JP3869476B2 - 黒色腫関連抗原ポリペプチド、そのエピトープ及び黒色腫のワクチン - Google Patents
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Description
【産業上の利用分野】
本発明は、ガンの治療及び診断、特に黒色腫関連抗原、そのエピトープ、黒色腫のワクチン、抗原を認識する腫瘍浸潤Tリンパ球、並びに黒色腫の検出及びワクチン接種監視のための診断に関する。
【0002】
【従来の技術及び発明が解決しようする課題】
腫瘍細胞は、腫瘍遺伝子の活性化及び/又は腫瘍抑制遺伝子の不活化により制限増殖制御から解放され得る。腫瘍進行の過程は、種々の’単位特性’、即ち表現型特性で漸進的で段階的な一連の変化をたどる。その多くが、所定の腫瘍遺伝子及び/又は腫瘍抑制遺伝子の変容発現により決定されるか又は少なくともその影響を受けることは知られている。免疫宿主制限からの細胞のエマンシペーションは、増殖制御からのエマンシペーションと同様の多段階経路をたどり得る。
【0003】
ガン免疫療法でしばしば見られる問題は、腫瘍の免疫原性欠如である。免疫制御系のこのような欠落は、腫瘍細胞に認められる表現型の違い(Klein, G.及びBoon, T., Curr. Opinion in Immunol. 5, 687−692, 1993に基づきBurkittリンパ球細胞で認められた違い):
−抗原の処理/提示能力の低下;
−自己由来T細胞の刺激能力の低下;
−形質転換細胞に関連する免疫原タンパク質の完全ダウンレギュレーション;
−白血球付着分子又は他の補助分子の発現がないか又は小さいこと;及び
−あるMHCクラスI及びクラスIIの対立遺伝子の選択的ダウンレギュレーション
に基づくものであると理解され得る。
【0004】
MHCクラスI/II抗原はしばしば固体腫瘍でダウンレギュレートされる。これは、全てのクラスI/IIの抗原又はその一部分のみに作用し得る。細胞毒性Tリンパ球媒介溶解のために適切な標的細胞を感作し得るウイルスペプチド及び細胞ペプチドは、MHCクラスI抗原の発現レベルが低い細胞で産生されると、感作できないことがある。細胞毒性感受性は、少なくとも場合によってはインターフェロンγ及び腫瘍壊死因子αによりMHCクラスI/II抗原の発現レベルを増すことにより誘発され得る。
【0005】
しかしながら、正常組織から腫瘍組織への段階的変化の間に、腫瘍関連抗原が出現する。これらの抗原は、以下に示す種々の機構で解明され得る:
−前記抗原は、正常細胞の発達中に何からの方法でマスキングする分子であり得るが、腫瘍変化が免疫系のためのマスキング保護の除去を誘発する;
−原形質膜から幾つかの分子が欠失すると、所与の膜パッチで隣接分子のプロフィルが変化し、従って実際には宿主に対して免疫原性となり得る新しいプロフィルを生じ得る;
−腫瘍形質転換を伴う膜変化は、以前は隠されていた分子の新しい領域を露出させ得るか又は既存分子に新しい構造的特徴を付加し得る;
−腫瘍細胞のシェディング(shedding)及び崩壊により、免疫系は、通常細胞内に隠されている核成分、核小体成分又は細胞質成分にさらされ得る。
【0006】
腫瘍関連抗原の特性は、抗原を保有する腫瘍の起源に大きく依存する。動物腫瘍に関連する抗原の存在は今世紀に文献で証明され、ヒトガンの抗原性は、主に最近のモノクローナル抗体の研究により十分に確立されている。
【0007】
これらの抗原を単離して、化学特性の分析を行おうとしたが、重大な困難に遭遇した。困難の多くは、溶液から抗原を保有する分子を沈殿させるのに適した試薬が欠如していることに関係していた。
【0008】
他の多くの刺激と同様に、腫瘍関連抗原は、特異的及び非特異的な体液及び細胞の両方の防御機構のひとつではなく、全体を活性化する。腫瘍増殖のin vivo耐性の主要な役割はTリンパ球が果たしている。これらの細胞は、抗原提示細胞(APC)により該細胞に示される腫瘍関連抗原を認識し、この認識により活性化され、活性化及び判別により腫瘍細胞を攻撃して死滅させる。特定型のこの種のリンパ球は、固体腫瘍で認められ得る腫瘍浸潤リンパ球(TIL)により生成される。
【0009】
Tリンパ球を不溶性担体にin vitro結合した抗原物質で活性化し、次いでこれらの活性化リンパ球を腫瘍患者に投与することは既に提案されている(ヨーロッパ特許第147,689号)。
【0010】
従来の化学療法は転移性黒色腫患者の治療では比較的効果がなく、米国では毎年この疾病で約6000人の患者が死亡している。
【0011】
Rosenberg等(New Eng. J. Med. 319(25), 1676−1681, 1988)は、黒色腫患者での自己由来TIL及びインターロイキン−2(IL−2)による免疫療法の有効性を示した。
【0012】
この療法は、腫瘍デポジットを切除し、TILを単離し、TILをin vitro膨張させ、併用治療中の患者に毒性を誘発する高用量のIL−2を注入することからなる。
【0013】
Rosenbergが使用したTILは、黒色腫関連抗原を認識するためのものであり且つこれを認識し得る。
【0014】
このような黒色腫関連抗原を単離し、この抗原及び/又はそのエピトープを黒色腫患者の免疫療法の開発のために使用できるようにすることが本発明者等の目標である。
【0015】
黒色腫抗原は既に、120の黒色腫細胞系で産生する6種の抗原糖タンパク質及び3種の糖脂質を同定したOld, L.(1981)により発表されている。
【0016】
黒色腫抗原を含むワクチンも記載されている:米国特許第5,030,621号及び第5,194,384号では、黒色腫細胞を培養し、次いで分泌された黒色腫特異抗原を培地から単離することにより多価ワクチンが製造されている。
【0017】
黒色腫型ガンの治療や診断用として既に提案されている特異抗原もある:ペプチドp97は米国特許第5,262,177号及び米国特許第5,141,742号に開示され、35kDタンパク質はヨーロッパ特許第529,007号に記載されている。
【0018】
【課題を解決するための手段】
発明者等は、配列番号2のアミノ酸配列を含んでいることを特徴とする黒色腫関連ポリペプチドを発見した。
【0019】
このメラニン細胞系に特異的な抗原ポリペプチド(gp100とも称する)は、診断に適していることが証明されたモノクローナル抗体NKI−betebにより認識される。この抗体により認識される抗原は、約10kd(gp10)及び100kd(gp100)の細胞内タンパク質である。後者は、黒色腫細胞の培地でも検出可能である(Vennegoor, C.等,Am. J. Pathol. 130, 179−192, 1988)。gp100抗原が他の黒色腫特異抗体(例えばHMB−50)(Vogel, A. M.及びEsclamado, R.M., Cancer Res. 48, 1286−1294, 1988に記載)、又はHMB−45(Gown, A.M.等,Am. J. Pathol. 123, 195−203, 1986に記載)と反応することも判明した。これらのモノクローナル抗体と反応するタンパク質は黒色腫細胞でグリコシル化されることが判明しているので、SDS−PAGEで分析すると移動度が違うことが判明した。
【0020】
これらの細胞内タンパク質が処理され、MHC分子の場合のペプチドとして免疫系の細胞に提示され得ることが実証されているので、このgp100抗原は主に細胞内で発現されるが、適切な免疫原抗原であることが確定している。実際、黒色腫患者の腫瘍に由来する腫瘍浸潤リンパ球が抗原と反応することが判明した。
【0021】
従って、gp100ポリペプチドはガンに対する細胞応答の潜在的標的であり、従って黒色腫患者の治療や診断の適切な材料となる。
【0022】
gp100は、タンパク質の中央に存在する反復性アミノ酸配列を含むトレオニンに富むドメイン(アミノ酸309−427)を有する型Iのトランスメンブランタンパク質である。伸長性O−結合グリコシル化され得るこのトレオニンに富むドメインの前には、ヒスチジンに富む領域(アミノ酸182−313)があり、後にはシステインに富むドメイン(アミノ酸475−566)が来る。疎水性プロット分析(Kyte, J.及びDoolittle, R.F., 1982)に基づけば、帯電残基を末端に有する単一トランスメンブランドメインがgp100のカルボキシ末端部分(アミノ酸591−611)に存在する。予測される細胞質ドメインの長さは45アミノ酸である。5個の推定上のN−結合グリコシル化部位が存在し、gp100(糖タンパク質)と一致している。
【0023】
“ポリペプチド”という用語は、アミノ酸の分子鎖を意味し、産生物の特定の長さを意味するものではなく、必要とあれば、例えばグリコシル化、アミド化、カルボキシル化又はリン酸化によりin vivo又はin vitro改変させることができる。従って、とりわけペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質がポリペプチドの定義に包含される。
【0024】
もちろん、本発明のポリペプチドの機能的誘導体及び断片も本発明に包含される。機能的誘導体は、配列全体のうち1個以上のアミノ酸が、欠失、置換、逆位又は付加によって異なるポリペプチドを意味する。殆ど生物/免疫活性を変化させないと思われ得るアミノ酸置換は文献に記載されている。関連アミノ酸間のアミノ酸置換、即ち進化中にしばしば生じた置換はとりわけ、Ser/Ala,Ser/Gly,Asp/Gly,Asp/Asn,Ile/Valである(Dayhof, M.D., Atlas of protein sequence and structure, Nat. Biomed. Res. Found., Washington D.C., 1978, vol. 5, suppl. 3を参照)。Lipman及びPearsonは、この情報に基づいて高速感受性タンパク質比較方法(Science 227, 1435−1441, 1985)を開発し、同種ポリペプチドの機能的類似性を決定している。
【0025】
モノクローナル抗体NKI−beteb又はHMB−50又はHMB−45に対して尚免疫活性を示す機能的誘導体も本発明の範囲に包含される。
【0026】
更には、これらのペプチドの機能的誘導体は、腫瘍浸潤リンパ球による標的細胞溶解を誘発し得るgp100由来のペプチドを意味する。
【0027】
更には、これらのペプチドの機能的誘導体は、ペプチドの付加塩、ペプチドのアミド、特にC−末端アミド、エステル(とりわけC−末端エステル)、N−アシル誘導体(とりわけN−末端アシル誘導体)及びN−アセチル誘導体を意味する。
【0028】
本発明のポリペプチドは、合成処理により又は組換えDNA技術により産生され得る。合成ポリペプチドの産生方法は当業界ではよく知られている。
【0029】
ペプチド合成の有機化学方法は、均質相での又はいわゆる固相を用いた縮合反応による必要なアミノ酸のカップリングを包含すると考えられる。縮合反応は以下の方法で実施され得る:
a)縮合剤の存在下で、遊離カルボキシル基及び保護された他の反応性基を有する化合物(アミノ酸、ペプチド)を、遊離アミノ基及び保護された他の反応性基を有する化合物(アミノ酸、ペプチド)と縮合させる;
b)活性化カルボキシル基及び遊離した又は保護された他の反応性基を有する化合物(アミノ酸、ペプチド)を、遊離アミノ基及び遊離した又は保護された他の反応性基を有する化合物(アミノ酸、ペプチド)と縮合させる。
【0030】
カルボキシル基の活性化はとりわけ、カルボキシル基を酸ハロゲン化物、アジ化物、無水物、イミダゾリド又は活性化エステル(例えばN−ヒドロキシ−スクシンイミド、N−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール又はp−ニトロフェニルエステル)に変換することにより実施され得る。
【0031】
前記縮合反応の最も一般的な方法は、The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology Vol. 1−3(Ed. Gross, E.及びMeienhofer, J.)1979, 1980, 1981(Academic Press, Inc.)に記載のようなカルボジイミド法、アジ化物法、混合無水物法及び活性化エステルを用いる方法である。
【0032】
組換えDNA技術によるポリペプチドの産生は公知の一般的な方法であるが、多くの可能性があり、それにより幾分異なる結果が得られる。発現すべきポリペプチドは、DNA配列、更に正確に言えば核酸配列によりコードされる。
【0033】
gp100のアミノ酸配列が、Kwon,.B.S.(1991)が開示した公知の黒色腫関連ペプチドpMel17のアミノ酸配列と非常に類似していることが判明した。
【0034】
gp100とpMel17とのアミノ酸の違いは、アミノ酸274位(T−C/PRO−LEU)及び597位(C−G/ARG−PRO)での置換、並びに587位でgp100には存在しない7アミノ酸の伸長からなる。762位での単なるヌクレオチドの相違(C−T)はアミノ酸の置換を生じない。gp100は更に、ウシ網膜cDNAライブラリーから単離した部分的cDNAクローン(RPE−1)からの推定上のタンパク質と80%相同であり(Kim, R.Y.及びWistow, G.J., 1992)、ニワトリメラノゾームマトリックスタンパク質MMP115とは42%相同である(Mochii, M.,1991 )。図2も参照のこと。
【0035】
gp100ポリペプチドをコードする配列を含んでいる核酸配列も本発明の一部分である。
【0036】
好ましくはgp100をコードする配列は配列番号1の配列である。
【0037】
当業界でよく知られているように、遺伝暗号のデジェネラシーによりコドンの塩基が置換されても、その結果依然として同一のアミノ酸をコードする他のコドンが得られる。例えば、アミノ酸グルタミン酸のためのコドンはGAT及びGAAの両方である。配列番号2に示すアミノ酸配列でポリペプチドを発現するために、このような代替のコドン組成物を有して、配列番号1に示す核酸配列とは異なる誘導体核酸配列を使用することができることは明白である。
【0038】
本明細書で使用する“核酸配列”とは、任意長さのポリマー形態のヌクレオチド、即ちリボ核酸(RNA)配列及びデオキシリボ核酸(DNA)配列の両方を意味する。一般に、この用語は分子の一次構造を意味する。従って、この用語は二本鎖DNA、一本鎖DNA、二本鎖RNA、一本鎖RNA及びこれらの変形を包含している。
【0039】
gp100のヌクレオチド配列は2115塩基対(bp)を含み、15ヌクレオチドのポリ(A)領域を末端とする。この末端の前には、コンセンサスポリアデニル化配列AATAAAが位置する。ヌクレオチド22から2007に及ぶ読取り枠(ORF)がgp100 DNAに存在する。このORFは、翻訳開始の適切な配列コンテキスト内でATGコドンにより開始し、661アミノ酸のタンパク質をコードする。アミノ末端20アミノ酸は、シグナル配列(例えば20位(−1)でのALAの後の潜在的な開裂部位を含む)の全ての基準を満たす。これは、成熟gp100が641アミノ酸(約70kD)を含んでいることを示す。
【0040】
gp100とPmel17との間のcDNAの最も顕著な違いは、gp100cDNAでの21bpのインフレーム(inframe)欠失である(第2図)。ゲノムDNAのヌクレオチド配列をgp100 cDNAの配列と比較すると、ちょうどPmel17 cDNAの21bp挿入の位置にイントロン(102bp)が存在することが判明した。エキソン/イントロンの境界は、コンセンサス5’ドナー及び3’アクセプタースプライス部位配列と十分に適合する(Padgett, 1986)。ゲノムDNAでは、Pmel17 cDNAにおける追加の21bpを含む配列が、gp100 RNAの産生に使用される3’開裂部位のすぐ上流に位置し、その前には代替の3’アクセプタースプライス部位が位置する。gp100特異的3’アクセプタースプライス部位はコンセンサス部位に適合するが、Pmel17特異的3’アクセプタースプライス部位は、ピリミジンに富む領域が欠如している点で次善であるように思える。次善のRNAプロセッシング部位は、代替方法で処理された多くのメッセンジャーRNA前駆体に存在し、代替のRNAプロセッシングの調節機能に関与した(Green, M.R., 1991により再考察)。総括的には、これらのデータは、gp100及びPmel17のcDNAに対応する転写が単一の一次転写の代替スプライシングにより生じることを証明している。
【0041】
本発明の他の部分は、gp100ポリペプチドの免疫原断片たるペプチドである。
【0042】
免疫原断片はgp100分子の断片であり、この断片は尚、免疫原応答を誘発することができる。即ち、断片を特異的に認識する抗体を産生することができるか又はこの断片によって活性化されたTリンパ球を見つけることができる。
【0043】
前述したように、腫瘍関連抗原の免疫原作用がしばしばT細胞の活性化機構により引出されることは知られている(Townsend, A.R.M.及びBodmer, H., Ann. Rev. Immunol. 7, 601−624, 1989)。T細胞レセプター(TCR)依存的及びMHC制限的に黒色腫細胞を認識する細胞毒性Tリンパ球(CTL)が腫瘍患者から単離されている(Knuth,A., 1992により再考察)。Brichard等(1993)は、他のメラニン細胞特異抗原であるチロシナーゼ由来のペプチドがCTLクローンにより認識されることを示した。
【0044】
MHC分子によるT細胞の活性化が、その短いピース(例えば8−12マー)がTリンパ球に提示される抗原のプロセッシングを必要とすることは知られている。
【0045】
gp100配列に位置する免疫原オリゴペプチドも本発明の一部を構成する。
【0046】
MHC I分子と結合できるだけでなく、黒色腫患者から単離した腫瘍浸潤リンパ球を認識することも実証されたgp100配列の免疫原ペプチド配列を見出した。
【0047】
数種のペプチドが見出された:アミノ酸配列V−L−P−D−G−Q−V−I−W−V,M−L−G−T−H−T−M−E−V,R−L−M−K−Q−D−F−S−V,(V)−(W)−(K)−T−W−G−Q−Y−W−Q−V−(L)及びL−L−D−G−T−A−T−L−R−Lを有するペプチドが、MHC HLA−A2.1分子と結合することが判明した。更には、最後の2種のペプチドは、HLA−A2.1のコンテキストで抗黒色腫細胞毒性Tリンパ球により認識される。
【0048】
これらのペプチドが、非関連配列、即ち本来は全く関連のない配列によってフランキングされていることが好ましい。何故ならば、このようなフランキングが、恐らくはAPCによるより良いプロセッシング及び提示によって、これらのペプチドの免疫原性を高めることが判明しているからである。
【0049】
本発明の他の部分は、前記ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでいるヌクレオチド配列により構成される。
【0050】
以下で詳しく説明する組換えDNA技術によるペプチド産生でのこれらの配列の使用に次いで、gp100又はそのエピトープについて配列表に開示された配列情報を診断のために使用することができる。
【0051】
これらの配列からプライマーを診断試験の基準として誘導して、核酸増幅技術(例えばそれぞれ米国特許第4,683,202号及びヨーロッパ特許第329,822号に記載されているポリメラーゼ連鎖反応(PCR)又は核酸配列ベースの増幅(NASBA))によりgp100又はgp100様タンパク質を検出することができる。
【0052】
PCRを用いる場合、標的DNA配列をオリゴヌクレオチドプライマーで処理して、プライマー伸長産物を合成し、熱変性を用いてこれを鋳型から分離し、分離したものを鋳型として用いて標的配列を増幅させることにより多量のDNAが産生される。RNAをPCRで増幅すべきときには、まず逆転写酵素を用いてRNA鎖をDNA鎖に転写する。
【0053】
NASBAを用いる場合、多量の一本鎖RNAが一本鎖RNA、一本鎖DNA又は二本鎖DNAから産生される。RNAを増幅すべきときには、ssRNAが、ssRNAポリメラーゼ認識部位を含む第1のプライマーの伸長により第1のDNA鎖を合成するための鋳型として機能する。産生されたDNA鎖は、第2のプライマーの伸長により第2の相補的なDNA鎖を合成するための鋳型として機能する。これにより二本鎖活性RNA−ポリメラーゼプロモーター部位が得られる。第2のDNAは、RNAポリメラーゼを用いて第1の鋳型であるssRNAを多量に合成するための鋳型として機能する。
【0054】
増幅ヌクレオチド配列の検出は、相補的な検出プローブを増幅した核酸とハイブリダイズすることにより達成される。このプローブは固相上で標識及び/又は固定化され得る。ラベルの検出は、当業界で公知の方法により実施され得る。プローブにより固相に結合した核酸の検出は、核酸の選択的検出を可能とする化合物により実施され得る。
【0055】
前述したように、ヌクレオチド配列は、組換えDNA技術によるgp100又はそのエピトープのひとつの産生のために使用され得る。このために、ヌクレオチド配列は、適切な宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトするために使用され得るクローニング媒体に含まれねばならない。
【0056】
多種多様な宿主細胞とクローニング媒体との組み合わせを有効に用いて核酸配列をクローニングしてもよい。例えば、有用なクローニング媒体には、染色体、非染色体及び合成DNA配列[例えば種々の公知の細菌プラスミドや宿主範囲がより広範なプラスミド(例えばpBR 322、種々のpUC、pGEM及びpBluescriptプラスミド)、バクテリオファージ(例えばλ−gt−Wes、Charon 28及びM13由来のファージ)、並びにプラスミド及びファージ又はウイルスDNA(例えばSV40、アデノウイルスもしくはポリオーマウイルスDNA)の組み合わせに由来するベクター]が含まれ得る(Rodriquez, R.L.及びDenhardt(1988);Lenstra,1990も参照)。
【0057】
有用な宿主には、細菌宿主、酵母及び他の真菌、植物又は動物の宿主(例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞又はサル細胞)並びに他の宿主が含まれ得る。
【0058】
ペプチドの発現に使用されるビヒクルは更に、該ペプチドをコードする核酸配列に操作可能に連結された制御配列を含む。かかる制御配列は一般にプロモーター配列と、発現レベルを調節及び/または増強する配列とを含む。更に、複製開始点及び/または主選択マーカーがかかるビヒクル中に存在することが多い。当然ながら制御配列及び他の配列は、選択した宿主細胞に従って変えることできる。
【0059】
宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトする方法は当分野において公知である(例えばManiatisら,1982及び1989参照)。
【0060】
ペプチドの情報のほかに、宿主細胞を、前記ペプチドが結合することが知られているMHC分子の情報を担うベクターを用いて同時形質転換または同時トランスフェクトするならば、それは極めて実用的である。MHC分子はHLA−A2.1、HLA−A1もしくはHLA−A3.1、またはメラノーマ患者に存在することが知られている任意の他のHLA対立遺伝子であるのが好ましい。メラノーマ細胞は、メラノーマ患者由来のHLA−A2.1制限細胞障害性T細胞クローンによって認識される抗原を担うことが立証されている(Anichini A.,1993)ことから、HLA−A2.1は特に好ましい。
【0061】
gp100の発現に特に適した宿主細胞はネズミEL4及びP8.15細胞である。(Katano,M.,1984によって記載されている)ヒトBLM細胞は既にMHC分子HLA−A2.1を発現し得るので、gp100の発現には特に適している。
【0062】
gp100または上記ペプチドもしくはそれらのヌクレオチド配列のいずれかをメラノーマ治療用のワクチンに使用し得る。
【0063】
免疫原有効量の活性ペプチドに加え、ワクチンは医薬的に容認可能な担体または希釈剤を含み得る。
【0064】
本発明のペプチド、特にオリゴペプチドの免疫原性は、免疫原性担体分子(即ち、本発明のペプチドが共有結合することができる、患者中で免疫学的応答を独立に誘発する特性を有する高分子)に架橋またはカップリングすることにより増強し得る。
【0065】
担体分子への共有結合は当分野において公知の方法を使用して実施し得るが、その厳密な選択は使用する担体分子の特性によって左右される。免疫原性担体分子がタンパク質である場合、本発明のペプチドを例えばジシクロヘキシルカルボジイミドのごとき水溶性カルボジイミドまたはグルタルアルデヒドを使用してカップリングし得る。
【0066】
上述のごときカップリング剤を使用してペプチドをそれ自体に、別個の担体分子を使用せずに架橋することができる。ポリペプチドまたはペプチド凝集体をもたらす架橋は免疫原性を増強し得る。
【0067】
本発明に有用な医薬的に容認可能な担体または希釈剤の例としては、SPGAのごとき安定化剤、炭水化物(例えばソルビトール、マンニトール、澱粉、スクロース、グルコース、デキストラン)、アルブミンまたはカゼインのごときタンパク質、ウシ血清またはスキムミルクのごときタンパク質含有物質、及び緩衝液(例えばリン酸緩衝液)が挙げられる。
【0068】
必要によっては、アジュバント活性を有する1種以上の化合物をワクチンに添加してもよい。適当なアジュバントとしては例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたは酸化アルミニウム、(例えばBayol F(R)またはMarcol 52(R)の)油性エマルジョン、サポニンまたはビタミンE溶解物が挙げられる。
【0069】
本発明のワクチンは特に、静脈内、腹腔内、鼻腔内、皮内、皮下または筋肉内に与え得る。
【0070】
投与すべき有効量は患者の年齢及び体重並びにワクチン投与形態に従って変わる。
【0071】
本発明ワクチンを使用して特にT細胞応答を得ることができるが、予防接種後にB細胞応答を誘発することも可能である。その場合、B細胞応答によりワクチンのペプチドに対する抗体が形成されるが、その抗体は抗原産生源、即ち腫瘍細胞に対するものである。このように腫瘍細胞は両免疫学的系の応答によって応戦されるが故に、これは有利な特徴である。
【0072】
両免疫学的系は、ワクチンが抗原提示細胞(APC)によってMHC分子中に提示されるペプチドを含む場合に、より有効に誘発される。抗原提示は、本発明のペプチドの1つを負荷された、単球、マクロファージ、指状突起細胞、ランゲルハンス細胞、特に樹状細胞を使用して行われ得る。APCの負荷(loading)は、本発明ペプチドをAPCの近辺に置くことにより行い得るが、APCに完全gp100抗原を取込ませることがより好ましい。こうして、in vivo状況を最も実態に即して模倣した提示が行われる。更に、細胞によって使用されるMHCは、エピトープを提示するのに適したタイプのものである。
【0073】
エピトープ提示のためにAPCを使用することの総合的な利点は、これに関して使用されるAPC細胞を選択し得ることである。種々のタイプのAPCから、刺激性のAPCや阻害性のAPCがあることが知られている。
【0074】
好ましいのは、所謂「専門的(professional)」抗原提示細胞である列挙した細胞タイプであって、これらは、抗原提示過程で重要な機能を果たす同時刺激分子を有することを特徴とする。かかる同時刺激分子は例えばB7、CTLA−4、CD70または熱安定性抗原(Schwartz,1992)である。
【0075】
抗原提示細胞としても作用し得ることが判明している線維芽細胞にはかかる同時刺激分子が欠如している。
【0076】
gp100の情報を保有するクローニングビヒクルによって既にトランスフェクトされていると共に、MHCクラスI分子のヌクレオチド配列、例えばHLA−A2.1、HLA−A1またはHLA−A3.1をコードする配列を含むクローニングビヒクルによって同時トランスフェクトされている細胞を使用することもできる。かかる細胞は抗原提示細胞として作用し、表面に発現されたMHCクラスI分子でgp100フラグメントを提示する。細胞が上述の同時刺激分子のいずれかまたは類似機能を有する分子も発現し得る場合、この提示は増強されることが考えられる。この発現は、かかる同時刺激分子をコードする配列情報を有する第3のクローニングビヒクルを用いて細胞を形質転換またはトランスフェクトした結果であり得るが、細胞が既に同時刺激分子を産生し得たということもあり得る。
【0077】
所望の発現産物のほかに、やはり発現され、細胞の所望の免疫原性反応に悪影響を及ぼし得る多数のエレメントを保有する細胞を含むワクチンに代え、ペプチドが負荷されたMHC分子を露出すると共に例えばリンフォカインが充填されたリポソームを用いてワクチンを調合することもできる。このようなリポソームは免疫学的T細胞反応を誘発する。
【0078】
in vivoで提示されるようにペプチドを提示することにより、増強されたT細胞応答が喚起される。更に、比較的大きな抗原提示細胞の天然アジュバント作用により、B細胞応答も誘発される。このB細胞応答は特にペプチド−MHC複合体に対する抗体の形成をもたらす。この複合体は特に腫瘍細胞中に認められるが、患者の腫瘍細胞中ではgp100のエピトープが自然に提示され、それがT細胞応答を誘発し得ることが判っている。本発明のペプチドを既に提示するAPCの予防接種により拡張されるのはこの自然現象である。この拡張により、拡張されたT細胞応答が喚起されるだけでなく、MHC−ペプチド複合体に対する抗体をもたらすB細胞応答も開始される。
【0079】
本発明のワクチンは、予防接種後のT細胞及びB細胞の両応答の開始及び維持に増強作用を有する多数の化合物によって増強され得る。
【0080】
従って、ワクチンにサイトカインを添加することでT細胞応答が増強される。適当なサイトカインは例えば、IL−2、IL−4、IL−7またはIL−12のごときインターロイキン、GM−CSF、RANTES、腫瘍壊死因子、及びIFN−のごときインターフェロンである。
【0081】
同様に、CD2、CD3、CD27及びCD28のごときT細胞表面抗原に対する抗体も免疫原性反応を増強する。
【0082】
CD4+ヘルパー細胞またはCD8+キラー細胞を刺激すべくヘルパーエピトープを添加することでも免疫原性反応は増強される。或いは、他の抗原、例えば熱ショック誘導タンパク質またはコレラトキシン由来のヘルパーエピトープを使用することもできる。
【0083】
本発明の別の部分は、gp100反応性腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の使用により形成される。この方法においては、第1ステップは患者から試料を採取することからなる。これは通常、局所麻酔下に腫瘍デポジットを切除することにより行われる。この被検体中に存在するTILを公知の方法(Topalian,S.L.ら,1987)に従って培地中で4〜8週間膨張させる。この培養の間、gp100またはgp100から誘導されたエピトープの1つとの反応性についてTILを検査する。抗原を認識するTILを単離し、更に培養する。
【0084】
上記方法によって得られたgp100に反応性を示す腫瘍浸潤リンパ球も本発明の一部を形成する。gp100及びそのエピトープと特異的に反応する1つのこのようなTIL細胞系が明らかとなり、TIL 1200と命名した。このTIL 1200細胞系はMHC分子HLA−A2.1をも発現する。更に、この細胞系によるTCR α/β、CD3及びCD8の発現も認められた。更にTIL 1200は、HLA−A2.1及びgp100の両方を発現するトランスフェクト体を認識する。
【0085】
このTIL 1200及びgp100を認識する他のTILはメラノーマ患者の治療に適している。かかる治療のため、TILを上述のごとく培養し、静脈内注入によって患者に戻す。治療の成功は、全身放射線照射またはシクロホスファミドを用いた治療によって腫瘍を有する宿主を前処置し、更にインターロイキン−2(Rosenberg,S.A.ら,1986)を同時投与することにより増大され得る。
【0086】
注入により患者に戻されたTILは自原性TIL(即ち患者自身の腫瘍から誘導されたもの)であるのが好ましいが、同種TILを用いた注入も考え得る。
【0087】
上述の方法によって得られたTILは更にin vivo診断にも使用される。TILを例えば111In(Fisher,1989)または任意の他の適当な診断マーカーで標識し、メラノーマ患者中の腫瘍デポジットの同定に適したものとする。
【0088】
本発明の別の部分は、gp100反応性CTLによって発現されるT細胞レセプター(TCR)によって形成される。当分野において公知のように、TCRはCTLの特異性を決定する。従って、TCR、特にその可変域をコードするcDNAを単離し、T細胞中に導入し、それによって抗腫瘍活性を任意のT細胞に移入し得る。特に、このようなTCRを自原性T細胞中に導入し、次いでかかるT細胞を膨張させると、自原性患者中への養子移入に適した多数のCTLが得られる。
【0089】
このT細胞を保有する細胞を予防接種に使用することもできる。
【0090】
ワクチンは更にp100を発現し得るメラノーマ細胞から調合することもできる。NKI−betebのごとき抗gp100抗体を使用してかかる細胞を患者から単離することもできるが、天然のgp100産生体であるかまたはgp100を産生するよう遺伝子操作された培養メラノーマ細胞系からかかるメラノーマ細胞を生産することもできる。かかる細胞に放射線を照射して非腫瘍形成性とし、患者中に注入する(戻す)こともできる。かかるメラノーマ細胞の免疫学的作用を増強するため、それらを、リンフォカイン、好ましくはインターロイキン−2(IL−2)または顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)を産生するよう遺伝的に変性することが好ましい。gp100+メラノーマ細胞は、IL−2またはGM−CSFの産生をコードする配列を有するクローニングビヒクルを用いてトランスフェクトし得る。
【0091】
このようなワクチンを患者に注入するとCTLの形成が刺激される。
【0092】
同様の作用を有する別のタイプの予防接種は、純粋なDNA、例えばgp100抗原またはそれから誘導されるペプチドをコードするDNA配列を有するベクターまたはベクターウイルスのDNAを用いた予防接種である。一旦注射すると、ウイルスが感染するか、またはDNAが抗原もしくはペプチドを発現する細胞に形質転換される。
【0093】
(V)−(W)−(K)−T−W−G−Q−Y−W−Q−V−(L)及びL−L−D−G−T−A−T−L−R−Lに対する抗体を含む、任意のgp100ペプチドに対する抗体も本発明の一部である。
【0094】
かかるペプチドに対する単一特異性抗体は、Hall,R.ら(1984)の方法を改良することにより多特異性抗血清からアフィニティー精製によって得ることができる。多特異性抗血清は、標準免疫方法に従ってウサギを免疫することにより得ることができる。
【0095】
本明細書に使用される単一特異性抗体とは、関連抗原に対して均一の結合特性を有する単一抗体種または複数抗体種であると定義される。本明細書に使用される均一結合(homogeneous binding)とは、本発明のリガンド結合ドメインに結合し得る抗体種の能力を指す。
【0096】
抗体は好ましくはモノクローナル抗体であり、より好ましくはヒト化モノクローナル抗体である。
【0097】
モノクローナル抗体は、当分野において公知の方法(Koehler,G.及びMilstein C.,1975)によって、同系交配マウス、好ましくはBalb/cを適当なタンパク質を用いて免疫することにより調製し得る。次いで、ダルベッコ改良イーグル培地(DMEM)のごとき適当な細胞培地においてヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリン中で増殖させることにより、ハイブリドーマ細胞を選択する。抗体産生ハイブリドーマを好ましくはMacPherson(1973)の軟寒天法を使用してクローニングする。適当な培地で培養するために、個々のコロニーを培養プレートのそれぞれのウェル中に移す。適当な免疫原を用いてスクリーニングすることにより抗体産生細胞を同定する。免疫原性陽性ハイブリドーマ細胞を当分野において公知の方法によって維持する。ハイブリドーマをin vitroで培養するかまたは当分野において公知の方法によってハイブリドーマをマウスに注入した後に腹水を調製することにより、特異的抗モノクローナル抗体を生産する。
【0098】
ヒト化抗体を使用することは好ましい。CDR移植のごとき抗体をヒト化する方法が公知である(Jones,P.T.ら,1986)。本発明のポリペプチドに反応性を示す抗体に対する抗原性応答を回避する別の可能性は、ヒト抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体を使用することである。
【0099】
ヒト抗体は、単離したBリンパ球をin vitro刺激することで生産することもできるし、少なくとも1種の本発明のリガンド結合ドメインを用いて免疫したヒトから採取した(不死化)Bリンパ球から単離することもできる。
【0100】
上述の抗体は、メラノーマ患者の受動予防接種に使用し得る。この種のワクチンに好ましいタイプの抗体は、MHC分子に関連して提示される上記ペプチドに対する抗体である。この種の抗体を生産するためには、APCによって提示されるペプチドの免疫が必要である。このような免疫は上述のごとく実施し得る。或いは、ペプチド−MHC複合体に対するヒト抗体を、前記ペプチドの1つを負荷したAPCからなるワクチンを用いて処置した患者から単離することもできる。
【0101】
本発明のワクチンの1つで処置したあとに形成される抗体を、前記予防接種をモニターするために使用することもできる。かかる方法においては、患者の血清を得、予防接種したペプチドに対する抗体を検出する。この検出から抗体力価は既知となり、追加予防接種が必要かどうか判定し得る。
【0102】
血清中の前記抗体の特異的検出は標識ペプチドによって行ない得る。標識は、in vitro診断分野において公知の任意の診断マーカーとし得るが、最も好ましいのは(そして広く使用されているのは)酵素、色素、金属及び放射性核種、例えば67Ga、99mTc、111In、113mIn、123I、125Iまたは131Iである。
【0103】
放射性診断マーカーは、本発明のペプチドに直接カップリングしてもよいし、或いは、ペプチドに直接またはリンカーもしくはスペーサー分子を介してカップリングさせたキレート形成部分を介してカップリングしてもよい。放射性核種をペプチドまたはペプチド様構造体にカップリングする方法は、in vivo及びin vitro試験に使用されている多数の標識抗体用法から、(腫瘍)診断分野において既に知られている。
【0104】
ペプチドの直接標識は例えば1バイアル法(Haisma,1986)に記載のごとく実施し得る。リンカーまたはスペーサー分子を用いても用いなくても、ペプチドをキレート試薬を介して標識する一般方法は例えば米国特許第4,472,509号明細書及び米国特許第4,485,086号明細書に記載されている。DTPAの二環式無水物を使用するキレート試薬はHnatowich,D.J.ら(1983)に記載されている。ジアミドジメルカプチド化合物を介してのカップリングは欧州特許第188,256号明細書に記載されている。
【0105】
【実施例】
添付の図面を参照し、本発明を実施例によって更に説明する。
【0106】
実施例1−gp100分子の特性分析
材料と方法
細胞及びモノクローナル抗体
メラノーマ細胞系Mel−2a、M14、MEWO、BLM(Vennegoorら,1989;van Muijenら,1991;Beanら,1975;Katanoら,1984)及びぶどう膜メラノーマ細胞系Mel 202(Ksanderら,1991)が既に記載されている。Eisinger及びMarko(1982)の方法に(Smitら,1993)による改良を加えた方法により、胸または包皮から正常ヒトメラニン形成細胞を単離した。
【0107】
Mabs NKI−beteb及びHMB−50が既に記載されている(Vennegoor,1988;Vogel及びEsclamado,1988)。MAb HMB−45はEnzo Biochemから購入した。
【0108】
DNA構築物及びトランスフェクション
gp100 cDNAを含む2.2kbのEco RIフラグメントを、クレノウDNAポリメラーゼを用いて末端を充填することによりブラント末端化し、次いで、真核性発現ベクターpSVL(Pharmacia)のSmaI部位に両方向(pSVLgp100+及びpSVLgp100−)でクローニングした。pSVLはSV40後期プロモーター(late promoter)及びポリアデニル化部位とSV40複製開始点とを含み、COS−7細胞中での一時的発現の際に極めて高いコピー数が可能であった。
【0109】
3’切欠gp100転写単位pSVLgp100+(@BS)を構築するため、gp100 cDNAの3’部分にあるBgl II部位と、ベクターの多重クローニング部位にあるSac I部位との間の配列を欠失させた。得られた構築物は、gp100のカルボキシ末端の133のアミノ酸がベクター配列によってコードされる4つアミノ酸(Arg−Ile−Gln−Thr)で置き換えられた切欠qp100タンパク質をコードした。
【0110】
COS−7細胞中での構築物の一時的発現は、BRL(Felgnerら,1987)由来のリポフェクチン試薬40μg/ml及び前述のごときDNA(Loenenら,1991)7.5μgを使用して実施した。
【0111】
免疫蛍光法
上述のごときリポフェクチン/DNA混合物を添加した48時間後に、トランスフェクトしたCOS−7細胞を免疫蛍光法のために調製した(Vennegoorら,1988)。1次抗体と一緒に45分間インキュベートした後、細胞を洗浄し、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識ヤギF(ab)’2抗マウスIgG(Nordic)と一緒に30分間インキュベートした。同焦点レーザー走査顕微鏡(Biorad MRC 600)を使用して488nmにおいて調製物を調査した。
【0112】
代謝標識、免疫沈降及びV8プロテアーゼマップ作成
プロテインA−CL 4Bセファロースビーズ(Pharmacia)に共有結合したmAb NKI−betebまたはHMB−50のいずれかを使用し、Vennegoorら(1988)によって記載されているような代謝標識(L−[35S]−メチオニン/システイン;Amersham)細胞において免疫沈降試験を実施した。幾つかの実験においては前標識時にツニカマイシン(75μg/ml,Calbiochem)を添加し、代謝標識反応時(12.5分間)にそのまま存在させた。5〜17.5%ポリアクリルアミド濃度勾配ゲルを使用したSDS−PAGEによって還元条件下(SDS試料緩衝液中5%β−メルカプトエタノール)で免疫沈降物を分析した。タンパク質の相対分子量を、同時電気泳動した前染色分子量マーカー(BRL)を使用して決定した。オートラジオグラフィー(Kodak XAR)の前にゲルを1Mサリチル酸ナトリウム(pH5.4)を用いて処理した。
【0113】
Clevelandら(1977)によって記載されているゲル薄片法におけるタンパク質の消化を使用し、V8プロテアーゼのマップを作成した。簡単に述べると、100kDのタンパク質を含むゲル薄片を第2SDSゲル(10%)のウェル中に置き、Staphylococcus aureus V8プロテアーゼ(2.5μg/試料,Miles laboratories)を重層した。電気泳動後、ゲルを上述のごとく処理した。
【0114】
gp100/Pmel17遺伝子の一部の分子クローニング
既に記載されているプライマー:1497/1516:5’−TATTGAAAGTGCCGAGATCC−3’及び1839/1857:5’−TGCAAGGACCACAGCCATC−3’(Adema及びBaas,1991)を使用し、gp100/Pmel17遺伝子の一部を、末梢血リンパ球(PBL)から単離したヒトゲノムDNAにおいてPCR(Taq DNAポリメラーゼはGibco製)によって増幅した。次いでPCR産物を、追加Eco RI部位(5’−TATCTAGAATTCTGCACCAGATACTGAAG−3’及び5’−TATCTAGAATTCTGCAAGATGCCCACGATCAG−3’)を含むネストされたプライマーセットを使用して増幅した。これらのプライマー中の下線を引いたEco RI部位は、pUC18のEco RI部位においてPCR産物をクローニングするために使用した。
【0115】
RNAの単離及び分析
グアニジンチオシアネート法及び塩化セシウムクッションによる遠心(Chirgwinら,1979)を使用し、全RNAを単離した。Geneamp RNA PCRキット(Perkin Elmer Cetus)を製造業者指示に従って使用し、cDNAを調製した。cDNAのPCR分析を、既に記載されているプライマー1497/1516及び1839/1857(上記参照)(Adema及びBaas,1991)を使用して3mM MgCl2の存在下に35サイクル実施した。反応産物をアガロースゲル上でサイズ分画化し、ナイロン膜(Hybond−N,Amersham)上にブロットし、既に記載されている[32P]標識オリゴヌクレオチドプローブ(Adema及びBaas,1991)にハイブリダイズさせた。プローブとして、本発明者らはgp100特異的エキソン/エキソン接合オリゴヌクレオチド(5’−CTTCTTGACCAGGCATGATA−3’)またはPmel17特異的オリゴヌクレオチド(5’−TGTGAGAAGAATCCCAGGCA−3’)のいずれかを使用した。後者はPmel17 cDNA中に存在する追加の21ヌクレオチドのうちの20個に相当する。全てのハイブリダイゼーション実験において、Pmel17エキソン/エキソン接合(5’−GCTTATCATGCCTGTGCCTGGATTCTTCTCACAGGT−3’)からなるオリゴヌクレオチドを含むスポットブロットを対照として含めた。
【0116】
ヌクレオチド配列分析
T7 DNAポリメラーゼ(Pharmacia)を使用し、ジデオキシ−ヌクレオチド配列法(Sangerら,1977)によってgp100 cDNA及びゲノムDNAクローンの配列を決定した。両鎖の配列は各ケースで決定した。ゲノムDNAクローンはPCR後に得られたものなので、4つの別個のクローンの配列を決定した。DNA配列分析は、the University ofWinconsin Genetics Computing Group配列分析プログラム(Devereuxら,1984)を使用して実施した。
【0117】
結果
非染色COS−7細胞におけるgp100 cDNAの発現は、mAb NKI−beteb、mAb HMB−50及びmAb HMB−45との免疫反応性をもたらす。
【0118】
gp100陰性であるBLM黒色腫細胞におけるgp100 cDNAの発現は、メラノサイト系統特異的なmAb NKI−beteb、mAb HMB−50及びmAb HMB−45との免疫反応性をもたらす。メラノサイト系統以外の細胞におけるgp100−C1 cDNAの発現も上記mAbとの免疫反応性をもたらすかどうか確認するために、コーディング配向または非コーディング配向のgp100 cDNAを含む構築体を用いてCOS−7細胞(サル腎臓線維芽細胞)における遷移発現(transient expression)実験を行なった。コーディング配向のgp100 cDNAを含む構築体でトランスフェクトしたCOS−7細胞(COS−7/pSVLgp100+)のみが3種のmAb総てと反応する。このようなデータは、gp100 cDNA発現後にmAb NKI−beteb、mAb HMB−50及びmAb HMB−45と免疫反応性となるのはメラノサイト系統細胞に限らないことを明示している。加えて、上記データは、COS発現系がgp100 cDNAによってコードされたタンパク質の生化学的特徴を更に明らかにするのに用いられ得ることも示している。
【0119】
gp100 cDNAによってコードされたタンパク質の解析
gp100 cDNAによってコードされたタンパク質の特徴を明らかにするべくCOS−7/pSVLgp100+細胞を代謝的に標識し、これにmAb NKI−betebまたはmAb HMB−50を用いて免疫沈降を生起させた。mAb NKI−beteb及びmAb HMB−50はCOS−7/pSVLgp100+細胞の抽出物から約100kDのタンパク質を特異的に免疫沈降させる。前記タンパク質の分子量は代謝的に標識した、当該抗原を内在的に発現させるMEWO細胞の抽出物から免疫沈降するタンパク質の分子量(Vennegoor等,1988)に類似する(後段も参照)。これまでの報告(Vennegoor等,1988; Vogel及びEsclamado,1988)にも有るように、上記両mAbはMEWO黒色腫細胞の抽出物中に存在する10kDのタンパク質も認識する。同じ大きさのタンパク質はCOS−7/pSVLgp100+細胞のmAb NKI−betebと反応し、かつ長期曝露後にはmAb HMB−50と共に可視となる(図示せず)。10kDタンパク質の量は実験毎に甚だしく変化したことを指摘しておく。上記mAbが、非コーディング配向のgp100 cDNAを含む構築体でトランスフェクトしたCOS−7細胞から調製した抽出物に由来する場合は、いずれのmAbによっても特異的タンパク質は免疫沈降しない。
【0120】
黒色腫細胞の培地中にはmAb NKI−beteb及びmAb HMB−50と反応する約100kDの糖タンパク質も見出されている(Vennegoor等,1988; Vogel及びEsclamado,1988)。代謝的に標識したCOS−7/pSVLgp100+細胞及びMEWO細胞の培地を比較すれば、上記両mAbがこれらの細胞の培地中に存在する約100kDのタンパク質(後段も参照)も認識することは明らかである。黒色腫細胞に関して示したように、COS−7/pSVLgp100+細胞の培地に由来するmAbによって10kDのタンパク質は免疫沈降しない。このようなデータは、黒色腫細胞でのように、COS−7/pSVLgp100+細胞のmAb NKI−beteb及びmAb HMB−50によって認識される約100kDのタンパク質が分泌されることを明示している。
【0121】
mAbによって検出されるタンパク質がgp100 cDNAでのトランスフェクション後に誘導される内在遺伝子に由来する可能性を排除するために、3′截頭gp100転写単位を発現させるCOS−7細胞を用いて免疫沈降実験を行なった(詳細は“物質及び方法”の項参照)。129アミノ酸の欠失に合致して約85kDのタンパク質が、上記構築体を発現させるCOS−7細胞に由来する上記両mAbによって免疫沈降する。この発見は、COS−7/pSVLgp100+細胞のmAb NKI−beteb及びmAb HMB−50によって認識される100kDタンパク質がgp100 cDNAによってコードされることの直接の証拠となる。
【0122】
gp100 cDNAによってコードされる100kDタンパク質はgp100と同等である
COS−7/pSVLgp100+細胞のmAb NKI−beteb及びmAb HMB−50によって同定される約100kDのタンパク質は、SDS−PAGEによって解析すると、MEWO細胞のものとは僅かに異なる移動度を有する。黒色腫細胞においては上記mAbと反応するタンパク質はグリコシル化されることが示されているので(Vennegoor等,1988; Vogel及びEsclamado,1988)、この相違はCOS発現系においてしばしば観察される事象である変形グリコシル化に起因する可能性が有る。このことを確認するために、mAb NKI−betebを用いて、グリコシル化阻害剤であるツニカマイシンの存在下に培養したMEWO細胞及びCOS−7/pSVLgp100+細胞からタンパク質を免疫沈降させた。COS−7/pSVLgp100+細胞とMEWO細胞とのいずれにおいても約100kDの大きさのタンパク質は90kDと85kDとの2個のタンパク質バンドに縮小し、この事実によって観察された移動度の相違が変形グリコシル化に起因することが確認される。
【0123】
COS−7/pSVLgp100+細胞及びMEWO細胞のmAb NKI−betebによって認識されるタンパク質が同等であることの更に別の証拠を得るべく、V8プロテアーゼマッピング実験を行なった。COS−7/pSVLgp100+細胞またはMEWO細胞から単離した主要な100kDタンパク質をV8プロテアーゼで消化すると同じタンパク質フラグメントが得られる。これらのデータから本発明者は、gp100 cDNAは黒色腫細胞のmAb NKI−beteb及びmAb HMB−50によって認識されるメラノサイト系統特異的な糖タンパク質gp100をコードすると結論する。
【0124】
gp100はPmel17と高度に相同のI型膜透過タンパク質である
gp100 cDNAのヌクレオチド配列を決定した。この配列は2115個の塩基対(bp)を含み、その末端部は15ヌクレオチドのポリ(A)領域で、この領域の手前に共通ポリアデニル化配列AATAAAが位置する(Proudfoot及びBrownlee,1976)。gp100 cDNAにはヌクレオチド22から2007まで伸長する読み取り枠(ORF)が存在する。このORFは、適当な配列コンテクスト内に位置する翻訳開始のためのATGコドンから始まり(Kozak,1987)、661アミノ酸のタンパク質をコードする(配列番号1)。アミノ末端の20個のアミノ酸は、20位のAlaの後に位置する潜在的切断部位を含めてシグナル配列に関するあらゆる規準に適合し(von Heyne,1986)、このことは成熟したgp100が641個のアミノ酸を含む(約70kDに相当)ことを示唆する。疎水性プロット解析(Kyte及びDoolittle,1982)によれば、gp100のカルボキシル末端部(アミノ酸591〜611)には荷電残基によって規定されるただ一つの膜透過領域が存在する。予測される細胞質領域は45アミノ酸の長さを有する。五つの推定N末端連結グリコシル化部位が存在し、このことはgp100が糖タンパク質であることに合致する。更に、ヒスチジンに富む領域(アミノ酸182〜313)、反復アミノ酸配列を有するトレオニンに富む領域(アミノ酸309〜427)、及びシステインに富む領域(アミノ酸475〜566)が存在する。
【0125】
データベース検索(Pearson及びLipman,1988; Altschul等,1990)によって、gp100は別のメラノサイト特異的タンパク質Pmel17とほぼ同等であることが判明した(Kwon等,1991)。gp100のアミノ酸配列とPmel17のアミノ酸配列とは、274位(T−C/Pro−Leu)及び597位(C−G/Arg−Pro)のアミノ酸が置き換わっている点、及びPmel17の587位からの7個のアミノ酸がgp100には存在しない点で相違する(図2も参照)。782位におけるただ1個のヌクレオチドの相違(C−T)はアミノ酸の置換を惹起しない。gp100はまた、ウシ網膜cDNAライブラリーから単離された部分cDNAクローン(RPE−1)から推定されるタンパク質と80%相同であり(Kim及びWistow,1992)、ニワトリメラノソームマトリックスタンパク質MMP115とは42%相同である(Mochii等,1991)。
【0126】
gp100とPmel17とはただ一つの遺伝子によってコードされる
gp100 cDNAとPmel17 cDNAとの最も顕著な相違は、gp100 cDNAにおける21bpの読み取り枠内欠失である。この相違は、例えば緊密に関連する2種の遺伝子が存在するためと説明することができる。しかし、上記両cDNAは翻訳されないその3′領域に同等のヌクレオチド配列を有するので、この説明が当を得ているとは考えられない。別の可能性として、両cDNAがただ一つの一次転写物の択一的スプライシングによって得られる転写物に対応するということが考えられる。この仮説を検証するべく、PCRを用いてgp100遺伝子の推定の択一的スプライス部位を囲繞する部分に対応するゲノムDNAを解析した。このゲノムDNAのヌクレオチド配列をgp100−c1cDNAの配列と比較したところ、Pmel17 cDNAにおいて21bpが挿入されたまさにその位置にイントロン(102bp)が存在することが判明した(図1)。エキソン/イントロン境界部は、5′供与及び3′受容スプライス部位の共通配列に良く適合する(Padgett等,1986)。上記ゲノムDNAにおいて、Pmel17 cDNAの付加的な21bpを含む配列はgp100 RNAの調製に用いられる3′切断部位にその上流側で隣接し、この配列の手前に択一的3′受容スプライス部位が位置する(図1)。gp100特異的な3′受容スプライス部位が共通配列に適合する一方、Pmel17特異的な3′受容スプライス部位はピリミジンに富む領域を欠く点で次善のものと考えられる(図1)。次善のRNAプロセッシング部位は択一的プロセッシングを施される多くのメッセンジャーRNA前駆体に存在し、択一的RNAプロセッシングの調節機能と関係付けられている(Greenの観察,1991)。これらのデータは全体として、gp100 cDNA及びPmel17 cDNAに対応する転写物がただ一つの一次転写物の択一的スプライシングによって得られ、即ちただ一つの遺伝子に由来することを証明する。
【0127】
メラノサイト系統の細胞におけるgp100 RNA及びPmel17 RNAの発現
gp100 RNA及びPmel17 RNAがただ一つの一次転写物の択一的スプライシングによって得られるという発見は、この事象が発生上規則的に生起するのかどうかという疑問をもたらす。メラノサイト細胞から単離されたRNAを含有するノザンブロット上でgp100 cDNAによって検出される主要なRNA生成物は、2.5kbのRNA種である。プローブとしてPmel17cDNAを用いたKwon等(1987)によっても同じ結果が得られた。しかし、上記プローブはいずれもgp100 RNAとPmel17 RNAとを識別しない。メラノサイト系統の細胞におけるgp100 RNA及びPmel17 RNAの発現を調べるべく、逆転写酵素/ポリメラーゼ連鎖反応(RT/PCR)アッセイを行ない、その後サザンブロッティング、及びgp100特異的なエキソン/エキソン連結プローブまたはPmel17特異的なオリゴヌクレオチドプローブへのハイブリダイゼーションを行なった(“物質及び方法”の項参照)。4種の皮膚黒色腫細胞のうちの3種と、ブドウ膜黒色腫細胞と、新生児及び成人メラノサイトとにおいてgp100とPmel17との両方のスプライシング生成物が検出される。gp100陰性のBLM黒色腫細胞では、いずれのプローブを用いても生成物は検出されない。これらの結果は、試験した総てのメラノサイト細胞においてgp100 RNAとPmel17 RNAとが同時に発現することを明示している。
【0128】
実施例2―TILによるgp100の認識
物質及び方法
細胞培養物
転移性黒色腫のsibgle細胞懸濁液を1,000U/mlのIL−2(Cetus Corp., Emeryville, CA)の存在下に増殖させてTILを得、これを先に述べた方法(Kawakami,1992)で増殖させた。黒色腫細胞系Mel 397及びMel 624を得、これらを先に示した方法(Kawakami,1992)で増殖させた。HLA−A2.1+黒色腫細胞系MeWo(Bean,1975)及びBLM(Katano,1984)並びにマウスP815トランスフェクト体は、DMEM(Gibco, Paisley, Scotland, UK)に7.5%熱失活FCS(Gibco)を加えた中で増殖させた。JY、K562及びマウスEL4トランスフェクト体は、Iscoves培地(Gibco)に7.5% FCSを加えた中で培養した。マウス細胞は5×105M β−MEの存在下に増殖させ、いずれの培地にも抗生物質を含有させた。正常なメラノサイトは、Eisinger及びMarkoの方法(1982)を先に述べたように改良した方法(Smit,1989)で包皮から単離した。2回目から3回目の継代培養で得られたメラノサイトをクロム放出アッセイで用いた。
【0129】
DNA構築体及びトランスフェクション
コーディング配向のλ gp100 cDNAクローンのEcoRI断片をポリリンカーpBJ1−neo中でクローニングすることにより、プラスミドpBJ1gp100neoを得た(Lin,1990)。HLA−A2.1及びヒトβ−2ミクログロブリンをコードするゲノム断片を含むプラスミドpBA2はE. J. Baas(The Netherlands Cancer Institute, Division of Biochemistry, Amsterdam, The Netherlands)から、その好意によって提供を受けた。プラスミドpGK−hygはハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含む(Te Liele,1990)。HLA−A2.1遺伝子及びヒトβ−2ミクログロブリン遺伝子導入のためにEL4細胞を、リン酸カルシウムトランスフェクション系(Gibco BRL, Baithersburg, MD)を用いてリン酸カルシウム共沈法(Graham,1973)に従い18μgのpBA2及び2μgのpGK−hyg DNAでトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、安定なトランスフェクト体を選択するべく培地に500μg/mlのハイグロマイシンB(Calbiochem−Novabiochem Corp., La Jolla, CA)を添加した。安定なHLA−A2.1+ EL4クローンをリン酸カルシウム共沈により20μgのpBJ1gp100neo DNAでトランスフェクトしてHLA−A2.1+ gp100+ EL4細胞を得、これを1mg/mlのG418で選択した。P815 A2.1及びP815 A2.1/gp100細胞はP. Coulie(Ludwig Ins., Brussels, Belgium)から、その好意によって提供を受けた。
【0130】
mAb及び流動細胞計測法
間接免疫蛍光法を実施し、続いてFACScan(登録商標)(BectonDickinson & Co., Mountain View, CA)を用いて流動細胞計測法を実施することにより、黒色腫、トランスフェクト体及び正常なメラノサイトの表現型分析を行なった。精製した抗gp100 mAbのNKI−beteb(Vennegoor,1988)並びに抗HLA−A2mAbのBB7.2(培養物上清; Parham,1981)及びMA2.1(腹水1:500稀釈物; Parham,1978)を一次試薬として用いた。第二のインキュベーションのためにはFITC結合GAM−IgG−F(ab′)2(Zymed Laboratories, Inc., S. San Francisco, CA)を用いた。細胞内gp100抗原検出のために、細胞を0.01%ジギトニン中で透過性とし、その後1%パラホルムアルデヒド中で固定した。
【0131】
クロム放出アッセイ
クロム放出アッセイを先に述べたように行なった(Kawakami,1992)。手短に言えば、106個の標的細胞を100μCiのNa51CrO4(Amersham Int., Bucks, UK)と共に1時間インキュベートした。次に、丸底マイクロタイタープレート(Costar, Badhoevedorp, The Netherlands)の三つ組ウェル内に配置した2×103個の標的細胞に様々な量のエフェクター細胞を、最終的な量が150μlとなるように添加した。インキュベーションの5時間後、上清の一部を収穫してその放射性物質含量を測定した。標的細胞は、クロム放出アッセイに用いる前に50U/mlのヒト(Boehringer, Ingelheim, Germany)またはマウス(TNO, Rijswijk, The Netherlands)組み換え体IFNと共に48時間インキュベートした。
【0132】
TIL 1200
gp100特異的な細胞毒性Tリンパ球(CTL)の探索において、本発明者は制限要素としてHLA−A2.1に注目したが、なぜならHLA−A2.1は白色人種が一般的に有する抗原であり、かつ黒色腫に対するCTLの反応において主要な役割を果たすと推定されるからである。この研究にはHLA−A2.1+ TIL系のTIL 1200(Shilyansky, J.等,1994)を用いた。このTIL系はTCR α/β、CD3及びCD8を発現させる。
【0133】
結果
TIL 1200が黒色腫腫瘍細胞をHLA−A2.1の制限下に死滅させることはgp100の発現に対応する
一群のヒト黒色腫細胞系を用いて、TIL 1200の細胞溶解活性を分析した。TIL 1200は、いずれもgp100を発現させるHLA−A2.1+のMel 624及びMeWo黒色腫腫瘍細胞を有効に溶解させたが、HLA−A2.1- gp100+ Mel 397細胞への反応性は認められなかった。HLA−A2.1+ BLM黒色腫細胞もTIL 1200による溶解に対して耐性であることを観察したということが興味深く指摘される。更に、やはりgp100を発現させないHLA−A2.1+のEBV形質転換B細胞(JY)、及びK562細胞がTIL 1200によって溶解しなかった。これらのデータは全体として、TIL 1200がHLA−A2.1の制限下に細胞の死滅を実現し、その際前記死滅はgp100の発現と相関することを明示している。
【0134】
TIL 1200はHLA−A2.1 + gp100+トランスフェクト体を認識する
HLA−A2.1をコードするゲノム断片と、ハイグロマイシン耐性をもたらすプラスミドとで同時にトランスフェクトしたEL4細胞を流動細胞計測法で選択及び分析した。その後、HLA−A2.1発現細胞を、gp100をコードし、かつG418に対する耐性をもたらすpBJ1−gp100neoでトランスフェクトした。安定なトランスフェクト体を選択し、mAb NKI−betebを用いてgp100発現に関しスクリーニングした。P. Coulieと協力して、一群の同様トランスフェクト体をマウスP815細胞(P815 A2.1及びP815 A2.1/gp100)において作製した。得られたマウストランスフェクト体をクロム放出アッセイにおいて標的細胞として用いたところ、TIL 1200によるgp100特異的溶解が明らかに観察された。TIL1200によってマウスEL4 A2.1/gp100及びP815 A2.1/gp100トランスフェクト体が特異的に溶解するパーセンテージ(25〜35%; E/T 30:1)は、HLA−A2.1+ gp100+ヒト黒色腫細胞に関して得られるパーセンテージ(45〜60%; E/T 30:1)に比較して幾分低かった。この相違は、ヒトTILとマウストランスフェクト体との間に非整合性の補助分子が存在することで説明できる。この点を克服するべく、ヒトHLA−A2.1+ gp100- BLM黒色腫細胞にgp100抗原を、pBJ1−gp100neoでのトランスフェクションによって導入した。安定なBLM gp100クローンを、TIL 1200を用いるクロム放出アッセイにおいて試験した。BLM gp100クローンがTIL 1200による溶解に関して、gp100抗原を内在的に発現させるMel 624及びMeWo細胞と同様に感受性であることが判明した。TIL 1200のgp100特異性は、gp100を発現させないG418耐性BLM細胞が溶解しないことによっても明示され、それによってネオマイシン由来のペプチドが認識される可能性が排除された。
【0135】
実施例3
TIL 1200によって認識されるgp100エピトープの、gp100欠失変異株を用いてのマッピング
基本的に、抗腫瘍CTLによって認識されるエピトープのマッピングに当業者が通常用いる方法は二つ有る。
【0136】
1.HLA結合モチーフに従い、標的細胞中に存在するペプチドは合成可能である。合成したペプチドは、適当な制限要素を有する細胞に付加してCTLのための標的として用いることができる。
【0137】
2.欠失変異株を得、この欠失変異株を適当な制限要素と共に、例えばCOS−7細胞において発現させる。このようにトランスフェクトした細胞をCTLと共に培養し、CTLによる標的細胞の溶解またはTNF−α/IFNγの産生を測定する。CTLによって認識されないトランスフェクト体はペプチドを発現させない。
【0138】
本発明のエピトープの探索では上記方法を両方とも行なった。
【0139】
ペプチド付加T2細胞のTIL 1200媒介溶解
TIL 1200によって潜在的に認識され得るgp100ペプチドを化学的に合成した。ペプチドの合成はFmoc化学(Nijman,1993)を用いて、自動多段ペプチド合成機(Abimed AMS 422)において固相法で行なった。ペプチドがHLA−A2.1に実際に結合したことを、最近開示された、プロセッシング欠陥T2細胞を用いるペプチド結合アッセイ(Nijman,1993)で確認した。この分析によって、HLA−A2.1に強固に結合したgp100由来ペプチドを同定した。その後、HLA−A2.1に強固に結合したペプチドを付加したT2細胞を、標準的なクロム放出アッセイを用いてTIL 1200により溶解させた。このような操作によってペプチドL−L−D−G−T−A−T−L−R−Lを同定した。
【0140】
実施例4
欠失マッピングによって同定されるgp100エピトープ
gp100 cDNAを、発現ベクターpBJ1neo、pCMVneo(Baker等,1990)及びpSVLに挿入した。ペプチド457〜466のためのコーディング配列を欠くgp100 cDNAを得るべく、鋳型として完全長gp100 cDNAを用い、かつ次の組み合わせのオリゴヌクレオチド:
5'-CATGGAAGTGACTGTCTACC-3' / 5'-
CTGAGCGAATTCGGAACCTGTAATACTTTCCG-3' 及び 5'-
CTGAGCGAATTCGTGAAGAGACAAGTCCCCC-3' / 5'-
TCACAGCATCATATGAGAGTAC-3'を用いてPCR反応を生起させた。PCR生成物をEcoRIで消化し、連結し、次のプライマー:5'-GCACAGGCCAACTGCAGA-3'/5'-TTCAGTATCTGGTGCAGAAC-3'を用いる入れ子式PCRのための鋳型として用いた。前記入れ子式PCRの生成物から得たKpnI−ClaI断片をpCMVgp100neoの対応する断片と交換してpCMVgp100DEL454−481neoを得た。pBJ1gp100DEL454−481neoの1.7kb HindIII断片及び0.8kb EcoRI断片を欠失させることにより、gp100 cDNA変異株DEL149−654及びDEL454−654をそれぞれ得た。pSVLgp100のBglI−SacI断片、BamHI−BglII断片及びApaI−NsiI断片を欠失させることにより、gp100cDNA変異株DEL100−654、DEL194−528及びDEL167−508をそれぞれ得た。
【0141】
BLM細胞を、リン酸カルシウムトランスフェクション系(BRL, Gaithersburg, MD)を用いてリン酸カルシウム共沈操作(Graham及びvan der Eb,1973)に従い20μgのpCMVgp100DEL454−481neo DNAでトランスフェクトし、1mg/mlのG418(Gibco, Paisley, Scotland, UK)で選択した。
【0142】
COS−7細胞を、DEAE−デキストラン/クロロキン法(Seed及びAruffo,1987)を用いて5μgのpBJ1HLA−A2.1neoと、完全長または欠失gp100 cDNAを含む5μgのpBJ1またはpSVLプラスミドとで同時にトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、COS−7細胞をIFN−γ放出実験において刺激細胞として用いた。
【0143】
放出アッセイ
実施例2と同様の方法でクロム放出アッセイを行なった。
【0144】
IFN放出アッセイを行なうべく、105個のTIL 1200応答細胞を平底96ウェルマイクロタイタープレートにおいて、100U/mlのIL−2の存在下に300μlの培地中で5×104個の遷移トランスフェクト(transiently transfected)COS−7刺激細胞と共にインキュベートした。インキュベーションの24時間後に100μlの上清を収穫し、hIFN−γ−IRMA免疫放射線測定アッセイキット(megenix Diagnostics SA, Fleurus, Belgium)を用いてIFN−γの存在に関しスクリーニングした。
【0145】
結果
図3Aに、得られたgp100 cDNA欠失変異株を示す。図3Bに示したように、TIL 1200はHLA−A2.1及び完全長gp100 cDNAでトランスフェクトしたCOS−7細胞で刺激した場合に特異的にIFN−γを分泌した。また、gp100DEL454−481変異株に対するTIL 1200反応性も観察された。その他のgp100欠失変異株のうちではDEL100−661及びDEL149−661構築体のみが認識されなかったが、それによって、TIL 1200がgp100タンパク質のN末端からアミノ酸148位までに位置するペプチドと反応する可能性が排除された。gp100タンパク質のC末端領域も除外でき、なぜならTIL 1200の反応性が、gp100の最初の453個のアミノ酸をコードする変異構築体DEL454−661を用いて観察し得るからである。このN末端領域内でアミノ酸166までをコードする構築体(DEL167−508)がTIL 1200を刺激し得たという観察から、認識されるエピトープがgp100タンパク質のアミノ酸148〜166に位置するという結論が得られた。
【0146】
HLA−A2.1結合
自然のプロセッシングによってもたらされるHLA−A2.1に結合する9マーまたは10マーペプチド、及び合成されるHLA−A2.1結合ペプチドに関して幾つかのモチーフが開示されている(Falk等,1991; Hunt等,1992; Ruppert等,1993)。gp100タンパク質の148〜166領域を上記モチーフに対してスクリーニングし、2位に位置するトレオニン残基を含めた、幾分幅広いモチーフに適合する幾つかのペプチドを合成した。合成したペプチドをHLA−A2.1+ T2細胞に付加し、TIL 1200媒介標的細胞溶解を誘発する能力に関して試験した(図4A)。試験した五つのペプチドはいずれも、10μg/mlの濃度で用いた場合T2細胞をTIL 1200による溶解に関して感受性とし得た。これらのペプチドは総て、gp100のアミノ酸155〜162に対応する8マーペプチドTWGQYWQVを含む。全ペプチドを滴定してこれらのペプチドの、T2標的細胞をTIL 1200による溶解に関して感受性とする相対的な能力を評価した。図4Bに、9マーペプチドKTWGQYWQVは3ng/mlの濃度で適用すればTIL 1200によって認識され得るが、他のペプチドはより高い濃度で適用しなければならないことを示す。
【0147】
ペプチドKTWGQYWQV(gp100のアミノ酸155〜162)、LLDGTATLRL(gp100のアミノ酸457〜466)及びYLEPGPVTA(gp100のアミノ酸280〜288; Cox等が1994年に同定)を、HLA−A2.1中に現われる三つの公知ウイルスエピトープ、即ちインフルエンザマトリックス58−66ペプチド(Gotch等,1987)、HIVポリメラーゼ510−518ペプチド(Tsomides等,1991)及びHIV gp120 197−205ペプチド(Dadaglio等,1991)と比較した。上記エピトープのHLA−A2.1結合能を、プロセッシング欠陥細胞系T2を用いる間接結合アッセイ(Nijman等,1993)によって分析した。簡単に言うと、T2細胞を12.5μgのエピトープと共にインキュベートした。細胞表面におけるHLA−A2.1安定化を、mAb BB7.2を用いて流動細胞計測法により測定した。蛍光指数を、T2細胞を同様濃度のHLA−A2.1非結合ペプチドと共にインキュベートした場合に得られる平均蛍光強度(mean fluorescence)で除した実験での平均蛍光強度として表わす。
【0148】
このアッセイを用いて、gp100 280−288エピトープ、及び試験したウイルスエピトープに関しては同様のHLA−A2.1安定化が確認された。本発明のエピトープ(KTWGQYWQV及びLLDGTATLRL)は両方ともHLA−A2.1に、幾分低い親和性をもって結合する(図5)。このことから、gp100エピトープはHLA−A2.1に固有の親和性をもって結合すると結論付けられる。
【0149】
参考文献
【0150】
【表1】
【0151】
【表2】
【0152】
〔配列表〕
配列番号:1
配列の長さ:2115
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:mRNAに対するcDNA
ハイポセティカル配列:No
アンチセンス:No
起源
組織の種類:メラノーマ
細胞の種類:メラノサイト
配列の特徴
特徴を表す記号:CDS
存在位置:22..2005
配列の特徴
特徴を表す記号:misc signal
存在位置:1..81
配列の特徴
特徴を表す記号:misc feature
存在位置:1792..1870
他の情報:/機能=“膜貫通域”
配列の特徴
特徴を表す記号:misc binding
存在位置:262..264
他の情報:/bound moiety=“炭水化物”
配列の特徴
特徴を表す記号:misc binding
存在位置:337..339
他の情報:/bound moiety=“炭水化物”
配列の特徴
特徴を表す記号:misc binding
存在位置:352..354
他の情報:/bound moiety=“炭水化物”
配列の特徴
特徴を表す記号:misc binding
存在位置:982..984
他の情報:/bound moiety=“炭水化物”
配列の特徴
特徴を表す記号:misc binding
存在位置:1723..1725
他の情報:/bound moiety=“炭水化物”
配列
【0153】
【表3】
【0154】
【表4】
【0155】
【表5】
【0156】
【表6】
【0157】
配列番号:2
配列の長さ:661
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:タンパク質
配列
【0158】
【表7】
【0159】
【表8】
【0160】
【表9】
【0161】
配列番号:3
配列の長さ:30
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:mRNAに対するcDNA
ハイポセティカル配列:No
アンチセンス:No
配列の特徴
特徴を表す記号:CDS
存在位置:1..30
配列
CTG CTG GAT GGT ACA GCC ACC TTA AGG CTG 30
Leu Leu Asp Gly Thr Ala Thr Leu Arg Leu
1 5 10
配列番号:4
配列の長さ:10
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
分子の種類:タンパク質
配列
Leu Leu Asp Gly Thr Ala Thr Leu Arg Leu
1 5 10
配列番号:5
配列の長さ:30
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
ハイポセティカル配列:No
アンチセンス:No
配列の特徴
特徴を表す記号:CDS
存在位置:1..30
配列
GTA TTG CCA GAT GGG CAG GTT ATC TGG GTC 30
Val Leu Pro Asp Gly Gln Val Ile Trp Val
1 5 10
配列番号:6
配列の長さ:10
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
分子の種類:タンパク質
配列
Val Leu Pro Asp Gly Gln Val Ile Trp Val
1 5 10
配列番号:7
配列の長さ:24
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:mRNAに対するcDNA
ハイポセティカル配列:No
アンチセンス:No
起源
組織の種類:メラノーマ
細胞の種類:メラノサイト
配列の特徴
特徴を表す記号:CDS
存在位置:1..24
配列
ACC TGG GGC CAA TAC TGG CAA GTT 24
Thr Trp Gly Gln Tyr Trp Gln Val
1 5
配列番号:8
配列の長さ:8
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
分子の種類:タンパク質
配列
Thr Trp Gly Gln Tyr Trp Gln Val
1 5
配列番号:9
配列の長さ:36
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:mRNAに対するcDNA
ハイポセティカル配列:No
アンチセンス:No
起源
組織の種類:メラノーマ
細胞の種類:メラノサイト
配列の特徴
特徴を表す記号:CDS
存在位置:1..36
配列の特徴
特徴を表す記号:protein bind
存在位置:1..33
配列の特徴
特徴を表す記号:protein bind
存在位置:7..36
配列の特徴
特徴を表す記号:protein bind
存在位置:7..33
配列の特徴
特徴を表す記号:protein bind
存在位置:10..36
配列
GTC TGG AAG ACC TGG GGC CAA TAC TGG CAA GTT CTA 36
Val Trp Lys Thr Trp Gly Gln Tyr Trp Gln Val Leu
1 5 10
配列番号:10
配列の長さ:12
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:タンパク質
配列
Val Trp Lys Thr Trp Gly Gln Tyr Trp Gln Val Leu
1 5 10
配列番号:11
配列の長さ:29
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
配列の特徴
特徴を表す記号:misc feature
存在位置:7..12
他の情報:/ラベル=EcoRI−site
配列
TATCTAGAAT TCTGCACCAG ATACTGAAG 29
配列番号:12
配列の長さ:32
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
配列の特徴
特徴を表す記号:misc feature
存在位置:7..12
他の情報:/ラベル=EcoRI−site
配列
TATCTAGAAT TCTGCAAGAT GCCCACGATC AG 32
配列番号:13
配列の長さ:20
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
配列
CTTCTTGACC AGGCATGATA 20
配列番号:14
配列の長さ:20
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
配列
TGTGAGAAGA ATCCCAGGCA 20
配列番号:15
配列の長さ:36
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
配列
GCTTATCATG CCTGTGCCTG GATTCTTCTC ACAGGT 36
配列番号:16
配列の長さ:20
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
ハイポセティカル配列:No
配列
CATGGAAGTG ACTGTCTACC 20
配列番号:17
配列の長さ:32
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
ハイポセティカル配列:No
配列
CTGAGCGAAT TCGGAACCTG TAATACTTTC CG 32
配列番号:18
配列の長さ:31
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
ハイポセティカル配列:No
配列
CTGAGCGAAT TCGTGAAGAG ACAAGTCCCC C 31
配列番号:19
配列の長さ:22
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
ハイポセティカル配列:No
配列
TCACAGCATC ATATGAGAGT AC 22
【図面の簡単な説明】
【図1】ヒトgp100/Pmel17遺伝子の一部のゲノム構成を示す。A及びA’はそれぞれgp100 cDNA及びPmel17 cDNAに相当する転写物において除去されたイントロンを表わす。エキソン配列は大文字で、イントロン配列は小文字で表わしてある。分岐点配列(Ruskin,B.ら,1984)に最も適合する箇所には下線を引いてある。
【図2】gp100/pMel17ファミリーのメンバーのカルボキシ末端部分を並べて示す。同一のアミノ酸(−)及びギャップ(*)を示すと共に、保存されているシステイン残基(#)も示す。
【図3】(A)gp100タンパク質の一部をコードするgp100欠失突然変異体を示す(数字は、配列番号2に示したgp100タンパク質におけるアミノ酸を示す)。
(B)HLA−A2.1及び図3(A)に示したgp100欠失突然変異体を用いてトランスフェクトした細胞のTIL 1200による認識を示す。
【図4】(A)gp100の148−166領域から誘導された、8−merから11−merの5つのペプチドのTIL 1200による認識を試験した。エフェクター対ターゲット比30:1で、特異的溶解物を検出した。
(B)図4Aで同定されたgp100ペプチドのTIL 1200による認識に対する滴定(E/T比30:1)を示す。
【図5】gp100とウイルスエピトープのHLA−A2.1に対する結合を示す。
Claims (20)
- L−L−D−G−T−A−T−L−R−L、T−W−G−Q−Y−W−Q−V、V−W−K−T−W−G−Q−Y−W−Q−V、K−T−W−G−Q−Y−W−Q−V−L、K−T−W−G−Q−Y−W−Q−V及びT−W−G−Q−Y−W−Q−V−Lからなる群の中から選択されるアミノ酸配列からなる、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなる黒色腫関連抗原のペプチド断片。
- 請求項1に記載のペプチド断片をコードする核酸。
- 配列番号3又は7から選択される配列を含む請求項2に記載の核酸。
- 請求項2又は3の核酸を含むクローニング媒体。
- 請求項4に記載のクローニング媒体でトランスフェクト又は形質転換された宿主細胞。
- MHCクラスIの対立遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含むクローニング媒体でコトランスフェクトされた請求項5に記載の宿主細胞。
- 宿主細胞がネズミEL4細胞、ネズミP8.15細胞又はヒトBLM細胞である請求項5又は6に記載の宿主細胞。
- 抗原提示細胞である請求項5から7のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- B7、CTLA−4、CD70及び熱安定性抗原からなる群から選択される同時刺激分子を産生する請求項5から8のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 請求項1に記載のペプチド断片を含むワクチン。
- ペプチドを医薬的に許容できる担体又は希釈剤と混合する請求項10に記載のワクチン。
- 予めペプチドが負荷されている抗原提示細胞を含む請求項10又は11に記載のワクチン。
- 請求項5から9のいずれか1項に記載の宿主細胞を含むワクチン。
- 請求項2又は3に記載の核酸を含むワクチン。
- アジュバント、1種以上のサイトカイン、CD2、CD3、CD27、CD28又は他のT細胞表面抗原に対する抗体、及びCD4+又はCD8+T細胞を刺激するためのヘルパーエピトープからなる群の中から選択された1種以上の化合物を更に含む請求項10から14のいずれか1項に記載のワクチン。
- a.黒色腫試料中に存在する腫瘍浸潤リンパ球を培養し;
b.試料から腫瘍浸潤リンパ球を単離し;
c.該リンパ球を請求項1に記載のペプチド断片と反応させ;
d.該ペプチド断片に結合するリンパ球を単離する
段階からなることを特徴とする抗原反応性腫瘍浸潤リンパ球の産生方法。 - 請求項1に記載のペプチド断片に結合し得ることを特徴とする腫瘍浸潤リンパ球。
- 請求項17に記載の腫瘍浸潤リンパ球を含むワクチン。
- 請求項1に記載のペプチド断片と検出可能マーカーとの結合体。
- 検出可能マーカーが放射性核種である請求項19に記載の結合体。
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