DE69533295T3

DE69533295T3 - Melanoma-assoziierte Antigene, Epitope davon und Impstoffe gegen Melanoma

Info

Publication number: DE69533295T3
Application number: DE69533295T
Authority: DE
Inventors: Gosse Jan Adema; Carl Gustav Figdor
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: Government Of United States, Us
Priority date: 1994-02-16
Filing date: 1995-02-14
Publication date: 2009-07-16
Anticipated expiration: 2015-02-15
Also published as: FI121572B; ES2224113T5; ATE272113T1; DE69533295T2; JP3869476B2; DE69533295D1; US6500919B1; FI950665A0; KR100380503B1; AU697267B2; KR950032283A; DK0668350T4; AU1227295A; US20030216559A1; DK0668350T3; ES2224113T3; EP0668350A1; EP0668350B2; CA2142575A1; CA2142575C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Behandlung und Diagnose von Krebs, insbesondere mit einem Melanom-assoziierten Antigen und Epitopen davon, Impfstoffe gegen Melanom, tumorinfiltrierende T-Lymphocyten, die das Antigen erkennen, und Diagnosemittel für den Nachweis von Melanomen und zur Überwachung einer Impfung.
Tumorzellen können sich durch Onkogenaktivierung und/oder durch die Inaktivierung von Tumorsuppressor-Genen von einer restriktiven Wachstumskontrolle befreien. Der Verlauf der Tumorprogression schreitet durch eine Reihe von allmählichen, schrittweise erfolgenden Veränderungen in verschiedenen "Merkmalseinheiten", d. h. phanotypischen Zügen, voran, wobei von vielen davon bekannt ist, dass sie durch die geänderte Expression von definierten Onkogenen und/oder Tumorsuppressor-Genen bestimmt oder wenigstens beeinflusst werden. Die Befreiung der Zelle von der immunologischen Wirtsrestriktion kann in mehreren Schritten erfolgen, ähnlich wie die Befreiung von der Wachstumskontrolle.
Ein Problem, dem man bei der Immuntherapie von Krebs häufig begegnet, die die fehlende Immunogenität des Tumors. Diese Umgehung des Immunkontrollsystems kann auf der Basis von Phänotyp-Unterschieden verstanden werden, die man bei neoplastischen Zellen antrifft (Unterschiede gefunden in Burkitt-Lymphomzellen nach G. Klein und T. Boon, Curr. Opinion in Immunol. 5, 687-692, 1993):

– reduzierte Fähigkeit zur Verarbeitung und Präsentation von Antigenen;
– reduzierte Fähigkeit zur Stimulation von autologen T-Zellen;
– vollständiges Herunterregulieren von immunogenen Proteinen, die mit transformierten Zellen assoziiert sind;
– keine oder geringe Expression von Leukocyten-Adhäsionsmolekülen oder anderen akzessorischen Molekülen; und
– selektives Herunterregulieren bestimmter MHC-Klasse-I- und -Klasse-II-Allele.

In festen Tumoren sind MHC-Klasse-I/II-Antigene häufig herunterreguliert. Dies kann alle Klasse-I/II-Antigene oder nur einen Teil davon betreffen. Virale und zelluläre Peptide, die geeignete Zielzellen gegenüber einer durch cytotoxische T-Lymphocyten vermittelten Lyse sensibilisieren können, tun dies möglicherweise nicht, wenn sie in Zellen mit einem geringen Niveau der Expression von MHC-Klasse-I-Antigen produziert werden. Die Sensibilität gegenüber cytotoxischen Zellen kann wenigstens in einigen Fällen dadurch induziert werden, dass man das Niveau der MHC-Klasse-I/II-Antigenexpression durch Interferon-γ und Tumornekrosefaktor-α anhebt.
Während der schrittweise erfolgenden Veränderungen von normalem zu Tumorgewebe treten tumorassoziierte Antigene auf. Diese Antigene können durch verschiedene Mechanismen exponiert sein:

– es kann sich um Moleküle handeln, die während der normalen Zellentwicklung auf irgendeine Weise maskiert werden, bei denen die neoplastische Veränderung jedoch eine Entfernung des maskierenden Schutzes vor dem Immunsystem induziert;
– die Wegnahme einiger Moleküle aus der Plasmamembran kann das Profil benachbarter Moleküle in einem gegebenen Membranstück verändern und dadurch im Endeffekt ein neues Profil erzeugen, dass gegenüber dem Wirt immunogen werden könnte;
– eine Membranveränderung, die mit einer neoplastischen Umwandlung einhergeht, kann neue, zuvor verborgene Bereiche eines Moleküls exponieren, oder sie kann dazu führen, dass einem vorhandenen Molekül neue strukturelle Merkmale hinzugefügt werden;
– die Abstoßung und der Zerfall von Tumorzellen können Komponenten des Zellkerns, des Nucleolus oder des Cytoplasmas, die normalerweise in der Zellen verborgen sind, gegenüber dem Immunsystem exponieren.

Die Merkmale von tumorassoziierten Antigenen hängen sehr stark vom Ursprung des Tumors ab, der sie trägt. Die Existenz von Antigenen, die mit Tiertumoren assoziiert sind, wurde im letzten Jahrhundert dokumentiert, und der antigene Charakter von Krebs beim Menschen ist gut etabliert, in erster Linie durch neuere Studien mit monoklonalen Antikörpern.
Bei Versuchen, diese Antigene zu isolieren und chemisch zu charakterisieren, traten erhebliche Schwierigkeiten auf, von denen viele damit zu tun haben, dass geeignete Reagentien fehlen, um die antigentragenden Moleküle aus einer Lösung auszufällen.
Wie viele andere Reize aktivieren die tumorassoziierten Antigene nicht nur einen, sondern eine ganze Gruppe von Abwehrmechanismen, sowohl spezifische als auch unspezifische, humorale und zelluläre. Die vorherrschende Rolle bei der in-vivo-Resistenz gegen Tumorwachstum spielen T-Lymphocyten. Diese Zellenerkennen tumorassoziierte Antigene, die ihnen von antigenpräsentierenden Zellen (APCs) präsentiert werden, und werden durch diese Erkennung aktiviert, und nach der Aktivierung und Differenzierung greifen sie die Tumorzellen an und töten sie. Eine spezielle Klasse dieser Art von Lymphocyten wird von den tumorinfiltrierenden Lymphocyten (TILs) gebildet, die in festen Tumoren zu finden sind.
Es wurde bereits vorgeschlagen ( EP 147 689 ), T-Lymphocyten mit einer antigenen Substanz, die in vitro mit einem unlöslichen Träger verknüpft wird, zu aktivieren und dann diese aktivierten Lymphocyten einem Tumorpatienten zu verabreichen.
Die herkömmliche Chemotherapie ist bei der Behandlung von Patienten mit metastasierenden Melanomen relativ ineffektiv, und ungefähr 6000 Patienten sterben in den USA jedes Jahr an dieser Krankheit.
Rosenberg et al. (New Eng. J. Med. 319 (25), 1676-1681, 1988) haben die günstige Wirkung einer Immuntherapie mit autologen TILs und Interleukin-2 (IL-2) bei Melanompatienten gezeigt.
Diese Therapie besteht aus einer Resektion der Tumorablagerung, Isolierung der TILs, in-vitro-Vermehrung der TILs und Infusion derselben in den Patienten bei gleichzeitiger Behandlung mit hohen und toxizitätsinduzierenden Dosen von IL-2.
Die von Rosenberg verwendeten TILs sind gegen melanomassoziierte Antigene gerichtet und können diese erkennen.
Es war unser Ziel, ein solches melanomassoziiertes Antigen zu isolieren, um das Antigen und/oder seine Epitope für die Entwicklung einer Immuntherapie für Melanompatienten verwenden zu können.
Melanom-Antigene wurden bereits von L. Old (1981) beschrieben, der 6 antigene Glycoproteine und 3 Glycolipide identifizierte, die in 120 Melanomzelllinien vorkommen.
Impfstoffe mit Melanom-Antigenen wurden ebenfalls beschrieben: In den US-Patenten Nr. 5,030,621 und 5,194,384 wurde ein mehrwertiger Impfstoff hergestellt, indem man Melanomzellen kultivierte und anschließend die ausgeschiedenen melanomspezifischen Antigene aus dem Kulturmedium isolierte.
Einige spezifische Antigene wurden bereits für die Therapie und Diagnose des Melanomtyps von Krebs vorgeschlagen: Das Peptid p97 wurde in US 5,262,177 und US 5,141,742 vorgeschlagen, während in EP 529 007 ein 35-kD-Protein erwähnt ist.
Wir haben jetzt ein melanomassoziiertes Polypeptid gefunden, dass dadurch gekennzeichnet ist, dass es die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 umfasst.
Dieses für Melanocyten-Zelllinien spezifische antigene Polypeptid (auch gp100 genannt) wird vom monoklonalen Antikörper NKI-beteb erkannt, der sich als für diagnostische Zwecke geeignet erwiesen hat. Die von diesem Antikörper erkannten Antigene sind intrazelluläre Proteine von ungefähr 10 kD (gp10) bzw. 100 kD (gp100). Letzteres ist auch in einem Kulturmedium von Melanomzellen nachweisbar (C. Vennegoor et al., Am. J. Pathol. 130, 179-192, 1988). Es hat sich auch gezeigt, dass das gp100-Antigen mit anderen melanomspezifischen Antikörpern reagiert, wie HMB-50 (beschrieben von A. M. Vogel und R. M. Esclamado, Cancer Res. 48, 1286-1294, 1988) oder HMB-45 (beschrieben von A. M. Gown et al., Am. J. Pathol. 123, 195-203, 1986). Da gezeigt wurde, dass die mit diesen monoklonalen Antikörpern reagierenden Proteine in Melanomzellen glycosyliert werden, wurden bei der Analyse durch SDS-PAGE Unterschiede in der Mobilität gefunden.
Obwohl dieses gp100-Antigen vorwiegend intrazellulär exprimiert wird, wurde jetzt festgestellt, dass es ein geeignetes immunogenes Antigen ist, da nachgewiesen wurde, dass diese intrazellulären Proteine als Peptide verarbeitet und im Kontext von MHC-Molekülen Zellen des Immunsystems präsentiert werden können. Tatsächlich wurden von Tumoren von Melanompatienten abgeleitete tumorinfiltrierende Lymphocyten gefunden, die mit dem Antigen reagieren.
Daher ist das gp100-Polypeptid ein potentielles Ziel für zelluläre Reaktionen gegen Carcinome und somit ein geeigneter Gegenstand für die Therapie und Diagnose bei Melanompatienten.
Gp100 ist ein Typ-I-Transmembranprotein, das eine threoninreiche Domäne aufweist, die repetitive Aminosäuresequenzen enthält, welche sich in der Mitte des Proteins befinden (Aminosäuren 309-427). Dieser threoninreichen Domäne, die einer ausgedehnten O-verknüpften Glycosylierung unterzogen werden kann, geht ein histidinreicher Bereich (Aminosäuren 182-313) voraus und folgt eine cysteinreiche Domäne (Aminosäuren 475-566). Laut einer Hydrophobie-Plot-Analyse (J. Kyte und R. F. Doolittle, 1982) befindet sich im carboxyterminalen Teil (Aminosäuren 591-611) von gp100 eine einzige Transmembrandomäne, die von geladenen Resten umrahmt ist. Die vorausgesagte cytoplasmatische Domäne ist 45 Aminosäuren lang. Fünf mutmaßliche N-verknüpfte Glycosylierungsstellen sind vorhanden, was mit der Tatsache im Einklang steht, dass gp100 ein Glycoprotein ist.
Der Ausdruck "Polypeptid" bezieht sich auf eine molekulare Kette von Aminosäuren und bezieht sich nicht auf eine spezielle Länge des Produkts und kann erforderlichenfalls in vivo oder in vitro modifiziert werden, zum Beispiel durch Glycosylierung, Amidierung, Carboxylierung oder Phosphorylierung; somit sind in der Definition von "Polypeptid" unter anderem Peptide, Oligopeptide und Proteine mit umfasst.
Selbstverständlich sind auch funktionelle Derivate sowie Fragmente des Polypeptids gemäß der Erfindung in der vorliegenden Erfindung mitumfasst. Funktionelle Derivate sollen Polypeptide umfassen, die sich in einer oder mehreren Aminosäuren in der Gesamtsequenz unterscheiden und die Deletionen, Substitutionen, Inversionen oder Additionen aufweisen. Aminosäuresubstitutionen, von denen man erwarten kann, dass sie die biologischen und immunologischen Aktivitäten nicht wesentlich verändern, wurden beschrieben. Aminosäureersetzungen zwischen verwandten Aminosäuren oder Ersetzungen, die in der Evolution häufig stattgefunden haben, sind unter anderem Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val (siehe M. D. Dayhof, Atlas of Protein sequence and structure, Nat. Biomed. Res. Found., Washington D.C., 1978, Vol. 5, Suppl. 3). Auf der Grundlage dieser Informationen entwickelten Lipman und Pearson ein Verfahren für einen schnellen und empfindlichen Proteinvergleich (Science 227, 1435-1441, 1985) und zur Bestimmung der funktionellen Ähnlichkeit zwischen homologen Polypeptiden.
Funktionelle Derivate, die noch eine immunologische Aktivität gegenüber dem monoklonalen Antikörper NKI-beteb oder HMB-50 oder HMB-45 zeigen, sind im Umfang dieser Erfindung mit eingeschlossen.
Mit funktionellen Derivaten dieser Peptide sind weiterhin auch Peptide gemeint, die von gp100 abgeleitet sind und die in der Lage sind, die Lyse von Zielzellen durch tumorinfiltrierende Lymphocyten zu induzieren.
Außerdem sind mit funktionellen Derivaten dieser Peptide auch Additionssalze der Peptide, Amide der Peptide und insbesondere die C-terminalen Amide, Ester und insbesondere die C-terminalen Ester und N-Acyl-Derivate, insbesondere N-terminale Acyl-Derivate und N-Acetyl-Derivate, gemeint.
Die Polypeptide gemäß der Erfindung können entweder synthetisch oder durch DNA-Rekombinationstechnik erzeugt werden. Verfahren zur Herstellung von synthetischen Polypeptiden sind in der Technik wohlbekannt.
Es wird davon ausgegangen, dass die organisch-chemischen Verfahren zur Peptidsynthese die Kopplung der erforderlichen Aminosäuren mittels einer Kondensationsreaktion, entweder in homogener Phase oder mit Hilfe einer sogenannten festen Phase, umfassen. Die Kondensationsreaktion kann wie folgt durchgeführt werden:

a) Kondensation einer Verbindung (Aminosäure, Peptid), das eine freie Carboxygruppe und geschützte andere reaktive Gruppen aufweist, mit einer Verbindung (Aminosäure, Peptid), das eine freie Aminogruppe und geschützte andere reaktive Gruppen aufweist, in Gegenwart eines Kondensationsmittels:
b) Kondensation einer Verbindung (Aminosäure, Peptid), das eine aktivierte Carboxygruppe und freie oder geschützte andere reaktive Gruppen aufweist, mit einer Verbindung (Aminosäure, Peptid), das eine freie Aminogruppe und freie oder geschützte andere reaktive Gruppen aufweist.

Eine Aktivierung der Carboxygruppe kann unter anderem dadurch erfolgen, dass man die Carboxygruppe in ein Säurehalogenid, -azid, -anhydrid, -imidazolid oder in einen aktivierten Ester, wie N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxybenzotriazol oder p-Nitrophenylester, umwandelt.
Die häufigsten Verfahren für die obigen Kondensationsreaktionen sind: das Carbodiimid-Verfahren, das Azid-Verfahren, das gemischtes-Anhydrid-Verfahren und das Verfahren unter Verwendung von aktivierten Estern, wie es in The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 1–3 (Hrsg. E. Gross und J. Meienhofer), 1979, 1980, 1981 (Academic Press, Inc.), beschrieben ist.
Die Herstellung von Polypeptiden durch rekombinante DNA-Techniken ist ein allgemeines Verfahren, das bekannt ist, das aber viele Möglichkeiten hat, die alle zu etwas anderen Ergebnissen führen. Das zu exprimierende Polypeptid wird von einer DNA-Sequenz oder genauer von einer Nucleinsäuresequenz codiert.
Es hat sich gezeigt, dass die Aminosäuresequenz von gp100 der Aminosäuresequenz des bereits bekannten Melanom-assoziierten Peptids pMel17, das bei B. S. Kwon (1991) offenbart ist, stark ähnelt.
Die Aminosäureunterschiede zwischen gp100 und Pmel17 bestehen aus Substitutionen an Aminosäureposition 274 (T-C/Pro-Leu) und 597 (C-G/Arg/Pro) und einem Stück aus 7 Aminosäuren, das in gp100 auf Position 587 fehlt. Ein einziger Nucleotidunterschied in Position 762 (C-T) führt nicht zu einer Aminosäuresubstitution. GP100 ist außerdem zu 80% homolog zu einem mutmaßlichen Protein, das von einem partiellen cDNA-Klon (RPE-1) abgeleitet ist, der aus einer bovinen Retina-cDNA-Bibliothek isoliert wurde (R. Y. Kim und G. J. Wistow, 1992), und zu 42% homolog zu einem Hühner-Melanosomen-Matrixprotein, MMP115 (M. Mochii, 1991). Siehe auch 2.
Die Sequenz, die gp100 codiert, ist vorzugsweise die Sequenz von SEQ ID Nr. 1.
Wie in der Technik wohlbekannt ist, erlaubt die Degeneration des genetischen Codes eine Substitution von Basen in einem Codon, die zu einem anderen Codon führt, das immer noch für dieselbe Aminosäure codiert, z. B. ist das Codon für die Aminosäure Glutaminsäure sowohl GAT als auch GAA. Folglich ist klar, dass für die Expression eines Polypeptids mit einer in SEQ ID Nr. 2 gezeigten Aminosäuresequenz eine Derivat-Nucleinsäuresequenz mit einer solchen alternativen Codonzusammensetzung verwendet werden kann, wodurch sie sich von der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Nucleinsäuresequenz unterscheidet.
Der hier verwendete Ausdruck "Nucleotidsequenz" bezieht sich auf eine polymere Form von Nucleotiden beliebiger Länge, sowohl auf Ribonucleinsäure-(RNA)-Sequenzen als auch auf Desoxyribonucleinsäure-(DNA)-Sequenzen. Im Prinzip bezieht sich dieser Ausdruck auf die Primärstruktur des Moleküls. Dieser Ausdruck umfasst also doppel- und einzelsträngige DNA sowie doppel- und einzelsträngige RNA und Modifikationen davon.
Die Nucleotidsequenz von gp100 enthält 2115 Basenpaare (bp) und endet mit einem Poly(A)-Trakt von 15 Nucleotiden, dem sie Consensus-Polyadenylierungssequenz AATAAA vorausgeht. Ein offenes Leseraster (ORF), das sich von Nucleotid 22 bis 2007 erstreckt, ist in gp100-DNA vorhanden. Dieses ORF beginnt mit einem ATG-Codon innerhalb des geeigneten Sequenzkontext für einen Translationsstart und codiert für ein Protein mit 661 Aminosäuren. Die 20 aminoterminalen Aminosäuren erfüllen alle Kriterien für Signalsequenzen einschließlich einer potentiellen Spaltstelle nach ALA auf Position 20 (–1), was darauf hinweisen würde, dass reifes gp100 641 Aminosäuren enthält (ungefähr 70 kD).
Der auffallendste Unterschied zwischen gp100- und Pmel17-cDNA ist die in-frame-Deletion von 21 bp in gp100-cDNA (2). Ein Vergleich der Nucleotidsequenz von genomischer DNA mit der Sequenz von gp100-cDNA zeigte die Anwesenheit eines Introns (102 bp) genau auf der Position des 21-bp-Einschubs in Pmel17-cDNA. Die Exon/Intron-Grenzen passen gut zu den Consensus-5'-Donor- und -3'-akzeptor-Spleißstellensequenzen (Padgett, 1986). In der genomischen DNA befindet sich die Sequenz, die die zusätzlichen 21 bp in Pmel17-cDNA umfasst, direkt stromaufwärts von der 3'-Spaltstelle, die zur Erzeugung von gp100-RNA verwendet wird, und ihr voraus geht eine alternative 3'-Akzeptor-Spleißstelle. Während die gp100-spezifische 3'-Akzeptor-Spleißstelle zu der Consensussequenz passt, scheint die Pmel17-spezifische 3'-Akzeptor-Spleißstelle insofern suboptimal zu sein, als ihr ein pyrimidinreicher Bereich fehlt. Suboptimale RNA-Prozessierungsstellen befinden sich in vielen alternativ prozessierten Messenger-RNA-Vorläufern und wurden mit einer Funktion bei der Regulierung der alternativen RNA-Prozessierung in Verbindung gebracht (siehe Übersicht von M. R. Green, 1991). Zusammen genommen beweisen diese Daten, dass die Transcripte, die gp100- und Pmel17-cDNAs entsprechen, durch alternatives Spleißen eines einzigen Primärtranscripts erzeugt werden.
Ein weiterer Bestandteil der Erfindung sind Peptide, welche immunogene Fragmente des gp100-Polypeptids sind.
Immunogene Fragmente sind Fragmente des gp100-Moleküls, die noch die Fähigkeit haben, eine immunogene Antwort zu indizieren, d. h. dass es entweder möglich ist, Antikörper hervorzurufen, die die Fragmente spezifisch erkennen, oder dass es möglich ist, T-Lymphocyten zu finden, die durch die Fragmente aktiviert wurden.
Wie weiter oben bereits gesagt wurde, ist bekannt, dass die immunogene Wirkung von tumorassoziierten Antigenen häufig durch einen T-Zell-Aktivierungsmechanismus hervorgerufen wird (A. R. M. Townsend und H. Bodmer, Ann. Rev. Immunol. 7, 601-624, 1989). Cytotoxische T-Lymphocyten (CTLs), die Melanomzellen in einer T-Zell-Rezeptor-(TCR)-abhängigen und MHC-restringierten Weise erkennen, wurden aus tumortragenden Patienten isoliert (siehe Übersicht von A. Knuth, 1992). Brichard et al. (1993) haben gezeigt, dass ein von Tyrosinase, einem anderen melanocytenspezifischen Antigen, abgeleitetes Peptid von einem CTL-Klon erkannt wird.
Es ist bekannt, dass die Aktivierung von T-Zellen durch das MHC-Molekül die Verarbeitung des Antigens erfordert, von dem kurze Stücke (zum Beispiel Octa- bis Dodecamere) dem T-Lymphocyt präsentiert werden.
Die immunogenen Oligopeptide, die sich in der gp100-Sequenz befinden, bilden ebenfalls einen Bestandteil der Erfindung.
Wir haben immunogene Peptidsequenzen der gp100-Sequenz gefunden, die nicht nur an das MHC-I-Molekül binden können, sondern von denen auch gezeigt wurde, dass sie aus einem Melanompatienten isolierte tumorinfiltrierende Lymphocyten erkennen.
Mehrere Peptide wurden gefunden: Es hat sich gezeigt, dass die Peptide mit den Aminosäuresequenzen V-L-P-D-G-Q-V-I-W-V, M-L-G-T-H-T-M-E-V, R-L-M-K-Q-D-F-S-V, (V)-(W)-(K)-T-W-G-Q-Y-W-Q-V-(L) und L-L-D-G-T-A-T-L-R-L an das MHC-HLA-A2.1-Molekül binden. Außerdem werden die letzteren beiden Peptide von cytotoxischen Anti-Melanom-T-Lymphocyten im Kontext von HLA-A2.1 erkannt.
Vorzugsweise werden diese Peptide von nichtverwandten Sequenzen flankiert, d. h. von Sequenzen, mit denen sie in der Natur nicht verbunden sind, da sich gezeigt hat, dass eine solche Flankierung die immunogenen Eigenschaften dieser Peptide verstärkt, wahrscheinlich durch eine bessere Verarbeitung und Präsentation durch APCs.
Einen weiteren Bestandteil der Erfindung bilden Nucleotidsequenzen, die die Nucleotidsequenzen umfassen, die für die oben genannten Peptide codieren.
Neben der Verwendung dieser Sequenzen für die Herstellung der Peptide mit DNA-Rekombinationstechniken, für die unten weitere Beispiele angegeben werden, kann die in den Sequenzprotokollen für gp100 oder seine Epitope offenbarte Sequenzinformation auch für diagnostische Zwecke verwendet werden.
Aus diesen Sequenzen können Primer als Basis für einen diagnostischen Test abgeleitet werden, um gp100 oder gp100-artige Proteine durch eine Nucleinsäureamplifikationstechnik nachzuweisen, zum Beispiel die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder die auf Nucleinsäuresequenz basierende Amplifikation (NASBA), wie sie in US-Patent 4,683,202 bzw. EP 329,822 beschrieben sind.
Mit einer PCR werden große Mengen an DNA erzeugt, indem man eine Ziel-DNA-Sequenz mit Oligonucleotidprimern behandelt, so dass ein Primer-Verlängerungsprodukt synthetisiert wird, das mit Hilfe von Hitzedenaturierung von der Matrize getrennt wird und wiederum als Matrize dient, was zur Amplifikation der Zielsequenz führt. Wenn RNA mit PCR amplifiziert werden soll, wird der RNA-Strang zuerst mit Hilfe von Reverser Transcriptase in einen DNA-Strang transcribiert.
Mit Hilfe von NASBA werden große Mengen an einzelsträngiger RNA entweder aus einzelsträngiger RNA oder DNA oder aus doppelsträngiger DNA erzeugt. Wenn RNA amplifiziert werden soll, dient ssRNA als Matrize für die Synthese eines ersten DNA-Strangs durch Verlängerung eines ersten Primers, der eine ssRNA-Polymerase-Erkennungsstelle enthält. Der gebildete DNA-Strang dient wiederum als Matrize für die Synthese eines zweiten, komplementären DNA-Strangs durch Verlängerung eines zweiten Primers, was zu einer doppelsträngigen aktiven RNA-Polymerase-Promotor-Stelle führt, und die zweite DNA dient als Matrize für die Synthese großer Mengen der ersten Matrize, der ssRNA, mit Hilfe von RNA-Polymerase.
Der Nachweis der amplifizierten Nucleotidsequenz wird erbracht, indem man eine komplementäre Nachweissonde mit der amplifizierten Nucleinsäure hybridisiert. Diese Sonde kann markiert und/oder auf einer festen Phase immobilisiert sein. Der Nachweis des Markers kann durch in der Technik bekannte Verfahren erfolgen. Der Nachweis von Nucleinsäuren, die über die Sonde an die feste Phase gebunden sind, kann durch Verbindungen erfolgen, die zum selektiven Nachweis von Nucleinsäuren befähigt sind.
Wie bereits gesagt, können die Nucleotidsequenzen für die Herstellung von gp100 oder eines seiner Epitope mit DNA-Rekombinationstechniken verwendet werden. Dazu muss die Nucleotidsequenz in einem Klonierungsvektor enthalten sein, der verwendet werden kann, um eine geeignete Wirtszelle zu transformieren oder zu transfizieren.
Eine Vielzahl von Kombinationen aus Wirtszelle und Klonierungsvektor kann bei der Klonierung der Nucleinsäuresequenz in geeigneter Weise eingesetzt werden. Geeignete Klonierungsvektoren können zum Beispiel chromosomale, nichtchromosomale und synthetische DNA-Sequenzen sein, wie verschiedene bekannte bakterielle Plasmide und Plasmide mit einem breiteren Wirtsspektrum, wie pBR322, die verschiedenen pUC-, pGEM- und pBluescript-Plasmide, Bacteriophagen, z. B. Lambda-gt-Wes, Charon 28 und die von M13 abgeleiteten Phagen und Vektoren, die von Kombinationen aus Plasmiden und Phagen- oder Virus-DNA, wie SV40-, Adenovirus- oder Polyoma-Virus-DNA, abgeleitet sind (siehe auch R. L. Rodriguez und Denhardt (1988); Lenstra, 1990).
Geeignete Wirte können bakterielle Wirte, Hefen und andere Pilze, pflanzliche oder tierische Wirte, wie CHO-Zellen (Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters) oder Affenzellen, und andere Wirte sein.
Vektoren zur Verwendung bei der Expression der Peptide werden weiterhin Kontrollsequenzen umfassen, die funktlonell mit der für das Peptid codierenden Nucleinsäuresequenz verknüpft sind. Solche Kontrollsequenzen umfassen im Allgemeinen eine Promotorsequenz und Sequenzen, die die Expressionsniveaus regulieren und/oder verstärken. Weiterhin sind in solchen Vektoren häufig ein Replikationsstartpunkt und/oder ein dominanter Selektionsmarker vorhanden. Selbstverständlich können Kontroll- und andere Sequenzen je nach der ausgewählten Wirtszelle variieren.
Techniken zum Transformieren oder Transfizieren von Wirtszellen sind in der Technik ganz bekannt (siehe zum Beispiel Maniatis et al., 1982 und 1989).
Es ist äußerst praktisch, wenn die Wirtszelle neben der Information für das Peptid auch mit einem Vektor cotransformiert oder cotransfiziert wird, der die Information für ein MHC-Molekül trägt, an das das Peptid bekanntermaßen bindet. Vorzugsweise handelt es sich bei dem MHC-Molekül um HLA-A2.1, HLA-A1 oder HLA-A3.1 oder irgendein anderes HLA-Allel, von dem bekannt ist, dass es in Melanompatienten vorhanden ist. HLA-A2.1 ist besonders bevorzugt, da festgestellt wurde (A. Anichini, 1993), dass Melanomzellen Antigene tragen, die von HLA-A2.1-restringierten cytotoxischen T-Zell-Klonen von Melanompatienten erkannt werden.
Wirtszellen, die besonders gut für die Expression von gp100 geeignet sind, sind die murinen EL4- und P8.15-Zellen. Für die Expression von gp100 sind humane BLM-Zellen (beschrieben von M. Katano, 1984) besonders gut geeignet, da sie bereits befähigt sind, das MHC-Molekül HLA-A2.1 zu exprimieren.
Gp100 oder eines seiner Peptide oder ihre oben genannten Nucleotidsequenzen können in einem Impfstoff für die Behandlung von Melanomen verwendet werden.
Neben einer immunogen wirksamen Menge des aktiven Peptids kann der Impfstoff auch einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel enthalten.
Die Immunogenität der Peptide der Erfindung, insbesondere der Oligopeptide, kann durch Vernetzung oder durch Kopplung an ein immunogenes Trägermolekül (d. h. ein Makromolekül mit der Eigenschaft, bei einem Patienten unabhängig eine immunologische Antwort hervorzurufen, an welches die Peptide der Erfindung kovalent gebunden werden können) verstärkt werden.
Die kovalente Kopplung an das Trägermolekül kann unter Verwendung von in der Technik wohlbekannten Verfahren durchgeführt werden, deren genaue Wahl von der Natur des verwendeten Trägermoleküls bestimmt wird. Wenn das immunogene Trägermolekül ein Protein ist, können die Peptide der Erfindung gekoppelt werden, z. B. unter Verwendung von wasserlöslichen Carbodiimiden, wie Dicyclohexylcarbodiimid, oder Glutaraldehyd).
Kopplungsmittel wie diese können auch verwendet werden, um die Peptide ohne die Verwendung eines getrennten Trägermoleküls mit sich selbst zu vernetzen. Eine solche Vernetzung zu Polypeptiden oder Peptidaggregaten kann auch die Immunogenität erhöhen.
Beispiele für pharmazeutisch annehmbare Träger oder Verdünnungsmittel, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, sind Stabilisatoren, wie SPGA, Kohlenhydrate (z. B. Sorbit, Mannit, Stärke, Saccharose, Glucose, Dextran), Proteine, wie Albumin oder Casein, proteinhaltige Mittel, wie Rinderserum oder Magermilch, und Puffer (z. B. Phosphatpuffer).
Gegebenenfalls können eine oder mehrere Verbindungen, die als Adjuvans wirken, zu dem Impfstoff gegeben werden. Geeignete Adjuvantien sind zum Beispiel Aluminiumhydroxid, -phosphat oder -oxid, Ölemulsionen (z. B. von Bayol F^® oder Marcol 52^®), Saponine oder Vitamin-E-Solubilisat.
Der Impfstoff gemäß der vorliegenden Erfindung kann unter anderem intravenös, intraperitoneal, intranasal, intradermal, subkutan oder intramuskulär verabreicht werden.
Die geeignete wirksame Menge, die verabreicht werden soll, wird je nach dem Alter und Gewicht des Patienten und der Art der Verabreichung des Impfstoffs variieren.
Der Impfstoff kann eingesetzt werden, um eine spezifische T-Zell-Antwort zu erhalten, aber es ist auch möglich, dass nach der Impfung eine B-Zell-Antwort hervorgerufen wird. In diesem Fall führt die B-Zell-Antwort zur Bildung von Antikörpern gegen das Peptid des Impfstoffs, und diese Antikörper sind gegen die Quelle der Antigenproduktion, d. h. die Tumorzellen, gerichtet. Dies ist ein vorteil haftes Merkmal, da die Tumorzellen auf diese Weise durch Antworten beider immunologischer Systeme bekämpft werden.
Die beiden immunologischen Systeme werden noch effektiver ausgelöst, wenn der Impfstoff die Peptide so umfasst, wie sie in einem MHC-Molekül von einer antigenpräsentierenden Zelle (APC) präsentiert werden. Die Antigenpräsentation kann erreicht werden, indem man Monocyten, Makrophagen, interdigitierende Zellen, Langerhans-Zellen und insbesondere dendritische Zellen, die mit einem der Peptide der Erfindung beladen sind, verwendet. Die Beladung der APCs kann erreicht werden, indem man die Peptide der Erfindung in die APC oder in ihre Nachbarschaft bringt, aber es ist zu bevorzugen, die APC das vollständige gp100-Antigen verarbeiten zu lassen. Auf diese Weise wird eine Präsentation erreicht, die die Situation in vivo am realistischsten nachahmt. Weiterhin ist das von der Zelle verwendete MHC von dem Typ, der zum Präsentieren des Epitops geeignet ist.
Ein Gesamtvorteil der Verwendung von APCs für die Präsentation der Epitope ist die Wahl der APC-Zelle, die dafür verwendet wird. Von verschiedenen Typen von APCs ist bekannt, dass es stimulierende APCs und hemmende APCs gibt.
Bevorzugt sind die aufgeführten Zelltypen, sogenannte "professionelle" antigenpräsentierende Zellen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie costimulierende Moleküle aufweisen, die eine wichtige Funktion bei dem Vorgang der Antigenpräsentation haben. Solche costimulierenden Moleküle sind zum Beispiel B7, CTLA-4, CD70 oder hitzestabiles Antigen (Schwartz, 1992).
Fibroblasten, von denen ebenfalls gezeigt wurde, dass sie als antigenpräsentierende Zelle wirken können, fehlen diese costimulierenden Moleküle.
Es ist auch möglich, Zellen zu verwenden, die bereits mit einem Klonierungsvektor, der die Information für gp100 beherbergt, transfiziert sind und die mit einem Klonierungsvektor cotransfiziert werden, der die Nucleotidsequenz für ein MHC-Klasse-I-Molekül, zum Beispiel die Sequenz, die für HLA A2.1, HLA A1 oder HLA A3.1 codiert, umfasst. Diese Zellen wirken als antigenpräsentierende Zelle und präsentieren gp100-Fragmente in den MHC-Klasse-I-Molekülen, die auf ihrer Oberfläche exprimiert werden. Es wird in Betracht gezogen, dass diese Präsentation verstärkt wird, wenn die Zelle auch in der Lage ist, eines der oben genannten costimulierenden Moleküle oder ein Molekül mit einer ähnlichen Funktion zu exprimieren. Diese Expression kann das Ergebnis einer Transformation oder Transfektion der Zelle mit einem dritten Klonierungsvektor sein, der die Sequenzinformation aufweist, die für ein solches costimulierendes Molekül codiert, aber es kann auch sein, dass die Zelle bereits zur Produktion von costimulierenden Molekülen befähigt war.
Anstelle eines Impfstoffs mit diesen Zellen, die neben den gewünschten Expressionsprodukten auch viele Elmente beherbergen, die ebenfalls exprimiert werden und die die gewünschte immunogene Reaktion der Zelle negativ beeinflussen können, ist es auch möglich, dass ein Impfstoff mit Liposomen zusammengesetzt wird, die mit Peptiden beladene MHC-Moleküle exponieren und die zum Beispiel mit Lymphokinen gefüllt sind. Solche Liposomen lösen eine immunologische T-Zell-Reaktion aus.
Indem das Peptid in derselben Weise präsentiert wird, wie es auch in vivo präsentiert wird, wird eine verstärkte T-Zell-Reaktion hervorgerufen. Weiterhin wird durch die natürliche Adjuvanswirkung der relativ großen antigenpräsentierenden Zellen auch eine B-Zell-Antwort ausgelöst. Diese B-Zell-Antwort führt unter anderem zur Bildung von Antikörpern, die gegen den Peptid-MHC-Komplex gerichtet sind. Diesen Komplex findet man insbesondere in Tumorzellen, wobei gezeigt wurde, dass in dem Patienten Epitope von gp100 natürlicherweise präsentiert werden, die also in der Lage sind, eine T-Zell-Antwort hervorzurufen. Es ist dieses natürlich vorkommende Phänomen, das durch die Impfung von APCs, die die Peptide der Erfindung bereits präsentieren, verstärkt wird. Durch die Verstärkung wird nicht nur eine verstärkte T-Zell-Antwort hervorgerufen, sondern es wird auch eine B-Zell-Antwort eingeleitet, die zu Antikörpern führt, die gegen den MHC-Peptid-Komplex gerichtet sind.
Die Impfstoffe gemäß der Erfindung können mit zahlreichen Verbindungen angereichert sein, die eine verstärkende Wirkung auf die Einleitung und die Aufrechterhaltung sowohl der T-Zell- als auch der B-Zell-Antwort nach der Impfung haben.
Auf diese Weise verstärkt die Zugabe von Cytokinen zu dem Impfstoff die T-Zell-Antwort. Geeignete Cytokine sind zum Beispiel Interleukine, wie IL-2, IL-4, IL-7 oder IL-12, GM-CSF, RANTES, Tumornekrosefaktor und Interferone, wie IFN-.
Auf ähnliche Weise verstärken Antikörper gegen T-Zell-Oberflächenantigene, wie CD2, CD3, CD27 und CD28, die immunogene Reaktion.
Außerdem verstärkt die Zugabe von Helferepitopen zur Stimulierung von CD4-positiven Helferzellen oder CD8-positiven Killerzellen die immunogene Reaktion. Alternativ dazu können auch Helferepitope von anderen Antigenen verwendet werden, zum Beispiel von hitzeschockabgeleiteten Proteinen oder Choleratoxin.
Einen weiteren Bestandteil der Erfindung bildet die Verwendung von gegenüber gp100 reaktiven tumorinfiltrierenden Lymphocyten (TILs). Bei diesem Verfahren besteht der erste Schritt darin, eine Probe von einem Patienten zu entnehmen. Dies erfolgt gewöhnlich durch Resektion einer Tumorablagerung unter Lokalanästhesie. Die in dieser Probe vorhandenen TILs werden dann vier bis acht Wochen lang nach bekannten Verfahren (S. L. Topalian et al., 1987) in Kultur vermehrt. Während dieser Kultur werden die TILs dann auf Reaktivität gegenüber gp100 oder eines der von gp100 abgeleiteten Epitope überprüft. Die TILs, die das Antigen erkennen, werden isoliert und weiter kultiviert.
Eine TIL-Zelllinie, die spezifisch mit gp100 und seinen Epitopen reagiert, wurde gefunden und als TIL 1200 bezeichnet. Diese TIL-1200-Zelllinie exprimiert auch das MHC-Molekül HLA-A2.1. Weiterhin wurde die Expression von TCR α/β, CD3 und CD8 durch diese Zelllinie nachgewiesen. Weiterhin erkennt TIL 1200 Transfektanten, die sowohl HLA-A2.1 als auch gp100 exprimieren.
Diese TIL 1200 und andere TILs, die gp100 erkennen, sind für die Behandlung von Melanompatienten geeignet. Für eine solche Behandlung werden TILs kultiviert, wie es oben angegeben wurde, und durch eine intravenöse Infusion an die Patienten zurückgegeben. Der Erfolg der Behandlung kann durch Vorbehandlung des tumortragenden Wirts entweder mit Gesamtkörperbestrahlung oder Behandlung mit Cyclophosphamid und durch die gleichzeitige Verabreichung von Interleukin-2 (S. A. Rosenberg et al., 1986) verstärkt werden.
Die in den Patienten zurückinfundierten TILs sind vorzugsweise autologe (d. h. von dem eigenen Tumor des Patienten abgeleitete) TILs, aber auch eine Infusion mit allogenen TILs ist vorstellbar.
Eine weitere Verwendung der nach dem oben beschriebenen Verfahren erhaltenen TILs ist die Verwendung für die in-vivo-Diagnose. Durch Markierung der TILs, zum Beispiel mit ¹¹¹In (Fisher, 1989) oder irgendeinem anderen geeigneten diagnostischen Marker, werden sie für die Identifizierung von Tumorablagerungen in Melanompatienten geeignet.
Wie in der Technik wohlbekannt ist, bestimmt das TCR die Spezifität eines CTL. Daher kann die cDNA, die den TCR und insbesondere seinen variablen Bereich codiert, isoliert und in T-Zellen eingeführt werden, wodurch die Antitumorwirkung auf eine beliebige T-Zelle übertragen wird. Insbesondere die Einführung eines solchen TCR in autologe T-Zellen und die anschließende Vermehrung dieser T-Zellen, die zu einer großen Zahl von CTL führt, die für eine passive Übertragung in den autologen Patienten geeignet sind.
Ein Impfstoff kann auch aus Melanomzellen, die zur Expression von gp100 befähigt sind, zusammengesetzt werden. Es ist möglich, diese Zellen unter Verwendung von Anti-gp100-Antikörpern, wie NKI-beteb, aus einem Patienten zu isolieren, aber es ist auch möglich, solche Melanomzellen aus kultivierten Melanomzelllinien zu erzeugen, die gp100 entweder natürlicherweise erzeugen oder genetisch so manipuliert werden, dass sie es erzeugen. Diese Zellen können bestrahlt werden, so dass sie nicht mehr tumorogen sind, und dann in den Patienten (zurück) infundiert werden. Zur Verstärkung der immunologischen Wirkung dieser Melanomzellen ist es bevorzugt, die genetisch zu verändern, so dass sie ein Lymphokin erzeugen, vorzugsweise Interleukin-2 (IL-2) oder Granulocyten-Makrophagenkoloniestimulierenden Faktor (GM-CSF). Gp100-positive Melanomzellen können mit einem Klonierungsvektor transfiziert werden, der die Sequenz hat, die für die Produktion von IL-2 oder GM-CSF codiert.
Durch Infusion eines solchen Impfstoffs in einen Patienten wird die Bildung von CTLs stimuliert.
Eine andere Art von Impfung mit einer ähnlichen Wirkung ist die Impfung mit reiner DNA, zum Beispiel der DNA eines Vektors oder eines Vektorvirus mit der DNA-Sequenz, die das gp100-Antigen oder davon abgeleitete Peptide codiert. Sobald es injiziert worden ist, werden Zellen von dem Virus infiziert oder mit der DNA transformiert, so dass sie das Antigen oder das bzw. die Peptide exprimieren.
Antikörper gegen irgendein gp100-Peptid einschließlich Antikörpern gegen (V)-(W)-(K)-T-W-G-Q-Y-W-Q-V-(L) und L-L-D-G-T-A-T-L-R-L, sind ebenfalls Bestandteil der Erfindung.
Monospezifische Antikörper gegen diese Peptide können durch eine Modifikation des Verfahrens von R. Hall et al. (1984) durch Affinitätsreinigung aus polyspezifischen Antiseren erhalten werden. Polyspezifische Antiseren können erhalten werden, indem man Kaninchen nach Standard-Immunisierungsschemata immunisiert.
Der hier verwendete Ausdruck "monospezifischer Antikörper" ist definiert als eine einzige Antikörperspezies oder mehrere Antikörperspezies mit homogenen Bindungseigenschaften für das relevante Antigen. Der hier verwendete Ausdruck "homogene Bindung" bezieht sich auf die Fähigkeit der Antikörperspezies, an die ligandbindende Domäne der Erfindung zu binden.
Der Antikörper ist vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper, besonders bevorzugt ein humanisierter monoklonaler Antikörper.
Monoklonale Antikörper können hergestellt werden, indem man ingezüchtete Mäuse, vorzugsweise Balb/c, nach in der Technik bekannten Techniken mit dem geeigneten Protein immunisiert (G. Köhler und C. Milstein, 1975). Anschließend werden Hybridomzellen durch Züchten in Hypoxanthin, Thymidin und Aminopterin in einem geeigneten Zellkulturmedium, wie Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), selektiert. Antikörpererzeugende Hybridome werden kloniert, wobei man vorzugsweise die Weichagartechnik von MacPherson (1973) verwendet. Diskrete Kolonien werden zur Kultivierung in einem geeigneten Kulturmedium in einzelne Näpfe von Kulturplatten übergeführt. Antikörpererzeugende Zellen werden durch Screening mit dem geeigneten Immunogen identifiziert. Immunogen-positive Hybridomzellen werden durch in der Technik bekannte Techniken aufrechterhalten. Spezifische Anti-Monoklonale-Antikörper werden hergestellt, indem man die Hybridome in vitro kultiviert oder Ascitesflüssigkeit in Mäusen nach Hybridominjektion durch in der Technik bekannte Verfahren herstellt.
Vorzugsweise werden humanisierte Antikörper verwendet. Verfahren zum Humanisieren von Antikörpern, wie CDR-Transplantation, sind bekannt (P. T. Jones et al., 1986). Eine weitere Möglichkeit, eine antigene Antwort auf Antikörper, die gegenüber Polypeptiden gemäß der Erfindung reaktiv sind, zu vermeiden, ist die Verwendung von humanen Antikörpern oder von Fragmenten oder Derivaten davon.
Humane Antikörper können durch in-vitro-Stimulation von isolierten D-Lymphocyten hergestellt werden, oder sie können aus (immortalisierten) B-Lymphocyten isoliert werden, die aus einem Menschen geerntet wurden, der mit wenigstens einer ligandbindenden Domäne gemäß der Erfindung immunisiert wurde.
Antikörper, wie sie oben beschrieben sind, können für die passive Immunisierung von Melanompatienten verwendet werden. Eine bevorzugte Art von Antikörpern für diese Art von Impfstoff sind Antikörper, die gegen die oben genannten Peptide gerichtet sind, welche in Verbindung mit dem MHC-Molekül präsentiert werden. Um diese Art von Antikörpern zu erzeugen, ist eine Immunisierung von Peptiden, die von APCs präsentiert werden, erforderlich. Eine solche Immunisierung kann so durchgeführt werden, wie es oben beschrieben ist. Alternativ dazu können humane Antikörper gegen Peptid-MHC-Komplexe auch aus Patienten isoliert werden, die mit einem Impfstoff behandelt wurden, der aus mit einem der Peptide beladenen APCs besteht.
Die Antikörper, die nach Behandlung mit einem der Impfstoffe der Erfindung gebildet werden, können auch zur Überwachung der Impfung verwendet werden. Für ein solches Verfahren wird Serum von den Patienten gewonnen, und die Antikörper, die gegen das Peptid gerichtet sind, mit dem geimpft wurde, werden nachgewiesen. Wenn man den Antikörpertiter aus diesem Nachweis kennt, kann man beurteilen, ob eine Auffrischimpfung notwendig ist.
Der spezifische Nachweis der Antikörper in dem Serum kann durch markierte Peptide erreicht werden. Der Marker kann ein beliebiger diagnostischer Marker sein, der auf dem Gebiet der in-vitro-Diagnose bekannt ist, aber am meisten bevorzugt (und am verbreitetsten verwendet) sind Enzyme, Farbstoffe, Metalle und Radionuklide, wie ⁶⁷Ga, ^99mTc, ¹¹¹In, ^113mIn, ¹²³I, ¹²⁵I oder ¹³¹I.
Die radiodiagnostischen Marker können direkt oder über chelatisierende Struktureinheiten, die direkt oder über Linker- oder Spacer-Moleküle mit den Peptiden gekoppelt wurden, mit den Peptiden der Erfindung gekoppelt werden. Die Technik der Kopplung von Radionukliden mit Peptiden oder peptidartigen Strukturen ist auf dem Gebiet der (Tumor-)Diagnose von den zahlreichen Anwendungen markierter Antikörper, die sowohl bei in-vivo- als auch bei in-vitro-Tests verwendet werden, bereits bekannt.
Eine direkte Markierung von Peptiden kann zum Beispiel so durchgeführt werden, wie es im Ein-Gläschen-Verfahren beschrieben ist (Haisma, 1986). Ein allgemeines Verfahren zur Markierung von Peptiden über Chelatoren mit oder ohne Linker- oder Spacer-Moleküle ist zum Beispiel in den US-Patenten 4,472,509 und 4,485,086 beschrieben. Chelatoren, die ein bicyclisches Anhydrid von DTPA verwenden, sind offenbart in D. J. Hnatowich et al. (1983). Eine Kopplung über Diamiddimercaptid-Verbindungen ist in EP 188 256 offenbart.
Die vorliegende Erfindung wird beispielhaft unter Bezugnahme auf die Begleitfiguren näher beschrieben:
1 zeigt die genomische Organisation eines Teils des menschlichen gp100/Pmel17-Gens. A und A' stellen die Introns dar, die in Transcripten, die gp100-cDNA bzw. Pmel17-cDNA entsprechen, entfernt werden. Exonsequenzen sind in Großbuchstaben und Intronsequenzen als Kleinbuchstaben angegeben. Die beste Anpassung an die Verzweigungspunktsequenz (B. Ruskin et al., 1984) ist unterstrichen.
2 zeigt eine Abgleichung des carboxyterminalen Teils von Vertretern der gp100/pMel17-Familie. Identische Aminosäuren (–) und Lücken (*) sind angegeben. Konservierte Cysteinreste (#) sind ebenfalls angegeben.
3. (A) Mutanten mit Gp100-Deletion, die Teile des gp100-Proteins codieren, sind gezeigt (die Zahlen geben Aminosäuren im gp100-Protein an, wie sie in SEQ ID Nr. 2 angegeben sind);

(B) Erkennung von Zellen, die mit HLA-A2.1 transfiziert sind, und der in 3A gezeigten Mutanten mit gp100-Deletion durch TIL 1200.

4. (A) Fünf Peptide, die vom gp100-148-166-Bereich abgeleitet sind und von einem Octamer bis zu einem Undecamer variieren, wurden auf Erkennung durch TIL 1200 getestet. Die spezifische Lyse wurde bei einem Verhältnis von Effektor zu Target von 30:1 nachgewiesen.

(B) Titration von gp100-Peptiden, die in 4A auf Erkennung durch TIL 1200 identifiziert wurden (E/T-Verhältnis 30:1).

5. Bindung von gp100 und viralen Epitopen an HLA-A2.1.
Beispiel 1 – Molekulare Charakterisierung von gp100
Materialien und Verfahren
Zellen und monoklonale Antikörper
Die Melanomzelllinien Mel-2a, M14, MEWO, BLM (Vennegoor et al., 1988; van Muijen et al., 1991; Bean et al., 1975; Katano et al., 1984) und die Uveamelanomzelllinie Mel 202 (Ksander et al., 1991) wurden schon früher beschrieben. Die Isolierung von normalen humanen Melanocyten aus Brust oder Vorhaut wurde nach dem Verfahren von Eisinger und Marko (1982) mit Modifikationen nach Smit et al. (1993) durchgeführt.
Die monoklonalen Antikörper NKI-beteb und HMB-50 wurden schon früher beschrieben (Vennegoor et al., 1988; Vogel und Esclamado, 1988). Der monoklonale Antikörper HMB-45 wurde von Enzo Biochem bezogen.
DNA-Konstrukte und Transfektionen
Das 2,2-kb-EcoRI-Fragment, das gp100-cDNA enthielt, wurde mit glatten Enden versehen, indem man die Enden mit Klenow-DNA-Polymerase auffüllte, und dann in beiden Orientierungen (pSVLgp100+ und pSVLgp100–) in die SmaI-Stelle des eukaryontischen Expressionsvektors pSVL (Pharmacia) einkloniert. pSVL enthält den späten SV40-Promotor und eine Polyadenylierungsstelle sowie den SV40-Replikationsstartpunkt, was eine sehr hohe Kopienzahl während der transienten Expression in COS-7-Zellen erlaubt.
Für den Aufbau der 3'-verkürzten gp100-Transcriptionseinheit pSVLgp100+(@BS) führten wir eine Deletion der Sequenz zwischen der BglII-Stelle im 3'-Teil von gp100-cDNA und der SacI-Stelle in der multiplen Klonierungsstelle des Vektors durch. Das resultierende Konstrukt codiert ein verkürztes gp100-Protein, bei dem die carboxyterminalen 133 Aminosäuren von gp100 durch 4 Aminosäuren (Arg-Ile-Gln-Thr) ersetzt sind, die durch Vektorsequenzen codiert sind.
Eine transiente Expression der Konstrukte in COS-7-Zellen wurde durchgeführt, indem man 40 μg/ml Lipofektin-Reagens von BRL (Felgner et al., 1987) und 7,5 μg DNA verwendete, wie es schon früher beschrieben wurde (Loenen et al., 1991).
Immunofluoreszenz
Transfizierte COS-7-Zellen wurden 48 Stunden nach der Zugabe des Lipofektin/DNA-Gemischs für die Immunofluoreszenz präpariert, wie es schon früher beschrieben wurde (Vennegoor et al., 1988). Nach 45 Minuten Inkubation mit dem primären Antikörper wurden Zellen gewaschen und 30 Minuten lang mit Fiuoresceinisothiocyanat-(FITC)-markiertem Ziegen-F(ab)'₂-Anti-Mausd-IgG (Nordic) inkubiert. Die Präparate wurden unter Verwendung eines kornfokalen Laser-Scanning-Mikroskops bei 488 nm (Biorad MRC 600) untersucht.
Metabolische Markierung, Immunfällungen und V8-Protease-Kartierung
Immunfällungsexperimente wurden mit metabolisch markierten (L-[³⁵S]-Methionin/Cystein; Amersham) Zellen durchgeführt, wie es von Vennegoor et al. (1988) beschrieben wurde, wobei man entweder den monoklonalen Antikörper NKI-beteb oder HMB-50 verwendete, die kovalent an Protein-A-CL-4B-Sepharosekügelchen (Pharmacia) gebunden waren. In einigen Experimenten wurde Tunicamycin (75 μg/ml, Calbiochem) während der Vormarkierungszeit hinzugefügt und blieb während der metabolischen Markierungsreaktion zugegen (12,5 Minuten). Immunopräzipitate wurden unter reduzierenden Bedingungen (5% β-Mercaptoethanol in SDS-Probenpuffer) durch SDS-PAGE analysiert, wobei man 5–17,5%ige Polyacrylamid-Gradientengele verwendete. Das relative Molekulargewicht der Proteine wurde unter Verwendung von coelektrophorisierten, vorgefärbten Molekulargewichtsmarkern (BRL) bestimmt. Die Gele wurden vor der Autoradiographie (Kodak XAR) mit 1 M Natriumsalicylat (pH 5,4) behandelt.
Eine V8-Protease-Kartierung wurde durchgeführt, wobei man das Verfahren der Verdauung für Proteine in Gelscheiben verwendete, das von Cleveland et al. (1977) beschrieben wurde. Kurz gesagt wurden Gelscheiben, die die 100-kD- Proteine enthielten, in die Näpfe eines zweiten SDS-Gels (10%) gelegt und mit Staphylococcus-aureus-V8-Protease (2,5 μg/Probe, Miles Laboratories) überschichtet. Nach der Elektrophorese wurden die Gele so behandelt, wie es oben beschrieben ist.
Molekulares Klonieren eines Teils des gp100/Pmel17-Gens
Ein Teil des gp100/Pmel17-Gens wurde durch PCR (Taq-DNA-Polymerase von Gibco) auf humaner genomischer DNA, die aus Lymphocyten des peripheren Bluts (PBLs) isoliert wurde, amplifiziert, wobei man die folgenden Primer verwendete: 1497/1516: 5'-TATTGAAAGTGCCGAGATCC-3' und 1839/1857: 5'-TGCAAGGACCACAGCCATC-3', wie es schon früher beschrieben wurde (Adema und Baas, 1991). Die PCR-Produkte wurden anschließend amplifiziert, wobei man ein Nested-Primerpaar verwendete, das eine zusätzliche EcoRI-Stelle enthielt (5'-TATCTAGAATTCTGCACCAGATACTGAAG-3' und 5'-TATCTAGAATTCTGCAAGATGCCCACGATCAG-3'). Die unterstrichenen EcoRI-Stellen in diesen Primern wurden verwendet, um das PCR-Produkt in die EcoRI-Stelle von pUC18 einzuklonieren.
RNA-Isolierung und -Analyse
Gesamt-RNA wurde isoliert, wobei man das Guanidinthiocyanatverfahren und Zentrifugation durch ein Polster aus Cäsiumchlorid verwendete (Chirgwin et al., 1979). cDNA wurde unter Verwendung des Geneamp-RNA-PCR-Kits (Perkin Elmer Cetus) gemäß den Angaben des Herstellers hergestellt. Eine PCR-Analyse der cDNAs wurde über 35 Cyclen in Gegenwart von 3 mM MgCl₂ durchgeführt, wobei man die Primer 1497/1516 und 1839/1857 (siehe oben) verwendete, wie es schon früher beschrieben wurde (Adema und Baas, 1991). Die Reaktionsprodukte wurden auf einem Agarose-Gel nach Größe fraktioniert, auf eine Nylonmembran (Hybond-N, Amersham) geblottet und mit [³²P]-markierten Oligonucleotidsonden hybridisiert, wie es schon früher beschrieben wurde (Adema und Baas, 1991). Als Sonden verwendeten wir entweder ein gp100-spezifisches Exon/Exon-Verknüpfungs-Oligonucleotid (5'-CTTCTTGACCAGGCATGATA-3') oder ein Pmel17-spezifisches Oligonucleotid (5'-TGTGAGAAGAATCCCAGGCA-3'), das 20 der 21 zusätzli chen Nucleotide entspricht, die in Pmel17-cDNA vorhanden sind. Bei jedem Hybridisierungsexperiment wurde ein Spot-Blot, das ein Oligonucleotid enthielt, welches die Pmel17-Exon/Exon-Verknüpfung (5'-GCTTATCATGCCTGTGCCTGGATTCTTCTCACAGGT-3') umfasst, als Kontrolle mitverwendet
Nucleotidsequenzanalyse
Klone mit cDNA und genomischer DNA für gp100 wurden nach dem Didesoxy-Nucleotidsequenzierungsverfahren (Sanger et al., 1977) sequenziert, wobei man T7-DNA-Polymerase (Pharmacia) verwendete. In jedem Fall wurde die Sequenz beider Stränge bestimmt. Da die Klone mit genomischer DNA nach der PCR erhalten wurden, wurde die Sequenz von vier unabhängigen Klonen bestimmt. Eine Analyse der DNA-Sequenz wurde unter Verwendung der Sequenzanalyseprogramme der Genetics Computing Group der University of Wisconsin (Devereux et al., 1984) durchgeführt.
Ergebnisse
Die Expression von gp100-cDNA in nichtpigmentierten COS-7-Zellen führt zu Immunreaktivität gegenüber den monoklonalen Antikörpern NKI-beteb, HMB-50 und HMB-45.
Die Expression von gp100-cDNA in gp100-negativen BLM-Melanomzellen führt zu Immunreaktivität gegenüber den für Melanocyten-Zelllinien spezifischen monoklonalen Antikörpern NKI-beteb, HMB-50 und HMB-45. Um zu bestimmen, ob die Expression von gp100-c1-cDNA in nichtmelanocytischen Zellen ebenfalls zu einer Immunreaktivität gegenüber diesen monoklonalen Antikörpern führt, führten wir Experimente zur transienten Expression in COS-7-Zellen (Affennieren-Fibroblasten) mit Konstrukten durch, die gp100-cDNA in codierender oder nichtcodierender Orientierung enthielten. Nur COS-7-Zellen, die mit dem Konstrukt, das die cDNA in codierender Orientierung enthält (COS-7/pSVLgp100+), transfiziert sind, reagieren mit allen drei monoklonalen Antikörpern. Diese Daten beweisen, dass die Immunreaktivität gegenüber den monoklonalen Antikörpern NKI-beteb, HMB-50 und HMB-45 nach der Expression von gp100-cDNA nicht auf melanocytische Zellen beschränkt ist. Außerdem zeigen diese Daten, dass das COS-Expressionssystem für die weitere biochemische Charakterisierung der von gp100-cDNA codierten Proteine verwendet werden kann.
Analyse der von gp100-cDNA codierten Proteine
Um die von gp100-cDNA codierten Proteine zu charakterisieren, wurden COS-7/pSVLgp100+-Zellen metabolisch markiert und einer Immunfällung mit dem monoklonalen Antikörper NKI-beteb oder HMB-50 unterzogen. Die monoklonalen Antikörper NKI-beteb und HMB-50 fällen spezifisch Proteine von ungefähr 100 kD (95–110 kD) aus Extrakten von COS-7/pSVLgp100+-Zellen aus. Das Molekulargewicht dieser Proteine ist ähnlich (siehe auch unten) dem der Proteine, die durch Immunfällung aus Extrakten von metabolisch markierten MEWO-Zellen, die die Antigene endogen exprimieren, ausgefällt wurden (Vennegoor et al., 1988). Im Einklang mit früheren Berichten (Vennegoor et al., 1988; Vogel und Esclamado, 1988) erkennen beide monoklonalen Antikörper auch ein Protein von 10 kD in Extrakten von MEWO-Melanomzellen. Ein Protein derselben Größe reagiert mit dem monoklonalen Antikörper NKI-beteb in COS-7/pSVLgp100+-Zellen und kann nach verlängerter Einwirkung mit dem monoklonalen Antikörper HMB-50 unterschieden werden (nicht gezeigt). Wir stellen fest, dass die Menge des 10-kd-Proteins zwischen den Experimenten beträchtlich variierte. Von keinem der beiden monoklonalen Antikörper werden spezifische Proteine durch Immunfällung aus Extrakten ausgefällt, die aus COS-7-Zellen hergestellt wurden, die mit dem Konstrukt transfiziert wurden, das die cDNA in nichtcodierender Orientierung enthält.
Glycoproteine von ungefähr 100 kD, die mit den monoklonalen Antikörpern NKI-beteb und HMB-50 reagierten, wurden im Kulturmedium von Melanomzellen ebenfalls gefunden (Vennegoor et al., 1988; Vogel und Esclamado, 1988). Ein Vergleich des Kulturmediums von metabolisch markierten COS-7/pSVLgp100+-Zellen und MEWO-Zellen zeigt, dass beide monoklonalen Antikörper auch Proteine von etwa 100 kD (siehe auch unten) im Kulturmedium dieser Zellen erkennen.
Durch die monoklonalen Antikörper aus dem Kulturmedium von COS-7/pSVLgp100+-Zellen werden keine Proteine von 10 kD ausgefällt, wie es für Melanomzellen gezeigt wurde. Diese Daten beweisen, dass bei COS-7/pSVLgp100+-Zellen wie bei Melanomzellen die Proteine von etwa 100 kD, die von den monoklonalen Antikörpern NKI-beteb und HMB-50 erkannt werden, sezerniert werden.
Um die Möglichkeit auszuschließen, dass die von den monoklonalen Antikörpern nachgewiesenen Proteine von endogenen Genen abgeleitet sind, die nach der Transfektion mit gp100-cDNA induziert werden, führten wir Immunfällungsexperimente mit COS-7-Zellen durch, die eine 3'-verkürzte gp100-Transcriptionseinheit exprimierten (wegen Einzelheiten siehe Abschnitt "Materialien und Verfahren"). Aus COS-7-Zellen, die dieses Konstrukt exprimieren, werden von beiden monoklonalen Antikörpern Proteine von ungefähr 85 kD ausgefällt, was mit einer Deletion von 129 Aminosäuren im Einklang steht. Dieses Ergebnis liefert einen direkten Beweis dafür, dass das von den monoklonalen Antikörpern NKI-beteb und HMB-50 in COS-7/pSVLgp100+-Zellen erkannte 100-kD-Protein von gp100-cDNA codiert wird.
Das von gp100-cDNA codierte 100-kD-Protein ist mit gp100 identisch
Die Protein von etwa 100 kD, die von den monoklonalen Antikörpern NKI-beteb und HMB-50 in COS-7/pSVLgp100+-Zellen gegenüber MEWO-Zellen identifiziert werden, haben eine etwas andere Mobilität, wenn sie durch SDS-PAGE analysiert werden. Da gezeigt wurde, dass die Proteine, die mit diesen monoklonalen Antikörpern reagieren, in Melanomzellen glycosyliert sind (Vennegoor et al., 1988; Vogel und Esclamado, 1988), könnten diese Unterschiede auf eine veränderte Glycosylierung zurückzuführen sein, ein Ereignis, das man häufig im COS-Expressionssystem beobachtet. Um dies zu bestätigen, wurde der monoklonale Antikörper NKI-beteb verwendet, um Proteine aus MEWO-Zellen und aus COS-7/pSVLgp100+-Zellen, die in Gegenwart des Glycosylierungsinhibitors Tunicamycin kultiviert wurden, durch Immunfällung auszufällen. Sowohl bei COS-7/pSVLgp100+-Zellen als auch bei MEWO-Zellen ist die Größe der Proteine von etwa 100 kD auf zwei Proteinbanden von 90 kD und 85 kD reduziert, was bestätigt, dass der beobachtete Unterschied in der Mobilität auf eine veränderte Glycosylierung zurückzuführen ist.
Um weitere Beweise dafür zu erhalten, dass die vom monoklonalen Antikörper NKI-beteb in COS-7/pSVLgp100+-Zellen und MEWO-Zellen erkannten Proteine identisch sind, führten wir ein V8-Protease-Kartierungsexperiment durch. Nach V8-Protease-Verdauung des 100-kD-Hauptproteins, das aus COS-7/pSVLgp100+-Zellen oder MEWO-Zellen isoliert wurde, werden dieselben Proteinfragmente erhalten. Wir schließen aus diesen Daten, dass gp100-cDNA das für Melanocyten-Zelllinien spezifische Glycoprotein gp100 codiert, das von den monoklonalen Antikörpern NKI-beteb und HMB-50 in Melanomzellen erkannt wird.
Gp100 ist ein Typ-I-Transmembranprotein, das zu Pmel17 hochgradig homolog ist
Die Nucleotidsequenz von gp100-cDNA wurde bestimmt. Sie enthält 2115 Basenpaare (bp) und endet mit einem Poly(A)-Trakt von 15 Nucleotiden, dem die Consensus-Polyadenylierungssequenz AATAAA vorausgeht (Proudfoot und Brownlee, 1976). Ein offenes Leseraster (ORF), das sich von Nucleotid 22 bis 2007 erstreckt, ist in gp100-cDNA vorhanden. Dieses ORF beginnt mit einem ATG-Codon innerhalb des geeigneten Sequenzkontext für den Translationsstart (Kozak, 1987) und codiert für ein Protein von 661 Aminosäuren (SEQ ID Nr. 1). Die aminoterminalen 20 Aminosäuren erfüllen alle Kriterien für Signalsequenzen einschließlich einer potentiellen Spaltstelle nach ALA auf Position 20 (von Heyne, 1986), was darauf hinweisen würde, dass reifes gp100 641 Aminosäuren enthält (ungefähr 70 kD). Auf der Grundlage einer Hydrophobie-Plot-Analyse (Kyte und Doolittle, 1982) befindet sich im carboxyterminalen Teil (Aminosäuren 591-611) von gp100 eine einzige Transmembrandomäne, die von geladenen Resten umrahmt ist. Die vorausgesagte cytoplasmatische Domäne ist 45 Aminosäuren lang. Fünf mutmaßliche N-verknüpfte Glycosylierungsstellen sind vorhanden, was mit der Tatsache im Einklang steht, dass gp100 ein Glycoprotein ist. Weiterhin sind eine histidinreiche Domäne (Aminosäuren 182-313), eine threo ninreiche Domäne (Aminosäuren 309-427), die repetitive Aminosäuresequenzen enthält, und eine cysteinreiche Domäne (475-566 Aminosäuren) vorhanden.
Eine Datenbankrecherche (Pearson und Lipman, 1988; Altschul et al., 1990) zeigte, dass gp100 fast mit Pmel17, einem anderen melanocytenspezifischen Protein (Kwon et al., 1991), identisch ist. Die Aminosäureunterschiede zwischen gp100 und Pmel17 bestehen aus Substitutionen auf Position 274 (T-C/Pro-Leu) und 597 (C-G/Arg-Pro) und einem Stück aus 7 Aminosäuren, das in gp100 auf Position 587 fehlt (siehe auch 2). Ein einziger Nucleotidunterschied in Position 782 (C-T) führt nicht zu einer Aminosäuresubstitution. GP100 ist außerdem zu 80% homolog zu einem mutmaßlichen Protein, das von einem partiellen cDNA-Klon (RPE-1) abgeleitet ist, der aus einer bovinen Retina-cDNA-Bibliothek isoliert wurde (Kim und Wistow, 1992), und zu 42% homolog zu einem Hühner-Melanosomen-Matrixprotein, MMP115 (Mochii et al., 1991).
Gp100 und Pmel17 werden von einem einzigen Gen codiert
Der auffallendste Unterschied zwischen gp100- und Pmel17-cDNA ist die in-frame-Deletion von 21 bp in gp100-cDNA. Eine mögliche Erklärung für diesen Unterschied ist die Existenz von zwei nahe miteinander verwandten Genen. Da jedoch beide cDNAs identische Nucleotidsequenzen in ihren 3'-untranslatierten Bereichen haben, ist diese Erklärung nicht wahrscheinlich. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass beide cDNAs Transcripten entsprechen, die durch alternatives Spleißen eines einzigen Primärtranscripts entstehen. Um diese Hypothese zu testen, verwendeten wir PCR, um die genomische DNA zu analysieren, die dem Teil des gp100-Gens entspricht, der die mutmaßliche alternative Spleißstelle umgibt. Ein Vergleich der Nucleotidsequenz dieser genomischen DNA mit der Sequenz von gp100-c1-cDNA zeigte die Gegenwart eines Introns (102 bp) genau auf der Position des 21-bp-Einschubs in Pmel17-cDNA (1). Die Exon/Intron-Grenzen passen gut zu den Consensus-5'-Donor- und -3'-akzeptor-Spleißstellensequenzen (Padgett et al., 1986). In der genomischen DNA befindet sich die Sequenz, die die zusätzlichen 21 bp in Pmel17-cDNA umfasst, direkt stromaufwärts von der 3'-Spaltstelle, die zur Erzeugung von gp100-RNA verwendet wird, und ihr voraus geht eine alternative 3'-Akzeptor-Spleißstelle (1). Während die gp100-spezifische 3'-Akzeptor-Spleißstelle zu der Consensussequenz passt, scheint die Pmel17-spezifische 3'-Akzeptor-Spleißstelle insofern suboptimal zu sein, als ihr ein pyrimidinreicher Bereich fehlt (1). Suboptimale RNA-Prozessierungsstellen befinden sich in vielen alternativ prozessierten Messenger-RNA-Vorläufern und wurden mit einer Funktion bei der Regulierung der alternativen RNA-Prozessierung in Verbindung gebracht (siehe Übersicht von Green, 1991). Zusammen genommen beweisen diese Daten, dass die Transcripte, die gp100- und Pmel17-cDNAs entsprechen, durch alternatives Spleißen eines einzigen Primärtranscripts erzeugt werden und somit von einem einzigen Gen stammen.
Expression von gp100- und Pmel17-RNA in Zellen der melanocytischen Linie
Das Ergebnis, dass gp100- und Pmel17-RNA durch alternatives Spleißen eines einzigen Primärtranscripts entstehen, wirft die Frage auf, ob dies in einer entwicklungsmäßig regulierten Weise erfolgt. Eine RNA-Spezies von 2,5 kb ist das Haupt-RNA-Produkt, das auf Northern-Blots, die aus melanocytischen Zellen isolierte RNA enthalten, durch gp100-cDNA nachgewiesen wird. Dieselben Ergebnisse wurden von Kwon et al. (1987) unter Verwendung von Pmel17-1-cDNA als Sonde erhalten. Keine der beiden Sonden diskriminiert jedoch zwischen gp100- und Pmel17-RNA. Um die Expression von gp100- und Pmel17-RNA in Zellen der melanocytischen Linie zu untersuchen, führten wir einen RT/PCR-Assay (Reverse Transcriptase/Polymerase-Kettenreaktion) mit anschließendem Southern-Blotting und Hybridisierung mit entweder einer gp100-spezifischen Exon/Exon-Verknüpfungs- oder einer Pmel17-spezifischen Oligonucleotidsonde durch (siehe Abschnitt "Materialien und Verfahren"). Gp100- und Pmel17-Spleißprodukte werden beide in 3 von 4 Hautmelanomzellen, in Uveamelanomzellen sowie in Neugeborenen- und Erwachsenen-Melanocyten nachgewiesen. In gp100-negativen BLM-Melanomzellen werden mit keiner der beiden Sonden Produkte nachgewiesen. Diese Ergebnisse zeigen, dass gp100 und Pmel17 bei allen untersuchten melanocytischen Zellen gleichzeitig exprimiert werden.
Beispiel 2 – Erkennung von gp100 durch TILs
Material und Verfahren
Zellkultur
TILs wurden durch Züchten von Einzelzellsuspensionen von metastasierenden Melanomen mit 1000 E/ml IL-2 (Cetus Corp., Emeryville, CA) erzeugt und gemäß einer früheren Beschreibung (Kawakami, 1992) gezüchtet. Die Melanomzelllinien Mel 397 und Mel 624 wurden gemäß einem früheren Bericht (Kawakami, 1992) erhalten und gezüchtet. Die HLA-A2.1-positiven Melanomzelllinien MeWo (Bean, 1975) und BIM (Katano, 1984) sowie murine P815-Transfektanten wurden in DMEM (Gibco, Paisley, Schottland, UK) plus 7,5% hitzeinaktiviertem FCS (Gibco) gezüchtet. JY, K562 und murine EL4-Transfektanten wurden in Iscoves Medium (Gibco) plus 7,5% FCS kultiviert. Murine Zellen wurden in Gegenwart von 5·10⁵ M β-ME gezüchtet, und alle Medien enthielten Antibiotika. Die Isolierung von normalen Melanocyten aus Vorhaut wurde nach dem Verfahren von Eisinger und Marko (1982) mit Modifikationen gemäß einer früheren Beschreibung (Smit, 1989) durchgeführt. Melanocyten aus den Passagen zwei bis drei wurden in Chromfreisetzungsassays verwendet.
DNA-Konstrukte und Transfektion
Das Plasmid pBJ1gp100neo wurde erhalten, indem man das EcoRI-Fragment eines lambda-gp100-cDNA-Klons in codierender Orientierung in den Polylinker pBJ1-neo (Lin, 1990) einklonierte. Das Plasmid pBA2, das ein genomisches Fragment enthält, welches HLA-A2.1 und humanes β-2-Mikroglobulin codiert, wurde freundlicherweise von E. J. Baas (The Netherlands Cancer Institute, Division of Biochemistry, Amsterdam, Niederlande) zur Verfügung gestellt. Das Plasmid pGK-hyg enthält das Hygromycin-Phosphotransferase-Gen (Te Riele, 1990). Für die Einführung des HLA-A2.1- und des Human-β-2-Mikroglobulin-Gens wurden EL4-Zellen nach dem Calciumphosphat-Copräzipitationsverfahren (Graham, 1973) mit 18 μg pBA2 und 2 μg pGK-hyg-DNA transfiziert, wobei man Calcium Phosphate Transfec tion Systems (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) verwendete. 24 h nach der Transfektion wurde 500 μg/ml Hygromycin B (Calbiochem-Novabiochem Corp., La Jolla, CA) zu dem Medium gegeben, um stabile Transfektanten zu selektieren. HLA-A2.1-positive gp100-positive EL4-Zellen wurden durch Transfektion von stabilen HLA-A2.1-positiven EL4-Klonen mit 20 μg pBJ1-gp100neo-DNA durch Calciumphosphat-Copräzipitation erhalten und mit 1 mg/ml G418 selektiert. P815-A2.1- und P815-A2.1/gp100-Zellen wurden freundlicherweise von P. Coulie (Ludwig Ins., Brüssel, Belgien) zur Verfügung gestellt.
Monoklonale Antikörper und Durchflusscytometrie
Eine Phänotyp-Analyse von Melanomen, Transfektanten und normalen Melanocyten wurde durch indirekte Immunfluoreszenz und anschließende Durchflusscytometrie unter Verwendung eines FACScan^® (Becton Dickinson & Co., Mountain View, CA) durchgeführt. Der gereinigte monoklonale Anti-gp100-Antikörper NKI-beteb (Vennegoor, 1988) und die monoklonalen Anti-HLA-A2-Antikörper BB7.2 (Kulturüberstand; Parham, 1981) und MA2.1 (Ascites 1:500-Verdünnung; Parham, 1978) wurden als primäre Reagentien verwendet. FITC-konjugiertes GAM-IgG-F(ab')₂ (Zymed Laboratories, Inc., South San Francisco, CA) wurde für die zweite Inkubation verwendet. Für den Nachweis des intrazellulären gp100-Antigens wurden Zellen in 0,01% Digitonin permeabilisiert und anschließend in 1% Paraformaldehyd fixiert.
Chromfreisetzungsassay
Chromfreisetzungsassays wurden gemäß einer früheren Beschreibung (Kawakami, 1992) durchgeführt. Kurz gesagt, 10⁶ Targetzellen wurden 1 Stunde lang mit 100 μCi Na⁵¹CrO₄ (Amersham Int., Bucks, UK) inkubiert. Dann wurden verschiedene Mengen von Effektorzellen zu 2·10³ Targetzellen in dreifachen Parallelansätzen in Näpfe von U-Boden-Mikrotiterplatten (Costar, Badhoevedorp, Niederlande) in einem endgültigen Volumen von 150 μl gegeben. Nach 5 Stunden Inkubation wurde ein Teil des Überstands geerntet, und sein Gehalt an Radioaktivität wurde gemessen. Vor der Verwendung in Chromfreisetzungsassays wurden die Targetzel len 48 Stunden lang mit 50 E/ml humanem (Boehringer, Ingelheim, Deutschland) oder murinem rekombinantem IFN-(TNO, Rijswijk, Niederlande) inkubiert.
TIL 1200
Auf der Suche nach gp100-spezifischen cytotoxischen T-Lymphocyten (CTLs) konzentrierten wir uns auf HLA-A2.1 als Restriktionselement wegen seines weitverbreiteten Vorkommens bei Menschen europäischer Abstammung und seiner vermuteten dominanten Rolle in der CTL-Reaktivität gegen Melanome. Für diese Studie wurde eine HLA-A2.1-positive TIL-Linie, TIL 1200 (J. Shilyansky et al., 1994), verwendet. Diese TIL-Linie exprimiert TCR α/β, CD3 und CD8.
Ergebnisse
HLA-A2.1-restringiertes Abtöten von Melanom-Tumorzellen durch TIL 1200 entspricht gp100-Expression.
Die cytolytische Aktivität von TIL 1200 wurde analysiert, wobei man ein Panel von humanen Melanomzelllinien verwendete. TIL 1200 lysierte effizient HLA-A2.1-positive Me1624- und MeWo-Melanom-Tumorzellen, die beide gp100 exprimieren, während keine Reaktivität gegenüber HLA-A2.1-negative, gp100-positive Mel397-Zellen beobachtet wurde. Es ist interessant festzustellen, dass wir beobachteten, dass HLA-A2.1-positive BLM-Melanomzellen auch gegenüber Lyse durch TIL 1200 resistent sind. Weiterhin wurden HLA-A2.1-positive EBV-transformierte B-Zellen (JY), denen auch die gp100-Expression fehlt, und K562-Zellen nicht von TIL 1200 lysiert. Zusammen zeigen diese Daten, dass TIL 1200 ein HLA-A2.1-restringiertes Abtöten zeigt, das mit der gp100-Expression korreliert.
TIL 1200 erkennt HLA-A2.1-positive, gp100-positive Transfektanten
EL4-Zellen, die mit einem genomischen Fragment, das HLA-A2.1 codiert, zusammen mit einem Plasmid, das Hygromycin-Resistenz verleiht, cotransfiziert worden waren, wurden selektiert und mit Durchflusscytometrie analysiert. HLA-A2.1-exprimierende Zellen wurden anschließend mit pBJ1-gp100neo transfiziert, das gp100 codiert und Resistenz gegen G418 verleiht. Stabile Transfektanten wurden selektiert und einem Screening auf gp100-Expression unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers NKI/beteb unterzogen. In Zusammenarbeit mit P. Coulie wurde ein ähnliches Panel von Transfektanten in murinen P815-Zellen (P815 A2.1 und p815 A2.1/gp100) erzeugt. Unter Verwendung dieser murinen Transfektanten als Targetzellen in einem Chromfreisetzungsassay beobachteten wir eindeutig eine gp100-spezifische Lyse durch TIL 1200. Die prozentuale spezifische Lyse (25–35%, E/T 30:1) von murinen EL4-A2.1/gp100- und P815-A2.1/gp100-Transfektanten durch TIL 1200 war etwas geringer als diejenige, die man bei HLA-A2.1-positiven, gp100-positiven humanen Melanomzellen beobachtete (45–60%, E/T 30:1). Dieser Unterschied kann durch nichtpassende akzessorische Moleküle zwischen humanen TILs und murinen Transfektanten erklärt werden. Um dies zu überwinden, führten wir das gp100-Antigen durch Transfektion von pBJ1-gp100neo in humane HLA-A2.1-positive, gp100-negative BLM-Melanomzellen ein. Stabile BLM-gp100-Klone wurden in Chromfreisetzungsassays unter Verwendung von TIL 1200 getestet. BLM-gp100-Klone erwiesen sich als genauso empfindlich gegenüber Lyse durch TIL 1200 wie Mel624- und MeWo-Zellen, die das gp100-Antigen endogen exprimieren. Die gp100-Spezifität von TIL 1200 wurde weiterhin durch die fehlende Lyse von G418-resistenten BLM-Zellen, die kein gp100 exprimieren, bewiesen, was die Möglichkeit ausschließt, dass von Neomycin abgeleitete Peptide erkannt werden.
Beispiel 3
Kartierung von gp100-Epitopen, die von TIL 1200 erkannt werden, unter Verwendung von gp100-Deletionsmutanten
Grundsätzlich werden in der Technik gewöhnlich zwei Verfahren verwendet, um von Anti-Tumor-CTL erkannte Epitope zu kartieren.

1. Gemäß den HLA-Bindungsmotiven können Peptide synthetisiert werden, die im Targetprotein enthalten sind. Diese Peptide können dann auf Zellen, die das geeignete Restriktionselement tragen, geladen und als Targets für CTL verwendet werden.
2. Erzeugung von Deletionsmutanten und Expression dieser Deletionsmutanten zum Beispiel in COS-7-Zellen zusammen mit dem geeigneten Restriktionselement. Diese transfizierten Zellen werden dann mit CTL cokultiviert, und die Lyse der Targetzellen oder die TNF-α/IFNγ-Erzeugung durch die CTL werden gemessen. Transfektanten, die von CTL nicht erkannt werden, exprimieren das Peptid nicht.

Auf der Suche nach den Epitopen der Erfindung wurden beide Verfahren angewendet.
TIL-1200-vermittelte Lyse von peptidbeladenen T2-Zellen
Wir haben gp100-Peptide, die potentiell von TIL 1200 erkannt werden, chemisch synthetisiert. Die Peptide wurden mit einer Festphasenstrategie auf einem automatischen multiplen Peptidsynthesizer (Abimed AMS 422) unter Verwendung von Fmoc-Chemie (Nijman, 1993) synthetisiert. Die tatsächliche Bindung der Peptide an HLA-A2.1 wurde mit einem vor kurzem beschriebenen Peptidbindungsassay festgestellt, der sich die Verarbeitung von defekten T2-Zellen zunutze macht (Nijman, 1993). Diese Analyse führte zur Identifizierung von gp-100-abgeleiteten Peptiden, die stark an HLA-A2.1 binden. Anschließend wurden T2-Zellen, die mit den Peptiden, die stark an HLA-A2.1 binden, beladen waren, einer Lyse durch TIL 1200 unterzogen, wobei man einen Standard-Chromfreisetzungsassay verwendete. Auf diese Weise wurde das Peptid L-L-D-G-T-A-T-L-R-L gemäß diesem Verfahren identifiziert.
Beispiel 4
Durch Deletionskartierung identifiziertes gp100-Epitop
Gp100-cDNA wurde in die Expressionsvektoren pBJ1neo, pCMVneo (Baker et al., 1990) und pSVL eingesetzt. Für die Erzeugung einer gp100-cDNA, der die codierenden Sequenzen für das Peptid 457-466 fehlen, wurden PCR-Reaktionen mit den folgenden Kombinationen von Oligonucleotiden durchgeführt:
5'-CATGGAAGTGACTGTCTACC-3'/
5'-CTGAGCGAATTCGGAACCTGTAATACTTTCCG-3' und
5'-CTGAGCGAATTCGTGAAGAGACAAGTCCCCC-3'/
5'-TCACAGCATCATATGAGAGTAC-3', wobei man die gp100-cDNA in voller Länge als Matrize verwendete. PCR-Produkte wurden mit EcoRI verdaut, ligasiert und dienten als Matrize für ein Nested-PCR unter Verwendung der folgenden Primer: 5'-GCACAGGCCAACTGCAGA-3'/5'-TTCAGTATCTGGTGCAGAAC-3'. Das KpnI-ClaI-Fragment aus diesem PCR-Produkt wurde dann gegen das entsprechende Fragment in pCMVgp100neo ausgetauscht, wobei pCMVgp100DEL454-481neo entstand. Die gp100-cDNA-Mutanten DEL149-654 und DEL454-654 wurden durch Deletion des 1,7-kb-HindIII-Fragments bzw. des 0,8-kb-EcoRI-Fragments aus pCMVgp100DEL454-481neo erhalten. Die gp100-cDNA-Mutanten DEL100-654, DEL194-528 und DEL167-508 wurden durch Deletion des BglI-SacI-, BamhHI-BglII- bzw. ApaI-NsiI-Fragments aus pSVLgp100 erhalten.
BLM-Zellen wurden gemäß dem Calciumphosphat-Copräzipitationsverfahren (Graham und van der Eb, 1973) mit 20 μg pCMVgp100DEL454-481neo-DNA transfiziert, wobei man Calcium Phosphate Transfection Systems (BRL, Gaithersburg, MD) verwendete, und mit 1 mg/ml G418 (Gibco, Paisley, Schottland, UK) selektiert.
COS-7-Zellen wurden mit 5 μg pBJ1HLA-A2.1neo und 5 μg pBJ1- oder pSVL-Plasmid, die gp100-cDNAs entweder in voller Länge oder deletiert enthielten, cotransfiziert, wobei man das DEAE-Dextran/Chloroquin-Verfahren (Seed und Aruffo, 1987) verwendete. Nach 48 Stunden Transfektion wurden COS-7-Zellen als Stimulatorzellen in IFN-γ-Freisetzungsexperimenten verwendet.
Freisetzungsassays
Chromfreisetzungsassays wurden wie in Beispiel 2 durchgeführt.
Für einen IFN-Freisetzungsassay wurden 105 auf TIL 1200 ansprechende Zellen zusammen mit 5·104 transient transfizierten COS-7-Stimulatorzellen in 300 μl Medium in Gegenwart von 100 E/ml IL-2 in einer Flachboden-96-Napf-Mikro titerplatte inkubiert. Nach 24 Stunden Inkubation wurden 100 μl Überstand geerntet und einem Screening auf Anwesenheit von IFN-γ unterzogen, wobei man einen hIFN-γ-IRMA-Immunoradiometrie-Assaykit (megenix Diagnostics SA, Fleurus, Belgien) verwendete.
Ergebnisse
3A zeigt die gp100-cDNA-Deletionsmutanten, die erzeugt wurden. Wie in 3B gezeigt ist, sezernierten TIL 1200 spezifisch IFN-γ, wenn sie mit COS-7-Zellen stimuliert wurden, welche mit HLA-A2.1 und der gp100-cDNA in voller Länge transfiziert wurden. Wiederum wurde TIL-1200-Reaktivität gegen den gp100DEL454-481-Mutanten beobachtet. Von den anderen gp100-Deletionsmutanten wurden nur das DEL100-661- und das DEL149-661-Konstrukt nicht erkannt, wodurch die Möglichkeit ausgeschlossen ist, dass TIL 1200 gegenüber einem Peptid reaktiv war, das sich in N-terminaler Richtung von der Aminosäureposition 148 im gp100-Protein befindet. Außerdem konnte der C-terminale Bereich des gp100-Proteins ausgeschlossen werden, da TIL-1200-Reaktivität beobachtet werden konnte, wenn man ein mutantes Konstrukt, DEL454-661, verwendete, das die ersten 453 Aminosäuren von gp100 codierte. Aus der Beobachtung, dass ein Konstrukt, das innerhalb dieses N-terminalen Bereichs bis zu Aminosäure 166 codiert, in der Lage war, TIL 1200 zu stimulieren (DEL167-508), wurde geschlossen, dass sich das erkannte Epitop zwischen den Aminosäuren 148-166 des gp100-Proteins befand.
HLA-A2.1-Bindung
Für Nonamer- oder Dekamer-Peptide, die an HLA-A2.1 binden, wurden mehrere Motive beschrieben (Falk et al., 1991; Hunt et al., 1992; Ruppert et al., 1993), die von natürlich verarbeiteten und synthetischen HLA-A2.1-bindenden Peptiden abgeleitet sind. Der 148-166-Bereich des gp100-Proteins wurde einem Screening gegen diese Motive unterzogen, und mehrere Peptide wurden synthetisiert, die in ein etwas breiteres Motiv passten, das Threoninreste auf Position zwei mit einschloss. Diese Peptide wurden auf HLA-A2.1-positive T2-Zellen geladen und auf ihre Fähigkeit getestet, eine TIL-1200-vermittelte Lyse von Targetzellen zu induzieren (4A). Die fünf getesteten Peptide waren alle in der Lage, T2-Zellen für eine Lyse durch TIL 1200 zu sensibilisieren, wenn sie in einer Konzentration von 10 μg/ml verwendet wurden. Alle diese Peptide enthalten das Octamerpeptid TWGQYWQV, das den gp100-Aminosäuren 155-162 entsprach. Alle Peptide wurden titriert, um ihre relative Fähigkeit zu bewerten, T2-Targetzellen für die Lyse durch TIL 1200 zu sensibilisieren. 4B zeigt, dass das Nonamerpeptid KTWGQYWQV von TIL 1200 erkannt werden kann, wenn es in einer Konzentration von 3 ng/ml angewendet wird, während die anderen Peptide in höheren Konzentrationen angewendet werden mussten.
Ein Vergleich der Peptide KTWGQYWQV (gp100-Aminosäuren 155-162), LLDGTATLRL (gp100-Aminosäuren 457-466) und YLEPGPVTA (gp100-Aminosäuren 280-288, identifiziert von Cox et al., 1994) mit drei bekannten viralen Epitopen, die in HLA-A2.1 präsentiert werden, wurde angestellt: dem Influenzamatrix-58-66-Peptid (Gotch et al., 1987), dem HIV-Polymerase-510-518-Peptid (Tsomides et al., 1991) und dem HIV-gp120-197-205-Peptid (Dadaglio et al., 1991). Die HLA-A2.1-Bindungskapazität der oben genannten Epitope wurde mittels eines indirekten Bindungsassays unter Verwendung der verarbeitungsdefekten Zelllinie T2 (Nijman et al., 1993) analysiert. Kurz gesagt: T2-Zellen wurden mit 12,5 μg der Epitope inkubiert. Die HLA-A2.1-Stabilisierung an der Zelloberfläche wurde mit Durchflusscytometrie unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers BB7.2 bestimmt. Der Fluoreszenzindex wird ausgedrückt als experimentelle mittlere Fluoreszenz, dividiert durch die mittlere Fluoreszenz, die erhalten wird, wenn T2-Zellen mit einem HLA-A2.1-nichtbindenden Peptid in einer ähnlichen Konzentration inkubiert werden.
Unter Verwendung dieses Assays wurde eine ähnliche HL-A2.1-Stabilisierung mit dem gp100-280-288-Epitop und den getesteten viralen Epitopen beobachtet. Beide Epitope der Erfindung (KTWGQYWQV und LLDGTATLRL) binden mit einer etwas geringeren Affinität an HLA-A2.1 (5). Daraus wird geschlossen, dass die gp100-Epitope mit verschiedenen Affinitäten an HLA-A2.1 binden.

Claims

Immunogenes Peptidfragment des Melanom-assoziierten Antigens von SEQ ID NR. 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Fragment eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus L-L-D-G-T-A-T-L-R-L, T-W-G-Q-Y-W-Q-V, V-W-K-T-W-G-Q-Y-W-Q-V, K-T-W-G-Q-Y-W-Q-V-L, K-T-W-G-Q-Y-W-Q-V und T-W-G-Q-Y-W-Q-V-L besteht, wobei das immunogene Peptid die Lyse von Zielzellen durch tumorinfiltrierende Lymphocyten induzieren kann.
Immunogenes Peptidfragment gemäß Anspruch 1, das eine Deletion, eine Substitution, eine Inversion und/oder eine Addition umfasst, wobei die Addition eine Addition von Sequenzen ist, mit denen das Fragment nicht natürlicherweise verbunden ist.
Immunogenes Peptidfragment gemäß Anspruch 2, wobei die Substitution aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Substitutionen Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn und Ile/Val besteht.
Immunogenes Peptidfragment gemäß einem der Ansprüche 1–3, wobei das immonogene Peptid ein Salz des Peptids, ein Amid des Peptids, einen Ester des Peptids, ein N-Acyl-Derivat des Peptids oder ein N-Acetyl-Derivat des Peptids umfasst.
Immunogenes Peptidfragment gemäß Anspruch 4, wobei das Amid des Peptids ein C-terminales Amid umfasst.
Immunogenes Peptidfragment gemäß Anspruch 4, wobei der Ester des Peptids einen C-terminalen Ester umfasst.
Immunogenes Peptidfragment gemäß Anspruch 4, wobei das N-Acyl-Derivat des Peptids ein N-terminales Acyl-Derivat umfasst.
Nukleinsäuresequenz, die ein immunogenes Peptidfragment gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 kodiert.
Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Nukleotidsequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Sequenzen SEQ ID NR: 3, 7 und 9 besteht.
Klonierungsvektor, der die Nukleinsäuresequenz von Anspruch 8 oder 9 umfasst.
Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit dem Klonierungsvektor gemäß Anspruch 10 transfiziert oder transformiert ist und vorzugsweise mit einem Klonierungsvektor, der die für ein MHC-Klasse-I-Allel kodierende Nukleotidsequenz umfasst, cotransfiziert ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Mäuse-EL4- und -P8.15-Zellen und humanen BLM-Zellen besteht.
Wirtszelle gemäß Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine antigenpräsentierende Zelle ist.
Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass sie auch costimulierende Moleküle erzeugt.
Impfstoff, dadurch gekennzeichnet, dass er ein immonogenes Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 umfasst.
Impfstoff gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel gemischt ist.
Impfstoff gemäß Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass er eine antigenpräsentierende Zelle umfasst, die mit dem Peptid vorbeladen wurde.
Impfstoff, dadurch gekennzeichnet, dass er Wirtszellen gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14 ufmasst.
Impfstoff, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Nukleinsäure umfasst, die ein immunogenes Peptidfragment des Melanom-assoziierten Antigens von SEQ ID NR. 2 kodiert, dadurch gekennzeichnet, dass das Fragment eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus T-W-G-Q-Y-W-Q-V, V-W-K-T-W-G-Q-Y-W-Q-V, K-T-W-G-Q-Y-W-Q-V-L, K-T-W-G-Q-Y-W-Q-V und T-W-G-Q-Y-W-Q-V-L besteht, wobei das immunogene Peptid die Lyse von Zielzellen durch tumorinfiltrierende Lymphocyten induzieren kann.
Impfstoff gemäß einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass er auch eine oder mehrere Verbindungen umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus einem Adjuvans, einem oder mehreren Cytokinen, Antikörpern, die gegen CD2, CD3, CD27, CD28 oder andere T-Zellen-Oberflächenantigene gerichtet sind, und Helferepitopen zur Stimulation von CD4-positiven oder CD8-positiven T-Zellen besteht.
Verfahren zur Erzeugung von antigenreaktiven tumorinfiltrierenden Lymphocyten, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst: a. Kultivieren von tumorinfiltrierenden Lymphocyten, die in einer Melanomprobe vorhanden sind; b. Isolieren der tumorinfiltrierenden Lymphocyten aus der Probe; c. Umsetzen der Lymphocyten mit einem immunogenen Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7; und d. Isolieren der Lymphocyten, die an das Antigen binden.
Konjugat aus einem Peptid und einem nachweisbaren Marker, dadurch gekennzeichnet, dass das immonogene Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 verwendet wird.
Konjugat gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass der nachweisbare Marker ein Radionukleotid ist.