DE60030141T2

DE60030141T2 - Isolierte mhc-klasse ii-bindende peptide, und deren verwendung

Info

Publication number: DE60030141T2
Application number: DE60030141T
Authority: DE
Inventors: Ozlem Tureci; Ugur Sahin; Michael Pfreundschuh
Original assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Ludwig Institute for Cancer Research New York
Current assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Ludwig Institute for Cancer Research New York
Priority date: 1999-09-29
Filing date: 2000-09-26
Publication date: 2007-08-09
Anticipated expiration: 2020-09-27
Also published as: WO2001023560A2; ATE336579T1; EP1220908B1; US20040214284A1; WO2001023560A3; US6800730B1; US7385044B2; AU7615900A; DE60030141D1; EP1220908A2

Description

Verwandte Anmeldungen
Diese Anmeldung ist eine Continuation-in-part von S. N. 09/165.546, eingereicht am 2. Oktober 1998, und S. N. 09/344.040, eingereicht am 25. Juni 1999, die hierin durch Verweis aufgenommen sind.
Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft HLA-Bindungspeptide, die von einem Antigen abstammen, das mit Krebs assoziiert ist. Diese Peptide binden sich an Klasse-II-MHC-Moleküle.
Hintergrund und Stand der Technik
Es ist durchwegs anerkannt, dass zahlreiche pathologische Leiden, wie z.B. Infektionen, Krebs, Autoimmunerkrankungen und dergleichen, durch ungeeignete Expression bestimmter Moleküle gekennzeichnet sind. Diese Moleküle dienen somit als "Marker" für bestimmte pathologische oder abnormale Zustände. Abgesehen von ihrer Verwendung als Diagnose-"Targets", d.h. als Materialien, die es zu identifizieren gilt, um diese abnormalen Zustände zu diagnostizieren, dienen die Moleküle als Reagenzien, die verwendet werden können, um diagnostische und/oder therapeutische Mittel zu entwickeln. Ein keineswegs einschränkendes Beispiel hierfür ist die Verwendung von Krebsmarkern, um Antikörper zu bilden, die für einen bestimmten Marker spezifisch sind. Wiederum ein anderes, nicht einschränkendes Beispiel ist die Verwendung eines Peptids, das mit einem MHC-Molekül Komplexe bildet, um zytolytische T-Zellen gegen abnormale Zellen zu bilden.
Die Herstellung solcher Materialien setzt natürlich eine Quelle für die Reagenzien voraus, die verwendet werden, um diese zu bilden. Die Reinigung aus Zellen ist ein arbeitsaufwändiges und keineswegs sicheres Verfahren hierfür. Ein anderes, bevorzugtes Verfahren ist die Isolierung von Nucleinsäuremolekülen, die für einen bestimmten Marker kodieren, gefolgt von der Verwendung des isolierten kodierenden Moleküls, um das gewünschte Molekül zu exprimieren.
Bis heute wurden zwei Vorgehensweisen zur Detektion solcher Antigene, z.B. in menschlichen Tumoren, verwendet. Diese werden als genetischer Ansatz und biochemischer Ansatz bezeichnet. Der genetische Ansatz wird z.B. von dePlaen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2275 (1988), hierin durch Verweis aufgenommen, dargestellt. In diesem Ansatz werden mehrere hundert Pools von Plasmiden einer cDNA-Bibliothek, die aus einem Tumor gewonnen wurde, in Rezipientenzellen wie z.B. COS-Zellen oder in Antigen-negative Varianten von Tumorzelllinien, die auf die Expression des spezifischen Antigens getestet werden, transfiziert. Der biochemische Ansatz, der z.B. von O. Mandelboim et al., Nature 369, 69 (1994), beschrieben wird, basiert auf Säureelution von Peptiden, die sich an MHC-Klasse-I-Moleküle von Tumorzellen gebunden hatten, gefolgt von Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC). Antigene Peptide werden identifiziert, nachdem sie sich an leere MHC-Klasse-I-Moleküle von mutierten Zelllinien binden, die bezüglich Antigen-Verarbeitung defektiv sind, und spezifische Reaktionen mit zytotoxischen T-Lymphozyten induzieren. Diese Reaktionen umfassen die Induktion von CTL-Proliferation, TNF-Freisetzung und Lyse von Targetzellen, die in einem MTT-Test oder einem ⁵¹Cr-Release-Assay messbar sind.
Diese zwei Ansätze zur molekularen Definition von Antigenen haben die folgenden Nachteile: Erstens sind sie äußerst mühsam, zeitaufwendig und kostspielig; und zweitens hängen sie von der Erstellung zytotoxischer T-Zelllinien (CTLs) mit vorgegebener Spezifität ab.
Die den zwei bekannten Ansätzen zur Identifikation und molekularen Definition von Antigenen innewohnenden Probleme werden am besten durch die Tatsache aufgezeigt, dass beide Verfahren bisher zur erfolgreichen Definition von nur sehr wenigen neuen Antigenen in menschlichen Tumoren führten. Siehe z.B. van der Bruggen et al., Science 254, 1643–1647 (1991); Brichard et al., J. Exp. Med. 178, 489–495 (1993); Coulie et al., J. Exp. Med. 180, 35–42 (1994); Kawakami et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3515–3519 (1994).
Darüber hinaus hängen die beschriebenen Verfahren von der Verfügbarkeit von erstellten, permanenten Zelllinien des betreffenden Krebstyps ab. Es ist sehr schwierig, Zelllinien bestimmter Krebstypen zu erstellen, wie z.B. von Oettgen et al., Immunol. Allerg. Clin. North. Am. 10, 607–637 (1990), gezeigt wird. Es ist auch bekannt, dass manche Epithelzelltyp-Krebsarten in vitro gegenüber CTLs nur wenig empfindlich sind, was eine Routineanalyse ausschließt. Diese Probleme motivierten Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung, zusätzliche Methoden zur Identifikation von Krebsassoziierten Antigenen zu entwickeln.
Ein Schlüsselverfahren wird von Sahin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11810–11913 (1995), beschrieben. Siehe auch das US-Patent Nr. 5.698.396 und die Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/479.328, eingereicht am 3. Januar 1996. Zusammenfassend gesagt umfasst das Verfahren die Expression von cDNA-Bibliotheken in einem prokaryotischen Wirt. (Die Bibliotheken werden aus einer Tumorprobe gewonnen.) Die exprimierten Bibliotheken werden dann mit absorbierten und verdünnten Seren immungescreent, um jene Antigene zu detektieren, die humorale Antworten mit hohem Titer hervorrufen. Dieses Verfahren ist als SEREX-Verfahren bekannt ("Serological identification of antigens by Recombinant Expression Cloning"). Das Verfahren wurde eingesetzt, um Expression von davor identifizierten, Tumorassoziierten Antigenen zu bestätigen sowie um neue zu detektieren. Siehe die oben angeführten Patentanmeldungen und Sahin et al., s. o., sowie Crew et al., EMBO J. 144, 2333–2340 (1995).
Das SEREX-Verfahren wurde in einigen Fällen verwendet, um Krebs-assoziierte Antigene zu identifizieren. Siehe z.B. PCT/US 99/06875, in dem ein Krebs-assoziiertes Antigen beschrieben wird, von dem herausgefunden wurde, dass es unter anderem von Ösophaguskarzinomen und Melanomen exprimiert wird. Dieses Antigen wird als NY-ESO-1 bezeichnet. Siehe U.S.-Patent Nr. 5.804.381 sowie Chen et al., Proc. Natl. Acad Sci USA 92, 8125–8129 (1995). Zusätzlich wurde unter Anwendung dieses Verfahrens eine Familie verwandter Antigene, die "SSX"-Familie, identifiziert. Siehe PCT/US 99/14493 sowie Seriennummer 09/105.839, eingereicht am 26. Juni 1998, diesbezüglich.
Nach der Identifikation von Molekülen voller Länge als Krebs-assoziierte Antigene war der nächste Schritt die Identifikation jener Abschnitte der Antigene, die als Bindungspartner für MHC- oder HLA-Moleküle relevant sind. Die resultierenden Komplexe dienen als Targets für die Identifikation durch T-Zellen, die dann proliferieren und jene Zellen, die solche Komplexe aufweisen, eliminierten.
Frühe Forschungsarbeiten fokussierten sich auf die Identifikation jener Peptidmoleküle, die sich an Klasse-I-Moleküle binden und die Proliferation von CD8⁺-T-Zellen stimulieren. Siehe z.B. U.S.-Patent Nr. 5.925.729, worin dies für eine Antigenfamilie aufgezeigt wird. Siehe ebenso PCT/US 99/06875 sowie PCT/US 99/14493 für weitere Arbeiten über die Identifikation von Peptiden, die sich an MHC-Moleküle binden.
Die Gegenwart von Antikörpern gegen ein bestimmtes Molekül legt nahe, dass ein anderes Verfahren als eine Präsentation durch MHC-Klasse-I-Moleküle involviert ist. In PCT/US 99/06875, s. o., wird belegt, dass das NY-ESO-1-Molekül zu Peptiden verarbeitet wird, die von MHC-Klasse-II-Molekülen präsentiert werden.
Diese Forschungsarbeiten wurden fortgesetzt. Die folgende Offenbarung zeigt, dass zusätzliche Peptide identifiziert wurden, die sich an MHC-Klasse-II-Moleküle binden und die Proliferation von CD4⁺-T-Zellen stimulieren. Diese Peptide stammen sowohl von NY-ESO-1 als auch von SSX-2 ab. Dieses und andere Merkmale der Erfindung werden in der folgenden Offenbarung dargelegt.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein isoliertes Polypeptid bereit, das sich an MHC-Klasse-II-HLA-DR-Moleküle bindet und 14 bis 16 Aminosäuren enthält, worin die Aminosäuresequenz des Polypeptids eine Aminosäuresequenz umfasst, die in einem Tumor-Abstoßungs-Antigenvorläufer gefunden wurde, und worin das isolierte Polypeptid die Seq.-ID Nr. 31 oder 32 aufweist.
Der Tumor-Abstoßungs-Antigenvorläufer ist vorzugsweise NY-ESO-1.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt das Expressionsmuster von RNA für das NY-ESO-1-Antigen in verschiedenen Gewebetypen.
2 zeigt Northern-Blot-Analyse von NY-ESO-1-mRNA, die in Hoden und der Zelllinie SK-MEL-19, jedoch nicht in verschiedenen anderen Zell- und Gewebeproben, gefunden wurde.
3 zeigt potenzielle Stellen für die Modifikation der abgeleiteten Aminosäuresequenz von NY-ESO-1.
4 ist ein Diagramm der Hydrophilie von NY-ESO-1, das hydrophile Domänen im Aminoterminus und einen langen, hydrophoben Abschnitt in der Nähe des Carboxyl-Endes zeigt.
5 zeigt die Resultate von CTL-Lyse-Untersuchungen unter Verwendung verschiedener Zellen, die HLA-A2-positiv, NY-ESO-1-positiv, positiv bezüglich beider oder positiv bezüglich keines der beiden sind.
6 stellt Daten dar, die zeigen, dass HLA-A2 das präsentierende Molekül zur Präsentation von von Seq.-ID Nr. 1 abgeleiteten Peptiden ist.
Detaillierte Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen
Beispiel 1
Gesamt-RNA wurde aus einem schockgefrorenen Muster von gut bis mäßig differenziertem Plattenepithelkarzinom der Speiseröhre unter Verwendung von durchwegs bekannten Verfahren extrahiert. Siehe z.B. Chomzynski, J. Analyt. Biochem. 162, 156–159 (1987), für ein Beispiel eines solchen Verfahrens. Diese RNA wurde verwendet, um eine cDNA-Bibliothek herzustellen, die dann gemäß den Anweisungen des Herstellers in λZAP-Phagenvektoren transfiziert wurde. Die λZAP-Bibliothek wurde dann in E. coli transfiziert, was 1,6 × 10⁶ Primärisolate ergab.
Anschließend wurde das SEREX-Verfahren von Sahin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11810–11813 (1995) verwendet. Kurz zusammengefasst wurde autologes Serum von Antikörpern gegen Moleküle, die für E. coli endogen sind, durch Kombinieren des Serums mit Lysaten von E. coli, das mit Phagen λZAP transfiziert war, der die cDNA-Klone aus den Speiseröhrenkrebszellen nicht enthielt, entfernt.
Das abgereicherte Serum wurde dann verdünnt und mit Nitrocellulosemembranen, die Phagenplaques enthielten, vermischt. Die Plaques wurden über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Es folge ein Waschschritt, und dann wurden die Filter mit an alkalische Phosphatase konjugierten, sekundären Ziege-Anti-Human-FCγ-Antikörpern inkubiert, und reaktive Phagenplaques wurden durch Inkubieren mit 5-Brom-4-chlorindolylphosphat und Nitroblau-Tetrazolium sichtbar gemacht. Insgesamt wurden 13 positive Klone gefunden.
Beispiel 2
Nach der Identifikation wurden die reaktiven Klone bis zur Monoklonalität über Verdünnungsklonierung und Testen mit menschlichem Serum subkloniert. Diese Klone wurden dann gereinigt, in vitro ausgeschnitten und unter Einhaltung der Anweisungen des Herstellers zu pBK-CMV-Plasmidformen umgesetzt. Die insertierte DNA wurde dann unter Verwendung von EcoRI-XbaI-Restriktionskartierung bewertet, um verschiedene Inserts zu bestimmen. Acht verschiedene Inserts im Bereich von etwa 500 bis etwa 1,3 kbp wurden identifiziert. Die Klone wurden unter Verwendung eines automatisierten ABI-PRISM-Sequenziergeräts sequenziert.
Tabelle 1 fasst die Resultate zusammen. Ein Gen war durch vier überlappende Klone vertreten, ein zweites durch drei überlappende Klone und die verbleibenden sechs nur durch einen Klon.
Eine Homologiesuche zeigte auf, dass die Klone, die als NY-ESO-2, -3, -6, -7 bezeichnet wurden, bereits bekannt waren. Siehe Elisei et al., J. Endocrin. Invest. 16, 533–540 (1993); Spritz et al., Nucl. Acids Res. 15, 10373–10391 (1987); Rabbits et al., Nature Genetics 4, 175–180 (1993); Crozat et al., Nature 363, 640–644 (1993); GenBank H18368 und D25606. Für zwei der Klone (NY-ESO-3 und NY-ESO-6) wurde bereits davor gezeigt, dass sie in verschiedenen normalen menschlichen Geweben exprimiert werden. Es wurde kein Beweis für Abstammungseinschränkung gefunden. NY-ESO-6 (cDNA) scheint der untranslatierte 3'-Abschnitt des FUS/TLS-Gens zu sein. In Versuchen, über die hierin nicht berichtet wird, erbrachten Sequenzierung und Southern-Blot-Analyse von NY-ESO-6 keinen Beweis für Translokation oder Punktmutationen im Krebs. Vier der Klone, d.h. NY-ESO-1, -4, -5 und -8, zeigten keine starke Homologie zu Sequenzen aus der durchsuchten Datenbank und wurden somit näher untersucht.
Tabelle 1. Gene, die aus einer Speiseröhrenkrebs-Bibliothek durch Immunscreening mit autologem Serum isoliert wurden
Beispiel 3
Es wurden Untersuchungen durchgeführt, um mRNA-Expression der NY-ESO-1-, -4-, -5- und -8-Klone zu bewerten. Hierzu wurden spezifische Oligonucleotidprimer für jede Sequenz entworfen, sodass cDNA-Segmente mit 300–400 bp amplifiziert werden konnten und die Primer-Schmelztemperatur im Bereich von 65–70°C lag. Reverse-Transkriptions-PCR wurde anschließend unter Verwendung von im Handel erhältlichen Materialien und Standard-Arbeitsvorschriften durchgeführt. Zahlreiche normale und Tumorzelltypen wurden getestet. Die Klone NY-ESO-4 und NY-ESO-8 kamen überall vor und wurden nicht näher untersucht. NY-ESO-5 zeigte ein hohes Expressionsniveau im ursprünglichen Tumor und im normalen Speiseröhrengewebe, was darauf schließen lässt, dass es ein Differenzierungsmarker war.
Für NY-ESO-1 wurde erkannt, dass es in Tumor-mRNA und in Hoden, jedoch nicht in normalem Kolon-, Nieren-, Leber- oder Gehirngewebe exprimiert wird. Dieses Expressionsmuster stimmt mit anderen Tumorabstoßungs-Antigenvorläufern überein.
Beispiel 4
Der oben erläuterte RT-PCR-Test wurde für NY-ESO-1 an einer viel vollständigeren Reihe von normalen und Tumorgeweben durchgeführt. Die Tabellen 2, 3 und 4 zeigen diese Resultate. Kurz zusammengefasst wurde für NY-ESO-1 erkannt, dass es in normalen Hoden- und Eierstockzellen stark exprimiert wird. Ein geringes Ausmaß an RT-PCR-Produktion wurde in normalem uterinem Myometrium und nicht im Endometrium gefunden, doch die positiven Signale waren nicht konsistent. Plattenepithel von verschiedenen Zelltypen, einschließlich normaler Speiseröhre und Haut, war auch negativ.
Wurden Tumoren von nicht verwandten Zelllinien getestet, so zeigten 2 von 11 Melanomzelllinien starke Expression, wie auch 16 von 67 Melanomproben, 6 von 33 Brustkrebsproben und 4 von 4 Blasenkrebsproben. Es wurde auch sporadische Expression in anderen Tumortypen festgestellt.
Tabelle 2: mRNA-Verteilung von NY-ESO-1 in normalen Geweben
Tabelle 3: mRNA-Verteilung von NY-ESO-1 in Melanom- und Brustkrebszelllinien:
Tabelle 4: NY-ESO-1-mRNA-Expression in verschiedenen menschlichen Tumoren mittels RT-PCR
Eine weitere Reihe von Versuchen wurde durchgeführt, um festzustellen, ob die Gegenwart von Anti-NY-ESO-1-Antikörper in Krebspatientenseren mittels ELISA bestimmt werden konnte.
Hierzu wurde rekombinantes NY-ESO-1 in einer Lösung von Beschichtungspuffer (15 mM Na₂CO₃, 30 mM NaHCO₃, pH 9,6, 0,02% NaN₃) in einer Konzentration von 1 μg/ml an Mikrowellplatten adsorbiert (10 μl Lösung pro Well) und dann über Nacht bei 4°C gehalten. Die Platten wurden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und über Nacht bei 4°C mit 10 μl/Well von 2% Rinderserumalbumin/phosphatgepufferter Kochsalzlösung blockiert. Nach dem Waschen wurden 10 μl/Well verdünntes Serum in 2% Rinderserumalbumin zu den Wells zugesetzt. Nach zwei Stunden Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Platten gewaschen, und 10 μl/Well Konjugate zwischen Ziege-Anti-Human-IgG und alkalischer Phosphatase wurden in einer Verdünnung von 1:1.500 zugesetzt. Diese Lösung wurde eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von Waschen und Zusatz einer Substratlösung für die alkalische Phosphatase (10 μl/Well). Nach 25 min bei Raumtemperatur wurden die Wells mit einem Fluoreszenzplattenleser abgelesen. Die Resultate sind in der folgenden Tabelle angeführt:
Um zu bestimmen, ob es einen Zusammenhang zwischen der Expression von mRNA für NY-ESO-1 in Tumoren und Antikörperantwort auf das NY-ESO-1-Protein gab, wurden Daten von 62 Melanom-Patienten verglichen. Alle Patienten, deren Serum mit NY-ESO-1-Protein reaktiv war (d.h. Antikörper gegen NY-ESO-1 enthielt), wiesen auch NY-ESO-1-positive Tumoren auf, während keine Patienten mit NY-ESO-1-negativen Tumoren Antikörper gegen NY-ESO-1 in ihrem Serum zeigten. Es gab einen Prozentsatz an NY-ESO-1-positiven Patienten, denen der Antikörper fehlte. Angesichts dessen, dass etwa 20–40% der Melanome NY-ESO-1 exprimierten und nur Patienten mit NY-ESO-1-positiven Tumoren Antikörper aufweisen, lassen die Daten darauf schließen, dass ein hoher Prozentsatz an Patienten mit NY-ESO-1-positiven Tumoren Antikörper gegen das Protein entwickelt, was einen breit angelegten Test nahe legen würde, der für die Diagnose und das Ansprechvermögen auf eine Behandlung nützlich wäre.
Beispiel 5
Northern-Blot-Analyse wurde anschließend durchgeführt, um die Größe des NY-ESO-1-Transkripts zu untersuchen und um Gewebeexpressionsmuster zu bestätigen. Das Verfahren von Ausubel et al., Current Protocols In Molecular Biology (John Wiley & Sons, 1995), wurde verwendet. Im Detail beschrieben wurden 20 μg von Gesamt-RNA pro Spur in einem Formamid- und Formaldehyd-hältigen Puffer gelöst, auf 65°C erhitzt und dann auf einem 1,2%igen Agarosegel mit 3% Formaldehyd getrennt, gefolgt von Transfer auf Nitrocellulosepapier. Hybridisierung wurde dann unter Verwendung einer ³²P-markierten Sonde ausgeführt, woraufhin ein Waschschritt unter hochstringenten Bedingungen erfolgte. Der abschließende Waschschritt erfolgte bei 0,1 × SSC, 0,1% SDS, 60°C, 15 min lang.
RNA aus Hoden und einer Melanomzelllinie (SK-MEL-19), die in den vorangehenden Tests für NY-ESO-1 positiv war, zeigte ein RNA-Transkript mit etwa 0,8–0,9 kb. Eine Speiseröhrenkarzinom-Probe zeigte eine Unschärfe im Bereich von 0,4–0,9 kb, was auf teilweisen Abbau hinweist. RNA aus zusätzlichen getesteten Geweben oder Zelllinien wies kein Transkript auf.
Um cDNA zu erhalten, die für das vollständige Transkript kodiert, wurde die Speiseröhren-cDNA-Bibliothek unter Verwendung von Plaque-Hybridisierung und des ursprünglichen cDNA-Klons als Hybridisierungssonde erneut gescreent. Als 3 × 10⁵ Klo ne gescreent wurden, wurden sechs positive gefunden. Die drei längsten Klone wurden sequenziert. Eine Analyse von offenen Leserastern zeigte, dass alle drei die gesamte Kodierregion und untranslatierte 5'-Regionen unterschiedlicher Größe enthielten. Der längste Klon mit einer Länge von 755 Basenpaaren (ausschließlich polyA) enthält eine 543 Basenpaare umfassende Kodierregion zusammen mit 53 untranslatierten Basen am 5'-Ende und 151 untranslatierten Basenpaaren am 3'-Ende. Siehe Seq.-ID Nr. 1 (siehe auch 3).
Der lange ORF wies darauf hin, dass die abgeleitete Sequenz von NY-ESO-1-Protein 180 Aminosäuren umfasst. Der einzelne immunopositive Klon enthielt eine Sequenz, die für 173 davon kodiert. Das daraus abgeleitete Molekulargewicht beträgt 17.995 Da.
Eine Analyse zeigt, dass es ein Übermaß an Glycinresten im N-terminalen Abschnitt (30 unter den ersten 80, 4 in den verbleibenden 100) gibt. Hydrophilie-Analyse wies darauf hin, dass es hydrophile antigene Sequenzen in der N-terminalen Hälfte des Moleküls mit alternierenden hydrophoben und hydrophilen Sequenzen gab, die mit einem langen, C-terminalen hydrophoben Schwanz (Aminosäuren 152–172), gefolgt von einem kurzen hydrophilen Schwanz, endeten. Dieses Muster lässt auf eine Transmembrandomäne schließen. Es gibt mehrere potenzielle N-Myristorylierungsstellen, 3 Phosphorylierungsstellen und keinen Hinweis auf N-Glykosylierungsstellen.
Beispiel 6
Eine Melanomzelllinie "NW-MEL-38" wurde im Jahr 1995 aus einem Patienten, der an einem malignen Melanom erkrankt war, erstellt. Serumproben, periphere Blutlymphozyten und Tumorproben wurden der Person entnommen und eingefroren, bis die hierin beschriebene Arbeit daran durchgeführt wurde. Vorausblickend, dass die Antitumor-T-Zellen-Antwort in diesem Patienten bewertet werden soll, wurde der Patient als HLA-A1 und HLA-A2 HLA-typisiert.
Um zu bestimmen, ob das Melanom aus diesem Patienten NY-ESO-1 exprimierte, wurde Gesamt-RNA sowohl aus Tumorproben als auch aus der Zelllinie NW-MEL-38 unter Verwendung von Standardverfahren isoliert. Anschließend wurden 2 μg Gesamt-RNA aus jeder Probe, wiederum unter Verwendung von Standardverfahren, cDNA-Synthese unterzogen.
Die cDNA wurde dann in RT-PCR-Versuchen unter Verwendung der folgenden Primer verwendet:
Diese Primer sollten ein Segment von Seq.-ID Nr. 1 amplifizieren, das die Nucleotide 271 bis 599 überspannt.
Amplifikation wurde über 35 Zyklen unter Verwendung einer Anellierungstemperatur von 60°C durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden mittels Ethidiumbromidfärbung auf 1,5%igem Agarosegel sichtbar gemacht.
Die Resultate wiesen darauf hin, dass sowohl der Tumor als auch die Zelllinie Seq.-ID Nr. 1 exprimierten. Die Zelllinien- und Tumorproben wurden in späteren Versuchen verwendet.
Beispiel 7
Das oben erläuterte isolierte cDNA-Molekül wurde dann verwendet, um rekombinantes Protein zu bilden. Detailliert beschrieben wurde die cDNA mittels PCR unter Anwendung herkömmlicher Verfahren amplifiziert und wurde anschließend in einen im Handel erhältlichen Plasmidvektor, nämlich pQE9, kloniert, der His-Markierungen enthielt. In einer hierin nicht näher ausgeführten Arbeit wurde auch ein zweiter Vektor, pQE9K, verwendet. Dieser unterscheidet sich von pQE9 darin, dass durch pQE9K Kanamycinresistenz und nicht Ampicillinresistenz verliehen wird.
Der Plasmidvektor wurde in E.-coli-Stamm XL1-Blue transformiert, und positive Transformanten wurden über Restriktionskartierung und DNA-Sequenzierung identifiziert. Die Produktion von rekombinantem Protein wurde unter Verwendung von Isopropyl-β-D-thiogalactosid induziert, und das Protein wurde an einer Ni²⁺-Ionenchromatographiesäule nach gut bekannten Verfahren gereinigt. Das Protein wurde, als es mittels 15% SDS-PAGE und Silberfärbung analysiert wurde, als Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 22 kDa identifiziert. Dies stimmt mit der aufgrund seiner Sequenz erwarteten Größe des Proteins überein. Zwei andere Formen des rekombinanten Proteins wurden ebenfalls identifiziert. Diese bestanden aus den Aminosäuren 10–180 und 10–121 der in Seq.-ID Nr. 1 gezeigten Aminosäuresequenz. Sie weisen mittels SDS-PAGE, wie oben beschrieben durchgeführt, Molekulargewichte von etwa 14 kD bzw. 20 kD auf.
Eine zusätzliche Reihe von Versuchen wurde durchgeführt, um NY-ESO-1 in Baculovirus zu exprimieren. Detailliert beschrieben wurde das NY-ESO-1-cDNA-Insert aus dem pQE9-Vektor durch Spalten mit BamHI und HindIII freigesetzt. Dieses Insert wurde dann in einen handelsüblichen Baculovirusvektor subkloniert, der mit denselben Enzymen gespalten worden war. Positive Klone wurden unter Anwendung von Standardverfahren bestimmt und in Rezipienten-Sf9-Zellen transfiziert. Rekombinante Viren wurden dann verwendet, um Insektenzellen unter Verwendung eines Standardmediums (IPL-41), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum, zu infizieren. Die Infektionsmultiplizität betrug dabei 20. Expression von rekombinantem Protein wurde wie oben beschrieben bestimmt. Das in diesem Vektor produzierte rekombinante Protein trägt eine His-Markierung, und so wurde es an Ni²⁺-Affinitätssäulen gereinigt, die ebenfalls bereits oben beschrieben wurden. Das Protein besteht aus den Aminosäuren 10–180 und weist ein mittels SDS-PAGE ermitteltes Molekulargewicht von 20 kD auf.
Anschließend wurden zusätzliche eukaryotische Transfektanten erzeugt. Hierzu wurde die NY-ESO-1-Kodiersequenz aus dem oben beschriebenen pQE9-Vektor isoliert und dann in BamHI-HindIII-Stellen von eukaryotischer Expressionsvektor-pcDNA 3.1 kloniert. Als Nächstes wurden COS-7-Zellen mit diesem Vektor durch Kontaktieren von Zellproben mit 150 ng des zuvor erläuterten Plasmids und 150 ng von Plasmid- pcDNA 1 Amp, das entweder cDNA für HLA-A2.1 oder cDNA für HLA-A1 enthielt, transfiziert. Es wurde das durchwegs bekannte DEAE-Dextranchloroquinverfahren eingesetzt. Die Zellen wurden dann bei 37°C 48 h lang inkubiert, wonach sie in einem CTL-Stimulationstest getestet wurden. Im Besonderen wurde hierzu der Test gemäß Traversari et al., Immunogenetics 35, 145–148 (1992), hierin durch Verweis aufgenommen, eingesetzt. Kurz zusammengefasst wurden 2.500 CTLs (NW38-IVS-1, siehe Beispiel 9, unten) in 100 μl RPMI, ergänzt mit 100% menschlichem Serum, und 25 E/ml rekombinantes IL-2 zu Mikrowells, die COS-7-Transfektanten (20.000 Zellen/Well) enthielten, zugesetzt. Nach 24 h wurden 50 μl Überstand aus jedem Well abgenommen, und TNF-α-Levels wurden in einem Standardtest, d.h. in einem, in dem Zytotoxizität gegen WEHI-164-Klon-13-Zellen getestet wurde, unter Verwendung von MTT bestimmt. Positive Zellen wurden in der Western-Blot-Analyse, die im nachfolgenden Beispiel beschrieben wird, eingesetzt.
Die verwendeten CTLs waren CTL NW38-IVS-1, hergestellt gemäß Knuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 3511–3515 (1984). Im Detail wurden gemischte Lymphozyten-T-Zellen-Kulturen durch Kombinieren von 10⁵ autologen NW38-MEL-1-Tumorzellen und 10⁶ peripheren Blutlymphozyten, die der Person entnommen wurden, erstellt. Das Cytokin IL-2 wurde zugesetzt, und die gemischte Kultur wurde eine Woche lang bei 37°C inkubiert. Tumorzellen wurden entfernt, und eine neue Aliquote von 5 × 10⁴ Tumorzellen wurde zusammen mit IL-2 zugesetzt. Dieser Vorgang wurde wöchentlich wiederholt, bis eine starke Antwort beobachtet werden konnte, wenn gegen ⁵¹Cr-markierte NW-MEL-38-Zellen getestet wurde. Die Antwort-T-Zellen wurden gesammelt und eingefroren, bis sie in weiteren Versuchen eingesetzt wurden.
Beispiel 8
Western-Blot-Analyse wurde dann unter Verwendung der oben beschriebenen Serumproben sowie der oben beschriebenen Zelllysate, die aus der Zelllinie NW-MEL-38 entnommen wurden, und den oben beschriebenen COS-7-Transfektanten und dem gereinigten rekombinanten Protein, ebenfalls oben beschrieben, durchgeführt. Serumproben wurden zu verschiedenen Zeitpunkten der Therapie des Patienten entnommen. Es gab keinen Unterschied in den Resultaten.
In diesen Tests wurden 1 μg rekombinantes NY-ESO-1-Protein oder 5 μl Zelllysate von jedem Typ in SDS verdünnt und fünf Minuten lang gekocht und anschließend an einem 15%-SDS-Gel Elektrophorese unterzogen. Nach dem Blotting über Nacht auf Nitrocellulose (0,45 μm) und Blockieren mit 3% BSA wurden die Blots mit Serum, verdünnt auf 1:1.000, 1:10.000 und 1:100.000, oder mit einem monoklonalen Antikörper gegen NY-ESO-1, verdünnt auf 1:50, als positive Kontrolle inkubiert. Der monoklonale Antikörper wurde gemäß Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 5915–5919 (1996), wie folgt beschrieben hergestellt. BALB/C-Mäuse wurden mittels fünf subkutaner Injektionen von rekombinantem NY-ESO-1-Protein in 2- bis 3-Wochen-Intervallen immunisiert. Die Immunisierungsformulierung umfasste 50 μg rekombinantes Protein in Adjuvans. Bei der ersten Injektion wurde komplettes Freundsches Adjuvans verwendet, und inkomplettes Freundsches Adjuvans wurde danach verwendet. Milzzellen wurden den immunisierten Mäusen entnommen und mit Maus-Myelomzelllinie SP2/0 fusioniert, um Hybridome zu bilden. Das repräsentative Hybridom E978 wurde zur Bildung von mAbs verwendet.
Nachdem Hybridome gebildet waren, wurden sie kloniert, und ihre Überstände wurden gegen rekombinantes Protein unter Verwendung eines Standard-Festphasen-ELISA an Mikrotiterplatten gescreent. Der Test erfolgte gemäß Dippold et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 6114–6118 (1980). Eine Reihe von negativen Kontrollen wurden unter Verwendung von rekombinantem NY-ESO-1 ebenfalls durchgeführt. Serumantikörper, die sich an rekombinantes Protein banden, produziert durch E. coli wie oben beschrieben, wurden unter Verwendung von Ziege-Anti-Human-IgG, markiert mit alkalischer Phosphatase bei einer 1:10.000-Verdünnung, sichtbar gemacht und wurden dann mit NBT-Phosphat sichtbar gemacht. Nicht transfizierte COS-7-Zellen wurden auch als Kontrolle verwendet. Serum aus einer gesunden Person wurde ebenfalls als Kontrolle verwendet.
Starke Reaktivität gegen das rekombinante Protein wurde bei Serumverdünnungen bis hinunter zu 1:100.000 erkannt, und es wurde auch Reaktivität gegen Lysat von NW-MEL-38 beobachtet. Es wurde keine Reaktivität gegen die nicht transfizierten COS-7-Zellen gefunden, und das Serum aus einer gesunden Person zeigte auch keine Reaktivität.
Beispiel 9
Vier verschiedene Formen von NY-ESO-1 werden oben beschrieben, d.h. die durch Seq.-ID Nr. 1 in E. coli produzierte Form sowie eine, die aus den Aminosäuren 10–180 besteht, eine, die aus den Aminosäuren 10–121 besteht, und eine Form, die im oben erläuterten Baculovirus-Vektorsystem exprimiert wird und aus den Aminosäuren 10–180 besteht. Jede Form wurde in ELISAs gemäß der oben beschriebenen Arbeitsvorschriften eingesetzt. Alle Formen des Proteins erwiesen sich als gleich reaktiv mit Antikörpern, die verschiedenen Patienten entnommen wurden, sowie mit den oben erläuterten murinen monoklonalen Antikörpern.
Beispiel 10
Bei der Untersuchung der COS-7-Transfektanten, siehe oben, und den in diesem Beispiel erläuterten Tests wurde eine zytolytische T-Zelllinie "NW38-IVS-1" verwendet. Diese "CTL" wurde über In-vitro-Stimulation der oben erwähnten peripheren Blutlymphozyten unter Verwendung der Tumorzelllinie NW-MEL-38 gebildet. Dies erfolgte unter Verwendung von Standardverfahren.
Die CTL wurde in einem Zytotoxizitätstest mit NW-MEL-38 (die NLA-A1-, -A2-positiv und NY-ESO-1-positiv war) zusammen mit zwei allogenen Zelllinien, die NY-ESO-1- und NLA-A2-positiv waren (SK-MEL-37 und MZ-MEL-19), einer Zelllinie, die MHC-Klasse-1-negativ ist (SK-MEL-19), einer Zelllinie, die HLA-A2-positiv, jedoch NY-ESO-1-negativ ist (NW-MEL-145), zusammen mit Kontrollzelllinien K562 und autologen, Phytohämagglutinin-stimulierten Blasten verwendet. Verschiedene Effektor/Target- Verhältnisse wurden verwendet, und Lyse von ⁵¹Cr-markierten Targetzellen war der gemessene Parameter. 5 zeigt dies.
Die Resultate wiesen darauf hin, dass die CTL NW38-IVS-1 sowohl die autologe Zelllinie NW MEL-38 als auch die allogenen Zelllinien, die HLA-A2- und ESO-1-positiv waren, lysierte. Somit war die CTL mit allogenen Materialien reaktiv. Siehe 6.
Beispiel 11
Da Patient NW38 HLA-A1- und HLA-A2-positiv war, wurden Versuche durchgeführt, um zu bestimmen, welches MHC-Molekül das präsentierende Molekül war.
Derselbe Versuch, der oben mit COS-7-Zellen beschrieben wurde, wurde durchgeführt, mit der Ausnahme, dass in diesen Versuchen darauf geachtet wurde, separate Gruppen von Co-Transformanten sicherzustellen, die entweder mit HLA-A1-cDNA oder mit HLA-A2-cDNA, jedoch nicht mit beiden, transformiert worden waren. Diese Resultate zeigen, dass die CTL-NW38-IVS-1 ausschließlich COS-7-Transfektanten, die sowohl NY-ESO-1 als auch HLA-A2 enthielten, lysierten. Siehe 6. Die Arbeit bestätigte auch die Spezifität der CTL, da die NY-ESO-1-negativen, HLA-A2-positiven Zellen, die in Beispiel 9 beschrieben wurden, bezüglich anderer Moleküle positiv waren, die dafür bekannt sind, zu Peptiden verarbeitet zu werden, die von HLA-A2-Molekülen präsentiert werden.
Beispiel 12
Nachdem das präsentierende MHC-Molekül als HLA-A2 identifiziert worden war, wurde unter Verwendung des Modells von D'Amaro et al., Human Immunol. 43, 13–18 (1995), und Drijfhout et al., Human Immunol. 43, 1–12 (1995), ein Screening der Aminosäuresequenz auf NY-ESO-1 durchgeführt, um alle Peptide zu identifizieren, die diesem Motiv entsprechen. Peptide, die allen der dadurch abgeleiteten Aminosäuresequenzen entsprechen, wurden unter Verwendung herkömmlicher Verfahren synthetisiert und wurden anschließend in Zytotoxizitätstests gemäß Knuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 3511–3515 (1984), verwendet. Im Detail wurde die Zelllinie CEMX721.174.T2 (nachstehend als "T2" bezeichnet) verwendet, da sie keine Antigene gegen Peptide im Komplex mit MHC verarbeitet, was sie ideal für Versuche des hierin beschriebenen Typs macht. Proben von T2-Zellen wurden mit 100 μCi von Na(⁵¹Cr)O₄ unter Verwendung von Standardverfahren markiert und wurden dann dreimal gewaschen, woraufhin inkubation mit 10 μg/ml Peptid und 2,5 μg/ml β2-Mikroglobulin folgte. Die Inkubation dauerte eine Stunde bei Raumtemperatur. Dann wurden Antwortzellen (100 μl einer Suspension von CTL NW38-IVS-1) in einem Verhältnis Effektor:Target von 90:1 zugesetzt und vier Stunden lang in einer wassergesättigten Atmosphäre mit 5% CO₂ bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Platten bei 200 × g fünf Minuten lang zentrifugiert, 100 μl Überstand wurden entfernt, und Radioaktivität wurde gemessen. Der Prozentsatz an ⁵¹Cr-Freisetzung wurde gemäß bekannter Vorgehensweisen bestimmt. Es wurde erkannt, dass die Peptide SLLMWITQCFL (Seq.-ID Nr. 4), SLLMWITQC (Seq.-ID Nr. 5) und QLSLLMWIT (Seq.-ID Nr. 6) die drei besten Stimulatoren von CTLs waren. Vergleichbare Resultate wurden erhalten, wenn NW-MEL-38 und die Zelllinien SK-MEL-37 und MZ-MEL-19 als Targets verwendet wurden, wie oben bereits gezeigt wurde.
Beispiel 13
Es wurden Untersuchungen durchgeführt, um zu bestimmen, ob CD4⁺-Helfer-T-Zellen Komplexe von MHC-Klasse-II-Molekülen und von NY-ESO-1 abstammenden Peptiden erkannten.
Tumorzelllinie MZ-MEL-19 wurde als HLA-DR53-positiv typisiert. Somit wurde NY-ESO-1 unter Einbezug von Futaki et al., Immunogenetics 42, 299–301 (1995), die Bindungsmotive für NLA-DR53 beschrieben, gescreent. Insgesamt achtundzwanzig Peptide, die sich theoretisch an HLA-DR53 binden würden, und Antigene, die Zellen alleine präsentieren.
Periphere Blutlymphozyten ("PBLs") wurden aus zwei Patienten mit metastatischem Melanom isoliert, die als HLA-DR53-positiv typisiert worden waren.
Das Typisieren erfolgte unter Verwendung von herkömmlichen, im Handel erhältlichen Reagenzien. Ein Patient wurde als positiv bezüglich HLA-DRB1 (Allele 1501–05, 1601–1603, 1605 und 0701), HLA DRB4* (Allele 0101–0103) und DRB5* (Allele 0101) typisiert, während der zweite Patient als positiv für HLA-DRB1* (Allele 1401, 1407, 1408 und 0901), HLA-DRB3* (Allele 0201–0203) und DRB4* (Allele 0101–0103) typisiert wurde. Alle Allele von HLA-DRB4* werden gemäß Bodmer et al., Human Immunol. 34, 4–18 (1992), als HLA-DR53 bezeichnet.
Die PBLs wurden mit magnetischen Kügelchen, beschichtet mit geeigneten Antikörpern, um CD4⁺- und CD8⁺-T-Lymphozyten zu verarmen, behandelt. Die verbleibenden Zellen wurden in 24-Well-Platten bei 4 × 10⁶ Zellen/Well überimpft und wurden an den Kunststoff der Wells 24 h lang anhaften gelassen. Jegliche nicht anhaftende Zellen wurden entfernt, und die verbleibenden Zellen wurden als Antigen-präsentierende Zellen verwendet. Diese Zellen wurden mit GM-CSF (1.000 E/ml) und IL-4 (1.000 E/ml) 5 Tage lang in flachbödigen 96-Well-Nitrocellulose-Platten, die über Nacht bei 4°C mit 5 μg/ml Anti-γ-Interferon-Antikörpern beschichtet worden waren, stimuliert. Die Zellen wurden bei 3,5 × 10⁵ Zellen/Well überimpft.
Die Zellen wurden dann mit 4 μg/Well Testpeptid oder 2 μg/Well des kompletten NY-ESO-1-Proteins als Kontrolle gepulst.
Anschließend wurden CD4⁺-T-Zellen (1 × 10⁵ Zellen/Well) in RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10% menschlichem Serum, L-Asparagin (50 mg/l), L-Arginin (242 mg/l) und L-Glutamin (300 mg/l), zusammen mit 2,5 ng/ml IL-2 in einem Endvolumen von 100 μl zugesetzt.
Dieses Gemisch wurde 48 h lang bei 37°C in einer wassergesättigten Atmosphäre inkubiert. Dann wurden die Platten sechsmal mit einer Lösung von 0,05% Tween 20/ PBS gewaschen, und anschließend wurde biotinylierter Anti-Interferon-γ-Antikörper in 0,5 μg/ml zugesetzt. Der Antikörper wurde 2 h lang bei 37°C inkubiert, wonach die Platten mit Standardreagenzien 1 h lang entwickelt wurden. Das Substrat 3-Ethyl-9-aminocarbazol wurde zugesetzt und 5 min lang inkubiert, wobei Positive als rote Punkte dargestellt sind. Die Anzahl an roten Punkten/Well wies auf die Häufigkeit von CD4⁺-T-Lymphozyten hin, die Komplexe von Peptid und HLA-DR53 oder HLA-DR53 und einem Peptid, das aus rekombinantem NY-ESO-1-verarbeitet war, erkannte. Als Kontrollen wurden Tests unter Verwendung von Reagenzien alleine (d.h. CD4⁺-Zellen alleine und dem Farbstoff alleine) durchgeführt.
Für die folgenden Peptide wurde erkannt, dass sie die CD4⁺-T-Lymphozyten so sensibilisieren, dass sie γ-Interferon freisetzen.
Diese drei Peptide entsprechen dem Motiv für Bindung an HLA-DR53, das von Futaki et al., s. o., beschrieben wird und das ein Ankerrest von Tyr, Phe, Trp oder Leu, gefolgt von Ala oder Ser drei Reste stromab, ist.
Für zusätzliche Peptide wurde erkannt, dass sie sich an HLA-DR53 binden. Diese Peptide sind:
Beispiel 14
Eine menschliche Hoden-cDNA-Expressionsbibliothek wurde erhalten und mit Serum eines Melanompazienten, identifiziert als MZ2, gescreent. Siehe z.B. Stammanmeldung U.S.-Patent Nr. 5.804.381; siehe auch U.S.-Patent Nr. 5.698.396; Sahin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11810–11813 (1995). Dieses Serum wurde unter Anwendung der in diesen Verweisen beschriebenen Verfahren behandelt. Kurz gesagt wurde das Serum 1:10 verdünnt und anschließend mit transfiziertem E.-coli-Lysat vorabsorbiert. Nach diesem Vorabsorptionsschritt wurde das absorbierte Serum auf eine Endverdünnung von 1:100 1:10 verdünnt. Nach der letzten Verdünnung wurden die Proben über Nacht bei Raumtemperatur mit Nitrozellulosemembranen, die Phagenplaques enthielten, die unter Anwendung der oben beschriebenen Verfahren hergestellt wurden, inkubiert. Die Nitrozellulosemembranen wurden gewaschen, mit mit alkalischer Phosphatase konjugierten sekundären Ziege-Anti-Human-FCγ-Antikörpern inkubiert, und die Reaktion wurde mit den Substraten 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat und Nitroblau-Tetrazolium beobachtet. In einem zweiten Screening wurden jegliche Phagemide, die für menschliches Immunglobulin kodierten, eliminiert.
Insgesamt wurden 3,6 × 10⁵ pfus gescreent, was zu acht positiven Klonen führte. Es wurden Standardsequenzierungsreaktionen durchgeführt, und die Sequenzen wurden mit Sequenzbanken bekannter Sequenzen verglichen.
Von den acht Klonen wurde herausgefunden, dass zwei für bekannte, mit Autoimmunerkrankungen assoziierte Moleküle kodierten, d.h. Golgin-95 (Fritzler et al., J. Exp. Med. 178, 49–62 (1993)), sowie den menschlichen Bindungsfaktor stromauf (Chan et al., J. Exp. Med. 174, 1239–1244 (1991)). Von drei anderen Klonen wurde herausgefunden, dass sie für Proteine kodierten, die weitgehend in menschlichem Gewebe exprimiert werden, d.h. ribosomalen Rezeptor, Kollagentyp-VI-Globulardomäne und rapamycinbindendes Protein. Von den verbleibenden drei Sequenzen wurde von einer herausgefunden, dass sie zu keiner bekannten Sequenz homolog war, jedoch ubiquitär in menschlichen Geweben exprimiert wurde (dies wurde mittels RT-PCR-Analyse herausgefunden, es werden hierin jedoch keine Details bereitge stellt). Von den verbleibenden zwei wurde herausgefunden, dass sie identisch zu HOM-MEL-40 voller Länge waren, beschrieben in 08/479.328, während vom achten Klon herausgefunden wurde, dass er beinahe identisch mit "SSX3" war, wie von DeLeeuw et al., Cytogenet. Cell Genet 73, 179–183 (1996), beschrieben, und sich von diesem lediglich durch zwei Basenpaarunterschiede in der kodierenden Region unterschied. Diese Unterschiede sind in ihrer Natur wahrscheinlich künstlich; der Klon umfasste jedoch auch eine untranslatierte 3'-Region aus 43-Basenpaaren.
Beispiel 15
Um die unten beschriebenen Southern-Blotting-Versuche durchzuführen, wurden die SSX-Gene unter Anwendung von RT-PCR amplifiziert.
Dazu wurden unter Verwendung der veröffentlichten SSX2-Sequenz zwei Primer hergestellt, nämlich
Siehe Crew et al., EMBO J. 14, 2333–2340 (1995). Danach wurde die Amplifikation unter Verwendung von 0,25 U Taq-Polymerase in 25 μl Reaktionsflüssigkeitsmenge und einer Annealingtemperatur von 60°C durchgeführt. Es wurden insgesamt 35 Zyklen durchgeführt.
Beispiel 16
Das oben beschriebene RT-PCR-Verfahren wurde mit Hoden-Gesamt-RNA durchgeführt und das Amplifikationsprodukt wurde in Southern-Blotting-Versuchen eingesetzt.
Es wurde genomische DNA aus nicht neoplastischen Gewebeproben extrahiert, dann unter Verwendung von BamHI, Eco-RI oder HindIII in separaten Experimenten Restriktionsenzymverdau unterzogen und schließlich auf einem 0,7%igen Agarosegel getrennt, gefolgt von Blotting auf Nitrozellulosefiltern. Die oben beschriebenen Amplifikationsprodukte wurden unter Verwendung von bekannten Verfahren mit ³²P markiert, und die markierten Materialien wurden schließlich als Sonden unter Bedingungen hoher Stringenz (65°C, wässriger Puffer) eingesetzt, gefolgt von Waschvorgängen mit hoher Stringenz, und endeten mit einem Endwaschvorgang mit 0,2 × SSC, 0,2% SDS, 65°C.
Der Southern-Blotting-Test ergab in jedem Fall mehr als 10 Banden (d.h. jedes der BamHI-, EcoRI- und HindIII-Verdauprodukte), was sehr stark darauf hindeutete, dass es eine SSX-Genfamilie gibt, die mehr als die drei zuvor identifizierten enthält. Angesichts dieser Beobachtung wurde ein Ansatz kreiert, der sowohl PCR-Klonierung als auch Restriktionskartenanalyse kombinierte, um andere SSX-Gene zu identifizieren.
Beispiel 17
Wurden die Sequenzen von SSX1, -2 und -3 verglichen, so wurde herausgefunden, dass sie stark konservierte 5'- und 3'-Regionen gemeinsam hatten, was erklärte, warum die Oligonucleotide von Seq.-ID Nr. 13 und 14 fähig waren, alle drei Sequenzen unter den angegebenen Bedingungen zu amplifizieren, und nahe legte, dass diese Homologie von der SSX-Genfamilie, unabhängig von der Größe, geteilt wurde. Daher wären die Oligonucleotide der Seq.-ID Nr. 13 und 14 ausreichend, um die anderen Mitglieder der SSX-Genfamilie zu amplifizieren.
Eine Analyse der Sequenzen von SSX1, -2 und -3 ergab, dass SSX1 und -2 eine BglII-Stelle enthielt, die von SSX3 nicht geteilt wurde. Ähnlichermaßen enthielt SSX3 eine EcoRV-Stelle, die von anderen Genen nicht geteilt wurde.
Angesichts dieser Information wurde Hoden-cDNA unter Verwendung der Seq.-ID Nr. 13 und 14 wie oben beschrieben amplifiziert und dann einem BglII-Verdau unterzogen. Jegliche BglII-resistente Sequenzen wurden dann kloniert, sequenziert und mit den bekannten Sequenzen verglichen.
Dies führte zur Identifikation von zwei zuvor unidentifizierten Sequenzen, die hiernach als SSX4 und SSX5 bezeichnet wurden. Durch eine Suche in der GenBank-Datenbank wurden zwei Klone gefunden, die mit den Zugriffsnr. N24445 und W00507 identifiziert wurden, die beide aus einem von Sequenz-Markierung abstammenden cDNA-Segment bestanden. Der mit N24445 identifizierte Klon enthielt die untranslatierte 3'-Region von SSX4 und einen Teil von dessen kodierender Sequenz, während der als W00507 identifizierte Klon ein kürzeres Fragment der untranslatierten 3'-Region von SSX4 und einen längeren Abschnitt der kodierenden Sequenz enthielt. Im Speziellen besteht N24445 aus der Base 344 von SSX4, durch das 3-Ende, plus 319 Basen 3' von Stoppcodon. Die W00507-Sequenz besteht aus einer 99-Basenpaar-Sequenz, die keine Homologie zu den SSX-Genen aufweist, die von einer Region gefolgt werden, die identisch zu den Nucleotiden 280 bis zum Ende von SSX4 bis 67 Basen 3' vom Stoppcodon des Moleküls sind.
Es wurden zwei Formen von SSX4 identifiziert. Einer davon fehlten die Nucleotide 331 bis 466, sie war jedoch ansonsten mit SSX4, wie oben beschrieben, identisch. Weiters ist d e kürzere Form eine alternativ gespleißte Variante.
In der folgenden Tabelle 1 werden die Nucleotid- und Aminosäuresequenzen der 5 bekannten Mitglieder der SSX-Familie verglichen. In der Tabelle ist horizontal die Nucleotidhomologie und vertikal die Aminosäurehomologie angegeben.
Tabelle 1: Nucleotid- und Aminosäurehomologie unter Mitgliedern der SSX-Familie
Daher weisen SSX1 und SSX4 89,4%ige Homologie auf Nucleotidebene und 79,3%-ige Homologie auf Aminosäureebene auf.
Wird die trunkierte Form von SSX4 analysiert, so weist sie aufgrund von alternierendem Spleißen und Verschieben eines stromab gelegenen offenen Leserasters eine zu anderen vollkommen unterschiedliche Aminosäuresequenz auf. Das mutmaßliche Protein ist 153 Aminosäuren lang, und die 42 carboxyterminalen Aminosäuren zeigen keine Homologie zu den anderen SSX-Proteinen.
Beispiel 18
Anschließend wurde die genomische Organisation der SSX2-Gene studiert. Dazu wurde eine genomische menschliche Plazentabibliothek (in Lambda-Phage) unter Verwendung derselben, oben in der Abhandlung über die Southern-Blotting-Arbeit beschriebenen Arbeitsvorschriften und Sonden gescreent. Jegliche positive Primärklone wurden durch zwei zusätzliche Klonierungsrunden gereinigt.
Es wurden mehrere positive Klone isoliert, wobei einer davon partiell sequenziert wurde und als genomischer Klon von SSX2 identifiziert wurde. Eine Reihe von Experimenten, in der Standard-Subklonierungs- und Sequenzierungsarbeiten durchgeführt wurden, folgte, um die Exon-Intron-Grenzen zu definieren.
Die Analyse zeigte, dass das SSX2-Gen sechs Exons enthielt und zumindest 8 Kilobasen umfasste. Von allen definierten Grenzen wurde herausgefunden, dass sie die Consensus-Sequenz von Exon/Intron-Verbindungsstellen, d.h. GT/AG, einhielten.
Von der oben beschriebenen alternierenden Spleißvariante von SSX4 wurde herausgefunden, dass ihr das fünfte Exon in der kodierenden Region fehlte. Dies wurde durch einen Vergleich desselben mit dem genomischen SSX2-Klon und durch die daraus resultierenden Korrelationen ermittelt.
Beispiel 19
Danach wurde die Expression von individuellen SSX-Genen in normalen und Tumorgeweben untersucht. Dazu war die Konstruktion von spezifischen Primern, basierend auf den bekannten Sequenzen, notwendig, wobei diese als Seq.-ID Nr. 15–24 folgen:
Tabelle 2: Genspezifische PCR-Primersequenzen für einzelne SSX-Gene
Die Spezifität der Klone wurde durch Amplifizieren der zuvor identifizierten cDNA für SSX1 durch SSX5 bestätigt. Es wurde Taq-Polymerase bei 60°C für SSX1 und –4 und 65°C für SSX2, -3 und -5 verwendet. Für jeden Satz von Primerpaaren wurde herausgefunden, dass es spezifisch ist, außer dass für die SSX2-Primer herausgefunden wurde, dass sie geringe (weniger als 1/20 von SSX2) Mengen an SSX3-Plasmid-DNA amplifizieren.
Sobald die Spezifität bestätigt war, wurden die Primer verwendet, um Hoden-mRNA unter Anwendung der oben dargelegten RT-PCR-Arbeitsvorschriften zu analysieren.
Die erwarteten PCR-Produkte wurden in allen 5 Fällen gefunden, und eine Amplifikation mit dem SSX4-Paar führte tatsächlich zu zwei Amplifikationsprodukten, die alternativen Spleißvarianten entsprechen.
Danach wurde die Expression von SSX-Genen in kultivierten Melanozyten studiert. Es wurde eine RT-PCR unter Anwendung der oben dargelegten Arbeitsvorschriften durchgeführt. Es wurde kein PCR-Produkt gefunden. Reamplifikation führte zu einer kleinen Menge an SSX4-Produkt, das beide alternativen Formen umfasste, was darauf hindeutete, dass die SSX4-Expression in kultivierten Melanozyten inkonsistent ist und, wenn sie stattfindet, dies in sehr geringem Ausmaß tut.
Diese Analyse wurde dann auf ein Panel von zwölf Melanom-Zelllinien ausgedehnt. Diese Resultate werden in der folgenden Tabelle gezeigt.
Tabelle 3: SSX-Expression in Melanom-Zelllinien, nachgewiesen durch RT-PCR*
*Positiv (+) bedeutet starke Expression. Schwach positive Ergebnisse wurden inkonsistent in SK-MEL-30 für SSX1, -2 und -4 beobachtet, was wahrscheinlich ein geringes Expressionsausmaß darstellt.
Beispiel 20
Zusätzliche Experimente wurden durchgeführt, um die Expression der Mitglieder der SSX-Familie in verschiedenen Tumoren zu analysieren. Dazu wurde gesamtzelluläre DNA aus gefrorenen Gewebeproben unter Verwendung von Guanidiumisothiocyanat zur Denaturierung extrahiert, gefolgt von saurer Phenolextraktion und Isopropanolfällung, wie von Chomczynski et al., Ann. Biochem 162, 156–159 (1987) beschrieben. Proben von Gesamt-RNA (4 μg) wurden mit OligodT(18)-Primern geprimt und nach Standardverfahren revers transkribiert. Die Integrität der so erhaltenen cDNA wurde durch Amplifizieren von B-Acin-Transkripten mittels Standard-PCR mit 25 Zyklen getestet, wie von Tureci et al., Canc. Res. 56, 4766–4772 (1996) beschrieben.
Um die PCR-Analysen durchzuführen, wurden die oben als Seq.-ID Nr. 15–24 sowie die als Seq.-ID Nr. 25–26 gelisteten Primer verwendet, nämlich:
Diese beiden Sequenzen wurden jeweils zusammen mit sowohl Seq.-ID Nr. 15 als auch 18 verwendet, um das von dem für Synovialsarkom von Clark et al., s.o., und Crew et al., s.o., berichtete SYT/SSX-Fusionstranskript nachzuweisen. Die Amplifikation wurde durch Amplifizieren von 1 μl Erststrang-cDNA mit 10 pMol jedes dNTP und 1,67 mN MgCl₂ in einer 30-μl-Reaktion durchgeführt. Nach 12 Minuten bei 94°C, um das Enzym zu aktivieren, wurden 35 PCR-Zyklen durchgeführt. Jeder Zyklus bestand aus 1 Minute zum Annealing (56°C für die Seq.-ID Nr. 15 & 16; 67°C für die Seq.-ID Nr. 17 & 18; 56°C für die Seq.-ID Nr. 19 & 20; 60°C für die Seq.-ID Nr. 21 & 22; 66°C für die Seq.-ID Nr. 23 & 24; 60°C für die Seq.-ID Nr. 25 & 26 und 26 & 18), gefolgt von 2 Minuten bei 72°C; 1 Minute bei 94°C und einem letzten Verlängerungsschritt bei 72°C 8 Minuten lang. Eine 15-μl-Aliquote jeder Reaktion wurde auf 2%igem Agarosegel größenfraktioniert, mit Ethidiumbromidfärbung sichtbar gemacht und auf die erwartete Größe untersucht. Die erwarteten Größen waren 421 Basenpaare für Seq.-ID Nr. 15 & 16; 435 Basenpaare für Seq.-ID Nr. 17 & 18; 381 Basenpaare für Seq.-ID Nr. 19 & 20; 413 Basenpaare für Seq.-ID Nr. 21 & 22 und 324 Basenpaare für Seq.-ID Nr. 23 & 24. Die gewählten Bedingungen waren stringent, um ein Kreuzannealing der Primer an andere Mitglieder der SSX-Familie zu verhindern. Es wurden auch zusätzliche Schritte unternommen, um sicherzustellen, dass die RT-PCR-Produkte von der cDNA und nicht der kontaminierenden DNA abstammten. Jedes Experiment wurde in dreifacher Ausführung durchgeführt. Eine Gesamtmenge von 325 Tumorproben wurde analysiert. Die Resultate werden in den nun folgenden Tabellen 4 & 5 angeführt.
Es sei darauf hingewiesen, dass, während die meisten der SSX-positiven Tumoren lediglich ein Mitglied der SSX-Familie exprimierten, einige Tumorarten Co-Expression zweier oder mehrerer Gene aufwiesen.
Die Expression von SSX-Genen in Synovialsarkom wurde analysiert, da die Literatur davon berichtet, dass von allen analysierten Synovialsarkomfällen gezeigt wurde, dass sie entweder die SYT/SSX1- oder SYT/SSX2-Translokation an Bruchstellen, flankiert von den hierin beschriebenen Primersätzen tragen, d.h. Seq.-ID Nr. 25/Seq.-ID Nr. 16; Seq.-ID Nr. 25/Seq.-ID Nr. 18; Seq.-ID Nr. 25/Seq.-ID Nr. 16; Seq.-ID Nr. 26/Seq.-ID Nr. 18. Die oben beschriebene PCR-Arbeit zeigte, dass SYT/SSX1-Translokationen in drei der getesteten Synovialsarkomproben gefunden wurden, während SYT/SSX2 in einer gefunden wurde. Die eine, in der sie gefunden wurde, war auch eine, in der SYT/SSX1 gefunden wurde. Die Expression von SSX schien unabhängig von der Translokation zu sein.
Tabelle 4: Expression von SSX-Genen durch menschliche Neoplasmen
Tabelle 5: Expressionsmuster einzelner SSX-Gene in SSX-positiven Tumorproben
Tabelle 5 (Fortsetzung)
Tabelle 5 (Fortsetzung)
Beispiel 21
Dieses Beispiel beschreibt im Detail weitere Versuche, die so ausgelegt waren, dass zusätzliche Peptide identifiziert wurden, die sich an HLA-A2-Moleküle binden und die CTL-Proliferation stimulieren.
Zuerst wurden einkernige periphere Blutzellen (hiernach "PBMCs") unter Verwendung von Standard-Ficoll-Hypaque-Verfahren aus dem Blut von gesunden HLA-A*0201*-Spendern isoliert. Diese PBMCs wurden dann behandelt, um anhaftende Monozyten von nicht anhaftenden peripheren Blutlymphozyten ("PBLs") durch Inkubieren der Zellen 1–2 Stunden lang bei 37°C auf Kunststoffoberflächen zu trennen. Alle nicht anhaftenden PBLs wurden gefrierkonserviert, bis sie in weiteren Versuchen benötigt wurden. Die anhaftenden Zellen wurden stimuliert, um zwischen dendritischen Zellen zu differenzieren, und zwar durch Inkubieren dieser in AIMV-Medium, das mit 1000 U/ml IL-4 und 1000 U/ml GM-CSF ergänzt war. Die Zellen wurden 5 Tage lang inkubiert.
Sieben Tage nach Beginn der Inkubation wurden Proben der dendritischen Zellen (8 × 10⁵) mit 50 μg/ml exogen hinzugefügtem Peptid beladen. (Details über die Peptide werden später bereitgestellt). Das Beladen dauerte 2 Stunden bei 37°C in einem Medium, das 1000 U/ml TNF-α und 10.000 U/ml IL-1β enthielt. Die peptidgepulsten dendritischen Zellen wurden dann zwei Mal in überschüssigem peptidfreiem Medium gewaschen. Autologe PBLs wurden, wie oben beschrieben erhalten, aufgetaut, und 4 × 10⁷ PBLs wurden schließlich mit 8 × 10⁵ peptidbeladenen dendritischen Zellen in einem Medium, das 5 ng/ml IL-7 und 20 U/ml IL-2 enthielt, kombiniert (Verhältnis 50:1). Die Kulturen wurden dann bei 37°C inkubiert.
Lymphozytenkulturen wurden an den Tagen 14, 21 und 28 erneut stimuliert, auf dieselbe Art und Weise, wie dies im Rahmen des Experiments nach 7 Tagen durchgeführt wurde. An den Tagen 14, 21 und 28 wurden Cytotoxizitätstests unter Verwendung eines Europium-Freisetzungstests durchgeführt, wie von Blomberg et al., J. Immunol. Meth. 114, 191–195 (1988), beschrieben, oder aber mittels eines im Handel erhältlichen ELISPOT-Tests, der die IFN-γ-Freisetzung misst.
Die getesteten Peptide stammten alle von der Aminosäuresequenz NY-ESO-1 ab, wie dies im U.S.-Patent Nr. 5.804.381 beschrieben ist, Chen et al., oder von den Aminosäuresequenzen SSX-4. Die getesteten Peptide waren:
die beide von NY-ESO1 abstammen, und
das von SSX-4 abstammt. Die zwei von NY-ESO1 abstammenden Peptide wurden in ELISPOT-Tests getestet. Die Resultate folgen. Zusammenfassend gesagt wurden drei Experimente durchgeführt. Die Resultate werden hinsichtlich der Anzahl der gesicherten Punkte (Positiva) präsentiert, wenn HLA-A2-positive Zellen mit dem Peptid gepulst wurden, abzüglich der Anzahl der erhaltenen Punkte, die nicht gepulste Zellen verwendeten. Wie angegeben wurden Messungen an den Tagen 14, 21 und 28 vorgenommen.
Folgende Resultate ergaben sich für das Peptid RLLEFYLAM.
Tag der Messung (Gepulste Zellen – Ungepulste Zellen)
Beispiel 22
In nachfolgenden Versuchen wurden die oben beschriebenen T-Zellkulturen auf beiden COS-Zellen, die mit HLA-A*0201-kodierender cDNA transfiziert wurden, getestet und wie oben beschrieben mit endogenem Peptid gepulst oder mit COS-Zellen, die sowohl mit HLA-A*0201- und NY-ESO1- kodierenden Sequenzen transfiziert wurden. Es wurde erneut für beide Typen von COS-Transfektanten der ELISPOT-Test verwendet. Es wurden sechs verschiedene Kulturen an T-Zellen in zwei Versuchen pro Kultur getestet.
Die Tatsache, dass das endogene NY-ESO-1 zu Lyse führte, legt nahe, dass NY-ESO-1 von HLA-A2-positiven Zellen zu diesem Peptid verarbeitet wird.
Ähnliche Versuche wurden mit dem zweiten von NY-ESO-1 abstammenden Peptid, d.h. SLAQDAPPL, durchgeführt. Diese Ergebnisse folgen nun:
Beispiel 23
In weiteren Versuchen wurde die Spezifität der im vorhergehenden Versuch generierten CTLs durch Kombinieren dieser CTLs mit COS-Zellen, transfiziert mit HLA-A*0201-kodierenden Sequenzen, getestet, die dann mit Peptid gepulst wurden. Zuerst wurde das Peptid RLLEFYLAM in drei Versuchen getestet, und dann wurde SLAQDAPPL in sechs Versuchen getestet. Die Europium-Freisetzung wurde, wie oben beschrieben, gemessen, und der Prozentsatz der lysierten Targetzellen wurde bestimmt. Es folgen nun die Resultate:
In zusätzlichen Versuchen erkannten und lysierten die für RLLEFYLAM/HLA-A2-Komplexe spezifischen CTLs ebenso die Melanomzelllinie SK-Mel-37, von der bekannt ist, dass sie sowohl HLA-A2 als auch NY-ESO-1 lysiert. Diese Erkennung wurde durch Vorinkubieren der Targetzellen mit einem HLA-A2-bindenden monoklonalen Antikörper, BB7.2, inhibiert. Das bestätigte, dass die CTLs HLA-A2-spezifisch für die Komplexe aus dem Peptids und HLA-A2 waren.
Beispiel 24
Ein zusätzliches, von SSX-4 abstammendes Peptid, d.h. STLEKINKT (Seq.-ID Nr. 29) wurde ebenso getestet, und zwar auf dieselbe Art und Weise, wie das von NY-ESO-1 abstammende Peptid getestet wurde. Zuerst wurden ELISPOT-Tests unter Verwendung von COS-Zellen, die NLA-A*0201 exprimierten, durchgeführt und die entweder SSX-4 voller Länge exprimierten, aufgrund von Transfektion mit cDNA, die für das Protein kodiert, oder die mit dem Peptid gepulst waren. In zwei Versuchen wurden drei Kulturen getestet. Die Resultate folgen nun:
Weiters wurde die Spezifität der CTLs, so wie bei den NY-ESO-1-Peptiden, unter Verwendung desselben oben beschriebenen Tests bestätigt, d.h. durch Kombinieren der generierten CTLs gegen die Komplexe mit COS-Zellen, transfiziert mit NLA-A*0201 und gepulst mit Peptid. Es wurde der oben beschriebene Europium-Freisetzungstest eingesetzt. Es folgen nun die Resultate:
Wie bei den von NY-ESO-1 abstammenden Peptiden wurde die CTL-Erkennung durch Vorinkubation mit dem monoklonalen Antikörper BB7.2 inhibiert, was die Spezifität der CTL für Komplexe aus HLA-A2 und Peptiden bestätigt.
Beispiel 25
Zusätzliche Versuche wurden mit von SSX-2 abstammenden Peptiden, nämlich KASEKIFYV (Seq.-ID Nr. 30) und mit von NY-ESO-1 abstammenden Peptiden, nämlich SLLMWITQCFL, SLLMWITQC und QLSLLMWIT (Seq.-ID Nr. 4–6), durchgeführt.
In jedem Fall wurde dieselbe Art von Tests durchgeführt, wie sie in den Beispielen 8–11 durchgeführt wurden. Die Ergebnisse waren vergleichbar, da für jedes Peptid CTL generiert wurden, die für den jeweiligen Peptid/HLA-A2-Komplex spezifisch waren.
Beispiel 26
HLA-DR-Moleküle stellen mehr als 90% der Klasse-II-Moleküle dar, die an der Oberfläche von antigenpräsentierenden Zellen präsentiert werden. Es gibt daher ein Interesse daran, Peptide zu bestimmen, die sich an HLA-DR-Moleküle binden. Weiters gibt es ein Interesse daran, so genannte "promiskuitive" Peptide zu identifizieren, die sich an Untergruppen dieser Moleküle binden, genauso wie Peptide, die für nur ein bestimmtes HLA-DR-Molekül spezifisch sind.
Hammer et al., J. Exp. Med. 180, 2353–2358, präsentieren ein Verfahren zum Bestimmen solcher Peptide. Dieses Verfahren wird ebenso unter www.tepitope.com und in Hammer et al., Techniques To Identify The Rules Governing Class II MHC-Peptide Interaction, und in Fernandez et al., (Hrsg.), MHC Volume 2 A Practical Approach, Oxford University Press, 197–219 (1998) beschrieben. Weiters wird in einer Arbeit von Sturniolo et al., Nature Biotechnology 17, 555–567 (1999) ein Verfahren zur Herstellung von Peptidsequenzen beschrieben, die sich an spezielle HLA-Klasse-II-Moleküle binden könnten. Diese Verfahren wurden in Verbindung mit der oben beschriebenen Aminosäuresequenz von NY-ESO-1 und mit HLA-DR-Molekülen eingesetzt. Diese Peptide wurden dann unter Anwendung von Standardverfahren synthetisiert.
Die Peptide wurden dann mit autologen dendritischen Zellen kombiniert. Diese wurden durch Isolieren mononuklearer peripherer Blutzellen (hiernach "PBMCs") von HLA-DR⁺-Spendern unter Verwendung von FicolI-Hypaque-Verfahren erhalten. Diese PBMCs wurden dann 1–2 Stunden lang bei 37°C auf Kunststoffoberflächen inkubiert. Anliegende Monozyten wurden anschließend 5 Tage lang in Medium kultiviert, das mit IL-4 und GM-CSF ergänzt war. Zur weiteren Ausführung wurde AIMV-Me dium, ergänzt mit 1000 U/ml IL-4, und 1000 U/ml GM-CSF verwendet. Diese Inkubation stimuliert die Differenzierung zu dendritischen Zellen.
Danach wurden Proben dendritischer Zellen (8 × 10⁵) mit 50 μg/ml endogen hinzugefügtem Peptid beladen. Das Beladen dauerte 2 Stunden bei 37°C in einem Medium, das mit 1000 U/ml TNF-∝ und 10.000 U/ml IL-1β ergänzt war. Peptidgepulste dendritische Zellen wurden dann zwei Mal in überschüssigem peptidfreiem Medium gewaschen. Danach wurden autologe periphere Blutlymphozyten (4 × 10⁷) mit 8 × 10⁵ peptidbeladenen dendritischen Zellen (Verhältnis von 50:1) in einem Medium, das 5 ng/ml IL-7 und 20 U/ml IL-2 enthielt, kombiniert. Die Inkubation wurde bei 37°C durchgeführt.
Die Kulturen wurden wöchentlich erneut mit peptidbeladenen, bestrahlten PBMCs stimuliert.
Die Fähigkeit der Peptide, Komplexe mit HLA-DR-Molekülen zu bilden und CD4⁺-Zellproliferation zu stimulieren, wurde durch Messen der BrdU-Aufnahme gemessen.
Die Spezifität der resultierenden CD4⁺-Zellen wurde anschließend durch Kämmen dieser mit autologen dendritischen Zellen getestet, die mit Peptid, gemischt mit rekombinantem NY-ESO-1-Protein voller Länge, oder mit einem nicht verwandten Protein beladen wurden.
Die Peptide
wurden verwendet.
Von beiden Peptiden wurde herausgefunden, dass sie CD4⁺-Zellen von zwei verschiedenen gesunden Spendern sensibilisieren und ausweiten.
Beispiel 27
Dieselbe oben beschriebene Arbeitsvorschrift wurde anschließend eingesetzt, um Peptidsequenzen von SSX-2 zu bestimmen, die sich an HLA-DR-Moleküle binden könnten. Die folgenden Peptide wurden unter Anwendung von Standardverfahren identifiziert und synthetisiert.
Diese Peptide wurden dann in kompetitiven Bindungstests unter Verwendung von gereinigten HLA-DR-Molekülen getestet.
Der Test wird von Falcioni et al., Nature Biotechnology 17, 562–567 (1999), beschrieben. Kurz gesagt ist der Test ein "Szintillationsproximitätstest" unter Verwendung von HLA-DR-Molekülen, die mittels eines monoklonalen Antikörpers affinitätsgereinigt wurden. Die verwendeten HLA-DR-Moleküle waren DR*0101, DR*1501, DR*0301, DR*1101, DR*0701 und DR*0801. Die Peptide wurden auf ihre Fähigkeit, mit dem Kontrollpeptid zu konkurrieren, getestet.
(Seq.-ID Nr. 38), die von Falcioni et al., s.o., gezeigt wurde, bindet an andere HLA-DR-Moleküle. Die Resultate werden unten stehend als Konzentration des Testpeptids (nM) zusammengefasst, die notwendig ist, um die Bindung des Kontrollpeptids um 50% zu inhibieren.
HLA-DR-Typ
Beispiel 28
Die oben dargestellten Resultate führten zu zusätzlichen Versuchen unter Verwendung von T-Zellen, die aus zwei Spendern auf die oben beschriebene Art und Weise isoliert wurden. In diesen Versuchen wurden autologe dendritische Zellen wie beschrieben hergestellt und mit T-Zellen kombiniert, deren Proliferation in einem BrdU-Test bestimmt wurde. In einer ersten Versuchsreihe wurden die 5 in Beispiel 27 beschriebenen Peptide vermischt, und das Gemisch wurde mit einer gleichen Menge des SSX-2-Proteins voller Länge und einem irrelevanten Protein, "TALL", verglichen. TALL stimulierte die Proliferation überhaupt nicht. Das SSX-2-Molekül voller Länge provozierte lediglich eine Proliferation, die etwas geringer als 60% war, während das Peptidgemisch etwa 85% Proliferation provozierte.
In ähnlicher Weise wurden die zwei Peptide aus Beispiel 1 vermischt und mit NY-ESO-1-Protein voller Länge, dem "TALL"-Molekül und unbeladenen dendritischen Zellen verglichen. Das Gemisch provozierte lediglich unter 20% Proliferation und NY-ESO-1 lediglich unter 40%. Die anderen zwei Testproben provozierten keine Proliferation. Auch die Tatsache, dass CD4⁺-Zellen nach Kontakt mit Zellen, die mit von NY-ESO-1 abstammenden Peptiden gepulst wurden und Zellen, die mit dem Protein voller Länge gepulst wurden, proliferieren, zeigt, dass die Peptide endogen durch zelluläre Prozesse produziert werden, d.h., dass das Molekül voller Länge (NY-ESO-1) zu den relevanten Peptiden der Seq.-ID Nr. 31 und 32 verarbeitet wird. Das Erkennungsmuster ist spezifisch, da es, wenn dendritische Zellen mit TALL vermischt wurden, keine Erkennung gab, ebenso wie keine Erkennung ungepulster dendritischer Zellen.
Das Gemisch der beiden Peptide wurde dann mit jedem alleine verwendeten Peptid sowie ohne Peptid verglichen. In diesen Versuchen stimulierte das Gemisch über 70% Proliferation, während die einzelnen Peptide etwa 40% stimulierten. Ohne Peptid wurde keine Proliferation beobachtet. Der T-Zellen-Spender in diesen Versuchen war nicht auf HLA-DR-Moleküle typisiert worden.
In einer zweiten Versuchsreihe wurden Zellen eines Spenders, der als positiv bezüglich HLA-DR*0101 und HLA-DR*1301 typisiert worden war, mit den einzelnen Peptiden aus Beispiel 27, einer Mischung der Peptide, dem SSX-2-Molekül voller Länge und dem oben beschriebenen Tall-Protein getestet. Das Peptid der Seq.-ID Nr. 33 provozierte eine stärkere Proliferation als die anderen einzelnen Peptide oder das Gemisch daraus und wies eine ebenso gute Leistung auf wie das Molekül voller Länge.
Sechs einzelne Versuche wurden durchgeführt, und in allen Fällen gab es eine durchgehend stärkere T-Zellen-Proliferation, die von dendritischen Zellen, die mit Seq.-ID Nr. 33 oder SSX-2 voller Länge gepulst worden waren, induziert wurde, als mit einem beliebigen der anderen Peptide oder dem TALL-Molekül. Dies zeigt, dass das Molekül voller Länge zu zumindest einem Klasse-II-Molekül verarbeitet wird und dass das Peptid der Seq.-ID Nr. 33 spezifische CD4⁺-Zellen provozieren kann.
Die obigen Beispiele zeigen unter anderem, dass Tumor-Abstoßungsantigenvorläufer, wie z.B. NY-ESO-1, SSX-2 und jedes solche Molekül, das durch das SEREX-Verfahren identifiziert wird, zu Peptiden verarbeitet werden, die von MHC-Klasse-I-Molekülen und ebenso MHC-Klasse-II-Molekülen präsentiert werden. Peptide, die an Klasse-II-Moleküle binden, um mit ihnen Komplexe zu bilden, können verwendet werden, um die Proliferation von CD4⁺-Zellen zu stimulieren. Weiters können, wie hierin gezeigt wurde, Moleküle, die solche Sequenzen enthalten, verwendet werden, um die CD4⁺-Zellen ebenso zu provozieren. Die vorangehenden Beispiele zeigen verschiedene Wege, anhand derer ein durchschnittlicher Fachmann Moleküle identifizieren kann, die sich an Klasse-II-Moleküle binden. Diese sollten nicht als die einzigen Verfahren angesehen werden, nach denen solche Moleküle identifiziert werden könnten. Der Fachmann kennt auch andere Ansätze zu diesem Zweck.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung von Peptiden der Seq.-ID Nr. 31 oder 32, die sich an ein MHC-Klasse-II-Molekül auf der Oberfläche der Tumorzellen eines Patienten binden, und zwar in einer Menge, die ausreicht, damit sich die Peptide an die MHC-Moleküle binden, um eine Lyse durch T-Zellen zu provozieren. Die oben dargelegte Veranschaulichung für HLA-DR-Moleküle ist keineswegs die einzige Art dieser Verabreichung, die verwendet werden kann. Es kann jede Kombination von Peptiden verwendet werden, wie z.B. jene für andere Klasse-II-Moleküle. Diese Peptide, die alleine oder in Kombination verwendet werden können, sowie das ganze Protein oder immunreaktive Teile davon können einer Person, die dies benötigt, unter Verwendung einer der Standardverabreichungsarten, wie z.B. intravenöse, intradermale, subkutane, orale, rektale und transdermale Verabreichung, verabreicht werden. Ebenso können pharmazeutische Standardträger, Adjuvanzien, wie z.B. Saponine, GM-CSF und Interleukine, etc. verwendet werden. Weiters können diese Peptide und Proteine mit dem gelisteten Material zu Vakzinen formuliert werden, wie dies bei dendritischen Zellen oder anderen Zellen, die relevante MHC/Peptid-Komplexe präsentieren, der Fall ist. Diese Peptide können ebenso verwendet werden, um multimere Komplexe aus HLA/Peptiden, wie z.B. die von Dunbar et al., Curr. Biol. 8, 413–416 (1998) beschriebenen, zu bilden, worin vier Peptid/MHC/Biotin-Komplexe an ein Streptavidin- oder Avidin-Molekül gebunden sind. Solche Komplexe können verwendet werden, um T-Zellvorläufer zu identifizieren und/oder zu stimulieren.
In ähnlicher Weise werden in der Erfindung Verwendungen überdacht, in denen das Nucleinsäuremolekül, das für eine oder mehrere der Seq.-ID Nr. 31 oder 32 kodiert, in polytoper Form, in einen Vektor, z.B. einen auf einem Adenovirus basierenden Vektor, inkorporiert ist, um es in eukaryotische Zellen, wie z.B. menschliche Zellen, transfizierbar zu machen.
Tests, die aus den oben dargestellten Resultaten entwickelt wurden, können ebenso in Progressions/Regressions-Studien verwendet werden. Man kann den Verlauf der Abnormität im Bezug auf die Expression von Proteinen, wie z.B. NY-ESO-1 oder SSX-2, durch einfaches Beobachten der Proteinlevels, der Proteinexpression etc. unter Verwendung jeglicher oder aller der oben dargelegten Verfahren beobachten, wie z.B.. durch Identifizieren der CD4⁺-Zellpräsenz und/oder Levels mittels Antikörper, Peptide etc..
Es sollte klar sein, dass diese Verfahren ebenso angewandt werden können, um die Wirksamkeit einer therapeutischen Behandlung nachzuweisen. Im Wesentlichen kann man unter Verwendung eines jeden der oben beschriebenen Tests einen Basiswert für das Protein nehmen, einen bestimmten therapeutischen Wirkstoff verabreichen und dann die Proteinmengen danach beobachten, wobei Veränderungen der Proteinmengen als Indices für die Wirksamkeit der Therapie angesehen werden.
Wie oben angegeben wurde, umfasst die Erfindung unter anderem die Erkennung einer "integrierten" Immunantwort auf die Moleküle von Interesse. Eine Abzweigung davon ist die Fähigkeit, den Verlauf einer Krebstherapie zu beobachten, wobei ein Patient, der die Therapie benötigt, eine Impfung eines hierin beschriebenen Typs erhält. Solch eine Impfung führt z.B. zu einer T-Zellen-Antwort gegen Zellen, die MHC/Peptid-Komplexe auf ihren Zellen präsentieren. Die Antwort umfasst ebenso eine Antikörper-Antwort, möglicherweise ein Resultat der Freisetzung von Antikörperprovozierenden Proteinen durch die Lyse von Zellen durch die T-Zellen. Man kann daher die Wirkung einer Impfung durch Beobachten einer Immunantwort verfolgen. Wie oben angegeben, kann eine Erhöhung des Antikörper-Titers oder der T-Zellenzählung als ein Indiz für Fortschritt im Bezug auf eine Impfung angesehen werden und umgekehrt. Daher ist ein weiterer Aspekt der Erfindung ein Verfahren, um die Wirksamkeit einer Impfung nach ihrer Verabreichung zu beobachten, indem Antikörperspiegel im Patienten bestimmt werden, die für die Impfung selbst spezifisch sind, oder große Moleküle, von denen die Impfung einen Teil darstellt.
Die Wirkung einer Impfung kann ebenso durch Beobachten der T-Zellen-Antwort des Patienten, dem die Impfung verabreicht wurde, gemessen werden. Eine Anzahl an Tests kann verwendet werden, um die Vorläuferhäufigkeit dieser in-vitro-stimulierten T-Zellen zu messen. Diese umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Chrom-Freisetzungstests, TNF-Freisetzungstests, IFNγ-Freisetzungstests, einen ELISPOT-Test etc. Veränderungen in den Vorläufer-T-Zellhäufigkeiten können gemessen und mit der Wirksamkeit der Impfung korreliert werden. Zusätzliche Verfahren, die angewandt werden können, umfassen die Verwendung von multimeren Komplexen aus MHC/Peptiden. Ein Beispiel für solche Komplexe ist das tetramere HLA/Peptid-Biotin-Streptavidin-System von Dunbar et al., Curr. Biol. 8, 413–416 (1998).
Die Identifikation der gegenständlichen Proteine als Implikation bei pathologischen Zuständen, wie z.B. Krebs, legt auch eine Reihe therapeutischer Ansätze zusätzlich zu den oben beschriebenen nahe. Die oben dargelegten Experimente zeigen, dass Antikörper als Antwort auf die Expression des Proteins produziert werden. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist daher die Verwendung von Antikörpern, wie z.B. humanisierter Antikörper, Antikörperfragmente etc., bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krankheiten, die durch abweichende oder abnormale Proteinspiegel gekennzeichnet sind. Diese Antikörper können mit geeigneten zytostatischen oder zytotoxischen Reagenzien getaggt oder markiert werden.
Es können ebenso T-Zellen verabreicht werden. Es muss angemerkt werden, dass die T-Zellen in vitro unter Verwendung von immunantwortenden Zellen, wie z.B. dendritischen Zellen, Lymphozyten oder jeglicher anderer immunantwortender Zellen, zu Tage gebracht werden können und dann erneut in das behandelte Subjekt perfundiert werden können.
Es ist anzumerken, dass die Herstellung von T-Zellen und/oder Antikörpern ebenso durch Verabreichen von Zellen, vorzugsweise behandelt, damit sie nichtproliferativ gemacht werden, erreicht werden kann, wobei diese relevante T-Zellen- oder B-Zellen-Epitope zur Antwort bereitstellen, wie z.B. die oben beschriebenen Epitope.
Die therapeutischen Ansätze können ebenso Antisense-Therapien umfassen, worin ein Antisense-Molekül, vorzugsweise 10 bis 100 Nucleotide lang, dem Patienten entweder "unverdünnt" oder in einem Träger, wie z.B. einem Liposom, verabreicht wird, um die Inkorporation in eine Zelle zu erleichtern, gefolgt von einer Inhibierung der Expression des Proteins. Solche Antisense-Sequenzen können ebenso in geeignete Impfungen, wie z.B. in virale Vektoren (z.B. Vakzinia), bakterielle Konstrukte, wie z.B. Varianten der bekannten BCG-Impfung, etc., eingeschlossen werden.
CD4⁺-Zellen reagieren auf Komplexe von MHC-Klasse-II-Molekülen, und Peptide und MHC-Klasse-II-eingeschränkte CD4⁺-T-Zellantworten gegen rekombinantes NY-ESO-1, präsentiert von autolog kultivierten dendritischen Zellen, wurden in Melanompatienten entdeckt. Genauer gesagt wurden CD4⁺-Zellen von anderen Zellen von PBLs oder Serumproben unter Verwendung wohlbekannter Verfahren getrennt. Danach wurden sie mit dendritischen Zellen vermischt, die mit NY-ESO-1-Protein gepulst wurden. Die Proliferation von CD4⁺-Zellen wurde beobachtet, was die integrierte, hierin beschriebene Immunantwort um eine Facette bereichert. Ein weiterer Aspekt sind daher diese CD4⁺-T-Zellen, Peptide, die sich an die MHC-Klasse-II-Moleküle binden, sowie deren Verwendung in einer Therapie.
Wie die Beispiele zeigen, wird ESO-1 ebenso zu Peptiden verarbeitet, die mit MHC-Klasse-II-Molekülen, im Besonderen HLA-DR53, einen Komplex bilden.
Andere Merkmale und Anwendungen der Erfindung sind dem Fachmann bekannt und müssen hierin nicht dargelegt werden.
Die verwendeten Begriffe und Ausdrücke werden zur Beschreibung und nicht als Einschränkung gebraucht, und bei Verwendung solcher Begriffe und Ausdrücke sollen keinerlei Äquivalente der dargestellten und beschriebenen Merkmale oder Teile davon ausgeschlossen werden, da klar ist, dass verschiedene Modifikationen innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung möglich sind.

Claims

Isoliertes Polypeptid, das sich an MHC-Klasse-II-HLA-DR-Moleküle bindet, die 14 bis 16 Aminosäuren enthalten, worin die Aminosäuresequenz des Polypeptids eine Aminosäuresequenz umfasst, die in einem Tumor-abstoßenden Antigenvorläufer zu finden ist, und worin das isolierte Polypeptid Seq.-ID Nr. 31 oder 32 ist.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 1, worin das Peptid Erkennung und Proliferation von CD4+-Zellen stimuliert, die für Komplexe aus diesem Peptid und HLA-DR-Molekülen spezifisch sind.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 1, worin der Tumor-abstoßende Antigenvorläufer NY-ESO-1 ist.
Isolierte zytolytische T-Zelle, die für Komplexe aus MHC-Klasse-II-HLA-DR-Molekülen und Polypeptiden, die durch die Seq.-ID Nr. 31 oder 32 definiert sind, spezifisch ist.
Isolierter Komplex aus MHC-Klasse-II-HLA-DR-Molekülen und einem Polypeptid nach Anspruch 1.
Zusammensetzung, umfassend ein isoliertes Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und zumindest ein Adjuvans.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül, bestehend aus einer Nucleotidsequenz, die für ein isoliertes Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 kodiert.
Expressionsvektor, umfassend ein isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 7, das operabel an einen Promotor gebunden ist.
Zusammensetzung, umfassend ein Gemisch aus den durch die Seq.-ID Nr. 31 und 32 definierten Polypeptiden, das gegebenenfalls ein Adjuvans enthält.
Zusammensetzung, umfassend ein Gemisch aus zumindest einem der durch die Seq.-ID Nr. 31 oder 32 definierten Polypeptide und zumindest einem der durch die Seq.-ID Nr. 33, 34, 35, 36 oder 37 definierten Polypeptide.
Rekombinante Zelle, umfassend ein isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 7 oder einen Expressionsvektor nach Anspruch 8.
In-vitro-Verfahren zur Stimulierung der Proliferation von T-Helfer-Zellen, umfassend das Kontaktieren einer T-Zell-hältigen Probe mit einem Komplex aus MHC-Klasse-Molekül HLA-DR und einem Peptid nach Anspruch 3 in ausreichendem Ausmaß, um die Proliferation von T-Helfer-Zellen, die diesen Komplex erkennen, zu stimulieren.
Verfahren nach Anspruch 12, worin der Komplex an der Oberfläche einer Zelle liegt oder in freier Form vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 13, worin die Zelle eine nichtproliferative und/oder eine rekombinante Zelle ist.
Zumindest ein Polypeptid nach Anspruch 3 zur therapeutischen Verwendung, worin das Polypeptid an eine Person, die HLA-DR-positiv ist, in einer ausreichenden Menge zu verabreichen ist, um ausreichende Komplexe aus dem Peptid und HLA-DR zu bilden, um die Proliferation von dafür spezifischen T-Helfer-Zellen zu stimulieren.
Polypeptid oder Protein, dessen Aminosäuresequenz durch zumindest eine der Seq.-ID Nr. 31 oder 32 definiert ist, in einer Menge, die ausreicht, um zu zumindest einem Peptid verarbeitet zu werden, das von HLA-DR-Molekülen präsentiert wird, und die ausreicht, um eine ausreichende Anzahl an Komplexen aus HLA-DR-Molekülen und dem zumindest einen Peptid zu bilden, um die Proliferation von T-Helfer-Zellen, die für diese Komplexen spezifisch sind, zu stimulieren, zur therapeutischen Verwendung.
Polypeptid nach Anspruch 16, umfassend eine Vielzahl von Kopien der Seq.-ID Nr. 31 oder 32.
Verwendung einer Zelle, die mit (i) einer Nucleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid der Seq.-ID Nr. 31 oder 32 kodiert, und (ii) einer Nucleinsäuresequenz, die für ein HLA-DR-Molekül kodiert, das ein von NY-ESO-1 abgeleitetes, durch Seq.-ID Nr. 31 oder 32 definiertes Peptid aufweist, transfiziert ist, worin das Peptid von Zellen präsentiert wird, die mit einem Krebsleiden in Verbindung stehen, bei der Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung der Proliferation von T-Helfer-Zellen in einer Person, worin das Medikament in einer Menge eingesetzt wird, die ausreicht, um das Krebsleiden zu lindern.
Verwendung nach Anspruch 18, weiters umfassend das Behandeln der Zelle, um sie nichtproliferativ zu machen.
Reagens, bestehend aus nichtproliferativen Zellen, die an ihrer Oberfläche nichtkovalente Komplexe aus einem MHC-Klasse-II-Molekül und von NY-ESO-1 abgeleiteten, durch Seq.-ID Nr. 31 oder 32 definierten Peptiden aufweisen, zur Verwendung bei der therapeutischen Stimulierung der Proliferation von T-Helfer-Zellen in einer Person.
Verwendung eines Antikörpers, der sich spezifisch an ein von NY-ESO-1 abgeleitetes, in Seq.-ID Nr. 31 oder 32 definiertes Peptid bindet, das von einer Krebszelle, die mit einem Krebsleiden in Verbindung steht, exprimiert wird, worin der Antikörper an ein krebsbekämpfendes Mittel gebunden ist, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Person, die an einem Krebsleiden erkrankt ist.
Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 6 oder 9, eines Vektors nach Anspruch 8 oder einer Zelle nach Anspruch 11 bei der Herstellung eines Medikaments zur Prävention des Ausbruchs eines Krebsleidens bei einer Person.
In-vitro-Verfahren zum Screenen auf Krebs bei einer Person, umfassend das Testen einer der betreffenden Person abgenommenen Probe auf (i) Komplexe aus einem MHC-Klasse-II-Molekül und einem von durch NY-ESO-1 kodierten Protein abgeleiteten, durch Seq.-ID Nr. 31 oder 32 definierten Peptid oder (ii) T-Helfer-Zellen, die für diese Komplexe spezifisch sind, worin die Gegenwart von (i) oder (ii) ein Hinweis darauf ist, das bei dieser Person möglicherweise ein Krebserkrankung vorliegt.
Verwendung einer Nucleinsäure nach Anspruch 7 bei der In-vitro-Diagnose eines Krebsleidens bei einer Person, worin eine immunreaktive Zellen enthaltende Probe dieser Person mit einer Zelllinie, die mit einem isolierten Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 8 transfiziert ist, kontaktiert wird und die Wechselwirkung der transfizierten Zelllinie mit der immunreaktiven Zelle bestimmt wird, worin diese Wechselwirkung ein Hinweis auf das Krebsleiden ist,.
Verwendung nach Anspruch 24, worin die immunreaktive Zelle eine T-Helfer-Zelle ist.
In-vitro-Verfahren zur Bestimmung von Regression, Progression oder Ausbruch eines Krebsleidens, umfassend das Beobachten einer Probe eines Patienten mit dem Krebsleiden auf einen Parameter, der aus der aus (i) einem Komplex aus einem in Anspruch 1 definierten Polypeptid und einem MHC-Klasse-II-Molekül und (ii) für diese Komplexe spezifischen T-Helfer-Zellen bestehenden Gruppe ausgewählt ist, worin der Wert dieses Parameters ein Hinweis auf Progression oder Regression oder Ausbruch des Krebsleidens ist.
Verfahren nach Anspruch 26, worin die Probe eine Körperflüssigkeit oder ein Exsudat oder ein Gewebe ist.
Verfahren nach Anspruch 26, umfassend das Kontaktieren der Probe mit einem Antikörper, der sich spezifisch an den Komplex bindet, worin der Antikörper gegebenenfalls mit einer radioaktiven Markierung oder einem Enzym markiert ist und ein monoklonaler Antikörper sein kann.
In-vitro-Verfahren zur Diagnose eines Krebsleidens, umfassend das Testen einer einer Person abgenommenen Probe auf Zellen, die für ein von NY-ESO-1 abgeleitetes, durch Seq.-ID Nr. 31 oder 32 definiertes Peptid spezifisch sind, das mit einem MHC-Klasse-II-Molekül einen Komplex bildet, wobei die Gegenwart der immunreaktiven Zellen ein Hinweis auf das Krebsleiden ist.
Verfahren nach Anspruch 29, worin die immunreaktive Zelle eine T-Helfer-Zelle ist.
Zusammensetzung, umfassend zumindest ein Polypeptid, das sich an ein HLA-Klasse-I-Molekül bindet, und zumindest ein Polypeptid, das sich an ein HLA-Klasse-II-Molekül bindet, worin das zumindest eine Polypeptid, das sich an ein HLA-Klasse-II-Molekül bindet, wie in Anspruch 1 definiert ist, sowie ein Adjuvans.
Zusammensetzung nach Anspruch 31, worin jedes der Polypeptide aus einer Aminosäuresequenz besteht, das in demselben Molekül vorkommt.
Zusammensetzung nach Anspruch 32, worin das Molekül NY-ESO-1 ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 31, worin jedes der Polypeptide von einem unterschiedlichen Molekül abgeleitet ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 34, worin eines der Polypeptide von NY-ESO-1 abgeleitet ist und eines der Polypeptide von SSX-2 abgeleitet ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 31 zur Verwendung bei der Stimulierung von T-Helfer-Zellproliferation.