ES2224113T3

ES2224113T3 - Antigeno asociado al melanoma, epitopos de este antigeno y vacunas contra el melanoma.

Info

Publication number: ES2224113T3
Application number: ES95200348T
Authority: ES
Inventors: Gosse Jan Adema; Carl Gustav Figdor
Original assignee: Crucell Holand BV
Current assignee: Janssen Vaccines and Prevention BV
Priority date: 1994-02-16
Filing date: 1995-02-14
Publication date: 2005-03-01
Anticipated expiration: 2015-02-14
Also published as: AU1227295A; US20030216559A1; DE69533295T2; FI950665A0; KR950032283A; JP3869476B2; DK0668350T3; EP0668350B1; CA2142575C; DK0668350T4; EP0668350A1; FI121572B; CA2142575A1; DE69533295T3; EP0668350B2; ATE272113T1; FI950665A; AU697267B2; ES2224113T5; KR100380503B1

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN ANTIGENO ASOCIADO A LA MELANOMA, CONOCIDO COMO GP100. ADEMAS, SE REIVINDICAN PEPTIDOS DERIVADOS DE TAL ANTIGENO. GP100 Y SUS PEPTIDOS PUEDEN USARSE EN VACUNAS PARA EL TRATAMIENTO DE MELANOMAS. OTRO ASPECTO DE LA INVENCION LO CONSTITUYEN CELULAS HUESPEDES CAPACES DE EXPRESION DE GP100 O DE PEPTIDOS DERIVADOS DE GP100. ADEMAS, SE REIVINDICAN LINFOCITOS DE INFILTRACION DE TUMORES (TIL''S) ESPECIFICAMENTE RECONOCIENDO GP100, COMO VACUNAS CON ESTOS TIL''S. POR OTRA PARTE, FORMAN PARTE DE LA INVENCION DIAGNOSTICOS PARA LA DETECCION DE MELANOMA Y PARA LA MONITORIZACION DE VACUNACION.

Description

Antígeno asociado al melanoma, epítopos de este antígeno y vacunas contra el melanoma.

La presente invención está relacionada con el tratamiento y el diagnóstico del cáncer, especialmente con un antígeno asociado al melanoma, con epítopos del mismo, con vacunas contra el melanoma, con linfocitos T infiltrantes en tumores que reconocen el antígeno y con agentes de diagnóstico para la detección del melanoma y para la monitorización de la vacunación.

Las células tumorales pueden liberarse del control de crecimiento restrictivo por la activación de oncogenes y/o por la inactivación de los genes supresores de tumores. El curso de la progresión tumoral transcurre por una serie de cambios graduales, escalonados, en diferentes "características unitarias", esto es en rasgos fenotípicos, muchos de los cuales se sabe que están determinados o al menos influenciados por la expresión alterada de oncogenes y/o de genes supresores de tumores definidos. La liberación de la célula de la restricción inmunológica del huésped puede seguir rutas de múltiples etapas similares a las de la liberación del control de crecimiento.

Un problema encontrado a menudo en la inmunoterapia del cáncer es la falta de inmunogenicidad del tumor. Esta evasión del control por el sistema inmune puede ser comprendida sobre la base de diferencias fenotípicas encontradas en las células neoplásicas (diferencias encontradas en células del linfoma de Burkitt según Klein, G. y Boon, T., Curr. Opinion in Immunol. 5, 687-692, 1993):

-: capacidad disminuida para procesar y presentar antígenos;

-: capacidad disminuida para estimular células T autólogas;

-: regulación por disminución completa de proteínas inmunogénicas asociadas con células transformadas;

-: carencia de expresión, o baja expresión, de moléculas de adhesión de leucocitos o de otras moléculas accesorias; y

-: regulación por disminución selectiva de ciertos alelos de clase I y clase II del MHC.

Los antígenos de clase I/II del MHC están a menudo regulados por disminución en los tumores sólidos. Esto puede afectar a todos los antígenos de clase I/II, o solamente a parte de los mismos. Los péptidos víricos y celulares que pueden sensibilizar células diana apropiadas para la lisis mediada por linfocitos T citotóxicos, pueden fracasar en su función cuando son producidos en células con un bajo nivel de expresión de antígeno de clase I del MHC. Puede inducirse sensibilidad citotóxica, al menos en algunos casos, elevando el nivel de expresión de antígenos de clase I/II del MHC por interferón \gamma y factor de necrosis tumoral \alpha.

Sin embargo, durante los cambios graduales desde tejido normal a tejido tumoral aparecen antígenos asociados al tumor. Estos antígenos pueden ser expuestos mediante varios mecanismos:

- pueden ser moléculas que están enmascaradas de alguna manera durante el desarrollo celular normal, pero en las que el cambio neoplásico induce la eliminación de la protección por enmascaramiento para el sistema inmune;

- la eliminación de algunas moléculas de la membrana plasmática puede alterar el perfil de las moléculas adyacentes en un tramo de membrana dado y, de este modo, generar en efecto un nuevo perfil que podría resultar inmunogénico para el huésped;

- una alteración de la membrana concomitante a la transformación neoplásica podría exponer nuevas regiones de una molécula, previamente ocultas, o podría tener como resultado la adición de nuevas características estructurales a una molécula existente;

- el desprendimiento y la desintegración de células tumorales podría exponer el sistema inmune a componentes nucleares, nucleolares o citoplásmicos que están normalmente ocultos en la célula.

Las características de los antígenos asociados a tumores dependen en gran parte del origen del tumor portador de los mismos. La existencia de antígenos asociados a tumores animales fue documentada en el pasado siglo, y el carácter antigénico de los cánceres humanos ha sido bien establecido, primariamente a través de estudios recientes con anticuerpos monoclonales.

Los intentos para aislar y caracterizar químicamente estos antígenos se han encontrado con serias dificultades, teniendo muchas de ellas que ver con una falta de reactivos adecuados para la precipitación de las moléculas portadoras de antígenos a partir de una solución.

Igual que otros muchos estímulos, los antígenos asociados a tumores activan no sólo uno sino un conjunto completo de mecanismos de defensa - específicos e inespecíficos, humorales y celulares. El papel dominante de la resistencia in vivo al crecimiento tumoral está desempeñado por los linfocitos T. Estas células reconocen antígenos asociados a tumores presentados a las mismas por las células presentadoras de antígeno (APCs), y serán activadas por este reconocimiento, y después de la activación y la diferenciación, atacarán y destruirán las células tumorales. Una clase especial de este tipo de linfocitos está constituida por los linfocitos infiltrantes de tumores (TILs) que pueden ser encontrados en los tumores sólidos.

Se ha sugerido ya (EP 147.689) la activación de linfocitos T con una sustancia antigénica ligada a un vehículo insoluble in vitro y la administración posterior de estos linfocitos activados a un paciente con un tumor.

La quimioterapia convencional es relativamente ineficaz en el tratamiento de pacientes con melanoma metastásico, y 6000 pacientes aproximadamente mueren cada año de esta enfermedad en los Estados Unidos.

Rosenberg y col. (New Eng. J. Med. 319(25), 1676-1681, 1988) han demostrado el efecto beneficioso de la inmunoterapia con TILs autólogos e interleuquina-2 (IL-2) en pacientes con melanoma.

Esta terapia consta de la resección del depósito tumoral, el aislamiento de los TILs, la expansión in vitro de los TILs y la infusión al paciente bajo tratamiento simultáneo con dosis de IL-2 elevadas e inductoras de toxicidad.

Los TILs utilizados por Rosenberg están dirigidos hacia, y son capaces de reconocer, antígenos asociados al melanoma.

Nuestro objetivo ha sido aislar tal antígeno asociado al melanoma con el fin de poder utilizar el antígeno y/o sus epítopos para el desarrollo de una inmunoterapia para pacientes con melanoma.

Los antígenos del melanoma han sido ya descritos por Old, L. (1981) que identificó 6 glicoproteínas antigénicas y 3 glicolípidos que estaban presentes en 120 líneas celulares de melanoma.

Se han descrito también vacunas con antígenos del melanoma: en las patentes de EE.UU. n^{os} 5.030.621 y 5.194.384 se ha producido una vacuna polivalente mediante el cultivo de células de melamona y el aislamiento posterior de los antígenos específicos de melanoma excretados del medio de cultivo.

Se han propuesto ya algunos antígenos específicos para terapia y diagnóstico del tipo de cáncer melanoma: el péptido p97 ha sido descrito en US 5.262.177 y US 5.141.742, mientras que en EP 529.007 se ha mencionado una proteína de 35 kD.

Nosotros hemos encontrado ahora un polipéptido asociado al melanoma caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2.

Este polipéptido antigénico específico del linaje melanocítico (denominado también gp100) es reconocido por el anticuerpo monoclonal NKI-beteb, anticuerpo que ha demostrado ser adecuado para fines de diagnóstico. Los antígenos reconocidos por este anticuerpo son proteínas intracelulares de 10 kD (gp10) y 100 kD (gp 100) aproximadamente. Este último es también detectable en un medio de cultivo de células de melanoma (Vennegoor, C. y col., Am. J. Pathol. 130, 179-192, 1988). Se ha encontrado también que el antígeno gp100 reacciona con otros anticuerpos específicos de melanoma tales como HMB-50 (descrito por Vogel, A.M. y Esclamado, R.M., Cancer Res. 48, 1286-1294, 1988) o HMB-45 (descrito por Gown, A.M. y col., Am. J. Pathol. 123, 195-203, 1986). Como se ha demostrado que las proteínas que reaccionan con estos anticuerpos monoclonales están glicosiladas en las células de melanoma, se encontraron diferencias en la movilidad cuando fueron analizadas mediante SDS- PAGE.

Aunque este antígeno gp100 se expresa predominantemente intracelularmente, se ha establecido ahora que es un antígeno inmunogénico adecuado, ya que se ha demostrado que estas proteínas intracelulares pueden ser procesadas y presentadas como péptidos en el contexto de las moléculas del MHC a las células del sistema inmune. De hecho, se han encontrado linfocitos infiltrantes de tumores derivados de tumores de pacientes con melanoma que reaccionan con el antígeno.

Por tanto, el polipéptido gp100 es una diana potencial para respuestas celulares contra el carcinoma y de este modo un elemento adecuado para terapia y diagnóstico en pacientes con melanoma.

El gp100 es una proteína transmembranal de tipo I, que tiene un dominio rico en treonina conteniendo secuencias de aminoácidos repetitivas presentes en el centro de la proteína (aminoácidos 309-427). Este dominio rico en treonina, que puede ser sometido a una amplia glicosilación ligada a O, está precedido por una región rica en histidina (aminoácidos 182-313) y seguido por un dominio rico en cisteína (aminoácidos 475-566). Sobre la base de un análisis de la representación gráfica de la hidrofobicidad (Kyte, J. y Doolittle, R.F., 1982), un único dominio transmembranal limitado por residuos cargados está presente en la parte carboxi-terminal de gp100 (aminoácidos 591-611). El dominio citoplásmico pronosticado tiene 45 aminoácidos de longitud. Están presentes cinco supuestos sitios de glicosilación ligada a N, consistente con el hecho de que gp100 sea una glicoproteína.

El término "polipéptido" se refiere a una cadena molecular de aminoácidos, no se refiere a una longitud específica del producto y si se requiere puede ser modificada in vivo o in vitro, por ejemplo mediante glicosilación, amidación, carboxilación o fosforilación; por tanto están incluidos en la definición de polipéptido, inter alia, péptidos, oligopéptidos y proteínas.

Por supuesto, están también incluidos dentro de la presente invención derivados funcionales así como fragmentos del polipéptido de acuerdo con la invención. Los derivados funcionales tienen la intención de incluir polipéptidos que difieren en uno o más aminoácidos de la secuencia total, que tienen deleciones, sustituciones, inversiones o adiciones. Se han descrito sustituciones de aminoácidos que puede esperarse que no alteren esencialmente las actividades biológicas e inmunológicas. Las sustituciones de aminoácidos entre aminoácidos relacionados o sustituciones que han tenido lugar frecuentemente en la evolución son, inter alia, Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val (ver Dayhof, M.D., Atlas of protein sequence and structure, Nat. Biomed. Res. Found., Washington D.C., 1978, vol. 5, suplemento 3). Sobre la base de esta información Lipman y Pearson desarrollaron un método para comparar proteínas de manera rápida y sensible (Science 227, 1435-1441, 1985) y determinar la similitud funcional entre polipéptidos homólogos.

Los derivados funcionales que muestran todavía actividad inmunológica hacia el anticuerpo monoclonal NKI-beteb o HMB-50 o HMB-45 están incluidos dentro del ámbito de esta invención.

Además, como derivados funcionales de estos polipéptidos están también implicados polipéptidos derivados de gp100 que son capaces de inducir la lisis de células diana por los linfocitos infiltrantes de tumores.

Además, con los derivados funcionales de estos péptidos están también implicadas las sales de adición de los péptidos, amidas de los péptidos y específicamente las amidas C-terminales, ésteres y específicamente los ésteres C-terminales y derivados N-acilo, específicamente derivados acilo N-terminales y N-acetil derivados.

Los polipéptidos de acuerdo con la invención pueden ser producidos sintéticamente o mediante la tecnología del ADN recombinante. Los métodos para producir polipéptidos sintéticos son bien conocidos en la técnica.

Se considera que los métodos de química orgánica para la síntesis peptídica incluyen el acoplamiento de los aminoácidos requeridos por medio de una reacción de condensación, ya sea en fase homogénea o bien con la ayuda de una llamada fase sólida. La reacción de condensación puede ser llevada a cabo según sigue:

a) condensación de un compuesto (aminoácido, péptido) con un grupo carboxilo libre y otros grupos reactivos protegidos con un compuesto (aminoácido, péptido) con un grupo amino libre y otros grupos reactivos protegidos, en presencia de un agente de condensación;

b) condensación de un compuesto (aminoácido, péptido) con un grupo carboxilo activado y otros grupos reactivos libres o protegidos con un compuesto (aminoácido, péptido) con un grupo amino libre y otros grupos reactivos libres o protegidos.

La activación del grupo carboxilo puede tener lugar, inter alia, mediante la conversión del grupo carboxilo en un haluro de ácido, en una azida, en un anhídrido, en un imidazólido o en un éster activado, tal como N-hidroxi-succinimida, N-hidroxi-benzotriazol o p-nitrofenil éster.

Los métodos más comunes para las reacciones de condensación anteriores son: el método de la carbodiimida, el método de la azida, el método de anhídridos mixtos y el método que utiliza ésteres activados, tales como los descritos en The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 1-3 (Ed. Gross, E. y Meienhofer, J.) 1979, 1980, 1981 (Academic Press, Inc.).

La producción de polipéptidos mediante técnicas de ADN recombinante es un método general que es conocido, pero que tiene muchas posibilidades que conducen todas a resultados algo diferentes. El polipéptido que va a ser expresado está codificado por una secuencia de ADN o más exactamente por una secuencia de ácido nucleico.

Se ha encontrado que la secuencia de aminoácidos de gp100 se asemeja estrechamente a la secuencia de aminoácidos del péptido Pmel17 asociado a melanoma ya conocido, descrito en Kwon, B.S. (1991).

Las diferencias de aminoácidos entre gp100 y Pmel17 consisten en sustituciones de los aminoácidos en posición 274 (T-C/PRO-LEU) y 597 (C-G/ARG-PRO) y en un tramo de 7 aminoácidos ausente en gp100 en posición 587. La diferencia de un solo nucleótido en posición 762 (C-T) no tiene como resultado una sustitución de aminoácidos. El gp100 es también un 80% homólogo a una supuesta proteína deducida a partir de un clon de ADNc parcial (RPE-1) aislado de una biblioteca de ADNc de retina bovina (Kim, R.Y. y Wistow, G.J., 1992) y un 42% homólogo a una proteína de la matriz melanosómica de pollo, MMP115 (Mochii, M., 1991). Ver también la Fig. 2.

Es también parte de la invención la secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia que codifica el polipéptido gp100.

Preferiblemente, la secuencia que codifica gp100 es la secuencia de la SEC ID Nº: 1.

Como es bien conocido en la técnica, la degeneración del código genético permite la sustitución de bases en un codón que tiene como resultado otro codón que codifica todavía el mismo aminoácido, por ejemplo, el codón para el aminoácido ácido glutámico es GAT y también GAA. Por consiguiente, está claro que para la expresión de un polipéptido con una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº:2, puede utilizarse una secuencia de ácido nucleico derivada con tal composición de codones alternativos, difiriendo de este modo de la secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEC ID Nº: 1.

"Secuencia de nucleótidos", según se utiliza en la presente, se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, a secuencias de ácido ribonucleico (ARN) y a secuencias de ácido desoxirribonucleico (ADN). En principio este término se refiere a la estructura primaria de la molécula. Por tanto, este término incluye ADN de doble hebra y de hebra sencilla, así como ARN de doble hebra y de hebra sencilla, y modificaciones de los mismos.

La secuencia de nucleótidos de gp100 contiene 2115 pares de bases (pb) y termina con un tramo poli(A) de 15 nucleótidos que está precedido por la secuencia de poliadenilación consenso AATAAA. En el ADN de gp100 está presente un marco de lectura abierto (ORF) que se extiende desde el nucleótido 22 hasta el 2007. Éste ORF comienza con un codón ATG dentro del contexto de secuencia apropiado para el inicio de la traducción y codifica una proteína de 661 aminoácidos. Los 20 aminoácidos aminoterminales se ajustan a todos los criterios de las secuencias señal, incluyendo un sitio de corte potencial después de ALA en posición 20 (-1), que indicaría que la gp100 madura contiene 641 aminoácidos (70 kD aproximadamente).

La diferencia más sorprendente entre los ADNcs de gp100 y Pmel17 es la deleción en el marco de 21 pb en el ADNc de gp100 (Fig. 2). La comparación de la secuencia de nucleótidos del ADN genómico con la secuencia del ADNc de gp100 reveló la presencia de un intrón (102 pb) justo en la posición de la inserción de 21 pb en el ADNc de Pmel17. Los límites exón/intrón se ajustan perfectamente a las secuencias consenso de sitios donantes de ayuste 5' y de sitios aceptores de ayuste 3' (Padgett, 1986). En el ADN genómico, la secuencia que comprende los 21 pb adicionales en el ADNc de Pmel17 está situada directamente corriente arriba del sitio de corte 3' utilizado para generar el ARN de gp100 y está precedida por un sitio aceptor de ayuste 3' alternativo. Mientras que el sitio de aceptor de ayuste 3' específico de gp100 se ajusta a la secuencia consenso, el sitio aceptor de ayuste 3' específico de Pmel17 parece ser subóptimo en cuanto a que carece de una región rica en pirimidinas. Sitios de procesamiento de ARN subóptimos están presentes en muchos precursores de ARN mensajero procesados alternativamente y han sido implicados en la función de regulación del procesamiento de ARN alternativo (revisado por Green, M.R., 1991). Colectivamente, estos datos demuestran que los transcritos correspondientes a los ADNcs de gp100 y Pmel17 son generados mediante ayuste alternativo de un único transcrito primario.

Una parte adicional de la invención son péptidos que son fragmentos inmunogénicos del polipéptido gp100.

Los fragmentos inmunogénicos son fragmentos de la molécula de gp100 que tienen todavía capacidad para inducir una respuesta inmunogénica, esto es, que es posible que induzcan anticuerpos que reconozcan específicamente los fragmentos, o que es posible encontrar linfocitos T que hayan sido activados por los fragmentos.

Según se ha mencionado anteriormente, se ha sabido que la acción inmunogénica de los antígenos asociados a tumores es a menudo producida a través de un mecanismo activador de células T (Townsend, A.R.M. y Bodmer, H., Ann. Rev. Immunol. 7, 601-624, 1989). Se han aislado de pacientes portadores de tumores linfocitos T citotóxicos (CTLs) que reconocen células de melanoma de una manera dependiente de receptores de células T (TCR) y restringida por el MHC (revisado por Knuth, A., 1992). Brichard y col. (1993) han demostrado que un péptido derivado de tirosinasa, y otro antígeno específico de melanocitos, es reconocido por un clon de CTL.

Se sabe que la activación de células T a través de moléculas del MHC necesita el procesamiento del antígeno, del que fragmentos cortos (por ejemplo 8-12 meros) son presentados al linfocito T.

Los oligopéptidos inmunogénicos localizados en la secuencia de gp100 forman también parte de la invención.

Hemos encontrado secuencias peptídicas inmunogénicas de la secuencia de gp100 que no sólo son capaces de unirse a la molécula del MHC I, sino que también se ha demostrado que reconocen linfocitos infiltrantes de tumores que han sido aislados de un paciente con melanoma.

Se han hallado varios péptidos: se ha encontrado que los péptidos que tienen las secuencias de aminoácidos V-L-P-D-G-Q-V-I-W-V, M-L-G-T-H-T-M-E-V, R-L-M-K-Q-D-F-S-V, (V)-(W)-(K)-T-W-G-Q-Y-W-Q-V-(L) y L-L-D-G-T-A-T-L-R-L se unen a la molécula HLA-A2.1 del MHC. Además, los dos últimos péptidos son reconocidos por linfocitos T citotóxicos anti-melanoma en el contexto de HLA-A2.1.

Preferiblemente estos péptidos están flanqueados por secuencias no relacionadas, esto es secuencias con las que no están conectados en la naturaleza, ya que se ha encontrado que tales secuencias flanqueantes incrementan las propiedades inmunogénicas de estos péptidos, probablemente a través de un mejor procesamiento y una mejor presentación por las APCs.

Otra parte de la invención está constituida por secuencias de nucleótidos que comprenden las secuencias de nucleótidos que codifican los péptidos anteriormente mencionados.

Después de la utilización de estas secuencias para la producción de los péptidos con técnicas de ADN recombinante, las cuales serán ejemplificadas posteriormente, la información sobre las secuencias descrita en los listados de secuencias para gp100 o sus epítopos puede ser utilizada con fines de diagnóstico.

De estas secuencias pueden derivarse cebadores como base de un análisis de diagnóstico para detectar gp100 o proteínas similares a gp100 mediante una técnica de amplificación de ácidos nucleicos, por ejemplo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), o la amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico (NASBA) según está descrito en USP 4.683.202 y EP 329.822, respectivamente.

Con la PCR se generan grandes cantidades de ADN tratando una secuencia de ADN diana con cebadores oligonucleotídicos, de tal manera que se sintetiza un producto de extensión de los cebadores que es separado del molde utilizando desnaturalización por calor y que sirve a su vez como molde, teniendo como resultado la amplificación de la secuencia diana. Cuando se va a amplificar ARN con PCR, la hebra de ARN es transcrita primeramente a una hebra de ADN con la ayuda de transcriptasa inversa.

Con la ayuda de NASBA, se generan grandes cantidades de ARN de hebra sencilla a partir de ARN o ADN de hebra sencilla o de ADN de doble hebra. Cuando se va a amplificar ARN, el ARNss sirve como molde para la síntesis de una primera hebra de ADN por extensión de un primer cebador que contiene un sitio de reconocimiento de la ARNss polimerasa. La hebra de ADN formada sirve a su vez como molde para la síntesis de una segunda hebra de ADN complementaria por extensión de un segundo cebador, teniendo como resultado un sitio promotor de la ARN polimerasa activo de doble hebra, y el segundo ADN sirve como molde para la síntesis de grandes cantidades del primer molde, el ARNss, con la ayuda de ARN polimerasa.

La detección de la secuencia de nucleótidos amplificada se establece mediante hibridación de una sonda de detección complementaria con el ácido nucleico amplificado. Esta sonda puede estar marcada y/o inmovilizada en una fase sólida. La detección de la marca puede llevarse a cabo mediante métodos conocidos en la técnica. La detección de ácidos nucleicos unidos a través de la sonda a la fase sólida puede ser realizada mediante compuestos capaces de detectar selectivamente ácidos nucleicos.

Según se mencionó anteriormente, las secuencias de nucleótidos pueden ser utilizadas para la producción de gp100 o de uno de sus epítopos con técnicas de ADN recombinante. Para esto, la secuencia de nucleótidos debe estar contenida en un vehículo de clonaje que puede ser utilizado para transformar o transfectar una célula huésped adecuada.

Una amplia variedad de combinaciones de células huésped y vehículos de clonaje puede ser empleada útilmente en el clonaje de la secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, vehículos de clonaje útiles pueden incluir secuencias de ADN cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas tales como varios plásmidos bacterianos conocidos, y plásmidos con un rango de huéspedes más amplio tales como pBR322, los diferentes pUC, los plásmidos pGEM y pBluescript, bacteriófagos, por ejemplo lambda -gt-Wes, Charon 28 y los fagos derivados de M13 y vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fago o de virus, tal como SV40, ADN de adenovirus o de virus del polioma (ver también Rodriguez, R.L. y Denhardt (1988); Lenstra, 1990).

Los huéspedes útiles pueden incluir huéspedes bacterianos, levaduras y otros hongos, huéspedes vegetales o animales tales como células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mono y otros huéspedes.

Los vehículos para ser utilizados en la expresión de los péptidos contendrán además secuencias control unidas operativamente a la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido. Tales secuencias control contienen generalmente una secuencia promotora y secuencias que regulan y/o incrementan los niveles de expresión. Además, están a menudo presentes en tales vehículos un origen de replicación y/o un marcador para selección dominante. Por supuesto, las secuencias control y las demás secuencias pueden variar dependiendo de la célula huésped seleccionada.

Las técnicas para transformar o transfectar células huésped son bastante conocidas en el oficio (ver, por ejemplo, Maniatis y col., 1982 y 1989).

Es extremadamente práctico si, después de la información para el péptido, la célula huésped es también cotransformada o cotransfectada con un vector que lleve la información para una molécula del MHC a la cual se sabe que se une dicho péptido. Preferiblemente, la molécula de MHC es HLA-A2.1, HLA-A1 o HLA-A3.1 o cualquier otro alelo del HLA que se sepa que está presente en pacientes con melanoma. HLA-A2.1 es especialmente preferida porque se ha establecido que las células de melanoma llevan antígenos reconocidos por clones de células T citotóxicas restringidos por HLA-A2.1 procedentes de pacientes con melanoma (Anichini, A., 1993).

Células huésped especialmente adecuadas para la expresión de gp100 son las células murinas EL4 y P8.15. Para la expresión de gp100, las células BLM humanas (descritas por Katano, M., 1984) son especialmente adecuadas porque son ya capaces de expresar la molécula del MHC HLA-A2.1.

El gp100 o cualquiera de sus péptidos o de sus secuencias de nucleótidos anteriormente mencionados pueden ser utilizados en una vacuna para el tratamiento del melanoma.

Además de una cantidad inmunogénicamente eficaz del péptido activo, la vacuna puede contener un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

La inmunogenicidad de los péptidos de la invención, especialmente los oligopéptidos, puede ser intensificada mediante entrecruzamiento o mediante acoplamiento a una molécula transportadora inmunogénica (esto es, una macromolécula que tenga la propiedad de producir independientemente una respuesta inmunológica en un paciente, a la cual pueden ser unidos covalentemente los péptidos de la invención).

El acoplamiento covalente a la molécula transportadora puede ser llevado a cabo utilizando métodos bien conocidos en la técnica, la elección exacta de los cuales será dictada por la naturaleza de la molécula transportadora utilizada. Cuando la molécula transportadora inmunogénica es una proteína, los péptidos de la invención pueden ser acoplados, por ejemplo, utilizando carbodiimidas solubles en agua tales como diciclohexilcarbodiimida o glutaraldehído.

Agentes de acoplamiento tales como éstos pueden ser también utilizados para entrecruzar los péptidos consigo mismos sin la utilización de una molécula transportadora separada. Tal entrecruzamiento para dar polipéptidos o agregados peptídicos puede incrementar también la inmunogenicidad.

Ejemplos de vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables útiles en la presente invención incluyen estabilizantes tales como SPGA, carbohidratos (por ejemplo sorbitol, manitol, almidón, sacarosa, glucosa, dextrano), proteínas tales como albúmina o caseína, agentes que contienen proteínas tales como suero bovino o leche desnatada y tampones (por ejemplo tampón fosfato).

Opcionalmente, pueden añadirse a la vacuna uno o más compuestos que tengan actividad adyuvante. Son adyuvantes adecuados, por ejemplo, hidróxido, fosfato u óxido de aluminio, emulsiones oleosas (por ejemplo de Bayol F® o Marcol 52®), saponinas o solubilizado de vitamina E.

La vacuna de acuerdo con la presente invención puede ser administrada, inter alia, intravenosamente, intraperitonealmente, intranasalmente, intradérmicamente, subcutáneamente o intramuscularmente.

La cantidad eficaz útil para ser administrada variará dependiendo de la edad y el peso del paciente y del modo de administración de la vacuna.

La vacuna puede ser empleada con el fin de obtener específicamente una respuesta de células T, pero es posible también que se produzca una respuesta de células B después de la vacunación. Si es así, la respuesta de células B conduce a la formación de anticuerpos contra el péptido de la vacuna, anticuerpos que estarán dirigidos hacia la fuente de la producción del antígeno, esto es hacia las células tumorales. Ésta es una característica ventajosa, ya que de esta forma las células tumorales son combatidas por respuestas de ambos sistemas inmunológicos.

Ambos sistemas inmunológicos serán incluso estimulados más eficazmente cuando la vacuna contenga los péptidos presentados en una molécula del MHC por una célula presentadora de antígeno (APC). La presentación del antígeno puede ser conseguida mediante la utilización de monocitos, macrófagos, células interdigitales, células de Langerhans y especialmente células dendríticas, cargados con uno de los péptidos de la invención. La carga de las APCs puede ser realizada introduciendo los péptidos de la invención en las APCs o en las proximidades de las APCs, pero es más preferible dejar que la APC procese el antígeno gp100 completo. De esta forma se consigue una presentación que remeda de forma muy realista la situación in vivo. Además, el MHC utilizado por la célula es del tipo que es idóneo para presentar el epítopo.

Una ventaja global de la utilización de APCs para la presentación de los epítopos es la elección de la célula APC que es utilizada a este respecto. Se sabe por los diferentes tipos de APCs que existen APCs estimulantes y APCs inhibidoras.

Son preferidos los tipos celulares enumerados, que son denominados células presentadoras de antígeno "profesionales", caracterizadas porque tienen moléculas coestimulantes que tienen una importante función en el proceso de presentación del antígeno. Tales moléculas coestimulantes son, por ejemplo, B7, CTLA-4, CD70 o el antígeno estable al calor (Schwartz, 1992).

Los fibroblastos, que se ha demostrado también que son capaces de actuar como una célula presentadora de antígeno, carecen de estas moléculas coestimulantes.

Es también posible utilizar células ya transfectadas con un vehículo de clonaje que alberga la información para gp100 y que son cotransfectadas con un vehículo de clonaje que contiene la secuencia de nucleótidos para una molécula de clase I del MHC, por ejemplo la secuencia que codifica HLA-A2.1, HLA-A1 o HLA-A3.1. Estas células actuarán como una célula presentadora de antígeno y presentarán fragmentos de gp100 en las moléculas de clase I del MHC que se expresan en su superficie. Se prevé que esta presentación será incrementada cuando la célula sea capaz también de expresar una de las moléculas coestimulantes anteriormente mencionadas o una molécula con una función similar. Esta expresión puede ser el resultado de la transformación o transfección de la célula con un tercer vehículo de clonaje que tenga la información de la secuencia que codifica tal molécula coestimulante, pero puede ser también que la célula sea ya capaz de producir moléculas coestimulantes.

En lugar de una vacuna con estas células, que después de los productos de expresión deseados albergan también muchos elementos que son también expresados y que pueden afectar negativamente la reacción inmunogénica deseada de la célula, es también posible que una vacuna esté compuesta por liposomas que expongan moléculas del MHC cargadas con los péptidos y que, por ejemplo, estén llenos de linfoquinas. Tales liposomas desencadenarán una reacción inmunológica de células T.

Mediante la presentación del péptido de la misma manera que es también presentado in vivo, se provocará una respuesta incrementada de células T. Además, por la función adyuvante natural de las, relativamente grandes, células presentadoras de antígeno, se desencadena también una respuesta de células B. Esta respuesta de células B dará lugar entre otras cosas a la formación de anticuerpos dirigidos hacia el complejo péptido-MHC. Este complejo se encuentra especialmente en células tumorales, en las que se ha demostrado que epítopos de gp100 del paciente son presentados de manera natural, los cuales son por tanto capaces de producir una respuesta de células T. Es este fenómeno que tiene lugar de manera natural el que es intensificado por la vacunación con APCs que presentan ya los péptidos de la invención. Mediante esta intensificación, no sólo se provocará una respuesta incrementada de células T, sino que también se iniciará una respuesta de células B que dará lugar a anticuerpos dirigidos hacia el complejo MHC-péptido.

Las vacunas de acuerdo con la invención pueden ser enriquecidas con numerosos compuestos que tengan un efecto intensificador sobre el inicio y el mantenimiento de las respuestas de células T y de células B después de la vacunación.

De esta forma, la adición de citoquinas a la vacuna incrementará la respuesta de células T. Son citoquinas adecuadas, por ejemplo, interleuquinas tales como IL-2, IL-4, IL-7 o IL-12, GM-CSF, RANTES, factor de necrosis tumoral e interferones, tal como IFN-\gamma.

De forma similar, anticuerpos contra antígenos de superficie de células T, tales como CD2, CD3, CD27 y CD28, intensificarán la reacción inmunogénica.

Además, la adición de epítopos cooperadores para estimular las células cooperadoras CD4^{+} o las células destructoras CD8^{+}, aumenta la reacción inmunogénica. Alternativamente, pueden utilizarse también epítopos cooperadores procedentes de otros antígenos, por ejemplo de proteínas derivadas del choque de calor o de la toxina colérica.

Otra parte de la invención está constituida por la utilización de linfocitos infiltrantes de tumores (TILs) reactivos con gp100. En este método, la primera etapa es la toma de una muestra del paciente. Esto se realiza normalmente por resección de un depósito tumoral bajo anestesia local. Los TILs presentes en este espécimen son luego expandidos en cultivo durante cuatro a ocho semanas, de acuerdo con métodos conocidos (Topalian, S.L. y col., 1987). Durante este cultivo se comprueba la reactividad de los TILs con gp100 o con uno de los epítopos derivados de gp100. Los TILs que reconocen el antígeno son aislados y cultivados posteriormente.

Los linfocitos infiltrantes de tumores reactivos con gp100 que son obtenidos mediante este método, forman también parte de la invención. Se ha encontrado que una de tales líneas celulares de TIL, denominada TIL 1200, reacciona específicamente con gp100 y sus epítopos. Esta línea celular TIL 1200 expresa también la molécula del MHC HLA-A2.1. Además, se ha demostrado la expresión de TCR \alpha/\beta, CD3 y CD8 por esta línea celular. Además, TIL 1200 reconoce transfectantes que expresan HLA-A2.1 y gp100.

Este TIL 1200 y otros TILs que reconocen gp100 son adecuados para el tratamiento de pacientes con melanoma. Para tal tratamiento, los TILs son cultivados según se indicó anteriormente, y se vuelven a administrar a los pacientes mediante una infusión intravenosa. El éxito del tratamiento puede ser incrementado mediante el pretratamiento del huésped portador del tumor con radiación del cuerpo entero o mediante tratamiento con ciclofosfamida y mediante la administración simultánea de interleuquina-2 (Rosenberg, S.A y col., 1986).

Los TILs infundidos de nuevo al paciente son preferiblemente TILs autólogos (esto es, derivados del propio tumor del paciente), pero puede imaginarse también una infusión con TILs alogénicos.

Una utilización adicional de los TILs obtenidos por el método anteriormente descrito es para diagnóstico in vivo. El marcaje de los TILs, por ejemplo con ^{111}In (Fisher, 1989) o con cualquier otro marcador de diagnóstico adecuado, los convierte en idóneos para la identificación de depósitos tumorales en pacientes con melanoma.

Otra parte de la invención está constituida por el receptor de células T (TCR) expresado por CTLs reactivos con gp100. Como es bien conocido en la técnica, el TCR determina la especificidad de un CTL. Por tanto, el ADNc que codifica el TCR, especialmente su región variable, puede ser aislado e introducido en células T, transfiriendo de este modo actividad antitumoral a cualquier células T. Especialmente, la introducción de tal TCR en células T autólogas y la expansión posterior de estas células T, tendrá como resultado un gran número de CTLs adecuados para la transferencia adoptiva al paciente autólogo.

Pueden utilizarse también para fines de vacunación células que alberguen este receptor de células T.

Una vacuna puede estar compuesta también por células de melanoma capaces de expresar gp100. Es posible aislar estas células de un paciente, utilizando anticuerpos anti-gp100 tales como NKI-beteb, pero es posible también producir tales células de melanoma a partir de líneas celulares de melanoma cultivadas que sean productoras naturales de gp100 o que hayan sido manipuladas genéticamente para producir gp100. Estas células pueden ser irradiadas para que no sean tumorigénicas e infundidas (de nuevo) al paciente. Con el fin de incrementar el efecto inmunológico de estas células de melanoma, se prefiere alterar las mismas genéticamente para producir una linfoquina, preferiblemente interleuquina-2 (IL-2) o el factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF). Las células de melanoma gp100^{+} pueden ser transfectadas con un vehículo de clonaje que tenga la secuencia que codifica la producción de IL-2 o GM-CSF.

La infusión de tal vacuna en un paciente estimulará la formación de CTLs.

Otro tipo de vacunación que tiene un efecto similar es la vacunación con ADN puro, por ejemplo el ADN de un vector o un vector vírico que tenga la secuencia de ADN que codifica el antígeno gp100 o péptidos derivados del mismo. Una vez inyectado, el virus infectará las células o el ADN transformará las células para que expresen el antígeno o el(los) péptido(s).

Son también parte de la invención anticuerpos hacia cualquier péptido de gp100, incluyendo anticuerpos hacia (V)-(W)-(K)-T-W-G-Q-Y-W-Q-V-(L) y hacia L-L-D-G-T-A-T-L-R-L.

Anticuerpos monoespecíficos hacia estos péptidos pueden ser obtenidos mediante purificación por afinidad de antisueros poliespecíficos por una modificación del método de Hall, R. y col. (1984). Pueden obtenerse antisueros poliespecíficos inmunizando conejos de acuerdo con esquemas estándar de inmunización.

El anticuerpo monoespecífico utilizado en la presente es definido como una única especie de anticuerpo o como múltiples especies de anticuerpos con características de unión homogéneas para el antígeno relevante. Unión homogénea, según se utiliza en la presente, se refiere a la capacidad de la especie de anticuerpo para unirse al dominio de unión al ligando de la invención.

El anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo monoclonal, más preferiblemente un anticuerpo monoclonal humanizado.

Pueden prepararse anticuerpos monoclonales inmunizando ratones singénicos, preferiblemente Balb/c, con la proteína apropiada mediante técnicas conocidas en el oficio (Köhler, G. y Milstein, C., 1975). Las células de hibridoma son seleccionadas posteriormente por crecimiento en hipoxantina, timidina y aminopterina en un medio de cultivo celular apropiado tal como el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM). Los hibridomas productores de anticuerpos son clonados, utilizando preferiblemente la técnica del agar blando de MacPherson (1973). Colonias discretas son transferidas a pocillos individuales de placas de cultivo para ser cultivadas en un medio de cultivo apropiado. Las células productoras de anticuerpos son identificadas mediante selección con el inmunógeno apropiado. Las células de hibridoma positivas para el inmunógeno son mantenidas mediante técnicas conocidas en el oficio. Anti-anticuerpos monoclonales específicos son producidos mediante el cultivo de los hibridomas in vitro o mediante la preparación de fluido ascítico en ratones después de la inyección de los hibridomas mediante procedimientos conocidos en la
técnica.

Se prefiere la utilización de anticuerpos humanizados. Los métodos para humanizar anticuerpos, tales como el injerto de CDR, son conocidos (Jones, P.T y col., 1986). Otra posibilidad para evitar la respuesta antigénica a los anticuerpos reactivos con los polipéptidos de acuerdo con la invención es la utilización de anticuerpos humanos o de fragmentos o derivados de los mismos.

Pueden producirse anticuerpos humanos mediante la estimulación in vitro de linfocitos B aislados, o pueden ser aislados de linfocitos B (inmortalizados) que hayan sido recogidos de un ser humano inmunizado con al menos un dominio de unión al ligando de acuerdo con la invención.

Anticuerpos como los descritos anteriormente pueden ser utilizados para la vacunación pasiva de pacientes con melanoma. Un tipo preferido de anticuerpos para este tipo de vacuna son anticuerpos dirigidos contra los péptidos anteriormente mencionados presentados en conexión con la molécula del MHC. Para producir este tipo de anticuerpos, se requiere la inmunización con péptidos presentados por APCs. Tal inmunización puede ser realizada según se describió anteriormente. Alternativamente, pueden aislarse anticuerpos humanos hacia los complejos péptido-MHC de pacientes tratados con una vacuna consistente en APCs cargadas con uno de dichos péptidos.

Los anticuerpos, que se forman después del tratamiento con una de las vacunas de la invención, pueden ser también utilizados para la monitorización de dicha vacunación. Para tal método, se obtiene suero de los pacientes y se detectan los anticuerpos dirigidos hacia el péptido con el cual han sido vacunados. Conociendo el título de anticuerpos procedente de esta detección, puede considerarse si hay necesidad de una vacunación de refuerzo.

La detección específica de dichos anticuerpos en el suero puede ser realizada mediante la utilización de péptidos marcados. La marca puede ser cualquier marcador de diagnóstico conocido en el campo del diagnóstico in vitro, pero las más preferidas (y las más ampliamente utilizadas) son enzimas, colorantes, metales y radionúclidos tales como ^{67}Ga, ^{99m}Tc, ^{111}In, ^{113m}In, ^{123}I, ^{125}I o ^{131}I.

Los marcadores de radiodiagnóstico pueden ser acoplados directamente a los péptidos de la invención o través de restos quelantes que hayan sido acoplados al péptido directamente o mediante moléculas adaptadoras o separadoras. La técnica de acoplamiento de radionúclidos a péptidos o a estructuras similares a péptidos es ya conocida en el campo del diagnóstico (tumoral) a partir de las numerosas aplicaciones de anticuerpos marcados utilizadas en ensayos in vivo e in vitro.

El marcaje directo de péptidos puede ser realizado, por ejemplo, según está descrito en el método de un vial (Haisma, 1986). Un método general para el marcaje de péptidos mediante quelantes, con o sin moléculas adaptadoras o separadoras, ha sido descrito por ejemplo en USP 4.472.509 y USP 4.485.086. Quelantes que utilizan un anhídrido bicíclico de DTPA han sido descritos en Hnatowich, D.J. y col. (1983). El acoplamiento a través de compuestos diamida dimercaptida ha sido descrito en EP 188.256.

La presente invención se describe adicionalmente por medio de ejemplos con referencia a las figuras acompañantes, en las cuales:

La Fig. 1 muestra la organización genómica de parte del gen gp100/Pmel17 humano. A y A' representan los intrones que están eliminados en los transcritos correspondientes al ADNc de gp100 y al ADNc de Pmel17, respectivamente. Las secuencias de los exones están indicadas en mayúsculas y las secuencias de los intrones como minúsculas. Está subrayado el mejor ajuste a la secuencia del punto de ramificación (Ruskin, B. y col., 1984).

La Fig. 2 muestra una alineación de la parte carboxiterminal de miembros de la familia gp100/Pmel17. Se indican los aminoácidos idénticos (-) y los huecos (*). Están indicados también los residuos de cisteína conservados (#).

Fig. 3. (A) Se muestran mutantes de gp100 por deleción que codifican partes de la proteína gp100 (los números indican los aminoácidos de la proteína gp100 según están indicados en la SEC ID Nº: 2).

\hskip1,0cm

(B) Reconocimiento por TIL 1200 de células transfectadas con HLA-A2.1 y de los mutantes de gp100 por deleción mostrados en la Figura 3A.

Fig. 4. (A) Se analizaron cinco péptidos derivados de la región 148-166 de gp100, que variaban desde un 8-mero hasta un 11-mero, para determinar su reconocimiento por TIL 1200. Se detectó lisis específica a una proporción de efector respecto a diana de 30:1.

\hskip1,0cm

(B) Valoración de los péptidos de gp100 identificados en la Figura 4A por su reconocimiento por TIL 1200 (proporción E/D 30:1).

Fig. 5. Unión de gp100 y de epítopos víricos a HLA-A2.1.

Ejemplo 1 Caracterización molecular de gp100 Materiales y métodos Células y anticuerpos monoclonales

Las líneas celulares de melanoma Mel-2a, M14, MEWO, BLM (Vennegoor y col., 1988; van Muijen y col., 1991; Bean y col., 1975; Katano y col., 1984) y la línea celular de melanoma uveal Mel 202 (Ksander y col., 1991) han sido descritas previamente. El aislamiento de melanocitos humanos normales de mama o de prepucio fue realizado por el método de Eisinger y Marko (1982) con modificaciones de Smit y col. (1993).

Los mAbs NKI-beteb y HMB-50 han sido descritos previamente (Vennegoor y col., 1988; Vogel y Esclamado, 1988). El mAb HMB-45 fue adquirido a Enzo Biochem.

Construcciones de ADN y transfecciones

El fragmento de EcoRI de 2,2 kb que contenía ADNc de gp100 se hizo de extremos romos rellenando los extremos con ADN polimerasa Klenow y posteriormente se clonó en ambas orientaciones (pSVLgp100+ y pSVLgp100-) en el sitio de SmaI del vector de expresión eucariótico pSVL (Pharmacia). El pSVL contiene el promotor tardío de SV40 y un sitio de poliadenilación, así como el origen de replicación de SV40, permitiendo un número de copias muy elevado durante la expresión transitoria en células COS-7.

Para la construcción de la unidad de transcripción de gp100 truncada en 3' pSVLgp100+(@BS), eliminamos la secuencia entre el sitio de BglII en la parte 3' del ADNc de gp100 y el sitio de SacI en el sitio de clonaje múltiple del vector. La construcción resultante codifica una proteína gp100 truncada en la que los 133 aminoácidos carboxiterminales de gp100 están sustituidos por 4 aminoácidos (Arg-Ile-Gln-Thr) codificados por secuencias del vector.

La expresión transitoria de las construcciones en células COS-7 se realizó utilizando 40 \mul de reactivo lipofectina de BRL (Felgner y col., 1987) y 7,5 \mug de ADN según se describió previamente (Loenen y col., 1991).

Inmunofluorescencia

Las células COS-7 transfectadas fueron preparadas para inmunofluorescencia 48 horas después de la adición de la mezcla lipofectina/ADN según se describió previamente (Vennegoor y col., 1988). Después de la incubación con el anticuerpo primario durante 45 minutos, las células fueron lavadas e incubadas con F(ab)'_{2} anti-IgG de ratón producido en cabra marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Nordic) durante 30 minutos. Las preparaciones fueron examinadas utilizando un microscopio de barrido láser confocal a 488 nm (Biorad MRC 600).

Marcaje metabólico, inmunoprecipitaciones y mapeo con proteasa V8

Los experimentos de inmunoprecipitación fueron realizados en células marcadas metabólicamente (L-[^{35}S]-metionina/cisteína; Amersham) según fue descrito por Vennergoor y col. (1988), utilizando el mAb NKI-beteb o el HMB-50 unido covalentemente a esferas de proteína A-sefarosa CL 4B (Pharmacia). En algunos experimentos se añadió tunicamicina (75 \mug/ml, Calbiochem) durante el periodo de premarcaje y permaneció presente durante la reacción de marcaje metabólico (12,5 minutos). Los inmunoprecipitados fueron analizados bajo condiciones reductoras (\beta-mercaptoetanol al 5% en tampón de muestra-SDS) mediante SDS-PAGE utilizando geles de gradiente de poliacrilamida 5-17,5%. El peso molecular relativo de las proteínas fue determinado utilizando marcadores de peso molecular preteñidos sometidos a la electroforesis simultáneamente (BRL). Los geles fueron tratados con salicilato de sodio 1 M (pH 5,4) antes de la autorradiografía (Kodak XAR).

El mapeo con proteasa V8 fue realizado utilizando la digestión de proteínas en el procedimiento de cortes de gel descrito por Cleveland y col. (1977). Brevemente, cortes de gel que contenían las proteínas de 100 kD fueron colocados en los pocillos de un segundo gel de SDS (10%) y cubiertos con proteasa V8 de Staphyloccus aureus (2,5 \mug/muestra, Miles Laboratories). Después de la electroforesis los geles fueron tratados según se describió anteriormente.

Clonaje molecular de parte del gen gp100/Pmel17

Parte del gen gp100/Pmel17 fue amplificada por PCR (la ADN polimerasa Taq era de Gibco) en ADN genómico humano aislado de linfocitos de sangre periférica (PBLs) utilizando los cebadores siguientes: 1497/1516: 5'-TATTGAAAGTGCCGAGATCC-3' y 1839/1857: 5'-TGCAAGGACCACAGCCATC-3' según se describió previamente (Adema y Baas, 1991). Los productos de la PCR fueron amplificados posteriormente utilizando un conjunto de cebadores anidados que contenían un sitio adicional de EcoRI (5'-TATCTAGAATTCTGCACCAGATACTGAAG-3' y 5'-TATCTAGAATTCTGCAAGATGCCCACGATCAG-3'). Los sitios de EcoRI subrayados en estos cebadores fueron utilizados para clonar el producto de PCR en el sitio de EcoRI de pUC18.

Aislamiento y análisis del ARN

El ARN total fue aislado utilizando el procedimiento del tiocianato de guanidina y centrifugación a través de una banda de cloruro de cesio (Chirgwin y col., 1979). Se preparó ADNc utilizando el kit "Geneamp RNA PCR kit" (Perkin Elmer Cetus) según las indicaciones del fabricante. Se realizó un análisis por PCR de los ADNcs durante 35 ciclos en presencia de MgCl_{2} 3 mM utilizando los cebadores 1497/1516 y 1839/1857 (ver anteriormente) según se describió previamente (Adema y Baas, 1991). Los productos de la reacción fueron fraccionados por tamaños en un gel de agarosa, transferidos a una membrana de nailon (Hybond-N, Amersham) e hibridados a sondas oligonucleotídicas marcadas con [^{32}P] según se describió previamente (Adema y Baas, 1991). Como sondas utilizamos un oligonucleótido de la unión exón/exón específico de gp100 (5'-CTTCTTGACCAGGCATGATA-3') o un oligonucleótido específico de Pmel17 (5'-TGTGAGAAGAATCCCAGGCA-3') que corresponde a 20 de los 21 nucleótidos adicionales presentes en el ADNc de Pmel17. En todos los experimentos de hibridación se incluyó como control una transferencia de manchas que contenía un oligonucleótido comprendiendo la unión exón/exón de Pmel17 (5'-GCTTATCATGCCTGTGCCTGGATTCTTCTCACAGGT-3').

Análisis de la secuencia de nucleótidos

Los clones de ADNc y de ADN genómico de gp100 fueron secuenciados mediante el método de secuenciación de los didesoxinucleótidos (Sanger y col., 1977) utilizando ADN polimerasa de T7 (Pharmacia). En cada caso se determinó la secuencia de ambas hebras. Como los clones de ADN genómico fueron obtenidos después de la PCR, se determinó la secuencia de cuatro clones independientes. El análisis de la secuencia de ADN fue realizado utilizando los programas para el análisis de secuencias del Wisconsin Genetics Computing Group (Devereux y col., 1984).

Resultados

La expresión del ADNc de gp100 en células COS-7 no pigmentadas tiene como resultado la inmunorreactividad con los mAbs NKI-beteb, HMB-50 y HMB-45.

La expresión del ADNc de gp100 en células de melanoma BLM negativas para gp100 tiene como resultado la inmunorreactividad con los mAbs específicos del linaje de melanocitos NKI-beteb, HMB-50 y HMB-45. Con el fin de determinar si la expresión del ADNc de gp100-c1 en células no melanocíticas tenía también como resultado la inmunorreactividad con estos mAbs, llevamos a cabo experimentos de expresión transitoria en células COS-7 (fibroblastos de riñón de mono) con construcciones que contenían ADNc de gp100 en orientación codificadora o no codificadora. Solamente las células COS-7 transfectadas con la construcción que contenía el ADNc en la orientación codificadora (COS-7/pSVLgp100+) reaccionaban con los tres mAbs. Estos datos demuestran que la inmunorreactividad con los mAbs NKI-beteb, HMB-50 y HMB-45 después de la expresión del ADNc de gp100 no está restringida a células melanocíticas. Además, estos datos muestran que el sistema de expresión en COS puede ser utilizado para la caracterización bioquímica posterior de las proteínas codificadas por el ADNc de gp100.

Análisis de las proteínas codificadas por el ADNc de gp100

Con el fin de caracterizar las proteínas codificadas por el ADNc de gp100, células COS-7/pSVLgp100+ fueron marcadas metabólicamente y sometidas a inmunoprecipitación con los mAbs NKI-beteb o HMB-50. Los mAbs NKI-beteb y HMB-50 inmunoprecipitan específicamente proteínas de 100 kD aproximadamente (95-110 kD) de extractos de las células COS-7/pSVLgp100+. El peso molecular de estas proteínas es similar (ver también más adelante) al de las inmunoprecipitadas a partir de extractos de células MEWO marcadas metabólicamente que expresan los antígenos de manera endógena (Vennegoor y col., 1988). Consistentemente con informes previos (Vennegoor y col., 1988; Vogel y Esclamado, 1988), ambos mAbs reconocen también una proteína de 10 kD en extractos de células de melanoma MEWO. Una proteína del mismo tamaño reacciona con el mAb NKI-beteb en células COS-7/pSVLgp100+ y puede ser detectada con el mAb HMB-50 después de una exposición prolongada (no mostrado). Nosotros observamos que la cantidad de proteína de 10 kD variaba considerablemente entre experimentos. Ninguna proteína no específica fue inmunoprecipitada por ninguno de los mAbs procedentes de los extractos preparados a partir de células COS-7 transfectadas con la construcción que contenía el ADNc en la orientación no codificadora.

Se han encontrado también glicoproteínas de 100 kD aproximadamente que reaccionaban con los mAbs NKI-beteb y HMB-50 en el medio de cultivo de células de melanoma (Vennegoor y col., 1988; Vogel y Esclamado, 1988). La comparación del medio de cultivo de células COS-7/pSVLgp100+ marcadas metabólicamente y de células MEWO revela que ambos mAbs reconocen también proteínas de 100 kD aproximadamente (ver también más adelante) en el medio de cultivo de estas células. Ninguna proteína de 10 kD es inmunoprecipitada por los mAbs a partir del medio de cultivo de las células COS-7/pSVLgp100+, igual que se ha mostrado para células de melanoma. Estos datos demuestran que, igual que en las células de melanoma, las proteínas de 100 kD aproximadamente reconocidas por los mAbs NKI-beteb y HMB-50 en células COS-7/pSVLgp100+ son secretadas.

Para excluir la posibilidad de que las proteínas detectadas por los mAbs deriven de genes endógenos inducidos después de la transfección con ADNc de gp100, realizamos experimentos de inmunoprecipitación con células COS-7 que expresaban una unidad de transcripción de gp100 truncada en 3' (para detalles ver Materiales y Métodos). Proteínas de 85 kD aproximadamente son inmunoprecipitadas por ambos mAbs a partir de células COS-7 que expresaban esta construcción, lo cual es consistente con una deleción de 129 aminoácidos. Este hallazgo proporciona una evidencia directa de que la proteína de 100 kD reconocida por los mAbs NKI-beteb y HMB-50 en las células COS-7/pSVLgp100+, está codificada por el ADNc de gp100.

La proteína de 100 kD codificada por el ADNc de gp100 es idéntica a gp100

Las proteínas de 100 kD aproximadamente identificadas por los mAbs NKI-beteb y HMB-50 en las células COS-7/pSVLgp100+ frente a las células MEWO, tienen una movilidad ligeramente diferente cuando son analizadas mediante SDS-PAGE. Como se ha demostrado que las proteínas que reaccionan con estos mAbs están glicosiladas en las células de melanoma (Vennegoor y col., 1988; Vogel y Esclamado, 1988), estas diferencias podrían ser debidas a una glicosilación alterada, un acontecimiento observado frecuentemente en el sistema de expresión COS. Para confirmar este hecho, se utilizó el mAb NKI-beteb para inmunoprecipitar proteínas de células MEWO y de células COS-7/pSVLgp100+ cultivadas en presencia del inhibidor de glicosilación tunicamicina. En las células COS-7/pSVLgp100+ y en las células MEWO el tamaño de las proteínas de 100 kD aproximadamente se reduce a dos bandas de proteína de 90 kD y 85 kD, confirmando que la diferencia observada en la movilidad es debida a una glicosilación alterada.

Con el fin de proporcionar pruebas adicionales de que las proteínas reconocidas por el mAb NKI-beteb en células COS-7/pSVLgp100+ y en células MEWO son idénticas, llevamos a cabo un experimento de mapeo con proteasa V8. Se obtienen los mismos fragmentos proteicos después de la digestión con proteasa V8 de la proteína principal de 100 kD aislada de células COS-7/pSVLgp100+ o de células MEWO. A partir de estos datos, concluimos que el ADNc de gp100 codifica la glicoproteína gp100 específica del linaje melanocítico y reconocida por los mAbs NKI-beteb y HMB-50 en células de melanoma.

gp100 Es una proteína transmembranal de tipo I altamente homóloga a Pmel17

Se determinó la secuencia de nucleótidos del ADNc de gp100. Contienen 2115 pares de bases (pb) y termina con un tramo poli(A) de 15 nucleótidos que está precedido por la secuencia de poliadenilación consenso AATAAA (Proudfoot y Brownlee, 1976). En el ADNc de gp100 está presente un marco de lectura abierto (ORF) que se extiende desde el nucleótido 22 hasta el 2007. Este ORF comienza con un codón ATG en el contexto de secuencia apropiado para el inicio de la traducción (Kozak, 1987) y codifica una proteína de 661 aminoácidos (SEC ID Nº: 1). Los 20 aminoácidos aminoterminales se ajustan a todos los criterios de las secuencias señal, incluyendo un sitio potencial de corte después de ALA en posición 20 (von Heyne, 1986), que indicaría que la gp100 madura contiene 641 aminoácidos (70 kD aproximadamente). Sobre la base del análisis de las representaciones gráficas de hidrofobicidad (Kyte y Doolittle, 1982), un único dominio transmembranal limitado por residuos cargados está presente en la parte carboxiterminal (aminoácidos 591-611) de gp100. El dominio citoplásmico pronosticado tiene 45 aminoácidos de longitud. Están presentes cinco supuestos sitios de glicosilación ligada a N, lo cual es consistente con el hecho de que gp100 sea una glicoproteína. Además, están presentes un dominio rico en histidina (aminoácidos 182-313), un dominio rico en treonina (aminoácidos 309-427) conteniendo secuencias de aminoácidos repetitivas y un dominio rico en cisteína (aminoácidos 475-566).

La búsqueda en una base de datos (Pearson y Lipman, 1988; Altschul y col., 1990) reveló que gp100 es casi idéntica a Pmel17, otra proteína específica de melanocitos (Kwon y col., 1991). Las diferencias de aminoácidos entre gp100 y Pmel17 consisten en sustituciones en la posición 274 (T-C/PRO-LEU) y en la posición 597 (C-G/ARG-PRO) y un tramo de 7 aminoácidos ausente en gp100 en la posición 587 (ver también la Figura 2). La diferencia de un solo nucleótido en posición 782 (C-T) no tiene como resultado una sustitución de aminoácidos. La gp100 es también un 80% homóloga a una supuesta proteína deducida de un clon de ADNc parcial (RPE-1) aislado de una biblioteca de ADNc de retina bovina (Kim y Wistow, 1992) y un 42% homóloga a una proteína de la matriz melanosómica del pollo, MMP115 (Mochii y col., 1991).

gp100 Y Pmel17 están codificadas por un único gen

La diferencia más sorprendente entre los ADNcs de gp100 y Pmel17 está en la deleción en marco de 21 pb en el ADNc de gp100. Una explicación posible de esta diferencia es la existencia de dos genes estrechamente relacionados. Sin embargo, como ambos ADNcs tienen secuencias de nucleótidos idénticas en sus regiones 3' no traducidas, esta explicación no es probable. Otra posibilidad es que ambos ADNcs correspondan a transcritos generados por ayuste alternativo de un único transcrito primario. Con el fin de analizar esta hipótesis, utilizamos PCR para analizar el ADN genómico correspondiente a la parte del gen de gp100 de alrededor del supuesto sitio de ayuste alternativo. La comparación de la secuencia de nucleótidos de este ADN genómico con la secuencia del ADNc de gp100-c1 reveló la presencia de un intrón (102 pb) justo en la posición de la inserción de 21 pb en el ADNc de Pmel17 (Figura 1). Los límites exón/intrón se ajustan perfectamente a las secuencias consenso del sitio donante de ayuste 5' y del sitio aceptor de ayuste 3' (Padgett y col., 1986). En el ADN genómico, la secuencia que contiene los 21 pb adicionales en el ADNc de Pmel17 está situada directamente corriente arriba del sitio de corte 3' utilizado para generar ARN de gp100 y está precedida por un sitio aceptor de ayuste 3' alternativo (Fig. 1). Mientras que el sitio aceptor de ayuste 3' específico de gp100 se ajusta a la secuencia consenso, el sitio aceptor de ayuste 3' específico de Pmel17 parece ser subóptimo en cuanto a que carece de una región rica en pirimidinas (Fig. 1). Sitios de procesamiento de ARN subóptimos están presentes en muchos precursores del ARN mensajero procesados alternativamente y han sido implicados en la función de regulación del procesamiento alternativo del ARN (revisado por Green, 1991). Colectivamente, estos datos demuestran que los transcritos correspondientes a los ADNcs de gp100 y Pmel17 son generados mediante ayuste alternativo de un único transcrito primario y por tanto se originan de un único gen.

Expresión de los ARNs de gp100 y Pmel17 en células del linaje melanocítico

El hallazgo de que los ARNs de gp100 y Pmel17 se producen por ayuste alternativo de un único transcrito primario, genera la cuestión de si esto tiene lugar de una manera regulada en el desarrollo. Una especie de ARN de 2,5 kb es el principal producto ARN detectado por el ADNc de gp100 en transferencias Northern que contienen ARN aislado de células melanocíticas. Los mismos resultados fueron obtenidos por Kwon y col. (1987) utilizando como sonda ADNc de Pmel17-1. Sin embargo, ninguna de las sondas discriminaba entre los ARNs de gp100 y Pmel17. Para investigar la expresión de los ARNs de gp100 y Pmel17 en células del linaje melanocítico, llevamos a cabo un ensayo de transcriptasa inversa/reacción en cadena de la polimerasa (RT/PCR) seguido por transferencia Southern e hibridación con una sonda oligonucleotídica específica de la unión exón/exón de gp100 o con una sonda oligonucleotídica específica de Pmel17 (ver Materiales y Métodos). Los productos ayustados de gp100 y Pmel17 son ambos detectados en 3 de 4 células de melanoma cutáneo, en células de melanoma uveal así como en melanocitos neonatales y adultos. No es detectado ningún producto con ninguna de las sondas en células de melanoma BLM negativas para gp100. Estos resultados demuestran que en todas las células melanocíticas examinadas, los ARNs de gp100 y Pmel17 se expresan simultáneamente.

Ejemplo 2 Reconocimiento de gp100 por TILs Material y métodos Cultivo celular

Se generaron TILs mediante el crecimiento de suspensiones de células individuales de melanomas metastásicos con 1.000 U/ml de IL-2 (Cetus Corp., Emeryville, CA) y se cultivaron según se describió previamente (Kawakami, 1992). Se obtuvieron las líneas celulares de melanoma Mel 397 y Mel 624 y se cultivaron según se informó previamente (Kawakami, 1992). Las líneas celulares de melanoma HLA-A2.1^{+} MeWo (Bean, 1975) y BLM (Katano, 1984) y los transfectantes P815 murinos fueron cultivados en DMEM (Gibco, Paisley, Escocia, R.U.) más un 7,5% de FCS inactivado por calor (Gibco). JY, K562 y los transfectantes EL4 murinos fueron cultivados en medio de Iscove (Gibco) más un 7,5% de FCS. Las células murinas fueron cultivadas en presencia de \beta-ME 5 x 10^{5} M, y todos los medios contenían antibióticos. El aislamiento de melanocitos normales del prepucio se llevó a cabo mediante el método de Eisinger y Marko (1982) con modificaciones según se describió previamente (Smit, 1989). Melanocitos procedentes de dos a tres pases fueron utilizados en ensayos de liberación de cromo.

Construcciones de ADN y transfección

El plásmido pBJ1-gp100neo fue obtenido mediante clonaje del fragmento de EcoRI de un clon de ADNc de gp100 en lambda en la orientación codificadora en el poliadaptador pBJ1-neo (Lin, 1990). El plásmido pBA2 conteniendo un fragmento genómico que codifica HLA-A2.1 y la \beta-2 microglobulina humana fue proporcionado amablemente por E.J. Baas (The Netherlands Cancer Institute, Division of Biochemistry, Amsterdam, Países Bajos). El plásmido pGK-hyg contiene el gen de la higromicina fosfotransferasa (Te Riele, 1990). Para la introducción de los genes de HLA-A2.1 y de la \beta-2 microglobulina humana, células EL4 fueron transfectadas con 18 \mug de pBA2 y 2 \mug de ADN de pGK-hyg de acuerdo con el procedimiento de coprecipitación con fosfato de calcio (Graham, 1973) utilizando Sistemas de Transfección con Fosfato de Calcio (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Veinticuatro horas después de la transfección, se añadieron al medio 500 \mug/ml de higromicina B (Calbiochem-Novabiochem Corp., La Jolla, CA) para la selección de los transfectantes estables. Células EL4 HLA-A2.1^{+} gp100^{+} fueron obtenidas mediante la transfección de clones de EL4 HLA-A2.1^{+} estables con 20 \mug de ADN de pBJ1-gp100neo mediante coprecipitación con fosfato de calcio y fueron seleccionadas con 1 mg/ml de G418. Las células P815 A2.1 y P815 A2.1/gp100 fueron proporcionadas amablemente por P. Coulie (Ludwig Ins., Brussels, Bélgica).

mAb Y citometría de flujo

El análisis fenotípico de melanocitos de melanomas, transfectantes y normales fue realizado mediante inmunofluorescencia indirecta seguido por citometría de flujo utilizando un FACScan® (Becton Dickinson & Co., Mountain View, CA). El mAb anti-gp100 NKI-beteb purificado (Vennegoor, 1988) y los mAbs anti-HLA-A2 BB7.2 (sobrenadante del cultivo; Parham, 1981) y MA2.1 (líquido ascítico dilución 1:500; Parham, 1978) fueron utilizados como reactivos primarios. GAM-IgG-F(ab')_{2} conjugado a FITC (Zymed Laboratories, Inc., S. San Francisco, CA) fue utilizado para la segunda incubación. Para la detección del antígeno gp100 intracelular, las células fueron permeabilizadas en digitonina 0,01% y fijadas posteriormente en paraformaldehído al 1%.

Ensayo de liberación de cromo

Los ensayos de liberación de cromo fueron realizados según fue descrito previamente (Kawakami, 1992). Brevemente, 10^{6} células diana fueron incubadas con 100 \muCi de Na^{51}CrO_{4} (Amersham Int., Bucks, R.U.) durante 1 hora. Posteriormente se añadieron varias cantidades de células efectoras a 2 x 10^{3} células diana en pocillos triplicados de placas de microvaloración de fondo en U (Costar, Badhoevedorp, Países Bajos) en un volumen final de 150 \mul. Después de 5 horas de incubación, se recogió parte del sobrenadante y se midió su contenido radioactivo. Las células diana fueron incubadas durante 48 horas con 50 U/ml de IFN-\gamma recombinante humano (Boehringer, Ingelheim, Alemania) o de ratón (TNO, Rijswijk, Países Bajos) antes de su utilización en los ensayos de liberación de cromo.

TIL 1200

En la búsqueda de linfocitos T citotóxicos (CTLs) específicos de gp100, nosotros nos centramos en HLA-A2.1 como un elemento de restricción debido a su presencia extendida en caucasianos y a su supuesto papel dominante en la reactividad de los CTLs contra el melanoma. Se utilizó para este estudio una línea de TIL HLA-A2.1^{+}, TIL 1200 (Shilyansky, J. y col., 1994). Esta línea de TIL expresa TCR \alpha/\beta, CD3 y CD8.

Resultados La destrucción restringida por HLA-A2.1 de células tumorales de melanoma por TIL 1200 se corresponde con la expresión de gp100

La actividad citolítica de TIL 1200 fue analizada utilizando un panel de líneas celulares de melanoma humano. TIL 1200 lisó eficazmente las células tumorales de melanoma Mel 624 y MeWo HLA-A2.1^{+}, ambas de las cuales expresan gp100, mientras que no se observó reactividad hacia células Mel 397 HLA-A2.1^{-} gp100^{+}. Es interesante señalar que observamos que las células de melanoma BLM HLA-A2.1^{+} son también resistentes a la lisis por TIL 1200. Además, células B transformadas por VEB HLA-A2.1^{+} (JY), que carecen también de expresión de gp100, y células K562, no fueron lisadas por TIL 1200. En conjunto, estos datos demuestran que TIL 1200 presenta una actividad destructora restringida por HLA-A2.1 que se correlaciona con la expresión de gp100.

TIL 1200 reconoce transfectantes HLA-A2.1^{+} gp100^{+}

Células EL4 cotransfectadas con un fragmento genómico que codificaba HLA-A2.1 junto con un plásmido que confería resistencia a higromicina, fueron seleccionadas y analizadas mediante citometría de flujo. Las células que expresaban HLA-A2.1 fueron transfectadas posteriormente con pBJ1-gp100neo, que codifica gp100 y confiere resistencia a G418. Los transfectantes estables fueron seleccionados y sometidos a selección por la expresión de gp100 utilizando el mAb NKI-beteb. En colaboración con P. Coulie se generó un panel similar de transfectantes en células P815 murinas (P815 A2.1 y P815 A2.1/gp100). Utilizando estos transfectantes murinos como células diana en un ensayo de liberación de cromo, observamos claramente una lisis específica de gp100 por TIL 1200. El porcentaje de lisis específica (25-35%, E/D 30:1) de los transfectantes murinos EL4 A2.1/gp100 y P815 A2.1/gp100 por TIL 1200 fue algo menor en comparación con el observado con células de melanoma humano HLA-A2.1^{+} gp100^{+} (45-60%, E/D 30:1). Esta diferencia puede ser explicada por moléculas accesorias no coincidentes entre los TILs humanos y los transfectantes murinos. Para solventar esto introdujimos el antígeno gp100 en células de melanoma humano BLM HLA-A2.1^{+} gp100^{-} mediante transfección de pBJ1-gp100neo. Los clones de BLM gp100 estables fueron analizados en ensayos de liberación de cromo utilizando TIL 1200. Los clones de BLM gp100 mostraron ser tan sensibles a la lisis por TIL 1200 como las células Mel 624 y MeWo que expresan el antígeno gp100 endógenamente. La especificidad de gp100 de TIL 1200 fue demostrada además por la ausencia de lisis de células BLM resistentes a G418 que no expresan gp100, excluyendo la posibilidad de que sean reconocidos péptidos derivados de neomicina.

Ejemplo 3 Mapeo de los epítopos de gp100 reconocidos por TIL 1200 utilizando mutantes por deleción de gp100

Básicamente, se utilizan comúnmente dos métodos en la técnica para mapear epítopos reconocidos por CTL anti-tumorales.

1. De acuerdo con los motivos de unión a HLA, pueden sintetizarse péptidos que residan en la proteína diana. Estos péptidos pueden ser luego cargados en células portadoras del elemento de restricción apropiado y utilizados como dianas para los CTLs.

2. Generación de mutantes por deleción y expresión de estos mutantes por deleción en, por ejemplo, células COS-7 junto con el elemento de restricción apropiado. Estas células transfectadas son luego cocultivadas con CTLs y se mide la lisis de las células diana o la producción de TNF-\alpha/IFN-\gamma por los CTLs. Los transfectantes no reconocidos por los CTLs no expresan el péptido.

Ambos métodos han sido realizados en la búsqueda de los epítopos de la invención.

Lisis mediada por TIL 1200 de células T2 cargadas con péptidos

Hemos sintetizado químicamente péptidos de gp100 potencialmente reconocidos por TIL 1200. Los péptidos fueron sintetizados mediante una estrategia de fase sólida en un sintetizador peptídico múltiple automatizado (Abimed AMS 422) utilizando la química de Fmoc (Nijman, 1993). La unión real de los péptidos a HLA-A2.1 fue establecida con un ensayo de unión peptídica recientemente descrito que utiliza células T2 defectuosas en procesamiento (Nijman, 1993). Este análisis tuvo como resultado la identificación de péptidos derivados de gp100 que se unían potentemente a HLA-A2.1. Posteriormente, células T2 cargadas con los péptidos que se unían potentemente a HLA-A2.1 fueron sometidas a lisis por TIL 1200 utilizando un ensayo estándar de liberación de cromo. De esta forma se ha identificado el péptido L-L-D-G-T-A-T-L-R-L de acuerdo con este procedimiento.

Ejemplo 4 Epítopo de gp100 identificado mediante mapeo por deleción

ADNc de gp100 fue insertado en los vectores de expresión pBJ1neo, pCMVneo (Baker y col., 1990) y pSVL. Para la producción de un ADNc de gp100 carente de las secuencias codificadoras del péptido 457-466, se llevaron a cabo reacciones de PCR con las combinaciones siguientes de oligonucleótidos: 5'-CATGGAAGTGACTGTCTACC-3'/5'-CTGAGCGAATTCGGAACCTGTAATACTTTCCG-3' y 5'-CTGAGCGAATTCGTGAAGAGACAAGTCCCCC-3'/
5'-TCACAGCATCATATGAGAGTAC-3' utilizando como molde el ADNc de gp100 de longitud completa. Los productos de la PCR fueron digeridos con EcoRI, ligados y utilizados como molde para una PCR anidada utilizando los cebadores siguientes: 5'-GCACAGGCCAACTGCAGA-3'/5'-TTCAGTATCTGGTGCAGAAC-3'. El fragmento KpnI-ClaI de este producto de la PCR fue posteriormente intercambiado con el fragmento correspondiente de pCMVgp100neo para dar lugar a pCMVgp100DEL454-481neo. Los mutantes del ADNc de gp100 DEL149-645 y DEL454-654 fueron obtenidos por deleción de los fragmentos de HindIII de 1,7 kb y de EcoRI de 0,8 kb procedentes de pBJ1gp100DEL454-481neo, respectivamente. Los mutantes del ADNc de gp100 DEL100-654, DEL194-528 y DEL167-508 fueron obtenidos por deleción de los fragmentos BglI-SacI, BamHI-BglII y ApaI-NsiI de pSVLgp100, respectivamente.

Células BLM fueron transfectadas con 20 \mug de ADN de pCMVgp100DEL454-481neo de acuerdo con el procedimiento de coprecipitación con fosfato de calcio (Graham y van der Eb, 1973) utilizando Sistemas de Transfectación con Fosfato de Calcio (BRL, Gaithersburg, MD) y fueron seleccionadas con 1 mg/ml de G418 (Gibco, Paisley, Escocia, R.U.).

Células COS-7 fueron cotransfectadas con 5 \mug de pBJ1HLA-A2.1neo y 5 \mug de los plásmidos pBJ1 o pSVL conteniendo ADNc de gp100 de longitud completa o con deleciones utilizando el método de DEAE-dextrano/cloroquina (Seed y Aruffo, 1987). Después de 48 horas de transfección, se utilizaron células COS-7 como células estimuladoras en experimentos de liberación de IFN-\gamma.

Ensayos de liberación

Los ensayos de liberación de cromo se llevaron a cabo igual que en el Ejemplo 2.

Para el ensayo de liberación de IFN-\gamma, 10^{5} células respondedoras TIL 1200 fueron incubadas junto con 5 x 10^{4} células estimuladoras COS-7 transfectadas transitoriamente, en 300 \mul de medio y en presencia de 100 U/ml de IL-2 en una placa de microvaloración de 96 pocillos de fondo plano. Después de 24 horas de incubación, se recogieron 100 \mul de sobrenadante y se sometieron a selección por la presencia de IFN-\gamma utilizando un kit de ensayo inmunorradiométrico hIFN-\gamma-IRMA (Megenix Diagnostics SA, Fleurus, Bélgica).

Resultados

La Figura 3A muestra los mutantes por deleción del ADNc de gp100 que fueron generados. Según se muestra en la Figura 3B, TIL 1200 secretaba específicamente IFN-\gamma cuando era estimulada con células COS-7 transfectadas con HLA-A2.1 y el ADNc de gp100 de longitud completa. Se observó de nuevo reactividad de TIL 1200 frente al mutante gp100DEL454-481. De los demás mutantes por deleción de gp100, solamente las construcciones DEL100-661 y DEL149-661 no fueron reconocidas, excluyendo de este modo la posibilidad de que TIL 1200 fuera reactiva con un péptido situado N-terminal desde el aminoácido en posición 148 en la proteína gp100. También podía excluirse la región C-terminal de la proteína gp100, ya que pudo observarse reactividad con TIL 1200 utilizando una construcción mutante, DEL454-661, que codificaba los 453 primeros aminoácidos de gp100. A partir de la observación de que una construcción que codificaba esta región N-terminal hasta el aminoácido 166 era capaz de estimular TIL 1200 (DEL167-508), se concluyó que el epítopo reconocido estaba situado entre los aminoácidos 148-166 de la proteína gp100.

Unión a HLA-A2.1

Se han descrito varios motivos de péptidos 9-meros o 10-meros que se unen a HLA-A2.1 (Falk y col., 1991; Hunt y col., 1992; Ruppert y col., 1993) que fueron deducidos a partir de péptidos de unión a HLA-A2.1 procesados naturalmente y sintéticos. La región 148-166 de la proteína gp100 fue sometida a selección frente a estos motivos y se sintetizaron varios péptidos que encajaban en un motivo algo más amplio, incluyendo residuos de treonina en posición dos. Estos péptidos fueron cargados en células T2 HLA-A2.1^{+} y analizados para determinar su capacidad para inducir la lisis de células diana mediada por TIL 1200 (Figura 4A). Los cinco péptidos analizados fueron todos capaces de sensibilizar a las células T2 para su lisis por TIL 1200 cuando se utilizaron a una concentración de 10 \mug/ml. Todos estos péptidos contienen el péptido 8-mero TWGQYWQV, correspondiente a los aminoácidos 155-162 de gp100. Todos los péptidos fueron valorados con el fin de evaluar su capacidad relativa para sensibilizar a las células diana T2 para su lisis por TIL 1200. La Figura 4B muestra que el péptido 9-mero KTWGQYWQV puede ser reconocido por TIL 1200 cuando se aplica a una concentración de 3 ng/ml, mientras que los demás péptidos tuvieron que ser aplicados a concentraciones más elevadas.

Se realizó una comparación de los péptidos KTWGQYWQV (aminoácidos 155-162 de gp100), LLDGTATLRL (aminoácidos 457-466 de gp100) e YLEPGPVTA (aminoácidos 280-288 de gp100, identificado por Cox y col., 1994) con tres epítopos víricos conocidos presentados en HLA-A2.1: el péptido 58-66 de la matriz de la influenza (Gotch y col., 1987), el péptido 510-518 de la polimerasa del VIH (Tsomides y col., 1991) y el péptido 197-205 de gp120 del VIH (Dadaglio y col., 1991). La capacidad para unirse a HLA-A2.1 de los epítopos anteriormente mencionados fue analizada por medio de un ensayo de unión indirecta utilizando la línea celular T2 defectuosa en procesamiento (Nijman y col., 1993). Brevemente: células T2 fueron incubadas con 12,5 \mug de los epítopos. La estabilización de HLA-A2.1 en la superficie celular fue determinada mediante citometría de flujo utilizando el mAb BB7.2. El Índice de Fluorescencia es expresado como la fluorescencia experimental media dividida por la fluorescencia media que es obtenida cuando las células T2 son incubadas con un péptido que no se une a HLA-A2.1 a una concentración similar.

Utilizando este ensayo, se obtuvo una estabilización de HLA-A2.1 similar con el epítopo 280-288 de gp100 y con los epítopos víricos ensayados. Ambos epítopos de la invención (KTWGQYWQV y LLDGTATLRL) se unen a HLA-A2.1 con una afinidad algo menor (Figura 5). A partir de todo esto, se concluye que los epítopos de gp100 se unen a HLA-A2.1 con afinidades distintas.

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Claims

1. Un fragmento peptídico inmunogénico del antígeno asociado al melanoma de la SEC ID Nº: 2, caracterizado porque dicho fragmento comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consta de L-L-D-G-T-A-T-L-R-L, V-L-P-D-G-Q-V-I-W-V, T-W-G-Q-Y-W-Q-V, V-W-K-T-W-G-Q-Y-W-Q-V, K-T-W-G-Q-Y-W-Q-V-L, K-T-W-G-Q-Y-W-Q-V y T-W-G-Q-Y-W-Q-V-L, donde dicho péptido inmunogénico es capaz de inducir la lisis de células diana por linfocitos infiltrantes de tumores.

2. Un fragmento peptídico inmunogénico de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una deleción, una sustitución, una inversión y/o una adición.

3. Un fragmento peptídico inmunogénico de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicha sustitución es seleccionada del grupo que consta de las sustituciones Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn e Ile/Val.

4. Un fragmento peptídico inmunogénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde dicho péptido inmunogénico comprende una sal del péptido, una amida del péptido, un éster del péptido, un derivado N-acilo del péptido o un derivado N-acetilo del péptido.

5. Un fragmento peptídico inmunogénico de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicha amida del péptido comprende una amida C-terminal.

6. Un fragmento peptídico inmunogénico de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicho éster del péptido comprende un éster C-terminal.

7. Un fragmento peptídico inmunogénico de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicho derivado N-acilo del péptido comprende un derivado acilo N-terminal.

8. Una secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento peptídico inmunogénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

9. Una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizada porque comprende la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consta de las secuencias de SEC ID N^{os} 3, 5, 7 y 9.

10. Un vehículo de clonaje que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 8 ó 9.

11. Una célula huésped caracterizada porque está transfectada o transformada con el vehículo de clonaje de acuerdo con la reivindicación 10, preferiblemente cotransfectada con un vehículo de clonaje de comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un alelo de clase I del MHC.

12. Una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizada porque la célula huésped es seleccionada del grupo que consta de las células EL4 y P815 murinas y las células BLM humanas.

13. Una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 11 ó 12, caracterizada porque es una célula presentadora de antígeno.

14. Una célula huésped de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-13, caracterizada porque produce también moléculas coestimulantes.

15. Una vacuna caracterizada porque comprende un péptido inmunogénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o un epítopo del mismo.

16. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizada porque el péptido está mezclado con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

17. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 15 ó 16, caracterizada porque contiene una célula presentadora de antígeno que ha sido precargada con el péptido.

18. Una vacuna caracterizada porque comprende células huésped de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12-14.

19. Una vacuna caracterizada porque comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9.

20. Una vacuna caracterizada porque comprende el receptor de células T contra los péptidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, o células que expresan dicho receptor de células T.

21. Una vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15-20, caracterizada porque comprende también uno o más compuestos seleccionados del grupo que consta de un adyuvante, una o más citoquinas, anticuerpos dirigidos contra CD2, CD3, CD27, CD28 o contra otros antígenos de superficie de células T y epítopos cooperadores para estimular células T CD4+ o CD8+.

22. Un método para la generación de linfocitos infiltrantes de tumores reactivos con un antígeno, caracterizado porque comprende las etapas de:

a. cultivo de los linfocitos infiltrantes de tumores presentes en una muestra de melanoma;

b. aislamiento de los linfocitos infiltrantes de tumores de la muestra;

c. reacción de dichos linfocitos con un péptido inmunogénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7; y

d. aislamiento de los linfocitos que se unen a dicho antígeno.

23. Linfocitos infiltrantes de tumores, caracterizados porque son capaces de unirse a un péptido inmunogénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

24. Una vacuna caracterizada porque comprende linfocitos infiltrantes de tumores de acuerdo con la reivindicación 23.

25. Un conjugado de un péptido y un marcador detectable, caracterizado porque se utiliza el péptido inmunogénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

26. Un conjugado de acuerdo con la reivindicación 25, caracterizado porque el marcador detectable es un radionucleótido.