DE20320429U1 - Monoklonale Antikörpertools für die biokonformatische Analyse - Google Patents

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Abstract

Kit zum Nachweis einer Prionkrankheit in einer Probe, wobei der Kit eine diagnostisch wirksame Menge eines Antikörpers beinhaltet, der durch seine Fähigkeit gekennzeichnet ist, an PrPCTM in situ zu binden, um zu bestimmen, ob der Antikörper spezifisch an irgendein Material in einer Probe bindet, unter Bedingungen, unter denen eine differenzielle Bindung des Antikörpers an PrP-Isoformen, die mit der Prionkrankheit assoziiert sind, auftritt, wobei die Antikörperbindung ein Hinweis auf eine Prionerkrankung ist.

Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen, um Proteinkonformationsisoformen zu unterscheiden, und zur Diagnose und Behandlung von Krankheiten, die mit einer speziellen konformationalen Isoform in Beziehung stehen. Die Erfindung betrifft beispielsweise Zusammensetzungen mit monoklonalen Antikörpern, die unterschiedlich an Prionproteinisoformen binden, und deren Verwendung zum Nachweis und/oder zur Hemmung einer Prionenkrankheit.
  • Hintergrund
  • Die Proteinbiogenese auf dem sekretorischen Weg beinhaltet verschiedene Prozesse, die sich im Zeitverlauf mit der Synthese der Polypeptidketten überlappen. Als erstes muss die naszierende bzw. entstehende Polypeptidkette korrekt der Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER) zugeführt werden. Dann wird die Translokation in das Lumen des ER begonnen. Das Falten der Polypeptidkette muss früh während der Translokation beginnen. Während und direkt nach der Translokation treten posttranslationale Modifikationen auf und es werden Entscheidungen von der Zelle getroffen im Hinblick auf den Abbau unerwünschter Ketten, einschließlich der Rücktranslokation in das Cytoplasma und dem Abbau durch das Proteasom. Von den Prozessen, die gleichzeitig mit der Translokation ablaufen, ist der profundeste vielleicht die Proteinfaltung, da dies die kritische Stufe in der Decodierung der Information im Genom ist. Ein falsch gefaltetes Protein kann so schlecht oder schlimmer sein, als überhaupt kein Protein zu haben. Wenn Proteine mehrere gefaltete Zustände mit unterschiedlichen Funktionen haben, bestimmt der genaue Weg des Faltens und seine Steuerung, welche Funktion tatsächlich exprimiert wird und in welchem Ausmaß.
  • Ein fundamentales Dogma der modernen Biologie ist es, dass die Primärstruktur die Sekundärstruktur bestimmt, die zusammen mit geeigneten posttranslationalen Modifikationen, wie Disulfidbindungsbildung, die tertiäre (und quartäre) Proteinstruktur bestimmt. Diese Organisation, von primärer Struktur, sekundärer Struktur, tertiärer Struktur bildet ein Organisierungsprinzip "erster Ordnung" für die Proteinfaltung. In dem Ausdruck "Struktur" ist implizit die Feststellung einer einzigen stabilen Einheit enthalten; aber Proteinstruktur ist ein statistisches Konzept. Native Proteinkonformationen sind energetisch bevorzugt gegenüber ungefalteten, denaturierten Formen der gleichen Ketten; aber die energetische Präferenz ist mäßig (10 kcal/Mol), was bedeutet, dass Proteine dynamische, fließende Einheiten sind und sogar "stabile" Proteine sich in einem gewissen Ausmaß vorübergehend entfalten.
  • Die Translokation überlappt sich mit der Proteinfaltung, daher wäre zu erwarten, dass im Verlauf der Evolution diese zwei Prozesse einander beeinflusst haben. Faltungswege können modifiziert worden sein, um sich an die Bedürfnisse der Translokation anzupassen; Translokationswege können modifiziert worden sein, um sich an die Bedürfnisse der Faltung anzupassen. Eine wachsende Menge an Literatur liefert Stützung für beide Möglichkeiten. Das dramatischste Beispiel für eine Translokationssteuerung mit Implikationen für die Faltung wird bis heute in der Biogenese des Prionproteins (PrP) gesehen. Im Fall von PrP führt eine homogene Population naszierender Ketten zu drei topologischen Formen. Eine davon, sec-PrP, scheint vollständig über die ER-Membran translokalisiert (ausgeschieden) zu werden und durch einen C-terminalen Glycolipidanker festgehalten zu werden; dies ist die im normalen Gehirn beobachtete Form. Obwohl die Funktion von sec-PrP unbekannt ist, ist es wahrscheinlich, durch Analogie mit anderen glycolipidverankerten Proteinen, dass es Signalfunktionen im Nervensystem hat. Eine kürzlich gezeigte anti-apoptotische Funktion scheint mit dieser Rolle konsistent zu sein. Die anderen beiden Formen von PrP durchspannen die Membran einmal in entgegengesetzten Orientierungen mit einer Membrandurchspannungsstrecke von ungefähr 112 ± 130 Aminosäuren. Im Gegensatz dazu werden die beiden anderen Formen von PrP als einzeln durchspannende Membranproteine in entgegengesetzten Orientierungen entweder mit dem N- oder C-Terminus in das ER-Lumen erzeugt (als NtmPrP bzw. CtmPrP bezeichnet). CtmPrP schaltet spontan die Neurodegeneration an, wenn es überexprimiert wird. Weiterhin scheint bei einer infektiösen Prionkrankheit CtmPrP direkt vor dem Einsetzen klinischer Zeichen induziert zu werden, was darauf hindeutet, dass es einen letzten gemeinsamen Stoffwechselweg zur Neurodegeneration impliziert. Andere Untersuchungen beteiligen ein bis jetzt unbekanntes Glycoprotein der ER-Membran als Translokationszugangsfaktor (TrAF), das das normale Gehirn vor einer Expression von CtmPrP "schützt", indem es naszierende PrP-Ketten in die Bahn lenkt, die zu Sec-PrP führt.
  • Der Unterschied zwischen Sec-PrP und CtmPrP erfolgt gewöhnlich aus topologischen Gründen. Diese zwei Polypeptide mit identischer Sequenz unterscheiden sich jedoch auch in ihrer Konformation. Dies wurde durch ihre unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber einem begrenzten Proteaseverdau in nicht denaturierenden Detergenzlösungen gezeigt. So scheint die Translokationssteuerung ein Mittel zu sein, um mehrere Formen von PrP zu erzeugen, die sich sowohl in Konformation als auch Funktion unterscheiden. Das Instrumentarium (d.h. ein TrAF), das naszierende PrP-Ketten dazu bringt, Sec-PrP statt CtmPrP zu erzeugen, mag selbst reguliert werden, basierend auf der Fähigkeit der Scrapie-Infektion, die Menge an CtmPrP zu erhöhen, die im Gehirn nachweisbar ist. Obwohl PrP derzeit das beste Beispiel für eine Translokationssteuerung ist, gibt es Hinweise für ähnliche Prinzipien, die von einer größeren Gruppe von Proteinen verwendet werden. Diese Beobachtungen führen zusammen zu einem neuen Prinzip: Die Konformation eines Proteins wird nicht nur durch die primäre Aminosäuresequenz bestimmt, sondern auch durch Proteine, wie TrAF, die Einfluss darauf haben, welche von zwei oder mehr verschiedenen funktionellen Konformationsarten tatsächlich auftritt oder vorherrscht.
  • Es ist daher von Interesse zu bestimmen, ob komplexe sekretorische oder integrale Membranproteine mehrere unterschiedliche funktionelle gefaltete Zustände haben können. Derzeit ist die Hauptbeschränkung, um diese und andere Hypothesen der Konformationskontrolle zu testen, der Mangel an Werkzeugen, um die Heterogenität von funktionellen Proteinkonformationen zu erkennen. Aber durch die zufällige Koinzidenz, dass bei PrP die Konformationsheterogenität als topologische Heterogenität exprimiert wird, ist dies möglicherweise bis jetzt noch nicht aufgedeckt worden. Bessere Werkzeuge, wie Gruppen von konformationsspezifischen monoklonalen Antikörpern, die es zulassen würden, relative Reaktivitäten von Unterpopulationen neu synthetisierter Proteine zu untersuchen und daher Konformationsunterschiede zu definieren, sind notwendig. Dieser Ansatz würde es zulassen, einen Katalog der Konformationszustände, die von einem gegebenen Protein in gesundem Zustand und während des Fortschreitens einer Krankheit verwendet werden, zu erstellen ebenso wie ein Mittel, um die Krankheit zu hemmen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Neue Zusammensetzungen auf Basis von konformational spezifischen monoklonalen Antikörpern und deren Verwendung zur Diagnose und Behandlung von Krankheiten, die mit speziellen Proteinkonformeren in Beziehung stehen, werden bereitgestellt. Für monoklonale Antikörpererzeugung werden Tiere mit Antigenen immunisiert, gegebenenfalls mit Adjuvans, die mindestens ein Konformer eines interessierenden Proteins enthalten. B-Zellen von einem immunisierten Wirt werden verwendet, um Hybridoma herzustellen, die monoklonale Antikörper gegen ein oder mehrere Konformere des interessierenden Proteins erzeugen, die ein gemeinsames Epitop teilen. Die monoklonalen Antikörper werden dann gescreent, um solche zu identifizieren, die eine unterschiedliche Bindung mit individuellen Konformeren des interessierenden Proteins zeigen. Die monoklonalen Antikörper finden Verwendung in Nachweisassays für durch Konformer vermittelte Krankheiten und zur Behandlung der Krankheit durch aktive oder passive Immunisierung. Ein ungewöhnlicher Ansatz zum Screenen wird bereitgestellt, der die Lösungsimmunfällung definierter Konformere mit einzelnen Hybridomas beinhaltet, um monoklonale Antikörper zu identifizieren, die selektiv, aber vielleicht schwach an ein spezifisches Konformer binden. Diese monoklonalen Antikörper werden dann charakterisiert und verwendet, um Patientenproben zu Screenen, einschließlich Serum, um konformer spezifische Merkmale und Zusammenhänge von Krankheit und Krankheitspathogenese zu identifizieren und/oder die Differenzierung von Zellen, die PrP exprimieren, zu fördern und/oder PrP-Expression zu hemmen.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1: Proteaseverdau mit Proteinase K (Merck, Deutschland) 100 μg/ml, wurden 1 Stunde bei 37°C angewendet und es wurde mit 5 mM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF; Sigma, USA) gestoppt.
  • 2: mAB 13A5 wurde verwendet in einer Verdünnung von 1:5000 aus Ascites.
  • 3: mAB 13A5 und Ro73 Antiserum wurden in einer Verdünnung von 1:5000 verwendet.
  • 4: PNGase F und Endo H wurden von New England Biolabs (NEB, USA) erworben und gemäß den Vorschriften des Herstellers verwendet.
  • 5: In vitro translatiertes, radioaktives S35-markiertes PrP wurde hergestellt, wie von Hay et al., 1987, Hegde et al., 1998, Science 279, 827–834, und Hegde et al., 1999, beschrieben. Die gesamten Produkte wurden dann mit mAB 7VC-Überstand oder Kontrollantikörpern und 15 μl Protein A (Gibco, Invitrogen, USA) inkubiert und auf einem sich drehenden Rad 3 Stunden lang bei 4°C inkubiert. Die Produkte wurden dann dreimal mit Homogenisierungspuffer gewaschen, in Probepuffer gesiedet und auf ein 15% SDS-Gel geladen. Die Gele wurden getrocknet und Hyperfilm ausgesetzt (Amersham Pharmacia, USA).
  • 6 zeigt radioaktiv markierte zellfreie Translationsprodukte, die in etwa äquivalente Mengen jeder topologischen Form von PrP darstellen und Vorläufer wurden verwendet, um 1.500 einzelne Hybridomaüberstände zu screenen. Die Bahnen 1 bis 13 wurden durch ausgewählte Klone immunpräzipitiert. Bahn 1 zeigt einen "starken Reagierer" unter Bedingungen, denen eine Konformationsspezifität fehlt. Bahn 13 zeigt die Ergebnisse ohne zugegebenen Antikörper. Die in den Bahnen 2 bis 12 verwendeten Antikörper zeigen unterschiedliche Grade an Konformationsspezifität, in einem Bereich von stark Ntm-spezifisch (Bahn 10) bis hauptsächlich sekretorisch (Bahn 3) und Ctm (Bahn 10). In den meisten Fällen wurde eine Reaktivität für den Vorläufer beobachtet, aber da der Vorläufer ein Artefakt der zellfreien Translation ist, der in vivo nicht beobachtet wird (aufgrund der Effizienz der Zielführung) kann seine Gegenwart ignoriert werden. Das Immunogen für diese Fusion war denaturiertes rekombinantes PrP. Es ist wahrscheinlich, dass bei Verwendung von nativem Ctm gegenüber Sec-PrP als Immunogen stärker gerichtete konformationsspezifische Reaktionen erhalten würden, wie vorgeschlagen.
  • 7 zeigt die in-vitro-Translation von PrP (linkeste Bahn) und Immunpräzipitationen mit Klonen von 7VC (Bahn 2 und 3) und 19B10 (Bahnen 4 und 5).
  • 8 zeigt die Immunfärbung von ScN2a-Zellen ohne Antikörper (linkes Feld), mAB 6H4 (zweites Feld von links), mAB 19B10 (drittes Feld von links) und mAB 7VC (rechtes Feld). Die Immunfärbung wurde auf der Zelloberfläche bewirkt (oberes Feld) oder nach Permeabilisierung mit Saponin (Sigma, USA) für intrazelluläre Färbung (unteres Feld).
  • 9 zeigt ScN2a-Zelldifferenzierung nach einwöchiger Behandlung mit 19B10.
  • 10 zeigt einen Western Blot, der zeigt, dass mAB 7VC und 19B10 die Prionreplikation hemmen.
  • 11A zeigt einen Western Blot, der die Wirkungen der Eluate mit verschiedenen Kupferkonzentrationen nach Immunfällung von 7 BHOZ-Gehirnhomogenisat (transgene Maus, die PrP vom Syrischen Hamster exprimiert; oberes Feld) oder F11 98-Gehirnhomogenisat (transgene Maus, die PrP von einem mutierten Syrischen Hamster mit erhöhtem CTM PrP exprimiert; unteres Feld) zeigt. 11B zeigt Western Blots von nicht mit Protease verdautem Gehirnhomogenisat vom normalen Syrischen Hamster, mit Scrapie infiziertes (Sc237-Stamm) Gehirnhomogenisat vom Syrischen Hamster und mit Protease verdautes Scrapie infiziertes Gehirnhomogenisat vom Syrischen Hamster.
  • 12 zeigt einen Western Blot von unterschiedlichen Gehirnhomogenisaten mit mABs 7VC, 19B10 und 6H4.
  • Tabelle 1: Enzyme-linked Immunoadsorbent assay (ELISA) für Peptidbindung wurde durchgeführt wie folgt: Streptavidin-beschichtete ELISA-Platten (96-Napf-Format; Roche, USA) wurden mit 1 μg/Napf N-terminal biotinyliertem Peptid der angegebenen Sequenz 2 Stunden lang bei 37°C beschichtet. Die ELISA-Platten wurden dann mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und mit 5% Rinderserumalbumin 1 Stunde lang bei 37°C blockiert. Nach dem Waschen wurden unverdünnte mAB 7VC-Überstände oder Kontroll-Antikörper und eine Verdünnungsreihe davon in TBS-T mit den beschichteten Näpfen 2 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Nach dem Waschen wurde sekundäres Ziegen-Antimaus-IgG, mit alkalischer Phosphatase markiert (Pierce, USA), in einer Konzentration von 1:1.000 in TBS-T 45 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen wurde das Substrat (p-Nitrophenylphosphat, Sigma, USA) in die Näpfe gegeben und eine gelbe Verfärbung in einem ELISA-Lesegerät untersucht.
  • Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Zusammensetzungen bereitgestellt, die einzelne Konformere eines interessierenden Proteins sind und monoklonale Antikörper dagegen. Bevorzugt werden die Konformere hergestellt unter Verwendung eines Systems, z.B. eines zellfreien Translationssystems, das die selektive Synthese eines einzelnen Konformers des interessierenden Proteins zulässt, so dass monoklonale Antikörper identifiziert werden können, die differentiell an ein einzelnes Konformer binden, so dass Konformere, die mindestens ein Epitop teilen, unterschieden werden können. Der Ausdruck "konformer" bezieht sich auf zwei oder mehr Proteine mit mindestens im Wesentlichen der gleichen Aminosäuresequenz, aber Heterogenität in der Struktur (physikalische Topologie oder Topografie) und Funktion. Unter Topologie wird die unterschiedliche Anordnung spezieller Teile des Proteins in speziellen subzellulären Kompartimenten, z.B. C-cytosolisch im Vergleich zu N-cytosolisch, verstanden und Topografie bedeutet die Veränderung der externen Konformation oder Form im Raum (d.h. unterschiedliche dreidimensionale Form aufgrund von Unterschieden in Faltung/Konformation), was stabile und/oder vorübergehende Assoziation mit anderen Proteinen einschließt. Polypeptide mit im Wesentlichen der gleichen Aminosäuresequenz, wie sie hier verwendet werden, sind solche mit konservativen Aminosäuresubstitutionen (d.h. kleine oder große Seitenkette für kleine bzw. große Seitenkette oder saure, basische, polare bzw. hydrophobe Seitenkette für saure, basische, polare oder hydrophobe Seitenkette), die die Proteinkonformation oder Topologie nicht verändern. Die Proteinkonformationsveränderungen beruhen auf Unterschieden in der Faltung oder auf posttranslationalen Modifikationen und sind nicht das Ergebnis von Unterschieden in der Aminosäuresequenz.
  • Tiere einschließlich Menschen werden für die Diagnose und/oder Behandlung und/oder Hemmung der Wirkungen einer speziellen mit einer Krankheit verbundenen Konformation des interessierenden Proteins immunisiert zur Erzeugung von Antiseren, die Antikörper enthalten, die spezifisch an eine mit der Krankheit verbundene Konformation des interessierenden Proteins binden. B-Zellen des immunisierten tierischen Wirts können verwendet werden, um Hybridomas zu erzeugen, die monoklonale Antikörper mit dem gleichen Spezifitätsspektrum erzeugen. Rekombinante Immunglobulinleichtketten und/oder Schwerketten und funktionelle Fragmente davon können rekombinant hergestellt werden, indem Nucleinsäure, die die leichten und schweren Ketten des monoklonalen Antikörpers oder funktionelle Teile davon codiert, isoliert wird und in einer prokaryotischen Wirtszelle, wie E. coli oder einer eukaryotischen Wirtszelle, wie Hefe oder einer Säugetierzelle, exprimiert wird. Die rekombinanten Antikörper können Veränderungen in der Aminosäuresequenz einschließen, um die gewünschten Eigenschaften zu schaffen, z.B. können Veränderungen gemacht werden in der variablen Region, um verbesserte Antigenbindungseigenschaften zu liefern. Bevorzugt sind die erzeugten und/oder zur Verwendung zur Behandlung der Wirkungen einer mit einer speziellen Krankheit verbundenen Konformation des interessierenden Proteins verabreichten Antikörper neutralisierende Antikörper. Der Ausdruck "Antikörper", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ganze Antikörpermoleküle, die sowohl schwere als auch leichte Ketten aufweisen, aber auch auf jegliche Fragmente solcher Antikörper, wie (FAB)2, FAB, Fv-Fragmente und ScFv-Fragmente, die die gewünschte Spezifität behalten, an einzelne Protein-Konformere zu binden. Der Ausdruck "neutralisierend", wie er hier verwendet wird, bedeutet in Bezug auf Antikörper, dass solche Antikörper an einzelne Proteinkonformere binden, die sich in Körperflüssigkeiten von Patienten befinden mit einer Krankheit, die mit einem spezifischen Proteinkonformer verbunden ist. In einigen Fällen kann der Antikörper dazu dienen, die Bindung des Proteins an zelluläre Rezeptoren zu verhindern; bevorzugt haben solche Antikörper eine ausreichende Affinität für das Proteinkonformer, dass sie rezeptorgebundenes Konformer von seinem Rezeptor entfernen können, wenn das Konformer an den Rezeptor gebunden ist.
  • Monoklonale Antikörper können erzeugt werden, um die funktionellen Testergebnisse zu bestätigen, und zeigen auf Basis der Epitopkartierung, dass (i) Antikörper für die gleichen Epitope Proteine nicht binden, die im Wesentlichen die gleichen Aminosäuresequenzen enthalten und (ii) eine alternative Faltung von Proteinen Epitope maskiert oder aufdeckt und sie immunologisch und damit strukturell unterschiedlich macht. Die Sequenzierung des klonierten verdächtigen Konformers wird durchgeführt, um zu zeigen, dass die Proteine im Wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz haben. Daher können monoklonale Antikörper gegen ein kartiertes Epitop verwendet werden, um Konformere mit unterschiedlichen strukturellen und implizit funktionellen Eigenschaften zu finden, die als spezifische Wirkstofftargets verwendet werden können, was potenzielle Nebenwirkungen verringert. Monoklonale Antikörper können mit ungereinigten Lysaten entweder aus transfizierten Zellen oder programmierten zellfreien Systemen verwendet werden.
  • Die vorliegende Erfindung bietet verschiedene Vorteile gegenüber bestehender Technologie. Das Problem, Heterogenitäten in biologischen Proben nachzuweisen, wird durch verschiedene Merkmale zusammengefasst: Als erstes kann Heterogenität nur nachgewiesen werden mit Reagenzien (z.B. monoklonalen Antikörpern), die ein Konformer von einem anderen unterscheiden. Die meisten Konformere teilen jedoch viele Epitope und daher ist nur eine kleine Untergruppe von monoklonalen Antikörpern, die gegen ein gegebenes Konformer gezüchtet wurden, absolut oder relativ konformerspezifisch und viele monoklonale Antikörper sind ununterscheidbar in ihrer Reaktivität mit verschiedenen Konformeren. Die vorliegende Erfindung lässt es zu, die "Nadel im Heuhaufen", d.h. den raren monoklonalen Antikörper, der absolut oder relativ konformerspezifisch ist, vielleicht mit geringer Affinität, wegen seiner Konformerspezifität, d.h. Beschränkung des Epitops auf einen kleinen Teil einer Oberfläche eines Konformers, von anderen monoklonalen Antikörpern, die nicht konformerspezifisch sind, zu unterscheiden. Als zweites ist der Zeitraum, um zu bestimmen, ob ein neues Hybridom konformerspezifisch ist, begrenzt auf wenige Tage, bevor das Hybridoma stirbt oder von konkurrierenden Klonen überwachsen wird. Die vorliegende Erfindung liefert Strategien, um diese Schranken der Identifizierung von relevanten monoklonalen Antikörpern zu überwinden. Diese wertvollen, aber seltenen monoklonalen Antikörper bieten, wenn sie z.B. in Screening-Tests verwendet werden, den Vorteil, dass sie unterschiedliche Konformere in einer Konformermischung in Patientenproben, wie Blutproben, unterscheiden können. Zusätzlich bieten sie den Vorteil, dass sie ein Mittel schaffen, um Konformere schnell und mit extrem hoher Empfindlichkeit und Spezifität zu unterscheiden mit minimaler Störung durch Bedingungen, wie sie beim Proteaseverdau und anderen konventionelleren Sonden der Konformation und Topologie auftreten würden.
  • Antigene, die zur Immunisierung verwendet werden können, schließen eine Mischung von Konformeren ein, aber bevorzugt sind einzelne Konformere eines interessierenden Proteins. Methoden, die zur Herstellung einzelner Konformerantigene verwendet werden können, schließen ein in-vitro-Translationssystem ein (siehe z.B. Haye et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 914–919; Hägde et al. (1998), Science 279, 827–834; und Hägde et al. (1999), Nature 402, 822–826). Es wurden Versuche gemacht, die synthetisierte Konformationsmischung asymmetrisch zu machen, damit kleinere und vorübergehende Konformere angereichert und stabilisiert werden und daher leichter nachgewiesen und charakterisiert werden können, so dass sie von den normal dominanten Konformeren unterschieden werden können. Dies kann auf verschiedenen Wegen erfolgen, einschließlich durch Swappen von Signalsequenzen, die gespalten werden oder durch Exprimieren der Proteine in fraktionierten und rekonstituierten Systemen, die die native Konformermischung durch Wirkungen (oder deren Abwesenheit) in trans, durch TrAF-Abreicherung oder mit anderen Mitteln modifizieren.
  • Für die Immunisierung können alle Methoden, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind, verwendet werden. Wenn nur kleine Mengen an Antigen verfügbar sind, können Protokolle, wie die von (Blachere et al. (1997), J. Exp. Med. 186, 1315–1322) und (Castellino et al. (2000), J. Exp. Med. 191, 1957-1964) verwendet werden. Kleine (Mikrogramm) Mengen eines Proteins, wie Hitzeschockprotein (HSP) und ein Konformer eines interessierenden Proteins werden vereinigt und dann zur Immunisierung eines Wirtstiers verwendet. Der Verabreichungsweg kann intracutan, subcutan, intramuskulär, intraperitoneal oder intravenös sein und die Verabreichungsmethode erfolgt mit dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannten Standardprotokollen. Gegebenenfalls können ein Adjuvans, wie Freund's komplettes Adjuvans, RIBI, oder Aluminiumhydroxid, oder rekombinante Cytokine, wie Interleukin-2, mit dem Antigen verwendet werden.
  • Monoklonale Antikörper können auf einer Anzahl von Wegen hergestellt werden, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind (siehe z.B. Kohler et al., Nature 256:495–497 (1975) und Eur. J. Immunol. 6:511–519 (1976); Milstein et al., Nature 266:550–552 (1977), Koprowski et al., U.S.-Patent Nr. 4 172 124; E. Harlow und D. Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); Current Protocols in Molecular Biology, Bd. 2 (Supplement 27, Sommer '94), F.M. Ausubel et al., Herausgeber (John Wiley & Sons: New York, N.Y.), Kapitel 11 (1991)). Bei diesem Verfahren werden Splenozyten oder Lymphozyten aus einem Tier, dem ein Antigen injiziert worden war, mit einer Tumorzelllinie fusioniert, was Hybridzellen oder "Hybridomas" erzeugt, die sowohl unsterblich sind als auch genetisch codierte Antikörper der B-Zelle erzeugen können. Die so gebildeten Hybride werden in einzelne genetische Stämme durch Selektion, Verdünnung und erneutes Wachstum getrennt und jeder Stamm repräsentiert somit eine einzelne genetische Linie. Sie produzieren daher immunreaktive homogene Antikörper gegen ein gewünschtes Antigen. Die Hybridomatechnologie verwendet allgemein die Fusion von Mauslinien, aber Human-Human-Hybridomas (L. Olsson et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 77:5429 (1980)); Human-Maus-Hybridomas (J. Schlom et al. (ibid) 77:6841 (1980)) und verschiedene andere xenogene Hybridkombinationen wurden auch berichtet. Zellen, die Antikörper mit den gewünschten Bindungseigenschaften erzeugen, werden mit einem geeigneten Test ausgewählt, z.B. einem serologischen Test einschließlich einem Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
  • Funktionelle Bindungsfragmente von monoklonalen Antikörpern können auch z.B. durch enzymatische Spaltung oder rekombinante Techniken erzeugt werden. Enzymatische Spaltungsmethoden schließen Papain- oder Pepsinspaltung ein, um Fab- bzw. F(ab')2-Fragmente zu erzeugen. Antikörper können auch in einer Vielzahl von trunkierten Formen verwendet werden unter Verwendung von Antikörpergenen, bei denen eine oder mehrere Stoppcodons stromaufwärts der natürlichen Stoppstelle eingeführt wurden. Z.B. kann ein chimäres Gen, das den Schwerkettenanteil eines F(ab')2 codiert, so ausgebildet werden, dass er DNA-Sequenzen enthält, die die CH1-Domäne und die Scharnierregion der Schwerkette codieren. Funktionelle Fragmente der monoklonalen Antikörper behalten mindestens eine Bindungsfunktion und/oder Modulationsfunktion des Antikörpers voller Länge, aus dem sie abgeleitet sind.
  • Bevorzugte funktionelle Fragmente behalten eine Antigenbindungsfunktion eines entsprechenden vollständigen Antikörpers (z.B. behalten sie die Fähigkeit, ein Epitop eines Konformers zu binden). In einer weiteren Ausführungsform behalten funktionelle Fragmente die Fähigkeit, eine oder mehrere Funktionen, die für ein Protein- oder Peptidkonformer charakteristisch sind, zu hemmen, z.B. eine Bindungsaktivität, eine Signalaktivität und/oder die Stimulierung einer zellulären Antwort. In einer Ausführungsform kann z.B. ein funktionelles Fragment den HIV-Kapselzusammenbau hemmen.
  • Eine Methode, um konformerspezifische Antikörper zu entwickeln, besteht darin, Knockout-Mäuse, denen ein funktionelles Gen für das interessierende Protein fehlt, mit einem möglichen Konformer des interessierenden Proteins zu immunisieren. Knockout-Mäuse können unter Verwendung von Standardtechniken, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind, erzeugt werden (Capecchi, Science (1989), 244:1288; Koller et al., Annu Rev. Immunol (1992), 10:705–30; Deng et al., Arch Neurol (2000), 57:1695–1702); das dem Protein, gegen das monoklonale Antikörper erzeugt werden sollen, entsprechende Gen wird ausgeknockt, z.B. HP68. Ein Zielvektor wird konstruiert, der zusätzlich dazu, dass er ein Fragment des auszuschaltenden Gens enthält, allgemein ein Antibiotikaresistenzgen, bevorzugt Neomycin, enthält, um auf homologe Rekombination zu selektieren, und ein Gen für eine virale Thymidinkinase (TK). Alternativ kann das Gen, das Diphtherietoxin (DTA) codiert, verwendet werden, um gegenüber zufälliger Insertion zu selektieren. Der Vektor ist so zugeschnitten, dass dann, wenn eine homologe Rekombination auftritt, das Neomycinresistenzgen in das Genom integriert wird, das TK- oder DTA-Gen aber immer verloren ist. Maus-Embryonenstammzellen (ES) werden mit dem linearisierten Zielvektor transfiziert und rekombinieren durch homologe Rekombination am Ort des Zielgens, das ausgeschaltet werden soll. Maus-ES-Zellen werden in Gegenwart von Neomycin und Ganciclovir (für TK) gezüchtet, einem Wirkstoff, der von TK metabolisiert wird, um ein tödliches Produkt zu erzeugen. Zellen, die eine homologe Rekombination durchlaufen haben, sind daher resistent sowohl gegenüber Neomycin als auch Ganciclovir. Vektoren, die DTA enthalten, töten jede Zelle, die das Gen codiert, sodass kein weiterer Wirkstoff im Zellkulturmedium notwendig ist. Southern Blot-Hybridisierung und PCR werden verwendet, um das homologe Rekombinationsereignis zu verifizieren, Techniken, die dem Fachmann auf diesem Gebiet wohl bekannt sind.
  • Um eine Maus zu erzeugen, die ein zerstörtes Zielgen trägt, werden positive ES-Zellen in Kultur propagiert, um zu differenzieren und die entstehende Blastozyste wird in ein pseudoträchtiges Tier implantiert. Alternativ werden die ES-Zellen wieder in die blastozölische Höhle eines Präimplantations-Maus-Embryos injiziert und die Blastozyste dann chirurgisch implantiert. Die transfizierten ES-Zellen und die aufnehmenden Blastozysten können von Mäusen mit anderer Hautfarbe stammen, so dass chimäre Nachkommen leicht identifiziert werden können. Durch Aufzuchttechniken werden homozygote Knockout-Mäuse erzeugt. Gewebe aus diesen Mäusen wird getestet, um den homozygoten Knockout für das Zielgen zu verifizieren, z.B. unter Verwendung von PCR und Southern Blot-Hybridisierung.
  • Bei einer anderen Methode kann Gene targeting unter Verwendung der Antisense-Technologie verwendet werden (Bergot et al., JBC (2000), 275:17605-17610). Die homozygoten Knockout-Mäuse werden mit gereinigten Wirtsproteinpeptiden, sowohl nativem als auch denaturiertem rekombinanten Protein immunisiert. Nach darauf folgenden Boosts, nach 3 und 6 Wochen, mit dem Immunogen werden die Mäuse getötet und die Milz entnommen und eine Fusion mit Myelomazellen durchgeführt (Korth et al., Methods in Enzymol. (1999), 309:106). Antikörper aus einzelnen Hybridomas werden auf Konformationsspezifität gescreent, d.h. Bindung mit einer erheblichen Spezifität für ein einzelnes Konformer. Das Screening-Verfahren wird mit radioaktiv markierten Proteinprodukten durchgeführt, die in dem zellfreien Translationssystem oder in radioaktiv markierten Medien oder Zellextrakten, die ausgewählt wurden, um ein Konformer gegenüber dem anderen anzureichern, erzeugt wurden.
  • Diese Produkte werden immunpräzipitiert unter Verwendung von Hybridomaüberstand und auf einem SDS-PAGE-Gel laufen gelassen. Bevorzugt werden zellfreie Extrakte verwendet wegen der Möglichkeit, dass die Verwendung tranfizierter Zellen zu Protein-Protein-Wechselwirkungen führen könnte, die Antikörper an der Bindung an ein spezifisches Epitop hindern könnten, wodurch ein mögliches Konformer maskiert würde. Die Verwendung eines Immunfällungsscreenings mit radioaktiv markierten Translationsprodukten, deren Konformation verdreht wurde (z.B. durch Swappen von Signalsequenzen) und das Screening auf schwache Responder sind Schlüsselmerkmale, die dieses Screening von dem üblichen Ansatz der monoklonalen Antikörperproduktion unterscheiden.
  • Eine Variation der Methode zum Screenen von monoklonalen Antikörpern, die eine unterschiedliche Bindung aufweisen, besteht darin, den pH, die Ionenzusammensetzung des Tests, und/oder andere Bedingungen, wie die Gegenwart von Serum oder Serumproteinen oder Metallionen, an die das interessierende Protein bindet, wie Kupfer, zu variieren. Diese Bedingungen können von Antikörper zu Antikörper zu variieren. Andere Mittel, um unterschiedliche Bindung von monoklonalen Antikörpern an spezifische Konformere zu erhalten, können verwendet werden. Als ein Beispiel werden spezifische konformationale Epitope, die von solchen monoklonalen Antikörpern definiert werden, als Tags oder Reporter oder Markierungen von Konformationsveränderungen verwendet, indem codierende Regionen verschiedener Größe in anderen Targetproteinen gentechnologisch verändert werden. So kann das Tag "an-" oder "ab-" geschaltet werden, einfach, indem die ionischen Bedingungen variiert werden und eine Konformationsänderung kann induziert oder unterdrückt werden durch Veränderung von ionischen oder anderen Bedingungen. Die Verwendung von 96-Napf-Platten zum Screenen rationalisiert das Verfahren, da ein einzelner Techniker bis zu 1000 einzelne Hybridomas an einem einzigen Tag screenen kann.
  • Antikörper können auch mit rekombinanten Mitteln hergestellt werden. Messenger-RNA, die für eine schwere oder leichte Kette codiert, wird aus einer geeigneten Quelle isoliert, z.B. reifen B-Zellen oder einer Hybridoma-Kultur, die Antikörper der gewünschten Spezifität erzeugt, unter Verwendung von Standardtechniken der RNA-Isolierung und unter Verwendung von Oligo-dT-Cellulosechromatographie, um Poly-A-mRNA zu segregieren. Die Poly-A-mRNA kann fraktioniert werden, um Sequenzen ausreichender Größe zu erhalten, die für die Aminosäuresequenzen in der leichten oder schweren Kette des gewünschten Antikörpers codieren. Eine cDNA-Bibliothek wird dann aus der Mischung von mRNA hergestellt unter Verwendung eines geeigneten Primers, bevorzugt einer Nucleinsäuresequenz, die für die gewünschte cDNA charakteristisch ist. Ein solcher Primer kann hypothetisch erstellt und synthetisiert werden auf Basis der Aminosäuresequenz des Antikörpers, wenn die Sequenz bekannt ist. Alternativ kann cDNA aus nicht fraktionierter Poly-A-mRNA aus einer Zelllinie, die den gewünschten Antikörper produziert, oder Poly-dT verwendet werden. Klonierungsvektoren, die die entstehende cDNA enthalten, werden hergestellt und verwendet, um einen geeigneten Wirtszellstamm, typischerweise E. coli, zu transformieren. Erfolgreiche Transformanten werden identifiziert z.B. mithilfe der Tetracyclinresistenz oder anderer phänotypischer Eigenschaften, die das klonierende Vektorplasmid aufweist. Die Transformantenkulturen werden dann mit geeigneten Nucleotidsequenzen sondiert, die Basen enthalten, von denen bekannt ist, dass sie komplementär zu den gewünschten Sequenzen in der cDNA sind. Plasmide aus Klonen, die erfolgreich hybridisieren, werden isoliert und mithilfe im Stand der Technik bekannter Mittel sequenziert, um zu verifizieren, dass die gewünschten Anteile des Gens vorhanden sind. Die gewünschten Genfragmente werden herausgeschnitten und so zugeschnitten, dass sichergestellt ist, dass sie den geeigneten Leserahmen mit den Kontrollsegmenten haben, wenn sie in geeignete Expressionsvektoren insertiert werden. Die zugeschnittene Gensequenz wird dann in einen Vektor gebracht, der einen Promotor im Leserahmen mit dem Gen enthält und mit der vorgeschlagenen Wirtszelle kompatibel ist. Eine Anzahl von Plasmiden, die bereits die geeigneten Promotoren, Kontrollsequenzen, Ribosomenbindungsstellen und Transkriptionsterminatiansstellen enthalten, ebenso wie geeignete Marker sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt.
  • Die Gene können auch so zugeschnitten werden, dass sie modifizierte Antikörper erzeugen. Z.B. mag eine Säugetierschwerkette nicht vollständig aus einer einzelnen Quelle oder einzelnen Art abgeleitet sein, sondern Teile einer Sequenz können aus verschiedenen Pools von mRNA gewonnen werden, wie Maus-Maus-Hybridomas, Human-Maus-Hybridomas oder B-Zellen, die als Antwort auf eine Reihe von Antigentests differenziert sind. Die gewünschten Anteile der Sequenzen können in jedem Fall gewonnen werden unter Verwendung der oben beschriebenen Sondierungs- und Analysetechniken und in einem Expressionsvektor rekombiniert werden. Solche chimären Ketten können mit jeder gewünschten Länge konstruiert werden; so kann z.B. eine vollständige schwere Kette konstruiert werden oder nur eine Sequenz für den Fab-Teil davon.
  • Für die Konstruktion von chimären Antikörpern, bei denen z.B. die variable Sequenz getrennt von den konstanten Sequenzen gewonnen wurde, werden gewünschte Anteile der Gene, die Teile der schweren und leichten Kette codieren, aus geeigneten unterschiedlichen Quellen gewonnen und dann ligiert, um das Gen, das eine solche Kette codiert, zu rekonstruieren. Z.B. werden Teile des Gens für die schwere Kette und des Gens für die leichte Kette, die die variablen Sequenzen von Antikörpern codieren, die von einer Maushybridomakultur erzeugt werden, kloniert und Genfragmente, die die konstanten Regionen der schweren und leichten Ketten für menschliche Antikörper codieren, z.B. aus Humanmyelomazellen kloniert. Die variablen Anteile des Mausgens werden dann mit den konstanten Bereichen des Humangens für jede der zwei Ketten ligiert. Statt Teile der Kette(n) zu spleißen, werden geeignete Aminosäureveränderungen, Deletionen oder Additionen unter Verwendung verfügbarer Techniken, wie Mutagenese gemacht, um die gewünschten Eigenschaften bereitzustellen.
  • Das Gen, das die leichte Kette codiert und das Gen, das die schwere Kette codiert, können in getrennte Expressionsplasmide insertiert werden oder zusammen in das gleiche Plasmid, solange jedes unter der Kontrolle des geeigneten Promotors und der geeigneten Translationskontrolle ist, und verwendet werden, um geeignete Zellen zu transformieren, die unter Bedingungen gezüchtet werden, die für die Produktion des gewünschten Proteins geeignet sind. Solche Bedingungen werden hauptsächlich von der Art des Promotors und den Kontrollsystemen, die in dem Expressionsvektor verwendet werden, bestimmt statt von der Art des gewünschten Proteins. Das so produzierte Protein wird dann aus der Zellkultur gewonnen mit im Stand der Technik bekannten Methoden, deren Auswahl notwendigerweise von der Form, in der das Protein exprimiert wird, abhängt. Wenn schwere und leichte Ketten gleichzeitig im gleichen Wirt co-exprimiert werden, ist das Isolierungsverfahren so ausgebildet, dass rekonstituierter Antikörper gewonnen wird. Dies kann erreicht werden unter Verwendung von Methoden, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind.
  • Spezifische Antikörperfragmente der Erfindung, wie (Fab)2, Fab und Fv-Fragmente, bei denen die Spezifität gegenüber einem speziellen Proteinkonformer konserviert ist, können erhalten werden durch chemische Spaltung vollständiger Antikörper mit wohl bekannten Methoden (siehe z.B. Weir (1986), Handbook of Experimental Immunology, 4. Auflage, Blackwell, Oxford, Bd. 1 Immunochemistry). (Fab)2-, Fab-, Fv- und ScFv-Fragmente können auch durch Gentechnologie erhalten werden, indem Gene kloniert werden, die variable Regionen von schweren und/oder leichten Antikörperketten codieren oder Teile davon, die Sequenzen tragen, die Antikörperbereiche codieren, die spezifisch ein spezielles Proteinkonformer erkennen, oder in rekombinierter Form, um spezifische rekombinante Fab- oder ScFv-Fragmente zu erhalten.
  • Um eine Krankheit zu verstehen und zu behandeln, an der Peptidkonformere beteiligt sind, ist es nützlich, einen oder mehrere Antikörper zu identifizieren, die im Wesentlichen für das Konformer spezifisch sind. Diese Methode beinhaltet, dass eine Anzahl von Konformeren mit einer Anzahl von Antikörpern oder bindenden Fragmenten, die von spezifischen Antikörpern abstammen, in Kontakt gebracht werden. Die Spezifität der Bindung der Antikörper oder Fragmente an einzelne Konformere wird dann ausgewertet. Antikörper oder Fragmente, die im Wesentlichen für jedes der verschiedenen Konformere spezifisch sind, können so gefunden werden.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen der Erfindung sind geeignet zur Verwendung in einer Vielzahl von Abgabesystemen zur Verabreichung an Menschen, einschließlich einer Verabreichung auf parenteralem, z.B. intravenösem, subcutanem, intradermalem, intraperitonealem oder intramuskulärem Weg. Die Antigenpräparate können auch abgegeben werden unter Verwendung implantierter Minipumpen, die dem Fachmann auf diesem Gebiet wohl bekannt sind. Die Zusammensetzungen schließen Formulierungen ein, die ein oder mehrere gereinigte Antigene enthalten, ebenso wie Antikörper, die für ein interessierendes Proteinkonformer spezifisch sind. Die Antikörper können aus Seren von irgendeinem Tier, in dem Antikörper gegen ein interessierendes Proteinkonformer gezüchtet werden können, gereinigt werden. Bevorzugt werden die Antikörper humanisiert. Humanisierte Antikörper können in transgenen Tieren erzeugt werden, die humane Antikörper erzeugen. Humanisierte Antikörper können auch durch biochemische Modifikation von nicht humanen Antikörpern erzeugt werden, z.B. von monoklonalen Maus-Antikörpern, was beinhalten kann, dass der Antigenbindungs- oder Fab-Teil des murinen monoklonalen Antikörpers mit einem nicht bindenden oder Fc-Anteil eines menschlichen Antikörpers fusioniert wird. Humanisierte Antikörper, die mit diesen und anderen Methoden erzeugt werden, behalten die gewünschte Antigenbindungsspezifität, im Allgemeinen ohne eine unerwünschte Immunantwort auf den Antikörper selbst zu erzeugen.
  • Beispiele für pharmazeutisch annehmbare Träger und Formulierungen zur Verwendung mit den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen finden sich in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17. Auflage (1985), das hier durch Bezugnahme miteingeschlossen wird. Bezüglich der Methoden zur Arzneimittelabgabe siehe Langer (1990), Science 249:1527–1533, der hier auch durch Bezugnahme miteingeschlossen wird. Bezüglich der Impfstoffverwendung und Erzeugung siehe Plotkin et al. (Herausgeber) (1999), Vaccines, 3. Auflage, W.B. Saunders, Philadelphia und Zegers et al. (Herausgeber) (1995), Immunological Recognition of Peptides in Medicine and Biology, CRC Press, Boca Raton, Florida, die auch hier durch Bezugnahme miteingeschlossen werden. Bezüglich der Vakzinzuführung über Schleimhäute siehe Ryan et al. (2001), Trends Biotechnol 19:293–304 und Ogra et al. (2001), Clin Microbiol Rev 14:430–445, die auch durch Bezugnahme miteingeschlossen werden. Bezüglich Adjuvantien siehe z.B. G. Gregoriadis, Herausgeber (1990), Immunological Adjuvants and Vaccines (NATO Asi Series A, Life Sciences, Bd. 179), der hier durch Bezugnahme miteingeschlossen wird.
  • Zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung kann es wünschenswert sein, die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zu modifizieren, um ihre Immunogenizität und biologische Verteilung zu verändern. Bezüglich einer allgemeinen Diskussion der Pharmakokinetik siehe Remington's Pharmaceutical Sciences, oben, Kapitel 37 bis 39. Eine Anzahl von Methoden zur Veränderung der Pharmakokinetik, Immunogenizität und biologischen Verteilung sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt (siehe z.B. Langer, oben, Gregoriadis (1990), oben). Beispiele für solche Methoden schließen den Schutz der Mittel in Vesikeln ein, die aus Substanzen, wie Proteinen, Lipiden (z.B. Liposomen), Kohlenhydraten oder synthetischen Polymeren aufgebaut sind. Z.B. können die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung in Liposomen eingebaut werden, um ihre Immunogenizität und biologischen Verteilungseigenschaften zu verbessern. Liposomen, die Vakzinantigene mikroverkapseln und dann mit Polymer beschichtet werden, sind nützlich, um die Abgaberate zu kontrollieren und damit die Wirksamkeit bei parenteral und oral verabreichten Impfstoffen. Eine Vielzahl von Methoden zur Herstellung von Liposomen sind verfügbar, wie z.B. in Szoka et al. (1980), Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467, U.S.-Patente Nr. 4 235 871, 4 501 728 und 4 837 028 beschrieben, die alle hier durch Bezugnahme miteingeschlossen werden. Bezüglich eines kurzen Überblicks über die Verwendung von Liposomen zum Einfangen von Antigenen und der Abgabe von Adjuvantien oder Immunmodulatoren siehe Gregoriadis (1999), Methods 19:156-162 und Rogers et al. (1998), Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 15:421–480, die hier durch Bezugnahme miteingeschlossen werden. Polymere lamellare Substratteilchen, die durch Ausfällen von Poly(D,L-lactid) erzeugt werden, bilden ein polymeres System zur Adsorption von Antigenen. Dieses Verfahren vermeidet pH-Veränderungen, den Kontakt mit organischen Lösungsmitteln und lässt daher zu, dass die Integrität des Antigens erhalten bleibt. Für polymere lamellare Substratteilchen für die intranasale Impfung siehe Jabbal-Gill et al. (2001), Adv Drug Deliv Rev 51:97–111, der hier durch Bezugnahme miteingeschlossen wird.
  • Um Formulierungen zur Injektion herzustellen, wird eine Lösung der Zusammensetzung in einem geeigneten Träger, bevorzugt einem wässrigen Träger, gelöst oder suspendiert. Eine Vielzahl von pharmazeutisch annehmbaren wässrigen Trägern kann verwendet werden, z.B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4% Kochsalzlösung, 0,85% Kochsalzlösung, 0,3% Glycin, Hyaluronsäure und dgl. Die Konjugatpräparate können auch Adjuvans enthalten, um eine aktive Immunantwort auf ein Antigen zu stimulieren. Beispiele für Adjuvantien sind im Stand der Technik wohl bekannt und schließen z.B. Aluminiumhydroxid (Spectrum Chem. Mtg. Corp., New Brunswick, N.J.) oder Aluminiumphosphat (Spectrum), Calciumphosphat, Saponine, Monophosphoryllipid A, Freund's Adjuvans, Liposomen, polymerbeschichtete Liposomen, polymere lamellare Substratteilchen und Cytokine, wie Interleukin-2 ein.
  • Die Zusammensetzungen können als pharmazeutisch annehmbare Träger Substanzen nach Bedarf enthalten, um sich physiologischen Bedingungen anzunähern, z.B. den pH einstellende und puffernde Mittel, die Tonizität einstellende Mittel, Benetzungsmittel und dgl., z.B. Natriumacetat, Natriumlactat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Sorbitanmonolaurat, Triethanolaminoleat und dgl. ebenso wie Konservierungsmittel, einschließlich z.B. Thimerisol, und Proteinträger, einschließlich z.B. Humanserumalbumin oder tierische Seren. Die Zusammensetzungen können mit üblichen wohl bekannten Sterilisationstechniken, einschließlich Sterilfiltration, sterilisiert werden. Die entstehenden wässrigen Lösungen oder Suspensionen können zur Verwendung so wie sie sind, verpackt werden oder lyophilisiert werden, wobei das lyophilisierte Präparat mit einer sterilen Lösung vor der Verabreichung kombiniert wird. Für feste Zusammensetzungen können übliche nicht-toxische pharmazeutisch annehmbare Träger verwendet werden, was z.B. pharmazeutische Qualitäten von Mannit, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talk, Cellulose, Glucose, Saccharose, Magnesiumcarbonat und dgl. einschließt.
  • Die Sequenzierung der Proteinkonformere, gegen die monoklonale Antikörper erzeugt wurden, zeigt, dass die Konformerproteine im Wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz wie das native Protein enthalten. Es ist daher nicht notwendig, eine Epitopkarte auf Basis linearer Peptide zu entwickeln, stattdessen wird das Protein bevorzugt auf konformationale oder diskontinuierliche Epitope kartiert. Die unterschiedliche Spezifität der monoklonalen Antikörper entsteht aus der unterschiedlichen Faltung der gleichen Aminosäuresequenz. So ist eine Konformationsepitopkartierung nützlich, um zu zeigen, dass die monoklonalen Antikörper an beschränkte Epitope binden. Diskontinuierliche Epitope können unter Verwendung einer begrenzten Proteolyse des Antikörpers, der an ein Konformer des interessierenden Proteins bindet, gefunden werden und dann kann das Lysat analysiert werden unter Verwendung von Massenspektrometrie (MS) oder Erzeugung von dreidimensionalen Bildern durch NMR-Spektroskopie oder Kristallografie. Monoklonale Antikörper (MAb) werden an feste Träger gebunden und Lysate, die das Konformerprotein enthalten, werden mit dem immobilisierten Mab inkubiert. Nach Entfernung von ungebundenem Protein werden ausgewählte verdünnte Proteasen zu den immobilisierten Mab-Konformer-Komplexen zugegeben und ungebundene Spaltungsprodukte entfernt. Die gebundenen Konformerproteine werden eluiert unter geeigneten Bedingungen und mit LC-MS analysiert. Die Sequenzierung von Konformerprotein und die Molekülmodellierung sind im Allgemeinen notwendig, um das konformationale Epitop vollständig zu identifizieren.
  • Populationsprofile von Konformeren, die mit der Schwere der Krankheit assoziiert werden oder andere Eigenschaften können entwickelt werden, indem eine Flüssigkeit einer Person mit einer mit dem Konformer in Beziehung stehenden Krankheit oder infizierte Zellen der Person mit einem oder mehreren monoklonalen Antikörpern, die für ein Konformer, das an der Krankheit beteiligt ist, spezifisch sind, in Kontakt gebracht werden. Die Flüssigkeit kann irgendeine Körperflüssigkeit sein, was Blut, Serum, Plasma, Lymphflüssigkeit, Urin, Sputum, Cerebrospinalflüssigkeit oder eine Eiterprobe einschließt. Ein bindendes Fragment, das von einem monoklonalen Antikörper abgeleitet ist, der für ein Wirtsprotein und/oder Konformer spezifisch ist, kann auch verwendet werden. Der monoklonale Antikörper oder das bindende Fragment werden mit einer nachweisbaren Markierung markiert, z.B. einer radioaktiven Markierung oder einer Enzymmarkierung. Beispiele für Enzymmarkierungen, die an einen Antikörper gebunden werden können, schließen Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase und Urease ein und Methoden, um Enzyme mit Antikörpern zu verbinden, sind im Stand der Technik wohl bekannt. Die Markierung kann unter Verwendung von dem Fachmann auf diesem Gebiet wohl bekannten Methoden nachgewiesen werden, z.B. Radiografie oder serologische Methoden einschließlich ELISA oder Blot-Methoden. Die Gegenwart der Markierung weist auf die Gegenwart mindestens eines Protein- oder Peptidkonformers in der einzelnen Person hin und kann verwendet werden, um Konformerprofile zu identifizieren, die eine Rolle im Krankheitsverlauf spielen. Der Nachweis der Markierung in einer Körperflüssigkeit deutet auf die Gegenwart mindestens eines Protein- und/oder Peptidkonformers davon in der Person hin. Eine Mehrzahl von monoklonalen Antikörpern oder von deren bindenden Fragmenten kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Konformeren nachzuweisen, die mit einem Krankheitszustand bei einer Person verbunden sind.
  • Indem Konformere, die mit einer Krankheit verbunden sind, bei einer Anzahl von Personen in einer Population nachgewiesen und charakterisiert werden, kann ein Profil der verschiedenen Konformere, die mit der Krankheit verbunden sind, entwickelt werden. Die Etablierung eines Konformerprofils in einer solchen Population wird durchgeführt, indem Konformere, die mit irgendeiner gegebenen Krankheit bei einzelnen verbunden sind, nachgewiesen und charakterisiert werden, die Daten innerhalb der Population zusammengefasst werden und dann die Beziehung zwischen Konformerprofilen der einzelnen Mitglieder der Population und spezifischen Eigenschaften der Krankheit bei diesen einzelnen festgestellt werden. Diese spezifischen Eigenschaften hängen von der Krankheit und der Art des Protein- oder Peptidkonformers ab und können nicht nur für eine definitive Krankheitsdiagnose verwendet werden, sondern auch zur Bestimmung der Prognose und Entwicklung einer geeigneten Behandlung für einzelne Patienten. Z.B. können verschiedene Peptidkonformere mit einer höheren oder geringeren Schwere der Krankheit verbunden sein. Als weiteres Beispiel können Peptidkonformere mit größerer oder geringerer Resistenz gegenüber der Krankheit verbunden sein. Die Antwort der Einzelnen innerhalb der Population auf verschiedene Krankheitsbehandlungen ist ein wichtiger Faktor bei der Profilierung der Beziehung zwischen Konformerprofil eines Einzelnen und seinem oder ihrem Ansprechvermögen. Personen, die schlecht auf eine Behandlung ansprechen, können z.B. konformationale Formen eines Proteins oder Peptids, das an dem Krankheitsprozess beteiligt ist, haben, die schlechtere Targets für die Behandlung sind, als die konformationalen Formen des Proteins oder Peptids bei Personen, die gut auf die Behandlung ansprechen. Populationsstudien können erfolgen, um diese Beziehungen zwischen Konformeren und der Reaktion mit einem vernünftigen Grad an Signifikanz zu etablieren.
  • Sobald eine Beziehung zwischen einem Konformerprofil und der Behandlungswirksamkeit bei einer Population festgestellt wurde, kann die Auswahl einer Behandlung für einen gegebenen Patienten verbessert werden, indem das Konformerprofil eines einzelnen Patienten bestimmt wird, z.B. unter Verwendung der oben beschriebenen auf Antikörper oder Antikörperfragmenten basierenden Methoden. Solche Behandlungspläne, die sich für einzelne Personen mit im Wesentlichen gleichen Konformerprofilen wie denen des zu behandelnden Patienten als erfolgreich erwiesen haben, werden sich wahrscheinlich als wirksam erweisen. Beispiele für Populationsprofile, die entwickelt werden können, schließen Wirkstoffempfindlichkeit, Wirksamkeit und Nebenwirkungen, Komplikationen der Krankheit oder die Behandlung ein. Von Interesse ist auch die Fähigkeit, solche mAbs in Zusammenhang mit auf einer Population basierenden Patientenprofilen zu verwenden, um jeden einzelnen Patienten zu einem speziellen Zeitpunkt innerhalb einer Untergruppe solcher Populationen auf Basis von Profilen zu lokalisieren und die Veränderung in der Konformerenmischung eines einzelnen Patienten festzustellen und daher deren Mitgliedschaft in einer vorhergesagten auf einer Population basierenden Kohorte als Funktion der Veränderung von Alter, Wirkstofftherapie, Nahrung und Lebensstil.
  • Die hier beschriebenen Methoden und Zusammensetzungen haben eine Anzahl von Verwendungen. Z.B. kann das zellfreie Translations/Zusammenbausystem verwendet werden, um große Mengen spezifischer Proteinkonformere zu erzeugen. Die so erzeugten Proteinkonformere können z.B. zur Immunisierung oder zur Herstellung von Impfstoffen verwendet werden. Ein Antigen, das eine (humorale) Immunantwort selektiv gegen eine Konformation und nicht gegen eine andere Konformation eines gegebenen Proteins hervorruft, wird in immunogenen Mengen bei einem Menschen oder Tier angewendet. Konformationsselektive humorale Immunantworten werden hervorgerufen entweder durch Immunisierung mit einem "Minimalpeptid", das das Oberflächenepitop eines Konformationsantikörpers nachahmt oder mit einem vollständigen Antigen, das mit biochemischen Mitteln und/oder Zufügung zusätzlicher Molekülkomponenten so behandelt wurde, dass die humorale Immunantwort auf das eine Konformationsepitop kanalisiert wird und nicht auf ein anderes ("monospezifische konformationale Antikörperantwort"). Ein Minimalpeptid wird konstruiert, nachdem Kenntnisse über ei genauen dreidimensionalen Oberflächenkontakte zwischen einem spezifischen Antikörper oder abgeleiteten Liganden und dem Antigen erhalten wurde. Die Aminosäurereste, die das Epitop bilden, werden dann gentechnisch in ein Molekül mithilfe der Cyclisierung von linearen Peptidfragmenten und/oder anderen chemischen Modifikationen bearbeitet.
  • Alternativ wird das anzusteuernde Antigen aus präparativen Proben von Körpergewebe, Körperflüssigkeiten oder rekombinanten Expressionssystemen in der spezifischen Konformation isoliert. Dieses Präparat wird dann durch chemische Modifikationen, wie intra- oder intermolekulare Vernetzung, fixiert; andere biochemische Mittel des "Einfrierens" einer Konformation sind Immobilisierung mit zweiten, dritten oder mehr Molekülen. Diese Komplexe werden dann weiter optimiert, so dass eine konformationsspezifische humorale Immunantwort entsteht, indem andere Epitope unterdrückt werden, die nicht unter verschiedenen Konformeren des in Frage stehenden Proteins unterscheiden würden. Dies kann erreicht werden, indem andere immunogene Epitope mithilfe spezifischer Proteasen wegverdaut werden und/oder die anderen Epitope durch chemische Modifikationen geschützt werden. Dieses "Minimalepitop"-Molekül, das aus Peptiden synthetisiert wurde oder biochemisch hergestellte "eingefrorene" Konformere werden dann bei einem Testtier angewendet, um die Konformationsspezifität zu bestätigen und auf Nebenwirkungen zu testen. Schließlich wird das "Minimalepitop"-Molekül in einer pharmazeutischen Standardimmunisierungsformulierung verabreicht und verwendet, um Tiere oder Menschen mit Krankheiten, bei denen ein spezifisches Konformer die Ursache des pathologischen Prozesses ist, zu behandeln. Allgemein wird bei üblichen Immunisierungstechniken erwartet, dass jede Dosis etwa 1 bis 1000 μg Gesamtimmunogen, bevorzugt etwa 2 bis 100 μg, bevorzugter etwa 1 bis 40 μg und am meisten bevorzugt etwa 1 bis 5 μg enthält. Alternativ liegt, wenn Techniken gemäß Blachere et al. (1997) (oben) und Castellino et al. (2000) oben) verwendet werden, die Menge im Nanogrammbereich. In diesem Fall ist die Reinheit des Konformers im Impfstoff von höchster Wichtigkeit. Eine optimale Menge für einen speziellen Impfstoff kann durch Standarduntersuchungen sichergestellt werden, was die Beobachtung von Antikörpertitern und anderen Reaktionen in Patienten beinhaltet. Ein Primärimpfverlauf kann 2 oder 3 Dosen eines Impfstoffs, die im Abstand von 1 bis 2 Monaten gegeben werden, beinhalten, aufgrund genetischer und anderer Faktoren, wird jedoch wahrscheinlich eine Antikörperantwort auf irgendein Impfstoffpräparat variieren zwischen Präparaten und einzelnen Personen. Die Reaktion auf die Impfung wird überwacht, um sowohl kurzzeitige als langzeitige Impfeffizienz zu bestimmen, wobei erstere verwendet werden kann, um Konjugatpräparate auszuwerten und letztere, um Einzelpersonen auszuwerten im Bezug auf den Bedarf für "Booster"-Impfungen. Um den Antikörpertiter nach Impfung zu bestimmen, werden Blutproben von geimpften Tieren analysiert unter Verwendung von Standardtechniken, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind, z.B. ELISA. Bevorzugt schließen die Blutproben Proben von jedem Patienten vor (d.h. negative Kontrolle) und etwa 4 Wochen nach der Impfung und anschließend in Intervallen von etwa 2 bis 6 Monaten ein. Nach Bedarf kann eine Boosterimpfung verabreicht werden.
  • Die Konformere finden auch Nutzen als Reagenzien in Screeningassays auf monoklonale Antikörper, die unterschiedlich an nur ein Proteinkonformer binden und können auch als diagnostisches Mittel für Krankheiten verwendet werden, die ein infektiöses Mittel betreffen, wie mit mit Prionen in Beziehung stehende Krankheiten. Der Test kann in einer Anzahl von Formaten erfolgen. Um auf mit der Krankheit in Beziehung stehende Konformere zu screenen, werden monoklonale Antikörper direkt verwendet. High-throughput-Screening biologischer Proben auf mit der Krankheit in Beziehung stehende Konformere ist auch möglich. Z.B. wird die biologische Probe einer Festphasenimmuneinfangstelle, die mit Antikörpern beschichtet ist, die für ein oder mehrere mit der Krankheit in Beziehung stehende Konformere spezifisch sind, zugegeben; die Bindung weist auf die Gegenwart eines mit der Krankheit in Beziehung stehenden Konformers in der biologischen Probe hin. Eine solche Information kann verwendet werden, um mögliche Behandlungen zu finden oder Kombinationstherapeutika gegen das infektiöse Mittel. Mit der Krankheit in Beziehung stehende Proteine, die ausgewertet werden sollen auf geänderte Konformerverhältnisse schließen Insulin, Insulinrezeptor und Glucosetransporter (Diabetes mellitus), saure Phosphatase der Prostata (Prostatakrebs), Leptin (gestörtes Essverhalten und Fettsucht), nogo-a/b (neuronaler Regenerationsinhibitor), virale Capsidmolekülchaperone, wie hp68 (HIV) und Prionprotein ein.
  • Die für ein mit einer speziellen Krankheit assoziiertes Konformer spezifischen monoklonalen Antikörper können entweder für diagnostische Zwecke verwendet werden, wenn sie mit einer Population von Patienten mit einer speziellen natürlichen Historie, einem Krankheitsverlauf oder anderen klinisch epidemiologischen Erkenntnissen korrelieren oder zur passiven Immunisierung, wenn die Konformerspezifität einer biologischen Antwort modifiziert werden soll. Um Letzteres zu erreichen, wird ein monoklonaler Antikörper, der für eine mit einer speziellen Krankheit assoziierte Konformation spezifisch ist, oder eine rekombinante Form davon gereinigt, um jegliche pyrogenen Kontaminanten oder toxischen Nebenprodukte der Herstellung zu entfernen und zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung verarbeitet und einem Menschen oder anderem Tier, das eine Behandlung der mit dem Konformer in Beziehung stehenden Krankheit benötigt, verabreicht. Allgemein wird die Zusammensetzung intravenös verabreicht. Alternative Verabreichungswege schließen lokale Verabreichung, z.B. auf Wunden oder Schleimhautgewebe, abhängig von der jeweiligen Pathophysiologie des Krankheitsprozesses und der Verfügbarkeit des die Krankheit verursachenden Konformers ein. Passive Immunisierung ist eine etablierte pharmakologische Therapie; siehe z.B. die Herstellerinformation bezüglich der Verabreichung von Trastuzumab (Herceptin®, Roche), Daclizumab, Abciximab und dgl.
  • Geeigneterweise können die Formulierungen in Einzeldosiskits in sterilen Fläschchen bereitgestellt werden, so dass der Arzt die Fläschchen direkt anwenden kann, wobei die Fläschchen die gewünschte Menge und Konzentration der Formulierung enthalten. Wenn die Fläschchen die Formulierung für die direkte Verwendung enthalten, besteht üblicherweise kein Bedarf für andere Reagenzien zur Verwendung bei dieser Methode. Die jeweiligen Zusammensetzungen können in Verpackungsmaterial enthalten sein, das ein Etikett aufweist, das die jeweiligen Zusammensetzungen angibt, die verwendet werden können, um mit einem Proteinkonformer in Beziehung stehende Krankheiten bei Menschen zu behandeln.
  • Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung weiter erläutern ohne Beschränkung.
  • Beispiele
  • Materialien und Methoden
  • Verwendete Puffer
  • Homogenisierungspufter
    • 0,25 M Saccharose (Sigma, USA) 50 mM Hepes (Sigma, USA) 100 mM Kaliumacetat (Merck, Deutschland) 5 mM Magnesiumchlorid (Sigma, USA)
  • Probenladungspuffer
    • 50 mM Tris-Cl (pH 6,8) (Merck, Deutschland) 2% SDS (G/V) (Sigma, USA) 0,1% Bromphenolblau (Sigma, USA) 10% Glycerin (Sigma, USA) 2% β-Mercaptoethanol (Sigma, USA) 12% SDS-Gele wurden gegossen, wie von Sambrook & Russell (2001), Molecular Cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, beschrieben; Reagenzien von BioRad (USA): Acrylamid, TEMED oder Sigma (USA): Ammoniumpersulfat, SDS; Vorrichtung von Biometra Inc., Deutschland.
  • Gel-Laufpuffer
    • 25 mM Tris-Base (Merck, Deutschland) 250 mM Glycin pH 8,3 (Sigma, USA) 0,1 % SDS (G/V) (Sigma, USA)
  • Geltransferpuffer
    • 12 h Transfer auf Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membranen (Millipore, USA) bei 200 mA. 48 mM Tris-Base (Merck, Deutschland) 39 mM Glycin (Sigma, USA) 20% Methanol (Merck, Deutschland)
  • Fakulative Ponceau-Färbung
    • 1 g Ponceau S (Sigma, USA) in 5% Essigsäure (Merck, Deutschland)
  • Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit Tween 20 (TBS-T)
    • 8 g Natriumchlorid (Merck, Deutschland) 0,2 g Kaliumchlorid (Merck, Deutschland) 3 g Tris-Base (Merck, Deutschland) 1000 ml H2O mit 500 μl Tween 20 (0,05%) versetzt (Boehringer Ingelheim, Deutschland) pH auf 7,8 eingestellt
  • Blockierpuffer
    • 5% fettarme Milch (Oxoid, GB) in TBS-T
  • Kupfer-Vorratslösungen
  • 500 mM oder 25 mM Kupfer(II)sulfatpentahydrat (Merck, Deutschland) in ultrareinem Wasser, sterilfiltriert
  • Beispiel 1
  • Herstellung und Analyse der Bindungseigenschaften von konformerspezifischen monoklonalen Antikörpern an Prionprotein
  • Antikörperherstellung
  • 7VC Hybridomazellen wurden in proteinfreiem Hybridoma-Medium (PFHM II; #12040–051 Gibco/Invitrogen, USA), das OptiMAb (#11910–031 Gibco/Invitrogen, USA) in einem 75 ml Gewebekulturkolben enthielt, gezüchtet. Sie wurden geerntet kurz nachdem das Inkubationsmedium sich zu einem mehr gelblichen Farbton zu verfärben begann, um die maximale Antikörperkonzentration aber minimalen Zelltod zu haben. Die Antikörperkonzentration wurde dann gemessen, indem die mAB-Konzentration in Überstand mit einer bekannten durch Westernblotting erhaltenen verglichen wurde. Sie war etwa 100 μg/ml.
  • Versuchsprotokoll
  • Alle Western-Blots wurden unter Verwendung des folgenden Protokolls durchgeführt:
    • 1. 0,5% Hirnhomogenisate von Hamstern oder transgenen Mäusen, wie angegeben, wurden in gleichen Mengen auf ein 12%-SDS-Gel (bei 35 mA Strom laufen gelassen) geladen und auf eine PVDF-Membran überführt durch Eintauch-(nass)-Blotten 12 Stunden bei einem konstanten Strom von 200 mA.
    • 2. Die Membranen wurden gegebenenfalls mit Ponceau S in TBS-T angefärbt, um einzelne Bahnen sichtbar zu machen und den Transfer von Proteinen zu kontrollieren.
    • 3. Nach Waschen mit TBS-T wurden die Membranen mit 5% fettarmer Milch in TBS-T 1 Stunde lang blockiert.
    • 4. "Normales Waschen" schließt drei aufeinander folgende Waschzyklen in mit Millipore behandeltem Wasser (1 min) und TBS-T (5 min) ein; "intensives Waschen" schließt vier aufeinander folgende Waschzyklen in mit Millipore behandeltem Wasser (1 min mit dreifachem Spülen) und Waschstufen mit steigendem TBS-T mit anfangs fünf- und dann zehnminütigen Zyklen.
    • 5. Nach Blockieren wurden die Membranen intensiv gewaschen und gegebenenfalls in einzelne Streifen geschnitten. Schmale Streifen wurden in 15 ml Falcon-Tubes (Greiner, Deutschland) inkubiert.
    • 6. Antikörper wurde auf eine Endkonzentration von 10 μg/ml in TBS-T zugegeben und eine definierte Konzentration an Kupfersulfat oder 100 mM EDTA aus einer Vorratslösung zugegeben. Primärer Antikörper wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler inkubiert.
    • 7. Die Blots wurden intensiv gewaschen.
    • 8. Sekundäre Antikörper (Ziege-Antimaus-IgG H/L-Peroxidase-markiert; #31444 Pierce, USA) wurden in einer Verdünnung von 1:5.000 1 Stunde lang inkubiert.
    • 9. Die Blots wurden intensiv gewaschen. Ein letztes Waschen erfolgte mit Wasser, bevor ein Substrat mit verstärkter Chemilumineszenz (ECL; Amersham Pharmacia, USA) zugegeben wurde und mit Hyperfilm (Amersham Pharmacia, USA) entwickelt wurde.
  • Bereich unterschiedlicher Bindung
  • Bei pH 7,8 des TBS-T-Inkubationspuffers wurde ein differenzielles Bindungsprofil etabliert zum Nachweis von PrPCTM (PrP-Immunoreaktivität in Tg(KH > II)-Maushirnen gegen PrP sekretorisch (PrP-Immunoreaktivität in Tg(7BHOZ)-Maushirnen). Es wurde gefunden, dass die unterschiedliche Immunoreaktivität von Tg(KH > II) in CuSO4 Konzentrationen zwischen 1 μM und 50 μM vorhanden war. Höhere Konzentrationen schwächten die Immunoreaktivität signifikant und zogen schließlich den Antikörper vollständig von dem Blot ab. Niedrigere Konzentrationen ergaben inkonsistente Ergebnisse ohne klare Unterscheidung; daher wurden 100 mM EDTA zugegeben, um Metallionen, die statistisch in Blots und Puffern vorhanden sind, auszukomplexieren.
  • Bei festen Antikörper- (10 μg/ml) und Kupfer- (25 μM) Konzentrationen wurde der pH in TBS-T variiert und es wurde gefunden, dass bei pH 5 die gesamte Immunoreaktivität verloren war, bei pH 7,8 die Immunoreaktivität unterschiedlich war zwischen Tg(KH > II)- und Tg(7BHOZ)-Gehirnen und positiv aber nicht unterschiedlich bei pH 9 war.
  • Beispiel 2
  • Identifizierung eines monoklonalen Antikörpers, der an NTM PrP bindet
  • In vitro translatierte PrP-Isoformen wurden hergestellt, wie in USPN 09/739 179, eingereicht am 15. Dezember 2000 und veröffentlicht am 26. September 2002 als US-2002-0137915-A1, beschrieben, deren Offenbarung hier durch Bezugnahme miteingeschlossen wird. Die erzeugten Konformationsisoformen wurden durch Immunfällung mit monoklonalen Antikörpern gescreent, die unter Verwendung von Methoden, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind, hergestellt worden waren und von denen vorher gezeigt worden war, dass sie mit PrP wechselwirkten (siehe z.B. die Ergebnisse von Beispiel 1 oben). Die in-vitro-Translation von PrP-Isoformen wird in 8 gezeigt (linke Bahn) und die Immunpräzipitation oder Immunfällung mit Klonen von 7VC (Bahn 2 und 3) und 19B10 (Bahnen 4 und 5). 19B10 erkennt sekretorisches oder CTM PrP nicht, sondern nur NTM PrP und Vorläufer-PrP.
  • Beispiel 3
  • Lokalisierung von PrP-Isoformen in mit Scrapie infizierten Neuroblastomzellen
  • Permanent mit Scrapie infizierte Neuroblastomzellen (ScN2a) wurden verwendet, die von einer Infektion von Neuroblastomzellen (N2a-Zellen; ATCC # CRL 131) mit dem RML-Stamm von Maus-adaptierter Scrapie (Chandler et al. 1961, The Lancet i: 1378–1379) und anschließende Subklonierung (Bosque und Prusiner, J. Virology 74:4377–4386) stammen.
  • Die Immunfärbung der Zellen erfolgte wie von Korth et al. (2000), Journal of General Virology 81:2555 beschrieben. Die für 7VC und 19B10 verwendeten Antikörpersuspensionen waren Zellkulturüberstände von HT-Medium (Minimalessenzielles Medium (Invitrogen/Gibco # 21090–022), das mit 10% FCS (PAA Laboratories, Linz, Österreich) und 100 U/100 μg/ml Penicillin/Streptomycin, Endkonzentration, ergänzt war und Hypoxanthin und Thymidin (beide von Sigma, USA) wurden mit 1,36 bzw. 0,76 mg/100 ml Endkonzentration in einer Konzentration von 1:1 mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung zugegeben. Die Ergebnisse sind in 9 gezeigt.
  • Immunfärbung von ScN2a-Zellen ohne Antikörper (linkes Feld von 9), mAB 6H4 (zweites Feld von links), mAB 19B10 (drittes Feld von links) und mAB 7VC (rechtes Feld). Die Immunfärbung wurde auf der Zelloberfläche (oberes Feld) oder nach Permeabilisierung mit Saponin (Sigma, USA) für intrazelluläre Färbung (unteres Feld) durchgeführt. Wie die Ergebnisse zeigen, färbt mAB 7VC sowohl die Zelloberfläche als auch die intrazellulären Kompartimente von ScN2a-Zellen. MAB 19B10 färbt die Zelloberfläche von ScN2a-Zellen, was darauf hindeutet, dass NTMPrP an der Zelloberfläche dieser Zellen vorhanden ist. MAB 19B10 färbt die intrazellulären Kompartimente nicht, wenn die Zellen mit Saponin permeabilisiert werden; dies beruht wahrscheinlich auf der Denaturierung der NTMPrP-Konformation durch Saponin.
  • Beispiel 4
  • Differenzierung von mit Scrapie infizierten Neuroblastomzellen mit 19B10
  • ScN2a-Zellen sind N2a-Zellen, die aus einer zusammenfließenden 10-cm-Zellkulturschale entnommen wurden und in eine 60-mm-Schale (1 Tropfen) aufgespalten wurden. Sie werden auf Minimalessenzialmedium, das mit 10% FCS und Penicillin/Streptomycin, wie oben beschrieben, ergänzt ist, gezüchtet. Unterschiedliche Konzentrationen von Nybridomazellkulturmediumüberstand (HT-Medium, siehe oben) wurden zugegeben (0,5%, 1 %, 5%, 10%, 50% und HT-Medium allein als Kontrolle). Medium und zugegebene HT-Mediumüberstände wurden jeden zweiten Tag 1 Woche lang ausgetauscht. Nach 7 Tagen Behandlung und nicht vorher und nur in einem engen Konzentrationsbereich von 5 bis 10% zugegebenem HT-Medium (entsprechend einer End-mAB-Konzentration von 2 bis 4 μg/ml Zellkulturmedium) wurde beobachtet, dass ein massiver Zelltod auftrat, aber die verbleibenden ScN2a-Zellen waren zu Riesenzellen differenziert (vgl. 10 oberes Feld links mit rechtem Bild). Dies wurde begleitet von einem apoptoseartigen Blebbing einiger Kerne (10, mittleres Feld) und einer Downregulierung der Gesamt-PrP-Expression (10, unteres Feld), was durch intrazelluläre PrP-Färbung mit mAB 6H4 zu sehen ist, durchgeführt, wie von Korth et al. beschrieben (2000), Journal of General Virology 81:2555.
  • Die Behandlung von ScN2a-Zellen (und auch N2a-Zellen, Daten nicht gezeigt) mit mAB 19B10 führt zu einer dosisabhängigen Wirkung, die Zelltod und Differenzierung der verbleibenden Zellen einschließt. Aus bisher unbekannten Gründen haben Konzentrationen von ≥ 50% (≥ 10 μg/ml) von mAB 19B10 diese Wirkung nicht. Es ist auch unbekannt, warum die Wirkung ziemlich plötzlich – aber zuverlässig – nach etwa 1 Woche Behandlung auftritt. Das Ansteuern von PrP mit anderen Antikörpern (z.B. 7VC oder 6H4) führt nicht zu diesen Wirkungen. Ziemlich einheitlich führt das Ansteuern von NTM PrP mit mAB 19B10 zu einer allgemeinen Downregulierung von PrP (was durch Immunfärbung zu sehen ist).
  • Beispiel 5
  • Hemmung der Prionreplikation durch konformerspezifische monoklonale Antikörper
  • ScN2a-Zellen wurden behandelt, wie in Beispiel 4 oben beschrieben. Nach 1 Woche wurden die Zellen lysiert und wurden exakt, wie von Korth et al. (2001), PNAS 98:9836 beschrieben, aufgearbeitet. Wie in 11 gezeigt, hemmt mAB 7VC die Prionreplikation in ScN2a-Zellen (11, oberes Feld). MAB 19B10 hemmt die Prionreplikation in ScN2a-Zellen nur bei Konzentrationen von 10% (ca. 4 μg/ml), nicht aber bei Konzentrationen ≥ 50% (10 μg/ml) oder weniger als 5% (2 μg/ml). Die Antiprionwirkung von mAB 19B10 steht im Gegensatz zu der von anderen mABs, einschließlich 7VC. "Übliche" mABs schirmen PrPC (wahrscheinlich die sekretorische Form) davon ab, umgewandelt zu werden (Peretz et al. (2001), Nature 412:(6848):739–43), wohingegen 19B10 wirkt, indem es die PrP-Expression herunterreguliert.
  • Beispiel 6
  • Unterschiedliche Kupferabhängigkeit von verschiedenen PrP-Arten
  • Gehirne wurden mit einem Dounce-Homogenisator in 0,25 M Saccharose, 150 mM Kaliumacetat und 5 mM Magnesiumchlorid ("Puffer A") zu einem 10%igen Homogenisat homogenisiert. Die Homogenisate wurden dann auf 1 % verdünnt und durch Zentrifugation in einer Tischzentrifuge mit 1000 U/min 1 Minute lang vorgeklärt. Dann wurden 1,5 ml vorgeklärtes 1 %iges Homogenisat und ca. 5 μg in serumfreiem Medium gezüchteter mAB 7VC und Protein-A-Agarose über Nacht bei 4°C inkubiert. Agarosehaltiges Protein-A-gebundenes 7VC und immungefälltes PrP wurden dann durch ein kurzes (ca. 10 s) Schleudern mit 1000 U/min in einer Tischzentrifuge ausschleudert und mit Puffer A dreimal gewaschen. Anschließende Elutionen mit 50 μl sterilem Wasser, das zunehmende Konzentrationen von Kupfersulfat (Cu2SO4) enthielt, wurden genommen und auf einem SDS-Gel laufen gelassen. Ein Western Blot zeigt Eluate mit unterschiedlichen Kupferkonzentrationen nach Immunfällung von 7BHOZ Hirnhomogenisat (transgene Maus, die PrP von Syrischem Hamster exprimiert; 12A, oberes Feld) oder F1198-Hirnhomogenisat (transgene Maus, die PrP von mutiertem Syrischen Hamster exprimiert mit zunehmendem CTMPrP; 12A, unteres Feld). Wie gezeigt, bindet mAB 7VC in kupferabhängiger Art und Weise an verschiedene PrP-Arten in Lösung. In dem Homogenisat, in dem CTMPrP vorhanden ist, können sogar höhere Konzentrationen an Kupfer PrP nicht vollständig eluieren ("Gel"-Bahn); außerdem gibt es PrP-Arten, die mit hohen Konzentrationen von Kupfer in dem CTMPrP-haltigen Homogenisat eluierten, nicht aber im normalen Homogenisat.
  • Western Blots von nicht mit Protease verdautem Hirnhomogenisat von normalem Syrischen Hamster, Hirnhomogenisate von mit Scrapie infiziertem (Sc237-Stamm) Syrischen Hamster und mit Protease verdautes Hirnhomogenisat von mit Scrapie infiziertem Syrischen Hamster, hergestellt wie in Beispiel 1 oben beschrieben, sind in 12b gezeigt. PrP aus verschiedenen Hirnhomogenisaten, auf eine Membran geblottet, hat unterschiedliche kupferabhängige Affinitäten für mAB 7VC. Insbesondere wird die Immunoreaktivität von PrP aus normalem Gehirn viel leichter durch Kupfer ausgelöscht als bei Scrapie-infiziertem Gehirn. Da beide Homogenisate in SDS vor der Gelelektrolyse gesiedet wurden, gibt es Merkmale in PrP, die dieses Denaturierungsverfahren "überleben" können und zu einer gewissen erneuten Faltung der Membran führen, die dann die beschriebenen Unterschiede offensichtlich macht. Unter Verwendung des vorliegenden Verfahrens kann mAB 7VC Scrapie-infiziertes Gehirn von nicht infiziertem Gehirn in kupferabhängiger Art und Weise unterscheiden.
  • Beispiel 7
  • Bindung von konformersgezifischen Antikörpern an verschiedene Gehirnhomogenisate
  • Ein Western Blot von 10%igen Hirnhomogenisaten in Puffer A, hergestellt wie vorher beschrieben, wurde verwendet und mit mABs 7VC, 19B10 und 6H4 inkubiert. Die Ergebnisse sind in 13 gezeigt. mAB 7VC bindet an Octarepeats, daher kann er moPrP, dem die Octarepeats entfernt wurden, immunologisch nicht erkennen (13, unteres Feld rechts, vgl. Bahn 7 und 8). mAB 19B10 hat generell eine schwache Immunoreaktivität. Die stärkste Immunoreaktivität besteht bei Gehirnhomogenisaten aus transgenen Mäusen, in denen die PrP-Expression unterdrückt wurde durch Expression unter Tetracyclinpromotor; wenn der Tetracyclinpromotor entfernt ist, wird die PrP-Expression induziert und die Mäuse werden krank mit Zeichen von neurologischer Krankheit. Diese Mäuse produzieren wahrscheinlich abweichende Isoformen von PrP, wahrscheinlich einschließlich CTMPrP und NTMPrP.
  • Beispiel 8
  • Herstellung von konformerspezifischen monoklonalen Antikörpern und deren Verwendung bei der Patientenprofilierung
  • Ein denaturiertes oder natives Antigen wird verwendet, um eine Maus zu immunisieren und Hybridomas werden erzeugt durch Fusion von Splenozyten mit Myelomazellen. Die entstehenden Hybridomas werden gescreent durch Lösungs-IP gegen konformerangereicherte zellfreie Translationsprodukte oder konformerhaltige Gewebeschnitte oder Zellen durch Immunfärbung oder durch Western Blot, wobei die wenigen oft schwach reagierenden Vertreter, die rein konformationsspezifisch sind, identifiziert werden. Patientenserum oder isolierte und lysierte "Buffy coat" aus einer zentrifugierten antikoagulierten Blutprobe wird dann als "unbekannt" verwendet unter Bezugnahme auf die bekannten zellfreien Translationskonformere und wird durch Lösungs-IP, Western Blot oder Immunfärbung auf relative Reaktivität der Antikörper, die für unterschiedliche Konformere spezifisch sind, gescreent, um ein Konformerindexprofil zu erzeugen, das die relativen Verhältnisse eines Konformers zu den anderen in dem speziellen Patientenserum zu der Zeit, zu der das Blut abgenommen wurde, widerspiegelt. Veränderungen im Profil können bestimmt werden durch Korrelation von Population und retrospektiver klinischer Epidemiologie und können als Funktion von Zeit, Wirkstofftherapie, Nahrung und Lebensstil oder andere Veränderungen überwacht werden, um den jeweiligen Zustand irgendeines gegebenen Patienten mit der auf der Population basierenden Kohorte zu korrelieren.
  • Beispiel 9
  • Immunisierung gegen Prionkrankheit
  • PrPCTM wird synthetisiert in einem in-vitro-Translationssystem, wie von Hay et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7:914–919; Hegde et al. (1998) oben und Hegde et al. (1999) oben beschrieben. Mutierte PrP-Konstrukte werden verwendet, so dass einzelne PrP-Konformere favorisiert sind. Für das Immunisierungsverfahren werden Methoden, die von Srivastava und Kollegen entwickelt wurden, verwendet (siehe (Blachere et al. (1997) oben und (Castellino et al. (2000) oben). Kurz gesagt, werden rekombinantes (Maus oder andere Art) HSP70 (1 bis 10 μg) und das Antigen, in vitro translatiertes PrPCTM (so viel wie möglich, aber mindestens 50 ng) zusammen mit PBS, das 1 mM KCI, 2 mM MgCl2 und 100 μM ATP enthält, 60 Minuten bei Raumtemperatur in einem geeigneten Volumen inkubiert; schließlich wird 1 mM ADP zugegeben und 30 Minuten lang inkubiert. Dies ist das Antigen. Das Antigen wird dann zur Immunisierung des gewünschten Tiers verwendet entweder durch intracutane, subcutane, intramuskuläre, intraperitoneale oder intravenöse Injektion gemäß Standardprotokollen. Gegebenenfalls werden Adjuvantien, wie Freund's komplettes Adjuvans, RIBI oder Aluminiumhydroxid (alle von Sigma, USA) oder ein rekombinantes Cytokin, wie Interleukin-2, verwendet.
  • Beispiel 10
  • Passive Immunisierung mit konformationsspezifischen Antikörpern
  • Die passive Immunisierung beinhaltet zuerst die Identifikation eines mit einer Krankheit assoziierten Konformers eines Proteins. Monoklonale Antikörper oder Derivate davon mit der gewünschten differenziellen Bindungsspezifität werden wie oben beschrieben erzeugt. Diese monoklonalen Antikörper werden so prozessiert, dass sie physiologisch annehmbar sind und die entsprechenden pharmakologischen Standards für die Verabreichung erfüllen. Gewöhnlich sind Antikörper höchst gereinigt, Pyrogene extrahiert und mögliche immunogene Epitope auf dem monoklonalen Antikörper durch genetische Modifikation des monoklonalen Antikörpers unterdrückt (z.B. "humanisierte Antikörper"). Ein pharmazeutisches Präparat des Antikörpers wird dann einem Tier, das es benötigt, je nach Krankheitsphänotyp und Lokalisierung der Krankheit intravenös, subcutan, intramuskulär, intraventrikulär, intraperitoneal oder lokal an cutanem oder Schleimhautgewebe gegeben. Diese Behandlung wird so lange wiederholt, wie die Symptome der Krankheit fortbestehen und bis der Schutz etabliert ist.
  • Beispiel 11
  • Erzeugung von konformationsempfindlichen Antikörperchips
  • Konformationsempfindliche Antikörperchips zur Profilierung von Patientengewebe oder Flüssigkeitsproben zur High Throughput-Diagnose werden wie folgt hergestellt. Eine Gruppe konformationsspezifischer Antikörper, die mit den oben im Detail angegebenen Methoden gezüchtet werden, wird kovalent an einem speziellen Mikroarray fixiert, bevorzugt einem adressierbaren Mikroarray. Es gibt keine Beschränkung in der Anzahl der konformationsspezifischen Antikörper, die verwendet werden, da die einzelnen Unterschiede von Reaktivitäten einzelner Antikörper (in fixierten Mengen) mit dem jeweiligen Gewebe oder den Flüssigkeitsproben untersucht und dokumentiert werden. Je größer die Anzahl der verwendeten Antikörper ist, desto höher ist das Profilierungspotenzial. Da die Mikroarrays mit Standardverfahren hergestellt werden (siehe z.B. die Anleitungen des Herstellers von Affymetrix oder Ciphergen) und im Mikro- bis Nanomaßstab betrieben werden, werden Hunderte von monoklonalen Antikörpern verwendet. Eine Gewebeprobe oder Körperflüssigkeit in einer geeigneten Pufferlösung wird mit dem Chip in Kontakt gebracht und jegliches ungebundene Material durch Waschen entfernt. Die Bindung wird z.B. mit biophysikalischen Mitteln (z.B. Laserscanning und/oder Plamonresonanzmessung, Fluoreszenzlöschung) oder immunologisch nachgewiesen. Beispiele für Nachweisverfahren schließen solche ein, die für Antikörperchips verwendet werden (Becton & Dickinson, Ciphergen und andere). Die Gegenwart der jeweiligen Konformere wird erkennbar gemacht durch Nachweis der Bindung der monoklonalen Antikörper, die auf dem Chip immobilisiert sind. Die Gegenwart oder Abwesenheit spezieller Konformere wird dann verwendet, um ein Profil für den Patienten zu entwickeln.
  • Wie oben gezeigt, wurde eine einzigartige molekulare Struktur in PrPCTM (das auch mit PrPsc assoziiert ist) gefunden unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, der diese molekulare Struktur differenziell erkennen kann. Diese einzigartige molekulare Komponente, die mit PrPCTM und PrPsc assoziiert ist, kann mit mAB 7VC unter definierten Bedingungen mit überschüssigen Kupferionen, die in der Nähe der Bindungsstelle von mAB 7VC vorhanden sind, gefärbt werden. Bei pH 7,8 des TBS-T-Inkubationspuffers wurde ein differentielles Bindungsprofil von PrPCTM (PrP-Immunoreaktivität in Tg(KH > II)-Mausgehirnen gegenüber sekretorischem PrP (PrP-Immunoreaktivität in Tg(7BHOZ)-Mausgehirnen) etabliert. Es wurde gefunden, dass eine unterschiedliche bzw. differentielle Immunoreaktivität von Tg(KH > II) bei CuSO4-Konzentrationen zwischen 1 μM und 50 μM vorhanden war. Höhere Konzentrationen schwächten die Immunoreaktivität signifikant und zogen schließlich den Antikörper vollständig von dem Blot ab. Geringere Konzentrationen lieferten inkonsistente Ergebnisse ohne klare Unterscheidung; daher wurden 100 mM EDTA zugegeben, um Metallionen, die zufällig in Blots und Puffern vorhanden sind, auszukomplexieren. Bei festen Antikörper-(10μg/ml)- und Kupfer-(25 μM)-Konzentrationen wurde der pH in TBS-T variiert. Es wurde gefunden, dass bei einem pH von 5 jegliche Immunoreaktivität verschwunden war, bei pH 7,8 die Immunoreaktivität unterschiedlich war zwischen Tg(KH > II)- und Tg(7BHOZ)-Gehirnen und positiv, aber nicht unterschiedlich bei pH 9 war. Diese molekulare Komponente ist entweder eine kovalente Modifikation oder eine extrem enge Faltung des Proteins oder beides. Die molekulare Ansteuerung von mAB 7VC zu der Struktur ermöglicht nun die differenzielle Erkennung von PrPCTM oder PrPSc gegenüber anderen PrP-Arten.
  • Ein zweiter mAB wurde identifiziert, 19B10, der differentiell an PrPNTM bindet und die Zelloberfläche von ScN2a-Zellen färbt. Die Zugabe des Antikörpers zu kultivierten N2a- oder Sc2a-Zellen führt zu einer Reduktion der Zellzahl und Differenzierung der überlebenden Zellen nach 1 Woche Behandlung bei mittleren Konzentrationen von etwa 25 bis 250 μg/ml. Behandelte Zellen werden größer, haben mehr axonale Extensionen und die PrP-Expression (alle konformationalen Isoformen) ist hinunterreguliert. Die Behandlung ist reversibel. N2a-Zellen sind empfindlicher auf die Behandlung und die Umkehr der Wirkungen erfolgt schneller als mit ScN2a-Zellen. Es ist eine Hypothese der Erfindung, dass 19B10 mAB an unglycosilierte und monoglycosilierte Formen von PrP bindet.
  • Alle Publikationen und Patentanmeldungen, die in dieser Beschreibung erwähnt werden, zeigen das Ausmaß des Fachwissens des Fachmanns auf diesem Gebiet, an den sich die Erfindung richtet. Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen werden hier durch Bezugnahme miteingeschlossen in dem Ausmaß, in dem die einzelne Veröffentlichung oder Patentanmeldung spezifisch und einzeln angegeben ist.
  • Nachdem die Erfindung nun vollständig beschrieben wurde, ergibt sich für den Fachmann auf diesem Gebiet, dass viele Veränderungen und Modifikationen erfolgen können, ohne von der Idee und dem Schutzbereich der beigefügten Ansprüche abzuweichen.
  • Figure 00360001

Claims (27)

  1. Kit zum Nachweis einer Prionkrankheit in einer Probe, wobei der Kit eine diagnostisch wirksame Menge eines Antikörpers beinhaltet, der durch seine Fähigkeit gekennzeichnet ist, an PrPCTM in situ zu binden, um zu bestimmen, ob der Antikörper spezifisch an irgendein Material in einer Probe bindet, unter Bedingungen, unter denen eine differenzielle Bindung des Antikörpers an PrP-Isoformen, die mit der Prionkrankheit assoziiert sind, auftritt, wobei die Antikörperbindung ein Hinweis auf eine Prionerkrankung ist.
  2. Kit nach Anspruch 1, bei dem die Probe ein Gewebe oder eine Körperflüssigkeit ist.
  3. Kit nach Anspruch 1, wobei die Bedingungen eine lokale Konzentration von Cu2+-Ionen in einer Menge, die die differenzielle Bindung fördert, beinhalten.
  4. Kit nach Anspruch 3, wobei die lokale Konzentration etwa 1 μM bis etwa 50 μM ist.
  5. Kit nach Anspruch 1, wobei die Bedingungen einen pH-Wert von etwa 7,8 beinhalten.
  6. Zusammensetzung enthaltend: eine Hybridoma-Zellkultur, die monoklonale Antikörper erzeugt, die spezifisch an ein Konformer von PrP binden, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus PrPCTM und PrPNTM, und eine geringe oder keine Kreuzreaktivität mit einem zweiten Konformer von PrP haben.
  7. Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei die monoklonalen Antikörper als 7VC oder 19B10 bezeichnet werden.
  8. Zusammensetzung enthaltend: einen monoklonalen Antikörper, der an eine antigene Determinante eines PrP-Konformers auf der Oberfläche einer Neuroblastomzelle bindet und eine geringe oder keine Kreuzreaktivität mit Nicht-Zelloberflächen-Antigendeterminanten von PrP-Konformeren hat.
  9. Hybridom, das monoklonale Antikörper mit der gleichen Antigenspezifität, wie die der monoklonalen Antikörper 7VC oder 19B10 exprimiert.
  10. Monoklonale Antikörper, die aus einem Hybridom gemäß Anspruch 9 stammen.
  11. Monoklonales Antikörperfragment, das von einem monoklonalen Antikörper mit der Bindungsspezifität eines monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 10 abgeleitet ist.
  12. Monoklonale Antikörper gemäß Anspruch 10, markiert mit einem Mittel, das ein nachweisbares Signal liefern kann.
  13. Prionproteinkonformerspezifische monoklonale Antikörper, die mit einem Verfahren erhältlich sind, das beinhaltet: dass Prionproteinkonformere, die jeweils unter Verwendung eines zellfreien Translationssystems hergestellt wurden, mit einer Zusammensetzung in Kontakt gebracht werden, die ein oder mehrere monoklonale Antikörper enthält, die an ein Prionproteinkonformer binden, die Bindung der monoklonalen Antikörper an ein oder mehrere Prionproteinkonformere nachgewiesen wird durch Immunfällung aus der Lösung und monoklonale Antikörper isoliert werden, die im wesentlichen spezifisch an ein einzelnes Prionproteinkonformer binden, wodurch konformerspezifische monoklonale Antikörper erhalten werden.
  14. Hybridomas, um konformerspezifische Mabs zu unterscheiden erhältlich unter Verwendung einer Immunfällung von radioaktiv markierten Translationsprodukten, die in Gegenwart von mikrosomalen Membranen synthetisiert wurden, die aus dem endoplasmatischen Reticulum stammen, aus der Lösung, was zu einer Anreicherung eines Konformers gegenüber einem anderen führt.
  15. Hybridomas nach Anspruch 14, wobei die Konformeranreicherung von radioaktiv markierten Translationsprodukten durch Signalsequenz-Swapping erreicht wurde.
  16. Hybridomas nach Anspruch 14, wobei die Konformeranreicherung von radioaktiv markierten Translationsprodukten durch Veränderung der Ribosomenmembranverbindungsstelle erreicht wurde.
  17. Hybridomas nach Anspruch 14, wobei die Konformeranreicherung von radioaktiv markierten Translationsprodukten durch Translation von von Glycoprotein abgereicherten Mikrosomenmembranen erreicht wurde.
  18. Hybridomas nach Anspruch 17, wobei die Konformeranreicherung durch Exprimieren von bezüglich der Signalsequenz geswappten oder ausgetauschten cDNAs in transfizierten Säugetierzellen erreicht wurde.
  19. Spezifischer Antikörper (7VC), der Prionprotein in kupferabhängiger Art und Weise erkennt.
  20. Monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 9, wobei der monoklonale Antikörper PrPNTM erkennt.
  21. Spezifischer Antikörper (SS), der die Signalsequenz von PrP erkennt.
  22. Monoklonaler Antikörper mit der Bezeichnung 19B10.
  23. Monoklonaler Antikörper mit der Bezeichnung 7VC.
  24. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 9, wobei der monoklonale Antikörper PrPCTM erkennt.
  25. Kit nach Anspruch 2, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
  26. Kit nach Anspruch 25, wobei der monoklonale Antikörper ein als 7VC bezeichneter monoklonaler Antikörper ist.
  27. Epitop; das von dem monoklonalen Antikörper 7VC erkannt wird, wobei das Epitop in einer Aminosäuresequenz erscheint, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Octarepeatsequenz eines Prionproteins, WGQPHGGGWGQPHGG, GWGQPHGGGWGQPH und GGGEGQGGGTHNQWN.--.
DE20320429U 2002-10-10 2003-08-18 Monoklonale Antikörpertools für die biokonformatische Analyse Expired - Lifetime DE20320429U1 (de)

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