 化合物を、胃腸管の消化分泌液からの保護なしに経口投与した場合の、その分解 し易さを考慮した、更なる考察を必要とする。このような処方物は(a)液状の溶 液、例えば水、塩水またはオレンジジュース等の希釈剤中に溶解した有効量の該 化合物、(b)カプセル、分包(sachets)、錠剤、トローチ剤およびロゼンジ(lozen ges)、これらは各々所定量の活性成分を固体または顆粒として含有する、(c)粉 剤、(d)適当な液体中の懸濁剤、および(e)適当な乳剤からなるものであり得る。 液状処方物は希釈剤、例えば水およびエタノール、ベンジルアルコールおよびポ リエチレンアルコール等のアルコール類を含むことができ、また製薬上許容され る界面活性剤、懸濁剤または乳化山を含んでいてもまた含まなくともよい。カプ セル形状は、通常例えば界面活性剤、潤滑剤および不活性フィラー、例えばラク トース、スクロース、燐酸カルシウム、およびコーンスターチ等を含む、硬質− または軟質殻ゼラチン型のものであり得る。錠剤型のものは、ラクトース、スク ロース、マニトール、コーンスターチ、ジャガイモ澱粉、アルギン酸、ミクロク リスタリンセルロース、アカシア、ゼラチン、グアーガム、コロイド状二酸化珪 素、ナトリウムクロスカルメロース(croscarmellose)、タルク、ステアリン酸マ グネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、およ び他の賦形剤、着色剤、希釈剤、バッファー、崩壊剤、保湿剤、保存剤、矯味／ 矯臭剤、および製薬上許容される賦形剤の１種以上を含むことができる。ロゼン ジ形状のものは、通常はスクロース、およびアカシアまたはトラガカンスゴムで ある矯味／矯臭剤中に活性成分を含み、更に不活性ベース、例えばゼラチンおよ びグリセリンまたはスクロースおよびアカシア中に該活性成分を含む香錠、該活 性成分以外に当分野において公知の賦形剤を含有するエマルション、ゲル等を包 含する。 本発明の分子および／またはペプチド単独または他の適当な成分との組み合わ せは、吸入を通して投与するためのエーロゾル処方物とすることも可能である。 エーロゾル投与のために、該細胞毒性Ｔリンパ細胞刺激ペプチドは、好ましくは 界面活性剤および噴射剤と共に、微粉化された状態で供給される。ペプチドの典 型的な割合は0.01〜20重量％、好ましくは１〜10重量％の範囲にある。該界面活 性剤は、勿論無毒であり、かつ好ましくは該噴射剤に可溶性のものである。この ような試薬の代表は、６〜22個の炭素原子を含有する脂肪酸のエステルまたは部 分エステル、例えばカプロン酸、オクタン酸、ラウリル酸、パルミチン酸、ステ アリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリン(olesteric)酸およびオレイ ン酸と、脂肪族多価アルコールまたはその環状無水物とのエステルまたは部分エ ステルである。混合エステル、例えば混合または天然グリセライドを使用するこ とも可能である。該界面活性剤は、該組成物の0.1 〜20重量％、好ましくは0.25 〜５重量％を構成し得る。該組成物の残部は、通常噴射剤である。必要ならば、 担体例えば鼻内放出に対するレシチン等を含むこともできる。これらのエーロゾ ル処方物は、許容される加圧噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、プロパ ン、窒素ガス等に入れることができる。これらは、また非−加圧型処方、例えば ネブライザーまたはアトマイザー用の調剤として処方することもできる。このよ うなスプレー処方は粘膜に噴霧するのに使用できる。 更に、本発明の方法において有用な該化合物およびポリマーは、乳化ベースま たは水溶性ベース等の種々のベースと混合することにより坐剤とすることも可能 である。経膣投与に適した処方は、該活性成分以外に、当分野で適当であるとさ れている担体を含有する、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、 フォームまたは噴霧処方として提供できる。 幾つかの態様においては、該薬理組成物中に、一般的にCTL を感作する少なく とも一つの成分を含めることが望ましい場合がある。脂質は、ウイルス抗原に対 してインビボにてCTL を感作できるものであることが明らかにされており、その 例としてはトリパルミトイル-S- グリセリルシステイニル−セリル−セリン(P2C SS)であり、これは適当なペプチドに共有結合的に付着した場合には、腫瘍特異 的細胞毒性Ｔリンパ細胞を効果的に感作することができる（例えば、デレス(Der es)等，Nature，1989，342: 561-564を参照のこと）。本発明のペプチドはP2CSS 等とカップリングすることができ、またこのリポペプチドは個体に投与された 場合に、特定の腫瘍細胞または組織に対する細胞毒性Ｔリンパ細胞応答を特異的 に刺激することができる。更に、中和抗体の誘導も、適当なエピトープ例えば幾 つかのp53 エピトープを表示するペプチドと複合化したP2CSS により刺激す ることができるので、これら２種の組成物は、腫瘍または他の悪性疾患細胞また は組織に対する体液性並びに細胞−媒介応答両者を、より効果的に誘発するため に組み合わせることができる。 該薬理処方物における、本発明の細胞毒性Ｔリンパ細胞を刺激するペプチドの 濃度は、広範囲で変えることができ、即ち約１重量％未満、通常は約10重量％ま たは少なくとも約10重量％から、20〜50重量％またはそれ以上であり、主として 流体の体積、粘度等により、選択された特定の投与形式に応じて選択されるであ ろう。かくして、静脈内注入用の典型的な薬理組成物は、リンゲル溶液250 mlお よびペプチド100 mg含むように調製できる。非経口経路で投与可能な化合物の調 製法は、当業者には公知または明らかであり、例えばRemington's Pharmaceutic al Science（第17版，マック出版社，イーストン，PA，1985）により詳細に記載 されている。 当業者には、上記の薬理組成物に加えて、本発明の化合物が包接型錯体、例え ばシクロデキストリン包接錯体またはリポソームとして処方することができる。 リポソームは、特定の組織、例えばリンパ様組織または悪性細胞または組織まで 該ペプチドを誘導するよう機能する。リポソームは、また該ペプチド組成物の半 減期を増大するために使用できる。 本発明において有用なリポソームは、エマルション、フォーム、ミセル、不溶 性単分子層、液晶、リン脂質分散体、ラメラ層等を包含する。これらの処方にお いて、放出すべき該ペプチドはリポソームの一部として、単独でまたは例えばレ セプタ（好ましくは、該CD45抗原に結合するモノクローナル抗体等のリンパ様細 胞中で優勢なもの）と結合する分子または他の治療用または免疫原性組成物との 組み合わせとして配合される。かくして、本発明の所定のペプチドで満たされた リポソームを、リンパ様または腫瘍細胞の該サイトに誘導できる。そこで、該リ ポソームは該選択された治療／免疫原性ペプチド組成物を放出する。 本発明で使用するリポソームは、典型的には標準的なビヒクル−生成脂質から 形成され、これは一般的には中性かつ負に帯電したリン脂質およびステロール、 例えばコレステロールを含有する。脂質は、一般的に、例えばリポソームのサイ ズ、および血流中のリポソームの安定性を考慮することにより選択される。例え ば、ゾーカ(Szoka)等，Ann．Rev．Biophy．Bioeng.，1980，9: 467 および米国 特許第4,235,871 号、同第4,501,728 号、同第4,837,028 号、同第5,019,369 号 （これらを本発明の参考文献とする）に記載されているように、様々な方法がリ ポソームの調製のために利用可能である。 該免疫細胞に誘導するために、該リポソーム中に配合すべきリガンドは、例え ば所定の免疫系細胞の細胞表面決定基に対して特異的な、抗体またはそのフラグ メントを含むことができる。ペプチドを含有するリポソーム懸濁液は、静脈内、 局所、局部等の経路で、該投与様式、放出される該ペプチド、治療すべき疾患の 状態等に応じて変動する服用量で投与することができる。 もう一つの局面において、本発明は、活性成分として免疫原的に有効な量の、 上記のような細胞毒性Ｔリンパ細胞刺激性ペプチドを含有するワクチンをも目的 とする。該ペプチドを、宿主、好ましくは哺乳動物、例えばマウス種またはヒト に、その固有の担体に結合した状態で、または活性ペプチド単位をもつホモポリ マーまたはヘテロポリマーとして導入することができる。このようなポリマーは 高い免疫学的反応性をもつという利点をもち、また該ポリマーを作成するのに異 なるペプチドを使用した場合には、腫瘍細胞または組織の異なる抗原決定基（例 えば、p53 、Her-2/Neu)と反応する抗体および／または細胞毒性Ｔ細胞を誘発す るという付随的な利点をももたらす。 有用な担体は当分野で周知であって、例えばキーホールリンペットヘモシアニ ン、チログロブリン、アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）、破傷風毒素、 ポリアミノ酸、例えばポリ(D- リジン: D-グルタミン酸)等を包含する。これら のワクチンは、生理的に許容される希釈剤、例えば水、PBS 、または塩水を含む こともでき、また更に典型的にはアジュバントを含むことができる。不完全フロ インドアジュバント、燐酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、またはミョウバ ン、または当分野において周知の物質等を例示できる。 また、上記のように、細胞毒性Ｔリンパ細胞応答は、本発明のペプチドを、P3 CSS 等の脂質と複合化することにより刺激できる。注入、エーロゾル、経口、経 皮または他の経路で、本明細書に記載のようなペプチド組成物により免疫化する 場合、宿主の免疫系は、腫瘍関連または腫瘍特異的抗原に対して特異的な細胞毒 性Ｔリンパ細胞を大量に生産することにより、該ワクチンに応答し、該宿主は、 少なくとも部分的に、該抗原が関連する該腫瘍または悪性疾患の発症に対して免 疫性とするかあるいは耐性とする。 本発明のペプチドを含有するワクチン組成物を、関連する腫瘍または悪性疾患 に罹りやすいか、さもなくば発症の危険性のある患者に投与して、患者自身の免 疫応答能を高める。このような量は「免疫原的に有効な投与量」または「予防的 に有効な投与量」であると定義される。この用途において、その正確な量は、ま た患者の健康状態および体重、投与形式、処方の特性等に依存するが、一般的に は患者の体重70kg当たり約1.0 μｇ〜約500 mg、より一般的には体重70kg当たり 約50μｇ〜約200 mgの範囲である。 本発明のペプチドは、好ましくは適当なHLA 型の個体に投与される。例えば、 HLA-A2個体用のワクチン組成物については、以下のペプチドを有利に投与できる ：p53.25-35，LLPENNVLSPL(SEQ ID NO 1)、p53.65-73，RMPEAAPPV(SEQ ID NO 2) 、p53.149-157，STPPPGTRV(SEQ ID NO 3)、p53.264-272，LLGRNSFEV(SEQ ID NO 4)、HER-3，KIFGSLAFL（SEQ ID NO 10）、HER-6，TLQGLGISWL(SEQ ID NO 11)、H ER-7，VMAGVGSPYV(SEQ ID NO 12)、HER-8，VLQGLPREYV(SEQ ID NO 13)、およびH ER-9，ILLVVVLGV（SEQ ID NO 14)。上記のものと実質的に相同性のペプチドも、 本発明に従って有利に投与できる。 治療もしくは免疫化の目的にとって、本発明のペプチドは弱毒化したウイルス 宿主、例えばワクシニアによっても発現できる。この方法は、本発明の該p53 ま たはHer-2/Neu ペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するためのベクタ ーとしての、ワクシニアウイルスの使用を含む。宿主中への導入の際に、該組み 換えワクシニアウイルスは、該腫瘍−関連ペプチド（例えば、p53 またはHer-2/ Neu ペプチド）を発現し、結果として該宿主の、適当な腫瘍−関連ペプチドまた はタンパクに対する細胞毒性Ｔリンパ細胞応答を誘発する。免疫化プロトコール において有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば米国特許第4,722,848 号に記載されている。もう一つのベクターはBCG(バシリカルメットゲラン(Bacil le Calmette Guerin))である。BCG ベクターは、ストーバー(Stover)等，Nature ,1991，351: 456-460に記載されている。本発明のペプチドの治療のための投与 ま たは免疫化のために有用な広範な他のベクターは、本明細書の記載から当業者に は明らかであろう。 特許請求された本発明の組成物および方法は、また生体外療法のために利用す ることも可能であり、そこでは、簡単に上で説明したように、患者のリンパ細胞 の一部を取り出し、本発明のペプチドの刺激誘発量で攻撃し、得られる刺激され たCTL を該患者に戻す。従って、より詳細には、本明細書で使用する生体外療法 は、リンパ細胞または患者から取り出された他のターゲット細胞についての、生 体外で実施される治療または免疫原的処置に関連する。次いで、このような細胞 を、対象とするペプチドの高ドーズにてインビトロで培養し、該患者により達成 されるあるいは許容される濃度を遙に越える、該細胞媒体中でのペプチドの刺激 による濃厚化をもたらす。該CTL を刺激する処理に引き続いて、該細胞を該宿主 に戻し、かくして該腫瘍または他の悪性疾患を治療する。該宿主の細胞を、上記 のように該ペプチドをコードする遺伝子を担持するベクターに暴露することも可 能である。一旦これらのベクターでトランスフェクションすると、該細胞はイン ビトロで増殖させることができおよび／または該患者に戻すことができる。イン ビトロで増殖される該細胞は、所定の細胞密度に達した後に、該患者に戻すこと ができる。 一方法において、腫瘍関連タンパク(例えば、p53 またはHer-2/Neu)に対する インビトロでのCTL 応答は、患者のCTL 先駆体細胞(CTLp)を、抗原提示細胞(APC )および適当な免疫原性ペプチドと共に、組織培養培地中でインキュベートする ことにより誘発される。適当なインキュベーション時間(典型的には、１〜４週 間)の経過後（ここで、該CTLpは活性化され、成熟し、エフェクタCTL に発展す る)、該細胞を該患者に戻され、そこで該細胞はその特異的ターゲット細胞（例 えば、細胞発現Her-2/Neu 等の腫瘍関連抗原発現細胞）を崩壊するであろう。特 異的細胞毒性Ｔ細胞の発生のためのインビトロ条件を最適化するためには、刺激 体細胞の培養を、典型的には適当な血清を含まない培地中で維持する。末梢血リ ンパ細胞は、有利には、正常なドナーの簡単な静脈穿刺または白血球除去血輸血 に従って単離され、かつCTLpの免疫応答体細胞源として利用される。一態様にお いて、適当なAPC を、適当な培養条件下で、４時間、血清を含まない培地中で、 約10 -100μＭのペプチドと共にインキュベートする。次いで、このペプチド−担持AP C を、インビトロで該免疫応答体細胞集団と共に、最適化された培養条件下で、 ５〜10日間インキュベートする。 正のCTL 活性化は、該培養物を、以下で更に論じるように、放射性標識された ターゲット細胞、即ち腫瘍関連(例えばp53 またはHer-2/Neu)抗原の内因的にプ ロセッシングされた形状を発現するターゲット細胞並びに特異的ペプチド−パル ス化ターゲット両者を殺すCTL の存在についてアッセイすることにより決定でき る。具体的には、患者の該CTL のMHC 制限は、当分野で公知の種々の方法によっ て測定できる。例えば、CTL 制限は、適当なまたは不適当なヒトMHC クラスＩを 発現する異なるペプチドターゲット細胞に対してテストすることにより測定でき る。テストにより、該MHC 結合アッセイにおいて正であることが分かっている、 しかも特異的CTL 応答を生ずる該ペプチドが、免疫原性ペプチドとして同定され る。 インビトロでのCTL の誘導は、APC 上のMHC クラスＩ分子に対して特異的な対 立遺伝子に結合するペプチドの特異的識別を必要とする。細胞上のエンプティー (empty)主要組織適合遺伝子複合体分子のペプチド担持は、一次CTL 応答の誘発 を可能とする。変異細胞系は何れのMHC 対立遺伝子に対しても存在するわけでは ないので、APC の表面から内因性のMHC 関連ペプチドを除去し、引き続き得られ るエンプティーMHC 分子に対象とする免疫原性ペプチドを担持させるための技術 を利用することが有利であり得る。形質転換されていない、感染されていない細 胞、好ましくは患者自身の細胞のAPC としての利用は、生体外CTL 療法の発展の ための、CTL 誘発プロトコールを工夫するのに望ましい。典型的には、該APC と 活性化すべきCTLpとのインキュベーション前に、一定量の抗原ペプチドを、該AP C の表面上で、発現すべきヒトクラスＩ分子に担持されるのに十分な量で、該AP C または刺激体細胞培養物に添加する。次いで、静止期のまたは先駆体CTL を、 適当なAPC と共に培養物中で、該CTL を活性化するのに十分な時間インキュベー トする。好ましくは、該CTL は抗原特異的方法で活性化される。静止期のまたは 先駆体CTL 対APC の比は、個体毎に変動する可能性があり、また更に個体のリン パ細胞の培養条件に対する順応性、該疾患状態の正常さおよび重度または記載し た種類の処理を利用するための他の条件等の変数に依存する。しかしながら、好 ましくは該CTL/APC の比は、約30:1〜300:1 の範囲内にある。このCTL/APC は、 治療上有用なまたは効果的なCTL 数を刺激するのに必要な十分に長い時間維持す ることができる。 活性化したCTL は、種々の公知の方法の何れか１つを利用して、該APC から効 果的に分離できる。例えば、APC 、該刺激体細胞に担持されたペプチド、または 該CTL(またはそのセグメント)に対して特異的なモノクローナル抗体は、その適 当な相補性リガンドと結合させるのに利用することができる。次に、抗体を付着 した分子を適当な手段、例えば周知の免疫沈降またはイムノアッセイ法により、 該混合物から抽出できる。 該活性化されたCTL の効果的な細胞毒性量は、インビボおよびインビトロ用途 間で、またこれらキラー細胞の最終的なターゲットである細胞の量および型によ って変動する可能性がある。該量は患者の状態に依存して変動するであろうし、 また開業医により、あらゆる適当な因子を考慮して決定されるべきである。しか しながら、好ましくは成人のヒトに対して、約1X106〜約1X1012、より好ましく は約1X108〜約1X1011およびより一層好ましくは約1X109〜約1X1010個の活性化さ れたCD8+細胞を使用し、これに対してマウスにおいては約5X106〜約5X107個の細 胞を使用する。細胞成分の再導入法は当分野で公知であり、ホンシック(Honsik) 等による米国特許第4,844,893 号およびローゼンバーグ(Rosenberg)による米国 特許第4,690,915 号に例示されているもの等の手順を包含する。これら米国特許 の開示を本発明の参考とする。例えば、静脈内注入による活性化CTL の投与が、 典型的には適当である。 本発明の治療用組成物は、生理的に許容される担体を、本明細書に記載する本 発明の治療剤の少なくとも１種と共に含み、該治療剤は該担体中に分散される。 好ましい一態様において、該治療用組成物は、治療の目的でヒト患者に投与され た場合には、免疫原性ではない。 本明細書で使用する用語「製薬上許容される」、「生理的に許容される」およ びその文法上の変形は、組成物、担体、希釈剤および試薬について使用された場 合には、互換性あるものとして使用され、かつ該物質が、吐き気、目眩、胃腸障 害等の望ましからぬ生理的作用を引き起こすことなしに、哺乳動物またはヒトに 投与できることを示す。 分散された活性成分を含有する薬理組成物の調製は、当分野では十分に理解さ れている。典型的なこのような組成物は、液状溶液または懸濁液としての滅菌組 成物として調製できるが、使用前に水性または非水性の懸濁液を調製することも 可能である。 該活性成分は、製薬上許容され、該活性成分と相容性である賦形剤と、本明細 書に記載される治療法で使用するのに適した量で、混合することができる。適当 な賦形剤は、例えば水、塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等お よびその組み合わせである。更に、必要ならば、該組成物は少量の補助物質、例 えば湿潤剤、乳化剤、pH緩衝剤等（これらは該活性成分の有効性を高める）を含 むことができる。 本発明の治療組成物は該成分の製薬上許容される塩を含むことができる。製薬 上許容される塩は、塩酸または燐酸等の無機酸または酢酸、酒石酸、マンデル酸 等の有機酸により形成される酸付加塩類（該ポリペプチドの遊離アミノ基により 形成される）を含む。遊離カルボキシル基によって形成される塩は、水酸化ナト リウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは鉄等の無機塩基およびイソ プロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、 プロカイン等の有機塩基から誘導できる。 生理的に許容される担体は当分野で周知である。液状担体の例は、活性成分と 水以外に何も含有しない滅菌水性溶液であり、あるいは生理的pHをもつ燐酸ナト リウム等を含むバッファー、生理的塩水またはその両者、例えばPBS を含む。更 に、水性担体は一種以上の緩衝塩並びに塩化ナトリウムおよびカリウム、デキス トロース、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよび他の溶質を含 むこともできる。 液状組成物は、また水以外の液相を含むことができる。このような付随的な液 相は、グリセリン、綿実油等の植物油、エチルオレエート等の有機エステル、お よび水−油エマルションである。 治療組成物は本発明の腫瘍関連試薬（例えば、ポリペプチド）を、典型的には 全治療組成物重量基準で、少なくとも0.1 重量％の量で含む。重量％は、腫瘍関 連試薬対全組成物の重量基準の比である。従って、例えば0.1 重量％は全組成物 100ｇ当たり、試薬0.1gである。 腫瘍関連試薬−含有組成物または該組成物中の有益な化合物の治療上有効な量 は、所定の効果を達成するために、即ち該組成物を投与する個体に効果的に便益 を与えるように計算された所定量であり、授与すべき利益に依存する。かくして 有効量は患者中に発生しているリンパ増殖性疾患の状態と関連する１以上の症状 における改善により測定できる。 かくして、本発明の腫瘍関連試薬（例えば、ポリペプチド）の投与のための服 用量範囲は、処置すべき状態を改善する所定の効果を生み出すのに十分に大きな 範囲である。この服用量は、有害な副作用を引き起こす程の量であってはならな い。一般的に、この服用量は年齢、状態および患者の性別、並びに患者中の該疾 患の程度に応じて変動し、また当業者はこれを決定することができよう。何等か の合併症がある場合には、該服用量は個々の医師により調節できる。 本発明の組成物は、該投薬処方と適合する様式でかつ治療上有効な量で投与さ れる。本発明の記載された組成物の治療で使用する量は、該所定の結果を引き起 こすのに十分な量であり、該疾患の状態および該治療化合物の効力に依存して広 範囲に渡り変動する。該投与すべき量は、治療すべき対象、該対象の系の該活性 成分を利用する能力、および所定の治療効果の程度に依存する。投与に必要な該 活性成分の正確な量は、開業医の判断に依存し、各個体に固有のものである。し かし、適当な投与量範囲は、全身的適用については、本明細書に記載され、投与 条件に依存する。投与の適当な養生法も変えることができるが、初期投与により 特徴付けされ、また後の投与による、１またはそれ以上の間隔での反復的投与を 伴う。 5．治療法 本発明は、種々の治療法をも意図する。例えば、p53 およびHer-2/Neu タンパ クから誘導されるペプチドが特定の腫瘍（または悪性疾患）と関連しており、CT L を刺激しもしくは活性化するのに利用でき、また「誘導試薬」として機能す る可能性があることを今や見出した。即ち、活性化されたCTL は各ペプチドを発 現し、または表示する細胞または組織の探索を「指図」することを見出した。か くして、現時点で発見された組成物および方法は、より遊離な治療法が限られた 効力しかもたない、多数の状態において利用可能な治療上の選択の幅を拡張し、 かつ増強する。 ここに記載する治療用分子およびこれを含有する組成物は、多数の用途をもち またインビボおよびインビトロで利用可能である。例えば、該組成物は、インビ ボで予防または治療上の目的で使用して、主要の成長または増殖を途絶すること ができる。ここに記載する他の有用な治療法は、本発明の治療用試薬および組成 物の投与を通して、腫瘍細胞を破壊することを意図する。 本発明は、またここに記載する治療組成物および方法の有効性を決定する方法 をも意図する。効力を確認する方法の例は、以下の実施例に記載されている。特 に、ここに記載のペプチド、組成物および治療法の有効性を決定するのに利用で きる幾つかの方法があることを理解すべきである。 本発明は、また「静止期」または先駆体CTL の単離法にも関連する。静止期の （または先駆体）CTL 細胞、即ち特定の抗原をターゲットとするように活性化さ れていないＴ細胞は、好ましくは、該CTL 細胞と本発明の形質転換された培養物 とのインキュベーションに先立って、患者から抽出される。また、該CTL 細胞の 特異的に活性化される能力を妨害する恐れのある他の処理または治療を開始する 前に、先駆体CTL 細胞を患者から収穫することが好ましい。例えば、腫瘍形成ま たは腫瘍のある個体を治療しようとする場合、化学療法または放射線療法を開始 する前に、細胞のサンプルを得かつこれを培養することが好ましい。先駆体CTL を単離する方法は、ピーターソン(Peterson)等による米国特許第5,314,813 号に 記載されている（この特許の開示を本発明の参考とする）。 リンパ細胞を抽出しかつ培養する方法は周知である。例えば、ローゼンバーグ (Rosenberg)の米国特許第4,690,915 号は、リンパ細胞分離法による多数のリン パ細胞を得る方法を記載している。使用する適当な培養条件は、哺乳動物細胞に 対しては、典型的には37℃にて実施する。 種々の方法が、先駆体CTL 細胞の培養物を分離し、および／または富化するの に利用可能である。細胞分離のための一般的な方法の幾つかは、細胞の特異的に 一被覆された表面への間接的結合を含む。もう一つの例において、CTL 細胞を含 むヒト末梢血リンパ細胞(PBL)はフィコール−ハイパック(Ficoll-Hypaque)勾配 遠心(ファルマーシア(Pharmacia),ピスカタウエイ，NJ)により単離される。PBL リンパ芽球はその後即座に使用でき、あるいはFBS-含有10% DMSO（シグマケミカ ル社(Sigma Chemical Co.)，セントルイス，MO，これは細胞の生存性およびリン パ細胞の機能を保存する）中で凍結した後、液体窒素中に保存することもできる 。 先駆体細胞の培養物を分離しおよび／またはこれを富化するためのもう一つの 方法は、以下の例を含む。リンパ細胞−富化PBL 集団を全血から調製し、CTL リ ンパ細胞のサブ集団を、該CTL レセプタ抗原の存在を指向する、アフィニティー に基づく分離技術によってこれから単離する。これらのアフィニティーに基づく 分離技術はフルオレッセンス−活性化細胞選択(FACS)、細胞接着等の方法を含む フローミクロフルオリメトリー(flow microfluorimetry)を包含する（例えば、 シェーア＆メイジ(Scher and Mage)，Fundamental Immunology，W.E.ポール(Pau l)編，pp．767-780,リバープレス，NY(1984)を参照のこと）。アフィニティー法 は、アフィニティー試薬の源として、抗−CTL レセプタ抗体を使用できる。また 、CTL レセプタの天然リガンドまたはリガンド類似体を、該アフィニティー試薬 として使用することも可能である。これらの方法で使用する、種々の抗−Ｔ細胞 および抗−CTL モノクローナル抗体は、一般的に種々の市販元から入手でき、該 市販元は、アメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture C ollection)(MD 州，ロックビル)およびファーミンゲン(Pharmingen)(MD 州，サ ンジエゴ)を包含する。抗原の名称に応じて、種々の抗体が適している。（T細胞 を含むヒト白血球の命名、抗原名称および割当られた抗体についての議論および 概要は、例えばナップ(Knapp)等，Immunology Today，1989，10: 253-258 を参 照のこと）。例えば、モノクローナル抗体OKT4(抗-CD4，ATCC No．CRL 8002)、O KT5(ATCC No．CRL 8013および8016)、OKT8(抗-CD8，ATCC No．CRL 8014)およびO KT9(ATCC No．CRL 8021)が、それぞれヒトＴリンパ細胞、ヒトＴ細胞サブセット および活性化Ｔ細胞に対して反応性であるとして、細胞系およびハイブリドーマ のATCCカタログに同定されている（ATCC，ロックビル，MD）。種々の他の抗 体が、Ｔ細胞種を同定し、かつ単離するのに利用できる。 好ましくは、該PBL を次に精製する。例えば、この目的に対してフィコール勾 配遠心処理が利用できる。 6．発現ベクター 本発明のヌクレオチド配列またはセグメントが機能可能に結合しているベクタ ーの選択は、当分野で周知のごとく、所定の機能特性、例えばタンパク発現形質 転換すべき宿主細胞（これらは、組み換え核酸分子の構築技術に固有の限界であ る）に直接依存する。しかしながら、本発明の意図するベクターは、機能的に結 合した核酸セグメントに含まれる、本発明のタンパクまたはポリペプチドをコー ドする遺伝子の、少なくとも複製および好ましくはその発現を指示することがで きる。 好ましい態様において、本発明の意図するベクターは、原核レプリコン、即ち 該ベクターで形質転換される原核宿主細胞、例えばバクテリア宿主細胞中で、染 色体外で該組み換え核酸分子の自己複製および維持を指令する能力をもつ、核酸 配列を含む。このようなレプリコンは当分野において周知である。更に、原核レ プリコンを含むこれら態様は、またある遺伝子を含み、該遺伝子の発現はこれに より形質転換されたバクテリア宿主に薬物耐性を付与する。典型的なバクテリア 薬物耐性遺伝子は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する抵抗性を付与 するものである。 原核レプリコンを含むこれらのベクターは、またこれにより形質転換されたE. コリ等のバクテリア宿主細胞中での、有利なタンパク遺伝子の発現（転写および 翻訳）を指令できる原核プロモータを含むことができる。プロモータは、RNA ポ リメラーゼの結合および転写の発生を可能とする、核酸配列によって形成される 発現制御エレメントである。バクテリア宿主と相容性のプロモータ配列は、典型 的にはプラスミドベクター中に与えられ、該ベクターは、本発明の核酸セグメン トの挿入に対して有利な制限サイトを含む。このようなベクタープラスミドの典 型例は、バイオラドラボラトリーズ社（リッチモンド，CA）から入手できるpUC8 、pUC9、pBR322およびpBR329、並びにN.J.州、ピスカタウエイのファルマシア (Pharmacia)から入手できるpPL およびである。 真核細胞と相容性の、好ましくは哺乳動物細胞と相容性の発現ベクターを使用し て、本発明で使用する組み換え核酸分子を生成することも可能である。哺乳動物 細胞発現ベクターは当分野で周知であり、幾つかの市販元から入手できる。典型 的には、このようなベクターは、所定の核酸セグメントの挿入用の、有利な制限 サイトを備えかつ哺乳動物細胞における遺伝子発現に必要なシグナルを与える。 このようなベクターの典型例は、インビトロゲン(Invitrogen)社(サンジエゴCA) から入手可能なpREP系のベクターおよびpEBV、アメリカンタイプカルチャーコレ クション(American Type Culture Collection)(ATCC)から入手可能なベクターpT DT1(ATCC #31255)、pCP1(ATCC #37351)およびpJ4W(ATCC #37720)並びに同様な哺 乳動物細胞発現ベクターである。 哺乳動物中での発現を制御するためには、ウイルス−由来のプロモータが最も 普通に使用される。例えば、高い頻度で使用されるプロモータは、ポリオーマ、 アデノウイルスタイプ２、およびシミアンウイルス40(SV40)を包含する。SV40の 初期および後期のプロモータは特に有用である。というのは、これら両者は、SV 40ウイルスの複製源をも含むフラグメントとして該ウイルスから容易に得られる からである。より大きなまたはより小さなSV40フラグメントを使用することも可 能である。但し、Hind III制限サイトから該ウイルスの複製源に位置するBglIサ イトに広がる、約250 塩基対の配列が含まれている。また、所定の発現配列、例 えばアデノウイルス２と通常は結合した該プロモータ配列を使用することも意図 されている。複製源は、例えばSV40、または他のウイルス源例えばポリオーマ、 バキュロウイルスまたはアデノウイルスから誘導できるもののように、外来源を 含むようにベクターを構築することにより得ることができるか、もしくは該宿主 細胞の染色体複製メカニズムにより与えることができる。後者は、該宿主細胞の 染色体中に該発現ベクターを組み込むのに十分である。 アデノウイルスに基づくベクターは、PCT 出願公開No．WO94/17832に、より詳 細に記載されている。その開示事項を本発明の参考とする。他の有用なベクター は以下の実施例に記載されている。 本発明のベクターは、細胞内で自己複製可能であって、DNA セグメント、例え ば遺伝子即ちポリヌクレオチドが機能可能に結合して付着したセグメントの複製 をもたらす、核酸（好ましくは、DNA ）分子である。本発明においては、ベクタ ー配列に機能可能に結合すべき該ヌクレオチドセグメントの一つは、哺乳動物の クラスＩMHC 分子の少なくとも一部をコードする。好ましくは、該MHC 遺伝子の 全ペプチド−コード配列が、該ベクター中に挿入され、発現されるが、幾つかの 非−コードMHC 配列をも含有するベクターの構築も実施可能である。好ましくは MHC の非コード配列は排除される。また、クラスＩMHC 分子の可溶性(“sol”) 型に対するヌクレオチド配列を使用することもでき、この“sol”型は、これが α３ドメインの端部または該貫膜ドメイン前方に挿入された「停止」コドンを含 む点においてnon-sol とは異なる。もう一つの好ましいベクターは、発現用の該 ベクターに機能可能に結合された、哺乳動物のβ２マイクログロブリン分子の少 なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を含む。またクラスＩMHC 分子およ びβ２マイクログロブリン両者をコードするヌクレオチド配列を含有するベクタ ーを構築することも実施可能である。 好ましいベクターは、方向性結合に適したヌクレオチド配列を介して、発現の ために機能可能に結合した、１以上の翻訳可能なDNA 配列を含むカセットを含有 する。このカセットは、好ましくは該ポリペプチドまたはタンパクを発現するた めのDNA 発現調節配列を含み、該ポリペプチド等は翻訳可能なDNA 配列が、方向 性結合に適したヌクレオチドの配列を介して該カセットに方向結合的に挿入され た場合に生成される。このカセットは、また該翻訳可能なDNA 配列の上流側にプ ロモータ配列を、および該哺乳動物MHC 配列の下流側にポリアデニル化配列を含 むことが好ましい。このカセットは、また選択マーカーを含むことができるが、 このようなマーカーは、もう一つの発現ベクター配列に機能可能に結合したヌク レオチド配列中でコードされることが好ましい。 発現ベクターは、相容性宿主内で、構造遺伝子生成物、例えば哺乳動物クラス ＩMHC ポリペプチド、β２マイクログロブリン、またはその両者を発現すること が可能であることにより特徴付けられる。特に、本明細書に記載される発現ベク ターは、ヒトクラスＩMHC 分子および／またはヒトβ２マイクログロブリンを発 現できる。 ここで使用する用語「ベクター」とは、機能可能に結合されたもう一つの核酸 を、異なる遺伝子環境間で伝達することのできる核酸分子を意味する。好ましい ベクターは、これらが機能可能に結合したヌクレオチド(DNA)セグメント中に存 在する構造遺伝子生成物を自己複製しかつ発現することのできるものである。 DNA 配列またはセグメントに関連してここで使用する「機能可能に結合」なる 表現は、一本鎖であれ二本鎖であれ、一片のDNA に共有結合的に結合されている 配列またはセグメントを意味する。本発明のカセットを機能可能に結合するベク ターの選択は、当分野で公知である如く、所定の機能特性、例えばベクターの複 製およびタンパク発現、および形質転換すべき宿主細胞(これらは、組み換えDNA 分子を構築する技術において固有の制限である)に、直接依存する。 種々の態様において、ベクターが、MHC 変異体および抗原性ペプチドを包含す る、本発明で有用なポリペプチドを製造するために利用される。このようなベク ターは、有用な量のタンパクまたはポリペプチドを製造するのに適した、バクテ リア「宿主」細胞と組み合わせて使用することが好ましい。このようなベクター は、原核レプリコン、即ち該ベクターで形質転換されたバクテリア宿主細胞等の 原核宿主細胞中で染色体外にて該組み換えDNA 分子を直接自己複製し、かつこれ を維持する能力を有するヌクレオチド配列を含むことができる。このようなレプ リコンは当分野において周知である。更に原核レプリコンを含むこれらの態様で も、選別上の利益、例えば薬物耐性を、形質転換されたバクテリア宿主に与える 遺伝子を含むことができる。典型的なバクテリア薬物耐性遺伝子は、アンピシリ ンまたはテトラサイクリンに対する抵抗性を与える遺伝子である。典型的に、ベ クターはまた、翻訳可能なヌクレオチド配列の挿入のための有利な制限サイトを 含む。ベクターの例はバイオラドラボラトリーズ(BioRad Laboratories; リッチ モンド，CA)から入手できるプラスミドpUC8、pUC9、pUC18、pBR322および pBR32 9、ファルマーシア社(Pharmacia; ピスカタウエイ，NJ)から入手できるプラスミ ドpPL およびpKK223、並びにpBS およびM13mp19(ストラタジーヌ(Stratagene)， ラジョラ，CA)を包含する。他のベクターの例は、pCMU(ニルソン(Nilsson)等，C ell，1989，58: 707)を含む。その他の適当なベクターも、公知の方法により合 成でき、例えば本発明の種々の用途において使用されるベクターpCMU/Kbお よびpCMUIIはpCMUIV（ニルソン(Nilsson)等の上記文献）の改良体である。 方向性結合に適したヌクレオチド、即ちポリリンカーの配列は、(1)上流およ び下流ヌクレオチド配列を複製し、かつ伝達するように機能可能に結合し、(2) ヌクレオチド配列を該ベクターに方向性結合するためのサイトまたは手段を与え る、発現ベクターのある領域である。典型的には、方向性ポリリンカーは、２以 上の制限エンドヌクレアーゼ認識配列または制限サイトを規定するヌクレオチド の配列である。制限開裂の際に、これら２つのサイトは付着末端を生成し、翻訳 可能なヌクレオチド配列を該発現ベクターに結合できる。好ましくは、これら２ つの制限サイトは、制限開裂の際に、非−相補性の付着末端を与え、結果として 翻訳可能なヌクレオチド配列の該カセットへの方向性挿入が可能となる。一態様 において、この方向性結合を達成する手段は、上流側ヌクレオチド配列、下流側 ヌクレオチド配列または両者中に存在するヌクレオチドによって与えられる。も う一つの態様において、方向性結合に適したヌクレオチド配列は、多重方向性ク ローニング手段を規定するヌクレオチド配列を含む。方向性結合に適したヌクレ オチド配列が多数の制限サイトを規定する場合には、これは多重クローニングサ イトと呼ばれる。 翻訳可能なヌクレオチド配列は、一個の読み取り枠内のポリペプチドをコード する、非妨害性の一連りの少なくとも８個のコドンを与える、線状の一連りのヌ クレオチドである。好ましくは、このヌクレオチド配列はDNA 配列である。その 上、プロモータ配列をコードする翻訳可能なヌクレオチド配列の上流側に一つの 配列をもつことが好ましい。好ましくは、このプロモータは条件的（例えば、誘 発性の）プロモータである。ここに記載するように、有用な条件的プロモータは メタロチオネインプロモータまたはヒートショックプロモータを包含する。 ベクターは、周知のベクター構築技術を利用して構築できる。しかしながら、 これらの技術は該宿主細胞のゲノムに挿入すべき、翻訳可能なヌクレオチド配列 が、適当なプロモータによって、該配列の「上流側」でフランキングされ、また 本発明の幾つかの変法において、該翻訳可能なヌクレオチド配列がポリアデニル 化サイトによって「下流側」でフランキングされる程度に改善される。これは、 特に該「宿主」細胞が昆虫細胞であり、かつ該ヌクレオチド配列がトランスフェ クションによって伝達された場合に好ましい。このトランスフェクションは、多 数の方法により達成でき、該方法は燐酸カルシウム法、DEAE−デキストラン法、 安定伝達(stable transfer)法、エレクトロポーレーション法、またはリポソー ム媒介法によって達成できる。公知のトランスフェクション法および細胞中にヌ クレオチドを導入するための他の方法を提示する、多数のテキストが入手できる （例えば、オスベル(Ausubel)等(編)，Current Protocols in Molecular Biolog y,ジョンウイリ＆サンズ，NY（1991）。 ベクター自体は、任意の適当なもの、例えばウイルスベクター(RNA またはDNA )、裸の直鎖または環状DNA(遊離または他の分子に結合したもの)、あるいは該細 胞中に挿入すべき任意の核酸物質およびポリペプチドを含有するビビクルまたは エンベロープ等であり得る。ビヒクルに関連して、脂質ビヒクル、例えばリポソ ームの構築技術は周知である。このようなリポソームは、他の公知の技術を使用 して、例えば該リポソームの外部に抗体または他の特異的結合分子を与えること により、特定の細胞を指示するものであり得る。例えば、A.ハング(Huang)等，J ．Biol．Chem.，1980，255: 8015-8018を参照のこと。 最も有用なベクターは、宿主細胞、即ち形質転換される細胞の特性に応じて、 以下の１種以上を含有する多重エレメントを含む：(1)高いコピー数にまで増幅 するための、SV40の複製源、(2)高レベルでの転写開始のための効果的なプロモ ータエレメント、(3)mRNA開裂およびポリアデニル化配列（およびしばしば介在 配列も）などのmRNAプロセッシングシグナル、(4)「外来」DNA を挿入するため の、多重制限エンドヌクレアーゼサイトを含むポリリンカー、(5)安定にプラス ミドDNA と一体化された、細胞性別で使用できる選別マーカー、および(6)バク テリア細胞内での増殖を可能とする、プラスミド複製調節配列。上記のものに加 えて、同様に多くのベクターが誘導可能な発現系を含み、該発現系は外的刺激に よって調節されている。誘発された転写に必要な幾つかのプロモータ由来の配列 が同定され、かつ発現ベクター中に組み込まれて、誘導性の発現を達成する。幾 つかの有用な誘導性のベクターは、β−インターフェロン、ヒートショック、重 金属イオンおよびステロイド（例えば、グルココルチコイド）による誘導に基づ いている(例えば、カウフマン(Kaufman)，Meth．Enzymol.，1990，185:487-511 を参照のこと）。 好ましい態様において、該ベクターは、また選別可能なマーカーをも含む。発 現後、該翻訳可能なヌクレオチド配列は、次いで当該配列に対する抗体を使用し て精製することができる。選別可能なマーカーの一例は、ネオマイシン耐性であ る。ネオマイシン耐性をコードするプラスミド、例えばphshsneo、phsneoまたは pcopneo は、選択された遺伝子を発現する細胞集団を、選択培地中でのトランス フェクション生成物の育成により確認することができる。 好ましい態様において、該翻訳可能なヌクレオチド配列は、適当な調節可能な 転写プロモータ、翻訳調節配列、および正確な配向での該翻訳可能なヌクレオチ ド配列の挿入を簡略化するためのポリリンカーをもつプラスミドに組み込むこと ができ、かつマウス種由来の細胞等の真核細胞、あるいはE.コリ等の原核細胞内 で、公知の条件下で発現できる。好ましくは、5'調節配列があり、該配列は、上 流側の翻訳可能なDNA 配列の5'末端において機能可能に結合したリボソーム結合 サイトおよび転写を開始するためのプロモータを画成している。形質転換された またはトランスフェクションされた細胞、例えばE.コリ中で、高い遺伝子発現レ ベルを達成するためには、大量のmRNAを発生する強力なプロモータのみならず、 該mRNAが効果的に翻訳されることを保証するための、リボソーム結合サイトをも 必要とする。 例えば、E.コリにおいて、該リボソーム結合サイトは、開始コドン(AUG)と、 該開始コドンから3-11ヌクレオチド上流に位置する3-9 個のヌクレオチドに対応 する長さの配列を含む(シャイン(Shine)等，Nature，1975，254: 34)。シャイン −ダルガルノ(Shine-Dalgarno)(SD)配列と呼ばれる配列：AGGAGGU は、E.コリ 1 6SmRNAの3'末端に対して相補的である。該リボソームのmRNAへの結合および該mR NAの3'末端における配列は、幾つかの因子により影響される可能性があり、該因 子は(1)該SD配列と該16S tRNAの3'末端との間の相補性の程度、および(2)該SD配 列と該AUG との間のスペーシングおよびその間に横たわる可能なDNA 配列を包含 する（例えば、ロバーツ(Roberts)等，PNAS USA，1979a，76: 760; ロバーツ等 ，PNAS USA，1979B，76: 5596;ガレンテ(Guarente)等，Science，1980，209：14 28; およびガレンテ等，Cell，1980，20: 543 を参照のこと）。 このスペーシングが系統的に変更されるプラスミド中での、遺伝子の発現レベ ルを測定することにより、一般的に最適化が達成される。異なるmRNAの比較は、 位置-20 から+13 に統計的に好ましい配列があることを示している(ここで、AUG のＡは位置０である：例えばゴールド(Gold)等，Ann．Rev．Microbiol.，1981， 35: 365 を参照）。また、リーダー配列も、著しく翻訳に影響を与えることが示 されている（ロバーツ等，上記文献(1979a,b)参照）。該リボソームの結合も、 リボソーム結合に影響を与える、AUG 以下のヌクレオチド配列によって影響され る可能性がある（例えば、タニグチ(Taniguchi)等，J．Mol．Biol.，1978，118 ：533 を参照のこと）。 本発明に従って使用できる一つのベクターは、ヒートショックプロモータを含 む。このようなプロモータは当分野において公知である。これについては、例え ばステラー(Stellar)等，EMBO J.，1985，4: 167-171 を参照のこと。このプロ モータを使用した場合、ポリアデニル化サイトをも付加することが好ましい。 本発明において使用することが示唆された一つのベクターは、プラスミドであ り、より好ましくは高−コピー数のプラスミドである。該ベクターが誘発性のプ ロモータ配列を含むことが望ましい。というのは、誘発性プロモータは、このよ うなベクター（これはしばしば天然産でないまたはキメラヌクレオチド配列を担 持するように構築される）が導入された、細胞に対する選別圧を制限する傾向が あるからである。同様に、該ベクターの選択は、該選択された宿主中での発現に 対して最も適しているものであることが好ましい。 その他の適当なベクターは、レトロウイルスベクター、カナリーウイルスベク ター、アデノウイルスおよびアデノウイルス−由来のベクター等を包含する。例 えば、レトロウイルスベクターを使用した遺伝子転移の概説のためには、国際出 願WO 92/07943 およびWO 92/07959 を参照できる。これらの開示を本発明の参考 とする。 本発明のDNA 発現ベクター中のカセットは、翻訳可能なDNA 配列を挿入した場 合に、適当な宿主中で本発明の融合タンパクを発現することのできる、ヌクレオ チド配列を形成する該ベクターの領域である。ヌクレオチドの発現−能力配列は シストロンと呼ばれる。かくして、該カセットは、好ましくは一またはそれ以上 の翻訳可能なDNA 配列に機能可能に結合したDNA 発現調節エレメントを含む。翻 訳可能なDNA 配列が、方向性結合に適したヌクレオチド配列を介して、調節エレ メント間に方向性をもって挿入（方向性をもって結合）された場合に、シストロ ンが形成される。得られた翻訳可能なDNA 配列、即ち挿入された配列は、適当な 読み取り枠中で機能可能に結合されていることが好ましい。 DNA 発現調節配列は、構造遺伝子生成物を発現するための一組のDNA 発現シグ ナルを含み、かつ周知のように、該シストロンに機能可能に結合された、5'およ び3'エレメント両者を含み、かくして該シストロンは構造遺伝子生成物を発現で きる。該5'調節配列は、転写を開始するためのプロモータおよび上流側の翻訳可 能なDNA 配列の該5'末端において機能可能に結合されたリボソーム結合サイトを 規定する。 かくして、本発明のDNA 発現ベクターは、翻訳可能なDNA 配列を、該ベクター のカセット部分にクローニングして、本発明の融合タンパクを発現できるシスト ロンを生成する系を与える。 首尾よく形質転換された細胞、例えば本発明のrDNAまたはcDNA分子を含む細胞 は、周知の方法で同定できる。例えば、本発明のrDNAの導入によって生ずる細胞 は、核酸ハイブリダイゼーション法、例えばサザーン(Southern)，J．Mol．Biol .,1975，98: 503またはベレント((Berent)等，Biotech.，1985，3: 208に記載さ れた方法を利用して、特定のrDNAの存在を検出するためのアッセイにかけること ができる。 組み換え核酸の存在についての直接的アッセイに加えて、首尾よいトランスフ ェクションまたは形質転換は、発現されたタンパクの存在についての、周知の免 疫学的方法によって確認できる。例えば、発現ベクターによって首尾よく形質転 換された細胞は、該発現されたタンパクの機能の存在について免疫学的方法によ り直接アッセイできるタンパクを生成する。首尾よいトランスフェクションまた は形質転換を確認する他の方法は、実施例部分に記載されている。 7．細胞系 本発明の好ましい細胞系は、培地中で連続的に育成でき、かつ該細胞の表面上 に哺乳動物クラスＩMHC 分子を発現することができる。種々の形質転換されたお よび形質転換されていない細胞または細胞系の任意のものが、この目的に適して おり、バクテリア、酵母、昆虫および哺乳類細胞系を包含する（例えば、E.コリ およびS.セレビシアエ(derevisiae)等の種々の細胞系の培養および利用に関する 概要並びに手順についての、“Current Protocols in Molecular Biology”，ジ ョンウイリー＆サンズ，NY(1991)を参照のこと）。 好ましくは、該細胞系は真核細胞系である。より好ましくは、該細胞系は哺乳 類の細胞系である。 好ましい態様において、該細胞系は、哺乳類のクラスＩMHC 遺伝子を発現でき る、形質転換された細胞系であり、より好ましくはヒトクラスＩMHC 遺伝子が、 該細胞系により発現可能である。同様に、該細胞系は哺乳類β２マイクログロブ リンを発現できるものであり、また好ましくは該発現されたβ２マイクログロブ リンはヒトβ２である。本発明の好ましい細胞系は安定なまたは一次的な発現が 可能である。 ベクターは、本発明に従って、細胞系を形質転換／トランスフェクションする のに使用できる。細胞系の形質転換／トランスフェクションにおいて有用な多く のベクターが利用可能であり、これらベクターは上で詳細に議論されている。 一態様において、MHC をコードするcDNAおよびβ２マイクログロブリンをコー ドするものは、機能可能に別々の発現プラスミドに結合され、かつ培養された細 胞中に同時トランスフェクションされる。また、MHC およびβ２マイクログロブ リンをコードする該cDNAを、同一の発現プラスミドに機能可能に結合し、かつ該 同一のプラスミドを介して同時にトランスフェクションすることもできる。もう 一つの変法においては、MHC 、β２マイクログロブリンおよびサイトカイン例え ばIL2 をコードする該cDNAを、発現プラスミドに機能可能に結合し、かつ本発明 の細胞系中に同時トランスフェクションする。 首尾よく形質転換された細胞、即ち本発明による発現可能なヒトヌクレオチド 配列を含む細胞は、公知の技術を利用して同定できる。例えば、本発明のcDNAま たはrDNAの導入により生成する細胞をクローニングして、モノクローナルコロニ ーを製造できる。これらのコロニー由来の細胞を収穫し、溶解し、かつそのDNA 含有率を、例えばサザーン(Southern)，J．Mol．Biol.，1975，98: 503に記載の 方法を使用して、rDNAの存在について検査した。rDNAの存在についての直接的ア ッセイに加えて、該rDNAが目的のキメラポリペプチドの発現を指示できる場合に は、上首尾の形質転換またはトランスフェクションを、周知の免疫学的方法によ って確認することができる。例えば、発現ベクターによって首尾よく形質転換さ れた細胞は、適当な抗体を使用して容易に測定できる、特定の抗原特性を表示す るタンパクを生成する可能性がある。更に、上首尾の形質転換／トランスフェク ションは、上記のようなマーカー配列、例えばネオマイシン耐性をもつ追加のベ クターを使用して、確認できる。 MHC 分子の発現用の培養物を調製するために、該培養物をまず、例えばCuSO4 誘導によって、所定時間刺激する必要がある。適当な誘導期間の後、例えば約12 〜48時間後に、所定の濃度（例えば、約100 μg/ml）でペプチドを添加できる。 ペプチドは上記のようにして調製できる。更なるインキュベーション時間、例え ば適当な温度にて約12時間のインキュベーション時間後、該培養物は、CD8 細胞 の活性化のために使用できる。この追加のインキュベーション時間は短縮するか あるいはこれを是認できるが、我々の観測によれば、該培養物は、静止期または 先駆体CTL(CD8)細胞の添加前に、一定時間インキュベートした場合には、温度衝 撃に対して著しく安定になる傾向をもつ。 形質転換した宿主細胞の培養において有用な栄養培地は、当分野でにおいて周 知であり、また多くの販売元から得ることができる。該宿主細胞が哺乳類の細胞 である態様において、「血清を含まない」培地を使用することが好ましい。 8．診断法および診断装置 一態様において、本発明は、特定のタンパクおよびポリペプチドまたはそのポ リペプチド部分に対する、自己抗体を包含する抗体の検出法をを意図する。ここ に記載するアッセイは、またかかるタンパクおよびポリペプチドの同族体または 類似体である分子をも検出するのに使用できる。 本発明によるアッセイは、例えば適当な抗原および抗体を適宜選択することに より、腫瘍細胞または組織に関連する抗体に対して特異的なアッセイとすること ができる。例えば、本発明のアッセイシステムはp53 タンパク、ポリペプチドま たはその部分に対する抗体を検出するのに使用できる。また、本発明のアッセイ は、Her-2/Neu タンパク、ポリペプチド、またはその部分に対する抗体の検出に おいて有用であり得る。典型的には、該アッセイ法は、生体サンプル、例えば体 液サンプル（例えば血液）中に存在する抗体の検出を含む。 本発明では、抗原、例えばタンパクおよびポリペプチドを検出するためのアッ セイをも意図する。例えば、本発明は腫瘍または他の悪性細胞および組織に関連 するタンパクまたはポリペプチドを同定するための方法を開示する。 該方法の一例においては、ターゲット種に対する試薬分子の相対的結合アフィ ニティーは、フローマイクロフルオロメトリー(FMF)法を利用して、本明細書に 記載のように有利に測定される。かくして、ターゲット抗原、例えばp53-由来の またはHer-2/Neu-由来のペプチドを発現する細胞は、該蛍光−標識抗体の細胞表 面抗原に対する結合による、該細胞に関連した蛍光強度が、所定の域値を越えた 場合には常に表示される。該標識抗体は、典型的にはフルオレセインイソチオシ アネート複合体(FITC)であるが、他の周知の蛍光標識も使用できる。 本発明のもう一つの局面は、p53 またはHer-2/Neu 抗原に対する免疫応答を誘 発する方法を提供し、該方法は適当な細胞毒性Ｔリンパ細胞と、免疫応答誘発に 有効な量の、上に列挙されたCTL エピトープ群からなる群から選ばれるペプチド を含む分子とを接触させる工程を含む。本発明の分子および該分子が含有するポ リペプチドに関連して上記した種々の例全てが、免疫応答を誘起するこの方法に おいて使用できる。 該CTL エピトープ−含有分子（これは、例えば該CTL エピトープ単独または放 射性標識CTL エピトープあるいは上記のような幾つかの他のCTL エピトープ類似 体であり得る）と、CTL との接触はインビトロまたはインビボで起こり得る。従 って、このような接触を行った後（該接触後には、該CTL は接触状態に置かれた 該抗原に関して刺激される）、該CTL は、以下において更に論じるように、治療 の目的で、その起源である宿主に戻すことができる（例えば、治療を必要とする 患者）。 勿論、診断の目的は、該接触させた細胞を宿主に戻されるか否かを確認するこ とである。この目的は、該宿主のCTL が、（設計はどうあれ）該テストしたエピ トープと結合できるかどうかに答えることであり、またそうであった場合これに より刺激されるか否かに答えることである。事実、本発明は哺乳類のリンパ細胞 集団中で、腫瘍抗原のＴ細胞エピトープに応答する細胞毒性Ｔ細胞を検出するた めの種々のアッセイ法にも関わり、該応答は古典的なリガンド−レセプタ結合現 象の結果であると理解される。本発明は、更にリガンド−レセプタ相互作用の分 野において周知の方法を使用して、このような結合の強度を測定するアッセイを も意図する。 かくして、本発明の一局面は、哺乳動物のリンパ細胞中の、腫瘍−関連抗原、 例えばp53 またはHer-2/Neu の特定のＴ細胞エピトープに応答する細胞毒性Ｔ細 胞を検出する方法をも目的とする。本明細書において「診断法１」と呼ぶこの方 法は、(a)ターゲット細胞と、上に列挙されたエピトープの群から選択されるペ プチド少なくとも１種を含む分子とを接触させ、ここで該ターゲット細胞は、該 細胞毒性Ｔ細胞についてテストすべきリンパ細胞と同一のHLA クラスのものであ る、(b)該細胞毒性Ｔ細胞についてテストすべきリンパ細胞と、上に列挙された エピトープの同一の群から選択されるペプチド少なくとも１種を含む分子、また はこれと実質的に相同性の分子とを、該腫瘍−特異的CTL を再刺激するのに十分 な条件下で接触させて、適当なターゲット細胞に応答させ、(c)該テストしたリ ンパ細胞が該ターゲット細胞に対して細胞毒性作用を及ぼし、結果として腫瘍− 関連タンパク(例えば、p53 またはHer-2/Neu)のT-細胞エピトープを認識するCTL の存在を示すか否かを決定する工程を含む。 もう一つの好ましい態様は、（哺乳動物のリンパ細胞中の）腫瘍−関連抗原、 例えばp53 またはHer-2/Neu の特定のT-細胞エピトープと結合できるレセプタを もつCTL を検出する方法を提供する。この第二の態様（本明細書において「診断 法２」と呼ぶ）は、(a)該CTL についてテストすべき該リンパ細胞と、適当な標 識および上記と同一の群のエピトープから選択される少なくとも１種のペプチド を含有する分子またはその実質的に相同性の分子とを、腫瘍−特異的CTL を再刺 激するのに十分な適当な時間、温度、湿度、塩、栄養分およびpH条件下で接触さ せて、適当なターゲット細胞に対して応答させ、(b)このような接触させた細胞 を収穫し、かつ標識分子を含まない培地で、全ての未結合標識分子を除去するの に十分に洗浄し、および(c)適当な測定手段を使用して、該結合した標識分子を 測定する諸工程を含む。該工程(b)は、また未標識分子を含むまたは含まない低 張液を使用して、あるいは当分野で公知の他の手段を使用して、該細胞を溶解し て、未結合標識分子を含まない膜画分を調製することにより達成できる。 この方法で使用する適当な標識は、放射性同位元素標識分子を含み、ここで該 分子の構成非放射性元素は、放射性元素、例えば3H、14C または35S 等により置 換されており、あるいは該分子がベンゼンリングまたは他の適当な基を含む場合 には、125Iをこれに固定することができる。他の適当な標識は蛍光性の基、例え ばフルオレセインイソチオシアネートまたはローダミンイソチオシアネートを含 み、当分野で周知の方法を使用して、適当なアミノ酸側鎖に共有結合的に付着あ るいは基質をある色から他の色に転化できる、アルカリホスファターゼ等の酵素 を共有結合的に付着し得る。適当な測定手段は、シンチレーションγ線またはガ イガーカウンター等並びに分光光度計、あるいは結合リガンド、即ちペプチドの 幾つかの濃度を示す刊行された標準に対する、反応色の眼球比較のためのカラー チャートを包含する。 患者から細胞を入手し、これらを培養し、かつ所定の細胞集団の細胞毒性の存 在および／またはその程度を決定するのに使用する特定の方法は、当分野におい て周知である。また、上記の診断手順における宿主リンパ細胞の接触を、インビ ボまたはインビトロ何れでも実施することを意図する。該接触をインビボで実施 する場合、「診断法１」を採用した場合には、次に工程(a)および(c)をインビト ロで実施することが好ましい。ここで「診断法２」とした方法を選んだ場合、工 程(b)および(c)もインビトロで実施する。従って、本発明は、他のヒトCTL を検 出するための公知の方法（例えば、クレリシ(Clerici)等，J．Immunol.，1991， 146-2214-2219を参照のこと）を適当に適合させることにより、例えばp53 由来 のペプチドに対する抗体等の腫瘍−特異的抗原に対する抗体を産生することが分 かっているあるいはその疑いがある患者の血液または他の組織中のヒトCTL の検 出法を与える。更に、本発明は、本発明のペプチドに特異的なレセプタを有する 細胞の検出法を提供する。 本発明のアッセイは、また哺乳動物の免疫系がp53 、Her-2/Neu または他の腫 瘍関連抗原の上記エピトープによって誘発されるか否かを決定し、結果としてか かる応答の出現およびその大きさが、腫瘍または他の悪性疾患の発症（即ち、診 断の目的で）あるいは該悪性疾患または腫瘍の病原作用の重度（即ち、予後指示 薬として）と相関をもつか否かを決定するのに有用である。従って、本発明のペ プチドは、特定の個体の、本発明のペプチド（またはその誘導体）を使用する治 療養生に対する感受性を決定するのに使用でき、またかくして既存の治療プロト コールを改善し、もしくは罹患した個体についての予後を決定する上で役立つ可 能性がある。更に、現時点で開示されたペプチドは、特定の治療プロトコールの 有効性を追跡するのに利用できる。 インビトロ手順として上に記載された、本発明の分子（その種々の形状の何れ か）とCTL との接触を、インビボでも実施することが好ましく、即ちマウス種、 ヒトおよび他の哺乳動物種を包含する哺乳動物中で、以下の実施例において更に 説明されるように実施することができる。これまでに記載されてきた形態の一つ での、該CTL エピトープは、腫瘍または他の悪性疾患に罹った個体に、有利に導 入できる。 本発明の抗原タンパクまたはポリペプチドを検出する方法は、本明細書に記載 するように、該タンパクまたはポリペプチドと、抗−ポリペプチド抗体分子との 間の免疫反応生成物の形成を含む。検出すべき該抗原は血管流動サンプルまたは 身体組織サンプル中に存在する可能性がある。該免疫反応生成物は、当業者には 周知の方法により検出される。多数の臨床的診断化学手順が検出可能な免疫錯体 を形成するのに利用できる。 また、本明細書に記載した腫瘍−関連レセプタまたはポリペプチドに対するタ ンパクまたはポリペプチドリガンド（非−抗体組成物）が、ここに記載するアッ セイ法で利用できる。即ち、例示的なアッセイ法をここに記載するが、本発明は これらによって制限されない。 有用な一方法は、身体サンプル、好ましくは分析すべき細胞および／または流 体を含有するヒトドナーまたは患者から採取したものと、Her-2/Neu またはp53 タンパクまたはポリペプチドと免疫反応できる、ここに記載する抗体組成物の一 種と混合する工程を含む。該細胞サンプルは、該混合工程に先立って洗浄しても よい。かくして形成される該免疫反応混合物を、適当なアッセイ条件下、例えば 生物学的アッセイ条件下に、任意の細胞が該抗原を発現するのに十分な時間また は任意の可溶性抗原が該抗体組成物中の抗体と免疫反応して、抗体−レセプタ免 疫錯体を形成するのに十分な時間維持する。次いで、該免疫反応生成物（免疫錯 体）を、該混合物中に存在する任意の未反応抗体から分離する。生成された該免 疫反応生成物の存在および必要ならばその量を、次に決定する。形成される異性 物の量は、該細胞により発現されたレセプタの量または発現された可溶性抗原の 量と関連付けることができる。 生成した免疫反応生成物の存在または量の測定は、該生成物を同定するために 選択された方法に依存する。例えば、標識された抗体を使用して、本発明のタン パクまたはポリペプチド（例えば、p53-由来のポリペプチド）との標識された免 疫錯体を形成することができる。該標識された免疫錯体は、以下において論ずる ように、各標識、例えば蛍光標識、放射性標識、ビオチン標識等を検出するのに 適した方法によって定量化できる。また、未標識の抗体を使用して、未標識の免 疫錯体を生成し、引き続き該未標識の免疫錯体と、未標識の抗体を識別する標識 抗体と免疫反応させることにより、検出することができる。結果として、この免 疫錯体は標識され、かつ上記のように検出できる。 このアッセイで使用する生物学的条件は、該抗体および本発明のタンパクまた はポリペプチド分子の生物学的活性を維持するような条件である。これらの条件 は、約４〜約45℃の範囲の温度、好ましくは約37℃の温度、約５〜約９の範囲の pH、好ましくは約７、蒸留水のイオン強度乃至１モル塩化ナトリウムのイオン強 度の範囲内のイオン強度、好ましくはほぼ生理塩水のイオン強度である。このよ うな条件を最適化する方法は当分野で周知である。 好ましい態様において、分析すべき身体サンプルは、ドナーまたは患者から取 り出し、アリコートに分割する。少なくとも１つのアリコートを、本発明の抗体 組成物を使用して、抗原発現の決定のために使用する。必要ならば、第二アリコ ートを、コントロール抗体の該サンプルとの反応性を測定するのに使用すること ができる。該分析は同時に実施できるが、通常は周期的に実施する。 本発明のもう一つの局面においては、これらアッセイで得られたデータを、有 形の媒体を介して記憶し、例えばコンピュータ記憶またはハードコピー形式で記 憶される。これらのデータは、市販品として入手できる標準的なアナログ／ディ ジタル(A/D)機器により自動的に入力および記憶できる。また、これらのデータ は、必要に応じてデータの相関性を最もよく表示するために、呼出し、記録また はディスプレイすることができる。従って、本発明の方法と共に使用するのに適 した装置およびソフトウエアも、本発明の範囲内に含まれる。 本発明の抗体組成物および方法は、同定可能なタンパクまたはポリペプチドの 発現が疾患状態と相関をもつ、種々の型の腫瘍または癌（例えば、小細胞肺癌） および他の疾患に罹患している疑いのあるまたはその恐れがある個体中の腫瘍細 胞または悪性疾患細胞の存在を診断する方法を提供する。従って、治療に対する 患者の応答を追跡する方法も本発明に関わり、該方法において、該疾患に対する マーカーが検出可能であり、および／またはこれが検出される。この方法は、腫 瘍関連マーカーの発現につきアッセイすべき細胞を含有する身体サンプルと、本 発明の抗体組成物とを、上記のアッセイ法に従って混合する工程を含む。この混 合物を、所定の反応条件下で、免疫反応生成物を形成するのに十分な時間維持す る。形成された該免疫反応生成物の量は、初期の疾患状態と相関性をもつ。これ らの工程を、治療養生中の後の期間において繰り返し、結果として該患者の治療 に対する応答性を決定する。ここで、該疾患関連タンパクまたはポリペプチドを 発現する細胞数の減少は該疾患状態の改善を示す。 上記アッセイを実施するための診断装置も、本発明の範囲内にある。本発明の 診断装置は、キット形状にあることが好ましく、かつ少なくとも１回のアッセイ に対して十分な量で、別々に包装された試薬の形で、本発明の抗体分子（または そのフラグメント）を含有する組成物を含む。該抗体分子を標識することが可能 であり、また標識用試薬を別途包装し、該キット内に含めることも可能である。 ここで、該標識は、免疫反応生成物が存在するか否かを指示することができる。 該包装した試薬の使用における指針を与える印刷された指示を、種々の態様で含 むこともできる。用語「指示」または「使用上の指示」とは、典型的には該試薬 の濃度または少なくとも１つのアッセイ法パラメータ、例えば試薬および混合す べきサンプルの相対的量、試薬／サンプル混合物の維持時間、温度、緩衝条件等 を記載する、実質的な表現を含む。 一態様において、診断装置は、腫瘍関連タンパクおよび／またはポリペプチド の存在、該タンパク／ポリペプチドが細胞表面で発現されるか否かをアッセイす るのに使用することを意図している。 キットの１例は、包装体（パッケージ）として与えられ、本発明の新規な試薬 用の容器を含む。一例においては、かかる試薬は、細胞サンプル中で細胞上の腫 瘍関連分子と免疫反応することのできる、抗体結合サイト−含有分子を含む。用 語「抗体結合サイト」とは、抗原と特異的に結合（免疫反応）する、重および軽 鎖、可変および超可変領域からなる抗体分子の該構造部分を意味する。典型的に は、キットは、標識抗体プローブをも含み、該プローブは、例えば抗体とその同 族レセプタ、タンパクまたはポリペプチドが免疫反応した場合に形成される免疫 錯体と免疫反応する。 もう一つの変法においては、本発明のキットは、リガンド分子と免疫反応でき る、抗体結合サイト−含有分子を含む容器を含有する包装体（パッケージ）とし て与えられる。ここで、該リガンド分子は該テストサンプル中の細胞物質と結合 していても、これらを含まなくともよい。典型的には、該キットは、また標識抗 体プローブをも含み、該プローブは該抗体結合サイト−含有分子と該リガンド分 子との免疫錯体と免疫反応する。 該標識は一般的に入手できる任意のものであり得、例えばフルオレセイン、フ ィコエリトリン、ローダミン、125I等を包含するが、これらに制限されない。他 の標識の例は111In 、99Tc、67Gaおよび132I並びに非放射性標識、例えばビオチ ンおよび酵素−結合抗体を包含する。抗体分子に結合またはこれに組み込むこと のできる任意の標識または指示手段は、本発明の抗体またはモノクローナル組成 物の一部を構成する。意図された標識は、また別々に使用でき、またこれらの原 子または分子は単独でまたは付随的な試薬との組み合わせとして使用することも 可能である。このような性質の多くの有用な標識が、臨床診断化学において公知 である。 標識の、ポリペプチドおよびタンパクへの結合も、周知である。例えば、ハイ ブリドーマにより生産された抗体分子は、培養培地中に成分として与えられる、 放射性同位元素−含有アミノ酸の、代謝を通しての取り込みにより標識すること も可能である。これについては、例えばガルフル(Galfre)等，Meth．Enzymol.， 1981，73: 3-46を参照できる。特に、活性化された官能基を通しての、タンパク の結合またはカップリング技術が応用できる。例えば、オーラメアス(Aurameas) 等，Scand．J．Immunol.，1978，8,追補7: 7-23;ロッドウエル(Rodwell)等，Bio tech.，1984，3: 889-894; および米国特許第4,493,795 号（後者を本発明の参 考文献とする）を参照のこと。 この診断装置は、また特異的結合試薬を含むこともできる。ここで、「特異的 結合試薬」とは、本発明の試薬種と選択的に結合できる化学種であるが、それ自 体は本発明の抗体分子ではない。特異的結合試薬の例は、該抗体が上記免疫錯体 の一部として存在する場合に、本発明の抗体分子と反応する、抗体分子、補体タ ンパクまたはそのフラグメント、タンパクＡ等である。好ましい態様において、 該特異的結合試薬は標識される。しかしながら、該診断系が標識されていない特 異的結合試薬を含有する場合には、該試薬は、典型的には増幅手段または試薬と して使用される。これらの態様において、標識された特異的結合試薬は、該増幅 試薬が本発明の試薬の一つを含む錯体と結合している場合には、該増幅試薬を特 異的に結合することができる。 例えば、本発明の診断キットを、ELISA フォーマットで使用して、身体サンプ ルまたは体液サンプル、例えば血清、血漿または尿、もしくは細胞の洗浄剤によ る溶解物、例えば10mMCHAPS 溶解物中の、腫瘍関連タンパクまたはポリペプチド の存在またはその量を検出することができる。“ELISA”は酵素結合イムノソル ベントアッセイを意味し、そこでは固相に結合した抗体または抗原および酵素− 抗原または酵素−抗体複合体を使用して、サンプル中に存在する抗体または抗原 を検出しかつその量を定量する。ELISA 技術に関する説明は、1982年にCA州ロス アルトスのランゲメディカルパブリケーションズ(Lange Medical Publications) により出版された、D.P.サイツ(Sites)著，“Basic and Clinical Immunology” ,第４編、第22章、および米国特許第3,654,090 号、同第3,850,752 号および同 第4,016,043 号に見られる。これらを本発明の参考文献とする。 好ましい態様において、該抗体または抗原試薬成分を、固体マトリックスに付 着させて、本発明の診断装置における別途の包装体としての固体担体を形成する ことができる。この試薬は、典型的には水性媒体からの吸着により、該固体マト リックスに付着される。但し、当業者に周知の他の付着法、例えば特異的結合法 を利用することも可能である。例えば、本発明の抗−腫瘍関連ポリペプチド抗体 を表面に付着させ、このような分子を発現または表示する、腫瘍−関連分子また は細胞を含有する溶液のアッセイに使用することができる。また、腫瘍関連タン パク、その同族体、腫瘍関連タンパクまたはその同族体のポリペプチドフラグメ ント、これらの何れかを発現する細胞の完全または部分的溶解物を該表面に付着 させて、該付着された種と免疫反応する抗体組成物につき、溶液をスクリーニン グするのに使用できる。 この点に関連して、有用な固体マトリックス材料は、ファルマーシアファイン ケミカルズ(Pharmacia Fine Chemicals; NJ,ピスカタウエイ)から商標セファデ ックス(SEPHADEX)の下で入手できる誘導体化した架橋デキストラン、誘導体およ び／または架橋型のアガロース、径約１μ〜約５mmのポリスチレンビーズ（IL州 ノースシカゴのアボットラボラトリーズ(Abbott Laboratories)社から入手でき る）、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド、ニトロセルロ ース−またはナイロンベースウエブ、例えばシート、ストリップまたはパドル、 チューブ、プレート、マイクロタイタープレートのウエル、例えばポリスチレン またはポリ塩化ビニル等から作成したもの等を包含する。 ここに記載する任意の診断装置の、該試薬種、標識された特異的結合試薬また は増幅剤は、溶液、液体分散体または実質的に乾燥された粉末、例えば凍結乾燥 された形状で与えることができる。指定された手段が酵素である場合、該酵素の 基質は該キットまたは装置の別個のパッケージとして与えることができる。通常 該試薬は、不活性雰囲気下で包装される。固体担体、例えば前に記載されたマイ クロタイタープレートおよび１以上のバッファーも、この診断アッセイ装置にお ける別途包装されるエレメントとして含めることができる。 この診断装置は、通常公知のパッケージ中に収容されている。このようなパッ ケージはガラスまたはプラスチック（例えばポリエチレン、ポリプロピレンおよ びポリカーボネート）ビン、バイアル、プラスチックおよびプラスチック−箔積 層エンベロープ等を包含する。 ここに記載する態様の種々の組み合わせは、本発明の範囲内に含まれるものと 理解すべきである。本発明の他の特徴並びに利点は、上記記載、以下の実施例に 関する記載および添付請求の範囲から明らかとなろう。 実施例 以下の実施例は、本発明を例示するものであり、本発明を制限するものではな い。 実施例１：p53- 特異的ペプチドを発現するターゲット細胞のCTL-媒介溶解 A．HLA-A2.1/Kb −制限p53 特異的細胞毒性Ｔリンパ細胞(CTL)の調製 p53 ペプチドに特異的な細胞毒性Tリンパ細胞(CTL)は、HLA-A2.1分子により結 合し得るp53 由来のペプチドを設計しかつ合成し、HLA-A2.1/Kb（A2.1/Kb）トラ ンスジェニックマウスを、インビボにて該p53 ペプチドで免疫付与し、該免疫付 与したトランスジェニックマウス由来の、p53 ペプチド−特異的CTL 細胞系を発 生させることにより調製した。これら手順の詳細は以下に概説する。 1．p53 ペプチドの調製 a. ペプチドデザイン 長さにおいて８〜11個のアミノ酸残基を含むペプチドは、該HLA 分子のペプチ ド結合溝内に収容できる。該結合ペプチドの長さは該ペプチドのアミノおよびカ ルボキシ末端と、該ペプチド結合溝の端部との相互作用によって制限される（マ ッデン(Madden)等，Nature，1991，353: 321-325)。MHC I-結合ペプチドのアミ ノ酸残基配列分析は、規定されたアミノ酸残基部分におけるアミノ酸残基の保存 性を明らかにした（フォーク(Falk)等，Nature，1991，351: 290-296）。これら のアミノ酸残基は、該MHC Ｉペプチド結合溝におけるポケットと相互作用するも のと考えられている(マッデン(Madden)等，Nature，1991，351: 321-325; フレ モント(Fremont)等，Science，1992，257: 919-927)。 該p53 由来のペプチドは、ヒトp53 遺伝子の天然の配列に基づくものである。 該ペプチドは、これが誘導されたアミノ酸残基位置に従って命名され、例えばp5 3.25-35 は、ヒトp53 遺伝子配列の位置25〜35からのアミノ酸残基を表す（ハイ ンズ(Hinds)等，Cell Growth Diff.，1990，1:571）。p53 由来のペプチドp53.2 5-35 およびp53.65-73 は、ホービアーズ(Houbiars)等，Eur．J．Immunol.,1993 ，23: 2072-2077 に記載されている。ペプチドp53.264-272 およびp53.149-157 は、以下に説明するようにして設計した。 該p53.264-272 およびp53.149-157 ペプチドは、８-11アミノ酸A2-制限ペプチ ドモチーフを基にするものであった(フォーク(Falk)等，Nature，1991，351：29 0; ハント(Hunt)等，Science，1992，255:1261)。このペプチドのモチーフは、 該第二のアミノ酸残基位置においてロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリ ン、アラニンまたはスレオニンを指定し、また該カルボキシ末端アミノ酸残基位 置においてバリン、ロイシン、イソロイシン、アラニン、メチオニンまたはスレ オニンを指定する。これらの第二およびカルボキシ末端アミノ酸残基位置は、ア ンカー残基として機能し、結果として該ペプチドは該ペプチド結合溝と相互作用 する。ヒトp53 の天然産のアミノ酸残基配列を、A2−制限ペプチドモチーフに対 応するアミノ酸残基の配列サブセットについて検査した。ここに記載するP53 由 来のペプチドは、このモチーフに対応するペプチドの全てを表す訳ではなく、寧 ろ例示であると考えるべきである。従って、本発明は、ここに記載されるペプチ ドにより制限されるものと考えるべきではない。 このモチーフに従って、免疫原として使用されるp53 特異的ペプチドのアミノ 酸残基配列を、以下の第１表にその各SEQ ID NOSと共に示す。同様に、A2に結合 するための、コントロールペプチドとして使用する、付随的なペプチドのアミノ 酸残基配列をも与える。例えば、HIV pol501-518ペプチドは、ヒト免疫不全症ウ イルス(HIV)のポリメラーゼ遺伝子から誘導された、アミノ酸残基510 から518 までのものである。これが高い効率でA2に結合することが報告されているので選 択した。インフルエンザＡマトリックスペプチドから誘導された、アミノ酸残基 365 から373 までのものであるFLU NP 365-373ペプチドは、前にH-2Dbに結合す ることが示されたものである。VSV N52-59ペプチドは、水疱性口内炎ウイルス (VSV)由来の核タンパクから誘導されたものであり、アミノ酸残基52から59まで を含み、このペプチドはKbに結合することが報告されている。 b. ペプチド合成および分析 第１表に記載のペプチドを、以前に記載された(セット(Sette)等，J．Immumol .，1989，142:35)ように、ペプチド合成装置（430A; アプライドバイオシステム ズ(Applied Biosystems)、フォスター，CA）上で合成した。これらペプチドはル ーチンワークにより測定して、純度70-95%であることを確認した。 2．p53 特異的ペプチドのA2.1/Kbに対するインビトロ結合 p53 特異的ペプチドおよびコントロールペプチド（テストペプチド）各々が、 A2.1/Kbにより結合した効率を、競合結合アッセイで測定した。このアッセイに おいて、各テストペプチドは、インフルエンザＡウイルスマトリックスタンパク 由来のペプチド（インフルエンザA-特異的ペプチド）の存在下で、該細胞表面上 でA2.1/Kbを発現するターゲット細胞と共にインキュベートした。ここで、イン フルエンザA-特異的ペプチドはA2.1/Kbに高効率で結合するものと考えられてい る（ビチエロ(Vitiello)等，J．Exp．Med.，1991，173: 1007-1015）。このイン キュベート中、該テストペプチドおよびインフルエンザA-特異的ペプチドは、A2 .1/Kbに対する結合につき競合する。次いで、該A2.１/KbがインフルエンザA- 特異的ペプチドと結合する効率を、該ターゲット細胞とインフルエンザA-特異的 CTL(エフェクタ細胞)とインキュベートし、かつ該ターゲット細胞の溶解につき アッセイすることにより測定した。該A2.1/Kbが該テストペプチドと、インフル エンザA-特異的ペプチドよりも高度に結合する場合には、該ターゲット細胞の低 効率のインフルエンザA-特異的CTL-媒介溶解をもたらすであろう。該A2.1/Kbが 、該テストペプチドに対するよりも、高度にインフルエンザA-特異的ペプチドと 結合する場合には、効果的な該ターゲット細胞の溶解が生ずるはずである。該タ ーゲット細胞が該テストペプチドと結合する効率は、かくして該ターゲット細胞 のインフルエンザA-媒介溶解の％阻害率として表すことができる。エフェクタ対 ターゲット細胞の比は各実験において変動し、このことは、エフェクタとターゲ ット細胞との間の投与量−依存性関係の存在を立証している。 付随的なペプチドをもアッセイして、該ペプチドが該A2分子に特異的に結合し ていることの更なる証拠を得た。例えば、該ペプチドHIV pol510-518は、以前に A2と効果的に結合することが示されている。従って、このペプチドのA2との結合 は、インフルエンザA-特異的ペプチドのA2との結合を効果的に阻害し、またイン フルエンザA-特異的CTL の、該ターゲット細胞を溶解する能力を減ずるであろう ことを予測した。該ペプチドVSV N52-59およびFLU NP365-373 は、それぞれKbお よびH-2Dbと結合するが、A2とは結合しないことが示された。従って、これら後 者の２つのペプチドは、A2とは効果的に結合せず、従ってインフルエンザA-特異 的ペプチドのA2との結合を可能とするであろうことを予測していた。該インフル エンザA-特異的ペプチドとA2との結合は、インフルエンザA-特異的CTL による該 ターゲット細胞の効果的な溶解をもたらすであろう。該コントロールペプチドの アミノ酸残基配列およびその各々のSEQ ID NOSを第１表に与える。 a. A2.1/Kb トランスジェニックマウスの調製 これら実験で使用した該A2.1/Kbトランスジェニックマウスは、以前に生産さ れており、ビチエロ等の上記文献に記載されている。簡単にいえば、A2.1/Kbト ランスジェニックマウスは標準的なプロトコールを使用して製造した（ホーガン (Hogan)等，“Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual”，コー ル ドスプリングハーバーラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory),コールド スプリングハーバ-NY(1986))。該A2.1/Kbキメラ遺伝子（イルビン(Irwin)等，J ．Exp．Med.，1989，170: 1091)を、(C57BL/6xDBA/2)F1マウスの交雑により得た 受精卵に注入した。トランスジェニックマウス系を、テールDNA ドットブロット 分析により検出されるような、導入遺伝子を組み込んだマウスを同定することに より樹立した（サンブロック(Sambrook)等編，Molecular Cloning: A Laborator y Manual，コールドスプリングハーバ-NY(1989))。“66”および“372”として 同定した、２種のトランスジェニック系の選別は、該A2.1/Kb遺伝子の細胞表面 発現に基づいて実施した。該発現は以下に記載するような、FACS分析により決定 した。系66は同系接合され、再度系“6”と命名された。系６からのトランスジ ェニックマウスを本明細書に記載する実施例において使用した。 b. A2 の細胞表面発現の検出 A2.1/Kbの細胞表面発現は、イルビン等の上記文献に記載のように測定した。 脾細胞（約106細胞）または約0.5 mlの末梢血を、トランスジェニックマウスの 尾の静脈から集め、５mlのトリス−緩衝塩化アンモニウムで処理して赤血球を溶 解した。残りの細胞を洗浄し、2.5 μg/mlのCon A 、250 ng/ml のイオノマイシ ン、3ng/mlのPMA(ホルボールミリステートアセテート；シグマ社(Sigma),セント ルイス，MO)および5%(v/v)のCon A-活性化ラット脾細胞の培養上澄を補充したRP MI 10%中に再懸濁した。サンプルを細胞密度3x106細胞／ウエルにて、2ml の体 積にて、３日間、37℃にて、湿潤した5%CO2雰囲気下で培養した。 トランスジェニックマウスの該脾細胞または末梢血細胞上で、あるいは上記の Con A-刺激細胞上での、A2.1/Kbの細胞表面発現を、フローサイトメトリー(FACS IV;ベクトンディッキンソン＆コ(Becton Dickinson & Co.)，マウンテンビュー ，CA）により、該製造業者等の指示に従って立証した。該ビオチン処理したHLA- A2.1- 特異的モノクローナル抗体MA2.1（McMichael），Hum．Immunol.，1980，1 : 121)およびフィコエリトリン−複合化ストレプタビジン（バイオメダ(Biomeda ),フォスターシティー，CA）を該FACS分析と組み合わせて使用した。 c. A2.1/Kb 関連インフルエンザＡペプチド−特異的CTL の調製 表面上でA2.1/Kbに結合したインフルエンザA-特異的ペプチドを表示するター ゲット細胞を効果的に溶解できる、インフルエンザＡウイルスペプチド−特異的 CTL(エフェクタ細胞)は、ビチエロ等の上記文献において、他のp53 由来のペプ チドについて前に記載されたように発生させた。これら研究において使用する該 インフルエンザA-特異的ペプチドは、該インフルエンザＡウイルスマトリックス タンパクのアミノ酸残基58〜66から誘導され、かくしてここではM1(58-66)(イン フルエンザA-特異的ペプチド: GILGFVFTL; SEQ ID NO ８)と同定する。このM1(5 8-66)ペプチドは、また以下の実施例で述べるように、「G-マトリックスペプチ ド」とも呼ばれる。というのは、M1(58-66)およびG-マトリックスペプチドが同 一のアミノ酸配列をもち、従ってこれらには、同一のSEQ ID NO が与えられてい る。同定された該インフルエンザA-特異的CTL は「クローン12」および「Ａクロ ーン12」と命名される。クローン12(Aクローン12)は、細胞表面上でA2に結合し たM1(58-66)を有するターゲット細胞を特異的に溶解することができる。クロー ン12はここに記載する結合阻害アッセイで使用して、特定のペプチドが細胞表面 上でA2と結合しているか否かを決定する。 d. ターゲットおよび刺激体細胞の調製 該ペプチド結合阻害アッセイで使用する該ターゲット細胞は、その細胞表面上 でA2.1/Kbを発現する。該ターゲット細胞は選択されたペプチドおよびインフル エンザA-特異的ペプチドと共にインキュベートして、A2.1/Kbとの結合について 該ペプチドを競合させる。該ペプチドのA2.1/Kbへの結合は、インフルエンザA- 特異的CTL の、該ターゲット細胞を溶解する能力につき、後にアッセイすること により立証される。 刺激細胞を、実施例1A2dに記載するように、ペプチド−特異的CTL 集団の維持 において使用した。これら細胞の調製を以下に記載する。 1) EA2 細胞 結合阻害アッセイで使用する、EA2 ターゲット細胞は、ペプチド−特異的CTL 集団の維持においても使用した。ここに記載するEA2 細胞は、元々C57BL/6 マウ スから誘導したEL-4マウス胸腺腫細胞から製造する。 該EL-4細胞は、以前に記載されたように(イルビン(Irwin)等，J．Exp．Med.， 1989，170: 1091)、A2.1/Kbキメラ遺伝子により安定にトランスフェクションさ れる。簡単に言えば、キメラ構築物A2.1/Kbを含有するpSV2プラスミドを、ネオ マイシン耐性遺伝子（クロンテック(Clontech)，パロアルト，CA州）を含有する 該pSV2neo プラスミドにより、該EL-4細胞系に同時にトランスフェクションした 。１mlの燐酸緩衝塩水(PBS)中の約107EL-4細胞を、該キメラA2.1/Kb遺伝子を含 有する10μｇのpSV2プラスミドおよび２μｇのpSV2neo プラスミドと１mlキュベ ット中で混合した。細胞を、X-細胞(X-Cell)450 トランスフェクション装置(プ ロメガバイオテック(Promega Biotec)，マジソン，WI)を使用してエレクトロポ レーションにより、50-msec の放電、一定電圧(400 mV)および800mfdに充電した キャパシタを用いて、トランスフェクションした。 トランスフェクションしたEL-4細胞を、10%の子牛血清(FCS)、2 mMのL-グルタ ミン、50μg/mlのゲンタマイシンおよび5x10-5M のβ−メルカプトエタノールを 補充したRPMI1640(RPMI 10%)中で育成した。24時間のインキュベーションの後に 、トランスフェクションしたEL-4細胞を、400 μg/mlのG418（ギブコラボラトリ ーズ(Gibco Laboratories)，グランドアイランド，NY）の添加により、ネオマイ シン耐性につき選別した。ネオマイシン耐性細胞をサブクローニングし、実施例 1A2bに記載したように、FACS分析により、A2.1/Kbの表面発現につきテストした 。 ネオマイシン耐性細胞の発現を、A2.1特異的モノクローナル抗体およびFcフラ グメント特異的F(ab')2FITC-複合山羊抗−マウスIgG(ペルフリーズバイオロジカ ルズ(Pel-Freez Biologicals),ロジャーズ，AR)を使用して、トランスフェクシ ョンされていないEL-4細胞と比較した。得られたEA2 細胞系を、250 μg/mlのG4 18を含有するRPMI 10%中に維持した。該EA2 細胞系による、A2.1/Kbの細胞表面 発現は、実施例1A2bに記載したように、FACSによって周期的に立証された。 2) ジャーカット細胞 ジャーカット細胞(ATCC CRL 8163)はA2.1を発現しないヒトＴ細胞白血病細胞 系である。ペプチド特異的CTL 集団の維持における刺激細胞として使用されるジ ャーカット細胞は、EL-4細胞について上記したように（但し、以下のような変更 を行って）、A2.1/Kbキメラ遺伝子(イルビン(Irwin)等，J．Exp．Med.，1989，1 70: 1091)により安定にトランスフェクションされた。このトランスフェクショ ン中、該キャパシタは1,450 mfd まで充電し、かつ選別中該トランスフェクショ ンされた細胞は800 μg/mlのG418で選別された。 e. 結合阻害アッセイ この結合阻害アッセイにおいて、A2.1/Kbを表示するターゲット細胞を、放射 線標識し、テストペプチドおよびインフルエンザA-特異的ペプチドと共にインキ ュベートし、次いでインフルエンザA-特異的ペプチドのA2.1/Kbに対する結合に つきアッセイした。該テストペプチドのA2.1/Kbに対する結合は、インフルエン ザA-特異的CTL とのインキュベーションにより決定し、また細胞毒性アッセイに おける、該ターゲット細胞の溶解についてアッセイした。該ターゲット細胞の溶 解は、該ターゲット細胞の表面上での該A2.1/Kbが、ペプチド−特異的CTL に相 当するペプチドと結合したことを示した。かくして、テストペプチドの該ターゲ ット細胞への結合は、該インフルエンザA-特異的CTL の該ターゲット細胞を溶解 する能力の減少により証拠付けられるように、インフルエンザA-特異的ペプチド 結合の競合的阻害により検出できた。 該A2.1/Kb−発現EA2 細胞（ターゲット細胞）は、1.2x106個のターゲット細胞 を、150 μCiの51Cr(Na51CrO4;アマーシャム(Amersham)，アーリントン，IL）と 共に、37℃にて1.5 時間インキュベートすることにより放射性標識した。この標 識操作中、ターゲット細胞も、10μｇのp53 特異的ペプチド（第２表）および0. 1 μｇのインフルエンザA-特異的ペプチドの存在下でインキュベートした。組み 込まれなかった51Crおよび未結合のペプチドを、３回洗浄することにより除去し た。この51Crで標識されたターゲット細胞をRPMI 10%中に再懸濁した。 約104個の51Cr標識ターゲット細胞を、3x103個のインフルエンザA-特異的CTL （エフェクタ細胞）と共に、96−ウエルのU-字型底部をもつマイクロタイタープ レート（コスター(Coster)，ケンブリッジ，MA）中の200 μｌのRPMI 10%中にて 37℃にて６時間インキュベートして、エフェクタ細胞対ターゲット細胞の比0.3: 1(E:T = 0,3:1)を得た。エフェクタ細胞の不在下で、標識したターゲット細胞を インキュベートしたコントロール反応も、並行して実施して、該インキュベーシ ョン中に自然に遊離する51Crの量を測定した。遊離した51Crの最大量は、5%(v/v )のツイーン(Tween)-20で該細胞を完全に溶解することにより決定した。該上澄1 00 μｌを各サンプルから取り出し、該インキュベーション中に放出された51Cr の量を、γカウンターによる該サンプルの計数により測定した。 p53 特異的ペプチドおよびコントロールペプチド各々に対して第１図に与えた ％特異的溶解(%-SL)は、以下の式を利用して算出した：100 ×（実験値−自然放 出値）／（最大値−自然放出値）＝％特異的溶解値。 第１図に示したように、インフルエンザA-特異的ペプチド（外因性p53 特異的 ペプチドおよびVSV N52-59およびFLU NP365-373 ペプチドの不在下で）は、比肩 する値を与え、かつ最大の％特異的溶解(%-SL)を達成した。上記のように、VSV N52-59およびFLU NP365-373 ペプチドは、それぞれKbおよびH-2Dbに対して結合 するがA2.1/Kbには結合しないことが知られている。従って、これらペプチドはA 2.1/Kbに結合しないであろうことが予想され、結果としてインフルエンザA-特異 的ペプチドのA2.1/Kbへの結合を可能とし、かつインフルエンザA-特異的CTLの該 ターゲット細胞の溶解を生ずる。 同様に、第１図に示されているように、該p53 由来のおよびHIV pol ペプチド は効果的にA2.1/Kbと結合した。このことは、インフルエンザA-特異的CTL が低 効率で該ターゲット細胞を溶解するという事実により証拠付けられる。 3．p53 ペプチド−特異的CTL 細胞系 実施例1A2aからのA2.1/Kbトランスジェニックマウスを、同時にp53-特異的お よびHBc-特異的ペプチドで免疫付与した。肝炎Ｂウイルスコアタンパクから誘導 され、かつアミノ酸残基数128 〜140(TPPAYRPPNAPIL; SEQ ID NO 9)を含む、HBc -特異的ペプチドは、CD4 Ｔ細胞ヘルパー応答を誘発することが見出された（セ ッテ(Sette)等，J．Immunol.，1994, 153）。 脾細胞を収穫し、p53-特異的ペプチドと反応性のCTL 集団が回収された。この p53-特異的ペプチドCTL 集団は、照射脾細胞およびＴ細胞成長因子(TCGF)の存在 下で、ターゲット細胞の表面上に提示されたそれぞれのp53-特異的ペプチドで、 毎週再刺激することにより維持された。 p53 ペプチド−特異的CTL 細胞系を調製し、かつ以下のように維持した。即ち 各A2.1/Kbトランスジェニックマウスを、尾の基部における皮下経路で、100 μ ｌの不完全フロインドアジュバント(IFA)中に添加した、100 μｇのp53-特異的 ペプチドおよび120 μｇのHBc-特異的ペプチドにより免疫付与した。 マウス−由来の脾細胞のインビトロ再刺激のために使用する、A2.1/Kbリポポ リサッカライド(LPS)-ブラストを、感作されていないA2.1/Kbトランスジェニッ クマウスから調製した。即ち、脾細胞を、25μg/mlの LPSおよび７μg/mlのデキ ストランを含む培地中に懸濁させた。培養物は、全体積30mI中に1.5x106脾細胞/ ml を含むように設定し、スタンド式T75 フラスコ中で、37℃にて70時間インキ ュベートした（セッテ(Sette)等，J．Immunol.，1994, 153）。再刺激前に、該L PS-ブラストを５μｇのp53-特異的ペプチドおよび10μｇのヒトβ-2- マイクロ グロブリン(カルビオケム(Calbiochem)，ラジョラ,CA)の存在下でインキュベー トし、かつ照射した（約3000 rad）。 免疫付与後10日において収穫したマウス脾細胞を、該p53-特異的ペプチドと結 合している、該照射したA2.1/KbLPS-ブラストによりインビトロで再刺激した。 得られたp53-特異的ペプチドCTL 集団を、毎週の再刺激によりインビトロで維持 した。刺激細胞、A2.1/Kb発現EA2 細胞(EA2/Kb)またはA2.1/Kb発現ジャーカット 細胞(JA2/Kb)を照射し(約20,000rad)、15μＭのp53-特異的ペプチドと共に、１ 時間37℃にてインキュベートし、３回洗浄して、未結合ペプチドを除去した。CT L 集団を、結合したp53-特異的ペプチドを含有する、照射されたEA2/KbまたはJA 2/Kb刺激細胞と共に、0.1-0.2x106細胞／ウエルの濃度にて、照射された(3,000r ad)C57/BL6 脾細胞および2%(v/v)のTCGFの存在下でインキュベートすることによ り再刺激した。TCGFは、ラット脾細胞を、５μｇのconAと共に２日間刺激し、次 いでTCGFを含有する上澄を集めることにより調製した。ConAは、該CTL 集団との インキュベーション前に、該上澄を１g/mlのα−メチルマンノシドと共にインキ ュベートすることにより不活性化する。 p53 ペプチドに対して特異的なCTL 、即ちp53.25-35 、p53.65-73 、p53.149- 157 またはp53.264-272 は、上記の方法によって生成し、それぞれCTL A2.1/Kb2 5、CTL A2.1/Kb65、CTL A2.1/Kb149 およびCTL A2.1/Kb264と命名した。該イン フルエンザＡマトリックスペプチド(M1(55-66))に対して特異的なCTL を、上記 のおよびビチエロ等の上記文献に記載の方法と同様にして発生させた。M1(55-66 )に特異的なCTL は、「Ａクローン12」（これは「クローン12」と略称すること ができる）と命名した。 B．ターゲット細胞のp53-特異的ペプチドCTL-媒介溶解 外因的または内因的に誘導された、表面上にA2.1/Kbと結合したp53 ペプチド をもつターゲット細胞の、p53 ペプチド−特異的CTL に対する感受性を、細胞毒 性アッセイにおいて評価した。その詳細は以下の通りである。 1．外因的に誘導されたp53-特異的ペプチドをもつターゲット細胞の、p53-特 異的ペプチドCTL-媒介溶解 表面にA2.1/Kbと結合したp53-特異的ペプチドをもつターゲット細胞のp53 ペプ チド−特異的CTL-に対する感受性を、実施例1A2eに記載したような、標準的な51 Cr−放出細胞毒性アッセイにより評価した。簡単に説明すれば、表面にA2.1/Kb と結合したp53-特異的ペプチドをもつターゲット細胞を、51Crで放射性標識し、 ペプチド−特異的CTL(エフェクタ細胞)と共にインキュベートした。このインキ ュベーション後に、得られた上澄を、該標識されたターゲット細胞からの51Crの 放出についてアッセイした。51Crの放出は該ターゲット細胞の溶解と相関性をも ち、従って該ターゲット細胞の、該ペプチド−特異的CTL-による溶解に対する感 受性の指標となる。 A2.1/KbでトランスフェクションしたEA2 を、２μｇのp53-特異的ペプチド(p5 3.25-35、p53.65-73 、p53.149-157 またはp53.264-272)と共にインキュベート し、一方で実施例1A2eに記載したように、51Crで放射性標識した。次いで、該p5 3-特異的ペプチド−担持放射性標識したEA2 細胞（ターゲット細胞）を、実施例 1A3 に記載したように調製しかつ維持した、対応するp53-特異的ペプチドCTL （ エフェクタ細胞）の存在下でインキュベートした。 種々のエフェクタ対ターゲット細胞の比(E:T)10:1、3:1 、1:1 、0.3:1 、0.1 :1 および0.03:1をもつ別々の反応体を調製した。51Crの放出量を実施例1A2eに 記載のように測定し、エフェクタ対ターゲット細胞の比(E:T)に対してプロット した％特異的溶解として、第2A〜2D図に示した。 第2A〜2D図に見られるように、CTL A2.1/Kb25、CTL A2.1/Kb65、CTL A2.1/Kb1 49およびCTL A2.1/Kb264 は、それぞれのp53-由来のペプチドが結合している、E A2.1/Kbターゲット細胞を特異的に溶解する。結合したp53 ペプチドをもたない ターゲット細胞は、その各CTL-によって特異的に溶解されることはなかった。 2．内因的に誘導されたp53-特異的ペプチドをもつターゲット細胞の、p53 ペプチド−特異的CTL-媒介溶解 p53-ペプチド特異的CTL-を、A2.1/Kbおよびヒトp53 の変異型を発現する遺伝 子(ハーロー(Harlow)等，Mol．Cell Biol.，1985，5:1601)によりトランスフェ クションされているターゲット細胞を、特異的に溶解する能力についてアッセイ した。かくして、A2.1/Kbにより該ターゲット細胞の表面に結合している、該p53 ペプチドは、実施例1B1 に記載されているように、p53 ペプチドとインキュベー トすることにより、外因的ではなく、ヒト変異p53 遺伝子から内因的に誘導した 。 このp53 遺伝子生成物は細胞の成長速度を調節する。腫瘍細胞中で、該p53 遺 伝子は、一般的にコードされたアミノ酸残基配列中に１以上の変異を含み、従っ てヒトp53 の変異型を発現する。ヒトp53 の幾つかの変異型は細胞の成長速度に 影響を及ぼす。該EL-4ターゲット細胞を、野性型p53 遺伝子ではなく、変異型p5 3 遺伝子によりトランスフェクションし、該形質転換したp53 が該トランスフェ クションされた細胞の成長速度を変えるのを防止した。更に、腫瘍細胞は、しば しば高い濃度でp53 を発現し、従ってHLA 分子に結合しかつ該細胞表面上で発現 されるp53-由来のペプチドの高い濃度をもつ。 該トランスフェクションされたターゲット細胞内で発現された該ヒト変異p53 遺伝子を、該タンパクの細胞内プロセッシングにより、処理して、抗原ペプチド フラグメントとし、かつ該ターゲット細胞の表面上のA2.1/Kbと結合させた。該 ターゲット細胞の表面上のA2.1/Kbと結合した、該ヒト変異p53-由来のペプチド の存在は、該ターゲット細胞と、p53-特異的ペプチドCTL-とのインキュベーショ ンにより検出できる。該ターゲット細胞の表面上のp53-由来のペプチドが、該p5 3-特異的ペプチドCTL-により識別される場合には、該放射性標識したターゲット 細胞の溶解が生じ、かつ該放射性標識の放出により検出されるであろう。 a. ターゲット細胞の調製 1) ヒト変異p53 によるEA2 細胞のトランスフェクション EA2 ターゲット細胞（安定にA2.1/KbによりトランスフェクションされたEL-2 細胞；実施例1A2d1 参照）を、実施例1A2d1 に記載の手順に従って、pC53-Cx4.2 N3で安定にトランスフェクションした。pC53-Cx4.2N3はヒトp53 遺伝子をコード し、該遺伝子は、天然のアルギニンをヒスチジンに変更した（ハーロー等の上記 文献）、該ヒトp53 遺伝子の位置273 におけるアミノ酸残基をコードするヌクレ オチド配列中に変異を含む。 2) ヒト変異p53 によるSaos-2細胞のトランスフェクション Saos-2細胞(ATCC HTB-85)を、該p53 遺伝子の欠失を有し(ディットマー(Dittm er)等，Nature Gen．1993，4: 42)および通常はその細胞表面にA2を発現する骨 形成原肉腫細胞から誘導される。Saos-2細胞は、ここに記載する標準的な51Cr放 出細胞毒性アッセイにおけるターゲット細胞として使用して、細胞表面に該ペプ チドを表示する、Saos-2細胞のペプチド−特異的CTL-媒介溶解を立証する。 Saos-2細胞を、アミノ酸残基175 にArg-His 変異をもつヒト変異p53 遺伝子を 発現する、プラスミドで安定にトランスフェクションして、ここでSaos-2/175と して同定した細胞系（ディットマー等の上記文献）を生成する。このプラスミド は、ヒトp53 の位置175 におけるアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列中 に、天然のアルギニン(Arg)アミノ酸残基を、ヒスチジン(His)アミノ酸残基に変 更する変異を含む。 Saos-2細胞の表現型および安定にトランスフェクションされたSaos-2細胞は、 実施例1A2bに記載したように、FACS分析により周期的に証明された。A2の該発現 は、A2−特異的モノクローナル抗体PA2.1(ATCC HB 117)との反応性により立証さ れた。ヒト変異p53 遺伝子の発現は、上記のディットマー等の文献に記載されて いるように、PAb1801 モノクローナル抗体（オンコジーヌ(Oncogene Science)， ユニオンデール，NY）と、可溶性細胞タンパク抽出物の免疫沈降物との反応性に より証拠付けられた。 b. ターゲット細胞溶解を検出するための細胞毒性アッセイ 該ターゲット細胞EA2KbおよびEA2Kb.1p53(273)を、実施例1A2eに記載したよう に、細胞毒性アッセイによって、その表面上の内因性p53 ペプチドの存在につき アッセイした。該ターゲット細胞を、実施例1A2eに記載したように、但し外因 性p53 ペプチドの添加なしに、放射性標識した。ターゲット細胞(T)を、p53 ペ プチド−特異的エフェクタ細胞（Ｅ）と共に、E:T 比60:1、20:1、6:1 、2:1 、 0.6:1 および0.2:1(60 、20、６、２、0.6 および0.2)にて、インキュベートし た。アッセイした該エフェクタ細胞はCTL A2/Kb25、CTL A2/Kb65、CTL A2/Kb149 、CTL A2/Kb264 、およびCTL CD8xA2/KbHIVpol 9K であった。反応を実施し、％ 特異的溶解を実施例1A2eに記載したようにして測定した。 結果を、E:T 比に対する％特異的溶解として、第3A〜3E図に示した。第3Aおよ び3B図の考察により、CTL A2Kb25もCTL A2Kb65も、内因性p53 を発現する(EA2Kb .1 p53(273))またはこれを発現しない(EA2Kb)ターゲット細胞を溶解しないこと を示している。 次いで、該ターゲット細胞EA2KbおよびEA2Kb.1p53(273)を、標識反応中に外因 性p53.149-157 と共にインキュベートし(EA2Kb+p53.149-157およびEA2Kb.1 p53( 273)+p53.149-157)、またCTL A2Kb149、CTL A2Kb264 およびCTL CD8xA2KbHIV-po l 9Kと共にインキュベートした。結果を、E:T 比に対してプロットされた％特異 的溶解(%-SL)として、第3C〜3E図に示した。 それぞれCTL A2/Kb149 およびCTL A2/Kb264 を使用した、第3C〜3D図に示した 結果は、p53 を発現しないターゲット細胞(EA2Kb)と比較した場合に、内因性p53 を発現するターゲット細胞(EA2Kb.1 p53(273))の溶解における増大が明らかに みられる。これらの効果は、検査した全E:T 比、即ち60:1〜0.2:1 のE:T 比にお いて明らかとなった。p53 を発現しないターゲット細胞(EA2Kb)と比較した場合 に、内因性p53 を発現するターゲット細胞(EA2Kb.1 p53(273))の溶解における増 大は、CTL A2/Kb149 およびCTL A2/Kb264 については明らかではない。第3E図に 示したように、CTL CD8xA2/KbHIVpol 9K は、アッセイしたターゲット細胞（EA2 KbおよびEA2Kb.1p53(273)）の何れも溶解しないように考えられた。 c. ターゲット細胞溶解の検出のための細胞毒性アッセイ ターゲット細胞Saos-2およびSaos-2/175を、実施例1A2eに記載したように、表 面上での内因性p53 ペプチドの存在についてアッセイした。該ターゲット細胞を 前のように放射性標識したが、外因性p53 ペプチドは添加しなかった。ターゲッ ト細胞（Ｔ）を、p53 ペプチド−特異的エフェクタ細胞（Ｅ）と共に、E:T 比60 :1、20:1、6:1 、2:1 、0.6:1 および0.2:1（60 、20、６、２、0.6 および0.2 ）にて、インキュベートした。アッセイした該エフェクタ細胞はCTL A2/Kb25、C TL A2/Kb65、CTL A2/Kb149 、CTL A2/Kb264 、およびCTL CD8xA2/KbHIVpol 9K であった。反応を実施し、％特異的溶解(%-SL)を実施例1A2eに記載したようにし て測定した。 上記アッセイの結果を第4A〜4F図に示した。第4A〜4B図は、溶解における極僅 かな増大がCTL A2/Kb25エフェクタ細胞について観測され、かつ幾分より穏やか な増大がCTL A2Kb65エフェクタ細胞が存在する場合に観測された。 次に、ターゲット細胞Saos-2およびSaos-2/175を、標識反応中に外因性p53.14 9-157 と共にインキュベートし（Saos-2＋p53.149-157およびSaos-2/175+p53.14 9-157）、またCTL A2Kb149 と共にインキュベートした。結果を、E:T 比に対し てプロットされた％特異的溶解として、第4C図に示した。ターゲット細胞の両集 団とも、図示したように有意数で溶解された。 それぞれCTL A2/Kb149 およびCTL A2/Kb264 を使用した、第4Dおよび4E図に示 した結果は、p53 を発現しないターゲット細胞と比較した場合に、内因性p53 を 発現するターゲット細胞（Saos-2/175）の溶解細胞数の増大が明らかにみられる 。これらの効果は、検査した全E:T 比、即ち60:1〜0.2:1 のE:T 比において明ら かとなった。p53 を発現しないターゲット細胞と比較した場合に、内因性p53 を 発現するターゲット細胞溶解細胞数における増大は、調べた残りのCTL について は観測されない。更に、外因性p53.149-157 と共にインキュベートした、内因性 p53 を発現するまたは発現しないターゲット細胞が、外因性p53.149-157 をもた ないターゲット細胞よりも、高い％特異的溶解を与えるという事実に注目すべき である。 第4F図は、CTL CD8xA2/KbHIVpol 9K によるターゲット細胞の溶解を示す図で ある。ここでも、Saos-2（白丸）およびSaos-2/175（黒丸）ターゲット細胞を使 用する。しかしながら、第4F図に示したように、CTL CD8xA2/KbHIVpol 9K は、 アッセイした該ターゲット細胞集団のいずれに対しても有意な溶解を誘発しない ように考えられた。 上記の結果は、細胞表面上でA2と結合した外因性または内因性p53 ペプチドを もつターゲット細胞を特異的に溶解することのできるCTL 集団は、所定のA2結合 モチーフと一致するp53 由来のペプチドで、インビボにて免疫付与することによ り、生成できる。CTL 集団による、これらターゲット細胞の特異的溶解は、外因 性または内因性ペプチドを有するまたはもたないターゲット細胞を比較すること により明らかになる。更に、該細胞表面上における、A2と結合したペプチドの存 在または不在を、ここに記載する阻害結合アッセイにより明らかにすることがで きる。 実施例２：Her-2/Neu- 特異的ペプチドを発現するターゲット細胞のCTL-媒介 溶解 A．結合したHer-2/Neu-由来のペプチドをもつターゲット細胞のCTL-媒介溶解 Her-2/Neu ペプチド−特異的CTLを、HLA A2.1分子により結合できるHer-2/Neu から誘導されるペプチドを設計かつ合成し、インビボでHer-2/Neu ペプチドによ りA2KbxCD8トランスジェニックマウスに免疫付与し、かつ該免疫付与されたトラ ンスジェニックマウス由来のHer-2/Neu ペプチド−特異的CTL 細胞系を生成する ことにより調製される。 1．Her-2/Neu ペプチド免疫原の調製 Her-2/Neu-特異的ペプチドを、該p53 ペプチドについて記載したもの（実施例 1A1a参照）と同様なモチーフに従って設計し、その各アミノ酸残基位置およびSE Q ID NO と共に第３表に掲載した。Her-2/Neu 特異的ペプチドは、実施例1A1bに 記載のようにして、合成しかつ分析した。 2．A2KbxCD8 トランスジェニックマウスの調製 A2KbxCD8トランスジェニックマウスは、実施例1A2aに記載のようにして調製し たA2.1/Kbトランスジェニックマウスを、ヒトCD8(hCD8)を発現するトランスジェ ニックマウスと交雑することにより調製した。該hCD8トランスジェニックマウス は、標準的なプロトコール(ホーガン(Hogan)等，Manipulating the Mouse Embry o: A Laboratory Manual，コールドスプリングハーバーラボラトリー(Cold Spri ng Harbor Laboratory),コールドスプリングハーバー，NY(1986))に従って製造 した。この導入遺伝子発現ベクター(p1013)は、マウスp56lck近接プロモータお よび完全な長さのhCD8αまたはhCD8βcDNA配列を含み、かつポリメラーゼ連鎖反 応(PCR)増幅により改善して、BamHI 制限サイトを添加し、かくして該ベクター への挿入を簡略化する（ガービン(Garvin)等，Int．Immunol.，1990，2:173-180 ）。 ２つのNotl制限サイト間のhCD8αまたはhCD8βをコードするヌクレオチド配列 を含むDNA フラグメントを、C57BL/6xSJL)F2胚中に、別々にまたは一緒にマイク ロインジェクションして(イルビン(Irwin)等，J．Exp．Med.，1989，170:1091) 、判別発現(differential expression)性を示す系を生成する。トランスジェニ ックマウス系は、テールDNA ドットブロット分析法（サンブロック等の上記文献 ）により検出されるような、導入遺伝子を組み込んだマウスを同定することによ り樹立した。次いで、トランスジェニック創始マウスを、H-2bハプロタイプを有 するC57BL/6 マウスに逆交雑した。５つのトランスジェニック系を、以下に説明 するように、FACS分析により測定される、hCD8の細胞表面発現に基づい て選別した。 1) hCD8 の細胞表面発現の検出 hCD8の細胞表面発現を、A2.1/Kbの細胞表面発現について実施例1A2bに記載し たようなFACS分析により測定した。ヒトCD8、マウスCD8 およびマウスCD4 と反 応性のFITC−複合化、フィコエリトリン−複合化およびビオチン−複合化抗体（ ファーミンゲン(Pharmingen)，サンジエゴ，CA）を、該トランスジェニックマウ スの胸腺および脾臓からの細胞懸濁液を染色するのに使用した。これら３種の複 合化抗体から放出される重複蛍光を、製造業者の指示に従って補正した。該染色 した細胞をFACScan(ベクトンディッキンソン(Becton Dickinson)，マウンテンビ ュー，CA)装置を用い、全細胞集団またはhCD8に対する抗体に関して正に染色さ れた細胞について、ライシス(Lysis)IIソフトウエアを利用して、分析した。 3．A2.1/Kb に対するHer-2/Neu ペプチドのインビトロ結合 p53-由来のペプチドについて実施例1A2eに記載したように、A2.1/KbのHer-2/N eu-由来のペプチドに対する結合効率を、インフルエンザA-由来のペプチドおよ びインフルエンザAペプチド−特異的CTL を使用した結合阻害アッセイにおいて 測定した。 A2.1/Kbによりトランスフェクションされ、実施例1A2d1 に記載の如く維持し たEA2 ターゲット細胞を、第３表に記載した外因性Her-2/Neu-由来のペプチドと 共に、実施例1A2eに記載のようにインキュベートした。インフルエンザA-特異的 CTL 、インフルエンザA-特異的ペプチドおよび結合したHer-2/Neu 由来のペプチ ドをもち、放射性標識したターゲット細胞を使用した結合阻害アッセイを実施例 1A2eに記載のように実施した。そのエフェクタ対ターゲット細胞比(E:TまたはE/ T)を10:1、3:1 、1:1 、0.3:1 および0.1:1 に設定した。この結合阻害アッセイ の結果を第５図に示し、インフルエンザA-特異的CTL クローン12のE/T 比に対し てプロットした％特異的溶解（あるいはまた、％放出51CrＤ 表される）として 表示される。 第５図に示された結果は、インフルエンザA-特異的CTL が、A2.1/Kbに対して 結合したインフルエンザA-由来のペプチド(G-MATRIX，SEQ ID NO 8)を有するタ ーゲット細胞の溶解において最も効果的であることを示す。この結果は、またテ ストした全てのHer-2/Neu 由来のペプチドが、ほぼ同一の効率で、後のインフル エンザA-由来のペプチドの結合を阻害することを立証した。Her-9 が最大の効率 で結合した。 これらの結果は、テストした全てのHer-2/Neu ペプチドが、該EA2 ターゲット 細胞の表面上に、A2.1/Kbにより結合され得ることを示し、このことは該インフ ルエンザA-特異的ペプチドのA2.1/Kbに対する結合を阻害するその能力、その後 の該ターゲット細胞のインフルエンザA-特異的CTL による溶解により証拠付けら れる。テストしたHer-2/Neu ペプチドは、その後にトランスジェニックマウスを 免疫化するのに使用され、またHer-2/Neu ペプチド−特異的CTL 集団が調製され た。 B．ターゲット細胞のHer-2/Neu-特異的ペプチドCTL-媒介溶解 1．A2.1/Kb −制限Her-2/Neu ペプチド−特異的CTL の調製 Her-2/Neu 由来のペプチドに対して特異的なCTL 集団を、該p53-由来のペプチ ドについて実施例1A3 に記載した方法に従って調製し、かつ維持した。該Her-2/ Neu 特異的CTL 集団を、細胞表面上でA2.1/Kbに結合したHer-2/Neu 特異的ペプ チドをもつターゲット細胞を溶解するその能力についてアッセイした。 2．外因的に誘導されたHer-2/Neu ペプチドを有するターゲット細胞の Her-2/Neu ペプチド特異的CTL-媒介溶解 該Her-2/Neu 由来のペプチド各々の免疫原性を、実施例1A2eに記載したような 標準的な51Cr放出細胞毒性アッセイにより測定した。このアッセイで使用したエ フェクタ細胞は、Her-2/Neu 由来のペプチドHer-3 およびHer-7(それぞれH-3pop およびH-7 pop;上記を参照のこと)により免疫化された、A2KbxCD8トランスジェ ニックマウス由来のCTL であった。該ターゲット細胞は、外因的に添加されたHe r-３またはHer-７ペプチドを有する(EA2Kb+Her-3-pep およびEA2Kb+Her-7-pep) またはこれをもたない(EA2Kb)EA2Kbであった。Her-３またはHer-７に関 する該アッセイの結果は第６図に示されており、そこではエフェクタ対ターゲッ ト細胞の比(B/T)に対する％放出51Crとしてプロットされている。 外因性Her-2/Neu ペプチドをもつA2.1/Kbを発現するターゲット細胞は、対応 するHer-2/Neu 特異的CTL により効果的に溶解されたが、対応しないHer-2/Neu 特異的CTL によっては、溶解されなかった。A2.1/Kbを発現するターゲット細胞 は、これらのアッセイにおいて、Her-３またはHer-７ペプチド−特異的CTL いず れによっても溶解されなかった。 次いで該Her-2/Neu 特異的CTL を、ターゲット細胞を溶解するその能力につい てテストした。該ターゲット細胞は、該Her-2/Neu遺伝子によりトランスフェク ションされ、かつ該細胞の表面上で、A2.1/Kbに結合したHer-2/Neu 遺伝子由来 のペプチドを発現する。 3．内因的に誘導されたHer-2/Neu ペプチドを有するターゲット細胞の Her-2/Neu ペプチド特異的CTL-媒介溶解 Her-2/Neu 遺伝子を発現し、従ってA2.1/Kbに結合した表面上で、Her-2/Neu 由来のペプチドを表示する、ターゲット細胞を溶解する、Her-2/Neu ペプチド− 特異的CTL 集団の能力を、該51Cr放出細胞毒性アッセイにおいて評価した。 該A2.1/Kb遺伝子によりトランスフェクションされたEA2ターゲット細胞も、該 Her-2/Neu 遺伝子(ジフィオレ(Di Fiore)等，Science，1987，237: 178)をコー ドするプラスミドによりトランスフェクションした。EA2細胞中の該Her-2/Neu遺 伝子の発現は、該EA2 細胞の表面上でA2.1/Kbと結合した該Her-2/Neu 遺伝子由 来のペプチドを、内因的にプロセッシングし、かつ表示する手段を提供してくれ る。 Her-3 およびHer-7 ペプチドに対して特異的なCTL 集団の、その表面上でのHe r-2/Neu 由来のペプチドを発現するターゲット細胞を溶解する能力は、実施例1A 2eに記載したような標準的な51Cr放出細胞毒性アッセイにより測定した。このア ッセイで使用したエフェクタ細胞は、実施例1A3 に記載のようにして、Her-3 お よびHer-7 ペプチドで免疫化したA2KbxCD8トランスフェクションマウス由来のCT L であった。該ターゲット細胞は内因的に発現されかつプロセッシングされ たHer-2/Neu タンパクを有するおよびもたないEA2Kbであった。E/T の比は10:1 、3:1 、1:1 、0.3:1 および0.1:1 であった。更に、実施例1A3 に記載のように して調製したHIV ペプチドに対する特異的なCTL をアッセイした。このアッセイ の結果を第７図に示したが、そこではエフェクタ対ターゲット細胞の比(E/T)に 対する％放出51Crとしてプロットされている。 この実験の結果は、明らかに、該Her-3 およびHer-7 特異的CTL(H-3 およびH- 7 pop)が、効果的にA2.1/KbおよびHer-2/Neu 遺伝子(EA2Kb-Her-2)により同時ト ランスフェクションされたターゲット細胞を溶解することを立証している。Her- 2/Neu 特異的CTL による該細胞の溶解の特異性は、低効率のHIV 特異的CTL(HIV- pop)による該同時トランスフェクションターゲット細胞の溶解により立証された 。該ターゲット細胞を溶解する、該CTL 集団の能力は、A2.1/Kb分子に結合した ペプチドの表示に依存し、該表示は、Her-2/Neu 遺伝子(EA2Kb-Her-2)によりト ランスフェクションされたターゲット細胞と、該遺伝子によりトランスフェクシ ョンされていないターゲット細胞(EA2Kb)との間の比較により証明される。 実施例３：Her-2/Neu 特異的ペプチドを発現するターゲット細胞のCTL-媒介 溶解 A．乳癌細胞のHer-2/Neu ペプチド−特異的CTL-媒介溶解 次いで、実施例2B1 に記載のようにして調製した、Her-2/Neu ペプチド−特異 的CTL を、A2およびHer-2/Neu を発現する乳癌細胞を溶解する能力についてアッ セイした。 1．ターゲット細胞の調製 乳癌細胞系MCF-7(ATCC HTB 22)、MDA 23.1(ATCC HTB 26)およびMDS 435(ATCC HTB 129)を表現型について特徴付けし、A2が該細胞上で表現されるか否かを、A2 −特異的抗体PA2.1(ATCC HB 117)を使用してFACS分析により測定した。MCF-7 お よびMDA 23.1はA2を発現した（従って、A2+と命名）が、MDS 435 はA2を発現し ない（従って、A2-と命名）。更に、これらの細胞系を、Her-2 の細胞表面発 現について、c-Neu(AB-5)モノクローナル抗体（オンコジーヌサイエンス(Oncoge ne Science)，ユニオンデール，NY）を使用したFACS分析により特徴付けした。 該c-Neu 抗体は、該細胞表面上でHer-2/Neu のエピトープと反応するが、ヒトEG F-レセプタとは交叉−反応しない。これら３種全ての細胞系がHer-2/Neu を発現 し、従ってHer+と命名される。 2．Her-2/Neu 特異的CTL によるターゲット細胞の溶解を検出するための細 胞毒性アッセイ 調製されかつA2.1/Kbに結合したHer-2/Neu 特異的ペプチドを有するターゲッ ト細胞（実施例2B2 参照）を溶解する能力につき特徴付けされた、Her-2/Neu 特 異的CTL(エフェクタ細胞)および実施例3A1 に記載した乳癌細胞系(ターゲット細 胞)を、51Cr放出細胞毒性アッセイで使用して、Her-2/Neu 特異的ペプチドCTLが 、細胞表面上でA2に結合したHer-2/Neu タンパクから内因的に誘導されたペプチ ドを発現するターゲット細胞を殺傷できるか否かを決定した。その手順および結 果を以下に記載する。 a. Her-3 およびHer-7 ペプチド−特異的CTL による乳癌細胞系の溶解 Her-3 およびHer-7 ペプチド−特異的CTL 集団の、細胞表面上でHer-2/Neu 由 来のペプチドを発現する乳癌細胞系を溶解する能力を、実施例1A2eに記載した、 標準的な51Cr放出細胞毒性アッセイを利用して測定した。このアッセイで使用し たエフェクタ細胞はA2KbxCD8トランスジェニックマウス由来のCTL であり、これ は実施例2B1 に記載のように、Her-3 およびHer-7 ペプチドの何れかにより免疫 付与されていた。該ターゲット細胞は、細胞表面上でA2と結合したHer-2/Neu ペ プチドを発現する乳癌細胞系(MCF-7，MDA 23.1およびMDA 435)であった。該Her- 2/Neu ペプチドは、該細胞系により内因的に発現されたHer-2/Neu タンパクから 誘導された。MCF-7 およびMDA 23.1細胞系はA2を発現するが、MDA 435 細胞系は これを発現しない。E:T の比は10:1、3:1 、1:1 、0.3:1 および0.1:1 に設定し た。Her-3 およびHer-7 アッセイの結果は第８図に示されているが、そこではエ フェクタ対ターゲット細胞の比(X-軸)に対する％放出51Cr(Y-軸)として プロットされている。 Her-3 およびHer-7 ペプチド−特異的CTL 集団(それぞれH-3 pop およびH-7 p op)は、表面上でA2と結合した内因性Her-2/Neu 遺伝子由来のペプチドを有する ターゲット細胞を溶解する上で有効であることが示された（実施例2B2 を参照の こと）。乳癌細胞系MCF-7 およびMDA 23.1はA2を発現するが、MDA 435 細胞系は これを発現しない。該乳癌細胞系は細胞表面上のモノクローナル抗体により識別 される該Her-2/Neu エピトープを発現する(実施例3A1)。A2およびHer-2/Neu を 発現する該乳癌細胞系MCF-7 およびMDA 23.1は、H-3 pop およびH-7 pop により 効果的に溶解された。Her-2/Neu を発現するがA2を発現しない、乳癌細胞系MDA 435 は、H-3 pop およびH-7 pop により溶解されなかった。 b. Her-7 ペプチド−特異的CTL による乳癌細胞系の溶解に及ぼす、A2濃度 およびA2−特異的抗体の影響 A2の細胞表面発現のレベルを、MDA 23.1乳癌細胞系においては、Her-7 特異的 CTL 集団と共にインキュベートする前に、γ−インターフェロンと共にインキュ ベートすることにより高めて、該CTL の、MDA 23.1乳癌細胞を溶解する能力に及 ぼすA2濃度の影響を決定した。更に、A2に特異的に結合する抗体(PA2.1，ATCC H B 117)の、MDA 23.1乳癌細胞を溶解する該Her-7 特異的CTL の能力に及ぼす作用 をも評価した。 A2特異的抗体の、Her-7 ペプチド特異的CTL 集団（エフェクタ細胞）の、MDA 23.1細胞(ターゲット細胞)(これはその表面上でA2に結合したHer-2/Neu-由来の ペプチドを発現する)の溶解を阻害する能力は、実施例1A3 に記載したような、 標準的51Cr放出細胞毒性アッセイにおいて測定した。ターゲット細胞は、実施例 1A3 に記載の如く、51Crにより標識され、かつ100ng/mlのγ−インターフェロン (R & D)と共にRPMI 10%中で24時間インキュベートして、該ターゲット細胞の表 面上で発現されるA2の濃度を高めた。γ−インターフェロンと共にインキュベー トされ、放射性標識されたターゲット細胞を、Her-7 特異的またはHIV pol CTL (それぞれHer2-7 CTLおよびHIV pol CTL)と共に、0.5 μg/mlのA2特異的抗体（+ anti-A2(Her2-7 CTL)および+anti-A2(HIVpol CTL)）の存在下または不在下で インキュベートした。E:T の比は30:1、10:1、3:1 および1:1 に設定した。該タ ーゲット細胞の表面上のA2濃度の増加およびA2特異的抗体の存在下でのインキュ ベーションの、Her-7 特異的CTL による溶解に及ぼす影響に関する結果は、第９ 図に与えられ、エフェクタ対ターゲット細胞の比(E:T)に対する％特異的溶解と してプロットした。 第９図に示した如く、ターゲット細胞およびCTL の、該抗−A2抗体(+anti-A2( Her2-7 CTL ))の存在下および該抗−A2抗体の不在下でのインキュベーションは 、該CTL の特異的に該ターゲット細胞を溶解する能力を有意に減じる。更に、該 抗−A2抗体の存在(+anti-A2(HIVpol CTL))または不在(HIVpol CTL)は、該HIVpol CTLの該ターゲット細胞を溶解する能力に影響することはない。 第８図と第９図の結果の比較により、A2濃度の増大の、Her2-7CTL-媒介ターゲ ット細胞溶解に及ぼす効果が示される。ターゲット細胞の％特異的溶解は、低A2 濃度（第８図，H7-pop(MDA 23.1)，白抜き三角）において、Her-2/Neu7 CT につ いて28% および高いA2濃度（第９図，H2-7 CTL，白抜き四角）において14% であ る。従って、A2濃度の増加は、ターゲット細胞の溶解における約２倍の増加をも たらす。 実施例４：一般的腫瘍抗原としてのp53 の、ターゲットとしての攻撃 ここで使用する材料および方法は前の実施例に記載されたものである。しかし ながら、再吟味のため、これらの研究で使用するトランスジェニック(Tg)系（そ の誘導は上に記載した）は以下の通りであった。ここで使用するA2.1/KbTgマウ スは、H-2bおよびA2.1/Kb導入遺伝子両者に対して同系接合であった。全てのA2. 1TgマウスはH-2bに対して同系接合であり、かつ該導入遺伝子に対して異系接合 であった。マウスはザスクリップスリサーチインスティチュート(The Scripps R esearch Institute)（ラジョラ，CA）の動物飼育場において増殖されかつ飼育さ れた。C57BL/6 マウスは、ザスクリップスリサーチインスティチュートの飼育コ ロニーから購入した。 ペプチドは、ギルソン(Gilson)AMS 422ペプチド合成装置（ギルソン(Gilson), ミドルトン，WI）を使用して合成し、純度はビィダック(Vydac)C18 カラム（ビ ィダック(Vydac),ヘスペリア，CA）上での逆相HPLC分析により確認した。幾つか のペプチドは、アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)430A 合成装 置（フォスターシティー，CA）上でも合成した。 これらの研究において使用した、前に記載されたトランスフェクション生成物 は、EL4A2(EA2)、EL4 A2/Kb(EA2Kb)、ジャーカットA2/K(JA2Kb)(シェルマン(She rman)等，Science，1992，258: 815-181;イルビン(Irwin)等，J.Exp．Med.，198 9，170:1091-1101)、Saos-2およびヒト変異p53 遺伝子によりトランスフェクシ ョンされたSaos-2、Saos-2/175（ディットマー(Dittmer)等，Nature Genet.，19 93，42: 42-46）を含んでいた。ラモス(Ramos)-A2およびT2-A2/Kbを得るために 、A2.1またはA2/Kbのゲノムクローンを含むプラスミド10mgを、前に記載された （イルビン等の上記(1989)文献）pSV2neoDNA(2 mg)と共に同時トランスフェクシ ョンした。T2細胞をDr．ピータークレスウエル(Peter Cresswell)から入手し、 全ての他のヒト細胞系を、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)から 入手し、HLA A2（イルビン等の上記(1989)文献）の存在について、フローサイト メトリーによりテストした。 該p53 遺伝子の機能的同系接合変異の結果としての高いレベルのp53 タンパク が、乳癌細胞系MDA 231 およびBT 549、結腸直腸癌細胞系SW 480およびバーキッ トリンパ腫細胞系Ramos により発現され、一方で乳癌細胞系MCF７は核排除(nucl ear exclusion)を介して細胞質中にwt-p53タンパクを蓄積した（バーテック(Bar tek)等，Oncogene，1990，5:893-9;ニグロ(Nigro)等，Nature，1989，342:705-8 ; ベイカー(Baker)等，Cancer Res.，1990，50:7717-7722;ロドリゲス(Rodrigue s)等，PNAS USA，1990，87:7555-9;ガイダノ(Gaidano)等，PNAS USA，1991，88: 5413-7;タカハシ(Takahashi)等，Mol．Carchinog.，1993，8:58-66を参照のこと 。両p53対立遺伝子は、骨肉腫細胞系Saos-2においては欠損している（ディット マー(Dittmer)等，Nature Genet.，1993，4:42-46; マスダ(Masuda)等，PNAS US A，1987，84:7716-9;ハインズ(Hinds)等，Cell Growth Diff.，1987，1:571-580 ）。樹状細胞、コンカナバリンＡ(conA)およびフィトヘマグルチニン(PHA)-活性 化リンパ芽球は、健康な、HLA A2.1正のボランティアドナーから得た、末梢血単 核細胞から、記載されているように(サルスト(Sallusto)等，J．Exp． Med.，1994，179:1109-1118;ミルナー(Milner)，Nature，1984，310:143-5)、し て調製した。 A．HLA-A2.1 に対するペプチド結合 競合アッセイを利用して、HLA-A2.1に対するペプチドの結合性を評価した。EA ２細胞を、１mMのA2−結合合成ペプチド（これはA/PR/8/34 インフルエンザウイ ルスマトリックスタンパクM1の残基58-66 を表す）および100 mMの指定したテス トペプチドによりパルス処理した（ベッドナレク(Bednarek)等，J．Immunol.，1 991，147:4047-4053; モリソン(Morrison)等，Eur．J．Immunol.，1992，22:903 -7）。ヒト免疫不全症ウイルスタイプ-1(HIV-1)の逆転写酵素の残基476-484 を 表す、このA2.1−結合ペプチドは、正のコントロールとして機能した(ソミデス( Tsomides)等，PNAS USA，1991，88:11276-80)。水疱性口内炎ウイルス核タンパ クの残基52-59 を表すH-2Kb−結合ペプチド(VSV-N52-59)およびインフルエンザ Ａウイルス(1934)核タンパクの残基366-374 を表すH-2Db-結合合成ペプチド(Flu NP 1934 366-374)両者は、負のコントロールとして機能した（ファンブリーク ＆ナーザンソン(VanBleek and Nathenson)，Nature，1990，348:213-6;ロチュク (Rotzschke)等，Nature，1990，348:252-4;フォーク(Falk)等，J．Exp．Med.，1 991，174:425-434)。A2.1−制限、M1−特異的CTL クローン12(Aクローン12)を種 々のエフェクタ対ターゲット細胞比(E:T)にて、ペプチド−または非ペプチド− パルス処理EA2 ターゲット細胞に対する溶解活性について、4-時間の51Cr放出ア ッセイ（イルビン等の上記(1989)文献）によってアッセイした。M1−パルス処理 EA2 ターゲット細胞の、指定したペプチドによるＡクローン12媒介溶解の％阻害 をE:T 比0.3:1 にて算出した。 B．HLA トランスジェニックマウスのペプチド感作およびCTL 系の増殖 マウス尾の基部において、100 mlの不完全フロインドアジュバント(IFA)中に 乳化させた、100 mgの指定したテストペプチドおよび120 mgのI-Ab−結合合成Ｔ ヘルパーペプチド（肝炎Ｂウイルスコアタンパク(セッテ(Sette)等，J．Imfnuno l.，1994，1534:5586-5592)の残基128-140 を表す）を、該マウスに皮下注射し た。10日後に、感作したマウスの脾細胞を、照射したA2.1/KbまたはA2.1-Tg リ ポポリサッカライド(LPS)活性化脾細胞刺激剤と共に培養した。ここで該刺激剤 は、指定した感作ペプチド５mg/ml およびヒトβ2-マイクログロブリン10mg/ml でパルス処理されていた(シャーマン(Sherman)等，Science，1992，258:815-818 ; ビチエロ(Vitiello)等，J．Exp．Med.，1991，173:1007-1015)。６日後に、得 られたエフェクタ細胞を、種々のE:T 比にて、4-時間の51Cr放出アッセイにより 、T2またはT2A2Kb（これは、指定された感作ペプチド、関連性のないA2.1−結合 ペプチドによりパルス処理されているかまたはペプチドの不在下にあった）に対 する溶解活性について、アッセイした。hu-p53.149-157(CTL A2/Kb149 A2 149) およびhu-p53.264-272(CTL A2/Kb264 A2 264)に対して特異的なポリクローナルC TL 系を、エフェクタCTL の照射したJA2KbまたはJA2 細胞（これらは５mgの指定 したp53 ペプチド、照射したC57BL/6 脾臓フィラー細胞および2%(v/v)のＴ細胞 増殖因子でパルス処理されていた）による毎週の再刺激により樹立した。 C．結果および考察 該hu-p53タンパク中の配列を表す合成ペプチドは、A2.1により結合されたペプ チドに対する公知の共通モチーフに従って選別された（例えば、フォーク(Falk) 等，Nature，1991，351:290-6;ハント(Hunt)等，Science，1992，255:1261-3;パ ーカー(Parker)等，J．Immunol.，1992，149:3580-7;ラパート(Ruppert)等，Cel l，1993，74:929-937; カスト(Kast)等，J．Immunol.，1994，152:3904-3912; クボ(Kubo)等，J．Immunol.，1994，152:3913-3924; ツェー(Zeh)等，Human Imm unol.，1994，39:79-86; スタバー(Stuber)等，Eur．J．Immunol.，1994，24:76 5-8）。選別されたwt:p53ペプチドは、その長さにおいて８〜11アミノ酸に相当 し、かつそのN-末端位置にＬ、Ｍ、Ｉ、Ｖ、ＡまたはＴ(1- 文字コードで表示) を、かつそのC-末端にＶ、Ｌ、Ｉ、Ａ、Ｍ、Ｔ、ＳまたはＱを有していた。 A2.1−結合は、A/PR/8/34(PR8)インフルエンザウイルスマトリックスタンパク M1(58-66)(ベッドナレク(Bednarek)等，J．Immunol.，1991，147:4047-4053; モ リソン(Morrison)等，Eur．J．Immunol.，1992，22:903-7の58-66)残基を表す、 合成ペプチドの、ターゲット細胞上でのA2.1に対する結合を阻害する、各ペプチ ドの能力を評価する競合アッセイにより測定した（第４表）。M1−特異的、A2.1 −制限CTL クローン、クローン12を使用して、M1ペプチド−結合を、ターゲット 細胞溶解における減少として追跡した。 中間〜高A2.1−結合活性(M1 のA2.1結合の〉23%阻害)をもつ19個のペプチドお よび低活性(10%〜22% の阻害)を示すまたはA2.1結合活性をもたない(〈10% の阻 害)３種のペプチド全てを、A2.1/Kb-Tg マウスにおけるその免疫原性についてテ ストした。マウスをペプチドで感作し、10日後にこれらマウス由来の脾細胞をイ ンビトロにてペプチドにより再刺激し、A2.1/Kb−制限、ペプチド−特異的CTL 応答についてテストした。報告されたように、A2.1/Kb-Tg マウスは、公知のA2. 1−結合CTL エピトープ、例えはHIV-1 RT(476-484)(第４表)に対して特異的な、 A2.1/Kb−制限CTL 応答を増大できた（シャーマン(Sherman)等，Science，1992 ，258:815-8; ビチエロ(Vitiello)等，J．Exp.Med.，1991，173:1007-1015;エン ゲルハード(Engelhard)等，J．Immun.，1991，146:1226-1232; セッテ(Sette)等 ，J．Immunol.，1994，153:5586-5592をも参照のこと）。 第４表は、種々のwt-p53ペプチドの該A2.1−結合アフィニティーおよび免疫原 性を示す。選択されたwt-p53ペプチドを合成し、該M1(58-66)ペプチドの、該A2. 1−結合アフィニティーを阻害する能力を測定することにより、その相対的A2.1 −結合アフィニティーを測定した。wt-p53ペプチドおよび該HIV-1 RT 4760484コ ントロールペプチドの免疫原性は、A2.1/Kb-Tg マウスのペプチド−感作により 測定した。２mgのペプチドを使用して、51Cr標識中に、T2A2/Kbターゲットをパ ルス処理するのに使用した。E:T 比60:1におけるCTL の溶解活性を、前に記載さ れたように（イルビン等の上記(1989)文献）して算出した。無関係のA2.1−結合 ペプチドでパルス処理したT2A2/Kbの溶解は、非ペプチドでパルス処理したT2A2/ Kbについて得られた結果と類似しており、また15% を越えることはなかった。こ れらのデータは、少なくとも３匹のマウスのペプチド−感作後に得た最大の溶解 活性量を表す。hu-wt-p53 とmur-wt-p53との間で相同な残基は太文字で示されて いる。アミノ酸残基は一文字コードで与えられている。NDは測定しなかったこと を意味する。 hu-p53.25-35、65-73 、149-157 および264-272 に対して特異的なA2.1/Kb− 制限CTL 応答も、検出可能であった。これら応答のペプチド特異性は、CTL の、 免疫化ペプチドによりパルス処理した細胞を溶解する能力により証拠付けられる が、他のA2.1−結合ペプチドによっては立証されない（例えば、第10Ａおよび10 Ｃ図参照）。 第10Ａ〜Ｈ図は、A2.1/Kb-Tg およびA2.1-Tg マウス由来のp53-特異的CTL に よる、内因的に合成しp53 エピトープの、A2.1−制限認識を示す図である。エフ ェクタCTL は、Tgマウスのペプチド−感作により発生する。第10ＡおよびＢ図に おいて、該CTL 細胞系はA2Kb149-感作され、第10ＣおよびＤ図において、該CTL はA2Kb264 により感作された。第10ＥおよびＦ図において、該CTL 細胞系はA2Kb 149-感作されており、第10ＧおよびＨ図において、該CTL はA2Kb264 により感作 された。第10Ａ〜10Ｈ図において、エフェクタ対ターゲット細胞の比(E :T)は特異的51Cr放出(%)に対してプロットされている。 CTL を、指定したターゲットに対する5-時間の51Cr放出アッセイにおいて、細 胞毒性をアッセイした:第10ＡおよびＣ図においてはT2A2/Kb（白丸，○）または p53.149-157(黒丸，●)またはp53.264-272(■)によりパルス処理されたT2A2/Kb ；第10ＥおよびＧ図においてはT2（○）またはp53.149-157(●)またはp53.264-2 72(■)によりパルス処理されたT2; 第10Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ図においてはSaos-2（白 抜きの三角，△）またはヒトp53 遺伝子によりトランスフェクションされた同一 の細胞Saos-2/175(黒三角，▲)(例えば、ディットマー(Dittmer)等，Nature Gen et.，1993，4:42-6;マスダ(Masuda)等，PNASUSA，1987，84:7716-9;ハインズ(Hi nds)等，Cell Growth Diff.，1990，1:571-580を参照のこと)。これら両細胞系 ともに、フローサイトメトリーにより検出されるように、A2.1を同様なレベルで 発現した（例えば、イルビン(Irwin)等，J．Exp．Med.，1989，170:1091-1101 を参照のこと）。 これらの発見は、機能性TCR エピトープの大部分が、提示されたMHC クラスＩ 分子（セッテ(Sette)等の上記(1994)文献）に対する、高いアフィニティー（hu- p53.25-35、65-73 および264-272等のように）をもつおよび中間的なアフィニテ ィー(hu-p53.149-157 等のように)をもつペプチドによって生成されるという仮 説と一致した。しかしながら、これらデータは、また機能性Ｔ細胞の能力範囲に おけるギャップが存在する可能性を示唆している。というのは、高いA2.1−結合 活性をもつ非相同性hu-p53ペプチドの全てが、CTL 応各を誘発できた訳ではなか ったからである。A2.1/Kb-Tg マウスによる有意の応答は、hu-p53.264-272に対 して１個のアミノ酸を除き、全く相同であり、しかもテストした全てのp53 ペプ チドのうちで最大のA2.1−結合活性を有する（第４表）マウスペプチド、mur-p5 3.261-269 に対しては検出不能であった。 A2.1/Kb-Tg マウスによるCTL 応答性の欠如は、またmur-p53 配列に対して相 同であり、かつA2.1に対する高い（hu-p53.187-195）または中間の(hu-p53.255- 264 および322-330)結合活性をもつhu-p53ペプチドについても観測された。これ らの結果は、自己−p53 に対する寛容性が、応答性のＴ細胞の能力範囲を制限し ている可能性があることを示唆している。 本研究で同定した幾つかのペプチドは、以前にA2.1と結合することが報告され ており、またヒト末梢血リンパ細胞により、ペプチド−特異的応答を誘発する。 （例えば、ツェー(Zeh)等，Human Immunol.，1994，39:79-86; スタバー(Stuber )等，Eur．J．Immunol.，24:765-8; ホービアーズ(Houbiers)等，Eur．J．Immun ol.，1993，23:2072-7;ナイマン(Nijman)等，J．Immunother.，1993，14:121-6 ；ナイマン(Nijman)等，Immunol．Letters，1994，40:171-8を参照のこと）。し かしながら、このようなCTL の、内因的にp53 を発現する細胞を認識する能力は 報告されておらず、従ってこれらのまたは他のp53 ペプチドが、該細胞表面上で MHC との結合状態で提示されるかどうかは、未解決のままである。 これらの配列に対応するペプチドが、実際に内因的にプロセッシングされ、か つhu-p53を発現するヒト腫瘍細胞の表面上のA2.1分子との結合状態で提示される か否かを決定するために、A2.1/Kb-Tg マウス由来のペプチド−特異的ポリクロ ーナルCTL 細胞系を樹立し、p53-欠失細胞系、Saos-2およびhu-p53遺伝子でトラ ンスフェクションされたこれら細胞系、Saos-2/175を発現する該A2.1の識別につ いてテストした（ディットマー(Dittmer)等，Nature Genet.，1993，4:42-6;マ スダ(Masuda)等，PNAS USA，1987，84:7716-9;ハインズ(Hinds)等，Cell Growth Diff.，1990，1:571-580）。p53-欠失親細胞系に相対的なトランスフェクション 生成物の溶解レベルの比較は、hu-p53.25-35および65-73 に対して特異的なCTL は、Saos-2/175を溶解しなかったことを示し、このことは、これらのペプチドが プロセッシングされず、かつ該CTL 細胞系による認識に十分な量で提示されなか ったことを示唆している（データは提示せず）。これとは対象的に、hu-p53.149 -157および264-272 に対して特異的なCTL が、高いレベルでhu-p53を内因的に発 現する細胞により提示された（第10ＢおよびＤ図）。 しかしながら、自然に高いレベルでhu-p53を発現する、A2.1−発現腫瘍細胞の CTL 系により識別を達成しようとの試みは、インターフェロン−γ(IFN- γ)お よび腫瘍壊死因子−α(TNF- α)両者によるターゲット細胞の予備処理後におい てさえ、成功せず（データは提示せず）、該細胞表面上で発現される、MHC-ペプ チド錯体および付着分子の数両者を増大することにより、特異的細胞溶解を増大 する方法が知られている（フィスク(Fisk)等，Lympho．& Cytokine Res.，1994, 13:125-131; ファディー(Fady)等，Cancer Immunol．Immunother.，1993，37:32 9-336)。このことは、腫瘍細胞系がp53 ペプチドを提示できない可能性があるこ とを示唆しており、またはより確からしいことは、これらが該特定のCTL 細胞系 により認識すべき該p53 ペプチドを、不十分なレベルで発現することを示唆して いる。 マウスCD8 が該ヒトA2.1分子のα-3ドメインと相互作用できないために、A2.1 /Kb-Tg マウス由来のCTL が、A2.1/Kbと比較して、A2.1を発現する細胞の識別に おいて劣っていることに注目すべきである（シャーマン(Sherman)等の上記(1992 )文献; ビチエロ(Vitiello)等の上記(1991)文献; エンゲルハード(Engelhard)等 の上記(1991)文献; イルビン等の上記(1989)文献)。しかしながら、A2.1/Kb-Tg マウス由来のA2.1−制限CTL は、恐らくマウスCD８の関与のない状態での選別並 びに刺激によるものと考えられる（シャーマン(Sherman)等の上記(1992)文献） 、そのターゲット細胞の認識においてCD８に独立であると思われる。CD８独立CT L を示した以前の実験は、ターゲット細胞認識のためにより少量のペプチド抗原 を必要とした(アレクサンダー(Alexander)等，J．Exp．Med.，1991,173:849-858 )。従って、A2.1/Kb-Tg マウス由来のp53-特異的CTL が、関連するペプチドMHC 錯体の限られた数の提示のために、ヒト腫瘍細胞を溶解できないとすれば、A2.1 −トランスジェニック体が、腫瘍細胞により発現された少量のp53-ペプチドを検 出することを可能とする、ペプチド−特異的CTL を与えることができよう。 この仮説を検証するために、hu-p53.149-157(CTL A2 149)および264-272(CTL A2 264)に対して特異的なポリクローナルCTL 細胞系をペプチド−感作A2.1/Kb-T g マウスから樹立した（第10ＥおよびＧ図）。これら両CTL 系は、そのSaos-2/1 75のトランスフェクション生成体の溶解により示されるように、内因的に構成さ れたp53-エピトープを認識した（第10ＦおよびＨ図）。重要なことに、Saos-2/1 75ターゲットのCTL A2 149および264 による溶解の程度は、A2.1/Kb-Tg マウス 由来のCTL により達成される程度よりも高かった（第10Ｂ図対第10Ｆ図；第10Ｄ 図対第10Ｈ図）。また、A2.1/Kb由来のCTL に対して、A2によるT2ターゲットの 等価な溶解を達成するのに必要な、hu-p53.149-157および264-272 ペプチドの 濃度は、それぞれ3-および10−倍低い（第11ＡおよびＢ図を参照のこと）。かく して、A2.1-p53 -ペプチド錯体に対するより高い感度をもつCTL が、A2.1/Kb-Tg マウスとは逆にA2.1-Tg において選別できた。 第11ＡおよびＢ図は、p53-特異的CTL 系によるペプチド識別効率を示す。hu-w t-p53.149-157(第11Ａ図)および264-272(第11Ｂ図）を、A2.1-Tg(CTL A2 149お よびCTL A2 264)並びにA2.1/Kb-Tgマウス(CTL A2/Kb149 およびCTL A2/Kb264)か ら樹立し、E:T 比10:1において、非ペプチドおよびp53.149-157-パルス処理T2タ ーゲット（第11Ａ図）または非ペプチドおよびp53.264-272-パルス処理T2ターゲ ット（第11Ｂ図）に対する溶解活性についてアッセイした。ペプチドは、51Cr標 識後に、T2ターゲットをパルス処理するために使用された。エフェクタ細胞は、 CTL A2 149（黒丸，●）、CTL A2/Kb149（白丸，○）、CTL A2 264（黒角，■） 、およびCTL A2/Kb264(白角，□)であった。これらデータは、4-時間51Cr放出ア ッセイの結果を表し、特異的51Cr放出(%)をペプチド濃度(M)に対してプロットし た。 A2.1−p53-ペプチド錯体に対する見掛け上高いアフィニティーをもつCTL 系を 樹立した後、該A2 149およびA2 264CTL 系を、高いレベルでp53 タンパクを発現 することが知られているヒト腫瘍細胞系（MDA 231 、BT549、SW 480、Ramos A2. 1およびMCF7）の識別についてテストした(第５表)(26-31バーテク(Bartek)等の 上記(1990)文献; ニグロ(Nigro)等の上記(1989)文献; ベイカー(Baker)等の上記 (1990)文献; ロドリゲス(Rodrigues)等の上記(1990)文献; ガイダノ(Gaidano)等 の上記文献(1991); タカハシ(Takahashi)等の上記文献(1993))これらの腫瘍細胞 系は、p53-特異的およびアロ反応性(alloreactive)A2.1−特異的コントロールCT L 両者により溶解された。認識はA2.1−制限的であった。というのは、溶解がA2 .1−特異的抗体により阻害されたからである（第５表）。 第５表は、p53-タンパクを過剰発現するヒト腫瘍細胞系が、A2.1−制限、抗− p53.149-157(CTL A2 149)および抗−p53.264-272(CTL A2 264)CTL 系により溶解 された場合に得られた結果を示す。アロA2.1/KbCTL は、異質反応性A2.1−特異 的エフェクタCTL であり、かつ機能的ヒトCD８α＋β分子を発現するTgマウス(h uCD8-Tg マウス)(シャーマン(Sherman)等の上記(1992)文献)から、huCD8-Tg 脾細胞を、照射されたA2.1/Kb-Tg 脾細胞刺激体と共に6-日間の一次インビトロ 培養により誘導された。RT 427はペプチド−感作(huCD8x A2.1/Kb)ダブル-Tg マ ウスから樹立されたA2.1−制限ポリクローナルCTL 系であり、HIV-1 RTの残基42 7-435 を表す合成ペプチドに対して特異的であった。CTL を、指定したヒト腫瘍 細胞系、ヒト樹状細胞、およびConAまたはPHA-活性化リンパ芽球に対して、6-時 間の51Cr放出アッセイにおいて、細胞毒性につきアッセイした。データは、IFN- γで処理されている(20ng/ml，24時間)、非サイトカイン−処理Ramos およびRam os A2.1ターゲット、MDA 231 ターゲットに対して提示され、また残りのものは 、IFN-γ(20ng/ml，24時間)およびTNF-α(3ng/ml，24時間)両者で処理されてい るものであった。抗−A2.1阻害は、51Cr標識細胞を抗−A2.1モノクローナル抗体 PA2.1(パーハン＆ボッドマー(Parham and Bodmer)，Nature，1978，276:397-8) に対して、飽和かつ非特性濃度において暴露することにより実施した。NDは測定 しなかったことを示す。 無関係の合成ペプチド、RT 427に対して特異的なA2.1−制限CTL 系を、エフェ クタ細胞源として使用した場合には、応答は何等見られなかった。乳癌および直 腸結腸癌細胞系は、抗−p53 CTL による最適の抗原特異的溶解を達成するために は、IFN-γ(MDA 231)またはIFN-γおよびTNF-α両者(MCF 7，BT 549，SW 480)に より予備処理する必要があった。p53-特異的CTL による、非サイトカイン−処理 乳癌および直腸結腸癌細胞系の溶解は、低いものであった（E:T 比10:1において 4%〜14% であった）。MDA 231、MCF７およびSW 480は、クラスＩMHC-制限CTL に よる認識のための、内因的に合成されたペプチドを提示するその能力に欠けてい ない(レスチフィオ(Restifio)等，J．Exp．Med.，1993，177:265-272)こと を考慮すれば、最適の溶解を達成するための、観測されたサイトカインの必要性 は、A2.1により結合されたp53-ペプチドが、Saos-2/175と比較して、これら腫瘍 細胞により比較的低い数で提示されたこと、またA2.1−ペプチド錯体および付着 分子の、サイトカイン処理による高い発現が、TCR-媒介認識およびターゲット細 胞溶解を簡単化するのに必要とされることを示唆した。これとは対照的に、A2.1 (Ramos A2.1)によりトランスフェクションされ、また該トランスフェクション遺 伝子生成物およびp53-タンパク両者の高レベルで発現された（ガイダノ(Gaidano )等の上記(1991)文献）バーキットリンパ腫細胞は、サイトカイン刺激の不在下 でp53-特異的CTL により効果的に溶解された。また、その応答はA2.1−制限性で ある。というのは、トランスフェクションされていないRamosターゲット細胞がp 53-特異的CTL により溶解されなかったからである。 p53-特異的CTL による有意な溶解は、p53-欠失Saos-2細胞、または種々の非− 形質転換ターゲット、例えば樹状細胞（サルスト＆ランツァベッキア(Sallusto and Lanzavecchia)，J．Exp．Med.，1994，179:1109-1118）およびCon A または PHA(第５表)による刺激の３〜４日後に、少量のp53-タンパクを発現することが 示されている、活性化されたリンパ芽球に対しては明白ではなかった。これらの 発見は、サイトカインに暴露した後でさえも、分割しかつ活性化した正常な細胞 は、余りに少ないコピー数でA2.1−結合p53-ペプチドを提示し、これらCTL によ る認識を不可能とすることを示唆している。 簡単に言えば、これらの結果は、A2-Tg マウス由来のCTL による識別のために 十分なレベルで、種々のヒト腫瘍が、p53-由来のペプチドを提示することを立証 している。正常な細胞が溶解されないという観測は、必ずしもp53-ペプチドの提 示の欠失を意味せず、寧ろ該CTL による溶解のための不十分な提示レベルが、こ れら研究において観測された。これは、p53-指向型免疫治療のチャンスを与えて くれる。 p53-過剰発現腫瘍を溶解するのに十分なTCR アフィニティーをもつCTL が、腫 瘍に罹った宿主の直接的感作により得ることができるかどうかは、現時点では未 知である。正常な細胞により発現されるp53-エピトープの濃度は、溶解を検出す るのに十分ではないが、寛容に必要な抗原の量は、エフェクタ細胞の識別に必要 な量よりも少ない(ピアチャー(Pircher)等，Nature，1991，351:482-5;カヤライ ネン(Karjalainen)，Curr．Po．Immunol.，1994，6:9-12)。このような自己寛容 は、形質転換された細胞上のp53-ペプチドを検出するのに十分に高いアフィニテ ィーを有するレセプタを備えたＴ細胞の欠損をもたらす可能性があり、この場合 、免疫療法用の高アフィニティー、hu-p53−特異的TCRsの源として、Tgマウスを 使用する必要がある可能性がある。最後に本例はその議論をp53 に限ったが、こ こに記載する戦略は、悪性腫瘍中で特異的に改善調節する種々の遺伝子生成物の 解析に対して価値があり、またCTL を基準とする免疫療法およびワクチンの設計 のための、有力なターゲットを表す可能性がある。 実施例５：HLA トランスジェニックマウスを使用して同定されたHer-2/Neu 腫瘍抗原 最も一般的な腫瘍特異的CTL の源は、腫瘍浸潤リンパ細胞である。しかしなが ら、このようなCTL を得るために、該腫瘍担持宿主の免疫系に依存する際には、 幾つかの欠点がある。まず、これら細胞の単離および抗−腫瘍活性は、その自然 発生およびインビトロでの増殖に依存している。第二に、これらのCTL は、自己 −寛容を生き長らえさせている特異性の能力限界を示す。自己抗原に対して特異 的な高いアフィニティーをもつ細胞が排除またはアネルギー化され、このような 細胞が、インビボでの腫瘍除去にとって最適ではなくなる可能性のある、残留低 アフィニティー細胞となる恐れがある。第三に、該腫瘍細胞の存在下で、ある期 間の経過後に、Ｔ細胞は、該CD3 錯体またはP56lck分子のζ鎖の発現を負の方向 に導く(down-regulating)により、その機能上の活性を失わしめる可能性がある （ミゾグチ(Mizoguchi)等，Science，1992，258:1795-1798）。これらの考察に 照らして、TAA を指向するCTL を得るための別の源を同定することが重要であろ う。 理想的には、広範なCTL 先駆体の能力範囲を利用することにより、腫瘍−特異 的CTL を獲得することが望まれる。TAA を認識する抗体を開発する上で成功した 戦略（方法）に基づいて(ブロッティアレ(BlottiAre)等，Cancer Res.，1991，5 1:1537-1543)、このような能力範囲は異種間CTL を生成することにより確立で きた。ヒトTAA に対して特異的な異種間CTL は、腫瘍特異的ワクチンのターゲッ トとなり得るクラスＩ関連ペプチドを同定するための手段として機能できる。 ここで、特に、我々は該ヒトHLA-A2およびCD8 分子を発現するトランスジェニ ックマウスを使用して得られる、腫瘍−特異的異種間CTL を説明する。適当なA2 −結合ペプチドにより免疫付与した場合、このようなマウスはA2制限CTL を与え ることができる。Her-2/Neu プロトオンコジーヌ由来のA2−結合ペプチドを、免 疫化のために使用した。プロセッシングされ、かつ異なる起源の種々の腫瘍細胞 系に、HLA-A2との関連で提示される、２種のA2−制限Ｔ細胞エピトープを説明す る。 該Her-2/Neu プロトオンコジーヌの高しルベルでの発現は、悪性形質転換およ び活発な疾患と関連しており、従ってこのタンパクは、上で述べたように、Ｔ細 胞免疫療法における優れたターゲットである。付随的な担体を提供することによ って、該Her-2/Neu 配列由来の更なる潜在的HLA A2.1−結合ペプチドの同定をこ こに記載する。 幾つかのHer-2/Neu ペプチドが、候補Ｔ細胞エピトープとして選択された。各 ペプチドの免疫原性は、該ヒトCD8 およびHLA A2.1分子両者を発現するダブルト ランスジェニックマウスを、これら配列に相当する合成ペプチドで感作すること により評価した。６種のペプチドのうちの僅かに２種のみが、ペプチド−特異的 CTL を誘発する点で、免疫原性であることを見出した。両CTL 集団は、種々の組 織由来のA2.1−発現ヒト腫瘍細胞を特異的に溶解することができた。腫瘍がこれ らのペプチドを表示したことを示す直接的証拠は、細胞表面MHC 分子由来のペプ チドの抽出により得られた。これらのペプチドおよびCTL は、ここに記載するよ うに、ヒトの癌の治療のための新規な方法を開発する際に利用できる。 A．物質および方法 1．マウス 以下のトランスジェニック系は、ザスクリップスリサーチインスティチュート (The Scripps Research Institute;ラジョラ，CA)において確立され、飼育され ている：A2.1/Kb、A2.1、CD８α＋β.57(ビチエロ(Vitiello)等，J．Exp．Med., 1991，173:1007-1015;シャーマン(Sherman)等，Science，1992，258:815-818を も参照のこと）。CD 8α＋β.57 を、A2.1/Kbトランスジェニック体と交雑して 、A2.1/KbxCD8マウスを生成した。該C57BL/6 マウスはザスクリップスリサーチ インスティチュートの飼育コロニーから購入した。 2．細胞系 我々の研究室で生成され、かつこれら研究において使用したトランスフェクシ ョン生成体は、EL4-A2.1/Kb、ジャーカットA2.1/KbおよびジャーカットA2並びに T2-A2/Kb（ビチエロ(Vitiello)等の上記(1991)文献）を包含する。乳癌MCF-７、 MDA-MB-231、BT549;結腸癌SW480;骨肉腫U2-OS;メラノーマMalme-3M、SK-MEL-5； 膠芽腫T98G；卵巣癌OVCAR-5;頸部癌(cervix carcinoma)カスキ(Caski)細胞は全 て、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)から購入した。肝癌Hep-G2 はDr．フランクチサリ(Frank Cisari)（ザスクリップスリサーチインスティチュ ート）から入手した。Saos-175はDr．アーノルドレビン(Arnold Levine)(プリン ストンユニバーシティー)から得た。肺癌細胞NCl-H1355 は、Dr．A.F.ガズダー( Gazdar;ザユニバーシティーオブテキサス，サウスウエスタンメディカルセンタ ー)により提供された。腫瘍細胞系をA2およびHer-2/Neu の細胞表面発現につい て、抗−A2mAb(BB7.2)および抗−c-NEU mAb(AB-5，オンコジーヌサイエンス，ユ ニオンデール，NY)を用いたFACS分析により検討した。 3．ペプチド合成 Her-2/Neu-由来のペプチドを、A2.1により結合したペプチドに対する公知の共 通モチーフに従って、ヒトHer-2/Neu の天然の配列から選択した（ラパート(Rup pert)等，Cell，1993，74:929-937; ヤマモト(Yamamoto)等，Nature，1986，319 :230-234 を参照のこと）。以下の第６表に掲載したペプチドを、以前に記載さ れたように(セッテ(Sette)等，J．Immunol.，1989，142:0035)、ペプチド合成装 置(430A;アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)，フォスター，CA) 上で合成した。これらペプチドの組成および純度をマススペクトルおよびHPLC分 析により確認した。これらペプチドはルーチンワークにより、90% 以上の純度で あることが測定された。 4．A2.1/Kb に対するペプチドのインビトロ結合 各Her-2/Neu 特異的ペプチドがA2.1/Kbと結合する効率を、競合結合アッセイ （上記実施例４参照）において測定した。各テストペプチド(10mg)を、放射性標 識したターゲット細胞(T2-A2.1/Kb，150mCiの51Crにより3TCにて1.5 時間標識し た106 ターゲット細胞）と共に、A2.1/Kbに対して高い結合効率をもつインフル エンザＡウイルスマトリックスタンパクから誘導したペプチド(0.1mg)，M(58-66 )の存在下でインキュベートした(モリソン(Morrison)等，Eur．J．Immunol.,199 2，22:903-907)。ターゲット細胞を、次にマトリックスペプチド−特異的CTLと 共にインキュベートして、パルス処理したターゲット細胞の識別についてアッセ イした。該テストペプチドの該ターゲット細胞に対する結合は、該インフルエン ザA-特異的CTL の該ターゲット細胞を溶解する能力によって示されるように、該 M(58-66)ペプチドの結合の競合的阻害により検出できた。 5．CTL 集団の生成 A2.1/KbxCD8およびA2.1トランスジェニックマウスを、第６表に記載の各ペプ チドにより免疫処理して、これらがA2.1−制限CTL を刺激できるか否かを決定し た。マウスを、100 mlの不完全フロインドアジュバント(IFA)中の100 mgの該Her -2/Neu ペプチドと120 mgの「ヘルパー」ペプチドとの混合物で免疫処理した。 該ヘルパーペプチドは、アミノ酸残基128 〜140 を含む肝炎Ｂウイルスコアタン パクであり、これはまた強力なCD4 ヘルパー応答を誘発する(セッテ(Sette)等， J．Immunol.，1994，153:5586-5592))由来のI-Ab制限ペプチドである。 A2.1/KbxCD8またはA2.1リポポリサッカライド(LPS)-ブラストを、免疫化した マウス由来の脾細胞のインビトロ再刺激体として調製した。これらは、A2.1/Kb またはA2.1マウスの脾細胞を、25mg/ml のLPS および7mg/mlのデキストランサル フェートを含有する完全RPMI中で、1.5x106 細胞/ml なる密度にて、全体積30ml 中で３日間インキュベートすることにより調製した。マウス脾細胞を、免疫処理 の10日後に収穫し、インビトロで、Her-2/Neu 特異的ペプチドと結合している、 照射された(3000 rad)A2/KbまたはA2.1LPS-ブラストにより再刺激した。インビ トロでの再刺激の６日後に、該CTL 集団を、刺激に使用するペプチド(15mM)によ り予備インキュベートしたT2-A2/Kbターゲット細胞に対する溶解活性についてア ッセイした。得られたHer-2/Neu ペプチド−特異的CTL 集団を、毎週再刺激する ことによりインビトロで維持した。CTL 集団を、Her-2/Neu ペプチド(15mM)およ びフィラーとしての5x105 個の照射したC57BL/6 脾細胞(3000 rad)と共に、コン カナバリンＡ刺激ラット脾細胞(TCGF)由来の上澄2%(v/v)を含有する培地中で予 備インキュベートした、0.1-0.2x106 個の照射されたジャーカット−A2.1細胞(2 0,000rad)と共に２mlの培養液中でインキュベートした。（実施例４参照のこと ）。 6．細胞毒性アッセイ 106 個のターゲット細胞を150mCiのナトリウム51Crクロメートで37℃にて90分 間、特異的ペプチドの存在下または不在下でインキュベートした。細胞を３回洗 浄し、5%RPMI中に再懸濁した。アッセイのために、104 個の51Cr−標識したター ゲット細胞を、U-字型の底をもつ96−ウエルのプレート中で最終体積200 mlで、 種々の濃度のエフェクタ細胞と共にインキュベートした。37℃で4-7 時間のイン キュベート後に、上澄を取り出し、以下の式に従って％特異的溶解を測定した。 ％特異的溶解=100X(放出の実験値- 自然放出値)/(最大放出値−自然放出値) 7．細胞毒性の抗−A2遮断 抗−A2mAb(PA2.1)を使用して、CTL 溶解がA2制限であるか否かを決定した（パ ルハン＆ボドマー(Parham and Bodmer)，Nature，1978，276:397-398を参照のこ と）。該エフェクタ細胞の添加前に、腫瘍細胞を、該PA2.1mAb0.5mg/mlの存在下 または不在下でインキュベートした。 8．ペプチド抽出 MHC-結合ペプチドを、ストーカス(Storkus)等(J．Immunol.，1993，151:3719- 3724)により記載されたように、腫瘍細胞の表面から抽出した。簡単に説明すれ ば、密集したMDA-MB-231およびMCF-7 腫瘍細胞を、T175フラスコ中で培養した。 これらの付着性腫瘍細胞をHBSSで２回洗浄し、１分間にフラスコ当たり５mlの酸 性バッファー(0.131M のクエン酸、0.066MのNa2HPO4、pH 3.0)と共にインキュベ ートした。この酸で溶出した上澄を、セップパック(SepPak)C18カートリッジ（ ウォーターズ(Waters)）上で濃縮し、４mlの60% アセトニトリルで溶出した。こ のペプチド処方物を凍結乾燥し、水中に再懸濁し、セントリコン(Centricon)10 （アミコン(Amicon)）フィルタを通して濾過した。 濃縮したペプチドを、0.1%トリフルオロ酢酸で平衡化した、逆相C18 分析カラ ムに流し込み、該ペプチドを線形0-70%(v/v)アセトニトリル濃度勾配下で溶出し た。１分毎の画分を集め、凍結乾燥し、かつ100 mlのPBS に再懸濁し、上記のよ うに抗原性ペプチドの存在についてテストした。 B．結果 1．免疫原性ペプチドの選別 HLA-A2.1(L,I,M,V,A,T位置２およびL,I,M,V,A,T 位置8/9/10）に対するアンカ ーモチーフを含むヒトHer-2/Neu タンパク由来のペプチド配列を同定し、これら の幾つかを合成のために選択した。合成ペプチドの該A2結合効率は、インフルエ ンザマトリックスタンパクペプチドM(58-66)のA2.1に対する結合を阻害する能力 を測定するための競合アッセイにより測定した。このアッセイにおいて、連続的 な競合は、第12図に示されたように、M(58-66)−特異的、A2.1制限CTL クローン による溶解の阻害をもたらした。これらの結果は、合成された全てのHer-2/Neu ペプチドが、該M1ペプチドの結合の阻害により示されるように、実際にA2に結合 できることを実証した。 第12図は、A2.1/Kbに対するペプチドのインビトロ結合を示している。各Her-2 /Neu 特異的ペプチドがA2.1/Kbと結合する効率を、ここに記載する競合的結合ア ッセイにおいて測定した。該テストペプチドの該ターゲット細胞に対する結合は 、インフルエンザA-特異的CTL の該ターゲット細胞を溶解する能力における減少 により証拠付けられるように、インフルエンザA-特異的ペプチドの結合の競合的 阻害により検出できた。該競合ペプチドは、縦軸上に与えられ、溶解の％阻害は 水平軸上に与えられている。データは、該ペプチド各々による溶解の％阻害で与 えられている。阻害なしを71% 溶解で表した。 該Her-2/Neu ペプチドがインビボでの免疫応答を刺激できるか否か決定するた めに、各ペプチドを、A2.1/KbxCD8またはA2.1トランスジェニック(Tg)マウスを 免疫するのに使用した。注射した動物由来の脾細胞を、インビトロにて、インビ ボ感作で使用した該ペプチドによりパルス処理し、照射した同系の細胞により再 刺激した。免疫原性は、これら培養した細胞を、該感作ペプチドでパルス処理し たT2-A2.1/Kbターゲット細胞に対する細胞毒性についてアッセイすることにより 評価した。その結果の概要を、第６表に示した。該H3およびH7ペプチドのみがCT L 応答を刺激できた。HIV ポリメラーゼ由来の関連性のないペプチドに対して特 異的なA2−制限CTL 集団をも、特異性に関するコントロールとして（以下の記載 参照）利用する目的で、確立した。H3−およびH7−特異的CTL 集団は、A2.1/Kbx CD8およびA2.1トランスジェニックマウス両者から樹立した。何れの起源のCTL 集団も、T2ターゲット細胞上のA2.1分子と結合した合成ペプチドの識別における 、同様なドーズ−依存性を示した（第13図参照）。 第13ＡおよびＢ図は、Her-2/Neu 特異的CTL 系によるペプチド識別効率を示す 図である。A2.1-Tg またはA2.1/Kb-Tg マウスから樹立した、H3−およびH7−特 異的CTL を、H3およびH7ペプチドそれぞれに対する溶解活性についてアッセイし た。ペプチドは、指定した濃度にてT2標識ターゲット細胞をパルス処理するため に使用した。％特異的溶解をペプチド濃度（モル濃度）に対してプロットした。 第13Ａ図において、白丸（○）はH7-A2.1/KbxCD8を表し、一方黒丸（●）はH7-A 2.1を表す。第13Ｂ図において、白丸（○）はH3-A2.1/KbxCD8を表し、一方黒丸 （●）はH3-A2.1 を表す。データは、4-時間のアッセイでの、エフェクタ対ター ゲット細胞比(E:T)1:1 における溶解を表す。 2．H3 およびH7特異的CTL によるヒト腫瘍細胞の溶解 該H3およびH7Her-2/Neu 合成ペプチドが、A2.1との関連で内因的にプロセッシ ングされかつ提示されるか否かを決定するために、A2.1およびHer-2/Neu 両者を 発現するヒト腫瘍細胞系を、該ペプチド−誘発CTL 集団用のターゲットとして使 用した。腫瘍細胞系は異なる組織源（胸部、卵巣、結腸、メラノーマ、骨肉腫、 膠芽腫等）を示し、かつA2およびHer-2/Neu の表面発現についてFACS解析により 特徴付けられる（データは提示せず）ように選択された。γ−インターフェロン (γ-IFN; 20ng/ml)＋腫瘍壊死因子−α(TNF- α; 3ng/ml)を補充した培地中にて 、アッセイの前に、腫瘍細胞を24時間予備インキュベートした。腫瘍細胞のこの ような予備処理は、MHC Ｉおよび付着分子、例えばICAM Iの、該細胞の表面上で の発現を増幅し、かくしてCTL による溶解に対するその感受性を高めることが知 られている（例えば、フィスク(Fisk)等，Lympho & Cytokine Res.，1994，13:1 25-131; ファディー(Fady)等，Cancer Immunol．Immunother.，1993，37:329-33 6 を参照のこと）。 これらの細胞毒性実験の結果を第７表にまとめた。これらのデータは、多くの 異なる型のA2.1−発現腫瘍細胞が、H3およびH7特異的CTL により識別されること を示唆している。溶解が、該サイトカイン混合物中での予備インキュベーション により増幅されることが分かり、このことは、該細胞系が抗原提示において高効 率ではないことを示唆している。全ての実験に含まれるのは、該細胞により発現 されない無関係のHIV ペプチドに対して特異的なCTL 集団であった（第６表を参 照のこと）。 この集団の存在下で各ターゲットの示す溶解の程度は、非−特異的バックグラ ウンド溶解を表した。更に、遮蔽実験を、抗−A2mAb 、PA2.1 を用いて実施し、 A2がターゲット細胞識別に関与することを確認した。第14図に示したように、抗 −A2mAb の存在下でのターゲット細胞およびCTL のインキュベーションは、CTL の該腫瘍を特異的に溶解する能力を減じた。 第14Ａ〜Ｄ図は、抗−A2抗体による特異的殺傷の阻害を示す。抗−A2mAb(PA2. 1)を使用して、CTL 溶解がA2制限型であるか否かを決定した。該エフェクタ細胞 の添加前に、腫瘍細胞を、0.5mg/mlのPA2.1 mAb の存在下または不在下でインキ ュベートした。第14Ａ〜Ｄ図の各々において、％特異的溶解を、E:T 比に対して プロットした。第14Ａ図において、黒丸（●）はNCl-H1355 を表し、一方黒角（ ■）はNCl-H1355-PA2.1 を表す。第14Ｂ図において、黒丸（●）はMDA-231 を表 し、一方黒角（■）はMDA-231PA2.1を表す。第14Ｃ図において、黒丸（●）はSA OS-175を表し、一方黒角（■）はSAOS-175-PA2.1を表す。第14Ｄ図において、黒 丸（●）はT98Gを表し、一方黒角（■）はT98G-PA2.1を表す。同様な結果をH3 C TLについて得た（データは提示せず）。 3．腫瘍細胞由来のH3およびH7ペプチドの発現 Her-2/Neu およびHLA A2.1両者の発現が、H3−およびH7−特異的集団によりタ ーゲット細胞を達成するのに必要とされる、という事実は該腫瘍細胞上の該ター ゲットエピトープが、実際に該CTL が元々生成されたものと同一のペプチドであ ることを示唆した。しかしながら、溶解が交叉反応性のエピトープに対して特異 的であることは常に可能性があり、従って我々は、該CTL が実際に、該ヒト腫瘍 細胞により提示される該H3およびH7ペプチドを識別することを確認したかった。 MDA-MB-231およびMCF-7 細胞由来のペプチドは、酸溶出により、該細胞表面上の MHC 分子から抽出され、次いで逆相HPLCにより分画された。T2−A2/Kbターゲッ トは、各HPLC画分の一部によってパルス処理された。 第15図に示したように、該H3 CTLは、MDA-MB-231およびMCF-7 細胞系の何れか からの画分38において溶出されるペプチドを識別し、かつH7 CTLは画分32で溶出 されるペプチドを識別した。これらの位置は合成ペプチドの溶出位置に対応し、 該腫瘍細胞が、これらと同一のペプチドの提示により、溶解されることを確認し ている。 第15Ａ〜Ｄ図は、H3およびH7ペプチドが、腫瘍細胞の表面上に提示されること を示している。MDA-MB-231およびMCF-7 腫瘍細胞系由来のペプチドを、C18 分析 カラムを使用して、本明細書に記載するように、酸溶出により抽出し、かつ分画 した。該HPLC分画に引き続き、これらサンプルを凍結乾燥し、100 μｌのPBS 中 に再懸濁した。MDA-MB-231（第15Ａおよび15Ｃ図）およびMCF-7(第15Ｂおよび15 Ｄ図）由来の各画分50μｌを、T2-A2Kbターゲット細胞をパルス処理するのに使 用し、H3（第15Ａおよび15Ｂ図）およびH7（第15Ｃおよび15Ｄ図）CTL 集団によ り識別するためにアッセイした。データは4-時間アッセイでのE:T 10:1における 溶解を表す。第15Ａ〜15Ｄ図各々において、％特異的溶解が、該HPLC画分各々に 対して示されている。 C．考察 種々の組織由来の腫瘍のもつ抗原の同定は、腫瘍免疫学の主な一つの目標とな っている。腫瘍の広いスペクトルに渡り高いレベルで発現さているタンパク、例 えばp53 およびHer-2/Neu の免疫原性に注目した（例えば、スラモン(Slamon)等 ，Science，1987，235:177-182; デポッター(DePotter)等，Int．J．Cancer，19 89,44:969-974を参照のこと）。本例において、Her-2/Neu 由来の潜在的なA2− 結合ペプチドは、A2−アンカーモチーフに従って選択され、またA2.1−制限応答 を刺激するその能力は、A2−トランスジェニックマウスの免疫付与により評価さ れた。 幾つかの以前の研究は、このような方法の、A2−制限ヒト抗原を同定する際に おける価値が立証されていた。最近幾つかの研究所により、A2.1-Tg マウスが、 HLA-A2.1ヒトCTL により識別される肝炎Ｃ由来の同一のペプチドに応答したこと が報告された（セッテ(Sette)等，J．Immunol.，1994，153:5586-5592; シライ( Shirai)等，J．Immunol.，1995，154:2733-2742）。これは以前の研究を確認し ており、ここではヒトおよびHLA-A2/Kbトランスジェニックマウス両者がインフ ルエンザから同一のA2−制限抗原エピトープを選択することを立証した（ビチエ ロ(Vitiello)等，J，Exp．Med.，1991，173:1007-1015;マン(Man)等，J．Immuno l.，1994，153:4458-67）。 可能な抗原性ペプチドを同定する際のHLA トランスジェニックマウスの使用は 幾つかの利点をもたらす。なかでも、最も明白なのは、インビボで感作する能力 である。このことは、候補抗原性ペプチドの免疫原性をテストする方法を与える ばかりでなく、CTL 集団が比較的高い結合活性をもつことを保証していることで ある。一次CTL をインビトロで刺激する方法が開発されているが、これらの方法 は、しばしば低結合活性のCTL 集団を与え、また限られた量の内在的にプロセッ シングされたペプチドを提示する細胞を溶解できない可能性がある（スペイサー (Speiser)等，J．Immunol.，1992，149:972-980）。ここに記載されるおよびヒ トp53 由来の抗原性ペプチドの研究における結果に基づいて（上記の実施例４参 照）、HLA トランスジェニックマウスのペプチド免疫化によって得られる該CTL は、内在的にプロセッシングされかつ提示されたヒト腫瘍抗原の識別を可能とし た。腫瘍の広いスペクトルに渡り、高いレベルで発現されたタンパク由来の、Ｔ 細胞エピトープの同定は、かかるタンパクを、治療的観点から抗−腫瘍Ｔ細胞応 答のターゲットとして興味がもたれる、腫瘍−関連抗原として規定することを可 能とする。 検討した該Her-2/Neu ペプチドの僅かに２種のみが、動物内での応答の上昇を 可能とした。応答を誘発できなかったものの中には、ヒトTILsによる識別性を基 に以前に同定されたH11 ペプチドが含まれる（ピープルズ(Peoples)等，PNAS US A，1995，92:432-436）。この矛盾に対する理由は、明らかとなっていないが、 幾つかのペプチドに対しては、マウスとヒトとの間に免疫原性における差異があ る可能性を示している。更なる検討を行って、このことが正しいかどうか、また 正しい場合には一般的にはどのように適用できるかを明らかにする必要がある。 しかしながら、フィスク(Fisk)等は、最近ヒトCTL により識別される抗原として Her-2/Neu −由来のノナペプチド(E75)を報告した(J．Exp．Med.，1995，181:21 09-2117)。このE75 配列はH3ペプチドと同一である。このことは、該A2.1-Tg が 、HLA A2ヒトCTL にみられるように、同一のペプチドを認識できることを再度確 認している。該H7ペプチドも、ヒトＴ細胞により認識され得るかを明らかにする ことは興味あることである。 ヒト腫瘍が、該H3およびH7ペプチドをプロセッシングし、かつ提示することを 示す、決定的な証拠は、細胞表面MHC 分子由来のペプチドの酸溶出により得られ た。H3およびH7ペプチドは、テストした異なる２種の腫瘍、即ちMDA 237 および MCF７から得られるペプチドである。他の位置で溶出されるペプチドの認識のた めの基礎は未知である。１以上の活性ペプチドピークの検出は、比較的よくみら れることであり、また他のペプチドとの交叉反応または同等の配列を含有するサ イズの異なるペプチドによるものと考えられる（ウダカ(Udaka)等，Cell，1992, 69:989-998）。 該H3およびH7 CTL集団の、異なる組織由来のA2+Her-2/neu+ ヒト腫瘍を特異的 に殺傷する能力は、該H3およびH7ペプチドが、Her-2/Neu を発現する多くのA2.1 ＋腫瘍により提示されることを示唆している。しかしながら、テストした腫瘍の 間には、溶解量における顕著な差異が存在する。このことは、発現されたHLA-A2 の濃度、抗原のプロセッシングにおけるまたはHer-2/Neu の濃度における変動に よるものである可能性があった。HLA-A2発現を増大することが知られている（フ ィスク(Fisk)等，Lympho．& Cytokine Res.，1994，13:125-131;ニスチコ(Nisti co)等，Cancer Res.，1990，50:7422）サイトカイン類（γ-INF，TNF−α）、抗 原プロセッシング（グライナー(Greiner)等，Cancer Treat．Res.，1990，51:41 3; モルタリニ(Mortarini)等，Int．J．Cancer，1990，45:334）およびICAM発現 の誘導(ファディー(Fady)等，Cancer Immunol．Immunother.，1993，37:329-336 )による該腫瘍の予備処理によって、細胞毒性を増大することができた。効果的 な抗−腫瘍治療としてCTL を使用する可能性は、かかるサイトカイン類の同時− 放出に依存している可能性がある（シュミット−ウォルフ(Schmidt-Wolf)，G.お よびI.G.H.シュミット−ウォルフ(Schmidt-Wolf)，Eur．J．Immunol.，1995，25 :1137-1140)。 Her-2/Neu は、脊椎動物中において高度に保存されている。該H3およびH7ペプ チドによって表される分子の領域は、ラットおよびヒトにおいて同等であり(ヤ マモト(Yamamoto)等，Nature，1986，319:230-234;バーグマン(Bargmann)等，Na ture，1986，319:226-230)、従ってヒトおよびマウスにおいても同等であると考 えられる。このような配列の保存性にも拘らず、これらペプチドは、該トランス ジェニックマウス中で免疫原性であることが証明されている。Her-2/Neu の寛容 性の見掛け上の欠落は、種々の研究グループにより報告されているように(例え ば、イオアナイズ(Ioannides)等，Cellular Immunol.，1993，151:225-234; ヨ シノ(Yoshino)等，Cancer Res.，1994，54:3387-3390)、腫瘍に罹った患者中の Her-2/Neu ペプチドに対して特異的なTILsの存在を説明するであろう。 Her-2/Neu は、胚の段階、成熟組織の段階両者において広範には発現されない ことが知られている(ナタリ(Natali)等，Int．J．Cancer，1990，45:457-461; プレス(Press)等，Oncogene，1990，5:953-962)。ブーン(Boon)等(Ann．Rev．Im munol.，1994，12:337-65)は、Ｔ細胞によって識別される腫瘍抗原が、以下の３ つの群に分類されることを提案した：(1)点変異により生じた新規な配列、(2)生 殖系列の配列に等価であるが、任意の正常な細胞内では発現されない腫瘍抗原、 および(3)特異的分化抗原である腫瘍抗原をコードする遺伝子。Her-2/Neu は、 後者の範疇に属するはずである。正常細胞の自己免疫の如何なる証拠もなしに、 該Her-2/Neu ペプチドに対する免疫応答の検出は、腫瘍免疫療法用のワクチン開 発の可能性を増大する。 特定の態様および実施例を含む上記本明細書の記載は、本発明を例示する目的 で与えられたものであり、本発明を限定するものではない。本発明の真の精神並 びにその範囲を逸脱することなしに、多数の他の変更並びに改良を行うことがで きる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 15/02 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 15/00 Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．インビボで細胞毒性Ｔリンパ細胞を活性化することのできるポリペプチドで あって、該細胞毒性Ｔリンパ細胞(CTLs)が悪性細胞を特異的にターゲットとして 攻撃することを特徴とする、上記ポリペプチド。 ２．該ポリペプチドが、ヒトp53 タンパクから誘導される、請求の範囲第１項に 記載のポリペプチド。 ３．該ポリペプチドが、STPPPGTRV 、LLGRNSFEV およびその配列サブセットから なる群から選ばれるアミノ酸残基配列をもつ、請求の範囲第２項に記載のポリペ プチド。 ４．該ポリペプチドが、Her-2/Neu タンパクから誘導される、請求の範囲第１項 に記載のポリペプチド。 ５．該ポリペプチドが、KIFGSLAFL 、VMAGVGSPYVおよびその配列サブセットから なる群から選ばれるアミノ酸残基配列をもつ、請求の範囲第４項に記載のポリペ プチド。 ６．STPPPGTRV 、LLGRNSFEV 、KIFGSLAFL 、VMAGVGSPYVおよびその配列サブセッ トからなる群から選ばれるCTL エピトープと実質的な相同性を有することを特徴 とするポリペプチド。 ７．製薬上許容される担体を更に含む薬理組成物中に配合された、請求の範囲第 ６項に記載のポリペプチド。 ８．特定のペプチドを表示する腫瘍細胞を溶解できる、特異的細胞毒性Ｔ細胞の 集団。 ９．該ペプチドが外因的に表示される、請求の範囲第８項に記載の集団。 10．該ペプチドが内因的に表示される、請求の範囲第８項に記載の集団。 11．該CTLsが、インビボ免疫化を介して生成される、請求の範囲第８項に記載の 集団。 12．該特異的ペプチドがp53 から誘導される請求の範囲第８項に記載の集団。 13．該特異的ペプチドが、Her-2/Neu から誘導される、請求の範囲第８項に記載 の集団。 14．免疫原的に有効な量の、細胞毒性Ｔ−リンパ細胞−刺激ペプチドを含むこと を特徴とするワクチン。 15．該ペプチドが、STPPPGTRV 、LLGRNSFEV 、KIFGSLAFL 、VMAGVGSPYVおよびそ の配列サブセットからなる群から選ばれるものである、請求の範囲第14項に記載 のワクチン。 16．該ペプチドが担体に結合されている請求の範囲第14項に記載のワクチン。 17．該ペプチドが、ホモポリマーとして哺乳動物中に導入される、請求の範囲第 14項に記載のワクチン。 18．該ペプチドが、ヘテロポリマーとして哺乳動物中に導入される、請求の範囲 第14項に記載のワクチン。 19．活性化されたCTL 細胞をインビボで生成する方法であって、インビボにて、 CTL 細胞と、マウス細胞上で表面発現された、抗原−担持クラスＩ分子とを、抗 原−特異的様式で、該CTL 細胞を活性化するのに十分な期間接触させる工程を含 むことを特徴とする、上記方法。 20．該クラスＩ分子が、ヒトクラスＩMHC 分子である、請求の範囲第19項に記載 の方法。 21．該クラスＩ分子が、キメラヒト−マウスクラスＩMHC 分子である、請求の範 囲第19項に記載の方法。 22．更に、a. 該抗原−担持クラスＩMHC 分子から、該活性化されたCTL 細胞を 分離する工程、 b. 該活性化されたCTL 細胞を、許容される担体または賦形剤中に懸濁する工 程、および c. 該懸濁液を治療を必要とする個体に投与する工程 を含む、請求の範囲第19項に記載の方法。 23．特定の細胞集団をターゲットとして攻撃するであろうCTL 細胞を生成する方 法であって、 a. 該特定の細胞集団に対して特異的な免疫原性ポリペプチドを、動物に投与 して、細胞表面上に、該ポリペプチドを表示する、抗原−担持クラスＩ分子の集 団を生成する工程、 b. インビボで、CTL 細胞の集団と、該抗原−担持クラスＩ分子の集団とを、 抗原−特異的様式で、該CTL 細胞を活性化するのに十分な期間接触させる工程、 および c. 該活性化されたCTL 細胞を、該動物から収穫する工程、 を含むことを特徴とする、上記方法。 24．該ポリペプチドが、LLPENNVLSPL 、RMPEAAPPV 、STPPPGTRV 、LLGRNSFEV お よびその配列サブセットからなる群から選ばれるものである、請求の範囲第23項 に記載の方法。 25．該ポリペプチドが、KIFGSLAFL 、VMAGVGSPYVおよびその配列サブセットから なる群から選ばれるものである、請求の範囲第23項に記載の方法。 26．該クラスＩ分子が、ヒトクラスＩMHC 分子である、請求の範囲第23項に記載 の方法。 27．該クラスＩ分子が、キメラヒト−マウスクラスＩMHC 分子である、請求の範 囲第23項に記載の方法。 28．特異的な活性化されたCTL を使用して、個体中のターゲット細胞を特異的に 殺傷する方法であって、 a. 該個体から、Ｔ細胞を含有する流体サンプルを得る工程と、 b. エンプティークラスＩMHC 分子に、抗原ペプチドの少なくとも１種を担持 させる工程と、ここで該ペプチドは、該ターゲット細胞由来のペプチドの少なく とも一部と実質的に相同である、 c. 該Ｔ細胞と、活性化されたCTL を生成するのに十分な量の、ペプチド−担 持クラスＩMHC 分子とを混合する工程と、 d. 該活性化されたCTL を収穫する工程と、 e. 該活性化されたCTL を該個体に投与する工程、 を含むことを特徴とする、上記方法。 29．腫瘍−関連抗原に、免疫応答を誘発する方法であって、細胞毒性Ｔリンパ細 胞と、STPPPGTRV 、LLGRNSFEV 、KIFGSLAFL 、VMAGVGSPYVおよびその配列サブセ ットからなる群から選ばれるペプチドを含有する分子の、免疫応答を誘発する量 とを接触させる工程を含むことを特徴とする、上記方法。 30．該接触が哺乳動物中で起こる、請求の範囲第29項に記載の方法。 31．該接触がインビトロで起こる、請求の範囲第29項に記載の方法。 32．該方法が更に、該接触させた細胞毒性Ｔ細胞を、該宿主に戻す工程をも含む 請求の範囲第29項に記載の方法。 33．該ポリペプチドを、Ｔヘルパー応答を誘発する第二のポリペプチドと共に、 同時に投与する、請求の範囲第29項に記載の方法。 34．該ポリペプチドおよび該Ｔヘルパー誘発性ポリペプチドが、相互に複合化さ れている、請求の範囲第29項に記載の方法。 35．特定のＴ細胞エピトープに対して応答性の特異的な細胞毒性Ｔ細胞(CTLs)を 同定する方法であって、 a. 個体からリンパ細胞を含むテストサンプルを採取する工程と、ここで該テ ストサンプルは、該特異的CTL の存在につきアッセイされる、 b. ターゲット細胞と、STPPPGTRV 、LLGRNSFEV 、KIFGSLAFL 、VMAGVGSPYVお よびその配列サブセットからなる群から選ばれるペプチドを含有する分子とを接 触させる工程と、ここで該ターゲット細胞は、該特異的なCTL についてテストす べき該リンパ細胞と同一のHLAクラスのものである、 c. 該テストサンプルと、上記工程b.の分子とを、該特異的CTL が適当なター ゲット細胞に対して応答性となるように再刺激するのに十分な条件下で、接触さ せる工程と、 d. 該リンパ細胞のテストサンプルが、該ターゲット細胞に細胞毒性作用を及 ぼすか否かを決定し、かくして該特異的CTL の存在を確認する工程と、 を含む上記方法。 36．組織サンプル中の特異的Ｔ細胞エピトープを結合することのできる、レセプ タをもつ、特異的細胞毒性Ｔ細胞(CTLs)を検出する方法であって、 a. 個体からリンパ細胞を含むテストサンプルを採取する工程と、ここで該テ ストサンプルは、該特異的CTL の存在につきアッセイされる、 b. 該テストサンプルを、標識およびSTPPPGTRV 、LLGRNSFEV 、KIFGSLAFL 、 VMAGVGSPYVおよびその配列サブセットからなる群から選ばれるペプチドとを含有 する分子とを接触させて、混合物を形成する工程と、 c. 該混合物を、適当なアッセイ条件下で、該テストサンプル中の該特異的CT L 全てが、適当なターゲット細胞に対して応答性となるように再刺激するのに十 分な期間維持する工程と、 d. 該接触させた細胞を収穫し、該標識分子の不在下で、あらゆる未結合標識 分子を除去するのに十分に、培地で洗浄する工程と、 e. 適当な測定手段を使用して、該結合した標識分子を測定する工程、 を含むことを特徴とする上記方法。 37．個体中の抗−p53 抗体を検出する方法であって、 a. テストすべき個体から流体サンプルを採取する工程と、 b. 所定量のp53 ポリペプチドを該サンプルに添加して、混合物を生成する工 程と、 c. 該混合物を、生物学的アッセイ条件下に、該p53 ポリペプチドが該サンプ ル中に存在する任意の抗−p53 抗体と免疫反応するのに十分な期間維持する工程 と、 d. 免疫反応生成物の存在についてアッセイして、抗−p53 抗体の存在を確認 する工程、 を含むことを特徴とする、上記方法。 38．該p53 ポリペプチドが、STPPPGTRV 、LLGRNSFEV 、KIFGSLAFL 、VMAGVGSPYV およびその配列サブセットからなる群から選ばれる、請求の範囲第37項に記載の 方法。 39．該p53 ポリペプチドが、STPPPGTRV 、LLGRNSFEV 、KIFGSLAFL 、VMAGVGSPYV およびその配列サブセットからなる群から選ばれる２種またはそれ以上の異なる ポリペプチドを含有する、請求の範囲第37項に記載の方法。 40．キット式のアッセイ装置であって、少なくとも１回のアッセイを実施するの に十分な量で、約50未満のアミノ酸残基を含み、しかもLLPENNVLSPL 、RMPEAAPV 、STPPPGTRV 、LLGRNSFEV およびその配列サブセットからなる群から選ばれる アミノ酸残基配列を含む少なくとも１種のポリペプチドを含有するパッケージを 含むことを特徴とする、上記アッセイ装置。 41．該ポリペプチドが固体マトリックスに固定されている、請求の範囲第40項に 記載のアッセイ装置。 42．該ポリペプチドが、１種以上のポリペプチドを含み、かつ該種が混合物とし て存在する、請求の範囲第40項に記載のアッセイ装置。 43．更に、別々のパッケージ内に、ポリペプチド−含有免疫反応生成物の存在に ついてシグナルを発する、標識された特異的結合試薬をも含有する、請求の範囲 第40項に記載のアッセイ装置。 44．キット式のアッセイ装置であって、少なくとも１回のアッセイを実施するの に十分な量で、腫瘍−関連抗原と免疫反応できる、抗体結合−サイト含有分子を 収容する、パッケージを含むことを特徴とする、上記アッセイ装置。 45．該分子が、固体マトリックスに固定されている、請求の範囲第40項に記載の アッセイ装置。 46．該分子が標識されている、請求の範囲第40項に記載のアッセイ装置。 47．請求の範囲第１項に記載のポリペプチドと免疫反応する抗体分子。 48．該抗体分子が、モノクローナル抗体分子である、請求の範囲第47項に記載の 抗体分子。 49．該抗体分子が、ポリクローナル抗体分子である、請求の範囲第47項に記載の 抗体分子。 50．請求の範囲第47項に記載の抗体分子を、１種以上を含むことを特徴とする組 成物。 51．請求の範囲第47項に記載の抗体を分泌することのできるハイブリドーマ。 52．STPPPGTRV 、LLGRNSFEV 、KIFGSLAFL 、VMAGVGSPYVおよびその配列サブセッ トからなる群から選ばれるCTL エピトープとの実質的な相同性をもつポリペプチ ドを含む分子。 53．該分子が、少なくとも約８個のアミノ酸および約50未満のアミノ酸を含む、 請求の範囲第52項に記載の分子。 54．該分子が、少なくとも約８個のアミノ酸および約13未満のアミノ酸を含有す る、請求の範囲第52項に記載の分子。 55．該ポリペプチドが、該CTL エピトープの何れかのアミノ酸残基配列と実質的 に相同なアミノ酸残基配列をもつ、請求の範囲第52項に記載の分子。 56．該ポリペプチドが物質と複合化されており、該物質が放射性標識、酵素、蛍 光標識、固体マトリックス、担体および第二のCTL エピトープからなる群から選 ばれる、請求の範囲第52項に記載の分子。 57．該物質が第二のCTL エピトープである、請求の範囲第52項に記載の分子。 58．該第二のCTL エピトープが、Ｔヘルパーエピトープである、請求の範囲第52 項に記載の分子。 59．該担体が免疫原性脂質またはタンパクを含む、請求の範囲第52項に記載の分 子。 60．該ポリペプチドが、リンカーにより、該物質と間接的に複合化されている、 請求の範囲第52項に記載の分子。
JP8519293A 1994-12-14 1995-12-14 腫瘍−特異的細胞毒性ｔ細胞のインビボ活性化 Ceased JPH10510988A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US35555894A 1994-12-14 1994-12-14
US08/355,558 1994-12-14
PCT/US1995/016415 WO1996018409A1 (en) 1994-12-14 1995-12-14 In vivo activation of tumor-specific cytotoxic t cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH10510988A true JPH10510988A (ja) 1998-10-27

Family

ID=23397879

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP8519293A Ceased JPH10510988A (ja) 1994-12-14 1995-12-14 腫瘍−特異的細胞毒性ｔ細胞のインビボ活性化

Country Status (8)

Country Link
US (1) US7402314B2 (ja)
EP (1) EP0793501A4 (ja)
JP (1) JPH10510988A (ja)
AU (1) AU712441B2 (ja)
CA (1) CA2207736A1 (ja)
FI (1) FI972514A (ja)
NO (1) NO972729L (ja)
WO (1) WO1996018409A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014526462A (ja) * 2011-09-06 2014-10-06 エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ ポリペプチドワクチン
JP2016539082A (ja) * 2013-09-26 2016-12-15 シェンヅェン サルブリス ファーマシューティカルズ カンパニー リミテッドＳｈｅｎｚｈｅｎ Ｓａｌｕｂｒｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏ．， Ｌｔｄ ポリペプチドワクチンの塩及びその製造方法と該塩を含有する医薬製品

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7252829B1 (en) 1998-06-17 2007-08-07 Idm Pharma, Inc. HLA binding peptides and their uses
US9340577B2 (en) * 1992-08-07 2016-05-17 Epimmune Inc. HLA binding motifs and peptides and their uses
US5801005A (en) * 1993-03-17 1998-09-01 University Of Washington Immune reactivity to HER-2/neu protein for diagnosis of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
EP1767542B1 (en) * 1996-03-21 2016-05-11 Epimmune Inc. HLA-A2.1 binding peptides and their uses
JP4210735B2 (ja) * 1996-03-21 2009-01-21 ファーメクサ インコーポレイテッド Ｈｌａ―ａ２．１結合ペプチド及びその使用
NO315238B1 (no) * 1998-05-08 2003-08-04 Gemvax As Peptider som stammer fra leserammeforskyvingsmutasjoner i TBF<beta>II- eller BAX-genet, og farmasöytiske sammensetninger inneholdende disse,nukleinsyresekvenser som koder for slike peptider, plasmider og virusvektoreromfattende slikenukleinsy
CA2330824A1 (en) * 1998-06-17 1999-12-23 Epimmune Inc. Hla binding peptides and their uses
JP2002526421A (ja) * 1998-10-05 2002-08-20 ジェンザイム・コーポレーション 癌細胞に差別的に発現する癌ワクチン設計のための遺伝子
US7198920B1 (en) 1999-01-29 2007-04-03 Corika Corporation HER-2/neu fusion proteins
DE60042693D1 (de) 1999-08-27 2009-09-17 Genentech Inc Dosierung für die behandlung mit anti erbb2-antikörpern
WO2001078766A1 (de) 2000-04-13 2001-10-25 Bio Life Science Forschungs Und Entwicklungsgesellschaft Mbh Vakzine gegen krebserkrankungen, die sich auf mimotope von auf tumorzellen exprimierte antigenen stützt
US7229623B1 (en) 2000-08-03 2007-06-12 Corixa Corporation Her-2/neu fusion proteins
EP1236740B1 (de) 2001-02-28 2012-07-18 Bio Life Science Forschungs- und Entwicklungsges.m.b.H. Vakzine gegen Krebserkrankungen, die mit dem HER-2/neu Onkogen assoziiert sind
DK1546188T3 (da) * 2001-06-05 2008-10-27 Altor Bioscience Corp P53-bindende T-cellereceptormolekyler og anvendelser deraf
CA2522812C (en) 2003-04-18 2012-08-21 Idm Pharma, Inc. Hla-a2 tumor associated antigen peptides and compositions
US20050048646A1 (en) * 2003-08-25 2005-03-03 Medinet Co., Ltd. Method for inducing cytotoxic T lymphocyte
EP1670513B1 (en) * 2003-10-06 2013-01-23 Cedars-Sinai Medical Center Cox-2 inhibitors and dendritic cells for use in the treatment of cancer.
EP1676132B1 (en) 2003-10-21 2014-01-22 Cedars-Sinai Medical Center Combination of chemotherapy and administration of glioma-antigen-pulsed dendritic cells in the treatment of glioma
US7612162B2 (en) 2004-09-21 2009-11-03 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Peptide analogs capable of enhancing stimulation of a glioma-specific CTL response
EP2084267B1 (en) 2006-09-26 2018-04-11 Cedars-Sinai Medical Center Cancer stem cell antigen vaccines and methods
US8097256B2 (en) 2006-09-28 2012-01-17 Cedars-Sinai Medical Center Cancer vaccines and vaccination methods
MX2009012858A (es) 2007-06-01 2010-02-03 Jackson H M Found Military Med Vacuna para la prevencion de recaidas de cancer de seno.
WO2009108807A1 (en) * 2008-02-26 2009-09-03 The Regents Of The University Of California Glycopeptides and methods of making and using them
US9068020B2 (en) 2008-09-02 2015-06-30 Cedars-Sinai Medical Center CD133 epitopes
ES2618573T3 (es) 2009-05-07 2017-06-21 ImmunoCellular Therapeutics,Ltd Epítopos de CD133
US8075895B2 (en) 2009-09-22 2011-12-13 Janssen Pharmaceutica N.V. Identification of antigenic peptides from multiple myeloma cells
JP2013536240A (ja) 2010-08-24 2013-09-19 ユニヴァーシティ オヴ ピッツバーグ オヴ ザ コモンウェルス システム オヴ ハイアー エデュケーション インターロイキン−１３受容体α２ペプチド脳がんワクチン
PT3536334T (pt) 2012-05-16 2021-09-27 Stemline Therapeutics Inc Vacinas contra o cancro dirigidas a células estaminais cancerígenas
WO2014127296A1 (en) 2013-02-14 2014-08-21 Immunocellular Therapeutics, Ltd Cancer vaccines and vaccination methods
EP3427057A1 (en) 2016-03-07 2019-01-16 H. Hoffnabb-La Roche Ag Detection of anti-p53 antibodies
EP3818083A2 (en) 2018-07-03 2021-05-12 Elstar Therapeutics, Inc. Anti-tcr antibody molecules and uses thereof

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4950598A (en) * 1982-09-22 1990-08-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Process for making T cell hybridomas
US5112948A (en) * 1986-10-10 1992-05-12 Jones C Michael Methods and compositions for inducing monocyte cytotoxicity
US5434247A (en) * 1986-10-10 1995-07-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Peptides for inducing monocyte cytotoxicity in diagnostics
US6419931B1 (en) * 1991-08-26 2002-07-16 Epimmune Inc. Compositions and methods for eliciting CTL immunity
US5679641A (en) 1992-05-26 1997-10-21 Rijksuniversiteit Leiden Peptides of human P53 protein for use in human T cell response inducing compositions, and human P53 protein-specific cytotoxic t-lymphocytes
CA2141960A1 (en) * 1992-08-07 1994-02-17 Ralph T. Kubo Hla binding peptides and their uses
FR2698367B1 (fr) * 1992-11-02 1995-02-17 Eurobio Lab Fragments de la protéine p53 et leurs utilisations dans la détection et le suivi d'états pathologiques.
ATE466869T1 (de) * 1993-03-05 2010-05-15 Epimmune Inc Verfahren zur herstellung von immunogenen hla- a2.1-bindenden peptiden
US5801005A (en) * 1993-03-17 1998-09-01 University Of Washington Immune reactivity to HER-2/neu protein for diagnosis of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014526462A (ja) * 2011-09-06 2014-10-06 エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ ポリペプチドワクチン
JP2016539082A (ja) * 2013-09-26 2016-12-15 シェンヅェン サルブリス ファーマシューティカルズ カンパニー リミテッドＳｈｅｎｚｈｅｎ Ｓａｌｕｂｒｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏ．， Ｌｔｄ ポリペプチドワクチンの塩及びその製造方法と該塩を含有する医薬製品

Also Published As

Publication number Publication date
US20030064916A1 (en) 2003-04-03
EP0793501A1 (en) 1997-09-10
FI972514A (fi) 1997-08-12
NO972729L (no) 1997-08-13
AU4600796A (en) 1996-07-03
EP0793501A4 (en) 2000-05-03
AU712441B2 (en) 1999-11-04
CA2207736A1 (en) 1996-06-20
FI972514A0 (fi) 1997-06-13
NO972729D0 (no) 1997-06-13
WO1996018409A1 (en) 1996-06-20
US7402314B2 (en) 2008-07-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH10510988A (ja) 腫瘍−特異的細胞毒性ｔ細胞のインビボ活性化
US7524930B2 (en) Tumor antigen
JP4102027B2 (ja) Ｈｌａクラスｉｉ分子により提示されるｍａｇｅ−ａ３ペプチド
US8598125B2 (en) CDCA1 peptide and pharmaceutical agent comprising the same
JP4643255B2 (ja) 乳癌および膀胱癌において差次的に発現される遺伝子ならびにコードされるポリペプチド
JP2001516579A (ja) Ｈｌａクラスｉｉ分子により提示されるｍａｇｅ−３ペプチド
JP2003520606A (ja) 癌抗原ｎｙｅｓｏ−１由来の新規ｍｈｃクラスｉｉ拘束ｔ細胞エピトープ
JPH07278193A (ja) 黒色腫関連抗原ポリペプチド、そのエピトープ及び黒色腫のワクチン
US20090208518A1 (en) Immunogenic peptides for the treatment of prostate and breast cancer
JP5198354B2 (ja) メラノーマ関連ペプチド類似体およびメラノーマに対するワクチン
US20040156861A1 (en) Melanoma associated peptide analogues and vaccines against melanoma
TW202340224A (zh) Ｍａｇｅａ１免疫原性肽、識別ｍａｇｅａ１免疫原性肽之結合蛋白及其用途
US20160331818A1 (en) Novel antigen peptide and uses thereof
AU752116B2 (en) In vivo activation of tumor-specific cytotoxic T cells
US20030022820A1 (en) In vivo activation of tumor-specific cytotoxic t cells
AU2022268348B2 (en) Binding proteins recognizing hpv16 e7 antigen and uses thereof
AU1102100A (en) Peptides related to an igf-ii-r epitope, polynucleotides encoding the peptides, and their use in immunomodulation
JPH0959175A (ja) 抗腫瘍免疫活性化剤
JPH05336960A (ja) 抗原特異的ｔリンパ球反応の誘導

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20051122

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20060222

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20060424

A313 Final decision of rejection without a dissenting response from the applicant

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A313

Effective date: 20060710

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20060815