FI121572B - Melanoomaan liittyvä antigeeninen peptidifragmentti ja melanoomarokotteita - Google Patents

Description

Melanoomaan liittyvä antigeeninen peptidifragmentti ja me-lanoomarokottei ta Tämä keksintö koskee melanoomaan liittyvän anti-5 geenin immunogeenista peptidifragmenttia, rokotteita melanoomaa vastaan, antigeenin tunnistavia kasvaimeen tunkeutuvia T-imusoluja ja menetelmää antigeenin suhteen reak-tiokykyisten kasvaimeen tunkeutuvien imusolujen aikaansaamiseksi in vitro.

10 Kasvainsolut voivat vapautua rajoittavasta kasvun kontrolloinnista onkogeenien aktivoinnin ja/tai kasvaimen-suppressiogeenien inaktivoinnin avulla. Kasvaimen edistyminen tapahtuu sarjana vähittäisiä, asteittaisia muutoksia erilaisissa "yksittäisominaisuuksissa", so. fenotyypin piir-15 teissä, joista monia tiedetään määräävän tai niihin vähintään vaikuttavan määrättyjen omkogeenien ja/tai kasvainta estävien geenien muuttuneen ilmentymisen. Solun vapautumisen immunologisesta isännän rajoittamisesta voi noudattaa monivaiheisia reittejä, jotka muistuttavat vapautumista 20 kasvun kontrolloinnista.

Syövän immunoterapiassa usein kohdattu ongelma on kasvaimen immunogeenisyyden puute. Tämä pääsy immuunikont-rollijärjestelmästä voidaan ymmärtää neotyyppisissä soluissa tavattavien fenotyypin erojen perusteella [eroa-25 vuuksia, joita on löydetty Burkittin lymfoomasoluilla jul kaisun Klein, G. ja Boon, T., Curr. Opinion in Immunol. 5 q (1993) 687 - 692 mukaan]: oi ...

^ - vähentynyt kyky muokata ja esittää antigeenejä; "7" - vähentynyt kyky stimuloida autologisia T-soluja; 30 - transformoituihin soluihin liittyvien immunogee- | nisten proteiinien ilmentämisen täydelleen estyneeksi sää- ^ täminen;

CD

g - leukosyyttien adheesiomolekyylien tai muiden m cd apumolekyylien ilmentämättömyys tai vähäinen ilmentäminen 1 ja 2 - selektiivinen eräiden MHC-luokan I ja luokan II alleelien ilmentämistä estävä säätely.

MHC-luokan I/II antigeenien ilmentymistä säädellään usein estävästi kiinteissä kasvaimissa. Tämä voi vaikuttaa 5 kaikkiin luokan I/II antigeeneihin tai vain osaan niistä. Virus- ja solupeptidit, jotka voivat herkistää sopivia kohdesoluja sytotoksisten T-imusolujen välittämälle lyy-sille, voivat epäonnistua tämän aikaansaamisessa, kun ne on tuotettu soluissa, joissa MHC-luokan I antigeenin il- 10 mentymistaso on alhainen. Sytotoksisuusherkkyys voidaan aiheuttaa ainakin joissakin tapauksissa kohottamalla MHC-luokan I/II antigeenien ilmentymistasoa interferoni gamma: n ja kasvainnekroositekijä a:n avulla.

Kuitenkin asteittaisten muutosten normaalista kas- 15 vainkudokseksi aikana ilmestyy kasvaimeen liittyviä antigeenejä. Nämä antigeenit voivat paljastua erilaisten mekanismien avulla: - ne voivat olla molekyylejä, jotka on naamioitu jollakin tavalla normaalin solun kehityksen aikana, mutta 20 joissa neoplastinen muutos aiheuttaa naamioivan suojauksen poistumisen immuunijärjestelmää varten; - joidenkin molekyylien poistaminen solukalvosta voi muuttaa viereisten molekyylien profiilia määrätyssä kalvon kohdassa ja siten tämän seurauksena synnyttää uuden 25 profiilin, josta saattaa tulla immunogeeninen isännälle; - neoplastiseen transformaatioon liittyvä kalvon 0 muutos voi paljastaa uusia, aikaisemmin piilossa olleita o molekyylin alueita tai voi johtaa uusien rakennepiirteiden c\i lisäämiseen olemassa olevaan molekyyliin; ^ 30 - kasvainsolujen irti päästäminen ja hajoaminen voi paljastaa immuunijärjestelmälle tuman, tumajyväsen tai cc D- soluliman komponentteja, jotka ovat normaalisti piilossa S solussa.

CD

g Kasvaimiin liittyvien antigeenien ominaisuudet O) 35 riippuvat hyvin suuressa määrin niitä omaavan kasvaimen 3 alkuperästä. Eläinten kasvaimiin littyvien antigeenien esiintyminen on dokumentoitu viime vuosisadalla ja ihmisen syöpien antigeeninen luonne on hyvin osoitettu, pääasiallisesti viimeaikaisten, monoklonaalisilla vasta-aineilla 5 suoritettujen tutkimusten avulla.

Yrityksissä eristää ja kemiallisesti karakterisoida näitä antigeenejä on kohdattu vakavia vaikeuksia, joissa on usein kysymys antigeenejä omaavien molekyylien liuoksesta saostamiseen sopivien reagenssien puuttumisesta.

10 Kuten monet muut ärsykkeet kasvaimiin liittyvät antigeenitkään eivät aktivoi yhtä vaan kokonaista ryhmää puolustusmekanismeja - sekä spesifisiä että epäspesifisiä, humoraalisia ja solusidonnaisia. Vallitseva rooli in vivo vastustuskyvyssä kasvaimen kasvua vastaan on T-imusoluil-15 la. Nämä solut tunnistavat kasvaimiin liittyviä antigeenejä, joita niille esittävät antigeenejä tarjoavat solut (APC), ja tämä tunnistaminen aktivoi ne, ja aktivoiduttu-aan ja erilaistuttuaan ne hyökkäävät kasvainsolujen kimppuun ja tappavat niitä. Tämän tyyppisten imusolujen eri-20 koisen luokan muodostavat kasvaimeen tunkeutuvat imusolut (TIL), joita voidaan löytää kiinteistä kasvaimista.

On jo ehdotettu (EP 147 689) T-imusolujen aktivoimista antigeenisellä aineella, joka on kytketty liukenemattomaan kantaja-aineeseen in vitro, ja näiden aktivoitu-25 jen imusolujen antamista sitten kasvainpotilaalle.

Tavanomainen kemoterapia on suhteellisen tehotonta o etäispesäkkeisen melanooman omaavien potilaiden hoidossa, ^ ja noin 6 000 potilasta kuolee tähän sairauteen Yhdysval- £! loissa joka vuosi.

30 Rosenberg et ai. [New Eng. J. Med. 319 (25) (1988) x 1 676 - 1 681] ovat osoittaneet autologisilla TILreilla ja cc interleukiini 2:11a (IL-2) suoritettavan immunoterapian S hyödyllisen vaikutuksen melanoomapotilailla.

co g Tämä hoito käsittää kasvainkerrostuman poisleikkaa-

CD

35 misen, TIL:en eristämisen, TIL:en lisäämisen in vitro ja 4 infuusion potilaasen hoitaen samanaikaisesti suurilla ja myrkyllisyyttä aiheuttavilla IL-2-annoksilla.

Rosenbergin käyttämät TIL:t on suunnattu melanoomaan liittyviin antigeeneihin ja kykenevät tunnistamaan 5 näitä.

Päämääränämme on ollut eristää tällainen melanoomaan liittyvä antigeeni, jotta voisimme käyttää antigeeniä ja/tai sen epitooppeja immunoterapian kehittämiseen mela-noomapotilaita varten.

10 Melanooma-antigeenejä on jo kuvannut Old, L.

(1981), joka on identifioinut 6 antigeenistä glykoproteii-nia ja 3 glykolipidiä, jotka esiintyivät 120 melanoomaso-lulinjassa.

On kuvattu myös rokotteita, joissa on käytetty me-15 lanooma-antigeenejä: US-patenteissa 5 030 621 ja 5 194 384 on valmistettu monitehoinen rokote viljelemällä melanoo-masoluja ja eristämällä sen jälkeen eritettyjä melanoomalle spesifisiä antigeenejä viljelyaineesta.

Joitakin spesifisiä atigeenejä on jo ehdotettu me-20 lanoomatyyppiä olevan syövän hoitoa ja diagnosointia varten: peptidi p97 on esitelty US-patenteissa 5 262 177 ja 5 141 742, kun taas 35 kilodaltonin proteiini on mainittu julkaisussa EP 529 007.

Olemme löytäneet melanoomaan liittyvän polypepti-25 din, jolle on tunnusomaista, että se käsittää aminohappo-sekvenssin SEQ ID NO:2.

o Tämän melanosyyttilinjalle spesifisen antigeenisen £3 polypeptidin (josta käytetään myös nimitystä gplOO) tun- c!j nistaa monoklonaalinen vasta-aine NKI-beteb, joka vasta- sj- 30 aine on osoittautunut sopivaksi diagnosointitarkoituksia x varten. Tämän vasta-aineen tunnistamat antigeenit ovat

DC

solunsisäisiä proteiineja, jotka ovat kooltaan noin 10 kd (gp 10) ja 100 kd (gplOO). Viimeksi mainittu on myös toco o dettavissa melanoomasolujen viljelyaineessa [Vennegoor, C.

05 35 et ai., Am. J. Pathol. 130 (1988) 179 - 192]. On myös to- 5 dettu, että gplOO-antigeeni reagoi muiden melanoomalle spesifisten vasta-aineiden kuten HMB-50:n [kuvanneet Vogel, A.M. ja Esclamado, R.M., Cancer Res. 48 (1988) 1 286 - 1 294] tai HMB-45:n kanssa [kuvanneet Gown, A.M.

5 et ai., Am. J. Pathol. 123 (1986) 195 - 203]. Koska näiden monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa reagoivien proteiinien on osoitettu olevan glykosyloituja melanoomasoluissa, on havittu eroavuuksia kulkeutumisnopeudessa analysoitaessa SDS-PAGE:n avulla.

10 Vaikka tämä gplOO-antigeeni ilmentyy pääasiallises ti solun sisällä, on sen nyt todettu olevan sopiva immuno-geeninen antigeeni, koska on osoitettu, nämä solunsisäiset proteiinit voidaan muokata ja esittää peptideinä MHC-mole-kyylien yhteydessä immuunijärjestelmän soluille. Itse asi-15 assa on löydetty melanoomapotilaiden kasvaimista peräisin olevia kasvaimeen tunkeutuneita imusoluja, jotka reagoivat kyseisen antigeenin kanssa.

Sen vuoksi gplOO-polypeptidi on mahdollinen kohde syövänvastaisia soluvälitteisiä vasteita varten ja sopiva 20 melanoomapotilaiden hoitoa ja diagnosoitia varten.

GplOO on tyyppiä I oleva kalvon läpi ulottuva proteiini, jossa on runsaasti treoniinia omaava, toistuvia aminohapposekvenssejä sisältävä domeeni läsnä proteiinin keskellä (aminohapot 309 - 427). Tätä runsaasti treoniinia 25 sisältävää domeenia, jolle voi tapahtua laajaa 0-sidosgly-kosylointia, edeltää runsaasti histidiiniä sisältävä alue o (aminohapot 182 - 313) ja seuraa runsaasti kysteiiniä si- £3 sältävä domeeni (aminohapot 475 - 566). Hydrofobisuus- c\j plot-analyysin perusteella (Kyte, J. ja Doolittle, R.F., 30 1982) on yksi ainoa kalvon läpi ulottuva domeeni, jota reunustavat varaukselliset jäännökset, läsnä gpl00:n kar- 0c boksiterminaalisessa osassa (aminohapot 591 - 611). Ole-S tettu soluliman domeeni on pituudeltaan 45 aminohappoa.

CD

o Läsnä on viisi otaksuttua N-sidosglykosylointikohtaa, mikä σ> 6 sopii yhteen sen käsityksen kanssa, että gplOO on glykpro-teiini.

Termi "polypeptidi" viittaa aminohappomolekyyliket-juun, ei viittaa tuotteen erityiseen pituuteen, ja vaadit-5 taessa tämä voidaan modifioida in vivo tai in vitro esimerkiksi glykosyloimalla, amidoimalla, karboksyloimalla tai fosforyloimalla; siten polypeptidin määritelmään sisältyy muun muassa peptidejä, oligopeptidejä ja proteiineja.

10 Tähän keksintöön luetaan luonnollisesti mukaan myös keksinnön mukaisen polypeptidin funktionaalisia johdannaisia samoin kuin myös fragmentteja. Funktionaalisten johdannaisten tarkoitetaan käsittävän polypeptidejä, jotka eroavat yhden tai useamman kokonaissekvenssissä olevan 15 aminohapon suhteen, joissa on poistoja, korvautumisia, inversioita tai lisäyksiä. On kuvattu aminohappojen korvautumisia, joiden voidaan olettaa olevan muuttamatta oleellisesti biologisia ja immunologisia aktiivisuuksia. Aminohappojen korvautumisia toisiaan muistuttavien amino-20 happojen kesken tai korvautumisia, joita on esiitynyt usein evoluution aikana, ovat muun muassa Ser/Ala, Ser/ Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val (katso Dayhof, M.D., Atlas of protein sequence and structure, Nat. Biomed. Res. Found., Washington D.C., 1978, vol. 5, suppl. 3). Tämän 25 informaation perusteella Lipman ja Pearson ovat kehittäneet menetelmän nopeaa ja herkkää proteiinien vertailua o varten [Science 227 (1985) 1 435 - 1 441] ja funktionaali- ^ sen samankaltaisuuden määrittämiseksi holomogisten poly- £! peptidien välillä.

30 Tämän keksinnön piiriin sisältyy funktionaalisia x johdannaisia, jotka yhä osoittavat immunologista aktiivi- cc “ suutta monoklonaalista vasta-ainetta NKI-beteb tai HMB-50 S tai HMB-45 kohtaan.

co § Lisäksi näiden peptidien funktionaalisina johdan- 1 naisina mainitaan myös gpl00:sta saatuja peptidejä, jotka 7 kykenevät aiheuttamaan kasvaimeen tunkeutuven imusolujen aikaansaaman kohdesolujen lyysin.

Lisäksi näiden peptidien funktionaalisilla johdannaisilla tarkoitetaan myös peptidien additiosuoloja, pep-5 tidien amideja ja erikoisesti C-terminaalisia amideja, estereitä ja erikoisesti C-terminaalisia estereitä ja N-asyylijohdannaisia, erikoisesti N-terminaalisia asyylijoh-dannaisia, ja N-asetyylijohdannaisia.

Keksinnön mukaiset polypeptidit voidaan tuottaa 10 joko synteettisesti tai yhdistelmä-DNA-teknologian avulla. Alalla tunnetaan menetelmiä synteettisten polypeptidien tuottamiseksi.

Orgaanisen kemian peptidisynteesimenetelmien katsotaan käsittävän vaadittujen aminohappojen kytkemisen 15 kondensaatioreaktion avulla, joko homogeenisessa faasissa tai niin kutsutun kiinteän faasin avulla. Kondensaatiore-aktio voidaan suorittaa seuraavasti: a) yhdisteen (aminohappo, peptid), jossa on vapaa karboksyyliryhmä ja suojattuja muita reaktiokykyisiä ryh- 20 miä, kondensaatio sellaisen yhdisteen kanssa (aminohappo, peptidi), jossa on vapaa aminoryhmä ja suojattuja muita reaktiokykyisiä ryhmiä, kondensaatioaineen läsnä ollessa; b) yhdisteen (aminohappo, peptidi), jossa on aktivoitu karboksyyliryhmä ja vapaita tai suojattuja muita 25 reaktiokykyisiä ryhmiä, kondensaatio sellaisen yhdisteen kanssa (aminohappo, peptidi), jossa on vapaa aminoryhmä ja o vapaita tai suojattuja muita reaktiokykyisiä ryhmiä.

£3 Karboksyyliryhmän aktivointi voi tapahtua muun cnj muassa muuttamalla karboksyyliryhmä happohalogenidiksi, 4 30 -atsidiksi, -anhydridiksi, imidatsolidiksi tai aktivoiduk- x si esteriksi kuten N-hydroksisukkinimidiksi, N-hydroksi- cn bentsotriatsoliksi tai p-nitrofenyyliesteriksi .

5 Yleisimmät menetelmät yllä mainittuja kondensaatio-

CD

g reaktioita varten ovat: karbodi-imidimenetelmä, atsidi me- (J) 35 netelmä, seka-anhydridimenetelmä ja menetelmä, jossa käy- 8 tetään aktivoituja estereitä, kuten on esimerkiksi kuvattu julkaisussa The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology Voi. 1-3 (toim. Gross, E. ja Meienhofer, J. ) 1979, 1980, 1981 (Academic Press, Inc.).

5 Polypeptidien tuottaminen yhdistelmä-DNA-tekniikko- jen avulla on yleinen menetelmä, joka on tunnettu, mutta jossa on runsaasti jonkin verran erilaisiin tuloksiin johtavia mahdollisuuksia. Ilmennettävän polypeptidin koodaa DNA-sekvenssi tai tarkemmin sanottuna nukleiinihapposek-10 venssi.

On todettu, että gpl00:n aminohapposekvenssi muistuttaa läheisesti jo tunnetun melanoomaan liittyvän peptidin pMell7 aminohapposekvenssiä, jonka on paljastanut Kwon, B.S. (1991).

15 Gpl00:n ja Pmell7:n väliset aminohappoeroavuudet käsittävät korvautumisia aminohappoasemassa 274 (T-C/PRO-LEU) ja 597 (C-G/ARG-PRO) ja 7 aminohappoa käsittävän jakson puuttumisen gpl00:sta asemassa 587. Yhden ainoan nukleotidin ero asemassa 762 (C-T) ei johda aminohapon kor-20 vautumiseen. GplOO on myös 80-%-isesti homologinen sellai sen otaksutun proteiinin kanssa, joka on johdettu naudan verkkokalvon cDNA-kirjastosta eristetystä osittais-cDNA-kloonista (RPE-1) (Kim, R.Y. ja Wistow, G.J., 1992), ja 42-%-isesti homologinen kananpojan melanosomaalisen mat-25 riisin proteiinin MMP115 kanssa (Mochii, M., 1991). Katso myös kuvio 2.

0 Eräs keksinnön osa on myös nukleiinihapposekvenssi, o joka käsittää gplOO-polypeptidin koodaavan sekvenssin.

c\i Edullisesti gpl00:n koodaava sekvenssi on sekvenssi 4 30 SEQ ID NO:1.

Kuten alalla on tunnettua, geneettisen koodin dege-a. neraatio sallii sellaisen emästen korvaamisen kodonissa, g joka johtaa toiseen, edelleen saman aminohapon koodaavaan

CD

o kodoniin, esim. aminohapon glutamiinihappo kodoni on sekä

05 35 GAT että GAA. Siten on selvää, että sekvenssissä SEQ ID

9 NO :2 esitetyn aminohapposekvenssin omaavan polypeptidin ilmentämiseen voidaan käyttää johdannaisnukleiinihapposek-venssiä, jolla on tällainen vaihtoehtoinen kodonikoostumus ja joka siten eroaa SEQ ID NO: l:ssä esitetystä nukleiini-5 happosekvenssistä.

Tässä käytettynä "nukleotidisekvenssi" viittaa minkä tahansa pituiseen nukleotidien polymeeriseen muotoon, sekä ribonukleiinihappo (RNA) -sekvensseihin että deoksi-ribonukleiinihappo (DNA) -sekvensseihin. Periaatteessa 10 tämä termi viittaa molekyylin primaarirakenteeseen. Tämä termi käsittää siten kaksi- ja yksisäikeisen DNA:n samoin kuin myös kaksi- ja yksisäikeisen RNA:n ja niiden muunnoksia.

Gpl00:n nukleotidisekvenssi sisältää 2115 emäsparia 15 (bp) ja päättyy poly(A)-alueeseen, jossa on 15 nukleotidia ja jota edeltää konsensuspolyadenylaatiosekvenssi AATAAA. GplOO-DNA:ssa on läsnä avoin lukuvaiheistus (ORF), joka ulottuu nukleotidista 22 nukleotidiin 2007. Tämä ORF alkaa ATG-kodonilla, joka on asianmukaisen sekvenssin yhteydessä 20 translaation aloitusta varten, ja koodaa 661 aminohapon proteiinin. Aminoterminaaliset 20 aminohappoa täyttävät kaikki kriteerit signaalisekvessejä varten mukaan lukien mahdollinen katkaisukohta asemassa 20 olevan ALA:n jälkeen (-1), mikä viittaa siihen, että valmis gplOO sisältää 641 25 aminohappoa (noin 70 kd).

Huomattavin ero gplOO- ja Pmell7-cDNA:iden välillä o on lukuvaiheistuksen sisällä oleva 21 emäsparin deleetio £3 gpl00-cDNA:ssa (kuvio 2). Genomi-DNA:n nukleotidisekvens- cvi sin vertailu gpl00-cDNA:n sekvenssin kanssa paljasti int- 30 ronin (102 emäsparia) läsnäolon juuri Pmell7-cDNA:ssa ole-van 21 emäsparin insertin kohdalla. Eksonin/intronin rajat

CC

sopivat hyvin konsensus-5 '-donori- ja -3 '-akseptoriliitos- g kohtasekvensseihin (Padgett, 1986). Genomi-DNA:ssa sek- co o venssi, joka käsittää Pmell7-cDNA:ssa olevat 21 lisäemäs- 05 35 paria, sijaitsee välittömästi vastavirtaan 3'-katkaisukoh- 10 dasta, jota käytetään gpl00-RNA:n aikaansaamiseksi, ja sitä edeltää vaihtoehtoinen 3'-akseptoriliitoskohta. Sen sijaan että gplOOtlle ominainen 3'-akseptoriliitoskohta sopii konsensussekvenssiin, Pmell7:lle ominainen 3'-aksep-5 toriliitoskohta näyttää olevan optimaalista huonompi, koska siitä puuttuu runsaasti pyrimidiiniä sisältävä alue. Optimaalista huonompia RNA:n muokkauskohtia on läsnä monissa vaihtoehtoisesti muokatuissa lähetti-RNA:n edeltäjissä ja niiden on esitetty toimivan vaihtoehoisen RNA:n 10 muokkauksen säätelyssä (katsauksen tästä on esittänyt Green, M.R., 1991). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että gplOO- ja Pmell7-cDNA:ja vastaavat transkriptit aikaansaadaan yhden ainoan primaaritranskriptin vaihtoehtoisen katkomalla muokkauksen (splicing) avulla.

15 Keksinnön lisäosa ovat peptidit, jotka ovat gplOO- polypeptidin immunogeenisiä fragmentteja.

Immunogeeniset fragmentit ovat gplOO-molekyylin fragmentteja, joilla on edelleen kyky aiheuttaa immunogee-ninen vaste, so. niin että joko mahdollista synnyttää vas-20 ta-aineita, jotka tunnistavat fragmentit spesifisesti, tai niin että on mahdollista löytää T-imusoluja, jotka ovat fragmenttien aktivoimia.

Kuten yllä on sanottu, on tiedetty, että kasvaimiin liittyvien antigeenien immunogeeninen vaikutus tulee usein 25 esiin T-soluja aktivoivan mekanismin avulla [Townsend, A.R.M. ja Bodmer, H., Ann. Rev. Immunol. 7 (1989) 601 - 0 624], Sytotoksisia T-imusoluja (CTL), jotka tunnistavat ° melanoomasoluja T-solureseptorista (TCR) riippuvaisella ja i £! MHC:n rajoittamalla tavalla, on eristetty kasvaimia omaa- i ^ 30 viita potilailta (katsauksen esittänyt Knuth, A., 1992).

1 Brichard et ai. (1993) ovat osoittaneet, että CTL-klooni

CC

tunnistaa tyrosinaasista saadun peptidin, toisen melano- lo ...... . .

g syytille ominaisen antigeenin.

S Tiedetään, että T-solujen aktivointi MHC-molekyylin en 35 avulla vaatii antigeenin muokkauksen, josta antigeenistä 11 pieniä palasia (esimerkiksi 8 - 12-meerejä) esitetään T-imusolulle.

GplOO-sekvenssissä sijaitsevat immunogeeniset oli-gopeptidit muodostavat myös osan keksinnöstä.

5 Olemme löytäneet gplOO-sekvenssin immunogeenisiä peptidisekvenssejä, jotka eivät ainoastaan kykene sitoutumaan MHC I -molekyyliin, mutta joiden on myös osoitettu tunnistavan melanoomapotilaalta eristettyjä kasvaimeen tunkeutuvia imusoluja.

10 On löydetty useita peptidejä: peptidien, joilla on aminohapposekvenssit V-L-P-D-G-Q-V-I-W-V, M-L-G-T-H-T-M-E-V, R-L-M-K-Q-D-F-S-V, (V)-(W)-(K)-T-W-G-Q-Y-W-Q-V-(L) ja L-L-D-G-T-A-T-L-R-L, on todettu sitoutuvan MHC:n HLA-A2.1-molekyyliin. Lisäksi antimelanooma- sytotoksiset T-imuso-15 lut tunnistavat viimeksi mainitut kaksi peptidiä HLA-A2.1:n yhteydessä.

Näitä peptidejä reunustavat edullisesti niiden kanssa yhteen kuulumattomat sekvenssit, so. sekvenssit, joihin ne eivät ole yhdistettyjä luonnossa, koska on to-20 dettu, että tällaiset vierusalueet lisäävät näiden peptidien immunogeenisiä ominaisuuksia, luultavasti paremman muokkauksen ja APCrjen avulla esittämisen kautta.

Keksinnön vielä yhden osan muodostavat nukleotidi-sekvenssit, jotka käsittävät yllä mainittuja peptidejä 25 koodaavat nukleotidisekvenssit.

Sen lisäksi että näitä sekvenssejä käytetään pepti-o dien tuottamiseen yhdistelmä-DNA-tekniikkojen avulla, jota ^ valaistaan lisää esimerkkien avulla, gpl00:aa tai sen epi- i £! tooppeja varten annetussa sekvessiluettelossa esitettyä i 30 sekvenssi-informaatiota voidaan käyttää diagnosointitar- x koituksiin.

CC

“ Näistä sekvensseistä voidaan johtaa alukkeita pe-

LO

<o rustaksi diagnostiselle testille gpl00:n tai gpl00:n kal- § täisten proteiinien osoittamiseksi nukleiinihaponmonistus-

CD

35 tekniikan avulla esimerkiksi käyttäen polymeraasiketjure- 12 aktiota (PCR) tai nukleiinihapposekvenssiin perustuvaa monistusta (NASBA) kuten on kuvattu vastaavasti julkaisuissa US 4 683 202 ja EP 329 822.

PCR: n avulla aikaansaadaan suuria määriä DNA:ta 5 käsittelemällä kohteena olevaa DNA-sekvenssiä oligonukle-otidialukkeilla, niin että syntetisoituu alukkeenpidentä-mistuote, joka erotetaan templaatista käyttäen lämpödena-turointia ja joka puolestaan toimii templaattina, mikä johtaa kohdesekvenssin monistumiseen. Kun on tarkoitus 10 monistaa RNA:ta PCR:n avulla, RNA-säie kopioidaan ensin DNA-säikeeksi käänteiskopioijaentsyymin avulla. NASBA:n avulla aikaansaadaan suuria määriä yksisäikeistä RNA:ta joko yksisäikeisen RNA:n tai DNA:n tai kaksisäikeisen DNA:n avulla. Kun on tarkoitus monistaa RNA:ta, ssRNA toi-15 mii templaattina ensimmäisen DNA-säikeen synteesissä, joka tapahtuu pidentämällä ensimmäistä ssRNA-polymeraasin tun-nistuskohdan sisältävää aluketta. Muodostettu DNA-säie toimii puolestaan templaattina toisen, komplementaarisen DNA-säikeen synteesissä, joka tapahtuu pidentämällä toista 20 aluketta, mikä johtaa kaksisäikeiseen aktiiviseen RNA-po-lymeraasin promoottorikohtaan, ja toinen DNA toimii templaattina suurten määrien ensimmäistä templaattia, ssRNA:ta, syntetisoimiseksi RNA-polymeraasin avulla.

Monistetun nukleotidisekvenssin osoittaminen suori-25 tetaan hybridisoimalla komplementaarinen osoittamiskoetin monistettuun mukleiinihappoon. Tämä koetin vo olla merkit-o ty ja/tai immobilisoitu kiinteän faasin pinnalle. Merkki- ^ aineen osoittaminen voidaan suorittaa alalla tunnettujen i menetelmien avulla. Koettimen avulla kiinteään faasiin -?t· 30 sidottujen nukleiinihappojen osoittaminen voidaan suorit- t— x taa nukleiinihappojen selektiiviseen osoittamiseen sopivi- tr en yhdisteiden avulla.

S Kuten on sanottu aikaisemmin, nukleotidisekvenssejä g voidaan käyttää gpl00:n tai yhden sen epitopeista tuotta en 35 miseen yhdistelmä-DNA-tekniikkojen avulla. Tätä varten 13 nukleotidisekvenssin täytyy sisätyä kloonausvektoriin, jota vodaan käyttää sopivan isäntäsolun transformointiin tai transfektointiin.

Laajaa valikoimaa isäntäsolun ja kloonausvektorin 5 yhdistelmiä voidaan edullisesti käyttää nukleiinihapposek-venssin kloonauksessa. Esimerkiksi voivat hyödylliset kloonausvektorit käsittää kromosomaalisia, ei-kromosomaa-lisia ja synteettisiä DNA-sekvenssejä kuten erilaisia tunnettuja bakteeriplasmideja ja laajemman isäntävalikoiman 10 plasmideja kuten pBR 322, erilaisia pUC-, pGEM- ja pBluescript-plasmideja, bakteriofaageja, esim. lambda-gt-Wes, Cahron 28 ja M13:sta saatuja faageja, ja vektoreita, jotka on saatu plamidien ja faagi- tai virus-DNA:n, kuten SV40-, adenovirus- tai polyoomavirus-DNA:n, yhdistelmistä 15 [katso myös Rodriquez, R.L. ja Denhardt (1988); Lenstra, 1990].

Hyödylliset isännät voivat olla bakteeri-isäntiä, hiivoja ja muita sieniä, kasvi- tai eläinisäntäsoluja kuten kiinanhamsterin munasarjan (CHO) soluja tai apinan 20 soluja ja muita isäntiä.

Peptidien ilmentämisessä käytettävät vektorit sisältävät lisäksi säätelysekvenssejä toimivasti liitettynä peptidin koodaavaan nukleiinihapposekvenssiin. Tällaiset säätelysekvenssit käsittävät yleensä promoottorisekvenssin 25 ja sekvenssejä, jotka säätelevät ja/tai nostavat ilmentä-mistasoja. Lisäksi replikaationaloituskohta ja/tai valliten seva selektiomerkkigeeni ovat usein läsnä tällaisissa vek- £3 toreissa. Säätely- ja muut sekvenssit voivat luonnollisesti ti vaihdella riippuen valitusta isäntäsolusta.

30 Tekniikkoja isäntäsolujen transformoimiseksi tai transfektoimiseksi tunnetaan alalla varsin hyvin (katso £ esimerkiksi Maniatis et ai., 1982 ja 1989).

On erittäin käytännöllistä, jos peptidiä koskevan co o informaation lisäksi isäntäsolu myös yhteistransformoidaan ^ 35 tai yhteistransfektoidaan vektorilla, joka sisältää infor- 14 maation sellaista MHC-molekyyliä varten, johon mainitun peptidin tiedetään sitoutuvan. Edullisesti MHC-molekyyli on HLA-A2.1, HLA-A1 tai HLA-A3.1 tai mikä tahansa muu HLA-alleeli, jonka tiedetään olevan läsnä melanoomapotilaissa.

5 HLA-A2.1 on erityisen edullinen, koska on osoitettu (Anichini, A., 1993), että melanoomasolut omaavat antigeenejä, joita melanoomapotilaista peräisin olevat HLA-A2.1-rajoitettujen sytotoksisten T-solujen kloonit tunnistavat.

GplOO:n ilmentämiseen erityisen hyvin sopivia isän-10 täsoluja ovat hiiren EL4- ja P8.15-solut. Gpl00:n ilmentämiseen ovat erityisen sopivia ihmisen BLM-solut (kuvannut Katano, M., 1984), koska ne kykenevät jo ilmentämään MHC-molekyyliä HLA-A2.1.

GplOOiaa tai mitä tahansa sen peptideistä tai nii-15 den nukleotidisekvensseistä, jotka on mainittu yllä, voidaan käyttää rokotteessa melanooman hoitoa varten.

Immunogeenisesti tehokkaan määrän aktiivista peptidiä lisäksi rokote voi sisältää farmaseuttisesti hyväksyttävää kantaja- tai laimennusainetta.

20 Keksinnön mukaisten peptidien, erityisesti oligo- peptidien, immunogeenisyyttä voidaan lisätä ristikytkemäl-lä tai liittämällä immunogeeniseen kantajamolekyyliin (so. makromolekyyliin, joka kykenee itsenäisesti synnyttämään immunologisen vasteen potilaassa ja johon keksinnön mukai-25 set peptidit voidaan kytkeä kovalenttisesti).

Kovalenttinen kytkeminen kantajamolekyyliin voidaan o suorittaa käyttäen alalla tunnettuja menetelmiä, joiden o nimenomaisen valinnan määrää käytetyn kantajamolekyylin c\j laatu. Kun immunogeeninen kantajamolekyyli on proteiini, 30 keksinnön mukaiset peptidit voidaan kytkeä esim. käyttäen veteen liukenevia karbodi-imidejä kuten disykloheksyyli-£ karbodi-imidiä tai glutaarialdehydiä.

g Näiden kaltaisia kytkentäaineita voidaan myös käyt tö o tää peptidien ristikytkemiseksi toisiinsa käyttämättä ω 35 erillistä kantajamolekyyliä. Sellainen ristikytkeminen 15 polypeptideihin tai peptidiaggregaatteihin voi myös lisätä immunogeenisyyttä.

Esimerkkejä farmaseuttisesti hyväksyttävistä kantaja- tai laimennusaineista, jotka ovat käyttökelpoisia täs-5 sä keksinnössä, ovat stabiloimisaineet kuten SPGA, hiili hydraatit (esim. sorbitoli, mannitoli, tärkkelys, sakkaroosi, glukoosi, dekstraani), proteiinit kuten albumiini tai kaseiini, proteiineja sisältävät aineet kuten naudan seerumi tai kuorittu maito ja puskuriliuokset (esim. fosio faattipuskuriliuos).

Valinnaisesti voidaan yhtä tai useampaa adjuvantti-aktiivisuuden omaavaa yhdistettä lisätä rokotteeseen. Sopivia adjuvantteja ovat esimerkiksi alumiinihydroksidi, -fosfaatti tai -oksidi, öljyemulsiot (esim. joissa on Bayol 15 FtR) tai Marcol 52(R)), saponiinit tai vitamiini E -liuote.

Tämän keksinnön mukainen rokote voidaan antaa muun muassa laskimoon, vatsaontelon sisään, nenäontelon sisään, ihon sisään, ihon alle tai lihakseen.

Annettava hyödyllinen tehokas määrä vaihtelee poti-20 laan iän ja painon ja rokotteenantamistavan mukaan.

Rokotetta voidaan käyttää T-soluvasteen aikaansaamiseksi spesifisesti, mutta on myös mahdollista, että B-soluvaste tulee esiin rokottamisen jälkeen. Mkäli näin käy, B-soluvaste johtaa vasta-aineiden muodostumiseen ro-25 kotteen peptidiä vastaan, jotka vasta-aineet ovat suunnat tuja antigeenin tuotannon lähdettä, so. kasvainsoluja vasto taan. Tämä on edullinen piirre, koska tällä tavalla kas- ^ vainsoluja vastustetaan kummankin immunologisen järjestel- i män vasteiden avulla.

i ^ 30 Kummatkin immunologiset järjestelmät käynnistyvät x vielä tehokkaammin, jos rokote sisältää peptidit esitetty- cr “ nä MHC-molekyylissä antigeenin esittävän solun (APC) avul- S la. Antigeenin esittäminen voidaan suorittaa käyttäen mo- co g nosyyttejä, makrofageja, interdigitoivia soluja, Langer-

CD

35 hansxn soluja ja erityisesti dendriittisoluja, jotka on 16 kuormattu yhdellä keksinnön mukaisista peptideistä. APCijen kuormaus voidaan suorittaa viemällä keksinnön mukaiset peptidit APCrhin tai niiden läheisyyteen, mutta on edullisempaa antaa APC:jen käsitellä täydellinen gplOO-5 antigeeni. Tällä tavoin aikaansaadaan esittäminen, joka jäljittelee in vivo esiintyvää tilannetta realistisimmin. Lisäksi solun käyttämä MHC on tyyppiä, joka sopii epitoo-pin esittämiseen.

Yleinen etu APC:jen käyttämisestä epitooppien esit-10 tämiseen on tässä yhteydessä käytettävän APC-solun valinta. Erilaisista APC-tyypeistä tiedetään, että on stimuloivia APC:ja ja estäviä APCrja.

Edullisia ovat luetellut solutyypit, jotka ovat niin kutsuttuja "ammattilaisia" antigeenin esittäviä solu-15 ja ja joille on tunnusomaista, että niillä on samanaikaisesti stimuloivia molekyylejä, joilla on tärkeä tehtävä antigeenin esittämisen tapahtumasarjassa. Tällaisia samanaikaisesti stimuloivia molekyylejä ovat esimerkiksi B7, CTLA-4, CD70 tai lämpöä kestävä antigeeni (Schwartz, 20 1992).

Fibroblasteilta, joiden on myös osoitettu kykenevän toimimaan antigeenin esittävänä soluna, puuttuvat nämä samanaikaisesti stimuloivat molekyylit.

On myös mahdollista käyttää soluja, jotka on jo 25 transfektoitu informaation gpl00:aa varten sisältävällä kloonausvektorilla ja jotka on yhteistransfektoitu kloo- 0 nausvektorilla, joka sisältää nukleotidisekvenssin MHC- o luokan I molekyyliä varten, esimerkiksi sekvenssin, joka c\j koodaa HLA-A2.1:n, HLA-Al:n tai HLA-A3.1:n. Nämä solut 4- 30 toimivat antigeenin esittävinä soluina ja esittävät gplOO- fragmentteja MHC-luokan I molekyyleissä, joita ilmentyy £ niiden pinnalle. Pidetään mahdollisena, että tämä esittä- minen tehostuu, jos solu kykenee myös ilmentämään jotain co o yllä mainituista samanaikaisesti stimuloivista molekyy- 05 35 leistä tai samankaltaisen vaikutuksen omaavaa molekyyliä.

17 Tämä ilmentyminen voi olla tuloksena solun transformoin-nista tai transfektoinnista kolmannella kloonausvektoril-la, jossa on tällaisen samanaikisesti stimuloivan molekyylin koodaava sekvenssi-informaatio, mutta voi myös olla, 5 että solu on jo ollut kykenevä tuottamaan samanaikaisesti stimuloivia molekyylejä.

Soluja, joissa on haluttujen ilmentämistuotteiden ohella monia myös ilmennettäviä elementtejä, jotka voivat vaikuttaa kielteisesti haluttuun solun immunogeeniseen 10 reaktioon, sisältävän rokotteen asemesta on myös mahdollista, että rokote koostuu liposomeista, jotka tuovat esille lisättyjä peptidejä sisältäviä MHC-molekyylejä ja jotka on esimerkiksi täytetty lymfokiineillä. Tällaiset liposomit käynnistävät immunologisen T-solureaktion.

15 Esittämällä peptidi samalla tavalla kuin se esite tään myös in vivo aikaansaadaan vahvistunut T-soluvaste. Lisäksi suhteellisen suurten antigeenin esittävien solujen luonnollisen adjuvanttivaikutuksen avulla käynnistyy myös B-soluvaste. Tämä B-soluvaste johtaa mm. sellaisten vasta-20 aineiden muodostumiseen, jotka on suunnattu peptidi-MHC-kompleksia vastaan. Tätä kompleksia on löydetty erityisesti kasvainsoluista, joiden tapauksessa on osoitettu, että potilaassa gplOOrn epitooppeja esitetään luonnollisesti ja ne kykenevät siten tuomaan esiin T-soluvasteen. Tämä luon-25 nollisena esiintyvä ilmiö vahvistuu annettaessa rokotteena APC:ja, jotka jo esittävät keksinnön mukaisia peptidejä, o Vahvistamisen avulla ei ainoastaan aikaansaada vahvistu- o nutta T-soluvastetta, vaan pannaan myös alulle B-soluvas- c\i te, joka johtaa MHC-peptidikompleksia vastaan suunnattui- 4 30 hin vasta-aineisiin.

x Keksinnön mukaisiin rokotteisiin voidaan lisätä cc lukuisia yhdisteitä, joilla on vahvistava vaikutus sekä T- £2 solu- että B-soluvasteen alullepanoon ja ylläpitoon rokot- co o tamxsen jälkeen.

CD

18 Tällä tavalla sytokiinien lisääminen rokotteeseen vahvistaa T-soluvastetta. Sopivia sytokiinejä ovat esimerkiksi interleukiinit kuten IL-2, IL-4, IL-7 tai IL-12, GM-CSF, RANTES, kasvainnekroositekijä ja interferonit kuten 5 IFN-.

Samalla tavoin T-solujen pinta-antigeenien vastaiset vasta-aineet kuten CD2, CD3, CD27 ja CD28 vahvistavat immunogeenistä reaktiota.

Myös avustajaepitooppien lisääminen CD4+-auttajaso-10 lujen tai CD8+-tappajasolujen stimuloimiseks vahvistaa im munogeenistä reaktiota. Vaihtoehtoisesti voidaan myös käyttää auttajaepitooppeja, jotka ovat peräisin muista antigeeneistä, esimerkiksi lämpöshokin avulla saaduista proteiineista tai koleratoksiinista.

15 Keksinnön vielä erään osan muodostaa gpl00:n kanssa reaktiokykyisten kasvaimeen tunkeutuvien imusolujen (TIL) käyttö. Tässä menetelmässä on ensimmäinen vaihe näytteen ottaminen potilaasta. Tämä tehdään tavallisesti leikkaamalla pois kasvainkerrostuma käyttäen paikallispuudutusta. 20 Tässä näytteessä läsnä olevia TIL:jä lisätään sitten viljelmässä 4-8 viikon ajan tunnettujen menetelmien mukaan (Topalian, S.L. et ai., 1987). Tämän viljelyn aikana tarkistetaan sitten TIL:ien kyky reagoida gpl00:n tai jonkun gpl00:sta peräisin olevan epitoopin kanssa. Antigeenin 25 tunnistavat TIL:t eristetään ja niitä viljellään edelleen.

Kasvaimeen tunkeutuvat imusolut, jotka kykenevät o reagoimaan gpl00:n kanssa ja jotka saadaan tämän menetel- 0 män avulla, muodostavat myös osan keksinnöstä. On löydetty c\i yksi sellainen, TIL 1200 :ksi nimitetty, TIL-solulinja, 4 30 joka reagoi spesifisesti gpl00:n ja sen epitooppien kans- 1 sa. Tämä TIL 1 200 -solulinja ilmentää myös MHC-molekyyliä cc HLA-A2.1. Lisäksi on osoitettu tämän solulinjan ilmentävän TCR a/B:aa, CD3:a ja CD8:aa. Lisäksi TIL 1 200 tunnistaa

CD

o transfektantteja, jotka ilmentävät sekä HLA-A2.1:tä että ^ 35 gpl00:aa.

19 Tämä TIL 1 200 ja muut gplOOrn tunnistavat TIL:t sopivat melanoomapotilaiden hoitoon. Tällaista hoitoa varten TIL:ja viljellään kuten yllä on esitetty ja ne annetaan takaisin potilaille infuusiona laskimoon. Hoidon 5 onnistumista voidaan parantaa esikäsittelemällä kasvaimen omaavaa potilasta joko säteilyttämällä koko kehoa tai hoitamalla syklofosfamidilla ja antamalla samanaikaiseti in-terleukiini 2:ta (Rosenberg, S.A. et ai., 1986).

Potilaaseen takaisin infuusiona annetut TIL:t ovat 10 edullisesti autologisia TiL:ja (so. peräisin potilaan omasta kasvaimesta), mutta voidaan myös kuvitella mahdolliseksi allogeenisten TILren antamista infuusiona.

Yllä kuvatun mukaisella menetelmällä saatujen TILren eräs käyttömahdollisuus on lisäksi in vivo suori-15 tettavassa diagnosoinnissa. TILren merkitseminen, esimerkiksi nlInrlla (Fisher, 1989) tai millä tahansa muulla sopivalla diagnostisella merkkiaineella, tekee ne sopiviksi kasvainkerrostumien identifiointiin melanoomapotilailla.

Keksinnön vielä erään osan muodostaa T-soluresepto-20 ri (TCR), jota ilmentävät gplOOrn kanssa reagoimaan kykenevät CTLrt. Kuten alalla on tunnettua, määrää TCR CTLrn spesifisyyden. Sen vuoksi TCRrn, erityisesti sen vaihtuvan alueen, koodaava cDNA voidaan eristää ja viedä T-soluihin, siirtäen tällä tavalla kasvaimenvastainen aktiivisuus mi-25 hin tahansa T-soluun. Erityisesti tällaisen TCRrn laittaminen autologisiin T-soluihin ja sitä seuraava näiden Το solujen lisääminen johtaa suuriin määriin CTLrja, jotka ovat sopivia siirrettäviksi eksogeenisinä autologiseen c\j potilaaseen.

4- 30 Tämän T-solureseptorin omaavia soluja voidaan myös käyttää rokotustarkoituksiin. cc

Rokote voi myös koostua melanoomasoluista, jotka (2 kykenevät ilmentämään gplOOraa. On mahdollista eristää co o näitä soluja potilaasta käyttäen anti-gplOO-vasta-aineita ^ 35 kuten vasta-ainetta NKl-beteb, mutta on myös mahdollista 20 tuottaa sellaisia melanoomasoluja viljellyistä melanooma-solulinjoista, jotka joko ovat luonnollisia gpl00:n tuottajia tai jotka on geneettisesti käsitelty tuottamaan gpl00:aa. Nämä solut voidaan säteilyttää kasvainta aiheut-5 tamattomiksi ja antaa infuusiona (takaisin) potilaaseen. Näiden melanoomasolujen immunologisen vaikutuksen vahvistamiseksi on edullista muuttaa niitä geneettisesti tuottamaan lymfokiiniä, edullisesti interleukiini 2: ta (IL-2) tai granulosyytti-makrofagikoloniastimulaatiotekijää (GM-10 CSF). Gpl00+-melanoomasoluja voidaan transfektoida kloona-usvektorilla, jossa on IL-2:n tai GM-CSF:n tuottamista koodaavaa sekvenssi.

Tällaisen rokotteen antaminen infuusiona potilaaseen stimuloi CTL:en muodostumista.

15 Toisen tyyppinen rokotus, jolla on samankaltainen vaikutus, on rokotus puhtaalla DNA:11a, esimerkiksi sellaisella vektorin tai vektoriviruksen DNA:11a, jossa on gplOO-antigeenin tai siitä saatuja peptidejä koodaava DNA-sekvenssi. Injektoinnin jälkeen virus infektoi tai DNA 20 transformoidaan soluihin, jotka ilmentävät antigeeniä tai peptidiä (peptidej ä).

Minkä tahansa gplOO-peptidin vastaiset vasta-aineet mukaan lukien (V)-(W)-(K)-T-W-G-Q-Y-W-Q-V-(L):n ja L-L-D-G-T-A-T-L-R-L:n vastaiset vasta-aineet ovat myös osa kek-25 sintöä.

Näiden peptidien vastaisia monospesifisiä vasta-o aineita voidaan saada affiniteettipuhdistuksen avulla mo- ° nispesifisistä antiseerumeista käyttämällä muunnelmaa me- i w netelmästä, jonka ovat julkaisseet Hall, R. et ai. (1984).

i 30 Monispesifisiä antiseerumeja voidaan saada immunisoimalla x kaniineja yleisten immunisointisuunnitelmien mukaan.

tr

Monospesifinen vasta-aine määritellään tässä käyte tettynä yhdeksi ainoaksi vasta-ainelajiksi tai monen vas to g ta-aineen lajiksi, jolla on homogeeniset sitoutumisominai- O) 35 suudet kysymyksessä olevan antigeenin suhteen. Homogeeni- 21 nen sitoutuminen viittaa tässä käytettynä vasta-ainelajin kykyyn sitoutua keksinnön mukaiseen ligandin sitovaan do-meeniin.

Vasta-aine on edullisesti monoklonaalinen vasta-5 aine, edullisemmin ihmiselle sopivaksi tehty monoklonaalinen vasta-aine.

Monoklonaalisia vasta-aineita voidaan valmistaa immunisoimalla umpisiitoshiiriä, edullisesti Balb/c, asianmukaisella proteiinilla käyttäen alalla tunnettuja tek-10 nilkkoja (Köhler, G. ja Milstein, C., 1975). Hybridooma-soluja valitaan sen jälkeen kasvattamalla hypoksntiinia, tymidiiniä ja aminopteriiniä sisältävässä sopivassa solu-viljelyaineessa kuten Dulbeccon modifioidussa Eaglen ela-tusaineessa (DMEM). Vasta-ainetta tuottavia hybridoomia 15 kloonataan, edullisesti käyttäen MacPhersonin (1973) pehmyt agartekniikkaa. Erillisiä pesäkkeitä siirretään vilje-lylevyjen yksittäisiin kuoppiin viljeltäviksi sopivassa elatusaineessa. Vasta-ainetta tuottavat solut identifioidaan seulomalla sopivan immunogeenin avulla. Immunogeenil-20 le positiivisia hybridoomasoluja ylläpidetään alalla tunnettujen tekniikkojen avulla. Spesifisiä anti-monoklonaalisia vasta-aineita tuotetaan viljelemälä hybridoomia in vitro tai valmistamalla askitesnestettä hiirissä hybridoo-mien injektoinnin seurauksena alalla tunnettujen menetel-25 mien avulla.

On edullista käyttää ihmiselle sopivaksi tehtyjä o vasta-aineita. Menetelmiä vasta-aineiden tekemiseksi Hunted selle sopiviksi, kuten CDR-siirtäminen, tunnetaan (Jones, i ™ P.T. et ai., 1986). Toinen mahdollisuus keksinnön mukaiset 30 ten polypeptidien kanssa reagoimaan kykenevien vasta-ai- x neiden vastaisen, antigeenin synnyttämän vasteen välttämi-

CC

“ seksi on käyttää ihmisen vasta-aineita tai niiden frag- co mentteja tai johdannaisia.

§ Ihmisen vasta-aineita voidaan tuottaa stimuloimalla en 35 eristettyjä B-imusoluja in vitro tai niitä voidaan eristää 22 (ikuisiksi tehdyistä) B-imusoluista, jotka on otettu talteen vähintään yhdellä keksinnön mukaisella ligandin sitovalla domeenilla immunisoidusta ihmisestä.

Yllä kuvatun mukaisia vasta-ainetta voidaan käyttää 5 melanoomapotilaiden passiiviseen rokotukseen. Edullinen vasta-ainetyyppi tällaista rokotetta varten ovat MHC-mole-kyylin yhteydessä esitettyjä yllä mainittuja peptidejä vastaan suunnatut vasta-aineet. Tällaisten vasta-aineiden tuottamiseksi vaaditaan immunisointi APCtjen esittämillä 10 peptideillä. Tällainen immunisointi voidaan suorittaa kuten yllä on kuvattu. Vaihtoehtoisesti voidaan peptidi-MHC-kompleksien vastaisia ihmisen vasta-aineita eristää sellaisella rokotteella käsitellyiltä potilailta, joka koostuu yhdellä mainituista peptideistä kuormatuista APCrista. 15 Vasta-aineita, joita muodostuu jollakin keksinnön mukaisista rokotteista käsittelyn jälkeen, voidaan myös käyttää mainitun rokotuksen tarkkailuun. Tällaista menetelmää varten hankitaan potilaiden seerumia ja osoitetaan vasta-aineet, jotka on suunnattu rokotuksen suorittamiseen 20 käytettyä peptidiä vastaan. Tunnettaessa tästä osoittamisesta saatu vasta-ainetiitteri voidaan arvioida, tarvitaanko tehostusrokotusta.

Mainittujen vasta-aineiden spesifinen osoittaminen seerumista voidaan suorittaa merkittyjen peptidien avulla. 25 Merkkiaine voi olla mikä tahansa in vitro suoritettavan diagnosoinnin alalla tunnettu diagnostinen merkkiaine, o mutta edullisimpia (ja yleisesti käytettyjä) ovat entsyy- ^ mit, väriaineet, metallit ja radionuklidit kuten 67Ga, Λ "“Te, U1ln, 113mIn, 123I, 125I tai 131I.

4 30 Radiodiagnostiset merkkiaineet voidaan kytkeä suo- T“" x raan keksinnön mukaisiin peptideihin tai sellaisten kela- tr toivien ryhmien avulla, jotka on kytketty peptidiin suo- (2 raan tai liitos- tai väliosamolekyylien avulla. Radionuk- co o lidien peptideihin tai peptidin kaltaisiin rakenteisiin 1 kytkemisen tekniikka tunnetaan jo (kasvain) diagnostiikan 23 alalla sekä in vivo että in vitro suoritetuissa testeissä käytettyjen merkittyjen vasta-aineiden lukuisista käyttösovellutuksista .

Peptidien suora merkitseminen voidaan suorittaa 5 esimerkiksi kuten on kuvattu yhden astian menetelmässä (Haisma, 1986). Yleinen menetelmä peptidien merkitsemiseksi kelaatinmuodostajien avulla, käyttäen tai käyttämättä liitos- tai väliosamolekyylejä, on kuvattu esimerkiksi US-patenttijulkaisuissa 4 472 509 ja 4 485 086. Kelaatinmuo-10 dostajia, joissa käytetään DTPA:n bisyklistä anhydridiä, on esitelty julkaisussa Hnatowich, D.J. et ai. (1983). Kytkeminen diamididimerkaptidiyhdisteiden avulla on esitelty julkaisussa EP 188 256.

Tätä keksintöä kuvataan lisää esimerkkien avulla 15 viitaten oheisiin kuvioihin, joissa:

Kuvio 1 esittää osan ihmisen gpl00/Pmell7-geenistä genomirakenteen. A ja A' edustavat introneja, jotka on poistettu vastaavasti gplOO-cDNA:ta ja Pmell7-cDNA:ta vastaavista transkripteistä. Eksonisekvenssit on osoitettu 20 suurilla kirjaimilla ja intronisekvenssit pienillä kirjaimilla. Paras sopivuus jakautumiskohdan sekvenssiin (Ruskin, B. et ai., 1984) on alleviivattu.

Kuvio 2 esittää gpl00/pMell7-ryhmän jäsenten kar-boksiterminaalisten osien riveinä kohdakkain asettamisen. 25 Identtiset aminohapt (-) ja aukot (*) on osoitettu. Säilytetyt kysteiinijäännökset (#) on osoitettu myös. o Kuvio 3. A) On esitetty gplOO-deleetiomutantteja, £3 jotka koodaavat osia gplOO-proteiinista, (numerot osoiteli tavat gplOO-proteiinissa olevia aminohappoja kuten on >4- 30 osoitettu SEQ ID N0:2:ssa).

χ B) HLA-A2.1:llä ja kuviossa 3A esitetyillä gplOO- cc “ deleetiomutanteilla transfektoitujen solujen tunnistaminen S TIL 1200:n avulla, co g A) Kuvio 4 viisi peptidiä, jotka olivat peräisin O) 35 gpl00:n 148 - 166-alueelta ja vaihtelivat 8-meeristä 11- 24 meeriin, testattiin TIL 1200:n avulla tunnistetuksi tulemisen suhteen. Spesifinen lyysi osoitettiin käyttäen efek-torin ja kohteen suhdetta 30:1.

B) Kuviossa 4A identifioitujen gplOO-peptidien tit-5 raaminen TIL 1200:n avulla tunnistetuksi tulemisen suhteen (E/T-suhde 30:1).

Kuvio 5 Gpl00:n ja virusepitooppien sitoutuminen HLA-A2.1:teen.

Esimerkki 1 10 Gpl00:n molekyylinen karakterisointi

Materiaali ja menetelmät Solut ja monoklonaaliset vasta-aineet

Melanoomasolulinjat Mel-2a, M14, MEVIO, BLM (Vennegoor et ai., 1988; van Muijen et ai., 1991; Bean et ai., 1975;; 15 Katano et ai., 1984) ja silmän verkkokalvon melanoomasolu-linja Mel 202 (Ksander et ai., 1991) on kuvattu aikaisemmin. Noraalien ihmisen melanosyyttien eristäminen rinnasta tai esinahasta suoritettiin Eisingerin ja Markon (1982) menetelmän avulla käyttäen julkaisun (Smit et ai., 1993) 20 mukaisia modifiointeja.

Monoklonaaliset vasta-aineet NKI-beteb ja HMB-50 on kuvattu aikaisemmin (Vennegoor et ai., 1988; Vogel ja Esc-lamado, 1988). Monoklonaalinen vasta-aine HMB-45 hankittiin toiminimeltä Enzo Biochem.

25 DNA-rakennelmat ja transfektiot 2,2 kiloemäksen Eco Rl:n avulla saatu fragmentti, o joka sisälsi gpl00-cDNA:n, tehtiin tasapäiseksii täyttä- g mällä päät käyttäen Klenow-DNA-polymeraasia ja kloonattiin eli sitten kummankin suuntaisena (pSVLgpl00+) ja pSVLgplOO-) 4 30 eukaryootti-ilmentämisvektorin pSVL (Pharmacia) Sma I - χ kohtaan. pSVL sisältää SV40:n myöhäisen promootorin ja

CC

polyadenylaatiokohdan samoin kuin myös SV40-replikaationa- (§ loituskohdan, tehden mahdolliseksi hyvin suuren kopiomää- co g rän C0S-7-soluissa tapahtuvan ohimenevän ilmentymisen ai- 05 35 kana.

25 3'-typistetyn gplOO-transkriptioyksikön pSVLgplOO+ (@BS) kokoonpanemista varten poistinune sekvenssin gplOO-cDNA:n 3'-osassa olevan Bgl II-kohdan ja vektorin monen restriktioentsyymin tunnistuskohdassa olevan Sac I -kohdan 5 väliltä. Tulokseksi saatu rakennelma koodaa typistetyn gplOO-proteiinin, jossa gplOO:n karboksiterminaaliset 133 aminohappoa on korvattu vektorisekvenssien koodaamilla 4 aminohapolla (Arg-Ile-Gln-Thr).

Rakennelmien ohimenevä ilmentäminen COS 7 -soluissa 10 suoritettiin käyttäen 40 pg/ml lipofektiinireagenssia, joka oli peräisin BRL:ltä (Feigner et ai., 1987), ja 7,5 pg DNA:ta kuten on kuvattu aikaisemmin (Loenen et ai., 1991).

Immunofluoresenssi 15 Transfektoituja COS 7 -soluja valmistettiin immuno- fluoresenssia varten 48 tuntia lipofektiini/DNA-seoksen lisäämisen jälkeen kuten on kuvattu aikaisemmin (Vennegoor et ai., 1988). Sen jälkeen kun oli inkuboitu primaarisen vasta-aineen kanssa 45 minuutin ajan, solut pestiin ja 20 niitä inkubotiin fluoreseiini-isotiosyanaatilla (FITC) merkityn vuohen F(ab)'2-antihiiri-IgG:n (Nordic) kanssa 30 minuutin ajan. Preparaatit tutkittiin käyttäen konfokaa-lista laserskannausmikroskooppia aallonpituudella 488 nm (Biorad MRC 600).

25 Aineenvaihdunnallinen merkitseminen, immunosaostuk- sia ja V8-proteaasikartoitus o Immunosaostuskokeet suoritettiin aineenvaihdun- ^ nallisesti merkityillä (L-[35S]-metioniini/kysteiini; i £! Amersham) soluilla kuten Vennegoor et ai. (1988) ovat ku- i 30 vanneet käyttäen monoklonaalista vasta-ainetta NKI-beteb

x tai HMB-50 kovalenttisesti liitettynä proteiini A-CL 4B

cc “ sepharose -helmiin (Pharmacia). Joissakin kokeissa lisät- S tiin tunikamysiiniä (75 pg/ml, Calbiochem) esimerkitsemis-

(D

§ vaiheen aikana ja se jäi jäljelle aineenvaihdunnallisen O) 35 merkitsemisreaktion ajaksi (12,5 minuuttia). Immunosaostu- 26 mat analysoitiin pelkistävissä olosuhteissa (5 % β-merkap-toetanoli SDS-näytepuskuriliuoksessa) SDS-PAGE:n avulla käyttäen 5 - 17,5 % polyakryyliamidigradienttigeelejä.

Proteiinien suhteellinen molekyylipaino määritettiin käyt-5 täen elektroforeesissa samanaikaisesti esivärjättyjä mole-kyylipainomerkkiaineita (BRL). Geelejä käsiteltiin 1 M natriumsalisylaatilla (pH 5,4) ennen autoradiografiaa (Kodak XAR).

V8-proteaasikartoitus suoritettiin käyttäen Clevel-10 andin et ai. (1977) kuvaamaa menetelmää proteiinien pilkkomiseksi geeliviipaleissa. Lyhyesti kuvattuna geelivii-paleita jotka sisälsivät 100 kilodaltonin proteiineja, pantiin toisen SDS-geelin (10 %) kuoppiin ja päällystettiin Staphylococcus aureus V8-proteaasilla (2,5 pg/näyte, 15 Miles laboratories). Elektroforeesin jälkeen geelejä käsiteltiin kuten yllä on kuvattu.

Osan gpl00/Pmell7-geenistä molekyylikloonaus.

Osaa gplOO/Pmell7-geenistä monistettiin PCR:n avulla (Taq-DNA-polymeraasi oli toiminimeltä Gibco) käyttäen 20 ihmisen genomi-DNA:ta, joka oli eristetty periferisen veren imusoluista (PBL), käyttäen seuraavia alukkeita: 1497/1516: 5'-TATTGAAAGTGCCGAGATCC-3' ja 1839/1857: 5'- TGCAAGGACCACAGCCATC-3' kuten on kuvattu aikaisemmin (Adema ja Baas, 1991). PCR-tuotteita monistettiin sen jälkeen 25 käyttäen sisäkkäistä alukeparia, jotka alukkeet sisälsivät lisäksi Eco Rl -kohdan (5'-TATCTAGAATTCTGCACCAGATACTGAAG-o 3' ja 5'-TATCTAGAATTCTGCAAGATGCCCACGATCAG-3'). Näissä ^ alukkeissa olevia alleviivattuja Eco Rl -kohtia käytettiin CNJ PCR-tuotteen kloonaamiseen pUC 18:n Eco Rl -kohtaan.

30 RNA:n eristäminen ja analyysi x Kokonais-RNA eristettiin käyttäen guanidiinitiosya- cn naattimenetelmää ja sentrifugointia cesiumkloridikerroksen S läpi (Chirgwin et ai., 1979). cDNA valmistettiin käyttäen

CD

g Geneamp RNA PCR -tarvikkeita (Perkin Elmer Cetus) valmis- 05 35 tajän osoittamalla tavalla. cDNA:jen PCR-analyysiä suori- 27 tettiin 35 kierroksen verran 3 mM MgCl2:n läsnä ollessa käyttäen alukkeita 1497/1516 ja 1839/1857 (katso yllä) kuten on kuvattu aikaisemmin (Adema ja Baas, 1991). Reaktiotuotteet fraktioitiin koon perusteella agaroosigeelis-5 sä, siirrettiin nailonkalvolle (Hybond-N, Amersham) ja hybridisoitiin [32P]:lla merkittyihin oligonukleotidikoet-timiin kuten on kuvattu aikaisemmin (Adema ja Baas, 1991). Koettimina käytettiin joko gplOO-spesifistä eksoni/eksoni-liitoskohtaoligonukleotidiä (5'-CTTCTTGACCAGGCATGATA-3') 10 tai Pmell7-spesifistä oligonukleotidiä (5'TGTGAGAAGAATCCC-AGGCA-33'), joka vastaa 20:tä Pmell7-cDNA:ssa olevista 21 lisänukleotidistä. Jokaiseen hybrdisaatiokokeeseen sisällytettiin kontrolliksi täplä-blot, joka sisälsi Pmell7-eksoni/eksoniliitoskohdan käsittävvän oligonukleotidin 15 (5'-GCTTATCATGCCTGTGCCTGGATTCTTCTCACAGGT-3').

Nukleotidisekvenssianalyysi

GplOO-cDNA ja genomi-DNA-klooneja sekvenssoitiin dideoksinukleotidisekvenssointimenetelmän avulla (Sanger et ai., 1977) käyttäen T7-DNA-polymeraasia (Pharmacia). 20 Kummankin säikeen sekvenssi määritettiin kussakin tapauksessa. Koska genomi-DNA-kloonit saatiin PCR:n jälkeen, määritettiin neljän itsenäisen kloonin sekvenssi. DNA-sek-evssin analyysi suoritettiin käyttäen ryhmän the University of Wisconsin Genetics Computing Group sekvenssiana-25 lyysiohjelmia (Devereux et ai., 1984).

Tulokset o Gpl00-cDNA:n ilmentyminen vailla pigmenttiä olevis- ® sa C0S-7-soluissa johtaa immunoreaktiivisuuteen monoklo- naalisten vasta-aineiden NKI-beteb, HMB-50 ja HMB-45 kans- ^ 30 sa.

x Gpl00-cDNA:n ilmentyminen gplOO-negatiivisissa BLM- cc “· melanoomasoluissa johtaa immunoreaktiivisuuteen melano- S syyttilinjalle spesifisten monoklonaalisten vasta-aineiden co o NKI-beteb, HMB-50 ja HMB-45 kanssa. Tarkoituksessa määrit- 05 35 tää, johtaako gpl00-cl-cDNA:n ilmentyminen ei-melanosyyt- 28 tisoluissa myös immunoreaktiivisuuteen näiden monoklonaa-listen vasta-aineiden kanssa, suoritimme ohimenevän ilmentämisen kokeita C0S-7-soluilla (apinan munuaisen fibro-blasteja) käyttäen rakennelmia, jotka sisälsivät gplOO-5 cDNAtn koodaus- ja ei-koodaussuuntaisena. Ainoastaan COS-7-solut, jotka on transfektoitu cDNA:n koodaussuuntaisena sisältävällä rakennelmalla (COS-7/pSVLgplOO+), reagoivat kaikkien kolmen monoklonaalisen vasta-aineen kanssa. Nämä tulokset osoittavat, että immunoreaktiivisuus monoklonaa-10 listen vasta-aineiden NKI-beteb, HMB-50 ja HMB-45 kanssa gplOO-cDNA:n ilmentämisen jälkeen ei rajoitu melanosyytti-soluihin. Lisäksi nämä tiedot osoittavat, että COS-ilmen-tämisjärjestelmää voidaan käyttää gpl00-cDNA:n koodaamien proteiinien biokemialliseen lisäkarakterisoinitiin.

15 GplOO-cDNA:n koodaamien proteiinien analyysi

GplOO-cDNA:n koodaamien proteiinien karakterisointi -seksi soluja C0S-7/pSVLgpl00+ merkittiin aineenvaihdunnallisesta ja niille suoritettiin immunosaostus käyttäen mo-noklonaalista vasta-ainetta NKI-beteb tai HMB-50. Monoklo-20 naaliset vasta-aineet NKI-beteb ja HMB-50 immunosaostavat spesifisesti noin 100 kilodaltonin (95 - 110 kd) proteiineja solujen COS-7/pSVLgplOO+ uutteista. Nämä proteiinit ovat molekyylipainoltaan samanlaisia (katso myös jäljempää) kuin ne, jotka on immunosaostettu sellaisten aineen-25 vaihdunnallisesti merkittyjen MEWO-solujen uutteista, jotka ilmentävät antigeenejä endogeenisesti (Vennegoor et 0 ai., 1988). Aikaisempien selostusten (Vennegoor et ai., o 1988; Vogel ja Esclamado, 1988) mukaisesti kummatkin mononi klonaaliset vasta-aineet myös tunnistavat 10 kilodaltonin 4- 30 proteiinin MEWO-melanoomasolujen uutteista. Saman kokoinen proteiini reagoi monoklonaalisen vasta-aineen NKI-beteb £ kanssa soluilla COS-7/pSVLgplOO+, ja se voidaan todeta g monoklonaalisella vasta-aineella HMB-50 pitkän alttiina

CD

o olon jälkeen (ei ole esitetty). Mainittakoon, että 10 ki- 05 35 lodaltonin proteiinin määrä vaihteli huomattavasti eri 29 kokeissa. Mitään spesifisiä proteiineja ei immunosaostu kummallakaan monoklonaalisista vasta-aineista cDNA:n ei-koodaussuuntaisena sisältävällä rakennelmalla transfektoi-duista C0S-7-soluista valmistetuista uutteista.

5 Noin 100 kilodaltonin glykoproteiineja, jotka rea goivat monoklonaalisten vasta-aineiden NKI-beteb ja HMB-50 kanssa, on myös löydetty melanoomasolujen viljelyaineesta (Vennegoor et ai., 1988; Vogel ja Esclamado, 1988). Ai-neenvaihdunnallisesti merkittyjen COS-7/pSVLgpl00+ ja 10 MEW0-solujen viljelyaineen vertailu paljastaa, että kum matkin monoklonaaliset vasta-aineet tunnistavat myös noin 100 kilodaltonin proteiineja (katso myös jäljempää) näiden solujen viljelyaineessa. Mitään 10 kilodaltonin proteiineja ei immunosaostu näillä monoklonaalisilla vasta-aineilla 15 solujen COS-7/pSVLgplOO+ viljelyaineesta kuten on osoitet tu melanoomasolujen tapauksessa. Nämä tiedot osoittavat, että kuten melanoomasolujen tapauksessa erittyvät monoklonaalisten vasta-aineiden NKI-beteb ja HMB-50 tunnistamat noin 100 kilodaltonin proteiinit soluilla COS- 20 7/pSVLgpl00+.

Sen mahdollisuuden poissulkemiseksi, että monoklonaalisten vasta-aineiden avulla todetut proteiinit ovat peräisin endogeenisistä geeneistä, jotka ovat indusoituneet gplOO-cDNA;11a transfektoinnin jälkeen, suoritimme 25 immunosaostuskokeita C0S-7-soluilla, jotka ilmensivät 3'- typistettyä gplOO-transkriptioyksikköä (katso yksityiskoh-o dat kappaleesta Materiaali ja menetelmät). Noin 85 kilo- ^ daltonin proteiineja immunosaostuu kummankin monoklonaali- oj sen vasta-aineen avulla C0S-7-soluilta, jotka ilmentävät <4- 30 tätä rakennelmaa, mikä sopii yhteen 129 aminohapon delee- tion kanssa. Tämä havainto tarjoaa suoran todisteen siitä, cc että monoklonaalisten vasta-aineiden NKI-beteb ja HMB-50 £2 soluilta COS-7/pSVLgplOO+ tunnistaman 100 kilodaltonin <o o proteiinin koodaa gplOO-cDNA.

CD

30

Gpl00-cDNA:n koodaama 100 kilodaltonin proteiini on identtinen gpl00:n kanssa

Noin 100 kilodaltonin proteiineilla, jotka on identifioitu monoklonaalisten vasta-aineiden NKI-beteb ja HMB-5 50 avulla soluilla COS-7/pSVLgplOO+ ja toisaalta MEW0-so- luilla, on hiukan erilainen liikkumisnopeus analysoitaessa SDS-PAGE:n avulla. Koska näiden monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa reagoivien proteiinien on osoitettu olevan glykosyloituja melanoomasoluilla (Vennegoor et ai., 1988; 10 Vogel ja Esclamado, 1988), nämä erot voisivat johtua muuttuneesta glykosyloitumisesta, mikä ilmiö havaitaan usein COS-ilmentämisjärjestelmässä. Tämän varmistamiseksi käytettiin monoklonaalista vasta-ainetta NKI-beteb sellaisten proteiinien immunosaostamiseen, jotka olivat peräisin gly-15 kosyloinnin inhibiittorin tunikamysiinin läsnä ollessa viljellyistä MEWO-soluista ja soluista C0S-7/pSVLgpl00+. Sekä COS-7/pSVLgplOO+ että MEW0-soluilla noin 100 kilodaltonin proteiinien koko on pienentynyt kahdeksi proteiini-vyöhykkeksi, jotka ovat noin 90 kd ja 85 kd, mikä vahvis-20 taa sen, että havaittu ero likkumisnopeudessa johtuu muuttuneesta glykosyloitumisesta.

Lisätodisteen aikaansaamiseksi siitä, että monoklo-naalisen vasta-aineen NKI-beteb soluilta COS-7/pSVLgplOO+ ja MEWO-soluilta tunnistamat proteiinit ovat identtiset, 25 suoritimme V8-proteaasikartoituskokeen. Samat proteiini- fragmentit saadaan soluilta COS-7/pSVLgplOO+ tai MEWO-so-0 luilta eristetyn tärkeimmän 100 kilodaltonin proteiinin o V8:lla pilkkomisen jälkeen. Päättelemme näiden tulosten c\j perusteella, että gpl00-cDNA koodaa melanosyyttilinjalle ^ 30 spesifisen glykoproteiinin gplOO, jonka monoklonaaliset vasta-aineet NKI-beteb ja HMB-50 tunnistavat melanoomaso-£ luilta.

LO

CD

<o o

LO

(j> 31

GplOO on tyyppiä I oleva kalvon läpi ulottuva proteiini, joka on erittäin homologinen Pmell7:n kanssa Määritettiin gplOO-cDNA:n nukleotidisekvenssi. Se sisältää 2115 emäsparia ja päättyy 15 nukleotidin poly(A)-5 alueeseen, jota edeltää konsensuspoyadenylaatiosekvenssi AATAAA (Proudfoot ja Brownlee, 1976). GplOO-cDNA:ssa on lläsnä avoin lukuvaiheistus (ORF), joka ulottuu nukleotidista 22 nukleotidiin 2 007. Tämä ORF alkaa ATG-kodonilla, joka on asianmukaisen sekvenssin yhteydessä translaation 10 aloittamista varten (Kozak, 1987), ja koodaa 661 aminohapon proteiinin (SEQ ID NO:l). 20 aminoterminaalista aminohappoa täyttävät kaikki kriteerit signaalisekvenssejä varten mukaan lukien mahdollinen katkaisukohta asemassa 20 olevan ALA:n jälkeen (von Heyne, 1986), mikä viittaa sii-15 hen, että valmis gplOO sisältää 641 aminohappoa (noin 70 kd). Hydrofobisuus-plot-analyysin (Kyte ja Doolittle, 1982) perusteella on yksi ainoa kalvon läpi ulottuva do-meeni, jota reunustavat varaukselliset jäännökset, läsnä gpl00:n karboksiterminaalisessa osassa (aminohapot 591 -20 611). Otaksuttu soluliman domeeni on 45 aminohapon pitui nen. Läsnä on viisi oletettua N-sidosglykosylaatiokohtaa, mikä vastaa käsitystä, että gplOO on glykoproteiini. Lisäksi on läsnä runsaasti histidiiniä sisältävä doeeni (aminohapot 182 - 313), runsaasti treoniinia sisältävä 25 domeeni (aminohapot 309 - 427), joka sisältää toistuvia aminohapposekvenssejä, ja runsaasti kysteiiniä sisältävä o domeeni (aminohapot 475 - 566).

^ Tietokantahaku (Pearson ja Lipman, 1988; Altschul cij et ai., 1990) paljasti, että gplOO on melkein identtinen •sj· 30 Pmel77:n, toisen melanosyyteille ominaisen proteiinin x (Kwon et ai., 1991), kanssa. GplOO:n ja Pmell7:n väliset cc aminohappoerot käsittävät korvautumiset asemissa 274 (T- £ C/PRO-LEU) ja 597 (C-G/ARG-PRO) ja gplOO:ssa asemassa 587 co g puuttuvan 7 aminohapon j akson (katso myös kuvio 2). Yhden

CD

35 ainoan nukleotidin ero asemassa 782 (C-T) ei johda amino- 32 hapon korvautumiseen. GplOO on myös 80 %-sesti homologinen sellaisen oletetun proteiinin kanssa, joka on johdettu osoittaisesta cDNA-kloonista (RPE-1), joka on eristetty naudan verkkokalvon cDNA-kirjastosta (Kim ja Wistow, 5 1992), ja 42 %-sesti homologinen kananpojan melanosomaali- sen matriisin proteiinin MMP115 (Mochii et ai., 1991) kanssa.

GplOO:n ja Pmell7:n koodaa yksi geeni Huomattavin ero gplOO- ja Pmell7-cDNA:jen välillä 10 on lukuvaiheistuksessa oleva 21 emäsparin deleetio gplOO-cDNA:ssa. Yksi mahdollinen selitys tälle eroavuudelle on kahden läheisesti toisiaan muistuttavan geenin olemassaolo. Koska kummassakin cDNArssa on identtinen nukleotidi-sekvenssi niiden 3'- vaille translaatiota jäävällä alueel-15 la, ei tämä selitys kuitenkaan ole todennäköinen. Toinen mahdollisuus on, että cDNA:t vastaavat transkriptejä, jotka ovat syntyneet yhden ainoan primaarisen transkriptin vaihtoehtoisen muokkauksen avulla. Tämän olettamuksen testaamiseksi käytimme PCR:ta sen genomi-DNA:n analysoimisek-20 si, joka vastasi oletettua vaihtoehtoista muokkausliitos-kohtaa ympäröivää gplOO-geenin osaa. Tämän genomi-DNA:n nukleotidisekvenssin vertaaminen gplOO-cl-cDNA:n sekvenssin kanssa paljasti intronin (102 emäsparia) läsnäolon juuri Pmell7-cDNA:ssa olevan 21 emäsparin insertin kohdal-25 la. Eksoni/introniraja sopivat hyvin konsensus-5'-donori-ja -3'-akseptoriliitoskohtasekvenssien (Padgett et ai., o 1986) kanssa. Genomi-DNA:ssa sekvenssi, joka käsittää li- £3 sänä olevat 21 emäsparia Pmell7-cDNA:ssa, sijaitsee välit- oj tömästi vastavirtaan 3'-katkaisukohdasta, jota käytetään 30 gpl00-RNA:n aikaansaamiseksi, ja sitä edeltää vaihtoehtoi-nen 3'-akseptoriliitoskohta (kuvio 1). Sen sijaan että £ gplOO:lie ominainen 3'-akseptoriliitoskohta sopii konsen- sussekvenssin kanssa, Pmell7:lle ominainen 3'-akseptori- to o liitoskohta näyttää olevan optimaalista huonompi, koska ^ 35 siitä puuttuu runsaasti pyrimidiiniä sisältävä alue (kuvio 33 1). Optimaalista huonompia RNA:n muokkauskohtia on läsnä monissa vaihtoehtoisesti muokatuissa lähetti-RNA:n edeltäjissä, ja niiden on esitetty toimivan vaihtoehtoisen RNA:n muokkauksen säätelyssä (aiheesta on esittänyt katsauksen 5 Green, 1991). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että gplOO-ja Pmell7-cDNA:ja vastaavat transkriptit syntyvät yhden ainoan primaaritranskriptin vaihtoehtoisen muokkauksen avulla ja ovat siten peräisin yhdestä ainoasta geenistä.

GplOO- ja Pmell7-RNA: jen ilmentäminen melanosyytti-10 linjan soluissa

Havainto, että gplOO- ja Pmell7-RNA syntyvät yhden ainoan primaaritranskriptin vaihtoehtoisen muokkauksen avulla, herättää kysymyksen, tapahtuuko tämä kehitykseen liittyvän säätelyn avulla. 2,5 kiloeäksen RNA-laji on tär-15 kein RNA-tuote, jonka gplOO-cDNA osoittaa Northern blot -analyyseissä, jotka sisältävät melanosyyttisoluista eristettyä RNA:ta. Samat tulokset ovat saaneet Kwon et ai. (1987) käyttäen Pmell7-l-cDNA:ta koettimena. Kuitenkaan kumpikaan näistä koettimista ei tee eroa gplOO- ja Pmell7-20 RNA:n välillä. GplOO- ja Pmell7-RNA:n ilmentymisen melano-syyttilinjan soluissa tutkimiseksi suoritimme käänteisko-pioija/polymeraasiketjureaktio (RT/PCR) -analyysin noudattaen Southern blot -menetelmää ja hybridisoinnin joko gplOO-spesifiseen eksoni/eksoniliitoskohta- tai Pmell7-25 spesifiseen oligonukleotidikoettimeen (katso Materiaali ja menetelmät). GplOO- ja Pmell7- katkaisumuokatut tuotteet 0 todetaan kummatkin 3:ssa 4:stä ihomelanoomasolusta, silmän £3 keskikalvon melanoomasoluissa samoin kuin myös vastasynty- cvj neen ja täysikasvuisen melanosyyteissä. Tuotteita ei tode- 4 30 ta kummallakaan koettimella gplOO-negatiivisissa BLM-mela- 1 noomasoluissa. Nämä tulokset osoittavat, että kaikissa cc tutkituissa melanosyyttisoluissa gplOO- ja Pmell7-RNA il- co mentyvät samanaikaisesti, co o m 05 34

Esimerkki 2

GplOO:n tunnistaminen TIL:en avulla

Materiaali ja menetelmät

Solujen viljely 5 TILtejä aikaansaatiin kasvattamalla metastaattisten melanoomien yksisolususpensioita määrän 1 000 U/ml IL-2:ta (Cetus Corp., Emeryville, CA) kanssa, ja niitä kasvatettiin kuten on kuvattu aikaisemmin (Kawakami, 1992). Mela-noomasolulinjat Mel 397 ja Mel 624 saatiin ja niitä kasva-10 tettiin kuten on selostettu aikaisemmin (Kawakami, 1992). HLA-A2. l+-melanoomasolulinjoja MeWo (Bean, 1975) ja BLM (Katano, 1984) ja hiiren P815-transfektantteja kasvatettiin DMEM-elatusaineessa (Gibco, Paisley, Skotlanti, UK), joka sisälsi lisäksi 7,5 % lämmöllä inaktivoitua FCS:a 15 (Gibco). JY:tä, K562:ta ja hiiren EL4-transfektantteja viljeltiin Iscoves-eelatusaineessa (Gibco), joka sisälsi lisäksi 7,5 % FCS:a. Hiiren soluja kasvatettiin 5·105 M β-ME:n läsnä ollessa, ja kaikki elatusaineet sisälsivät antibiootteja. Normaalien melanosyyttien eristäminen esina-20 hasta suoritettiin Eisingerin ja Markon (1982) menetelmän avulla käyttäen aikaisemmin kuvatun mukaisia modifiointeja (Smit, 1989). Siirrostuksista 2-3 saatuja melanosyyttejä käytettiin krominvapautusanalyyseissä.

DNA-rakennelmat ja transfektointi 25 Plasmidi pBJlgplOOneo saatiin kloonamalla lambda- gplOO-cDNA-kloonin Eco Rl -fragmentti koodaussuunnassa o monen liitoskohdan kappaleeseen pBJl-neo (Lin, 1990).

^ Plasmidin pBA2, joka sisälsi HLA-A2.1:n ja ihmisen β-2- cvi mikroglobuliinin koodaavan genomifragmentin, toimitti ys- ^ 30 tävällisesti E.J. Baas (The Netherlands Cancer Institute, T*“ x Division of Biochemistry, Amsterdam, Hollanti). Plasmidi

DC

“ pGK-hyg sisältää hygromysiinifosfotransferaasigeenin (Te ¢2 Riele, 1990). HLA-A2.1- ja ihmisen β-2-mikroglobuliinigee- co o nin soluihin lisäämiseksi EL4-solut transfektoitiin ^ 35 18 pg:lla pBA2:ta ja 2 pg:lla pGK-hyg-DNA:ta kalsiumfos- 35 faattiyhteissaostusmenetelmän mukaan (Graham, 1973) käyttäen kalsiumfosfaattitransfektiojärjestelmiä (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). 24 tuntia transfektoinnin jälkeen 500 pg/ml hygromysiini B:tä (Calbiochem-Novabiochem Corp., 5 La Jolla, CA) lisättiin elatusaineeseen stabiilien trans-fektanttien valitsemista varten. HLA-A2. l+-gpl00+-EL4-solu-ja saatiin transfektoimalla stabiileja HLA-A2.l+-EL4-kloo-neja 20 pgilla pBJl-gplOOneo-DNA:ta kalsiumfosfaattiyh-teissaostuksen avulla ja valikoitiin käyttäen 1 mg/ml 10 G418:aa. P815-A2.1- ja P815-A2.1/gplOO-soluja toimitti ystävällisesti P. Coulie (Ludwig Ins., Brysseli, Belgium). Monoklonaalinen vasta-aine ja virtaussytometria Melanoomien, transfektanttien ja normaalien melano-syyttien fenotyypin analyysi suoritettiin epäsuoran immu-15 nofluoresenssin avulla, jota seurasi virtaussytometria käyttäen FACScanR (Becton Dickinson & Co., Mountain View, CA). Puhdistettua anti-gplOO- monoklonaalista vasta-ainetta NKI-beteb (Vennegoor, 1988) ja anti-HLA-A2- monoklonaa-lisia vasta-aineita BB7.2 (viljelmän supernatantti; 20 Parham, 1981) ja MA2.1 (askiitin 1:500-laimennos; Parham, 1978) käytettiin primaarisina regensseina. FITC:n kanssa konjugoitua GAM-IgG-F(ab')2:ta (Zymed Laboratories, Inc., S. San Francisco, CA) käytettiin toisessa inkuboinnissa. Solunsisäisen gplOO-antigeenin osoittamiseksi soluja teh-25 tiin läpäiseviksi 0,01 % digitoniinissa ja ne jähmetettiin sen jälkeen 1 % paraformaldehydissä. o Krominvapautusanalyysi T“ £3 Krominvapautusanalyysit suoritettiin kuten on kurvi vattu aikaisemmin (Kawakami, 1992). Lyhyesti kuvattuna 106 4 30 kohdesolua inkuboitiin määrän 100 pCi Na51Cr04:a kanssa (Amersham Int., Bucks, UK) 1 tunnin ajan. Erilaisia määriä DC , efektorisoluja lisättiin sitten 2*10 :n kohdesolun joukkoon 5 U-pohjaisten mikrotiitterilevyjen kolmiin rinnakkaisiin co o kuoppiin (Costar, Badhoevedorp, Hollanti) 150 μ1:η lopul- 05 35 liseen tilavuuteen. Viiden tunnin inkuboinnin jälkeen osa 36 supernatantista otettiin talteen ja sen radioaktiivisuus-pitoisuus määritettiin. Kohdesoluja inkuboitiin 48 tunnin ajan määrän 50 U/ml ihmisen (Boehringer, Ingelheim, Saksa) tai hiiren rekombinantti-IFN-:ta kanssa (TNO, Rijswijk, 5 Hollanti) ennen käyttöä krominvapautusanalyyseissä.

TIL 1200

Etsiessämme gplOOrlle spesifisiä syotoksisia T-imu-soluja (CTL) keskitimme huomiomme HLA-A2.1:teen restrik-tioelementtinä, mikä johtui sen laajasta esiintymisestä 10 kaukasialaisilla ja sen oletetusta dominoivasta osuudesta CTL:n reaktiivisuudessa melanoomaa vastaan. HLA-A2.1*-TIL-linjaa TIL 1200 (Shilyansky, J. et ai., 1994) käytettiin tähän tutkimukseen. Tämä TIL-linja ilmentää TCR a/8:aa, CD3:a ja CD8:aa.

15 Tulokset TIL 1200:n aikaansaama HLA-A2.1:n avulla rajoitettu melanoomakasvainsolujen tappo korreloi gpl00:n ilmentymisen kanssa TIL 1 200:n sytolyyttistä aktiivisuutta analysoi-20 tiin käyttäen joukkoa ihmisen melanoomasolulimjoja. TIL 1 200 aiheutti tehokkaasti lyysin HLA-A2.1*- Mel 624 ja MeWO-melanoomakasvainsoluille, jotka kummatkin ilmentävät gpl00:aa, kun sen sijaan ei havaittu reaktiivisuutta HLA-A2. l"-gpl00+- Mel 397 -soluja kohtaan. On kiinnostavaa to-25 deta, että havaitsimme HLA-A2. l+-BLM-melanoomasolujen myös olevan resistenttejä TIL 1200:n aiheuttamalle lyysille. o Lisäksi HLA-A2.1+- EBV:llä tarnsformoiduille B-soluille w (JY), joilta myös puuttuu gpl00:n ilmentäminen, ja K562- w soluille ei aiheutunut lyysiä TIL 1 200:n avulla. Yhdessä s* 30 nämä tiedot osoittavat, että TIL 1 200 osoittaa HLA-A2.1:n x rajoittamaa tappamista, joka korreloi gpl00:n ilmentymisen tr kanssa.

TIL 1200 tunnistaa HLA-A2. l+-gplOO+-transfektantteja CD

g EL4-soluja, jotka oli yhteistransfektoitu HLA- O) 35 A2*l:n koodaavalla genomifragmentilla yhdessä hygromysii- 37 niresistenssin antavan plasmidin kanssa, valittiin ja analysoitiin virtaussytometrian avulla. HLA-A2.1:tä ilmentäviä soluja transfektoitiin sen jälkeen pBJl-gplOOneo:11a, joka koodaa gplOOin ja antaa resistenssin G418:lle. Valit-5 tiin stabiileja transfektantteja ja ne seulottiin gplOO:n ilmentämisen suhteen käyttäen monoklonaalista vasta-ainetta NKI/beteb. Yhteistyössä P. Coulien kanssa aikaansaatiin samanalainen transfektanttien joukko hiiren P815-soluilla (P815-A2.1 ja p815-A2.1/gplOO). Käyttäessämme näitä hiiren 10 transfektantteja kohdesoluina krominvapautusanalyysissä havaitsimme selvästi TIL 1200:n aikaansaaman gplOO-spesi-fisen lyysin. Hiiren EL4-A2.1/gplOO- ja P815-A2.1/gplOO-transfektanttien prosenttinen spesifinen lyysi (25 - 35 %, E/T 30:1) TIL 1200:n vaikutuksesta oli jonkin verran vä-15 häisempi verrattuna siihen, joka havaittiin HLA-A2.1*- gpl00+- ihmisen melanoomasoluilla (45 - 60 %, E/T 30:1). Tämän eroavuuden selitys voivat olla yhteensopimattomat apumolekyylit ihmisen TIL:en ja hiiren transfketanttien välillä. Tämän voittamiseksi lisästään gplOO-antigeenin 20 ihmisen HLA-A2. l+-gpl00"-BLM-melanoomasoluihin transfektoi- malla pBJl-gplOOneo. Stabiileja BLM-gpl00-klooneja testattiin krominvapautuanalyyseissä käyttäen TIL 1200:ta. BLM-gplOO-kloonit osoittautuivat yhtä herkiksi TIL 1 200:n aiheuttamalle lyysille kuin Mel 624 ja MeW0-solut, jotka 25 ilmentävät gplOO-antigeeniä endogeenisesti. TIL 1200:n gplOO-spesifisyys osoitettiin lisäksi gpl00:aa ilmentämät-o tornien G418-resistenttien BLM-solujen lyysin puuttumisen ^ avulla, sulkien pois mahdollisuus, että tunnistetaan neo- ^ mysiinistä peräisin olevia peptidejä.

30 Esimerkki 3 x TIL 1 200:n tunnistamien gplOO-epitooppien kartoi- cc “ tus käyttäen gplOO-deleetiomutantteja co Periaatteessa alalla käytetään yleensä kahta mene- co g telmää kasvaimen vastaisen CTL:n tunnistamien epitooppien O) 35 kartoittamiseen.

38 1. HLA:han sitoutumisen perusteella voidaan syntetisoida peptidejä, jotka kuuluvat kohdeproteiiniin. Näitä peptidejä voidaan sitten lisätä sopivan restriktioelemen-tin omaavien solujen pinnalle ja käyttää CTL:en kohteina.

5 2. Deleetiomutanttien aikaansaaminen ja näiden de- leetiomutanttien ilmentäminen esimerkiksi C0S-7-soluissa yhdessä sopivan restriktioelementin kanssa. Näitä trans-fektoituja soluja viljellään sitten yhdessä CTL:en kanssa ja mitataan kohdesolujen lyysiä tai CTL:en TNF-a/IFNgamma-10 tuotantoa. Transfektantit, joita CTL ei tunnista, eivät ilmennä peptidiä.

Kumpaakin menetelmää on sovellettu keksinnön mukaisten epitooppien etsinnässä.

TIL 1200:n välittämä peptideillä kuormattujen T2-15 solujen lyysi

Olemme syntetisoineet kemiallisesti gplOO-peptide-jä, jotka TIL 1 200 mahdollisesti tunnistaisi. Peptidit syntetisoitiin kiinteäfaasimenetelmällä automatisoidun monen peptidin syntetisoijän (Abimed AMS 422) avulla käyt-20 täen Fmoc-kemiaa (Nijman, 1993). Peptidien todellinen si toutuminen HLA-A2.1:teen todettiin hiljattain kuvatun pep-tidinsitoutumisanalyysin avulla käyttäen muokkauksen suhteen puutteellisia T2-soluja (Nijman, 1993). Tämä analyysi johti sellaisten gpl00:sta peräisin olevien peptidien 25 identifiointiin, jotka sitoutuvat voimakkaasti HLA- A2.1:teen. Tämän jälkeen T2-soluille, jotka oli kuormattu o HLA-A2.1:teen voimakkaasti sitoutuvilla peptideillä, ai- £3 heutettiin lyysi TIL 1 200:n avulla käyttäen yleistä kro- c\i minvapautusanalyysiä. Tällä tavalla on peptidi L-L-D-G-T- 4 30 A-T-L-R-L idenifioitu tämän menetelmän avulla.

T" x Esimerkki 4

CC

Deleetiokartoituksen avulla identifioitu gpl00:n 5 epitooppi

CD

g Gpl00-cDNA sijoitettiin ilmentämisvektoreihin 05 35 pBJlneo, pCMVneo (Baker et ai., 1990) ja pSVL. Sellaisen 39 gplOO-cDNA:n aikaansaamiseksi, josta puuttuivat koodaus-sekvenssit peptidiä 457 - 466 varten, suoritettiin PCR-reaktioita käyttäen seuraavia oligonukleotidiyhdistelmiä: 5 ' -CATGGAAGTGACTGTCTACC-3' /5 ' -CTGAGCGAATTCGGAACCTGTAATACT-5 TTCCG-3' ja 5'-CTGAGCGAATTCGTGAAGAGACAAGTCCCCC-3'/5'-TCA-CAGCATCATATGAGAGTAC-3' käyttäen täysipitkää gplOO-cDNA:ta templaattina. PCR-tuotteita pilkottiin Eco Rl:n avulla, yhdistettiin ligaation avulla ja käytettiin templaattina sisäkkäistä PCR:ta varten käyttäen seuraavia alukkeita: 10 5'-GCACAGGCCAACTGCAGA-3'/5'-TTCAGTATCTGGTGCAGAAC-3'.Tämän PCR:n tuotteen Kpn I-Cal I -fragmentti vaihdettiin sitten pCMVgplOOneo:ssa olevaan vastaavaan fragmenttiin, jolloin aikaansaatiin pCMVgpl00DEL454-481neo. GplOO-cDNA-mutantit DEL149-654 ja DEL454-654 saatiin poistamalla vastaavasti 15 1,7 kiloemäksen Hind III ja 0,8 kiloemäksen Eco Rl -frag mentti pBJlgpl00DEL454-481neo:sta. GplOO-cDNA-mutantit DEL100-654, DEL194-528 ja DEL167-508 saatiin poistamalla vastaavasti Bgl 1-Sac I, Bamh HI-Bgl II ja Apa I-Nsi I-fragmentti pSVLgplOO:sta.

20 BLM-soluja transfektoitiin 20 pg:lla pCMVgplOODE- L454-481neo-DNA:takalsiumfosfaattiyhteissaostusmenetelmän (Graham ja van der Eb, 1973) käyttäen kalsiumfosfaatti-transfektiojärjestelmiä (BRL, Gaithersburg, MD) ja valittiin käyttäen 1 mg/ml G418:aa (Gibco, Paisley, Skotlanti 25 UK).

C0S-7-soluja yhteistransfektoitiin 5 pg:lla o PBJ1HLA-A2.lneo:a ja 5 pg pBJl- tai pSVL-plasmideja, jotka g sisälsivät joko täysipitkän tai deleetioita omaavia gplOO- c\j cDNA:ita, käyttäen DEAE-dekstraani/klorokiini-menetelmää 4 30 (Seed ja Aruffo, 1987). 48 tunnin transfektoinnin jälkeen x C0S-7-soluja käytettiin stimulaattorisoluina IFN-gamma:n cc vapauttamisen kokeissa.

5 Vapauttamisanalyysejä

CD

g Krominvapautusanalyysit suoritettiin kuten esimer- 05 35 kissä 2.

40 lFN-:n vapautuksen analyysiä varten 101 TIL 1 200 -reagoijasolua inkuboitiin yhdessä 5*104:n ohimenevästi transfektoidun C0S-7-stimulaattorisolun kanssa 300 pl:ssa elatusainetta määrän 100 U/ml IL-2:ta läsnä ollessa tasa-5 pohjaisella 96-kuoppaisella mikrotiitterilevyllä. 24 tunnin inkuboinnin jälkeen 100 μΐ supernatanttia otettiin talteen ja seulottiin IFN-gamman:n läsnäolon suhteen käyttäen hIFN-gamma-IRNA- immunoradiometrisen analyysin tarvikkeita (megenix Diagnostics SA, Fleurus, Belgia).

10 Tulokset

Kuvio 3A esittää aikaansaadut gplOO-cDNA-deleetio-mutantit. Kuten kuviossa 3B on esitetty, TIL 1 200 eritti spesifisesti IFN-gammaa, kun oli stimuloitu sellaisten C0S-7-solujen avulla, jotka oli transfektoitu HLA-A2.1:llä 15 ja täysipitkällä gpl00-cDNA:11a. Jälleen havaittiin til 1200:n reaktiivisuus gpl00DEL454-481-mutanttia vastaan. Muista gplOO-deleetiomutanteista ainoastaan DEKL100-661-ja DEL149-661-rakennelmia ei tunnistettu, sulkien siten pois mahdollisuus, että TIL 1 200 oli reaktiokykyinen sel-20 laisen peptidin kanssa, joka sijaitsi N-terminaalisesti aminohappoasemasta 148 gplOO-proteiinissa. Myös gpl00-pro-teiinin C-terminaalinen alue voitiin sulkea pois, koska TIL 1 200 -reaktiivisuutta voitiin havaita käyttettäessä mutanttirakennelmaa DEL454-661, joka koodasi gpl00:n en-25 simmäiset 453 aminohappoa. Havainnosta, että tämäm N-ter-minaalisen alueen sisällä aminohappoon 166 asti koodaava o rakennelma kykeni stimuloimaan TIL 1200:ta (DEL167-508), ^ pääteltiin, että tunnistettu epitooppi sijaitsi gpl00-pro- cvj teiinin aminohappojen 148 - 166 välillä.

^ 30 HLÄ-A2.1:teen sitoutuminen x Useita malleja on kuvattu HLA-A2.1:teen sitoutuvia

DC

9-meerisiä tai 10-meerisiä peptidejä varten (Falk et ai., 1991; Hunt et ai., 1992; Ruppert et ai., 1993), jotka malto o lit oli päätelty luonnollisesti valmistettujen ja synteet- 35 tisten HLA-A2.1:teen sitoutuvien peptidien perusteella.

41

GplOO-proteiinin 148 - 166-alue seulottiin näiden mallien suhteen ja syntetisoitiin monia peptidejä, jotka sopivat jonkin verran leveämpään malliin ja sisälsivät treoniini-jäännöksen asemassa kaksi. Näitä peptidejä lisättiin HLA-5 A2. l+-T2-solujen pinnalle ja testattiin niiden kyky aiheuttaa TIL 1200:n välittämä kohdesolujen lyysi (kuvio 4A). Viisi testattua peptidiä kykenivät kaikki herkistämään T2-soluja TIL 1 200:n aiheuttamalle lyysille, kun niitä käytettiin pitoisuutena 10 pg/ml. Nämä kaikki peptidit sisäl-10 tävät 8-meerisen peptidin TWGQYWQV, joka vastaa gpl00:n aminohappoja 155 - 162. Kaikki peptidit titrattiin niiden suhteellisen kyvyn herkistää T2-kohdesoluja TIL 1 200: n aiheuttamelle lyysille arvioimiseksi. Kuvio 4B osoittaa, että TIL 1 200 kykenee tunnistamaan 9-meerisen peptidin 15 KTWGQYWQV, kun sitä käytetään pitoisuutena 3 ng/ml, kun taas muita peptidejä oli käytettävä suurempina pitoisuuksina.

Vertailtiin peptidejä KTWGQYWQV (gpl00:n aminohapot 155 - 162), LLDGTATLRL (gpl00:n aminohapot 457 - 466) ja 20 YLEPGPVTA (gpl00:n aminohapot 280 - 288, jotka Cox et ai., 1994, ovat identtifioineet) kolmen HLA-A2.1:ssä tarjotun virusepitoopin kanssa: influenssaviruksen matriisi- 58 -66-peptidi (Gotch et ai., 1987), HIV-polymeraasin 510 -518-peptidi (Tsomides et ai., 1991) ja HIV-gpl20:n 197 -25 205-peptidi (Dadaglio et ai., 1991). Yllä mainittujen epi-tooppien HLA-A2.1:teen sitoutumisen kyky aanalysoitiin o epäsuoran sitoutumisanalyysin avulla käyttäen muokkauksen suhteen puuttellista solulinjaa T2 (Nijman et ai., 1993). c\J Lyhyesti kuvattuna: T2-soluja inkuboitiin 12,5 pg:n epi- i 30 tooppeja kanssa. HLA-A2.1-stabiloituminen solun pinnalla x määritettiin virtaussytometrian avulla käyttäen monokonaa- tr lista vasta-ainetta BB7.2. Fluoresenssi-indeksi ilmaistaan S arvona kokeellinen keskimääräinen fluoresenssi jaettuna

CD

g keskimääräisellä fluoresenssilla, joka saadaan, kun T2- <35 42 soluja inkuboidaan HLA-A2.l:teen sitoutumattoman peptidin kanssa, jota on samanlaisena pitoisuutena.

Tätä analyysiä käytettäessä saadaan samanlainen HLA-A2.1-stabiloituminen gplOO:n 280 - 288-epitoopilla ja 5 testatuilla virusepitoopeilla. Kummatkin keksinnön mukaiset epitoopit (KTWGQYWQV ja LLDGTATLRL) sitoutuvat jonkin verran pienemmällä affiniteetilla HLA-A2.1:teen (kuvio 5). Tämän perusteella päätellään, että gplOO-epitoopit sitoutuvat HLA-A2.1:teen erilaisilla affiniteeteilla.

o δ C\l

CM

x cc

CL

m co co o m σ> 43

Kirj allisuusviitteet

Adema,G.J. and Baas,P.D. (1991) Biochem. Biophys. Res. Comm. 178. 985-992 Altschul.S.F., Gish,W., Miller,W., Myers,E.W. and Lipman,D.J. (1990) J. Mol. Biol. 215.403-410 Anichini, A et al. (1993), J. Exp. Med. 177, 989-998 Baker, S.J. (1990), Science 249, 912-915

Bean,M.A, Bloom,B.R_, Herberman,R.B., 01d,L.J., Oettgen,H.F., Klein,G. and Terry,W.D. (1975) Cancer Res. 35, 2902-2907 Brichard et al. (1993) J. Exp. Med. 178,489-495

Chirgwin,J.M., Przybyla,AE., MacDonald,R.J. and Rutter,W.J. (1979) Biochemistry 18, 5294-5299 CIeveland,D.W., Fischer,S.G., Kirschner,M.W. and Laemmli.U.K. (1977) J. Biol. Chem. 253. 1102-1106

Cox,A.L., Skipper,J., Chen,Y., Henderson,R.A., Darrow,T.L., Shabanowitz,J., Engelhard,Y.H., Hunt,D.F., Slingluff,C.A. (1994) Science 264, 716 Dadaglio.G., Leroux,A., Langlade-Demoyen,P., Bahraoui,E.M., Traincard,V., Fisher,R., Plata,F., (1991) J. Immunol. 147, 2302.

Devereux,J., Haeberli.P., and Smithies,O. (1984) Nucleic Acids Res. 12,387 Eisinger,M. and Marco,O. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 2018-2022 Espevik and Nissen-Meyer (1986) J.Immunol.Methods 95, 99 Esclamado,RM., Gown,A.M. and Vogel, A.M. (1986) Am. J. Surg. 152. 376-385 Falk,K. et al. (1991) Nature 351, 290

Feigner,P.L., Gadek,T.R., Holm,M., Roman,R, Chan,W., Wenz,M., Northrop,J.P., Ringold,G.M and Danielsen,M. (1987) Proc. Nad. Acad. Sci. USA 84, 7413-7417 Fisher, B. et al. (1989), J. Clin. Oncol. 2,250-261

Gotch,F., RothbardJ., Howland,K., Townsend,A., McMichael A., (1987) Nature 326. 881

Graham,F.L. and van der Eb,A.J.(1973), Virology 52, 456

Green,M.R (1991) Ann. Rev. Cell Biol. 7, 559-599

Haisma, H.J. et al, (1986) J. Nucl. med. 27. 1890

Hall, R et al. (1984) Nature 311, 379-387

Hnatowich, D.J. et al. (1983) J. Immunol. Meth. 65, 147-157

Hunt,D.F. et al. (1992) Science 255. 1261

Jones, P.T. et al. (1986) Nature 321, 522-525

Katano.M, Saxton,R.E., Cochran,A.J. and Irie,RF. (1984) J. Cancer Res. Clin. Oncol. 108, 197

Kim,R.Y. and Wistow.G.J. (1992) Exp. Eye Res. 55, 657-662 Köhler, G. and Milstein C., (1975) Nature 256; 495-497

Knuth, A. et al., (1992) Cancer Surveys 39-52

Kozak,M. (1987) Nucleic Acids Res. 15, 8125-8148 o Ksander.B.R., Rubsamen,P.E., 01sen,K.R, Cousins,S.W. and Streilein,J.W. (1991) Invesdgative g Ophtamology & Visual Science, 32, 3198-3208

Kwon,B.S., Halaban,R., Kim,G.S., UsackJL., Pomerantz,S. and Haq,A.K. (1987) Mol. Biol. Med. 4, c\l 339-355 ^ Kwon,B.S., Chintammaneni,C., Kozak,C.A., Copeland,N.G., Gilbert,D.J., Jenkins,N., Barton,D., ^ Francke,U., Kobayashi,Y. and Kim K.K. (1991) Proc. Nad. Acad. Sci. USA, 88 9228-9232

Kyte,J. and Doolitde,R.F. (1982) J. Mol. Biol. 157, 105-132 g Lenstra, J.A et al. (1990), Arch. Virol. 110, 1-24

Loenen,W.AM., de Vries,E., Gravestein,L.A., Hintzen,RQ., van Lier.RA.W. and Borst,J. (1991) Eur. J. Immunol. 22, 447 g MacPherson, (1973) Soft Agar Techniques, Tissue Culture Methods and Applicadons, Kruse and

Paterson, eds., Academic Press, 276

Maniads et al., (1982, 1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory'

Mochii,M., Agata,K. and Eguchi,G. (1991) Pigment Cell Res. 4, 41-47 Old, L„ Cancer Res. (1981) 41, 361-375 Nijman et al. (1993), Eur.J.Immunol. 23, 1215 44

Padgett,R.A., Grabowski.P.J., Konarska,M.M., Seiler,S. and Sliarp.P.A. (1986) Ann. Rev.

Biochem. 55, 119-1150

Pearson, W.R. and Lipman,D.J. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444-2448 Proudfoot,N.J. and Brownlee,G.G. (1976) Nature 263, 211-214

Rodriquez, R.L. and Denhardt, D.T. (1988), ed., Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Butterworths

Rosenberg, S.A. etal. (1986), Science 223.1318-1321 Ruppert,J. et al. (1993) Cell 74, 929 Ruskin, B. et al. (1984) Cell 38, 317-331

Sanger,F., Nicklen,S. and Coulson,A.R (1977) Proc. Natl Acad. Sci. USA 74, 5463-5467

Schwartz, R.H. (1992) Cell 71, 1065-1068

Seed,B and Aruffo.A.A. (1987) Proc. Nad. Acad. Sci. USA 84, 3365

Shilyansky, J. et al., Proc. Nad. Acad. Sci. USA 91, 2829-2833, 1994.

Smit,N., Le Poole,I., van den Wijngaard.R., Tigges,A., Westerhof.W. and Das,P. (1993)

Arch. Dermatol. Res. 285. 356-365 Topalian, S.L. et al. (1987), J. Immunol. Meth. 102. 127-141 Townsend, A.R.M. and Bodmer H., (1989), Ann. Rev. Immunol. 7, 601-624 Tsomides,T.J., Walker, B.D., Eisen, H.N. (1991) Proc. Nad. Acad. Sci. USA 88, 11276 van Muijen,G.N.P., Comelissen,L.M.H.A., Jansen,C.F.J., Figdor.C.G., Johnson,J.P., Bröcker.E. and Ruiter,D.J. (1991) Clin. Expl. Metast. 9, 259-272

Vennegoor.C., Hageman,Ph., van Nouhuijs,H., Rulter.D.J., Calafat,J., Ringens,P.J. and Rumke,Ph.

(1988) Am. J. Pathol. 130, 179-192 Vogel,A.M. and Esclamado,R.M. (1988) Cancer Res. 48, 1286-1294 von Heijne.G. (1986) Nucleic Acids Res. ]4, 4683-4690 o δ

C\J

CM

X

oc Q.

LO

CO

CO

o

LO

CD

45

SEQUENCE LISTING

(1) GENERAL INFORMATION: (i) APPLICANT: (A) NAME: Akzo N.V.

(B) STREET: Velperweg 76 (C) CITY: Arnhem (E) COUNTRY: The Netherlands

(F) POSTAL CODE (ZIP): 6824 BM

(G) TELEPHONE: 04120 - 66204 (H) TELEFAX: 04120 - 50592 (I) TELEX: 37503 akpha nl (ii) TITLE OF INVENTION: Melanoma associated antigenic polypeptide, epitopes thereof and vaccine against melanoma.

(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 19 (IV) COMPUTER READABLE FORM: (A) MEDIUM TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible

(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (EPO) (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 1: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 2115 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: double (D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA to mRNA

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(ill) ANTI-SENSE: NO o O (vi) ORIGINAL SOURCE: , (F) TISSUE TYPE: Melanoma ^ (G) CELL TYPE: Melanocyte (IX) FEATURE:

x (A) NAME/KEY: CDS

£ (B) LOCATION: 22..2005 m <g (ix) FEATURE: o (A) NAME/KEY: misc_signal S (B) LOCATION: 1..81 (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: misc_feature (B) LOCATION: 1792..1870 (D) OTHER INFORMATION: /function= "transmembrane region" 46 (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: misc_binding (B) LOCATION: 262..264 (D) OTHER INFORMATION: /bound_moiety= "carbohydrate" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: misc_binding (B) LOCATION: 337..339 (D) OTHER INFORMATION: /bound_xnoiety= "carbohydrate" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: xnisc_binding (B) LOCATION: 352..354 (D) OTHER INFORMATION: /bound_moiety= "carbohydrate" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: misc_binding (B) LOCATION: 982..984 (D) OTHER INFORMATION: /bound_moiety= "carbohydrate" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: misc_binding (B) LOCATION: 1723..1725 (D) OTHER INFORMATION: /bound_moiety= "carbohydrate" (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 1: CGCGGAATCC GGAAGAACAC A ATG GAT CTG GTG CTA AAA AGA TGC CTT CTT 51

Met Asp Leu Val Leu Lys Arg Cys Leu Leu 15 10 CAT TTG GCT GTG ATA GGT GCT TTG CTG GCT GTG GGG GCT ACA AAA GTA 99

His Leu Ala Val lie Gly Ala Leu Leu Ala Val Gly Ala Thr Lys Val 15 20 25 CCC AGA AAC CAG GAC TGG CTT GGT GTC TCA AGG CAA CTC AGA ACC AAA 147

Pro Arg Asn Gin Asp Trp Leu Gly Val Ser Arg Gin Leu Arg Thr Lys 30 35 40 o GCC TGG AAC AGG CAG CTG TAT CCA GAG TGG ACA GAA GCC CAG AGA CTT 195 o Ala Trp Asn Arg Gin Leu Tyr Pro Glu Trp Thr Glu Ala Gin Arg Leu , 45 50 55

CM

4 GAC TGC TGG AGA GGT GGT CAA GTG TCC CTC AAG GTC AGT AAT GAT GGG 243 >- Asp Cys Trp Arg Gly Gly Gin Val Ser Leu Lys Val Ser Asn Asp Gly X 60 65 70 cc

CL

^ CCT ACA CTG ATT GGT GCA AAT GCC TCC TTC TCT ATT GCC TTG AAC TTC 291 co Pro Thr Leu lie Gly Ala Asn Ala Ser Phe Ser lie Ala Leu Asn Phe O 75 80 85 90 in cn CCT GGA AGC CAA AAG GTA TTG CCA GAT GGG CAG GTT ATC TGG GTC AAC 339 Pro Gly Ser Gin Lys Val Leu Pro Asp Gly Gin Val lie Trp Val Asn 95 100 105 47 AAT ACC ATC ATC AAT GGG AGC CAG GTG TGG GGA GGA CAG CCA GTG TAT 387

Asn Thr Ile Ile Asn Gly Ser Gin Val Trp Gly Gly Gin Pro Val Tyr 0 115 120 CCC CAG GAA ACT GAC GAT GCC TGC ATC TTC CCT GAT GGT GGA CCT TGC 435

Pro Gin Glu Thr Asp Asp Ala Cys lie Phe Pro Asp Gly Gly Pro Cys 125 130 135 CCA TCT GGC TCT TGG TCT CAG AAG AGA AGC TTT GTT TAT GTC TGG AAG 483

Pro Ser Gly Ser Trp Ser Gin Lys Arg Ser Phe Val Tyr Val Trp Lys 140 145 150 ACC TGG GGC CAA TAC TGG CAA GTT CTA GGG GGC CCA GTG TCT GGG CTG 531

Thr Trp Gly Gin Tyr Trp Gin Val Leu Gly Gly Pro Val Ser Gly Leu 155 160 165 170 AGC ATT GGG ACA GGC AGG GCA ATG CTG GGC ACA CAC ACC ATG GAA GTG 579

Ser lie Gly Thr Gly Arg Ala Met Leu Gly Thr His Thr Met Glu Val 175 180 185 ACT GTC TAC CAT CGC CGG GGA TCC CGG AGC TAT GTG CCT CTT GCT CAT 627

Thr Val Tyr His Arg Arg Gly Ser Arg Ser Tyr Val Pro Leu Ala His 190 195 200 TCC AGC TCA GCC TTC ACC ATT ACT GAC CAG GTG CCT TTC TCC GTG AGC 675

Ser Ser Ser Ala Phe Thr lie Thr Asp Gin Val Pro Phe Ser Val Ser 205 210 215 GTG TCC CAG TTG CGG GCC TTG GAT GGA GGG AAC AAG CAC TTC CTG AGA 723

Val Ser Gin Leu Arg Ala Leu Asp Gly Gly Asn Lys His Phe Leu Arg 220 225 230 AAT CAG CCT CTG ACC TTT GCC CTC CAG CTC CAT GAC CCC AGT GGC TAT 771

Asn Gin Pro Leu Thr Phe Ala Leu Gin Leu His Asp Pro Ser Gly Tyr 235 240 245 250 CTG GCT GAA GCT GAC CTC TCC TAC ACC TGG GAC TTT GGA GAC AGT AGT 819

Leu Ala Glu Ala Asp Leu Ser Tyr Thr Trp Asp Phe Gly Asp Ser Ser 255 260 265 o 5 GGA ACC CTG ATC TCT CGG GCA CTT GTG GTC ACT CAT ACT TAC CTG GAG 867 Gly Thr Leu lie Ser Arg Ala Leu Val Val Thr His Thr Tyr Leu Glu w 270 275 280 ^ CCT GGC CCA GTC ACT GCC CAG GTG GTC CTG CAG GCT GCC ATT CCT CTC 915 x Pro Gly Pro Val Thr Ala Gin Val Val Leu Gin Ala Ala lie Pro Leu £ 285 290 295 S ACC TCC TGT GGC TCC TCC CCA GTT CCA GGC ACC ACA GAT GGG CAC AGG 963 o Thr Ser Cys Gly Ser Ser Pro Val Pro Gly Thr Thr Asp Gly His Arg 300 305 310 CCA ACT GCA GAG GCC CCT AAC ACC ACA GCT GGC CAA GTG CCT ACT ACA 1011

Pro Thr Ala Glu Ala Pro Asn Thr Thr Ala Gly Gin Val Pro Thr Thr 315 320 325 330 48 GAA GTT GTG GGT ACT ACA CCT GGT CAG GCG CCA ACT GCA GAG CCC TCT 1059

Glu Vai Vai Gly Thr Thr Pro Gly Gin Ala Pro Thr Ala Glu Pro Ser 335 340 345 GGA ACC ACA TCT GTG CAG GTG CCA ACC ACT GAA GTC ATA AGC ACT GCA 1107

Gly Thr Thr Ser Vai Gin Vai Pro Thr Thr Glu Vai Ile Ser Thr Ala 350 355 360 CCT GTG CAG ATG CCA ACT GCA GAG AGC ACA GGT ATG ACA CCT GAG AAG 1155

Pro Vai Gin Met Pro Thr Ala Glu Ser Thr Gly Met Thr Pro Glu Lys 365 370 375 GTG CCA GTT TCA GAG GTC ATG GGT ACC ACA CTG GCA GAG ATG TCA ACT 1203

Vai Pro Vai Ser Glu Vai Met Gly Thr Thr Leu Ala Glu Met Ser Thr 380 385 390 CCA GAG GCT ACA GGT ATG ACA CCT GCA G AG GTA TCA ATT GTG GTG CTT 1251

Pro Glu Ala Thr Gly Met Thr Pro Ala Glu Vai Ser Ile Vai Vai Leu 395 400 405 410 TCT GGA ACC ACA GCT GCA CAG GTA ACA ACT ACA GAG TGG GTG GAG ACC 1299

Ser Gly Thr Thr Ala Ala Gin Vai Thr Thr Thr Glu Trp Vai Glu Thr 415 420 425 ACA GCT AGA GAG CTA CCT ATC CCT GAG CCT GAA GGT CCA GAT GCC AGC 1347

Thr Ala Arg Glu Leu Pro Ile Pro Glu Pro Glu Gly Pro Asp Ala Ser 430 435 440 TCA ATC ATG TCT ACG GAA AGT ATT ACA GGT TCC CTG GGC CCC CTG CTG 1395

Ser Ile Met Ser Thr Glu Ser Ile Thr Gly Ser Leu Gly Pro Leu Leu 445 450 455 GAT GGT ACA GCC ACC TTA AGG CTG GTG AAG AGA CAA GTC CCC CTG GAT 1443

Asp Gly Thr Ala Thr Leu Arg Leu Vai Lys Arg Gin Vai Pro Leu Asp 460 465 470 TGT GTT CTG TAT CGA TAT GGT TCC TTT TCC GTC ACC CTG GAC ATT GTC 1491

Cys Vai Leu Tyr Arg Tyr Gly Ser Phe Ser Vai Thr Leu Asp Ile Vai 475 480 485 490 o δ CAG GGT ATT GAA AGT GCC GAG ATC CTG CAG GCT GTG CCG TCC GGT GAG 1539 ™ Gin Gly Ile Glu Ser Ala Glu Ile Leu Gin Ala Vai Pro Ser Gly Glu όι 495 500 505 T“ ί GGG GAT GCA TTT GAG CTG ACT GTG TCC TGC CAA GGC GGG CTG CCC AAG 1587 x Gly Asp Ala Phe Glu Leu Thr Vai Ser Cys Gin Gly Gly Leu Pro Lys £ 510 515 520 S GAA GCC TGC ATG GAG ATC TCA TCG CCA GGG TGC CAG CCC CCT GCC CAG 1635 g Glu Ala Cys Met Glu Ile Ser Ser Pro Gly Cys Gin Pro Pro Ala Gin £ 525 530 535 <J> CGG CTG TGC CAG CCT GTG CTA CCC AGC CCA GCC TGC CAG CTG GTT CTG 1683

Arg Leu Cys Gin Pro Vai Leu Pro Ser Pro Ala Cys Gin Leu Vai Leu 540 545 550 49 CAC CAG ΑΤΑ CTG AAG GGT GGC TCG GGG ACA TAC TGC CTC AAT GTG TCT 1731

His Gin lie Leu Lys Gly Gly Ser Gly Thr Tyr Cys Leu Asn Val Ser 555 560 565 570 CTG GCT GAT ACC AAC AGC CTG GCA GTG GTC AGC ACC CAG CTT ATC ATG 1779

Leu Ala Asp Thr Asn Ser Leu Ala Val Val Ser Thr Gin Leu He Met 575 580 585 CCT GGT CAA GAA GCA GGC CTT GGG CAG GTT CCG CTG ATC GTG GGC ATC 1827

Pro Gly Gin Glu Ala Gly Leu Gly Gin Val Pro Leu Ile Val Gly He 590 595 600 TTG CTG GTG TTG ATG GCT GTG GTC CTT GCA TCT CTG ATA TAT AGG CGC 1875

Leu Leu Val Leu Met Ala Val Val Leu Ala Ser Leu He Tyr Arg Arg 605 610 615 AGA CTT ATG AAG CAA GAC TTC TCC GTA CCC CAG TTG CCA CAT AGC AGC 1923

Arg Leu Met Lys Gin Asp Phe Ser Val Pro Gin Leu Pro His Ser Ser 620 625 630 AGT CAC TGG CTG CGT CTA CCC CGC ATC TTC TGC TCT TGT CCC ATT GGT 1971

Ser His Trp Leu Arg Leu Pro Arg He Phe Cys Ser Cys Pro He Gly 635 640 645 650 GAG AAT AGC CCC CTC CTC AGT GGG CAG CAG GTC T GAGTACTCTC 2015

Glu Asn Ser Pro Leu Leu Ser Gly Gin Gin Val 655 660 ATATGATGCT GTGATTTTCC TGGAGTTGAC AGAAACACCT ATATTTCCCC CAGTCTTCCC 207 TGGGAGACTA CTATTAACTG AAATAAATAC TCAGAGCCTG 2115 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 2: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 661 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear o O (ii) MOLECULE TYPE: protein £ (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 2: ^ Met Asp Leu Val Leu Lys Arg Cys Leu Leu His Leu Ala Val He. Gly x 1 5 10 15 cr

CL

Ala Leu Leu Ala Val Gly Ala Thr Lys Val Pro Arg Asn Gin Asp Trp £ 20 25 30

CD

O

g Leu Gly Val Ser Arg Gin Leu Arg Thr Lys Ala Trp Asn Arg Gin Leu 35 40 45

Tyr Pro Glu Trp Thr Glu Ala Gin Arg Leu Asp Cys Trp Arg Gly Gly 50 55 60 50

Gin Vai Ser Leu Lys Vai Ser Asn Asp Gly Pro Thr Leu Ile Gly Ala 65 70 75 80

Asn Ala Ser Phe Ser Ile Ala Leu Asn Phe Pro Gly Ser Gin Lys Vai 85 90 95

Leu Pro Asp Gly Gin Vai Ile Trp Vai Asn Asn Thr Ile Ile Asn Gly 100 105 110

Ser Gin Vai Trp Gly Gly Gin Pro Vai Tyr Pro Gin Glu Thr Asp Asp 115 120 125

Ala Cys Ile Phe Pro Asp Gly Gly Pro Cys Pro Ser Gly Ser Trp Ser 130 135 140

Gin Lys Arg Ser Phe Vai Tyr Vai Trp Lys Thr Trp Gly Gin Tyr Trp 145 150 155 160

Gin Vai Leu Gly Gly Pro Vai Ser Gly Leu Ser Ile Gly Thr Gly Arg 165 170 175

Ala Met Leu Gly Thr His Thr Met Glu Vai Thr Vai Tyr His Arg Arg 180 185 190

Gly Ser Arg Ser Tyr Vai Pro Leu Ala His Ser Ser Ser Ala Phe Thr 195 200 205

Ile Thr Asp Gin Vai Pro Phe Ser Vai Ser Vai Ser Gin Leu Arg Ala 210 215 220

Leu Asp Gly Gly Asn Lys His Phe Leu Arg Asn Gin Pro Leu Thr Phe 225 230 235 240

Ala Leu Gin Leu His Asp Pro Ser Gly Tyr Leu Ala Glu Ala Asp Leu 245 250 255

Ser Tyr Thr Trp Asp Phe Gly Asp Ser Ser Gly Thr Leu Ile Ser Arg 260 265 270 ? Ala Leu Vai Vai Thr His Thr Tyr Leu Glu Pro Gly Pro Vai Thr Ala 275 280 285 C\l -7 Gin Vai Vai Leu Gin Ala Ala Ile Pro Leu Thr Ser Cys Gly Ser Ser ^ 290 295 300 g Pro Vai Pro Gly Thr Thr Asp Gly His Arg Pro Thr Ala Glu Ala Pro 305 310 315 320 in <§ Asn Thr Thr Ala Gly Gin Vai Pro Thr Thr Glu Vai Vai Gly Thr Thr g 325 330 335 co

Pro Gly Gin Ala Pro Thr Ala Glu Pro Ser Gly Thr Thr Ser Vai Gin 340 345 350

Vai Pro Thr Thr Glu Vai Ile Ser Thr Ala Pro Vai Gin Met Pro Thr 355 360 365 51

Ala Glu Ser Thr Gly Met Thr Pro Glu Lys Vai Pro Vai Ser Glu Vai 370 375 380

Met Gly Thr Thr Leu Ala Glu Met Ser Thr Pro Glu Ala Thr Gly Met 385 390 395 400

Thr Pro Ala Glu Vai Ser Ile Vai Vai Leu Ser Gly Thr Thr Ala Ala 405 410 415

Gin Vai Thr Thr Thr Glu Trp Vai Glu Thr Thr Ala Arg Glu Leu Pro 420 425 430

Ile Pro Glu Pro Glu Gly Pro Asp Ala Ser Ser Ile Met Ser Thr Glu 435 440 445

Ser Ile Thr Gly Ser Leu Gly Pro Leu Leu Asp Gly Thr Ala Thr Leu 450 . 455 460

Arg Leu Vai Lys Arg Gin Vai Pro Leu Asp Cys Vai Leu Tyr Arg Tyr 465 470 475 480

Gly Ser Phe Ser Vai Thr Leu Asp Ile Vai Gin Gly Ile Glu Ser Ala 485 490 495

Glu Ile Leu Gin Ala Vai Pro Ser Gly Glu Gly Asp Ala Phe Glu Leu 500 505 510

Thr Vai Ser Cys Gin Gly Gly Leu Pro Lys Glu Ala Cys Met Glu Ile 515 520 525

Ser Ser Pro Gly Cys Gin Pro Pro Ala Gin Arg Leu Cys Gin Pro Vai 530 535 540

Leu Pro Ser Pro Ala Cys Gin Leu Vai Leu His Gin Ile Leu Lys Gly 545 550 555 560

Gly Ser Gly Thr Tyr Cys Leu Asn Vai Ser Leu Ala Asp Thr Asn Ser 565 570 575 o 5 Leu Ala Vai Vai Ser Thr Gin Leu Ile Met Pro Gly Gin Glu Ala Gly «M 580 585 590 dj ^ Leu Gly Gin Vai Pro Leu Ile Vai Gly Ile Leu Leu Vai Leu Met Ala ^ 595 600 605 | Vai Vai Leu Ala Ser Leu Ile Tyr Arg Arg Arg Leu Met Lys Gin Asp 610 615 620

to (O

g Phe Ser Vai Pro Gin Leu Pro His Ser Ser Ser His Trp Leu Arg Leu S 625 630 635 640 O)

Pro Arg Ile Phe Cys Ser Cys Pro Ile Gly Glu Asn Ser Pro Leu Leu 645 650 655

Ser Gly Gin Gin Vai 660 52 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 3: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 30 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: double (D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA to mRNA

(iii) HYPOTHETICAL: NO (iii) ANTI-SENSE: NO

(ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: CDS

(B) LOCATION: 1..30 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 3: CTG CTG GAT GGT ACA GCC ACC TTA AGG CTG 30

Leu Leu Asp Gly Thr Ala Thr Leu Arg Leu 15 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 4: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 10 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 4:

Leu Leu Asp Gly Thr Ala Thr Leu Arg Leu 15 10 ° (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 5: o ™ (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: ™ (A) LENGTH: 30 base pairs 4 (B) TYPE: nucleic acid ^ (C) STRANDEDNESS: double x (D) TOPOLOGY: linear Q_

^ (ii) MOLECULE TYPE: cDNA

CD

o (iii) HYPOTHETICAL: NO

O)

(iii) ANTI-SENSE: NO

(ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: CDS

(B) LOCATION: 1..30 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 5: 53 GTA TTG CCA GAT GGG CAG GTT ATC TGG GTC 30

Val Leu Pro Asp Gly Gin Vai Ile Trp Val 15 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 6: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 10 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 6:

Val Leu Pro Asp Gly Gin Val lie Trp Val 15 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 7: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 24 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: double (D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA to mRNA

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTI-SENSE: NO

(vi) ORIGINAL SOURCE: (F) TISSUE TYPE: Melanoma O (G) CELL TYPE: Melanocyte

° (IX) FEATURE: (A) NAME/KEY: CDS

c\i (B) LOCATION: 1. .24 ^ (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 7: tr ACC TGG GGC CAA TAC TGG CAA GTT 24 g Thr Trp Gly Gin Tyr Trp Gin Val cp 1 5 o

LO

CD

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 8: 54 (X) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 8 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 8:

Thr Trp Gly Gin Tyr Trp Gin Val 1 5 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 9: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 36 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: double (D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA to mRNA

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTI-SENSE: NO

(vi) ORIGINAL SOURCE: (F) TISSUE TYPE: Melanoma (G) CELL TYPE: Melanocyt (ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: CDS

(B) LOCATION:1..36 (XX) FEATURE: (A) NAME/KEY: protein_bind (B) LOCATION:1..33 ° (ix) FEATURE: O (A) NAME/KEY: protein_bind , (B) LOCATION:7..36

C\J

4 (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: protein_bind - (B) LOCATION:7..33

X

£ (XX) FEATURE: w (A) NAME/KEY: protein_bind <g (B) LOCATION: 10. .36 o

LO

O) (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 9: GTC TGG AAG ACC TGG GGC CAA TAC TGG CAA GTT CTA 36

Val Trp Lys Thr Trp Gly Gin Tyr Trp Gin Val Leu 15 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 10: 55 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 12 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 10:

Vai Trp Lys Thr Trp Gly Gin Tyr Trp Gin Val Leu 15 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 11: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 29 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: misc_feature (B) LOCATION: 7..12 (D) OTHER INFORMATION: /label= EcoRI-site (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 11: TATCTAGAAT TCTGCACCAG ATACTGAAG 29 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 12: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 32 base pairs (B) TYPE: nucleic acid 2 (C) STRANDEDNESS: single o (D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

sj- X (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: misc_feature £ (B) LOCATION: 7..12 ^ (D) OTHER INFORMATION: /label= EcoRI-site co co o 8 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 12: TATCTAGAAT TCTGCAAGAT GCCCACGATC AG 32 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 13: 56 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 13: CTTCTTGACC AGGCATGATA 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 14: .(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 14: TGTGAGAAGA ATCCCAGGCA 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 15: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 36 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

° (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 15:

CM

^ GCTTATCATG CCTGTGCCTG GATTCTTCTC ACAGGT 36 4· (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 16: £ (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 base pairs m (B) TYPE: nucleic acid § (C) STRANDEDNESS: single g (D) TOPOLOGY: linear

CD

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:16: 57 CATGGAAGTG ACTGTCTACC 2 0 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 17: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 32 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(iii) HYPOTHETICAL: NO (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 17: CTGAGCGAAT TCGGAACCTG TAATACTTTC CG 32 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 18: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 31 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 18: CTGAGCGAAT TCGTGAAGAG ACAAGTCCCC C 31 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 19: O (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: δ (A) LENGTH: 22 base pairs ^ (B) TYPE: nucleic acid cvi (C) STRANDEDNESS: single T (D) TOPOLOGY: linear

x (ii) MOLECULE TYPE: CDNA

CE

(iii) HYPOTHETICAL: NO m

CD

CD

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 19: TCACAGCATC ATATGAGAGT AC 22

Claims (25)

1. Melanoomaan liittyvän SEQ ID NO: 2:n mukaisen antigeenin immunogeeninen peptidif ragmentti, tunnettu 5 siitä, että se käsittää aminohapposekvenssin, joka on valittu peptidien L-L-D-G-T-A-T-L-R-L, V-L-P-D-G-Q-V-I-W-V, T-W-G-Q-Y-W-Q-V, V-W-K-T-W-G-Q-Y-W-Q-V, V-W-K-T-W-G-Q-Y-W-Q-V-L, K-T-W-G-Q-Y-W-Q-V-L, K-T-W-G-Q-Y-W-Q-V ja T-W-G-Q-Y-W-Q-V-L muodostamasta ryhmästä, joka peptidi mahdolli- 10 sesti käsittää deleetion, korvauksen, ja/tai inversion jolloin mainittu immunogeeninen peptidi pystyy indusoimaan kohdesolun hajoamisen kasvaimeen tunkeutuvilla imusoluilla.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen immunogeeninen 15 peptidif ragmentti, tunnettu siitä, että korvaus on valittu ryhmästä, joka koostuu korvauksista Asp/Gly, Asp/Asn ja Ile/Val.

3. Jonkin patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen immunogeeninen peptidif ragmentti, tunnettu siitä, että se 20 käsittää peptidin suolan, amidin, esterin, N-asyylijoh-dannaisen tai N-asetyylijohdannaisen.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen immunogeeninen peptidif ragmentti, tunnettu siitä, että peptidin amidi käsittää C-päätteisen amidin.

5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen immunogeeninen peptidif ragmentti, tunnettu siitä, että peptidin esteri ? käsittää C-päätteisen esterin. o

^ 6. Patenttivaatimuksen 3 mukainen immunogeeninen c\i η- peptidifragmentti, tunnettu siitä, että peptidin N- ^ 30 asyylijohdannainen käsittää N-päätteisen asyylijohdannai- £ sen. CL

7. Nukleiinihapposekvenssi, tunnettu siitä, et- LO tä se koodaa jonkin patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisen o LO immunogeenisen peptidifragmentin.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen nukleiinihap posekvenssi, tunnettu siitä, että se käsittää sekvenssin, joka valitaan ryhmästä, joka koostuu SEQ ID No: 3:n, 5:n, 7:n ja 9:n mukaisista sekvensseistä.

9. Kloonausvektori, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukaisen nukleiinihap-posekvenssin.

10. Isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on 5 transfektoitu tai transformoitu patenttivaatimuksen 9 mu kaisella kloonausvektorilla ja edullisesti yhteistransfek-toitu kloonausvektorilla, joka sisältää MHC-luokan I al-leelin koodaavan nukleotidisekvenssin.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen isäntäsolu, 10 tunnettu siitä, että isäntäsolu on valittu ryhmästä, joka koostuu hiiren EL4- ja P8.15-soluista ja ihmisen BLM-soluista.

12. Patenttivaatimuksen 10 tai 11 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on antigeenin esittävä 15 solu.

13. Minkä tahansa patenttivaatimusten 10 - 12 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että se myös tuottaa samanaikaisesti stimuloivia molekyylejä.

14. Rokote, tunnettu siitä, että se sisältää 20 jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukaisen immunogeenisen peptidifragmentin.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen rokote, tunnettu siitä, että peptidi on sekoitettu farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan tai laimennusaineiden kanssa.

16. Patenttivaatimuksen 14 tai 15 mukainen rokote, tunnettu siitä, että se sisältää antigeenin esittävän ^ solun, joka on etukäteen altistettu peptidille, o «m

17. Rokote, tunnettu siitä, että se käsittää jonkin patenttivaatimuksen 11 - 13 mukaisia isäntäsoluja. ^30

18. Rokote, tunnettu siitä, että se käsittää x patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukaisen nukleiinihapposek- Q. venssm. LO

19. Rokote, tunnettu siitä, että se käsittää S jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukaista peptidiä vastaan 35 suunnatun T-solureseptorin, tai gpl00:n kanssa reaktiivisia sytoksisia T-lymfosyytteja (CTL) , jotka ekspressoivat kyseistä T-solureseptoria.

20. Jonkin patenttivaatimuksen 14 - 19 mukainen rokote, tunnettu siitä, että se sisältää myös yhtä tai useampaa yhdistettä, jotka on valittu ryhmästä, jonka muodostavat adjuvantti, yksi tai useampia sytokiinejä, vasta- 5 aineet, jotka on suunnattu CD2:ta, CD3:a, CD27:ää, CD28:aa tai muita T-solun pinta-antigeenejä vastaan, ja auttaja-epitoopit CD4+ tai CD8+ -T-solujen stimulointia varten.

21. Menetelmä antigeenin suhteen reaktiokykyisten kasvaimeen tunkeutuvien imusolujen aikaansaamiseksi in 10 vitro, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat vaiheet : a. viljellään kasvaimeen tunkeutuvia imusoluja, jotka esiintyvät melanoomanäytteessä; b. eristetään kasvaimeen tunkeutuvat imusolut 15 näytteestä; c. saatetaan mainitut imusolut reagoimaan jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukaisen immunogeenisen peptidin kanssa; ja d. eristetään mainittuun antigeeniin sitoutuvat 20 imusolut.

22. Kasvaimeen tunkeutuva imusolu, tunnettu siitä, että se on gplOO reaktiivinen, ilmentää HLA-A2.1:tä, ja on valmistettu patenttivaatimuksen 21 mukaisella menetelmällä.

23. Rokote, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 22 mukaista kasvaimeen tunkeutuvia $2 imusoluja, o

^ 24. Peptidin ja todettavissa olevan merkkiaineen konjugaatti, tunnettu siitä, että siinä käytetään jon-^ 30 kin patenttivaatimuksen 1-6 mukaista immunogeenistä pep- x tidiä. CC CL

25. Patenttivaatimuksen 24 mukainen konjugaatti, m g tunnettu siitä, että havaittavissa oleva merkkiaine on o m radionukleotidi. en