JPH07278193A

JPH07278193A - 黒色腫関連抗原ポリペプチド、そのエピトープ及び黒色腫のワクチン

Info

Publication number: JPH07278193A
Application number: JP7028387A
Authority: JP
Inventors: Gosse Jan Adema; ゴセ・ジヤン・アデマ; Carl Gustav Figdor; カール・ギユスターブ・フイグドール
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Akzo Nobel NV
Priority date: 1994-02-16
Filing date: 1995-02-16
Publication date: 1995-10-24
Anticipated expiration: 2022-01-17
Also published as: AU1227295A; US20030216559A1; DE69533295T2; FI950665A0; KR950032283A; JP3869476B2; ES2224113T3; DK0668350T3; EP0668350B1; CA2142575C; DK0668350T4; EP0668350A1; FI121572B; CA2142575A1; DE69533295T3; EP0668350B2; ATE272113T1; FI950665A; AU697267B2; ES2224113T5

Abstract

(57)【要約】【目的】黒色腫関連抗原を単離し、この抗原及び／ま
たはそのエピトープを黒色腫患者の免疫療法の開発のた
めに使用する。【構成】ｇｐ１００として公知のメラノーマ関連抗原
及び該抗原から誘導されるペプチドを提供する。ｇｐ１
００及びそのペプチドは、メラノーマ治療用のワクチン
に使用し得る。本発明は更に、ｇｐ１００またはｇｐ１
００誘導ペプチドを発現し得る宿主細胞、ｇｐ１００を
特異的に認識する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、及びＴ
ＩＬを含むワクチンもまた提供する。更に本発明は、メ
ラノーマ検出のため及び本発明の予防接種形態をモニタ
ーするための診断キットも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ガンの治療及び診断、
特に黒色腫関連抗原、そのエピトープ、黒色腫のワクチ
ン、抗原を認識する腫瘍浸潤Ｔリンパ球、並びに黒色腫
の検出及びワクチン接種監視のための診断に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようする課題】腫瘍細胞
は、腫瘍遺伝子の活性化及び／又は腫瘍抑制遺伝子の不
活化により制限増殖制御から解放され得る。腫瘍進行の
過程は、種々の’単位特性’、即ち表現型特性で漸進的
で段階的な一連の変化をたどる。その多くが、所定の腫
瘍遺伝子及び／又は腫瘍抑制遺伝子の変容発現により決
定されるか又は少なくともその影響を受けることは知ら
れている。免疫宿主制限からの細胞のエマンシペーショ
ンは、増殖制御からのエマンシペーションと同様の多段
階経路をたどり得る。

【０００３】ガン免疫療法でしばしば見られる問題は、
腫瘍の免疫原性欠如である。免疫制御系のこのような欠
落は、腫瘍細胞に認められる表現型の違い（Ｋｌｅｉ
ｎ，Ｇ．及びＢｏｏｎ，Ｔ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉ
ｎｉｏｎｉｎＩｍｍｕｎｏｌ．５，６８７−６
９２，１９９３に基づきＢｕｒｋｉｔｔリンパ球細胞
で認められた違い）： −抗原の処理／提示能力の低下； −自己由来Ｔ細胞の刺激能力の低下； −形質転換細胞に関連する免疫原タンパク質の完全ダウ
ンレギュレーション； −白血球付着分子又は他の補助分子の発現がないか又は
小さいこと；及び −あるＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩの対立遺伝子の選
択的ダウンレギュレーションに基づくものであると理解され得る。

【０００４】ＭＨＣクラスＩ／ＩＩ抗原はしばしば固体
腫瘍でダウンレギュレートされる。これは、全てのクラ
スＩ／ＩＩの抗原又はその一部分のみに作用し得る。細
胞毒性Ｔリンパ球媒介溶解のために適切な標的細胞を感
作し得るウイルスペプチド及び細胞ペプチドは、ＭＨＣ
クラスＩ抗原の発現レベルが低い細胞で産生されると、
感作できないことがある。細胞毒性感受性は、少なくと
も場合によってはインターフェロンγ及び腫瘍壊死因子
αによりＭＨＣクラスＩ／ＩＩ抗原の発現レベルを増す
ことにより誘発され得る。

【０００５】しかしながら、正常組織から腫瘍組織への
段階的変化の間に、腫瘍関連抗原が出現する。これらの
抗原は、以下に示す種々の機構で解明され得る： −前記抗原は、正常細胞の発達中に何からの方法でマス
キングする分子であり得るが、腫瘍変化が免疫系のため
のマスキング保護の除去を誘発する； −原形質膜から幾つかの分子が欠失すると、所与の膜パ
ッチで隣接分子のプロフィルが変化し、従って実際には
宿主に対して免疫原性となり得る新しいプロフィルを生
じ得る； −腫瘍形質転換を伴う膜変化は、以前は隠されていた分
子の新しい領域を露出させ得るか又は既存分子に新しい
構造的特徴を付加し得る； −腫瘍細胞のシェディング（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）及び崩
壊により、免疫系は、通常細胞内に隠されている核成
分、核小体成分又は細胞質成分にさらされ得る。

【０００６】腫瘍関連抗原の特性は、抗原を保有する腫
瘍の起源に大きく依存する。動物腫瘍に関連する抗原の
存在は今世紀に文献で証明され、ヒトガンの抗原性は、
主に最近のモノクローナル抗体の研究により十分に確立
されている。

【０００７】これらの抗原を単離して、化学特性の分析
を行おうとしたが、重大な困難に遭遇した。困難の多く
は、溶液から抗原を保有する分子を沈殿させるのに適し
た試薬が欠如していることに関係していた。

【０００８】他の多くの刺激と同様に、腫瘍関連抗原
は、特異的及び非特異的な体液及び細胞の両方の防御機
構のひとつではなく、全体を活性化する。腫瘍増殖のｉ
ｎｖｉｖｏ耐性の主要な役割はＴリンパ球が果たして
いる。これらの細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）により
該細胞に示される腫瘍関連抗原を認識し、この認識によ
り活性化され、活性化及び判別により腫瘍細胞を攻撃し
て死滅させる。特定型のこの種のリンパ球は、固体腫瘍
で認められ得る腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）により生成
される。

【０００９】Ｔリンパ球を不溶性担体にｉｎｖｉｔｒ
ｏ結合した抗原物質で活性化し、次いでこれらの活性化
リンパ球を腫瘍患者に投与することは既に提案されてい
る（ヨーロッパ特許第１４７，６８９号）。

【００１０】従来の化学療法は転移性黒色腫患者の治療
では比較的効果がなく、米国では毎年この疾病で約６０
００人の患者が死亡している。

【００１１】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ等（ＮｅｗＥｎｇ．
Ｊ．Ｍｅｄ．３１９（２５），１６７６−１６
８１，１９８８）は、黒色腫患者での自己由来ＴＩＬ
及びインターロイキン−２（ＩＬ−２）による免疫療法
の有効性を示した。

【００１２】この療法は、腫瘍デポジットを切除し、Ｔ
ＩＬを単離し、ＴＩＬをｉｎｖｉｔｒｏ膨張させ、併
用治療中の患者に毒性を誘発する高用量のＩＬ−２を注
入することからなる。

【００１３】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇが使用したＴＩＬは、
黒色腫関連抗原を認識するためのものであり且つこれを
認識し得る。

【００１４】このような黒色腫関連抗原を単離し、この
抗原及び／又はそのエピトープを黒色腫患者の免疫療法
の開発のために使用できるようにすることが本発明者等
の目標である。

【００１５】黒色腫抗原は既に、１２０の黒色腫細胞系
で産生する６種の抗原糖タンパク質及び３種の糖脂質を
同定したＯｌｄ，Ｌ．（１９８１）により発表されて
いる。

【００１６】黒色腫抗原を含むワクチンも記載されてい
る：米国特許第５，０３０，６２１号及び第５，１９
４，３８４号では、黒色腫細胞を培養し、次いで分泌さ
れた黒色腫特異抗原を培地から単離することにより多価
ワクチンが製造されている。

【００１７】黒色腫型ガンの治療や診断用として既に提
案されている特異抗原もある：ペプチドｐ９７は米国特
許第５，２６２，１７７号及び米国特許第５，１４１，
７４２号に開示され、３５ｋＤタンパク質はヨーロッパ
特許第５２９，００７号に記載されている。

【００１８】

【課題を解決するための手段】発明者等は、配列番号２
のアミノ酸配列を含んでいることを特徴とする黒色腫関
連ポリペプチドを発見した。

【００１９】このメラニン細胞系に特異的な抗原ポリペ
プチド（ｇｐ１００とも称する）は、診断に適している
ことが証明されたモノクローナル抗体ＮＫＩ−ｂｅｔｅ
ｂにより認識される。この抗体により認識される抗原
は、約１０ｋｄ（ｇｐ１０）及び１００ｋｄ（ｇｐ１０
０）の細胞内タンパク質である。後者は、黒色腫細胞の
培地でも検出可能である（Ｖｅｎｎｅｇｏｏｒ，Ｃ．
等，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３０，１７９
−１９２，１９８８）。ｇｐ１００抗原が他の黒色腫
特異抗体（例えばＨＭＢ−５０）（Ｖｏｇｅｌ，Ａ．
Ｍ．及びＥｓｃｌａｍａｄｏ，Ｒ．Ｍ．，Ｃａｎ
ｃｅｒＲｅｓ．４８，１２８６−１２９４，１
９８８に記載）、又はＨＭＢ−４５（Ｇｏｗｎ，Ａ．
Ｍ．等，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１２３，１
９５−２０３，１９８６に記載）と反応することも判
明した。これらのモノクローナル抗体と反応するタンパ
ク質は黒色腫細胞でグリコシル化されることが判明して
いるので、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析すると移動度が違う
ことが判明した。

【００２０】これらの細胞内タンパク質が処理され、Ｍ
ＨＣ分子の場合のペプチドとして免疫系の細胞に提示さ
れ得ることが実証されているので、このｇｐ１００抗原
は主に細胞内で発現されるが、適切な免疫原抗原である
ことが確定している。実際、黒色腫患者の腫瘍に由来す
る腫瘍浸潤リンパ球が抗原と反応することが判明した。

【００２１】従って、ｇｐ１００ポリペプチドはガンに
対する細胞応答の潜在的標的であり、従って黒色腫患者
の治療や診断の適切な材料となる。

【００２２】ｇｐ１００は、タンパク質の中央に存在す
る反復性アミノ酸配列を含むトレオニンに富むドメイン
（アミノ酸３０９−４２７）を有する型Ｉのトランスメ
ンブランタンパク質である。伸長性Ｏ−結合グリコシル
化され得るこのトレオニンに富むドメインの前には、ヒ
スチジンに富む領域（アミノ酸１８２−３１３）があ
り、後にはシステインに富むドメイン（アミノ酸４７５
−５６６）が来る。疎水性プロット分析（Ｋｙｔｅ，
Ｊ．及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．，１９８
２）に基づけば、帯電残基を末端に有する単一トランス
メンブランドメインがｇｐ１００のカルボキシ末端部分
（アミノ酸５９１−６１１）に存在する。予測される細
胞質ドメインの長さは４５アミノ酸である。５個の推定
上のＮ−結合グリコシル化部位が存在し、ｇｐ１００
（糖タンパク質）と一致している。

【００２３】“ポリペプチド”という用語は、アミノ酸
の分子鎖を意味し、産生物の特定の長さを意味するもの
ではなく、必要とあれば、例えばグリコシル化、アミド
化、カルボキシル化又はリン酸化によりｉｎｖｉｖｏ
又はｉｎｖｉｔｒｏ改変させることができる。従っ
て、とりわけペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質
がポリペプチドの定義に包含される。

【００２４】もちろん、本発明のポリペプチドの機能的
誘導体及び断片も本発明に包含される。機能的誘導体
は、配列全体のうち１個以上のアミノ酸が、欠失、置
換、逆位又は付加によって異なるポリペプチドを意味す
る。殆ど生物／免疫活性を変化させないと思われ得るア
ミノ酸置換は文献に記載されている。関連アミノ酸間の
アミノ酸置換、即ち進化中にしばしば生じた置換はとり
わけ、Ｓｅｒ／Ａｌａ，Ｓｅｒ／Ｇｌｙ，Ａｓｐ／Ｇｌ
ｙ，Ａｓｐ／Ａｓｎ，Ｉｌｅ／Ｖａｌである（Ｄａｙｈ
ｏｆ，Ｍ．Ｄ．，Ａｔｌａｓｏｆｐｒｏｔｅｉ
ｎｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，
Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎ
ｄ．，ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＤ．Ｃ．，１９７
８，ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３を参照）。Ｌ
ｉｐｍａｎ及びＰｅａｒｓｏｎは、この情報に基づいて
高速感受性タンパク質比較方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ２２
７，１４３５−１４４１，１９８５）を開発し、同
種ポリペプチドの機能的類似性を決定している。

【００２５】モノクローナル抗体ＮＫＩ−ｂｅｔｅｂ又
はＨＭＢ−５０又はＨＭＢ−４５に対して尚免疫活性を
示す機能的誘導体も本発明の範囲に包含される。

【００２６】更には、これらのペプチドの機能的誘導体
は、腫瘍浸潤リンパ球による標的細胞溶解を誘発し得る
ｇｐ１００由来のペプチドを意味する。

【００２７】更には、これらのペプチドの機能的誘導体
は、ペプチドの付加塩、ペプチドのアミド、特にＣ−末
端アミド、エステル（とりわけＣ−末端エステル）、Ｎ
−アシル誘導体（とりわけＮ−末端アシル誘導体）及び
Ｎ−アセチル誘導体を意味する。

【００２８】本発明のポリペプチドは、合成処理により
又は組換えＤＮＡ技術により産生され得る。合成ポリペ
プチドの産生方法は当業界ではよく知られている。

【００２９】ペプチド合成の有機化学方法は、均質相で
の又はいわゆる固相を用いた縮合反応による必要なアミ
ノ酸のカップリングを包含すると考えられる。縮合反応
は以下の方法で実施され得る：ａ）縮合剤の存在下で、遊離カルボキシル基及び保護さ
れた他の反応性基を有する化合物（アミノ酸、ペプチ
ド）を、遊離アミノ基及び保護された他の反応性基を有
する化合物（アミノ酸、ペプチド）と縮合させる；ｂ）活性化カルボキシル基及び遊離した又は保護された
他の反応性基を有する化合物（アミノ酸、ペプチド）
を、遊離アミノ基及び遊離した又は保護された他の反応
性基を有する化合物（アミノ酸、ペプチド）と縮合させ
る。

【００３０】カルボキシル基の活性化はとりわけ、カル
ボキシル基を酸ハロゲン化物、アジ化物、無水物、イミ
ダゾリド又は活性化エステル（例えばＮ−ヒドロキシ−
スクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール
又はｐ−ニトロフェニルエステル）に変換することによ
り実施され得る。

【００３１】前記縮合反応の最も一般的な方法は、Ｔｈ
ｅＰｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎ
ｔｈｅｓｉｓ，ＢｉｏｌｏｇｙＶｏｌ．１−３
（Ｅｄ．Ｇｒｏｓｓ，Ｅ．及びＭｅｉｅｎｈｏｆｅ
ｒ，Ｊ．）１９７９，１９８０，１９８１（Ａｃ
ａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）に記載のよう
なカルボジイミド法、アジ化物法、混合無水物法及び活
性化エステルを用いる方法である。

【００３２】組換えＤＮＡ技術によるポリペプチドの産
生は公知の一般的な方法であるが、多くの可能性があ
り、それにより幾分異なる結果が得られる。発現すべき
ポリペプチドは、ＤＮＡ配列、更に正確に言えば核酸配
列によりコードされる。

【００３３】ｇｐ１００のアミノ酸配列が、Ｋｗｏ
ｎ，．Ｂ．Ｓ．（１９９１）が開示した公知の黒色腫関
連ペプチドｐＭｅｌ１７のアミノ酸配列と非常に類似し
ていることが判明した。

【００３４】ｇｐ１００とｐＭｅｌ１７とのアミノ酸の
違いは、アミノ酸２７４位（Ｔ−Ｃ／ＰＲＯ−ＬＥＵ）
及び５９７位（Ｃ−Ｇ／ＡＲＧ−ＰＲＯ）での置換、並
びに５８７位でｇｐ１００には存在しない７アミノ酸の
伸長からなる。７６２位での単なるヌクレオチドの相違
（Ｃ−Ｔ）はアミノ酸の置換を生じない。ｇｐ１００は
更に、ウシ網膜ｃＤＮＡライブラリーから単離した部分
的ｃＤＮＡクローン（ＲＰＥ−１）からの推定上のタン
パク質と８０％相同であり（Ｋｉｍ，Ｒ．Ｙ．及びＷ
ｉｓｔｏｗ，Ｇ．Ｊ．，１９９２）、ニワトリメラ
ノゾームマトリックスタンパク質ＭＭＰ１１５とは４２
％相同である（Ｍｏｃｈｉｉ，Ｍ．，１９９１）。
図２も参照のこと。

【００３５】ｇｐ１００ポリペプチドをコードする配列
を含んでいる核酸配列も本発明の一部分である。

【００３６】好ましくはｇｐ１００をコードする配列は
配列番号１の配列である。

【００３７】当業界でよく知られているように、遺伝暗
号のデジェネラシーによりコドンの塩基が置換されて
も、その結果依然として同一のアミノ酸をコードする他
のコドンが得られる。例えば、アミノ酸グルタミン酸の
ためのコドンはＧＡＴ及びＧＡＡの両方である。配列番
号２に示すアミノ酸配列でポリペプチドを発現するため
に、このような代替のコドン組成物を有して、配列番号
１に示す核酸配列とは異なる誘導体核酸配列を使用する
ことができることは明白である。

【００３８】本明細書で使用する“核酸配列”とは、任
意長さのポリマー形態のヌクレオチド、即ちリボ核酸
（ＲＮＡ）配列及びデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列の
両方を意味する。一般に、この用語は分子の一次構造を
意味する。従って、この用語は二本鎖ＤＮＡ、一本鎖Ｄ
ＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ及びこれらの変形を
包含している。

【００３９】ｇｐ１００のヌクレオチド配列は２１１５
塩基対（ｂｐ）を含み、１５ヌクレオチドのポリ（Ａ）
領域を末端とする。この末端の前には、コンセンサスポ
リアデニル化配列ＡＡＴＡＡＡが位置する。ヌクレオチ
ド２２から２００７に及ぶ読取り枠（ＯＲＦ）がｇｐ１
００ＤＮＡに存在する。このＯＲＦは、翻訳開始の適
切な配列コンテキスト内でＡＴＧコドンにより開始し、
６６１アミノ酸のタンパク質をコードする。アミノ末端
２０アミノ酸は、シグナル配列（例えば２０位（−１）
でのＡＬＡの後の潜在的な開裂部位を含む）の全ての基
準を満たす。これは、成熟ｇｐ１００が６４１アミノ酸
（約７０ｋＤ）を含んでいることを示す。

【００４０】ｇｐ１００とＰｍｅｌ１７との間のｃＤＮ
Ａの最も顕著な違いは、ｇｐ１００ｃＤＮＡでの２１ｂ
ｐのインフレーム（ｉｎｆｒａｍｅ）欠失である（第２
図）。ゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列をｇｐ１００
ｃＤＮＡの配列と比較すると、ちょうどＰｍｅｌ１７
ｃＤＮＡの２１ｂｐ挿入の位置にイントロン（１０２ｂ
ｐ）が存在することが判明した。エキソン／イントロン
の境界は、コンセンサス５’ドナー及び３’アクセプタ
ースプライス部位配列と十分に適合する（Ｐａｄｇｅｔ
ｔ，１９８６）。ゲノムＤＮＡでは、Ｐｍｅｌ１７
ｃＤＮＡにおける追加の２１ｂｐを含む配列が、ｇｐ１
００ＲＮＡの産生に使用される３’開裂部位のすぐ上
流に位置し、その前には代替の３’アクセプタースプラ
イス部位が位置する。ｇｐ１００特異的３’アクセプタ
ースプライス部位はコンセンサス部位に適合するが、Ｐ
ｍｅｌ１７特異的３’アクセプタースプライス部位は、
ピリミジンに富む領域が欠如している点で次善であるよ
うに思える。次善のＲＮＡプロセッシング部位は、代替
方法で処理された多くのメッセンジャーＲＮＡ前駆体に
存在し、代替のＲＮＡプロセッシングの調節機能に関与
した（Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．Ｒ．，１９９１により再考
察）。総括的には、これらのデータは、ｇｐ１００及び
Ｐｍｅｌ１７のｃＤＮＡに対応する転写が単一の一次転
写の代替スプライシングにより生じることを証明してい
る。

【００４１】本発明の他の部分は、ｇｐ１００ポリペプ
チドの免疫原断片たるペプチドである。

【００４２】免疫原断片はｇｐ１００分子の断片であ
り、この断片は尚、免疫原応答を誘発することができ
る。即ち、断片を特異的に認識する抗体を産生すること
ができるか又はこの断片によって活性化されたＴリンパ
球を見つけることができる。

【００４３】前述したように、腫瘍関連抗原の免疫原作
用がしばしばＴ細胞の活性化機構により引出されること
は知られている（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ａ．Ｒ．Ｍ．及
びＢｏｄｍｅｒ，Ｈ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．７，６０１−６２４，１９８９）。
Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）依存的及びＭＨＣ制限的に
黒色腫細胞を認識する細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が
腫瘍患者から単離されている（Ｋｎｕｔｈ，Ａ．，１
９９２により再考察）。Ｂｒｉｃｈａｒｄ等（１９９
３）は、他のメラニン細胞特異抗原であるチロシナーゼ
由来のペプチドがＣＴＬクローンにより認識されること
を示した。

【００４４】ＭＨＣ分子によるＴ細胞の活性化が、その
短いピース（例えば８−１２マー）がＴリンパ球に提示
される抗原のプロセッシングを必要とすることは知られ
ている。

【００４５】ｇｐ１００配列に位置する免疫原オリゴペ
プチドも本発明の一部を構成する。

【００４６】ＭＨＣＩ分子と結合できるだけでなく、
黒色腫患者から単離した腫瘍浸潤リンパ球を認識するこ
とも実証されたｇｐ１００配列の免疫原ペプチド配列を
見出した。

【００４７】数種のペプチドが見出された：アミノ酸配
列Ｖ−Ｌ−Ｐ−Ｄ−Ｇ−Ｑ−Ｖ−Ｉ−Ｗ−Ｖ，Ｍ−Ｌ−
Ｇ−Ｔ−Ｈ−Ｔ−Ｍ−Ｅ−Ｖ，Ｒ−Ｌ−Ｍ−Ｋ−Ｑ−Ｄ
−Ｆ−Ｓ−Ｖ，（Ｖ）−（Ｗ）−（Ｋ）−Ｔ−Ｗ−Ｇ−
Ｑ−Ｙ−Ｗ−Ｑ−Ｖ−（Ｌ）及びＬ−Ｌ−Ｄ−Ｇ−Ｔ−
Ａ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ｌを有するペプチドが、ＭＨＣＨＬ
Ａ−Ａ２．１分子と結合することが判明した。更には、
最後の２種のペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２．１のコンテキ
ストで抗黒色腫細胞毒性Ｔリンパ球により認識される。

【００４８】これらのペプチドが、非関連配列、即ち本
来は全く関連のない配列によってフランキングされてい
ることが好ましい。何故ならば、このようなフランキン
グが、恐らくはＡＰＣによるより良いプロセッシング及
び提示によって、これらのペプチドの免疫原性を高める
ことが判明しているからである。

【００４９】本発明の他の部分は、前記ペプチドをコー
ドするヌクレオチド配列を含んでいるヌクレオチド配列
により構成される。

【００５０】以下で詳しく説明する組換えＤＮＡ技術に
よるペプチド産生でのこれらの配列の使用に次いで、ｇ
ｐ１００又はそのエピトープについて配列表に開示され
た配列情報を診断のために使用することができる。

【００５１】これらの配列からプライマーを診断試験の
基準として誘導して、核酸増幅技術（例えばそれぞれ米
国特許第４，６８３，２０２号及びヨーロッパ特許第３
２９，８２２号に記載されているポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）又は核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ））
によりｇｐ１００又はｇｐ１００様タンパク質を検出す
ることができる。

【００５２】ＰＣＲを用いる場合、標的ＤＮＡ配列をオ
リゴヌクレオチドプライマーで処理して、プライマー伸
長産物を合成し、熱変性を用いてこれを鋳型から分離
し、分離したものを鋳型として用いて標的配列を増幅さ
せることにより多量のＤＮＡが産生される。ＲＮＡをＰ
ＣＲで増幅すべきときには、まず逆転写酵素を用いてＲ
ＮＡ鎖をＤＮＡ鎖に転写する。

【００５３】ＮＡＳＢＡを用いる場合、多量の一本鎖Ｒ
ＮＡが一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡか
ら産生される。ＲＮＡを増幅すべきときには、ｓｓＲＮ
Ａが、ｓｓＲＮＡポリメラーゼ認識部位を含む第１のプ
ライマーの伸長により第１のＤＮＡ鎖を合成するための
鋳型として機能する。産生されたＤＮＡ鎖は、第２のプ
ライマーの伸長により第２の相補的なＤＮＡ鎖を合成す
るための鋳型として機能する。これにより二本鎖活性Ｒ
ＮＡ−ポリメラーゼプロモーター部位が得られる。第２
のＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼを用いて第１の鋳型で
あるｓｓＲＮＡを多量に合成するための鋳型として機能
する。

【００５４】増幅ヌクレオチド配列の検出は、相補的な
検出プローブを増幅した核酸とハイブリダイズすること
により達成される。このプローブは固相上で標識及び／
又は固定化され得る。ラベルの検出は、当業界で公知の
方法により実施され得る。プローブにより固相に結合し
た核酸の検出は、核酸の選択的検出を可能とする化合物
により実施され得る。

【００５５】前述したように、ヌクレオチド配列は、組
換えＤＮＡ技術によるｇｐ１００又はそのエピトープの
ひとつの産生のために使用され得る。このために、ヌク
レオチド配列は、適切な宿主細胞を形質転換又はトラン
スフェクトするために使用され得るクローニング媒体に
含まれねばならない。

【００５６】多種多様な宿主細胞とクローニング媒体と
の組み合わせを有効に用いて核酸配列をクローニングし
てもよい。例えば、有用なクローニング媒体には、染色
体、非染色体及び合成ＤＮＡ配列［例えば種々の公知の
細菌プラスミドや宿主範囲がより広範なプラスミド（例
えばｐＢＲ３２２、種々のｐＵＣ、ｐＧＥＭ及びｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド）、バクテリオファージ
（例えばλ−ｇｔ−Ｗｅｓ、Ｃｈａｒｏｎ２８及びＭ
１３由来のファージ）、並びにプラスミド及びファージ
又はウイルスＤＮＡ（例えばＳＶ４０、アデノウイルス
もしくはポリオーマウイルスＤＮＡ）の組み合わせに由
来するベクター］が含まれ得る（Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ，
Ｒ．Ｌ．及びＤｅｎｈａｒｄｔ（１９８８）；Ｌｅｎ
ｓｔｒａ，１９９０も参照）。

【００５７】有用な宿主には、細菌宿主、酵母及び他の
真菌、植物又は動物の宿主（例えばチャイニーズハムス
ター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はサル細胞）並びに他の宿主
が含まれ得る。

【００５８】ペプチドの発現に使用されるビヒクルは更
に、該ペプチドをコードする核酸配列に操作可能に連結
された制御配列を含む。かかる制御配列は一般にプロモ
ーター配列と、発現レベルを調節及び／または増強する
配列とを含む。更に、複製開始点及び／または主選択マ
ーカーがかかるビヒクル中に存在することが多い。当然
ながら制御配列及び他の配列は、選択した宿主細胞に従
って変えることできる。

【００５９】宿主細胞を形質転換またはトランスフェク
トする方法は当分野において公知である（例えばＭａｎ
ｉａｔｉｓら，１９８２及び１９８９参照）。

【００６０】ペプチドの情報のほかに、宿主細胞を、前
記ペプチドが結合することが知られているＭＨＣ分子の
情報を担うベクターを用いて同時形質転換または同時ト
ランスフェクトするならば、それは極めて実用的であ
る。ＭＨＣ分子はＨＬＡ−Ａ２．１、ＨＬＡ−Ａ１もし
くはＨＬＡ−Ａ３．１、またはメラノーマ患者に存在す
ることが知られている任意の他のＨＬＡ対立遺伝子であ
るのが好ましい。メラノーマ細胞は、メラノーマ患者由
来のＨＬＡ−Ａ２．１制限細胞障害性Ｔ細胞クローンに
よって認識される抗原を担うことが立証されている（Ａ
ｎｉｃｈｉｎｉＡ．，１９９３）ことから、ＨＬＡ−Ａ
２．１は特に好ましい。

【００６１】ｇｐ１００の発現に特に適した宿主細胞は
ネズミＥＬ４及びＰ８．１５細胞である。（Ｋａｔａｎ
ｏ，Ｍ．，１９８４によって記載されている）ヒトＢＬ
Ｍ細胞は既にＭＨＣ分子ＨＬＡ−Ａ２．１を発現し得る
ので、ｇｐ１００の発現には特に適している。

【００６２】ｇｐ１００または上記ペプチドもしくはそ
れらのヌクレオチド配列のいずれかをメラノーマ治療用
のワクチンに使用し得る。

【００６３】免疫原有効量の活性ペプチドに加え、ワク
チンは医薬的に容認可能な担体または希釈剤を含み得
る。

【００６４】本発明のペプチド、特にオリゴペプチドの
免疫原性は、免疫原性担体分子（即ち、本発明のペプチ
ドが共有結合することができる、患者中で免疫学的応答
を独立に誘発する特性を有する高分子）に架橋またはカ
ップリングすることにより増強し得る。

【００６５】担体分子への共有結合は当分野において公
知の方法を使用して実施し得るが、その厳密な選択は使
用する担体分子の特性によって左右される。免疫原性担
体分子がタンパク質である場合、本発明のペプチドを例
えばジシクロヘキシルカルボジイミドのごとき水溶性カ
ルボジイミドまたはグルタルアルデヒドを使用してカッ
プリングし得る。

【００６６】上述のごときカップリング剤を使用してペ
プチドをそれ自体に、別個の担体分子を使用せずに架橋
することができる。ポリペプチドまたはペプチド凝集体
をもたらす架橋は免疫原性を増強し得る。

【００６７】本発明に有用な医薬的に容認可能な担体ま
たは希釈剤の例としては、ＳＰＧＡのごとき安定化剤、
炭水化物（例えばソルビトール、マンニトール、澱粉、
スクロース、グルコース、デキストラン）、アルブミン
またはカゼインのごときタンパク質、ウシ血清またはス
キムミルクのごときタンパク質含有物質、及び緩衝液
（例えばリン酸緩衝液）が挙げられる。

【００６８】必要によっては、アジュバント活性を有す
る１種以上の化合物をワクチンに添加してもよい。適当
なアジュバントとしては例えば水酸化アルミニウム、リ
ン酸アルミニウムまたは酸化アルミニウム、（例えばＢ
ａｙｏｌＦ^(R)またはＭａｒｃｏｌ５２^(R)の）油性
エマルジョン、サポニンまたはビタミンＥ溶解物が挙げ
られる。

【００６９】本発明のワクチンは特に、静脈内、腹腔
内、鼻腔内、皮内、皮下または筋肉内に与え得る。

【００７０】投与すべき有効量は患者の年齢及び体重並
びにワクチン投与形態に従って変わる。

【００７１】本発明ワクチンを使用して特にＴ細胞応答
を得ることができるが、予防接種後にＢ細胞応答を誘発
することも可能である。その場合、Ｂ細胞応答によりワ
クチンのペプチドに対する抗体が形成されるが、その抗
体は抗原産生源、即ち腫瘍細胞に対するものである。こ
のように腫瘍細胞は両免疫学的系の応答によって応戦さ
れるが故に、これは有利な特徴である。

【００７２】両免疫学的系は、ワクチンが抗原提示細胞
（ＡＰＣ）によってＭＨＣ分子中に提示されるペプチド
を含む場合に、より有効に誘発される。抗原提示は、本
発明のペプチドの１つを負荷された、単球、マクロファ
ージ、指状突起細胞、ランゲルハンス細胞、特に樹状細
胞を使用して行われ得る。ＡＰＣの負荷（ｌｏａｄｉｎ
ｇ）は、本発明ペプチドをＡＰＣの近辺に置くことによ
り行い得るが、ＡＰＣに完全ｇｐ１００抗原を取込ませ
ることがより好ましい。こうして、ｉｎｖｉｖｏ状況
を最も実態に即して模倣した提示が行われる。更に、細
胞によって使用されるＭＨＣは、エピトープを提示する
のに適したタイプのものである。

【００７３】エピトープ提示のためにＡＰＣを使用する
ことの総合的な利点は、これに関して使用されるＡＰＣ
細胞を選択し得ることである。種々のタイプのＡＰＣか
ら、刺激性のＡＰＣや阻害性のＡＰＣがあることが知ら
れている。

【００７４】好ましいのは、所謂「専門的（ｐｒｏｆｅ
ｓｓｉｏｎａｌ）」抗原提示細胞である列挙した細胞タ
イプであって、これらは、抗原提示過程で重要な機能を
果たす同時刺激分子を有することを特徴とする。かかる
同時刺激分子は例えばＢ７、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ７０ま
たは熱安定性抗原（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，１９９２）であ
る。

【００７５】抗原提示細胞としても作用し得ることが判
明している線維芽細胞にはかかる同時刺激分子が欠如し
ている。

【００７６】ｇｐ１００の情報を保有するクローニング
ビヒクルによって既にトランスフェクトされていると共
に、ＭＨＣクラスＩ分子のヌクレオチド配列、例えばＨ
ＬＡ−Ａ２．１、ＨＬＡ−Ａ１またはＨＬＡ−Ａ３．１
をコードする配列を含むクローニングビヒクルによって
同時トランスフェクトされている細胞を使用することも
できる。かかる細胞は抗原提示細胞として作用し、表面
に発現されたＭＨＣクラスＩ分子でｇｐ１００フラグメ
ントを提示する。細胞が上述の同時刺激分子のいずれか
または類似機能を有する分子も発現し得る場合、この提
示は増強されることが考えられる。この発現は、かかる
同時刺激分子をコードする配列情報を有する第３のクロ
ーニングビヒクルを用いて細胞を形質転換またはトラン
スフェクトした結果であり得るが、細胞が既に同時刺激
分子を産生し得たということもあり得る。

【００７７】所望の発現産物のほかに、やはり発現さ
れ、細胞の所望の免疫原性反応に悪影響を及ぼし得る多
数のエレメントを保有する細胞を含むワクチンに代え、
ペプチドが負荷されたＭＨＣ分子を露出すると共に例え
ばリンフォカインが充填されたリポソームを用いてワク
チンを調合することもできる。このようなリポソームは
免疫学的Ｔ細胞反応を誘発する。

【００７８】ｉｎｖｉｖｏで提示されるようにペプチ
ドを提示することにより、増強されたＴ細胞応答が喚起
される。更に、比較的大きな抗原提示細胞の天然アジュ
バント作用により、Ｂ細胞応答も誘発される。このＢ細
胞応答は特にペプチド−ＭＨＣ複合体に対する抗体の形
成をもたらす。この複合体は特に腫瘍細胞中に認められ
るが、患者の腫瘍細胞中ではｇｐ１００のエピトープが
自然に提示され、それがＴ細胞応答を誘発し得ることが
判っている。本発明のペプチドを既に提示するＡＰＣの
予防接種により拡張されるのはこの自然現象である。こ
の拡張により、拡張されたＴ細胞応答が喚起されるだけ
でなく、ＭＨＣ−ペプチド複合体に対する抗体をもたら
すＢ細胞応答も開始される。

【００７９】本発明のワクチンは、予防接種後のＴ細胞
及びＢ細胞の両応答の開始及び維持に増強作用を有する
多数の化合物によって増強され得る。

【００８０】従って、ワクチンにサイトカインを添加す
ることでＴ細胞応答が増強される。適当なサイトカイン
は例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７またはＩＬ−
１２のごときインターロイキン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮ
ＴＥＳ、腫瘍壊死因子、及びＩＦＮ−のごときインター
フェロンである。

【００８１】同様に、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２７及びＣ
Ｄ２８のごときＴ細胞表面抗原に対する抗体も免疫原性
反応を増強する。

【００８２】ＣＤ４⁺ヘルパー細胞またはＣＤ８⁺キラー
細胞を刺激すべくヘルパーエピトープを添加することで
も免疫原性反応は増強される。或いは、他の抗原、例え
ば熱ショック誘導タンパク質またはコレラトキシン由来
のヘルパーエピトープを使用することもできる。

【００８３】本発明の別の部分は、ｇｐ１００反応性腫
瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の使用により形成される。こ
の方法においては、第１ステップは患者から試料を採取
することからなる。これは通常、局所麻酔下に腫瘍デポ
ジットを切除することにより行われる。この被検体中に
存在するＴＩＬを公知の方法（Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｓ．
Ｌ．ら，１９８７）に従って培地中で４〜８週間膨張さ
せる。この培養の間、ｇｐ１００またはｇｐ１００から
誘導されたエピトープの１つとの反応性についてＴＩＬ
を検査する。抗原を認識するＴＩＬを単離し、更に培養
する。

【００８４】上記方法によって得られたｇｐ１００に反
応性を示す腫瘍浸潤リンパ球も本発明の一部を形成す
る。ｇｐ１００及びそのエピトープと特異的に反応する
１つのこのようなＴＩＬ細胞系が明らかとなり、ＴＩＬ
１２００と命名した。このＴＩＬ１２００細胞系は
ＭＨＣ分子ＨＬＡ−Ａ２．１をも発現する。更に、この
細胞系によるＴＣＲ α／β、ＣＤ３及びＣＤ８の発現
も認められた。更にＴＩＬ１２００は、ＨＬＡ−Ａ
２．１及びｇｐ１００の両方を発現するトランスフェク
ト体を認識する。

【００８５】このＴＩＬ１２００及びｇｐ１００を認
識する他のＴＩＬはメラノーマ患者の治療に適してい
る。かかる治療のため、ＴＩＬを上述のごとく培養し、
静脈内注入によって患者に戻す。治療の成功は、全身放
射線照射またはシクロホスファミドを用いた治療によっ
て腫瘍を有する宿主を前処置し、更にインターロイキン
−２（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ら，１９８６）を
同時投与することにより増大され得る。

【００８６】注入により患者に戻されたＴＩＬは自原性
ＴＩＬ（即ち患者自身の腫瘍から誘導されたもの）であ
るのが好ましいが、同種ＴＩＬを用いた注入も考え得
る。

【００８７】上述の方法によって得られたＴＩＬは更に
ｉｎｖｉｖｏ診断にも使用される。ＴＩＬを例えば
¹¹¹Ｉｎ（Ｆｉｓｈｅｒ，１９８９）または任意の他の
適当な診断マーカーで標識し、メラノーマ患者中の腫瘍
デポジットの同定に適したものとする。

【００８８】本発明の別の部分は、ｇｐ１００反応性Ｃ
ＴＬによって発現されるＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）に
よって形成される。当分野において公知のように、ＴＣ
ＲはＣＴＬの特異性を決定する。従って、ＴＣＲ、特に
その可変域をコードするｃＤＮＡを単離し、Ｔ細胞中に
導入し、それによって抗腫瘍活性を任意のＴ細胞に移入
し得る。特に、このようなＴＣＲを自原性Ｔ細胞中に導
入し、次いでかかるＴ細胞を膨張させると、自原性患者
中への養子移入に適した多数のＣＴＬが得られる。

【００８９】このＴ細胞を保有する細胞を予防接種に使
用することもできる。

【００９０】ワクチンは更にｐ１００を発現し得るメラ
ノーマ細胞から調合することもできる。ＮＫＩ−ｂｅｔ
ｅｂのごとき抗ｇｐ１００抗体を使用してかかる細胞を
患者から単離することもできるが、天然のｇｐ１００産
生体であるかまたはｇｐ１００を産生するよう遺伝子操
作された培養メラノーマ細胞系からかかるメラノーマ細
胞を生産することもできる。かかる細胞に放射線を照射
して非腫瘍形成性とし、患者中に注入する（戻す）こと
もできる。かかるメラノーマ細胞の免疫学的作用を増強
するため、それらを、リンフォカイン、好ましくはイン
ターロイキン−２（ＩＬ−２）または顆粒球−マクロフ
ァージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を産生するよ
う遺伝的に変性することが好ましい。ｇｐ１００⁺メラ
ノーマ細胞は、ＩＬ−２またはＧＭ−ＣＳＦの産生をコ
ードする配列を有するクローニングビヒクルを用いてト
ランスフェクトし得る。

【００９１】このようなワクチンを患者に注入するとＣ
ＴＬの形成が刺激される。

【００９２】同様の作用を有する別のタイプの予防接種
は、純粋なＤＮＡ、例えばｇｐ１００抗原またはそれか
ら誘導されるペプチドをコードするＤＮＡ配列を有する
ベクターまたはベクターウイルスのＤＮＡを用いた予防
接種である。一旦注射すると、ウイルスが感染するか、
またはＤＮＡが抗原もしくはペプチドを発現する細胞に
形質転換される。

【００９３】（Ｖ）−（Ｗ）−（Ｋ）−Ｔ−Ｗ−Ｇ−Ｑ
−Ｙ−Ｗ−Ｑ−Ｖ−（Ｌ）及びＬ−Ｌ−Ｄ−Ｇ−Ｔ−Ａ
−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ｌに対する抗体を含む、任意のｇｐ１０
０ペプチドに対する抗体も本発明の一部である。

【００９４】かかるペプチドに対する単一特異性抗体
は、Ｈａｌｌ，Ｒ．ら（１９８４）の方法を改良するこ
とにより多特異性抗血清からアフィニティー精製によっ
て得ることができる。多特異性抗血清は、標準免疫方法
に従ってウサギを免疫することにより得ることができ
る。

【００９５】本明細書に使用される単一特異性抗体と
は、関連抗原に対して均一の結合特性を有する単一抗体
種または複数抗体種であると定義される。本明細書に使
用される均一結合（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓｂｉｎｄ
ｉｎｇ）とは、本発明のリガンド結合ドメインに結合し
得る抗体種の能力を指す。

【００９６】抗体は好ましくはモノクローナル抗体であ
り、より好ましくはヒト化モノクローナル抗体である。

【００９７】モノクローナル抗体は、当分野において公
知の方法（Ｋｏｅｈｌｅｒ，Ｇ．及びＭｉｌｓｔｅｉｎ
Ｃ．，１９７５）によって、同系交配マウス、好まし
くはＢａｌｂ／ｃを適当なタンパク質を用いて免疫する
ことにより調製し得る。次いで、ダルベッコ改良イーグ
ル培地（ＤＭＥＭ）のごとき適当な細胞培地においてヒ
ポキサンチン、チミジン及びアミノプテリン中で増殖さ
せることにより、ハイブリドーマ細胞を選択する。抗体
産生ハイブリドーマを好ましくはＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ
（１９７３）の軟寒天法を使用してクローニングする。
適当な培地で培養するために、個々のコロニーを培養プ
レートのそれぞれのウェル中に移す。適当な免疫原を用
いてスクリーニングすることにより抗体産生細胞を同定
する。免疫原性陽性ハイブリドーマ細胞を当分野におい
て公知の方法によって維持する。ハイブリドーマをｉｎ
ｖｉｔｒｏで培養するかまたは当分野において公知の
方法によってハイブリドーマをマウスに注入した後に腹
水を調製することにより、特異的抗モノクローナル抗体
を生産する。

【００９８】ヒト化抗体を使用することは好ましい。Ｃ
ＤＲ移植のごとき抗体をヒト化する方法が公知である
（Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．Ｔ．ら，１９８６）。本発明のポリ
ペプチドに反応性を示す抗体に対する抗原性応答を回避
する別の可能性は、ヒト抗体またはそのフラグメントも
しくは誘導体を使用することである。

【００９９】ヒト抗体は、単離したＢリンパ球をｉｎ
ｖｉｔｒｏ刺激することで生産することもできるし、少
なくとも１種の本発明のリガンド結合ドメインを用いて
免疫したヒトから採取した（不死化）Ｂリンパ球から単
離することもできる。

【０１００】上述の抗体は、メラノーマ患者の受動予防
接種に使用し得る。この種のワクチンに好ましいタイプ
の抗体は、ＭＨＣ分子に関連して提示される上記ペプチ
ドに対する抗体である。この種の抗体を生産するために
は、ＡＰＣによって提示されるペプチドの免疫が必要で
ある。このような免疫は上述のごとく実施し得る。或い
は、ペプチド−ＭＨＣ複合体に対するヒト抗体を、前記
ペプチドの１つを負荷したＡＰＣからなるワクチンを用
いて処置した患者から単離することもできる。

【０１０１】本発明のワクチンの１つで処置したあとに
形成される抗体を、前記予防接種をモニターするために
使用することもできる。かかる方法においては、患者の
血清を得、予防接種したペプチドに対する抗体を検出す
る。この検出から抗体力価は既知となり、追加予防接種
が必要かどうか判定し得る。

【０１０２】血清中の前記抗体の特異的検出は標識ペプ
チドによって行ない得る。標識は、ｉｎｖｉｔｒｏ診
断分野において公知の任意の診断マーカーとし得るが、
最も好ましいのは（そして広く使用されているのは）酵
素、色素、金属及び放射性核種、例えば⁶⁷Ｇａ、^99mＴ
ｃ、¹¹¹Ｉｎ、^113mＩｎ、¹²³Ｉ、¹²⁵Ｉまたは¹³¹Ｉであ
る。

【０１０３】放射性診断マーカーは、本発明のペプチド
に直接カップリングしてもよいし、或いは、ペプチドに
直接またはリンカーもしくはスペーサー分子を介してカ
ップリングさせたキレート形成部分を介してカップリン
グしてもよい。放射性核種をペプチドまたはペプチド様
構造体にカップリングする方法は、ｉｎｖｉｖｏ及び
ｉｎｖｉｔｒｏ試験に使用されている多数の標識抗体
用法から、（腫瘍）診断分野において既に知られてい
る。

【０１０４】ペプチドの直接標識は例えば１バイアル法
（Ｈａｉｓｍａ，１９８６）に記載のごとく実施し得
る。リンカーまたはスペーサー分子を用いても用いなく
ても、ペプチドをキレート試薬を介して標識する一般方
法は例えば米国特許第４，４７２，５０９号明細書及び
米国特許第４，４８５，０８６号明細書に記載されてい
る。ＤＴＰＡの二環式無水物を使用するキレート試薬は
Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ，Ｄ．Ｊ．ら（１９８３）に記載さ
れている。ジアミドジメルカプチド化合物を介してのカ
ップリングは欧州特許第１８８，２５６号明細書に記載
されている。

【０１０５】

【実施例】添付の図面を参照し、本発明を実施例によっ
て更に説明する。

【０１０６】実施例１−ｇｐ１００分子の特性分析材料と方法細胞及びモノクローナル抗体メラノーマ細胞系Ｍｅｌ−２ａ、Ｍ１４、ＭＥＷＯ、Ｂ
ＬＭ（Ｖｅｎｎｅｇｏｏｒら，１９８９；ｖａｎＭｕ
ｉｊｅｎら，１９９１；Ｂｅａｎら，１９７５；Ｋａｔ
ａｎｏら，１９８４）及びぶどう膜メラノーマ細胞系Ｍ
ｅｌ２０２（Ｋｓａｎｄｅｒら，１９９１）が既に記
載されている。Ｅｉｓｉｎｇｅｒ及びＭａｒｋｏ（１９
８２）の方法に（Ｓｍｉｔら，１９９３）による改良を
加えた方法により、胸または包皮から正常ヒトメラニン
形成細胞を単離した。

【０１０７】ＭａｂｓＮＫＩ−ｂｅｔｅｂ及びＨＭＢ
−５０が既に記載されている（Ｖｅｎｎｅｇｏｏｒ，１
９８８；Ｖｏｇｅｌ及びＥｓｃｌａｍａｄｏ，１９８
８）。ＭＡｂＨＭＢ−４５はＥｎｚｏＢｉｏｃｈｅ
ｍから購入した。

【０１０８】ＤＮＡ構築物及びトランスフェクションｇｐ１００ｃＤＮＡを含む２．２ｋｂのＥｃｏＲＩ
フラグメントを、クレノウＤＮＡポリメラーゼを用いて
末端を充填することによりブラント末端化し、次いで、
真核性発現ベクターｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の
ＳｍａＩ部位に両方向（ｐＳＶＬｇｐ１００＋及びｐＳ
ＶＬｇｐ１００−）でクローニングした。ｐＳＶＬはＳ
Ｖ４０後期プロモーター（ｌａｔｅｐｒｏｍｏｔｅ
ｒ）及びポリアデニル化部位とＳＶ４０複製開始点とを
含み、ＣＯＳ−７細胞中での一時的発現の際に極めて高
いコピー数が可能であった。

【０１０９】３’切欠ｇｐ１００転写単位ｐＳＶＬｇｐ
１００＋（＠ＢＳ）を構築するため、ｇｐ１００ｃＤ
ＮＡの３’部分にあるＢｇｌＩＩ部位と、ベクターの
多重クローニング部位にあるＳａｃＩ部位との間の配
列を欠失させた。得られた構築物は、ｇｐ１００のカル
ボキシ末端の１３３のアミノ酸がベクター配列によって
コードされる４つアミノ酸（Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−
Ｔｈｒ）で置き換えられた切欠ｑｐ１００タンパク質を
コードした。

【０１１０】ＣＯＳ−７細胞中での構築物の一時的発現
は、ＢＲＬ（Ｆｅｌｇｎｅｒら，１９８７）由来のリポ
フェクチン試薬４０μｇ／ｍｌ及び前述のごときＤＮＡ
（Ｌｏｅｎｅｎら，１９９１）７．５μｇを使用して実
施した。

【０１１１】免疫蛍光法上述のごときリポフェクチン／ＤＮＡ混合物を添加した
４８時間後に、トランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞を
免疫蛍光法のために調製した（Ｖｅｎｎｅｇｏｏｒら，
１９８８）。１次抗体と一緒に４５分間インキュベート
した後、細胞を洗浄し、フルオレセインイソチオシアネ
ート（ＦＩＴＣ）標識ヤギＦ（ａｂ）’₂抗マウスＩｇ
Ｇ（Ｎｏｒｄｉｃ）と一緒に３０分間インキュベートし
た。同焦点レーザー走査顕微鏡（ＢｉｏｒａｄＭＲＣ
６００）を使用して４８８ｎｍにおいて調製物を調査
した。

【０１１２】代謝標識、免疫沈降及びＶ８プロテアーゼ
マップ作成プロテインＡ−ＣＬ４Ｂセファロースビーズ（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ）に共有結合したｍＡｂＮＫＩ−ｂｅｔ
ｅｂまたはＨＭＢ−５０のいずれかを使用し、Ｖｅｎｎ
ｅｇｏｏｒら（１９８８）によって記載されているよう
な代謝標識（Ｌ−［³⁵Ｓ］−メチオニン／システイン；
Ａｍｅｒｓｈａｍ）細胞において免疫沈降試験を実施し
た。幾つかの実験においては前標識時にツニカマイシン
（７５μｇ／ｍｌ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を添加し、
代謝標識反応時（１２．５分間）にそのまま存在させ
た。５〜１７．５％ポリアクリルアミド濃度勾配ゲルを
使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥによって還元条件下（ＳＤＳ
試料緩衝液中５％β−メルカプトエタノール）で免疫沈
降物を分析した。タンパク質の相対分子量を、同時電気
泳動した前染色分子量マーカー（ＢＲＬ）を使用して決
定した。オートラジオグラフィー（ＫｏｄａｋＸＡ
Ｒ）の前にゲルを１Ｍサリチル酸ナトリウム（ｐＨ５．
４）を用いて処理した。

【０１１３】Ｃｌｅｖｅｌａｎｄら（１９７７）によっ
て記載されているゲル薄片法におけるタンパク質の消化
を使用し、Ｖ８プロテアーゼのマップを作成した。簡単
に述べると、１００ｋＤのタンパク質を含むゲル薄片を
第２ＳＤＳゲル（１０％）のウェル中に置き、Ｓｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓＶ８プロテアー
ゼ（２．５μｇ／試料，Ｍｉｌｅｓｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ）を重層した。電気泳動後、ゲルを上述のごと
く処理した。

【０１１４】ｇｐ１００／Ｐｍｅｌ１７遺伝子の一部の
分子クローニング既に記載されているプライマー：１４９７／１５１６：
５’−ＴＡＴＴＧＡＡＡＧＴＧＣＣＧＡＧＡＴＣＣ−
３’及び１８３９／１８５７：５’−ＴＧＣＡＡＧＧＡ
ＣＣＡＣＡＧＣＣＡＴＣ−３’（Ａｄｅｍａ及びＢａａ
ｓ，１９９１）を使用し、ｇｐ１００／Ｐｍｅｌ１７遺
伝子の一部を、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）から単離した
ヒトゲノムＤＮＡにおいてＰＣＲ（ＴａｑＤＮＡポリ
メラーゼはＧｉｂｃｏ製）によって増幅した。次いでＰ
ＣＲ産物を、追加ＥｃｏＲＩ部位（５’−ＴＡＴＣＴ
ＡＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＣＣＡＧＡＴＡＣＴＧＡＡＧ−
３’及び５’−ＴＡＴＣＴＡＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＡＧ
ＡＴＧＣＣＣＡＣＧＡＴＣＡＧ−３’）を含むネストさ
れたプライマーセットを使用して増幅した。これらのプ
ライマー中の下線を引いたＥｃｏＲＩ部位は、ｐＵＣ
１８のＥｃｏＲＩ部位においてＰＣＲ産物をクローニ
ングするために使用した。

【０１１５】ＲＮＡの単離及び分析グアニジンチオシアネート法及び塩化セシウムクッショ
ンによる遠心（Ｃｈｉｒｇｗｉｎら，１９７９）を使用
し、全ＲＮＡを単離した。ＧｅｎｅａｍｐＲＮＡＰ
ＣＲキット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ）
を製造業者指示に従って使用し、ｃＤＮＡを調製した。
ｃＤＮＡのＰＣＲ分析を、既に記載されているプライマ
ー１４９７／１５１６及び１８３９／１８５７（上記参
照）（Ａｄｅｍａ及びＢａａｓ，１９９１）を使用して
３ｍＭＭｇＣｌ₂の存在下に３５サイクル実施した。
反応産物をアガロースゲル上でサイズ分画化し、ナイロ
ン膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）上にブロ
ットし、既に記載されている［³²Ｐ］標識オリゴヌクレ
オチドプローブ（Ａｄｅｍａ及びＢａａｓ，１９９１）
にハイブリダイズさせた。プローブとして、本発明者ら
はｇｐ１００特異的エキソン／エキソン接合オリゴヌク
レオチド（５’−ＣＴＴＣＴＴＧＡＣＣＡＧＧＣＡＴＧ
ＡＴＡ−３’）またはＰｍｅｌ１７特異的オリゴヌクレ
オチド（５’−ＴＧＴＧＡＧＡＡＧＡＡＴＣＣＣＡＧＧ
ＣＡ−３’）のいずれかを使用した。後者はＰｍｅｌ１
７ｃＤＮＡ中に存在する追加の２１ヌクレオチドのう
ちの２０個に相当する。全てのハイブリダイゼーション
実験において、Ｐｍｅｌ１７エキソン／エキソン接合
（５’−ＧＣＴＴＡＴＣＡＴＧＣＣＴＧＴＧＣＣＴＧＧ
ＡＴＴＣＴＴＣＴＣＡＣＡＧＧＴ−３’）からなるオリ
ゴヌクレオチドを含むスポットブロットを対照として含
めた。

【０１１６】ヌクレオチド配列分析Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使
用し、ジデオキシ−ヌクレオチド配列法（Ｓａｎｇｅｒ
ら，１９７７）によってｇｐ１００ｃＤＮＡ及びゲノ
ムＤＮＡクローンの配列を決定した。両鎖の配列は各ケ
ースで決定した。ゲノムＤＮＡクローンはＰＣＲ後に得
られたものなので、４つの別個のクローンの配列を決定
した。ＤＮＡ配列分析は、ｔｈｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔ
ｙｏｆＷｉｎｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏ
ｍｐｕｔｉｎｇＧｒｏｕｐ配列分析プログラム（Ｄｅ
ｖｅｒｅｕｘら，１９８４）を使用して実施した。

【０１１７】結果非染色ＣＯＳ−７細胞におけるｇｐ１００ｃＤＮＡの
発現は、ｍＡｂＮＫＩ−ｂｅｔｅｂ、ｍＡｂＨＭＢ
−５０及びｍＡｂＨＭＢ−４５との免疫反応性をもた
らす。

【０１１８】ｇｐ１００陰性であるＢＬＭ黒色腫細胞に
おけるｇｐ１００ｃＤＮＡの発現は、メラノサイト系
統特異的なｍＡｂＮＫＩ−ｂｅｔｅｂ、ｍＡｂＨＭ
Ｂ−５０及びｍＡｂＨＭＢ−４５との免疫反応性をも
たらす。メラノサイト系統以外の細胞におけるｇｐ１０
０−Ｃ１ｃＤＮＡの発現も上記ｍＡｂとの免疫反応性
をもたらすかどうか確認するために、コーディング配向
または非コーディング配向のｇｐ１００ｃＤＮＡを含
む構築体を用いてＣＯＳ−７細胞（サル腎臓線維芽細
胞）における遷移発現（ｔｒａｎｓｉｅｎｔｅｘｐｒ
ｅｓｓｉｏｎ）実験を行なった。コーディング配向のｇ
ｐ１００ｃＤＮＡを含む構築体でトランスフェクトし
たＣＯＳ−７細胞（ＣＯＳ−７／ｐＳＶＬｇｐ１００
＋）のみが３種のｍＡｂ総てと反応する。このようなデ
ータは、ｇｐ１００ｃＤＮＡ発現後にｍＡｂＮＫＩ
−ｂｅｔｅｂ、ｍＡｂＨＭＢ−５０及びｍＡｂＨＭ
Ｂ−４５と免疫反応性となるのはメラノサイト系統細胞
に限らないことを明示している。加えて、上記データ
は、ＣＯＳ発現系がｇｐ１００ｃＤＮＡによってコー
ドされたタンパク質の生化学的特徴を更に明らかにする
のに用いられ得ることも示している。

【０１１９】ｇｐ１００ｃＤＮＡによってコードされ
たタンパク質の解析ｇｐ１００ｃＤＮＡによってコードされたタンパク質
の特徴を明らかにするべくＣＯＳ−７／ｐＳＶＬｇｐ１
００＋細胞を代謝的に標識し、これにｍＡｂＮＫＩ−ｂ
ｅｔｅｂまたはｍＡｂＨＭＢ−５０を用いて免疫沈降
を生起させた。ｍＡｂＮＫＩ−ｂｅｔｅｂ及びｍＡｂ
ＨＭＢ−５０はＣＯＳ−７／ｐＳＶＬｇｐ１００＋細
胞の抽出物から約１００ｋＤのタンパク質を特異的に免
疫沈降させる。前記タンパク質の分子量は代謝的に標識
した、当該抗原を内在的に発現させるＭＥＷＯ細胞の抽
出物から免疫沈降するタンパク質の分子量（Ｖｅｎｎｅ
ｇｏｏｒ等，１９８８）に類似する（後段も参照）。こ
れまでの報告（Ｖｅｎｎｅｇｏｏｒ等，１９８８；Ｖ
ｏｇｅｌ及びＥｓｃｌａｍａｄｏ，１９８８）にも有る
ように、上記両ｍＡｂはＭＥＷＯ黒色腫細胞の抽出物中
に存在する１０ｋＤのタンパク質も認識する。同じ大き
さのタンパク質はＣＯＳ−７／ｐＳＶＬｇｐ１００＋細
胞のｍＡｂＮＫＩ−ｂｅｔｅｂと反応し、かつ長期曝
露後にはｍＡｂＨＭＢ−５０と共に可視となる（図示
せず）。１０ｋＤタンパク質の量は実験毎に甚だしく変
化したことを指摘しておく。上記ｍＡｂが、非コーディ
ング配向のｇｐ１００ｃＤＮＡを含む構築体でトラン
スフェクトしたＣＯＳ−７細胞から調製した抽出物に由
来する場合は、いずれのｍＡｂによっても特異的タンパ
ク質は免疫沈降しない。

【０１２０】黒色腫細胞の培地中にはｍＡｂＮＫＩ−
ｂｅｔｅｂ及びｍＡｂＨＭＢ−５０と反応する約１０
０ｋＤの糖タンパク質も見出されている（Ｖｅｎｎｅｇ
ｏｏｒ等，１９８８；Ｖｏｇｅｌ及びＥｓｃｌａｍａ
ｄｏ，１９８８）。代謝的に標識したＣＯＳ−７／ｐＳ
ＶＬｇｐ１００＋細胞及びＭＥＷＯ細胞の培地を比較す
れば、上記両ｍＡｂがこれらの細胞の培地中に存在する
約１００ｋＤのタンパク質（後段も参照）も認識するこ
とは明らかである。黒色腫細胞に関して示したように、
ＣＯＳ−７／ｐＳＶＬｇｐ１００＋細胞の培地に由来す
るｍＡｂによって１０ｋＤのタンパク質は免疫沈降しな
い。このようなデータは、黒色腫細胞でのように、ＣＯ
Ｓ−７／ｐＳＶＬｇｐ１００＋細胞のｍＡｂＮＫＩ−
ｂｅｔｅｂ及びｍＡｂＨＭＢ−５０によって認識され
る約１００ｋＤのタンパク質が分泌されることを明示し
ている。

【０１２１】ｍＡｂによって検出されるタンパク質がｇ
ｐ１００ｃＤＮＡでのトランスフェクション後に誘導
される内在遺伝子に由来する可能性を排除するために、
３′截頭ｇｐ１００転写単位を発現させるＣＯＳ−７細
胞を用いて免疫沈降実験を行なった（詳細は“物質及び
方法”の項参照）。１２９アミノ酸の欠失に合致して約
８５ｋＤのタンパク質が、上記構築体を発現させるＣＯ
Ｓ−７細胞に由来する上記両ｍＡｂによって免疫沈降す
る。この発見は、ＣＯＳ−７／ｐＳＶＬｇｐ１００＋細
胞のｍＡｂＮＫＩ−ｂｅｔｅｂ及びｍＡｂＨＭＢ−
５０によって認識される１００ｋＤタンパク質がｇｐ１
００ｃＤＮＡによってコードされることの直接の証拠
となる。

【０１２２】ｇｐ１００ｃＤＮＡによってコードされ
る１００ｋＤタンパク質はｇｐ１００と同等であるＣＯＳ−７／ｐＳＶＬｇｐ１００＋細胞のｍＡｂＮＫ
Ｉ−ｂｅｔｅｂ及びｍＡｂＨＭＢ−５０によって同定
される約１００ｋＤのタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
によって解析すると、ＭＥＷＯ細胞のものとは僅かに異
なる移動度を有する。黒色腫細胞においては上記ｍＡｂ
と反応するタンパク質はグリコシル化されることが示さ
れているので（Ｖｅｎｎｅｇｏｏｒ等，１９８８；Ｖ
ｏｇｅｌ及びＥｓｃｌａｍａｄｏ，１９８８）、この相
違はＣＯＳ発現系においてしばしば観察される事象であ
る変形グリコシル化に起因する可能性が有る。このこと
を確認するために、ｍＡｂＮＫＩ−ｂｅｔｅｂを用い
て、グリコシル化阻害剤であるツニカマイシンの存在下
に培養したＭＥＷＯ細胞及びＣＯＳ−７／ｐＳＶＬｇｐ
１００＋細胞からタンパク質を免疫沈降させた。ＣＯＳ
−７／ｐＳＶＬｇｐ１００＋細胞とＭＥＷＯ細胞とのい
ずれにおいても約１００ｋＤの大きさのタンパク質は９
０ｋＤと８５ｋＤとの２個のタンパク質バンドに縮小
し、この事実によって観察された移動度の相違が変形グ
リコシル化に起因することが確認される。

【０１２３】ＣＯＳ−７／ｐＳＶＬｇｐ１００＋細胞及
びＭＥＷＯ細胞のｍＡｂＮＫＩ−ｂｅｔｅｂによって
認識されるタンパク質が同等であることの更に別の証拠
を得るべく、Ｖ８プロテアーゼマッピング実験を行なっ
た。ＣＯＳ−７／ｐＳＶＬｇｐ１００＋細胞またはＭＥ
ＷＯ細胞から単離した主要な１００ｋＤタンパク質をＶ
８プロテアーゼで消化すると同じタンパク質フラグメン
トが得られる。これらのデータから本発明者は、ｇｐ１
００ｃＤＮＡは黒色腫細胞のｍＡｂＮＫＩ−ｂｅｔ
ｅｂ及びｍＡｂＨＭＢ−５０によって認識されるメラ
ノサイト系統特異的な糖タンパク質ｇｐ１００をコード
すると結論する。

【０１２４】ｇｐ１００はＰｍｅｌ１７と高度に相同の
Ｉ型膜透過タンパク質であるｇｐ１００ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を決定した。
この配列は２１１５個の塩基対（ｂｐ）を含み、その末
端部は１５ヌクレオチドのポリ（Ａ）領域で、この領域
の手前に共通ポリアデニル化配列ＡＡＴＡＡＡが位置す
る（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ及びＢｒｏｗｎｌｅｅ，１９７
６）。ｇｐ１００ｃＤＮＡにはヌクレオチド２２から
２００７まで伸長する読み取り枠（ＯＲＦ）が存在す
る。このＯＲＦは、適当な配列コンテクスト内に位置す
る翻訳開始のためのＡＴＧコドンから始まり（Ｋｏｚａ
ｋ，１９８７）、６６１アミノ酸のタンパク質をコード
する（配列番号１）。アミノ末端の２０個のアミノ酸
は、２０位のＡｌａの後に位置する潜在的切断部位を含
めてシグナル配列に関するあらゆる規準に適合し（ｖｏ
ｎＨｅｙｎｅ，１９８６）、このことは成熟したｇｐ
１００が６４１個のアミノ酸を含む（約７０ｋＤに相
当）ことを示唆する。疎水性プロット解析（Ｋｙｔｅ及
びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）によれば、ｇｐ１０
０のカルボキシル末端部（アミノ酸５９１〜６１１）に
は荷電残基によって規定されるただ一つの膜透過領域が
存在する。予測される細胞質領域は４５アミノ酸の長さ
を有する。五つの推定Ｎ末端連結グリコシル化部位が存
在し、このことはｇｐ１００が糖タンパク質であること
に合致する。更に、ヒスチジンに富む領域（アミノ酸１
８２〜３１３）、反復アミノ酸配列を有するトレオニン
に富む領域（アミノ酸３０９〜４２７）、及びシステイ
ンに富む領域（アミノ酸４７５〜５６６）が存在する。

【０１２５】データベース検索（Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬ
ｉｐｍａｎ，１９８８；Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９
０）によって、ｇｐ１００は別のメラノサイト特異的タ
ンパク質Ｐｍｅｌ１７とほぼ同等であることが判明した
（Ｋｗｏｎ等，１９９１）。ｇｐ１００のアミノ酸配列
とＰｍｅｌ１７のアミノ酸配列とは、２７４位（Ｔ−Ｃ
／Ｐｒｏ−Ｌｅｕ）及び５９７位（Ｃ−Ｇ／Ａｒｇ−Ｐ
ｒｏ）のアミノ酸が置き換わっている点、及びＰｍｅｌ
１７の５８７位からの７個のアミノ酸がｇｐ１００には
存在しない点で相違する（図２も参照）。７８２位にお
けるただ１個のヌクレオチドの相違（Ｃ−Ｔ）はアミノ
酸の置換を惹起しない。ｇｐ１００はまた、ウシ網膜ｃ
ＤＮＡライブラリーから単離された部分ｃＤＮＡクロー
ン（ＲＰＥ−１）から推定されるタンパク質と８０％相
同であり（Ｋｉｍ及びＷｉｓｔｏｗ，１９９２）、ニワ
トリメラノソームマトリックスタンパク質ＭＭＰ１１５
とは４２％相同である（Ｍｏｃｈｉｉ等，１９９１）。

【０１２６】ｇｐ１００とＰｍｅｌ１７とはただ一つの
遺伝子によってコードされるｇｐ１００ｃＤＮＡとＰｍｅｌ１７ｃＤＮＡとの最
も顕著な相違は、ｇｐ１００ｃＤＮＡにおける２１ｂ
ｐの読み取り枠内欠失である。この相違は、例えば緊密
に関連する２種の遺伝子が存在するためと説明すること
ができる。しかし、上記両ｃＤＮＡは翻訳されないその
３′領域に同等のヌクレオチド配列を有するので、この
説明が当を得ているとは考えられない。別の可能性とし
て、両ｃＤＮＡがただ一つの一次転写物の択一的スプラ
イシングによって得られる転写物に対応するということ
が考えられる。この仮説を検証するべく、ＰＣＲを用い
てｇｐ１００遺伝子の推定の択一的スプライス部位を囲
繞する部分に対応するゲノムＤＮＡを解析した。このゲ
ノムＤＮＡのヌクレオチド配列をｇｐ１００−ｃ１ｃＤ
ＮＡの配列と比較したところ、Ｐｍｅｌ１７ｃＤＮＡ
において２１ｂｐが挿入されたまさにその位置にイント
ロン（１０２ｂｐ）が存在することが判明した（図
１）。エキソン／イントロン境界部は、５′供与及び
３′受容スプライス部位の共通配列に良く適合する（Ｐ
ａｄｇｅｔｔ等，１９８６）。上記ゲノムＤＮＡにおい
て、Ｐｍｅｌ１７ｃＤＮＡの付加的な２１ｂｐを含む
配列はｇｐ１００ＲＮＡの調製に用いられる３′切断
部位にその上流側で隣接し、この配列の手前に択一的
３′受容スプライス部位が位置する（図１）。ｇｐ１０
０特異的な３′受容スプライス部位が共通配列に適合す
る一方、Ｐｍｅｌ１７特異的な３′受容スプライス部位
はピリミジンに富む領域を欠く点で次善のものと考えら
れる（図１）。次善のＲＮＡプロセッシング部位は択一
的プロセッシングを施される多くのメッセンジャーＲＮ
Ａ前駆体に存在し、択一的ＲＮＡプロセッシングの調節
機能と関係付けられている（Ｇｒｅｅｎの観察，１９９
１）。これらのデータは全体として、ｇｐ１００ｃＤ
ＮＡ及びＰｍｅｌ１７ｃＤＮＡに対応する転写物がた
だ一つの一次転写物の択一的スプライシングによって得
られ、即ちただ一つの遺伝子に由来することを証明す
る。

【０１２７】メラノサイト系統の細胞におけるｇｐ１０
０ＲＮＡ及びＰｍｅｌ１７ＲＮＡの発現ｇｐ１００ＲＮＡ及びＰｍｅｌ１７ＲＮＡがただ一
つの一次転写物の択一的スプライシングによって得られ
るという発見は、この事象が発生上規則的に生起するの
かどうかという疑問をもたらす。メラノサイト細胞から
単離されたＲＮＡを含有するノザンブロット上でｇｐ１
００ｃＤＮＡによって検出される主要なＲＮＡ生成物
は、２．５ｋｂのＲＮＡ種である。プローブとしてＰｍ
ｅｌ１７ｃＤＮＡを用いたＫｗｏｎ等（１９８７）によ
っても同じ結果が得られた。しかし、上記プローブはい
ずれもｇｐ１００ＲＮＡとＰｍｅｌ１７ＲＮＡとを
識別しない。メラノサイト系統の細胞におけるｇｐ１０
０ＲＮＡ及びＰｍｅｌ１７ＲＮＡの発現を調べるべ
く、逆転写酵素／ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ／ＰＣ
Ｒ）アッセイを行ない、その後サザンブロッティング、
及びｇｐ１００特異的なエキソン／エキソン連結プロー
ブまたはＰｍｅｌ１７特異的なオリゴヌクレオチドプロ
ーブへのハイブリダイゼーションを行なった（“物質及
び方法”の項参照）。４種の皮膚黒色腫細胞のうちの３
種と、ブドウ膜黒色腫細胞と、新生児及び成人メラノサ
イトとにおいてｇｐ１００とＰｍｅｌ１７との両方のス
プライシング生成物が検出される。ｇｐ１００陰性のＢ
ＬＭ黒色腫細胞では、いずれのプローブを用いても生成
物は検出されない。これらの結果は、試験した総てのメ
ラノサイト細胞においてｇｐ１００ＲＮＡとＰｍｅｌ
１７ＲＮＡとが同時に発現することを明示している。

【０１２８】実施例２―ＴＩＬによるｇｐ１００の認識物質及び方法細胞培養物転移性黒色腫のｓｉｂｇｌｅ細胞懸濁液を１，０００Ｕ
／ｍｌのＩＬ−２（ＣｅｔｕｓＣｏｒｐ．，Ｅｍｅ
ｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）の存在下に増殖させてＴＩＬ
を得、これを先に述べた方法（Ｋａｗａｋａｍｉ，１９
９２）で増殖させた。黒色腫細胞系Ｍｅｌ３９７及び
Ｍｅｌ６２４を得、これらを先に示した方法（Ｋａｗ
ａｋａｍｉ，１９９２）で増殖させた。ＨＬＡ−Ａ２．
１⁺黒色腫細胞系ＭｅＷｏ（Ｂｅａｎ，１９７５）及び
ＢＬＭ（Ｋａｔａｎｏ，１９８４）並びにマウスＰ８１
５トランスフェクト体は、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｐ
ａｉｓｌｅｙ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ＵＫ）に７．５
％熱失活ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）を加えた中で増殖させ
た。ＪＹ、Ｋ５６２及びマウスＥＬ４トランスフェクト
体は、Ｉｓｃｏｖｅｓ培地（Ｇｉｂｃｏ）に７．５％
ＦＣＳを加えた中で培養した。マウス細胞は５×１０⁵
Ｍ β−ＭＥの存在下に増殖させ、いずれの培地にも抗
生物質を含有させた。正常なメラノサイトは、Ｅｉｓｉ
ｎｇｅｒ及びＭａｒｋｏの方法（１９８２）を先に述べ
たように改良した方法（Ｓｍｉｔ，１９８９）で包皮か
ら単離した。２回目から３回目の継代培養で得られたメ
ラノサイトをクロム放出アッセイで用いた。

【０１２９】ＤＮＡ構築体及びトランスフェクションコーディング配向のλ ｇｐ１００ｃＤＮＡクローン
のＥｃｏＲＩ断片をポリリンカーｐＢＪ１−ｎｅｏ中で
クローニングすることにより、プラスミドｐＢＪ１ｇｐ
１００ｎｅｏを得た（Ｌｉｎ，１９９０）。ＨＬＡ−Ａ
２．１及びヒトβ−２ミクログロブリンをコードするゲ
ノム断片を含むプラスミドｐＢＡ２はＥ．Ｊ．Ｂａ
ａｓ（ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓＣａｎｃｅｒ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＤｉｖｉｓｉｏｎｏｆＢ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔ
ｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から、その好意によっ
て提供を受けた。プラスミドｐＧＫ−ｈｙｇはハイグロ
マイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含む（Ｔｅ
Ｌｉｅｌｅ，１９９０）。ＨＬＡ−Ａ２．１遺伝子及
びヒトβ−２ミクログロブリン遺伝子導入のためにＥＬ
４細胞を、リン酸カルシウムトランスフェクション系
（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｂａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，
ＭＤ）を用いてリン酸カルシウム共沈法（Ｇｒａｈａ
ｍ，１９７３）に従い１８μｇのｐＢＡ２及び２μｇの
ｐＧＫ−ｈｙｇＤＮＡでトランスフェクトした。トラ
ンスフェクションの２４時間後、安定なトランスフェク
ト体を選択するべく培地に５００μｇ／ｍｌのハイグロ
マイシンＢ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃ
ｈｅｍＣｏｒｐ．，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）を
添加した。安定なＨＬＡ−Ａ２．１⁺ ＥＬ４クローン
をリン酸カルシウム共沈により２０μｇのｐＢＪ１ｇｐ
１００ｎｅｏＤＮＡでトランスフェクトしてＨＬＡ−
Ａ２．１⁺ ｇｐ１００⁺ ＥＬ４細胞を得、これを１ｍ
ｇ／ｍｌのＧ４１８で選択した。Ｐ８１５Ａ２．１及
びＰ８１５Ａ２．１／ｇｐ１００細胞はＰ．Ｃｏｕ
ｌｉｅ（ＬｕｄｗｉｇＩｎｓ．，Ｂｒｕｓｓｅｌ
ｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）から、その好意によって提供を
受けた。

【０１３０】ｍＡｂ及び流動細胞計測法間接免疫蛍光法を実施し、続いてＦＡＣＳｃａｎ（登録
商標）（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃ
ｏ．，ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，ＣＡ）を用い
て流動細胞計測法を実施することにより、黒色腫、トラ
ンスフェクト体及び正常なメラノサイトの表現型分析を
行なった。精製した抗ｇｐ１００ｍＡｂのＮＫＩ−ｂ
ｅｔｅｂ（Ｖｅｎｎｅｇｏｏｒ，１９８８）並びに抗Ｈ
ＬＡ−Ａ２ｍＡｂのＢＢ７．２（培養物上清；Ｐａｒ
ｈａｍ，１９８１）及びＭＡ２．１（腹水１：５００稀
釈物；Ｐａｒｈａｍ，１９７８）を一次試薬として用
いた。第二のインキュベーションのためにはＦＩＴＣ結
合ＧＡＭ−ＩｇＧ−Ｆ（ａｂ′）₂（ＺｙｍｅｄＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓ．Ｓａｎ
Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を用いた。細胞内ｇｐ１
００抗原検出のために、細胞を０．０１％ジギトニン中
で透過性とし、その後１％パラホルムアルデヒド中で固
定した。

【０１３１】クロム放出アッセイクロム放出アッセイを先に述べたように行なった（Ｋａ
ｗａｋａｍｉ，１９９２）。手短に言えば、１０⁶個の
標的細胞を１００μＣｉのＮａ⁵¹ＣｒＯ₄（Ａｍｅｒｓ
ｈａｍＩｎｔ．，Ｂｕｃｋｓ，ＵＫ）と共に１時
間インキュベートした。次に、丸底マイクロタイタープ
レート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｂａｄｈｏｅｖｅｄｏｒｐ，
ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）の三つ組ウェル内
に配置した２×１０³個の標的細胞に様々な量のエフェ
クター細胞を、最終的な量が１５０μｌとなるように添
加した。インキュベーションの５時間後、上清の一部を
収穫してその放射性物質含量を測定した。標的細胞は、
クロム放出アッセイに用いる前に５０Ｕ／ｍｌのヒト
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｇ
ｅｒｍａｎｙ）またはマウス（ＴＮＯ，Ｒｉｊｓｗｉ
ｊｋ，ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）組み換え体
ＩＦＮと共に４８時間インキュベートした。

【０１３２】ＴＩＬ１２００ｇｐ１００特異的な細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の探
索において、本発明者は制限要素としてＨＬＡ−Ａ２．
１に注目したが、なぜならＨＬＡ−Ａ２．１は白色人種
が一般的に有する抗原であり、かつ黒色腫に対するＣＴ
Ｌの反応において主要な役割を果たすと推定されるから
である。この研究にはＨＬＡ−Ａ２．１⁺ ＴＩＬ系の
ＴＩＬ１２００（Ｓｈｉｌｙａｎｓｋｙ，Ｊ．等，
１９９４）を用いた。このＴＩＬ系はＴＣＲ α／β、
ＣＤ３及びＣＤ８を発現させる。

【０１３３】結果ＴＩＬ１２００が黒色腫腫瘍細胞をＨＬＡ−Ａ２．１
の制限下に死滅させることはｇｐ１００の発現に対応す
る一群のヒト黒色腫細胞系を用いて、ＴＩＬ１２００
の細胞溶解活性を分析した。ＴＩＬ１２００は、いず
れもｇｐ１００を発現させるＨＬＡ−Ａ２．１⁺のＭｅ
ｌ６２４及びＭｅＷｏ黒色腫腫瘍細胞を有効に溶解さ
せたが、ＨＬＡ−Ａ２．１^- ｇｐ１００⁺ Ｍｅｌ３
９７細胞への反応性は認められなかった。ＨＬＡ−Ａ
２．１⁺ ＢＬＭ黒色腫細胞もＴＩＬ１２００による
溶解に対して耐性であることを観察したということが興
味深く指摘される。更に、やはりｇｐ１００を発現させ
ないＨＬＡ−Ａ２．１⁺のＥＢＶ形質転換Ｂ細胞（Ｊ
Ｙ）、及びＫ５６２細胞がＴＩＬ１２００によって溶
解しなかった。これらのデータは全体として、ＴＩＬ
１２００がＨＬＡ−Ａ２．１の制限下に細胞の死滅を実
現し、その際前記死滅はｇｐ１００の発現と相関するこ
とを明示している。

【０１３４】ＴＩＬ１２００はＨＬＡ−Ａ２．１ ⁺
ｇｐ１００⁺トランスフェクト体を認識するＨＬＡ−Ａ２．１をコードするゲノム断片と、ハイグロ
マイシン耐性をもたらすプラスミドとで同時にトランス
フェクトしたＥＬ４細胞を流動細胞計測法で選択及び分
析した。その後、ＨＬＡ−Ａ２．１発現細胞を、ｇｐ１
００をコードし、かつＧ４１８に対する耐性をもたらす
ｐＢＪ１−ｇｐ１００ｎｅｏでトランスフェクトした。
安定なトランスフェクト体を選択し、ｍＡｂＮＫＩ−
ｂｅｔｅｂを用いてｇｐ１００発現に関しスクリーニン
グした。Ｐ．Ｃｏｕｌｉｅと協力して、一群の同様ト
ランスフェクト体をマウスＰ８１５細胞（Ｐ８１５Ａ
２．１及びＰ８１５Ａ２．１／ｇｐ１００）において
作製した。得られたマウストランスフェクト体をクロム
放出アッセイにおいて標的細胞として用いたところ、Ｔ
ＩＬ１２００によるｇｐ１００特異的溶解が明らかに
観察された。ＴＩＬ１２００によってマウスＥＬ４Ａ
２．１／ｇｐ１００及びＰ８１５Ａ２．１／ｇｐ１０
０トランスフェクト体が特異的に溶解するパーセンテー
ジ（２５〜３５％；Ｅ／Ｔ３０：１）は、ＨＬＡ−
Ａ２．１⁺ ｇｐ１００⁺ヒト黒色腫細胞に関して得られ
るパーセンテージ（４５〜６０％；Ｅ／Ｔ３０：
１）に比較して幾分低かった。この相違は、ヒトＴＩＬ
とマウストランスフェクト体との間に非整合性の補助分
子が存在することで説明できる。この点を克服するべ
く、ヒトＨＬＡ−Ａ２．１⁺ ｇｐ１００^- ＢＬＭ黒色
腫細胞にｇｐ１００抗原を、ｐＢＪ１−ｇｐ１００ｎｅ
ｏでのトランスフェクションによって導入した。安定な
ＢＬＭｇｐ１００クローンを、ＴＩＬ１２００を用
いるクロム放出アッセイにおいて試験した。ＢＬＭｇ
ｐ１００クローンがＴＩＬ１２００による溶解に関し
て、ｇｐ１００抗原を内在的に発現させるＭｅｌ６２
４及びＭｅＷｏ細胞と同様に感受性であることが判明し
た。ＴＩＬ１２００のｇｐ１００特異性は、ｇｐ１０
０を発現させないＧ４１８耐性ＢＬＭ細胞が溶解しない
ことによっても明示され、それによってネオマイシン由
来のペプチドが認識される可能性が排除された。

【０１３５】実施例３ＴＩＬ１２００によって認識されるｇｐ１００エピト
ープの、ｇｐ１００欠失変異株を用いてのマッピング基本的に、抗腫瘍ＣＴＬによって認識されるエピトープ
のマッピングに当業者が通常用いる方法は二つ有る。

【０１３６】１．ＨＬＡ結合モチーフに従い、標的細胞
中に存在するペプチドは合成可能である。合成したペプ
チドは、適当な制限要素を有する細胞に付加してＣＴＬ
のための標的として用いることができる。

【０１３７】２．欠失変異株を得、この欠失変異株を適
当な制限要素と共に、例えばＣＯＳ−７細胞において発
現させる。このようにトランスフェクトした細胞をＣＴ
Ｌと共に培養し、ＣＴＬによる標的細胞の溶解またはＴ
ＮＦ−α／ＩＦＮγの産生を測定する。ＣＴＬによって
認識されないトランスフェクト体はペプチドを発現させ
ない。

【０１３８】本発明のエピトープの探索では上記方法を
両方とも行なった。

【０１３９】ペプチド付加Ｔ２細胞のＴＩＬ１２００
媒介溶解ＴＩＬ１２００によって潜在的に認識され得るｇｐ１
００ペプチドを化学的に合成した。ペプチドの合成はＦ
ｍｏｃ化学（Ｎｉｊｍａｎ，１９９３）を用いて、自動
多段ペプチド合成機（ＡｂｉｍｅｄＡＭＳ４２２）
において固相法で行なった。ペプチドがＨＬＡ−Ａ２．
１に実際に結合したことを、最近開示された、プロセッ
シング欠陥Ｔ２細胞を用いるペプチド結合アッセイ（Ｎ
ｉｊｍａｎ，１９９３）で確認した。この分析によっ
て、ＨＬＡ−Ａ２．１に強固に結合したｇｐ１００由来
ペプチドを同定した。その後、ＨＬＡ−Ａ２．１に強固
に結合したペプチドを付加したＴ２細胞を、標準的なク
ロム放出アッセイを用いてＴＩＬ１２００により溶解
させた。このような操作によってペプチドＬ−Ｌ−Ｄ−
Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ｌを同定した。

【０１４０】実施例４欠失マッピングによって同定されるｇｐ１００エピトー
プｇｐ１００ｃＤＮＡを、発現ベクターｐＢＪ１ｎｅ
ｏ、ｐＣＭＶｎｅｏ（Ｂａｋｅｒ等，１９９０）及びｐ
ＳＶＬに挿入した。ペプチド４５７〜４６６のためのコ
ーディング配列を欠くｇｐ１００ｃＤＮＡを得るべ
く、鋳型として完全長ｇｐ１００ｃＤＮＡを用い、か
つ次の組み合わせのオリゴヌクレオチド： 5'-CATGGAAGTGACTGTCTACC-3' ／ 5'- CTGAGCGAATTCGGAACCTGTAATACTTTCCG-3' 及び 5'- CTGAGCGAATTCGTGAAGAGACAAGTCCCCC-3' ／ 5'- TCACAGCATCATATGAGAGTAC-3'を用いてＰＣＲ反応を生起
させた。ＰＣＲ生成物をＥｃｏＲＩで消化し、連結し、
次のプライマー：5'-GCACAGGCCAACTGCAGA-3'／5'-TTCAG
TATCTGGTGCAGAAC-3'を用いる入れ子式ＰＣＲのための鋳
型として用いた。前記入れ子式ＰＣＲの生成物から得た
ＫｐｎＩ−ＣｌａＩ断片をｐＣＭＶｇｐ１００ｎｅｏの
対応する断片と交換してｐＣＭＶｇｐ１００ＤＥＬ４５
４−４８１ｎｅｏを得た。ｐＢＪ１ｇｐ１００ＤＥＬ４
５４−４８１ｎｅｏの１．７ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ断片及
び０．８ｋｂＥｃｏＲＩ断片を欠失させることによ
り、ｇｐ１００ｃＤＮＡ変異株ＤＥＬ１４９−６５４
及びＤＥＬ４５４−６５４をそれぞれ得た。ｐＳＶＬｇ
ｐ１００のＢｇｌＩ−ＳａｃＩ断片、ＢａｍＨＩ−Ｂｇ
ｌＩＩ断片及びＡｐａＩ−ＮｓｉＩ断片を欠失させるこ
とにより、ｇｐ１００ｃＤＮＡ変異株ＤＥＬ１００−６
５４、ＤＥＬ１９４−５２８及びＤＥＬ１６７−５０８
をそれぞれ得た。

【０１４１】ＢＬＭ細胞を、リン酸カルシウムトランス
フェクション系（ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ
ｇ，ＭＤ）を用いてリン酸カルシウム共沈操作（Ｇｒ
ａｈａｍ及びｖａｎｄｅｒＥｂ，１９７３）に従い
２０μｇのｐＣＭＶｇｐ１００ＤＥＬ４５４−４８１ｎ
ｅｏＤＮＡでトランスフェクトし、１ｍｇ／ｍｌのＧ
４１８（Ｇｉｂｃｏ，Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｓｃｏｔｌ
ａｎｄ，ＵＫ）で選択した。

【０１４２】ＣＯＳ−７細胞を、ＤＥＡＥ−デキストラ
ン／クロロキン法（Ｓｅｅｄ及びＡｒｕｆｆｏ，１９８
７）を用いて５μｇのｐＢＪ１ＨＬＡ−Ａ２．１ｎｅｏ
と、完全長または欠失ｇｐ１００ｃＤＮＡを含む５μ
ｇのｐＢＪ１またはｐＳＶＬプラスミドとで同時にトラ
ンスフェクトした。トランスフェクションの４８時間
後、ＣＯＳ−７細胞をＩＦＮ−γ放出実験において刺激
細胞として用いた。

【０１４３】放出アッセイ実施例２と同様の方法でクロム放出アッセイを行なっ
た。

【０１４４】ＩＦＮ放出アッセイを行なうべく、１０⁵
個のＴＩＬ１２００応答細胞を平底９６ウェルマイク
ロタイタープレートにおいて、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−
２の存在下に３００μｌの培地中で５×１０⁴個の遷移
トランスフェクト（ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙｔｒａｎ
ｓｆｅｃｔｅｄ）ＣＯＳ−７刺激細胞と共にインキュベ
ートした。インキュベーションの２４時間後に１００μ
ｌの上清を収穫し、ｈＩＦＮ−γ−ＩＲＭＡ免疫放射線
測定アッセイキット（ｍｅｇｅｎｉｘＤｉａｇｎｏｓ
ｔｉｃｓＳＡ，Ｆｌｅｕｒｕｓ，Ｂｅｌｇｉｕ
ｍ）を用いてＩＦＮ−γの存在に関しスクリーニングし
た。

【０１４５】結果図３Ａに、得られたｇｐ１００ｃＤＮＡ欠失変異株を
示す。図３Ｂに示したように、ＴＩＬ１２００はＨＬ
Ａ−Ａ２．１及び完全長ｇｐ１００ｃＤＮＡでトラン
スフェクトしたＣＯＳ−７細胞で刺激した場合に特異的
にＩＦＮ−γを分泌した。また、ｇｐ１００ＤＥＬ４５
４−４８１変異株に対するＴＩＬ１２００反応性も観
察された。その他のｇｐ１００欠失変異株のうちではＤ
ＥＬ１００−６６１及びＤＥＬ１４９−６６１構築体の
みが認識されなかったが、それによって、ＴＩＬ１２
００がｇｐ１００タンパク質のＮ末端からアミノ酸１４
８位までに位置するペプチドと反応する可能性が排除さ
れた。ｇｐ１００タンパク質のＣ末端領域も除外でき、
なぜならＴＩＬ１２００の反応性が、ｇｐ１００の最
初の４５３個のアミノ酸をコードする変異構築体ＤＥＬ
４５４−６６１を用いて観察し得るからである。このＮ
末端領域内でアミノ酸１６６までをコードする構築体
（ＤＥＬ１６７−５０８）がＴＩＬ１２００を刺激し
得たという観察から、認識されるエピトープがｇｐ１０
０タンパク質のアミノ酸１４８〜１６６に位置するとい
う結論が得られた。

【０１４６】ＨＬＡ−Ａ２．１結合自然のプロセッシングによってもたらされるＨＬＡ−Ａ
２．１に結合する９マーまたは１０マーペプチド、及び
合成されるＨＬＡ−Ａ２．１結合ペプチドに関して幾つ
かのモチーフが開示されている（Ｆａｌｋ等，１９９
１；Ｈｕｎｔ等，１９９２；Ｒｕｐｐｅｒｔ等，１
９９３）。ｇｐ１００タンパク質の１４８〜１６６領域
を上記モチーフに対してスクリーニングし、２位に位置
するトレオニン残基を含めた、幾分幅広いモチーフに適
合する幾つかのペプチドを合成した。合成したペプチド
をＨＬＡ−Ａ２．１⁺ Ｔ２細胞に付加し、ＴＩＬ１
２００媒介標的細胞溶解を誘発する能力に関して試験し
た（図４Ａ）。試験した五つのペプチドはいずれも、１
０μｇ／ｍｌの濃度で用いた場合Ｔ２細胞をＴＩＬ１２
００による溶解に関して感受性とし得た。これらのペプ
チドは総て、ｇｐ１００のアミノ酸１５５〜１６２に対
応する８マーペプチドＴＷＧＱＹＷＱＶを含む。全ペプ
チドを滴定してこれらのペプチドの、Ｔ２標的細胞をＴ
ＩＬ１２００による溶解に関して感受性とする相対的
な能力を評価した。図４Ｂに、９マーペプチドＫＴＷＧ
ＱＹＷＱＶは３ｎｇ／ｍｌの濃度で適用すればＴＩＬ
１２００によって認識され得るが、他のペプチドはより
高い濃度で適用しなければならないことを示す。

【０１４７】ペプチドＫＴＷＧＱＹＷＱＶ（ｇｐ１００
のアミノ酸１５５〜１６２）、ＬＬＤＧＴＡＴＬＲＬ
（ｇｐ１００のアミノ酸４５７〜４６６）及びＹＬＥＰ
ＧＰＶＴＡ（ｇｐ１００のアミノ酸２８０〜２８８；
Ｃｏｘ等が１９９４年に同定）を、ＨＬＡ−Ａ２．１中
に現われる三つの公知ウイルスエピトープ、即ちインフ
ルエンザマトリックス５８−６６ペプチド（Ｇｏｔｃｈ
等，１９８７）、ＨＩＶポリメラーゼ５１０−５１８ペ
プチド（Ｔｓｏｍｉｄｅｓ等，１９９１）及びＨＩＶ
ｇｐ１２０１９７−２０５ペプチド（Ｄａｄａｇｌｉ
ｏ等，１９９１）と比較した。上記エピトープのＨＬＡ
−Ａ２．１結合能を、プロセッシング欠陥細胞系Ｔ２を
用いる間接結合アッセイ（Ｎｉｊｍａｎ等，１９９３）
によって分析した。簡単に言うと、Ｔ２細胞を１２．５
μｇのエピトープと共にインキュベートした。細胞表面
におけるＨＬＡ−Ａ２．１安定化を、ｍＡｂＢＢ７．
２を用いて流動細胞計測法により測定した。蛍光指数
を、Ｔ２細胞を同様濃度のＨＬＡ−Ａ２．１非結合ペプ
チドと共にインキュベートした場合に得られる平均蛍光
強度（ｍｅａｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）で除した
実験での平均蛍光強度として表わす。

【０１４８】このアッセイを用いて、ｇｐ１００２８
０−２８８エピトープ、及び試験したウイルスエピトー
プに関しては同様のＨＬＡ−Ａ２．１安定化が確認され
た。本発明のエピトープ（ＫＴＷＧＱＹＷＱＶ及びＬＬ
ＤＧＴＡＴＬＲＬ）は両方ともＨＬＡ−Ａ２．１に、幾
分低い親和性をもって結合する（図５）。このことか
ら、ｇｐ１００エピトープはＨＬＡ−Ａ２．１に固有の
親和性をもって結合すると結論付けられる。

【０１４９】参考文献

【０１５０】

【表１】

【０１５１】

【表２】

【０１５２】〔配列表〕配列番号：１配列の長さ：２１１５配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ起源組織の種類：メラノーマ細胞の種類：メラノサイト配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：２２．．２００５配列の特徴特徴を表す記号：ｍｉｓｃｓｉｇｎａｌ存在位置：１．．８１配列の特徴特徴を表す記号：ｍｉｓｃｆｅａｔｕｒｅ存在位置：１７９２．．１８７０他の情報：／機能＝“膜貫通域” 配列の特徴特徴を表す記号：ｍｉｓｃｂｉｎｄｉｎｇ存在位置：２６２．．２６４他の情報：／ｂｏｕｎｄｍｏｉｅｔｙ＝“炭水化物” 配列の特徴特徴を表す記号：ｍｉｓｃｂｉｎｄｉｎｇ存在位置：３３７．．３３９他の情報：／ｂｏｕｎｄｍｏｉｅｔｙ＝“炭水化物” 配列の特徴特徴を表す記号：ｍｉｓｃｂｉｎｄｉｎｇ存在位置：３５２．．３５４他の情報：／ｂｏｕｎｄｍｏｉｅｔｙ＝“炭水化物” 配列の特徴特徴を表す記号：ｍｉｓｃｂｉｎｄｉｎｇ存在位置：９８２．．９８４他の情報：／ｂｏｕｎｄｍｏｉｅｔｙ＝“炭水化物” 配列の特徴特徴を表す記号：ｍｉｓｃｂｉｎｄｉｎｇ存在位置：１７２３．．１７２５他の情報：／ｂｏｕｎｄｍｏｉｅｔｙ＝“炭水化物” 配列

【０１５３】

【表３】

【０１５４】

【表４】

【０１５５】

【表５】

【０１５６】

【表６】

【０１５７】配列番号：２配列の長さ：６６１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列

【０１５８】

【表７】

【０１５９】

【表８】

【０１６０】

【表９】

【０１６１】配列番号：３配列の長さ：３０配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：１．．３０配列 CTG CTG GAT GGT ACA GCC ACC TTA AGG CTG 30 Leu Leu Asp Gly Thr Ala Thr Leu Arg Leu 1 5 10 配列番号：４配列の長さ：１０配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状分子の種類：タンパク質配列番号：５配列の長さ：３０配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：１．．３０配列 GTA TTG CCA GAT GGG CAG GTT ATC TGG GTC 30 Val Leu Pro Asp Gly Gln Val Ile Trp Val 1 5 10 配列番号：６配列の長さ：１０配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状分子の種類：タンパク質配列番号：７配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ起源組織の種類：メラノーマ細胞の種類：メラノサイト配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：１．．２４配列 ACC TGG GGC CAA TAC TGG CAA GTT 24 Thr Trp Gly Gln Tyr Trp Gln Val 1 5 配列番号：８配列の長さ：８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状分子の種類：タンパク質配列番号：９配列の長さ：３６配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ起源組織の種類：メラノーマ細胞の種類：メラノサイト配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：１．．３６配列の特徴特徴を表す記号：ｐｒｏｔｅｉｎｂｉｎｄ存在位置：１．．３３配列の特徴特徴を表す記号：ｐｒｏｔｅｉｎｂｉｎｄ存在位置：７．．３６配列の特徴特徴を表す記号：ｐｒｏｔｅｉｎｂｉｎｄ存在位置：７．．３３配列の特徴特徴を表す記号：ｐｒｏｔｅｉｎｂｉｎｄ存在位置：１０．．３６配列 GTC TGG AAG ACC TGG GGC CAA TAC TGG CAA GTT CTA 36 Val Trp Lys Thr Trp Gly Gln Tyr Trp Gln Val Leu 1 5 10 配列番号：１０配列の長さ：１２配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列番号：１１配列の長さ：２９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：ｍｉｓｃｆｅａｔｕｒｅ存在位置：７．．１２他の情報：／ラベル＝ＥｃｏＲＩ−ｓｉｔｅ配列 TATCTAGAAT TCTGCACCAG ATACTGAAG 29 配列番号：１２配列の長さ：３２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：ｍｉｓｃｆｅａｔｕｒｅ存在位置：７．．１２他の情報：／ラベル＝ＥｃｏＲＩ−ｓｉｔｅ配列 TATCTAGAAT TCTGCAAGAT GCCCACGATC AG 32 配列番号：１３配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列 CTTCTTGACC AGGCATGATA 20 配列番号：１４配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列 TGTGAGAAGA ATCCCAGGCA 20 配列番号：１５配列の長さ：３６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列 GCTTATCATG CCTGTGCCTG GATTCTTCTC ACAGGT 36 配列番号：１６配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡハイポセティカル配列：Ｎｏ配列 CATGGAAGTG ACTGTCTACC 20 配列番号：１７配列の長さ：３２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡハイポセティカル配列：Ｎｏ配列 CTGAGCGAAT TCGGAACCTG TAATACTTTC CG 32 配列番号：１８配列の長さ：３１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡハイポセティカル配列：Ｎｏ配列 CTGAGCGAAT TCGTGAAGAG ACAAGTCCCC C 31 配列番号：１９配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡハイポセティカル配列：Ｎｏ配列 TCACAGCATC ATATGAGAGT AC 22

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトｇｐ１００／Ｐｍｅｌ１７遺伝子の一部の
ゲノム構成を示す。Ａ及びＡ’はそれぞれｇｐ１００
ｃＤＮＡ及びＰｍｅｌ１７ｃＤＮＡに相当する転写物
において除去されたイントロンを表わす。エキソン配列
は大文字で、イントロン配列は小文字で表わしてある。
分岐点配列（Ｒｕｓｋｉｎ，Ｂ．ら，１９８４）に最も
適合する箇所には下線を引いてある。

【図２】ｇｐ１００／ｐＭｅｌ１７ファミリーのメンバ
ーのカルボキシ末端部分を並べて示す。同一のアミノ酸
（−）及びギャップ（＊）を示すと共に、保存されてい
るシステイン残基（＃）も示す。

【図３】（Ａ）ｇｐ１００タンパク質の一部をコードす
るｇｐ１００欠失突然変異体を示す（数字は、配列番号
２に示したｇｐ１００タンパク質におけるアミノ酸を示
す）。（Ｂ）ＨＬＡ−Ａ２．１及び図３（Ａ）に示したｇｐ１
００欠失突然変異体を用いてトランスフェクトした細胞
のＴＩＬ１２００による認識を示す。

【図４】（Ａ）ｇｐ１００の１４８−１６６領域から誘
導された、８−ｍｅｒから１１−ｍｅｒの５つのペプチ
ドのＴＩＬ１２００による認識を試験した。エフェク
ター対ターゲット比３０：１で、特異的溶解物を検出し
た。（Ｂ）図４Ａで同定されたｇｐ１００ペプチドのＴＩＬ
１２００による認識に対する滴定（Ｅ／Ｔ比３０：
１）を示す。

【図５】ｇｐ１００とウイルスエピトープのＨＬＡ−Ａ
２．１に対する結合を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ０７Ｋ 16/32 8318−4ＨＣ１２Ｎ 5/10 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｑ 1/68 Ａ 9453−4ＢＧ０１Ｎ 33/574 Ｚ // Ａ６１Ｋ 39/395 ＥＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ 21/08 9161−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号２のアミノ酸配列を含んでいる
ことを特徴とする黒色腫関連抗原。
【請求項２】請求項１に記載の抗原をコードするヌク
レオチド配列を含んでいることを特徴とするヌクレオチ
ド配列。
【請求項３】配列番号１のヌクレオチド配列を含んで
いることを特徴とする請求項２に記載のヌクレオチド配
列。
【請求項４】請求項１に記載の抗原の免疫原断片を含
んでいることを特徴とする免疫原ペプチド。
【請求項５】Ｌ−Ｌ−Ｄ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｌ−Ｒ−
Ｌ、Ｖ−Ｌ−Ｐ−Ｄ−Ｇ−Ｑ−Ｖ−Ｉ−Ｗ−Ｖ、Ｔ−Ｗ
−Ｇ−Ｑ−Ｙ−Ｗ−Ｑ−Ｖ、Ｖ−Ｗ−Ｋ−Ｔ−Ｗ−Ｇ−
Ｑ−Ｙ−Ｗ−Ｑ−Ｖ、Ｋ−Ｔ−Ｗ−Ｇ−Ｑ−Ｙ−Ｗ−Ｑ
−Ｖ−Ｌ、Ｋ−Ｔ−Ｗ−Ｇ−Ｑ−Ｙ−Ｗ−Ｑ−Ｖ及びＴ
−Ｗ−Ｇ−Ｑ−Ｙ−Ｗ−Ｑ−Ｖ−Ｌからなる群の中から
選択されるアミノ酸配列を含んでいることを特徴とする
免疫原ペプチド。
【請求項６】請求項５に記載のペプチドをコードする
ヌクレオチド配列を含んでいることを特徴とするヌクレ
オチド配列。
【請求項７】配列番号３、５、７及び９の配列からな
る群の中から選択されるヌクレオチド配列を含んでいる
ことを特徴とする請求項６に記載のヌクレオチド配列。
【請求項８】請求項２もしくは３に記載のヌクレオチ
ド配列又はその相補的配列に対する１個の標識プローブ
及び１個又は２個のプライマーを含んでいることを特徴
とする黒色腫細胞を検出するための試験キット。
【請求項９】ａ．患者から試料を採取し、ｂ．試料で請求項２もしくは３に記載のヌクレオチド配
列又は該配列の一部分の増幅を行い、ｃ．増幅した核酸を相補的な標識プローブと反応させ、ｄ．ラベルを検出する段階からなることを特徴とする黒色腫細胞の検出方法。
【請求項１０】請求項２、３、６及び７のいずれか一
項に記載のヌクレオチド配列を含んでいるクローニング
媒体。
【請求項１１】請求項１０に記載のクローニング媒体
でトランスフェクト又は形質転換し、好ましくはＭＨＣ
クラスＩの対立遺伝子をコードするヌクレオチド配列を
含んでいるクローニング媒体でコトランスフェクトする
ことを特徴とする宿主細胞。
【請求項１２】宿主細胞がネズミＥＬ４、Ｐ８．１５
細胞及びヒトＢＬＭ細胞からなる群の中から選択される
ことを特徴とする請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１３】抗原提示細胞であることを特徴とする
請求項１１又は１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】更に同時刺激分子を産生することを特
徴とする請求項１１から１３のいずれか一項に記載の宿
主細胞。
【請求項１５】請求項１に記載の抗原又はそのエピト
ープを含んでいることを特徴とするワクチン。
【請求項１６】請求項４に記載のペプチドを含んでい
ることを特徴とするワクチン。
【請求項１７】請求項５に記載のペプチドを含んでい
ることを特徴とする請求項２６に記載のワクチン。
【請求項１８】ペプチドを医薬的に許容できる担体又
は希釈剤と混合することを特徴とする請求項１５から１
７のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１９】予めペプチドが負荷されている抗原提
示細胞を含んでいることを特徴とする請求項１５から１
７のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２０】請求項１１から１３のいずれか一項に
記載の宿主細胞を含んでいることを特徴とするワクチ
ン。
【請求項２１】請求項２、３、６及び７のいずれか一
項に記載のヌクレオチド配列を含んでいることを特徴と
するワクチン。
【請求項２２】請求項１、４及び５のいずれか一項に
記載のペプチドに対するＴ細胞レセプター又は該Ｔ細胞
レセプターを発現する細胞を含んでいることを特徴とす
るワクチン。
【請求項２３】アジュバント、１種以上のサイトカイ
ン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２７、ＣＤ２８又は他のＴ細
胞表面抗原に対する抗体、及びＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ
細胞を刺激するためのヘルパーエピトープからなる群の
中から選択された１種以上の化合物を更に含んでいるこ
とを特徴とする請求項１５から２２のいずれか一項に記
載のワクチン。
【請求項２４】ａ．患者から黒色腫試料を採取し；ｂ．試料から腫瘍浸潤リンパ球を単離し；ｃ．該リンパ球を請求項１に記載の抗原と反応させ；ｄ．該抗原と結合するリンパ球を単離する段階からなることを特徴とする抗原反応性腫瘍浸潤リン
パ球の産生方法。
【請求項２５】請求項１に記載の抗原に結合し得るこ
とを特徴とする腫瘍浸潤リンパ球。
【請求項２６】リンホカインをコードするヌクレオチ
ド配列を有するクローニング媒体でトランスフェクトさ
れたことを特徴とする請求項１に記載の抗原を発現し得
る黒色腫細胞。
【請求項２７】請求項２５に記載の腫瘍浸潤リンパ球
及び／又は請求項２６に記載の黒色腫細胞を含んでいる
ことを特徴とするワクチン。
【請求項２８】請求項１、４及び５のいずれか一項に
記載のペプチドを使用することを特徴とするペプチドと
検出可能マーカーとの結合体。
【請求項２９】検出可能マーカーが放射性核種である
ことを特徴とする請求項２８に記載の結合体。
【請求項３０】請求項４又は５に記載のペプチドに対
するものであることを特徴とする抗体。
【請求項３１】請求項３０に記載の抗体を含んでいる
ことを特徴とするワクチン。
【請求項３２】請求項４又は５に記載のペプチドに対
する抗体の存在を患者の血清から検出することを特徴と
する免疫療法の監視方法。
【請求項３３】請求項２８又は２９に記載の結合体を
含んでいることを特徴とする請求項３０に記載の抗体の
検出用キット。