-
Gebiet der
Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen, um Proteinkonformationsisoformen
zu unterscheiden, und zur Diagnose und Behandlung von Krankheiten,
die mit einer speziellen konformationalen Isoform in Beziehung stehen.
Die Erfindung betrifft beispielsweise Zusammensetzungen mit monoklonalen
Antikörpern,
die unterschiedlich an Prionproteinisoformen binden, und deren Verwendung
zum Nachweis und/oder zur Hemmung einer Prionenkrankheit.
-
Hintergrund
-
Die
Proteinbiogenese auf dem sekretorischen Weg beinhaltet verschiedene
Prozesse, die sich im Zeitverlauf mit der Synthese der Polypeptidketten überlappen.
Als erstes muss die naszierende bzw. entstehende Polypeptidkette
korrekt der Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER) zugeführt werden.
Dann wird die Translokation in das Lumen des ER begonnen. Das Falten
der Polypeptidkette muss früh
während
der Translokation beginnen. Während
und direkt nach der Translokation treten posttranslationale Modifikationen auf
und es werden Entscheidungen von der Zelle getroffen im Hinblick
auf den Abbau unerwünschter
Ketten, einschließlich
der Rücktranslokation
in das Cytoplasma und dem Abbau durch das Proteasom. Von den Prozessen,
die gleichzeitig mit der Translokation ablaufen, ist der profundeste
vielleicht die Proteinfaltung, da dies die kritische Stufe in der
Decodierung der Information im Genom ist. Ein falsch gefaltetes
Protein kann so schlecht oder schlimmer sein, als überhaupt
kein Protein zu haben. Wenn Proteine mehrere gefaltete Zustände mit
unterschiedlichen Funktionen haben, bestimmt der genaue Weg des
Faltens und seine Steuerung, welche Funktion tatsächlich exprimiert
wird und in welchem Ausmaß.
-
Ein
fundamentales Dogma der modernen Biologie ist es, dass die Primärstruktur
die Sekundärstruktur bestimmt,
die zusammen mit geeigneten posttranslationalen Modifikationen,
wie Disulfidbindungsbildung, die tertiäre (und quartäre) Proteinstruktur
bestimmt. Diese Organisation, von primärer Struktur, sekundärer Struktur,
tertiärer
Struktur bildet ein Organisierungsprinzip "erster Ordnung" für
die Proteinfaltung. In dem Ausdruck "Struktur" ist implizit die Feststellung einer
einzigen stabilen Einheit enthalten; aber Proteinstruktur ist ein
statistisches Konzept. Native Proteinkonformationen sind energetisch
bevorzugt gegenüber
ungefalteten, denaturierten Formen der gleichen Ketten; aber die
energetische Präferenz
ist mäßig (10
kcal/Mol), was bedeutet, dass Proteine dynamische, fließende Einheiten
sind und sogar "stabile" Proteine sich in
einem gewissen Ausmaß vorübergehend
entfalten.
-
Die
Translokation überlappt
sich mit der Proteinfaltung, daher wäre zu erwarten, dass im Verlauf
der Evolution diese zwei Prozesse einander beeinflusst haben. Faltungswege
können
modifiziert worden sein, um sich an die Bedürfnisse der Translokation anzupassen;
Translokationswege können
modifiziert worden sein, um sich an die Bedürfnisse der Faltung anzupassen.
Eine wachsende Menge an Literatur liefert Stützung für beide Möglichkeiten. Das dramatischste
Beispiel für
eine Translokationssteuerung mit Implikationen für die Faltung wird bis heute
in der Biogenese des Prionproteins (PrP) gesehen. Im Fall von PrP
führt eine
homogene Population naszierender Ketten zu drei topologischen Formen.
Eine davon, sec-PrP, scheint vollständig über die ER-Membran translokalisiert
(ausgeschieden) zu werden und durch einen C-terminalen Glycolipidanker festgehalten
zu werden; dies ist die im normalen Gehirn beobachtete Form. Obwohl
die Funktion von sec-PrP unbekannt ist, ist es wahrscheinlich, durch
Analogie mit anderen glycolipidverankerten Proteinen, dass es Signalfunktionen
im Nervensystem hat. Eine kürzlich
gezeigte anti-apoptotische Funktion scheint mit dieser Rolle konsistent
zu sein. Die anderen beiden Formen von PrP durchspannen die Membran
einmal in entgegengesetzten Orientierungen mit einer Membrandurchspannungsstrecke
von ungefähr
112 ± 130
Aminosäuren.
Im Gegensatz dazu werden die beiden anderen Formen von PrP als einzeln
durchspannende Membranproteine in entgegengesetzten Orientierungen
entweder mit dem N- oder C-Terminus in das ER-Lumen erzeugt (als NtmPrP bzw. CtmPrP
bezeichnet). CtmPrP schaltet spontan die
Neurodegeneration an, wenn es überexprimiert
wird. Weiterhin scheint bei einer infektiösen Prionkrankheit CtmPrP direkt vor dem Einsetzen klinischer
Zeichen induziert zu werden, was darauf hindeutet, dass es einen
letzten gemeinsamen Stoffwechselweg zur Neurodegeneration impliziert.
Andere Untersuchungen beteiligen ein bis jetzt unbekanntes Glycoprotein
der ER-Membran als Translokationszugangsfaktor (TrAF), das das normale
Gehirn vor einer Expression von CtmPrP "schützt", indem es naszierende
PrP-Ketten in die Bahn lenkt, die zu Sec-PrP führt.
-
Der
Unterschied zwischen Sec-PrP und CtmPrP
erfolgt gewöhnlich
aus topologischen Gründen.
Diese zwei Polypeptide mit identischer Sequenz unterscheiden sich
jedoch auch in ihrer Konformation. Dies wurde durch ihre unterschiedliche
Empfindlichkeit gegenüber
einem begrenzten Proteaseverdau in nicht denaturierenden Detergenzlösungen gezeigt.
So scheint die Translokationssteuerung ein Mittel zu sein, um mehrere Formen
von PrP zu erzeugen, die sich sowohl in Konformation als auch Funktion
unterscheiden. Das Instrumentarium (d.h. ein TrAF), das naszierende
PrP-Ketten dazu bringt, Sec-PrP
statt CtmPrP zu erzeugen, mag selbst reguliert
werden, basierend auf der Fähigkeit
der Scrapie-Infektion, die Menge an CtmPrP
zu erhöhen, die
im Gehirn nachweisbar ist. Obwohl PrP derzeit das beste Beispiel
für eine
Translokationssteuerung ist, gibt es Hinweise für ähnliche Prinzipien, die von
einer größeren Gruppe
von Proteinen verwendet werden. Diese Beobachtungen führen zusammen
zu einem neuen Prinzip: Die Konformation eines Proteins wird nicht
nur durch die primäre
Aminosäuresequenz
bestimmt, sondern auch durch Proteine, wie TrAF, die Einfluss darauf haben,
welche von zwei oder mehr verschiedenen funktionellen Konformationsarten
tatsächlich
auftritt oder vorherrscht.
-
Es
ist daher von Interesse zu bestimmen, ob komplexe sekretorische
oder integrale Membranproteine mehrere unterschiedliche funktionelle
gefaltete Zustände
haben können.
Derzeit ist die Hauptbeschränkung, um
diese und andere Hypothesen der Konformationskontrolle zu testen,
der Mangel an Werkzeugen, um die Heterogenität von funktionellen Proteinkonformationen
zu erkennen. Aber durch die zufällige
Koinzidenz, dass bei PrP die Konformationsheterogenität als topologische
Heterogenität
exprimiert wird, ist dies möglicherweise bis
jetzt noch nicht aufgedeckt worden. Bessere Werkzeuge, wie Gruppen
von konformationsspezifischen monoklonalen Antikörpern, die es zulassen würden, relative
Reaktivitäten
von Unterpopulationen neu synthetisierter Proteine zu untersuchen
und daher Konformationsunterschiede zu definieren, sind notwendig.
Dieser Ansatz würde
es zulassen, einen Katalog der Konformationszustände, die von einem gegebenen
Protein in gesundem Zustand und während des Fortschreitens einer
Krankheit verwendet werden, zu erstellen ebenso wie ein Mittel,
um die Krankheit zu hemmen.
-
Zusammenfassung
der Erfindung
-
Neue
Zusammensetzungen auf Basis von konformational spezifischen monoklonalen
Antikörpern
und deren Verwendung zur Diagnose und Behandlung von Krankheiten,
die mit speziellen Proteinkonformeren in Beziehung stehen, werden
bereitgestellt. Für
monoklonale Antikörpererzeugung
werden Tiere mit Antigenen immunisiert, gegebenenfalls mit Adjuvans,
die mindestens ein Konformer eines interessierenden Proteins enthalten.
B-Zellen von einem immunisierten Wirt werden verwendet, um Hybridoma
herzustellen, die monoklonale Antikörper gegen ein oder mehrere
Konformere des interessierenden Proteins erzeugen, die ein gemeinsames
Epitop teilen. Die monoklonalen Antikörper werden dann gescreent,
um solche zu identifizieren, die eine unterschiedliche Bindung mit
individuellen Konformeren des interessierenden Proteins zeigen.
Die monoklonalen Antikörper
finden Verwendung in Nachweisassays für durch Konformer vermittelte
Krankheiten und zur Behandlung der Krankheit durch aktive oder passive
Immunisierung. Ein ungewöhnlicher
Ansatz zum Screenen wird bereitgestellt, der die Lösungsimmunfällung definierter
Konformere mit einzelnen Hybridomas beinhaltet, um monoklonale Antikörper zu
identifizieren, die selektiv, aber vielleicht schwach an ein spezifisches
Konformer binden. Diese monoklonalen Antikörper werden dann charakterisiert
und verwendet, um Patientenproben zu Screenen, einschließlich Serum,
um konformer spezifische Merkmale und Zusammenhänge von Krankheit und Krankheitspathogenese
zu identifizieren und/oder die Differenzierung von Zellen, die PrP exprimieren,
zu fördern
und/oder PrP-Expression zu hemmen.
-
Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
-
1: Proteaseverdau mit Proteinase
K (Merck, Deutschland) 100 μg/ml,
wurden 1 Stunde bei 37°C angewendet
und es wurde mit 5 mM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF; Sigma,
USA) gestoppt.
-
2: mAB 13A5 wurde verwendet
in einer Verdünnung
von 1:5000 aus Ascites.
-
3: mAB 13A5 und Ro73 Antiserum
wurden in einer Verdünnung
von 1:5000 verwendet.
-
4: PNGase F und Endo H wurden
von New England Biolabs (NEB, USA) erworben und gemäß den Vorschriften
des Herstellers verwendet.
-
5: In vitro translatiertes,
radioaktives S35-markiertes PrP wurde hergestellt,
wie von Hay et al., 1987, Hegde et al., 1998, Science 279, 827–834, und
Hegde et al., 1999, beschrieben. Die gesamten Produkte wurden dann
mit mAB 7VC-Überstand
oder Kontrollantikörpern
und 15 μl
Protein A (Gibco, Invitrogen, USA) inkubiert und auf einem sich
drehenden Rad 3 Stunden lang bei 4°C inkubiert. Die Produkte wurden
dann dreimal mit Homogenisierungspuffer gewaschen, in Probepuffer
gesiedet und auf ein 15% SDS-Gel geladen. Die Gele wurden getrocknet
und Hyperfilm ausgesetzt (Amersham Pharmacia, USA).
-
6 zeigt radioaktiv markierte
zellfreie Translationsprodukte, die in etwa äquivalente Mengen jeder topologischen
Form von PrP darstellen und Vorläufer
wurden verwendet, um 1.500 einzelne Hybridomaüberstände zu screenen. Die Bahnen
1 bis 13 wurden durch ausgewählte
Klone immunpräzipitiert.
Bahn 1 zeigt einen "starken
Reagierer" unter
Bedingungen, denen eine Konformationsspezifität fehlt. Bahn 13 zeigt die
Ergebnisse ohne zugegebenen Antikörper. Die in den Bahnen 2 bis
12 verwendeten Antikörper
zeigen unterschiedliche Grade an Konformationsspezifität, in einem
Bereich von stark Ntm-spezifisch (Bahn 10) bis hauptsächlich sekretorisch
(Bahn 3) und Ctm (Bahn 10). In den meisten Fällen wurde eine Reaktivität für den Vorläufer beobachtet,
aber da der Vorläufer
ein Artefakt der zellfreien Translation ist, der in vivo nicht beobachtet wird
(aufgrund der Effizienz der Zielführung) kann seine Gegenwart
ignoriert werden. Das Immunogen für diese Fusion war denaturiertes
rekombinantes PrP. Es ist wahrscheinlich, dass bei Verwendung von
nativem Ctm gegenüber
Sec-PrP als Immunogen stärker
gerichtete konformationsspezifische Reaktionen erhalten würden, wie
vorgeschlagen.
-
7 zeigt die in-vitro-Translation
von PrP (linkeste Bahn) und Immunpräzipitationen mit Klonen von 7VC
(Bahn 2 und 3) und 19B10 (Bahnen 4 und 5).
-
8 zeigt die Immunfärbung von
ScN2a-Zellen ohne Antikörper
(linkes Feld), mAB 6H4 (zweites Feld von links), mAB 19B10 (drittes
Feld von links) und mAB 7VC (rechtes Feld). Die Immunfärbung wurde
auf der Zelloberfläche
bewirkt (oberes Feld) oder nach Permeabilisierung mit Saponin (Sigma,
USA) für
intrazelluläre
Färbung
(unteres Feld).
-
9 zeigt ScN2a-Zelldifferenzierung
nach einwöchiger
Behandlung mit 19B10.
-
10 zeigt einen Western Blot,
der zeigt, dass mAB 7VC und 19B10 die Prionreplikation hemmen.
-
11A zeigt einen Western
Blot, der die Wirkungen der Eluate mit verschiedenen Kupferkonzentrationen
nach Immunfällung
von 7 BHOZ-Gehirnhomogenisat
(transgene Maus, die PrP vom Syrischen Hamster exprimiert; oberes
Feld) oder F11 98-Gehirnhomogenisat (transgene Maus, die PrP von
einem mutierten Syrischen Hamster mit erhöhtem CTM PrP exprimiert; unteres
Feld) zeigt. 11B zeigt
Western Blots von nicht mit Protease verdautem Gehirnhomogenisat
vom normalen Syrischen Hamster, mit Scrapie infiziertes (Sc237-Stamm)
Gehirnhomogenisat vom Syrischen Hamster und mit Protease verdautes
Scrapie infiziertes Gehirnhomogenisat vom Syrischen Hamster.
-
12 zeigt einen Western Blot
von unterschiedlichen Gehirnhomogenisaten mit mABs 7VC, 19B10 und
6H4.
-
Tabelle
1: Enzyme-linked Immunoadsorbent assay (ELISA) für Peptidbindung wurde durchgeführt wie folgt:
Streptavidin-beschichtete ELISA-Platten (96-Napf-Format; Roche, USA) wurden mit 1 μg/Napf N-terminal
biotinyliertem Peptid der angegebenen Sequenz 2 Stunden lang bei
37°C beschichtet.
Die ELISA-Platten wurden dann mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen
und mit 5% Rinderserumalbumin 1 Stunde lang bei 37°C blockiert.
Nach dem Waschen wurden unverdünnte
mAB 7VC-Überstände oder
Kontroll-Antikörper
und eine Verdünnungsreihe
davon in TBS-T mit den beschichteten Näpfen 2 Stunden lang bei 37°C inkubiert.
Nach dem Waschen wurde sekundäres
Ziegen-Antimaus-IgG, mit alkalischer Phosphatase markiert (Pierce,
USA), in einer Konzentration von 1:1.000 in TBS-T 45 Minuten lang
bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen wurde das Substrat
(p-Nitrophenylphosphat, Sigma, USA) in die Näpfe gegeben und eine gelbe
Verfärbung
in einem ELISA-Lesegerät
untersucht.
-
Beschreibung
der spezifischen Ausführungsformen
-
Gemäß der vorliegenden
Erfindung werden Zusammensetzungen bereitgestellt, die einzelne
Konformere eines interessierenden Proteins sind und monoklonale
Antikörper
dagegen. Bevorzugt werden die Konformere hergestellt unter Verwendung
eines Systems, z.B. eines zellfreien Translationssystems, das die
selektive Synthese eines einzelnen Konformers des interessierenden
Proteins zulässt,
so dass monoklonale Antikörper
identifiziert werden können,
die differentiell an ein einzelnes Konformer binden, so dass Konformere, die
mindestens ein Epitop teilen, unterschieden werden können. Der
Ausdruck "konformer" bezieht sich auf zwei
oder mehr Proteine mit mindestens im Wesentlichen der gleichen Aminosäuresequenz,
aber Heterogenität
in der Struktur (physikalische Topologie oder Topografie) und Funktion.
Unter Topologie wird die unterschiedliche Anordnung spezieller Teile
des Proteins in speziellen subzellulären Kompartimenten, z.B. C-cytosolisch
im Vergleich zu N-cytosolisch,
verstanden und Topografie bedeutet die Veränderung der externen Konformation
oder Form im Raum (d.h. unterschiedliche dreidimensionale Form aufgrund
von Unterschieden in Faltung/Konformation), was stabile und/oder
vorübergehende
Assoziation mit anderen Proteinen einschließt. Polypeptide mit im Wesentlichen
der gleichen Aminosäuresequenz,
wie sie hier verwendet werden, sind solche mit konservativen Aminosäuresubstitutionen
(d.h. kleine oder große
Seitenkette für
kleine bzw. große
Seitenkette oder saure, basische, polare bzw. hydrophobe Seitenkette
für saure,
basische, polare oder hydrophobe Seitenkette), die die Proteinkonformation
oder Topologie nicht verändern.
Die Proteinkonformationsveränderungen
beruhen auf Unterschieden in der Faltung oder auf posttranslationalen
Modifikationen und sind nicht das Ergebnis von Unterschieden in
der Aminosäuresequenz.
-
Tiere
einschließlich
Menschen werden für
die Diagnose und/oder Behandlung und/oder Hemmung der Wirkungen
einer speziellen mit einer Krankheit verbundenen Konformation des
interessierenden Proteins immunisiert zur Erzeugung von Antiseren,
die Antikörper
enthalten, die spezifisch an eine mit der Krankheit verbundene Konformation
des interessierenden Proteins binden. B-Zellen des immunisierten tierischen
Wirts können
verwendet werden, um Hybridomas zu erzeugen, die monoklonale Antikörper mit
dem gleichen Spezifitätsspektrum
erzeugen. Rekombinante Immunglobulinleichtketten und/oder Schwerketten
und funktionelle Fragmente davon können rekombinant hergestellt
werden, indem Nucleinsäure,
die die leichten und schweren Ketten des monoklonalen Antikörpers oder
funktionelle Teile davon codiert, isoliert wird und in einer prokaryotischen
Wirtszelle, wie E. coli oder einer eukaryotischen Wirtszelle, wie
Hefe oder einer Säugetierzelle,
exprimiert wird. Die rekombinanten Antikörper können Veränderungen in der Aminosäuresequenz
einschließen,
um die gewünschten
Eigenschaften zu schaffen, z.B. können Veränderungen gemacht werden in
der variablen Region, um verbesserte Antigenbindungseigenschaften
zu liefern. Bevorzugt sind die erzeugten und/oder zur Verwendung
zur Behandlung der Wirkungen einer mit einer speziellen Krankheit
verbundenen Konformation des interessierenden Proteins verabreichten
Antikörper
neutralisierende Antikörper.
Der Ausdruck "Antikörper", wie er hier verwendet
wird, bezieht sich auf ganze Antikörpermoleküle, die sowohl schwere als
auch leichte Ketten aufweisen, aber auch auf jegliche Fragmente
solcher Antikörper,
wie (FAB)2, FAB, Fv-Fragmente und ScFv-Fragmente, die die
gewünschte
Spezifität
behalten, an einzelne Protein-Konformere
zu binden. Der Ausdruck "neutralisierend", wie er hier verwendet
wird, bedeutet in Bezug auf Antikörper, dass solche Antikörper an
einzelne Proteinkonformere binden, die sich in Körperflüssigkeiten von Patienten befinden mit
einer Krankheit, die mit einem spezifischen Proteinkonformer verbunden
ist. In einigen Fällen
kann der Antikörper
dazu dienen, die Bindung des Proteins an zelluläre Rezeptoren zu verhindern;
bevorzugt haben solche Antikörper eine
ausreichende Affinität
für das
Proteinkonformer, dass sie rezeptorgebundenes Konformer von seinem
Rezeptor entfernen können,
wenn das Konformer an den Rezeptor gebunden ist.
-
Monoklonale
Antikörper
können
erzeugt werden, um die funktionellen Testergebnisse zu bestätigen, und
zeigen auf Basis der Epitopkartierung, dass (i) Antikörper für die gleichen
Epitope Proteine nicht binden, die im Wesentlichen die gleichen
Aminosäuresequenzen
enthalten und (ii) eine alternative Faltung von Proteinen Epitope
maskiert oder aufdeckt und sie immunologisch und damit strukturell
unterschiedlich macht. Die Sequenzierung des klonierten verdächtigen
Konformers wird durchgeführt,
um zu zeigen, dass die Proteine im Wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz
haben. Daher können
monoklonale Antikörper
gegen ein kartiertes Epitop verwendet werden, um Konformere mit
unterschiedlichen strukturellen und implizit funktionellen Eigenschaften
zu finden, die als spezifische Wirkstofftargets verwendet werden
können,
was potenzielle Nebenwirkungen verringert. Monoklonale Antikörper können mit
ungereinigten Lysaten entweder aus transfizierten Zellen oder programmierten
zellfreien Systemen verwendet werden.
-
Die
vorliegende Erfindung bietet verschiedene Vorteile gegenüber bestehender
Technologie. Das Problem, Heterogenitäten in biologischen Proben
nachzuweisen, wird durch verschiedene Merkmale zusammengefasst:
Als erstes kann Heterogenität
nur nachgewiesen werden mit Reagenzien (z.B. monoklonalen Antikörpern),
die ein Konformer von einem anderen unterscheiden. Die meisten Konformere
teilen jedoch viele Epitope und daher ist nur eine kleine Untergruppe
von monoklonalen Antikörpern,
die gegen ein gegebenes Konformer gezüchtet wurden, absolut oder
relativ konformerspezifisch und viele monoklonale Antikörper sind
ununterscheidbar in ihrer Reaktivität mit verschiedenen Konformeren.
Die vorliegende Erfindung lässt
es zu, die "Nadel
im Heuhaufen", d.h.
den raren monoklonalen Antikörper,
der absolut oder relativ konformerspezifisch ist, vielleicht mit
geringer Affinität,
wegen seiner Konformerspezifität,
d.h. Beschränkung
des Epitops auf einen kleinen Teil einer Oberfläche eines Konformers, von anderen
monoklonalen Antikörpern,
die nicht konformerspezifisch sind, zu unterscheiden. Als zweites
ist der Zeitraum, um zu bestimmen, ob ein neues Hybridom konformerspezifisch
ist, begrenzt auf wenige Tage, bevor das Hybridoma stirbt oder von
konkurrierenden Klonen überwachsen
wird. Die vorliegende Erfindung liefert Strategien, um diese Schranken
der Identifizierung von relevanten monoklonalen Antikörpern zu überwinden.
Diese wertvollen, aber seltenen monoklonalen Antikörper bieten,
wenn sie z.B. in Screening-Tests verwendet werden, den Vorteil,
dass sie unterschiedliche Konformere in einer Konformermischung
in Patientenproben, wie Blutproben, unterscheiden können. Zusätzlich bieten
sie den Vorteil, dass sie ein Mittel schaffen, um Konformere schnell
und mit extrem hoher Empfindlichkeit und Spezifität zu unterscheiden
mit minimaler Störung
durch Bedingungen, wie sie beim Proteaseverdau und anderen konventionelleren
Sonden der Konformation und Topologie auftreten würden.
-
Antigene,
die zur Immunisierung verwendet werden können, schließen eine
Mischung von Konformeren ein, aber bevorzugt sind einzelne Konformere
eines interessierenden Proteins. Methoden, die zur Herstellung einzelner
Konformerantigene verwendet werden können, schließen ein
in-vitro-Translationssystem
ein (siehe z.B. Haye et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 914–919; Hägde et al.
(1998), Science 279, 827–834;
und Hägde
et al. (1999), Nature 402, 822–826).
Es wurden Versuche gemacht, die synthetisierte Konformationsmischung
asymmetrisch zu machen, damit kleinere und vorübergehende Konformere angereichert
und stabilisiert werden und daher leichter nachgewiesen und charakterisiert
werden können,
so dass sie von den normal dominanten Konformeren unterschieden
werden können.
Dies kann auf verschiedenen Wegen erfolgen, einschließlich durch
Swappen von Signalsequenzen, die gespalten werden oder durch Exprimieren
der Proteine in fraktionierten und rekonstituierten Systemen, die
die native Konformermischung durch Wirkungen (oder deren Abwesenheit)
in trans, durch TrAF-Abreicherung oder mit anderen Mitteln modifizieren.
-
Für die Immunisierung
können
alle Methoden, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind, verwendet
werden. Wenn nur kleine Mengen an Antigen verfügbar sind, können Protokolle,
wie die von (Blachere et al. (1997), J. Exp. Med. 186, 1315–1322) und
(Castellino et al. (2000), J. Exp. Med. 191, 1957-1964) verwendet werden.
Kleine (Mikrogramm) Mengen eines Proteins, wie Hitzeschockprotein
(HSP) und ein Konformer eines interessierenden Proteins werden vereinigt
und dann zur Immunisierung eines Wirtstiers verwendet. Der Verabreichungsweg
kann intracutan, subcutan, intramuskulär, intraperitoneal oder intravenös sein und die
Verabreichungsmethode erfolgt mit dem Fachmann auf diesem Gebiet
bekannten Standardprotokollen. Gegebenenfalls können ein Adjuvans, wie Freund's komplettes Adjuvans,
RIBI, oder Aluminiumhydroxid, oder rekombinante Cytokine, wie Interleukin-2,
mit dem Antigen verwendet werden.
-
Monoklonale
Antikörper
können
auf einer Anzahl von Wegen hergestellt werden, die dem Fachmann auf
diesem Gebiet bekannt sind (siehe z.B. Kohler et al., Nature 256:495–497 (1975)
und Eur. J. Immunol. 6:511–519
(1976); Milstein et al., Nature 266:550–552 (1977), Koprowski et al.,
U.S.-Patent Nr. 4 172 124; E. Harlow und D. Lane, 1988, Antibodies:
A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, New York (1989); Current Protocols in Molecular Biology,
Bd. 2 (Supplement 27, Sommer '94), F.M.
Ausubel et al., Herausgeber (John Wiley & Sons: New York, N.Y.), Kapitel 11
(1991)). Bei diesem Verfahren werden Splenozyten oder Lymphozyten
aus einem Tier, dem ein Antigen injiziert worden war, mit einer
Tumorzelllinie fusioniert, was Hybridzellen oder "Hybridomas" erzeugt, die sowohl
unsterblich sind als auch genetisch codierte Antikörper der
B-Zelle erzeugen können.
Die so gebildeten Hybride werden in einzelne genetische Stämme durch
Selektion, Verdünnung
und erneutes Wachstum getrennt und jeder Stamm repräsentiert somit
eine einzelne genetische Linie. Sie produzieren daher immunreaktive
homogene Antikörper
gegen ein gewünschtes
Antigen. Die Hybridomatechnologie verwendet allgemein die Fusion
von Mauslinien, aber Human-Human-Hybridomas
(L. Olsson et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 77:5429 (1980));
Human-Maus-Hybridomas (J. Schlom et al. (ibid) 77:6841 (1980)) und
verschiedene andere xenogene Hybridkombinationen wurden auch berichtet.
Zellen, die Antikörper
mit den gewünschten
Bindungseigenschaften erzeugen, werden mit einem geeigneten Test
ausgewählt,
z.B. einem serologischen Test einschließlich einem Enzyme-linked immunosorbent
assay (ELISA).
-
Funktionelle
Bindungsfragmente von monoklonalen Antikörpern können auch z.B. durch enzymatische
Spaltung oder rekombinante Techniken erzeugt werden. Enzymatische
Spaltungsmethoden schließen Papain-
oder Pepsinspaltung ein, um Fab- bzw. F(ab')2-Fragmente
zu erzeugen. Antikörper
können
auch in einer Vielzahl von trunkierten Formen verwendet werden unter
Verwendung von Antikörpergenen,
bei denen eine oder mehrere Stoppcodons stromaufwärts der
natürlichen
Stoppstelle eingeführt
wurden. Z.B. kann ein chimäres
Gen, das den Schwerkettenanteil eines F(ab')2 codiert,
so ausgebildet werden, dass er DNA-Sequenzen enthält, die
die CH1-Domäne und die Scharnierregion
der Schwerkette codieren. Funktionelle Fragmente der monoklonalen
Antikörper
behalten mindestens eine Bindungsfunktion und/oder Modulationsfunktion
des Antikörpers
voller Länge,
aus dem sie abgeleitet sind.
-
Bevorzugte
funktionelle Fragmente behalten eine Antigenbindungsfunktion eines
entsprechenden vollständigen
Antikörpers
(z.B. behalten sie die Fähigkeit,
ein Epitop eines Konformers zu binden). In einer weiteren Ausführungsform
behalten funktionelle Fragmente die Fähigkeit, eine oder mehrere
Funktionen, die für ein
Protein- oder Peptidkonformer charakteristisch sind, zu hemmen,
z.B. eine Bindungsaktivität,
eine Signalaktivität
und/oder die Stimulierung einer zellulären Antwort. In einer Ausführungsform
kann z.B. ein funktionelles Fragment den HIV-Kapselzusammenbau hemmen.
-
Eine
Methode, um konformerspezifische Antikörper zu entwickeln, besteht
darin, Knockout-Mäuse, denen
ein funktionelles Gen für
das interessierende Protein fehlt, mit einem möglichen Konformer des interessierenden
Proteins zu immunisieren. Knockout-Mäuse können unter Verwendung von Standardtechniken,
die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind, erzeugt werden
(Capecchi, Science (1989), 244:1288; Koller et al., Annu Rev. Immunol
(1992), 10:705–30;
Deng et al., Arch Neurol (2000), 57:1695–1702); das dem Protein, gegen
das monoklonale Antikörper
erzeugt werden sollen, entsprechende Gen wird ausgeknockt, z.B. HP68.
Ein Zielvektor wird konstruiert, der zusätzlich dazu, dass er ein Fragment
des auszuschaltenden Gens enthält,
allgemein ein Antibiotikaresistenzgen, bevorzugt Neomycin, enthält, um auf
homologe Rekombination zu selektieren, und ein Gen für eine virale
Thymidinkinase (TK). Alternativ kann das Gen, das Diphtherietoxin (DTA)
codiert, verwendet werden, um gegenüber zufälliger Insertion zu selektieren.
Der Vektor ist so zugeschnitten, dass dann, wenn eine homologe Rekombination
auftritt, das Neomycinresistenzgen in das Genom integriert wird,
das TK- oder DTA-Gen aber immer verloren ist. Maus-Embryonenstammzellen
(ES) werden mit dem linearisierten Zielvektor transfiziert und rekombinieren
durch homologe Rekombination am Ort des Zielgens, das ausgeschaltet
werden soll. Maus-ES-Zellen
werden in Gegenwart von Neomycin und Ganciclovir (für TK) gezüchtet, einem
Wirkstoff, der von TK metabolisiert wird, um ein tödliches
Produkt zu erzeugen. Zellen, die eine homologe Rekombination durchlaufen
haben, sind daher resistent sowohl gegenüber Neomycin als auch Ganciclovir.
Vektoren, die DTA enthalten, töten
jede Zelle, die das Gen codiert, sodass kein weiterer Wirkstoff
im Zellkulturmedium notwendig ist. Southern Blot-Hybridisierung
und PCR werden verwendet, um das homologe Rekombinationsereignis
zu verifizieren, Techniken, die dem Fachmann auf diesem Gebiet wohl bekannt
sind.
-
Um
eine Maus zu erzeugen, die ein zerstörtes Zielgen trägt, werden
positive ES-Zellen
in Kultur propagiert, um zu differenzieren und die entstehende Blastozyste
wird in ein pseudoträchtiges
Tier implantiert. Alternativ werden die ES-Zellen wieder in die
blastozölische
Höhle eines
Präimplantations-Maus-Embryos
injiziert und die Blastozyste dann chirurgisch implantiert. Die
transfizierten ES-Zellen und die aufnehmenden Blastozysten können von
Mäusen
mit anderer Hautfarbe stammen, so dass chimäre Nachkommen leicht identifiziert
werden können.
Durch Aufzuchttechniken werden homozygote Knockout-Mäuse erzeugt.
Gewebe aus diesen Mäusen
wird getestet, um den homozygoten Knockout für das Zielgen zu verifizieren,
z.B. unter Verwendung von PCR und Southern Blot-Hybridisierung.
-
Bei
einer anderen Methode kann Gene targeting unter Verwendung der Antisense-Technologie
verwendet werden (Bergot et al., JBC (2000), 275:17605-17610). Die homozygoten
Knockout-Mäuse
werden mit gereinigten Wirtsproteinpeptiden, sowohl nativem als
auch denaturiertem rekombinanten Protein immunisiert. Nach darauf
folgenden Boosts, nach 3 und 6 Wochen, mit dem Immunogen werden
die Mäuse
getötet
und die Milz entnommen und eine Fusion mit Myelomazellen durchgeführt (Korth
et al., Methods in Enzymol. (1999), 309:106). Antikörper aus
einzelnen Hybridomas werden auf Konformationsspezifität gescreent,
d.h. Bindung mit einer erheblichen Spezifität für ein einzelnes Konformer.
Das Screening-Verfahren wird mit radioaktiv markierten Proteinprodukten
durchgeführt,
die in dem zellfreien Translationssystem oder in radioaktiv markierten Medien
oder Zellextrakten, die ausgewählt
wurden, um ein Konformer gegenüber
dem anderen anzureichern, erzeugt wurden.
-
Diese
Produkte werden immunpräzipitiert
unter Verwendung von Hybridomaüberstand
und auf einem SDS-PAGE-Gel laufen gelassen. Bevorzugt werden zellfreie
Extrakte verwendet wegen der Möglichkeit,
dass die Verwendung tranfizierter Zellen zu Protein-Protein-Wechselwirkungen
führen
könnte,
die Antikörper
an der Bindung an ein spezifisches Epitop hindern könnten, wodurch
ein mögliches
Konformer maskiert würde.
Die Verwendung eines Immunfällungsscreenings
mit radioaktiv markierten Translationsprodukten, deren Konformation
verdreht wurde (z.B. durch Swappen von Signalsequenzen) und das
Screening auf schwache Responder sind Schlüsselmerkmale, die dieses Screening
von dem üblichen
Ansatz der monoklonalen Antikörperproduktion
unterscheiden.
-
Eine
Variation der Methode zum Screenen von monoklonalen Antikörpern, die
eine unterschiedliche Bindung aufweisen, besteht darin, den pH,
die Ionenzusammensetzung des Tests, und/oder andere Bedingungen,
wie die Gegenwart von Serum oder Serumproteinen oder Metallionen,
an die das interessierende Protein bindet, wie Kupfer, zu variieren.
Diese Bedingungen können
von Antikörper
zu Antikörper
zu variieren. Andere Mittel, um unterschiedliche Bindung von monoklonalen
Antikörpern
an spezifische Konformere zu erhalten, können verwendet werden. Als
ein Beispiel werden spezifische konformationale Epitope, die von
solchen monoklonalen Antikörpern
definiert werden, als Tags oder Reporter oder Markierungen von Konformationsveränderungen
verwendet, indem codierende Regionen verschiedener Größe in anderen
Targetproteinen gentechnologisch verändert werden. So kann das Tag "an-" oder "ab-" geschaltet werden,
einfach, indem die ionischen Bedingungen variiert werden und eine
Konformationsänderung
kann induziert oder unterdrückt
werden durch Veränderung
von ionischen oder anderen Bedingungen. Die Verwendung von 96-Napf-Platten
zum Screenen rationalisiert das Verfahren, da ein einzelner Techniker
bis zu 1000 einzelne Hybridomas an einem einzigen Tag screenen kann.
-
Antikörper können auch
mit rekombinanten Mitteln hergestellt werden. Messenger-RNA, die
für eine schwere
oder leichte Kette codiert, wird aus einer geeigneten Quelle isoliert,
z.B. reifen B-Zellen oder einer Hybridoma-Kultur, die Antikörper der
gewünschten
Spezifität
erzeugt, unter Verwendung von Standardtechniken der RNA-Isolierung
und unter Verwendung von Oligo-dT-Cellulosechromatographie, um Poly-A-mRNA
zu segregieren. Die Poly-A-mRNA kann fraktioniert werden, um Sequenzen
ausreichender Größe zu erhalten,
die für
die Aminosäuresequenzen
in der leichten oder schweren Kette des gewünschten Antikörpers codieren. Eine
cDNA-Bibliothek wird dann aus der Mischung von mRNA hergestellt
unter Verwendung eines geeigneten Primers, bevorzugt einer Nucleinsäuresequenz,
die für
die gewünschte
cDNA charakteristisch ist. Ein solcher Primer kann hypothetisch
erstellt und synthetisiert werden auf Basis der Aminosäuresequenz
des Antikörpers, wenn
die Sequenz bekannt ist. Alternativ kann cDNA aus nicht fraktionierter
Poly-A-mRNA aus einer Zelllinie, die den gewünschten Antikörper produziert,
oder Poly-dT verwendet werden. Klonierungsvektoren, die die entstehende
cDNA enthalten, werden hergestellt und verwendet, um einen geeigneten
Wirtszellstamm, typischerweise E. coli, zu transformieren. Erfolgreiche
Transformanten werden identifiziert z.B. mithilfe der Tetracyclinresistenz
oder anderer phänotypischer
Eigenschaften, die das klonierende Vektorplasmid aufweist. Die Transformantenkulturen
werden dann mit geeigneten Nucleotidsequenzen sondiert, die Basen
enthalten, von denen bekannt ist, dass sie komplementär zu den
gewünschten
Sequenzen in der cDNA sind. Plasmide aus Klonen, die erfolgreich
hybridisieren, werden isoliert und mithilfe im Stand der Technik
bekannter Mittel sequenziert, um zu verifizieren, dass die gewünschten
Anteile des Gens vorhanden sind. Die gewünschten Genfragmente werden
herausgeschnitten und so zugeschnitten, dass sichergestellt ist,
dass sie den geeigneten Leserahmen mit den Kontrollsegmenten haben,
wenn sie in geeignete Expressionsvektoren insertiert werden. Die
zugeschnittene Gensequenz wird dann in einen Vektor gebracht, der
einen Promotor im Leserahmen mit dem Gen enthält und mit der vorgeschlagenen
Wirtszelle kompatibel ist. Eine Anzahl von Plasmiden, die bereits
die geeigneten Promotoren, Kontrollsequenzen, Ribosomenbindungsstellen
und Transkriptionsterminatiansstellen enthalten, ebenso wie geeignete
Marker sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt.
-
Die
Gene können
auch so zugeschnitten werden, dass sie modifizierte Antikörper erzeugen.
Z.B. mag eine Säugetierschwerkette
nicht vollständig
aus einer einzelnen Quelle oder einzelnen Art abgeleitet sein, sondern
Teile einer Sequenz können
aus verschiedenen Pools von mRNA gewonnen werden, wie Maus-Maus-Hybridomas,
Human-Maus-Hybridomas oder B-Zellen, die als Antwort auf eine Reihe
von Antigentests differenziert sind. Die gewünschten Anteile der Sequenzen
können
in jedem Fall gewonnen werden unter Verwendung der oben beschriebenen
Sondierungs- und Analysetechniken und in einem Expressionsvektor
rekombiniert werden. Solche chimären
Ketten können
mit jeder gewünschten
Länge konstruiert
werden; so kann z.B. eine vollständige
schwere Kette konstruiert werden oder nur eine Sequenz für den Fab-Teil
davon.
-
Für die Konstruktion
von chimären
Antikörpern,
bei denen z.B. die variable Sequenz getrennt von den konstanten
Sequenzen gewonnen wurde, werden gewünschte Anteile der Gene, die
Teile der schweren und leichten Kette codieren, aus geeigneten unterschiedlichen
Quellen gewonnen und dann ligiert, um das Gen, das eine solche Kette
codiert, zu rekonstruieren. Z.B. werden Teile des Gens für die schwere
Kette und des Gens für
die leichte Kette, die die variablen Sequenzen von Antikörpern codieren,
die von einer Maushybridomakultur erzeugt werden, kloniert und Genfragmente,
die die konstanten Regionen der schweren und leichten Ketten für menschliche
Antikörper
codieren, z.B. aus Humanmyelomazellen kloniert. Die variablen Anteile
des Mausgens werden dann mit den konstanten Bereichen des Humangens
für jede
der zwei Ketten ligiert. Statt Teile der Kette(n) zu spleißen, werden
geeignete Aminosäureveränderungen,
Deletionen oder Additionen unter Verwendung verfügbarer Techniken, wie Mutagenese
gemacht, um die gewünschten
Eigenschaften bereitzustellen.
-
Das
Gen, das die leichte Kette codiert und das Gen, das die schwere
Kette codiert, können
in getrennte Expressionsplasmide insertiert werden oder zusammen
in das gleiche Plasmid, solange jedes unter der Kontrolle des geeigneten
Promotors und der geeigneten Translationskontrolle ist, und verwendet
werden, um geeignete Zellen zu transformieren, die unter Bedingungen
gezüchtet
werden, die für
die Produktion des gewünschten
Proteins geeignet sind. Solche Bedingungen werden hauptsächlich von
der Art des Promotors und den Kontrollsystemen, die in dem Expressionsvektor
verwendet werden, bestimmt statt von der Art des gewünschten
Proteins. Das so produzierte Protein wird dann aus der Zellkultur
gewonnen mit im Stand der Technik bekannten Methoden, deren Auswahl
notwendigerweise von der Form, in der das Protein exprimiert wird, abhängt. Wenn
schwere und leichte Ketten gleichzeitig im gleichen Wirt co-exprimiert
werden, ist das Isolierungsverfahren so ausgebildet, dass rekonstituierter
Antikörper
gewonnen wird. Dies kann erreicht werden unter Verwendung von Methoden,
die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind.
-
Spezifische
Antikörperfragmente
der Erfindung, wie (Fab)2, Fab und Fv-Fragmente, bei denen
die Spezifität
gegenüber
einem speziellen Proteinkonformer konserviert ist, können erhalten
werden durch chemische Spaltung vollständiger Antikörper mit
wohl bekannten Methoden (siehe z.B. Weir (1986), Handbook of Experimental
Immunology, 4. Auflage, Blackwell, Oxford, Bd. 1 Immunochemistry).
(Fab)2-, Fab-, Fv- und ScFv-Fragmente können auch
durch Gentechnologie erhalten werden, indem Gene kloniert werden,
die variable Regionen von schweren und/oder leichten Antikörperketten
codieren oder Teile davon, die Sequenzen tragen, die Antikörperbereiche
codieren, die spezifisch ein spezielles Proteinkonformer erkennen,
oder in rekombinierter Form, um spezifische rekombinante Fab- oder
ScFv-Fragmente zu erhalten.
-
Um
eine Krankheit zu verstehen und zu behandeln, an der Peptidkonformere
beteiligt sind, ist es nützlich,
einen oder mehrere Antikörper
zu identifizieren, die im Wesentlichen für das Konformer spezifisch
sind. Diese Methode beinhaltet, dass eine Anzahl von Konformeren
mit einer Anzahl von Antikörpern
oder bindenden Fragmenten, die von spezifischen Antikörpern abstammen,
in Kontakt gebracht werden. Die Spezifität der Bindung der Antikörper oder
Fragmente an einzelne Konformere wird dann ausgewertet. Antikörper oder
Fragmente, die im Wesentlichen für
jedes der verschiedenen Konformere spezifisch sind, können so
gefunden werden.
-
Pharmazeutische
Zusammensetzungen der Erfindung sind geeignet zur Verwendung in
einer Vielzahl von Abgabesystemen zur Verabreichung an Menschen,
einschließlich
einer Verabreichung auf parenteralem, z.B. intravenösem, subcutanem,
intradermalem, intraperitonealem oder intramuskulärem Weg.
Die Antigenpräparate
können
auch abgegeben werden unter Verwendung implantierter Minipumpen,
die dem Fachmann auf diesem Gebiet wohl bekannt sind. Die Zusammensetzungen
schließen
Formulierungen ein, die ein oder mehrere gereinigte Antigene enthalten,
ebenso wie Antikörper,
die für
ein interessierendes Proteinkonformer spezifisch sind. Die Antikörper können aus
Seren von irgendeinem Tier, in dem Antikörper gegen ein interessierendes
Proteinkonformer gezüchtet
werden können,
gereinigt werden. Bevorzugt werden die Antikörper humanisiert. Humanisierte
Antikörper
können
in transgenen Tieren erzeugt werden, die humane Antikörper erzeugen.
Humanisierte Antikörper
können
auch durch biochemische Modifikation von nicht humanen Antikörpern erzeugt
werden, z.B. von monoklonalen Maus-Antikörpern, was beinhalten kann,
dass der Antigenbindungs- oder Fab-Teil des murinen monoklonalen
Antikörpers
mit einem nicht bindenden oder Fc-Anteil eines menschlichen Antikörpers fusioniert
wird. Humanisierte Antikörper,
die mit diesen und anderen Methoden erzeugt werden, behalten die
gewünschte
Antigenbindungsspezifität,
im Allgemeinen ohne eine unerwünschte Immunantwort
auf den Antikörper
selbst zu erzeugen.
-
Beispiele
für pharmazeutisch
annehmbare Träger
und Formulierungen zur Verwendung mit den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
finden sich in Remington's
Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia,
PA, 17. Auflage (1985), das hier durch Bezugnahme miteingeschlossen
wird. Bezüglich
der Methoden zur Arzneimittelabgabe siehe Langer (1990), Science
249:1527–1533,
der hier auch durch Bezugnahme miteingeschlossen wird. Bezüglich der
Impfstoffverwendung und Erzeugung siehe Plotkin et al. (Herausgeber)
(1999), Vaccines, 3. Auflage, W.B. Saunders, Philadelphia und Zegers
et al. (Herausgeber) (1995), Immunological Recognition of Peptides
in Medicine and Biology, CRC Press, Boca Raton, Florida, die auch
hier durch Bezugnahme miteingeschlossen werden. Bezüglich der
Vakzinzuführung über Schleimhäute siehe
Ryan et al. (2001), Trends Biotechnol 19:293–304 und Ogra et al. (2001),
Clin Microbiol Rev 14:430–445, die
auch durch Bezugnahme miteingeschlossen werden. Bezüglich Adjuvantien
siehe z.B. G. Gregoriadis, Herausgeber (1990), Immunological Adjuvants
and Vaccines (NATO Asi Series A, Life Sciences, Bd. 179), der hier
durch Bezugnahme miteingeschlossen wird.
-
Zur
Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden
Erfindung kann es wünschenswert
sein, die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
zu modifizieren, um ihre Immunogenizität und biologische Verteilung
zu verändern.
Bezüglich
einer allgemeinen Diskussion der Pharmakokinetik siehe Remington's Pharmaceutical
Sciences, oben, Kapitel 37 bis 39. Eine Anzahl von Methoden zur
Veränderung der
Pharmakokinetik, Immunogenizität
und biologischen Verteilung sind dem Fachmann auf diesem Gebiet
bekannt (siehe z.B. Langer, oben, Gregoriadis (1990), oben). Beispiele
für solche
Methoden schließen
den Schutz der Mittel in Vesikeln ein, die aus Substanzen, wie Proteinen,
Lipiden (z.B. Liposomen), Kohlenhydraten oder synthetischen Polymeren
aufgebaut sind. Z.B. können
die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung in Liposomen eingebaut
werden, um ihre Immunogenizität
und biologischen Verteilungseigenschaften zu verbessern. Liposomen,
die Vakzinantigene mikroverkapseln und dann mit Polymer beschichtet
werden, sind nützlich,
um die Abgaberate zu kontrollieren und damit die Wirksamkeit bei
parenteral und oral verabreichten Impfstoffen. Eine Vielzahl von
Methoden zur Herstellung von Liposomen sind verfügbar, wie z.B. in Szoka et
al. (1980), Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467, U.S.-Patente Nr. 4
235 871, 4 501 728 und 4 837 028 beschrieben, die alle hier durch
Bezugnahme miteingeschlossen werden. Bezüglich eines kurzen Überblicks über die
Verwendung von Liposomen zum Einfangen von Antigenen und der Abgabe
von Adjuvantien oder Immunmodulatoren siehe Gregoriadis (1999),
Methods 19:156-162
und Rogers et al. (1998), Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 15:421–480, die
hier durch Bezugnahme miteingeschlossen werden. Polymere lamellare
Substratteilchen, die durch Ausfällen
von Poly(D,L-lactid) erzeugt werden, bilden ein polymeres System
zur Adsorption von Antigenen. Dieses Verfahren vermeidet pH-Veränderungen,
den Kontakt mit organischen Lösungsmitteln und
lässt daher
zu, dass die Integrität
des Antigens erhalten bleibt. Für
polymere lamellare Substratteilchen für die intranasale Impfung siehe
Jabbal-Gill et al. (2001), Adv Drug Deliv Rev 51:97–111, der
hier durch Bezugnahme miteingeschlossen wird.
-
Um
Formulierungen zur Injektion herzustellen, wird eine Lösung der
Zusammensetzung in einem geeigneten Träger, bevorzugt einem wässrigen
Träger,
gelöst
oder suspendiert. Eine Vielzahl von pharmazeutisch annehmbaren wässrigen
Trägern
kann verwendet werden, z.B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4% Kochsalzlösung, 0,85%
Kochsalzlösung,
0,3% Glycin, Hyaluronsäure
und dgl. Die Konjugatpräparate
können
auch Adjuvans enthalten, um eine aktive Immunantwort auf ein Antigen
zu stimulieren. Beispiele für
Adjuvantien sind im Stand der Technik wohl bekannt und schließen z.B.
Aluminiumhydroxid (Spectrum Chem. Mtg. Corp., New Brunswick, N.J.)
oder Aluminiumphosphat (Spectrum), Calciumphosphat, Saponine, Monophosphoryllipid
A, Freund's Adjuvans,
Liposomen, polymerbeschichtete Liposomen, polymere lamellare Substratteilchen und
Cytokine, wie Interleukin-2 ein.
-
Die
Zusammensetzungen können
als pharmazeutisch annehmbare Träger
Substanzen nach Bedarf enthalten, um sich physiologischen Bedingungen
anzunähern,
z.B. den pH einstellende und puffernde Mittel, die Tonizität einstellende
Mittel, Benetzungsmittel und dgl., z.B. Natriumacetat, Natriumlactat,
Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Sorbitanmonolaurat,
Triethanolaminoleat und dgl. ebenso wie Konservierungsmittel, einschließlich z.B.
Thimerisol, und Proteinträger,
einschließlich
z.B. Humanserumalbumin oder tierische Seren. Die Zusammensetzungen
können
mit üblichen
wohl bekannten Sterilisationstechniken, einschließlich Sterilfiltration,
sterilisiert werden. Die entstehenden wässrigen Lösungen oder Suspensionen können zur
Verwendung so wie sie sind, verpackt werden oder lyophilisiert werden,
wobei das lyophilisierte Präparat
mit einer sterilen Lösung
vor der Verabreichung kombiniert wird. Für feste Zusammensetzungen können übliche nicht-toxische
pharmazeutisch annehmbare Träger
verwendet werden, was z.B. pharmazeutische Qualitäten von
Mannit, Lactose, Stärke,
Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talk, Cellulose, Glucose, Saccharose,
Magnesiumcarbonat und dgl. einschließt.
-
Die
Sequenzierung der Proteinkonformere, gegen die monoklonale Antikörper erzeugt
wurden, zeigt, dass die Konformerproteine im Wesentlichen die gleiche
Aminosäuresequenz
wie das native Protein enthalten. Es ist daher nicht notwendig,
eine Epitopkarte auf Basis linearer Peptide zu entwickeln, stattdessen
wird das Protein bevorzugt auf konformationale oder diskontinuierliche
Epitope kartiert. Die unterschiedliche Spezifität der monoklonalen Antikörper entsteht
aus der unterschiedlichen Faltung der gleichen Aminosäuresequenz.
So ist eine Konformationsepitopkartierung nützlich, um zu zeigen, dass
die monoklonalen Antikörper an
beschränkte
Epitope binden. Diskontinuierliche Epitope können unter Verwendung einer
begrenzten Proteolyse des Antikörpers,
der an ein Konformer des interessierenden Proteins bindet, gefunden
werden und dann kann das Lysat analysiert werden unter Verwendung
von Massenspektrometrie (MS) oder Erzeugung von dreidimensionalen
Bildern durch NMR-Spektroskopie oder Kristallografie. Monoklonale
Antikörper
(MAb) werden an feste Träger
gebunden und Lysate, die das Konformerprotein enthalten, werden
mit dem immobilisierten Mab inkubiert. Nach Entfernung von ungebundenem
Protein werden ausgewählte
verdünnte
Proteasen zu den immobilisierten Mab-Konformer-Komplexen zugegeben und ungebundene
Spaltungsprodukte entfernt. Die gebundenen Konformerproteine werden
eluiert unter geeigneten Bedingungen und mit LC-MS analysiert. Die Sequenzierung
von Konformerprotein und die Molekülmodellierung sind im Allgemeinen
notwendig, um das konformationale Epitop vollständig zu identifizieren.
-
Populationsprofile
von Konformeren, die mit der Schwere der Krankheit assoziiert werden
oder andere Eigenschaften können
entwickelt werden, indem eine Flüssigkeit
einer Person mit einer mit dem Konformer in Beziehung stehenden
Krankheit oder infizierte Zellen der Person mit einem oder mehreren
monoklonalen Antikörpern,
die für
ein Konformer, das an der Krankheit beteiligt ist, spezifisch sind,
in Kontakt gebracht werden. Die Flüssigkeit kann irgendeine Körperflüssigkeit
sein, was Blut, Serum, Plasma, Lymphflüssigkeit, Urin, Sputum, Cerebrospinalflüssigkeit
oder eine Eiterprobe einschließt.
Ein bindendes Fragment, das von einem monoklonalen Antikörper abgeleitet
ist, der für
ein Wirtsprotein und/oder Konformer spezifisch ist, kann auch verwendet
werden. Der monoklonale Antikörper
oder das bindende Fragment werden mit einer nachweisbaren Markierung
markiert, z.B. einer radioaktiven Markierung oder einer Enzymmarkierung.
Beispiele für
Enzymmarkierungen, die an einen Antikörper gebunden werden können, schließen Meerrettichperoxidase,
alkalische Phosphatase und Urease ein und Methoden, um Enzyme mit
Antikörpern
zu verbinden, sind im Stand der Technik wohl bekannt. Die Markierung
kann unter Verwendung von dem Fachmann auf diesem Gebiet wohl bekannten
Methoden nachgewiesen werden, z.B. Radiografie oder serologische
Methoden einschließlich
ELISA oder Blot-Methoden. Die Gegenwart der Markierung weist auf
die Gegenwart mindestens eines Protein- oder Peptidkonformers in
der einzelnen Person hin und kann verwendet werden, um Konformerprofile
zu identifizieren, die eine Rolle im Krankheitsverlauf spielen.
Der Nachweis der Markierung in einer Körperflüssigkeit deutet auf die Gegenwart
mindestens eines Protein- und/oder Peptidkonformers davon in der
Person hin. Eine Mehrzahl von monoklonalen Antikörpern oder von deren bindenden
Fragmenten kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Konformeren nachzuweisen,
die mit einem Krankheitszustand bei einer Person verbunden sind.
-
Indem
Konformere, die mit einer Krankheit verbunden sind, bei einer Anzahl
von Personen in einer Population nachgewiesen und charakterisiert
werden, kann ein Profil der verschiedenen Konformere, die mit der Krankheit
verbunden sind, entwickelt werden. Die Etablierung eines Konformerprofils
in einer solchen Population wird durchgeführt, indem Konformere, die
mit irgendeiner gegebenen Krankheit bei einzelnen verbunden sind,
nachgewiesen und charakterisiert werden, die Daten innerhalb der
Population zusammengefasst werden und dann die Beziehung zwischen
Konformerprofilen der einzelnen Mitglieder der Population und spezifischen Eigenschaften
der Krankheit bei diesen einzelnen festgestellt werden. Diese spezifischen
Eigenschaften hängen
von der Krankheit und der Art des Protein- oder Peptidkonformers
ab und können
nicht nur für
eine definitive Krankheitsdiagnose verwendet werden, sondern auch
zur Bestimmung der Prognose und Entwicklung einer geeigneten Behandlung
für einzelne
Patienten. Z.B. können
verschiedene Peptidkonformere mit einer höheren oder geringeren Schwere
der Krankheit verbunden sein. Als weiteres Beispiel können Peptidkonformere
mit größerer oder
geringerer Resistenz gegenüber
der Krankheit verbunden sein. Die Antwort der Einzelnen innerhalb
der Population auf verschiedene Krankheitsbehandlungen ist ein wichtiger
Faktor bei der Profilierung der Beziehung zwischen Konformerprofil
eines Einzelnen und seinem oder ihrem Ansprechvermögen. Personen,
die schlecht auf eine Behandlung ansprechen, können z.B. konformationale Formen
eines Proteins oder Peptids, das an dem Krankheitsprozess beteiligt
ist, haben, die schlechtere Targets für die Behandlung sind, als
die konformationalen Formen des Proteins oder Peptids bei Personen,
die gut auf die Behandlung ansprechen. Populationsstudien können erfolgen,
um diese Beziehungen zwischen Konformeren und der Reaktion mit einem
vernünftigen
Grad an Signifikanz zu etablieren.
-
Sobald
eine Beziehung zwischen einem Konformerprofil und der Behandlungswirksamkeit
bei einer Population festgestellt wurde, kann die Auswahl einer
Behandlung für
einen gegebenen Patienten verbessert werden, indem das Konformerprofil
eines einzelnen Patienten bestimmt wird, z.B. unter Verwendung der
oben beschriebenen auf Antikörper
oder Antikörperfragmenten
basierenden Methoden. Solche Behandlungspläne, die sich für einzelne
Personen mit im Wesentlichen gleichen Konformerprofilen wie denen
des zu behandelnden Patienten als erfolgreich erwiesen haben, werden
sich wahrscheinlich als wirksam erweisen. Beispiele für Populationsprofile,
die entwickelt werden können,
schließen
Wirkstoffempfindlichkeit, Wirksamkeit und Nebenwirkungen, Komplikationen
der Krankheit oder die Behandlung ein. Von Interesse ist auch die
Fähigkeit,
solche mAbs in Zusammenhang mit auf einer Population basierenden
Patientenprofilen zu verwenden, um jeden einzelnen Patienten zu
einem speziellen Zeitpunkt innerhalb einer Untergruppe solcher Populationen
auf Basis von Profilen zu lokalisieren und die Veränderung
in der Konformerenmischung eines einzelnen Patienten festzustellen
und daher deren Mitgliedschaft in einer vorhergesagten auf einer
Population basierenden Kohorte als Funktion der Veränderung
von Alter, Wirkstofftherapie, Nahrung und Lebensstil.
-
Die
hier beschriebenen Methoden und Zusammensetzungen haben eine Anzahl
von Verwendungen. Z.B. kann das zellfreie Translations/Zusammenbausystem
verwendet werden, um große
Mengen spezifischer Proteinkonformere zu erzeugen. Die so erzeugten
Proteinkonformere können
z.B. zur Immunisierung oder zur Herstellung von Impfstoffen verwendet
werden. Ein Antigen, das eine (humorale) Immunantwort selektiv gegen eine
Konformation und nicht gegen eine andere Konformation eines gegebenen
Proteins hervorruft, wird in immunogenen Mengen bei einem Menschen
oder Tier angewendet. Konformationsselektive humorale Immunantworten
werden hervorgerufen entweder durch Immunisierung mit einem "Minimalpeptid", das das Oberflächenepitop
eines Konformationsantikörpers
nachahmt oder mit einem vollständigen
Antigen, das mit biochemischen Mitteln und/oder Zufügung zusätzlicher
Molekülkomponenten
so behandelt wurde, dass die humorale Immunantwort auf das eine
Konformationsepitop kanalisiert wird und nicht auf ein anderes ("monospezifische konformationale
Antikörperantwort"). Ein Minimalpeptid
wird konstruiert, nachdem Kenntnisse über ei genauen dreidimensionalen
Oberflächenkontakte
zwischen einem spezifischen Antikörper oder abgeleiteten Liganden und
dem Antigen erhalten wurde. Die Aminosäurereste, die das Epitop bilden,
werden dann gentechnisch in ein Molekül mithilfe der Cyclisierung
von linearen Peptidfragmenten und/oder anderen chemischen Modifikationen
bearbeitet.
-
Alternativ
wird das anzusteuernde Antigen aus präparativen Proben von Körpergewebe,
Körperflüssigkeiten
oder rekombinanten Expressionssystemen in der spezifischen Konformation
isoliert. Dieses Präparat wird
dann durch chemische Modifikationen, wie intra- oder intermolekulare
Vernetzung, fixiert; andere biochemische Mittel des "Einfrierens" einer Konformation
sind Immobilisierung mit zweiten, dritten oder mehr Molekülen. Diese
Komplexe werden dann weiter optimiert, so dass eine konformationsspezifische
humorale Immunantwort entsteht, indem andere Epitope unterdrückt werden,
die nicht unter verschiedenen Konformeren des in Frage stehenden
Proteins unterscheiden würden.
Dies kann erreicht werden, indem andere immunogene Epitope mithilfe
spezifischer Proteasen wegverdaut werden und/oder die anderen Epitope
durch chemische Modifikationen geschützt werden. Dieses "Minimalepitop"-Molekül, das aus
Peptiden synthetisiert wurde oder biochemisch hergestellte "eingefrorene" Konformere werden
dann bei einem Testtier angewendet, um die Konformationsspezifität zu bestätigen und
auf Nebenwirkungen zu testen. Schließlich wird das "Minimalepitop"-Molekül in einer
pharmazeutischen Standardimmunisierungsformulierung verabreicht
und verwendet, um Tiere oder Menschen mit Krankheiten, bei denen
ein spezifisches Konformer die Ursache des pathologischen Prozesses
ist, zu behandeln. Allgemein wird bei üblichen Immunisierungstechniken
erwartet, dass jede Dosis etwa 1 bis 1000 μg Gesamtimmunogen, bevorzugt
etwa 2 bis 100 μg,
bevorzugter etwa 1 bis 40 μg
und am meisten bevorzugt etwa 1 bis 5 μg enthält. Alternativ liegt, wenn
Techniken gemäß Blachere
et al. (1997) (oben) und Castellino et al. (2000) oben) verwendet
werden, die Menge im Nanogrammbereich. In diesem Fall ist die Reinheit
des Konformers im Impfstoff von höchster Wichtigkeit. Eine optimale
Menge für
einen speziellen Impfstoff kann durch Standarduntersuchungen sichergestellt
werden, was die Beobachtung von Antikörpertitern und anderen Reaktionen
in Patienten beinhaltet. Ein Primärimpfverlauf kann 2 oder 3
Dosen eines Impfstoffs, die im Abstand von 1 bis 2 Monaten gegeben
werden, beinhalten, aufgrund genetischer und anderer Faktoren, wird
jedoch wahrscheinlich eine Antikörperantwort
auf irgendein Impfstoffpräparat
variieren zwischen Präparaten
und einzelnen Personen. Die Reaktion auf die Impfung wird überwacht,
um sowohl kurzzeitige als langzeitige Impfeffizienz zu bestimmen,
wobei erstere verwendet werden kann, um Konjugatpräparate auszuwerten
und letztere, um Einzelpersonen auszuwerten im Bezug auf den Bedarf
für "Booster"-Impfungen. Um den
Antikörpertiter
nach Impfung zu bestimmen, werden Blutproben von geimpften Tieren
analysiert unter Verwendung von Standardtechniken, die dem Fachmann
auf diesem Gebiet bekannt sind, z.B. ELISA. Bevorzugt schließen die
Blutproben Proben von jedem Patienten vor (d.h. negative Kontrolle)
und etwa 4 Wochen nach der Impfung und anschließend in Intervallen von etwa
2 bis 6 Monaten ein. Nach Bedarf kann eine Boosterimpfung verabreicht
werden.
-
Die
Konformere finden auch Nutzen als Reagenzien in Screeningassays
auf monoklonale Antikörper, die
unterschiedlich an nur ein Proteinkonformer binden und können auch
als diagnostisches Mittel für
Krankheiten verwendet werden, die ein infektiöses Mittel betreffen, wie mit
mit Prionen in Beziehung stehende Krankheiten. Der Test kann in
einer Anzahl von Formaten erfolgen. Um auf mit der Krankheit in
Beziehung stehende Konformere zu screenen, werden monoklonale Antikörper direkt
verwendet. High-throughput-Screening biologischer Proben auf mit
der Krankheit in Beziehung stehende Konformere ist auch möglich. Z.B.
wird die biologische Probe einer Festphasenimmuneinfangstelle, die
mit Antikörpern
beschichtet ist, die für
ein oder mehrere mit der Krankheit in Beziehung stehende Konformere
spezifisch sind, zugegeben; die Bindung weist auf die Gegenwart
eines mit der Krankheit in Beziehung stehenden Konformers in der
biologischen Probe hin. Eine solche Information kann verwendet werden,
um mögliche
Behandlungen zu finden oder Kombinationstherapeutika gegen das infektiöse Mittel.
Mit der Krankheit in Beziehung stehende Proteine, die ausgewertet
werden sollen auf geänderte
Konformerverhältnisse
schließen
Insulin, Insulinrezeptor und Glucosetransporter (Diabetes mellitus),
saure Phosphatase der Prostata (Prostatakrebs), Leptin (gestörtes Essverhalten
und Fettsucht), nogo-a/b (neuronaler Regenerationsinhibitor), virale
Capsidmolekülchaperone,
wie hp68 (HIV) und Prionprotein ein.
-
Die
für ein
mit einer speziellen Krankheit assoziiertes Konformer spezifischen
monoklonalen Antikörper
können
entweder für
diagnostische Zwecke verwendet werden, wenn sie mit einer Population
von Patienten mit einer speziellen natürlichen Historie, einem Krankheitsverlauf
oder anderen klinisch epidemiologischen Erkenntnissen korrelieren
oder zur passiven Immunisierung, wenn die Konformerspezifität einer
biologischen Antwort modifiziert werden soll. Um Letzteres zu erreichen,
wird ein monoklonaler Antikörper,
der für
eine mit einer speziellen Krankheit assoziierte Konformation spezifisch
ist, oder eine rekombinante Form davon gereinigt, um jegliche pyrogenen
Kontaminanten oder toxischen Nebenprodukte der Herstellung zu entfernen
und zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung verarbeitet und einem
Menschen oder anderem Tier, das eine Behandlung der mit dem Konformer
in Beziehung stehenden Krankheit benötigt, verabreicht. Allgemein
wird die Zusammensetzung intravenös verabreicht. Alternative
Verabreichungswege schließen
lokale Verabreichung, z.B. auf Wunden oder Schleimhautgewebe, abhängig von
der jeweiligen Pathophysiologie des Krankheitsprozesses und der
Verfügbarkeit
des die Krankheit verursachenden Konformers ein. Passive Immunisierung
ist eine etablierte pharmakologische Therapie; siehe z.B. die Herstellerinformation
bezüglich
der Verabreichung von Trastuzumab (Herceptin®, Roche),
Daclizumab, Abciximab und dgl.
-
Geeigneterweise
können
die Formulierungen in Einzeldosiskits in sterilen Fläschchen
bereitgestellt werden, so dass der Arzt die Fläschchen direkt anwenden kann,
wobei die Fläschchen
die gewünschte
Menge und Konzentration der Formulierung enthalten. Wenn die Fläschchen
die Formulierung für
die direkte Verwendung enthalten, besteht üblicherweise kein Bedarf für andere
Reagenzien zur Verwendung bei dieser Methode. Die jeweiligen Zusammensetzungen
können
in Verpackungsmaterial enthalten sein, das ein Etikett aufweist,
das die jeweiligen Zusammensetzungen angibt, die verwendet werden
können,
um mit einem Proteinkonformer in Beziehung stehende Krankheiten
bei Menschen zu behandeln.
-
Die
folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung weiter erläutern ohne
Beschränkung.
-
Beispiele
-
Materialien und Methoden
-
Verwendete Puffer
-
Homogenisierungspufter
-
- 0,25 M Saccharose (Sigma, USA)
50 mM Hepes (Sigma,
USA)
100 mM Kaliumacetat (Merck, Deutschland)
5 mM Magnesiumchlorid
(Sigma, USA)
-
Probenladungspuffer
-
- 50 mM Tris-Cl (pH 6,8) (Merck, Deutschland)
2% SDS
(G/V) (Sigma, USA)
0,1% Bromphenolblau (Sigma, USA)
10%
Glycerin (Sigma, USA)
2% β-Mercaptoethanol
(Sigma, USA)
12% SDS-Gele wurden gegossen, wie von Sambrook & Russell (2001),
Molecular Cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory
Press, New York, USA, beschrieben;
Reagenzien von BioRad (USA):
Acrylamid, TEMED oder Sigma (USA):
Ammoniumpersulfat, SDS;
Vorrichtung von Biometra Inc., Deutschland.
-
Gel-Laufpuffer
-
- 25 mM Tris-Base (Merck, Deutschland)
250 mM Glycin
pH 8,3 (Sigma, USA)
0,1 % SDS (G/V) (Sigma, USA)
-
Geltransferpuffer
-
- 12 h Transfer auf Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membranen
(Millipore, USA) bei 200 mA.
48 mM Tris-Base (Merck, Deutschland)
39
mM Glycin (Sigma, USA)
20% Methanol (Merck, Deutschland)
-
Fakulative Ponceau-Färbung
-
- 1 g Ponceau S (Sigma, USA) in 5% Essigsäure (Merck, Deutschland)
-
Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit
Tween 20 (TBS-T)
-
- 8 g Natriumchlorid (Merck, Deutschland)
0,2 g Kaliumchlorid
(Merck, Deutschland)
3 g Tris-Base (Merck, Deutschland)
1000
ml H2O mit 500 μl Tween 20 (0,05%) versetzt
(Boehringer Ingelheim, Deutschland)
pH auf 7,8 eingestellt
-
Blockierpuffer
-
- 5% fettarme Milch (Oxoid, GB) in TBS-T
-
Kupfer-Vorratslösungen
-
500
mM oder 25 mM Kupfer(II)sulfatpentahydrat (Merck, Deutschland) in
ultrareinem Wasser, sterilfiltriert
-
Beispiel 1
-
Herstellung
und Analyse der Bindungseigenschaften von konformerspezifischen
monoklonalen Antikörpern
an Prionprotein
-
Antikörperherstellung
-
7VC
Hybridomazellen wurden in proteinfreiem Hybridoma-Medium (PFHM II;
#12040–051
Gibco/Invitrogen, USA), das OptiMAb (#11910–031 Gibco/Invitrogen, USA)
in einem 75 ml Gewebekulturkolben enthielt, gezüchtet. Sie wurden geerntet
kurz nachdem das Inkubationsmedium sich zu einem mehr gelblichen
Farbton zu verfärben
begann, um die maximale Antikörperkonzentration
aber minimalen Zelltod zu haben. Die Antikörperkonzentration wurde dann
gemessen, indem die mAB-Konzentration in Überstand mit einer bekannten durch
Westernblotting erhaltenen verglichen wurde. Sie war etwa 100 μg/ml.
-
Versuchsprotokoll
-
Alle
Western-Blots wurden unter Verwendung des folgenden Protokolls durchgeführt:
-
- 1. 0,5% Hirnhomogenisate von Hamstern oder
transgenen Mäusen,
wie angegeben, wurden in gleichen Mengen auf ein 12%-SDS-Gel (bei
35 mA Strom laufen gelassen) geladen und auf eine PVDF-Membran überführt durch
Eintauch-(nass)-Blotten 12 Stunden bei einem konstanten Strom von
200 mA.
- 2. Die Membranen wurden gegebenenfalls mit Ponceau S in TBS-T
angefärbt,
um einzelne Bahnen sichtbar zu machen und den Transfer von Proteinen
zu kontrollieren.
- 3. Nach Waschen mit TBS-T wurden die Membranen mit 5% fettarmer
Milch in TBS-T 1 Stunde lang blockiert.
- 4. "Normales
Waschen" schließt drei
aufeinander folgende Waschzyklen in mit Millipore behandeltem Wasser
(1 min) und TBS-T (5 min) ein; "intensives
Waschen" schließt vier
aufeinander folgende Waschzyklen in mit Millipore behandeltem Wasser
(1 min mit dreifachem Spülen)
und Waschstufen mit steigendem TBS-T mit anfangs fünf- und
dann zehnminütigen
Zyklen.
- 5. Nach Blockieren wurden die Membranen intensiv gewaschen und
gegebenenfalls in einzelne Streifen geschnitten. Schmale Streifen
wurden in 15 ml Falcon-Tubes (Greiner, Deutschland) inkubiert.
- 6. Antikörper
wurde auf eine Endkonzentration von 10 μg/ml in TBS-T zugegeben und
eine definierte Konzentration an Kupfersulfat oder 100 mM EDTA aus
einer Vorratslösung
zugegeben. Primärer
Antikörper wurde
2 Stunden bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler inkubiert.
- 7. Die Blots wurden intensiv gewaschen.
- 8. Sekundäre
Antikörper
(Ziege-Antimaus-IgG H/L-Peroxidase-markiert; #31444 Pierce, USA)
wurden in einer Verdünnung
von 1:5.000 1 Stunde lang inkubiert.
- 9. Die Blots wurden intensiv gewaschen. Ein letztes Waschen
erfolgte mit Wasser, bevor ein Substrat mit verstärkter Chemilumineszenz
(ECL; Amersham Pharmacia, USA) zugegeben wurde und mit Hyperfilm (Amersham
Pharmacia, USA) entwickelt wurde.
-
Bereich unterschiedlicher
Bindung
-
Bei
pH 7,8 des TBS-T-Inkubationspuffers wurde ein differenzielles Bindungsprofil
etabliert zum Nachweis von PrPCTM (PrP-Immunoreaktivität in Tg(KH > II)-Maushirnen gegen
PrP sekretorisch (PrP-Immunoreaktivität in Tg(7BHOZ)-Maushirnen). Es wurde
gefunden, dass die unterschiedliche Immunoreaktivität von Tg(KH > II) in CuSO4 Konzentrationen zwischen 1 μM und 50 μM vorhanden
war. Höhere
Konzentrationen schwächten
die Immunoreaktivität
signifikant und zogen schließlich
den Antikörper
vollständig
von dem Blot ab. Niedrigere Konzentrationen ergaben inkonsistente
Ergebnisse ohne klare Unterscheidung; daher wurden 100 mM EDTA zugegeben,
um Metallionen, die statistisch in Blots und Puffern vorhanden sind,
auszukomplexieren.
-
Bei
festen Antikörper-
(10 μg/ml)
und Kupfer- (25 μM)
Konzentrationen wurde der pH in TBS-T variiert und es wurde gefunden,
dass bei pH 5 die gesamte Immunoreaktivität verloren war, bei pH 7,8
die Immunoreaktivität
unterschiedlich war zwischen Tg(KH > II)- und Tg(7BHOZ)-Gehirnen und positiv
aber nicht unterschiedlich bei pH 9 war.
-
Beispiel 2
-
Identifizierung eines monoklonalen
Antikörpers,
der an NTM PrP bindet
-
In
vitro translatierte PrP-Isoformen wurden hergestellt, wie in USPN
09/739 179, eingereicht am 15. Dezember 2000 und veröffentlicht
am 26. September 2002 als US-2002-0137915-A1, beschrieben, deren
Offenbarung hier durch Bezugnahme miteingeschlossen wird. Die erzeugten
Konformationsisoformen wurden durch Immunfällung mit monoklonalen Antikörpern gescreent,
die unter Verwendung von Methoden, die dem Fachmann auf diesem Gebiet
bekannt sind, hergestellt worden waren und von denen vorher gezeigt
worden war, dass sie mit PrP wechselwirkten (siehe z.B. die Ergebnisse
von Beispiel 1 oben). Die in-vitro-Translation von PrP-Isoformen wird in 8 gezeigt (linke Bahn) und
die Immunpräzipitation
oder Immunfällung
mit Klonen von 7VC (Bahn 2 und 3) und 19B10 (Bahnen 4 und 5). 19B10
erkennt sekretorisches oder CTM PrP nicht, sondern nur NTM PrP und
Vorläufer-PrP.
-
Beispiel 3
-
Lokalisierung
von PrP-Isoformen in mit Scrapie infizierten Neuroblastomzellen
-
Permanent
mit Scrapie infizierte Neuroblastomzellen (ScN2a) wurden verwendet,
die von einer Infektion von Neuroblastomzellen (N2a-Zellen; ATCC
# CRL 131) mit dem RML-Stamm von Maus-adaptierter Scrapie (Chandler
et al. 1961, The Lancet i: 1378–1379)
und anschließende
Subklonierung (Bosque und Prusiner, J. Virology 74:4377–4386) stammen.
-
Die
Immunfärbung
der Zellen erfolgte wie von Korth et al. (2000), Journal of General
Virology 81:2555 beschrieben. Die für 7VC und 19B10 verwendeten
Antikörpersuspensionen
waren Zellkulturüberstände von HT-Medium
(Minimalessenzielles Medium (Invitrogen/Gibco # 21090–022), das
mit 10% FCS (PAA Laboratories, Linz, Österreich) und 100 U/100 μg/ml Penicillin/Streptomycin,
Endkonzentration, ergänzt
war und Hypoxanthin und Thymidin (beide von Sigma, USA) wurden mit
1,36 bzw. 0,76 mg/100 ml Endkonzentration in einer Konzentration
von 1:1 mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung zugegeben. Die Ergebnisse
sind in 9 gezeigt.
-
Immunfärbung von
ScN2a-Zellen ohne Antikörper
(linkes Feld von 9),
mAB 6H4 (zweites Feld von links), mAB 19B10 (drittes Feld von links)
und mAB 7VC (rechtes Feld). Die Immunfärbung wurde auf der Zelloberfläche (oberes
Feld) oder nach Permeabilisierung mit Saponin (Sigma, USA) für intrazelluläre Färbung (unteres
Feld) durchgeführt.
Wie die Ergebnisse zeigen, färbt
mAB 7VC sowohl die Zelloberfläche
als auch die intrazellulären
Kompartimente von ScN2a-Zellen.
MAB 19B10 färbt
die Zelloberfläche
von ScN2a-Zellen, was darauf hindeutet, dass NTMPrP an der Zelloberfläche dieser
Zellen vorhanden ist. MAB 19B10 färbt die intrazellulären Kompartimente
nicht, wenn die Zellen mit Saponin permeabilisiert werden; dies
beruht wahrscheinlich auf der Denaturierung der NTMPrP-Konformation
durch Saponin.
-
Beispiel 4
-
Differenzierung von mit
Scrapie infizierten Neuroblastomzellen mit 19B10
-
ScN2a-Zellen
sind N2a-Zellen, die aus einer zusammenfließenden 10-cm-Zellkulturschale
entnommen wurden und in eine 60-mm-Schale (1 Tropfen) aufgespalten
wurden. Sie werden auf Minimalessenzialmedium, das mit 10% FCS und
Penicillin/Streptomycin, wie oben beschrieben, ergänzt ist,
gezüchtet.
Unterschiedliche Konzentrationen von Nybridomazellkulturmediumüberstand
(HT-Medium, siehe oben) wurden zugegeben (0,5%, 1 %, 5%, 10%, 50%
und HT-Medium allein
als Kontrolle). Medium und zugegebene HT-Mediumüberstände wurden jeden zweiten Tag
1 Woche lang ausgetauscht. Nach 7 Tagen Behandlung und nicht vorher
und nur in einem engen Konzentrationsbereich von 5 bis 10% zugegebenem
HT-Medium (entsprechend einer End-mAB-Konzentration von 2 bis 4 μg/ml Zellkulturmedium)
wurde beobachtet, dass ein massiver Zelltod auftrat, aber die verbleibenden
ScN2a-Zellen waren zu Riesenzellen differenziert (vgl. 10 oberes Feld links mit
rechtem Bild). Dies wurde begleitet von einem apoptoseartigen Blebbing
einiger Kerne (10, mittleres
Feld) und einer Downregulierung der Gesamt-PrP-Expression (10, unteres Feld), was durch
intrazelluläre
PrP-Färbung
mit mAB 6H4 zu sehen ist, durchgeführt, wie von Korth et al. beschrieben (2000),
Journal of General Virology 81:2555.
-
Die
Behandlung von ScN2a-Zellen (und auch N2a-Zellen, Daten nicht gezeigt)
mit mAB 19B10 führt zu
einer dosisabhängigen
Wirkung, die Zelltod und Differenzierung der verbleibenden Zellen
einschließt.
Aus bisher unbekannten Gründen
haben Konzentrationen von ≥ 50%
(≥ 10 μg/ml) von
mAB 19B10 diese Wirkung nicht. Es ist auch unbekannt, warum die
Wirkung ziemlich plötzlich – aber zuverlässig – nach etwa
1 Woche Behandlung auftritt. Das Ansteuern von PrP mit anderen Antikörpern (z.B.
7VC oder 6H4) führt
nicht zu diesen Wirkungen. Ziemlich einheitlich führt das
Ansteuern von NTM PrP mit mAB 19B10 zu einer allgemeinen Downregulierung
von PrP (was durch Immunfärbung
zu sehen ist).
-
Beispiel 5
-
Hemmung der
Prionreplikation durch konformerspezifische monoklonale Antikörper
-
ScN2a-Zellen
wurden behandelt, wie in Beispiel 4 oben beschrieben. Nach 1 Woche
wurden die Zellen lysiert und wurden exakt, wie von Korth et al.
(2001), PNAS 98:9836 beschrieben, aufgearbeitet. Wie in 11 gezeigt, hemmt mAB 7VC
die Prionreplikation in ScN2a-Zellen (11,
oberes Feld). MAB 19B10 hemmt die Prionreplikation in ScN2a-Zellen
nur bei Konzentrationen von 10% (ca. 4 μg/ml), nicht aber bei Konzentrationen ≥ 50% (10 μg/ml) oder
weniger als 5% (2 μg/ml).
Die Antiprionwirkung von mAB 19B10 steht im Gegensatz zu der von
anderen mABs, einschließlich
7VC. "Übliche" mABs schirmen PrPC
(wahrscheinlich die sekretorische Form) davon ab, umgewandelt zu
werden (Peretz et al. (2001), Nature 412:(6848):739–43), wohingegen 19B10
wirkt, indem es die PrP-Expression herunterreguliert.
-
Beispiel 6
-
Unterschiedliche
Kupferabhängigkeit
von verschiedenen PrP-Arten
-
Gehirne
wurden mit einem Dounce-Homogenisator in 0,25 M Saccharose, 150
mM Kaliumacetat und 5 mM Magnesiumchlorid ("Puffer A") zu einem 10%igen Homogenisat homogenisiert.
Die Homogenisate wurden dann auf 1 % verdünnt und durch Zentrifugation
in einer Tischzentrifuge mit 1000 U/min 1 Minute lang vorgeklärt. Dann
wurden 1,5 ml vorgeklärtes
1 %iges Homogenisat und ca. 5 μg
in serumfreiem Medium gezüchteter
mAB 7VC und Protein-A-Agarose über
Nacht bei 4°C
inkubiert. Agarosehaltiges Protein-A-gebundenes 7VC und immungefälltes PrP
wurden dann durch ein kurzes (ca. 10 s) Schleudern mit 1000 U/min
in einer Tischzentrifuge ausschleudert und mit Puffer A dreimal
gewaschen. Anschließende
Elutionen mit 50 μl
sterilem Wasser, das zunehmende Konzentrationen von Kupfersulfat
(Cu2SO4) enthielt,
wurden genommen und auf einem SDS-Gel laufen gelassen. Ein Western
Blot zeigt Eluate mit unterschiedlichen Kupferkonzentrationen nach
Immunfällung
von 7BHOZ Hirnhomogenisat (transgene Maus, die PrP von Syrischem
Hamster exprimiert; 12A,
oberes Feld) oder F1198-Hirnhomogenisat (transgene Maus, die PrP
von mutiertem Syrischen Hamster exprimiert mit zunehmendem CTMPrP; 12A, unteres Feld). Wie
gezeigt, bindet mAB 7VC in kupferabhängiger Art und Weise an verschiedene
PrP-Arten in Lösung.
In dem Homogenisat, in dem CTMPrP vorhanden ist, können sogar
höhere
Konzentrationen an Kupfer PrP nicht vollständig eluieren ("Gel"-Bahn); außerdem gibt
es PrP-Arten, die mit hohen Konzentrationen von Kupfer in dem CTMPrP-haltigen Homogenisat eluierten,
nicht aber im normalen Homogenisat.
-
Western
Blots von nicht mit Protease verdautem Hirnhomogenisat von normalem
Syrischen Hamster, Hirnhomogenisate von mit Scrapie infiziertem
(Sc237-Stamm) Syrischen
Hamster und mit Protease verdautes Hirnhomogenisat von mit Scrapie
infiziertem Syrischen Hamster, hergestellt wie in Beispiel 1 oben
beschrieben, sind in 12b gezeigt.
PrP aus verschiedenen Hirnhomogenisaten, auf eine Membran geblottet,
hat unterschiedliche kupferabhängige
Affinitäten
für mAB
7VC. Insbesondere wird die Immunoreaktivität von PrP aus normalem Gehirn
viel leichter durch Kupfer ausgelöscht als bei Scrapie-infiziertem
Gehirn. Da beide Homogenisate in SDS vor der Gelelektrolyse gesiedet
wurden, gibt es Merkmale in PrP, die dieses Denaturierungsverfahren "überleben" können
und zu einer gewissen erneuten Faltung der Membran führen, die
dann die beschriebenen Unterschiede offensichtlich macht. Unter
Verwendung des vorliegenden Verfahrens kann mAB 7VC Scrapie-infiziertes
Gehirn von nicht infiziertem Gehirn in kupferabhängiger Art und Weise unterscheiden.
-
Beispiel 7
-
Bindung von
konformersgezifischen Antikörpern
an verschiedene Gehirnhomogenisate
-
Ein
Western Blot von 10%igen Hirnhomogenisaten in Puffer A, hergestellt
wie vorher beschrieben, wurde verwendet und mit mABs 7VC, 19B10
und 6H4 inkubiert. Die Ergebnisse sind in 13 gezeigt.
mAB 7VC bindet an Octarepeats, daher kann er moPrP, dem die Octarepeats
entfernt wurden, immunologisch nicht erkennen (13,
unteres Feld rechts, vgl. Bahn 7 und 8). mAB 19B10 hat generell
eine schwache Immunoreaktivität.
Die stärkste Immunoreaktivität besteht
bei Gehirnhomogenisaten aus transgenen Mäusen, in denen die PrP-Expression
unterdrückt
wurde durch Expression unter Tetracyclinpromotor; wenn der Tetracyclinpromotor
entfernt ist, wird die PrP-Expression
induziert und die Mäuse
werden krank mit Zeichen von neurologischer Krankheit. Diese Mäuse produzieren
wahrscheinlich abweichende Isoformen von PrP, wahrscheinlich einschließlich CTMPrP
und NTMPrP.
-
Beispiel 8
-
Herstellung
von konformerspezifischen monoklonalen Antikörpern und deren Verwendung
bei der Patientenprofilierung
-
Ein
denaturiertes oder natives Antigen wird verwendet, um eine Maus
zu immunisieren und Hybridomas werden erzeugt durch Fusion von Splenozyten
mit Myelomazellen. Die entstehenden Hybridomas werden gescreent
durch Lösungs-IP
gegen konformerangereicherte zellfreie Translationsprodukte oder
konformerhaltige Gewebeschnitte oder Zellen durch Immunfärbung oder
durch Western Blot, wobei die wenigen oft schwach reagierenden Vertreter,
die rein konformationsspezifisch sind, identifiziert werden. Patientenserum oder
isolierte und lysierte "Buffy
coat" aus einer
zentrifugierten antikoagulierten Blutprobe wird dann als "unbekannt" verwendet unter
Bezugnahme auf die bekannten zellfreien Translationskonformere und
wird durch Lösungs-IP,
Western Blot oder Immunfärbung
auf relative Reaktivität
der Antikörper,
die für
unterschiedliche Konformere spezifisch sind, gescreent, um ein Konformerindexprofil
zu erzeugen, das die relativen Verhältnisse eines Konformers zu
den anderen in dem speziellen Patientenserum zu der Zeit, zu der
das Blut abgenommen wurde, widerspiegelt. Veränderungen im Profil können bestimmt
werden durch Korrelation von Population und retrospektiver klinischer
Epidemiologie und können
als Funktion von Zeit, Wirkstofftherapie, Nahrung und Lebensstil
oder andere Veränderungen überwacht
werden, um den jeweiligen Zustand irgendeines gegebenen Patienten
mit der auf der Population basierenden Kohorte zu korrelieren.
-
Beispiel 9
-
Immunisierung gegen Prionkrankheit
-
PrPCTM wird synthetisiert in einem in-vitro-Translationssystem,
wie von Hay et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7:914–919; Hegde et al. (1998) oben
und Hegde et al. (1999) oben beschrieben. Mutierte PrP-Konstrukte
werden verwendet, so dass einzelne PrP-Konformere favorisiert sind.
Für das
Immunisierungsverfahren werden Methoden, die von Srivastava und
Kollegen entwickelt wurden, verwendet (siehe (Blachere et al. (1997)
oben und (Castellino et al. (2000) oben). Kurz gesagt, werden rekombinantes
(Maus oder andere Art) HSP70 (1 bis 10 μg) und das Antigen, in vitro
translatiertes PrPCTM (so viel wie möglich, aber
mindestens 50 ng) zusammen mit PBS, das 1 mM KCI, 2 mM MgCl2 und 100 μM
ATP enthält,
60 Minuten bei Raumtemperatur in einem geeigneten Volumen inkubiert;
schließlich
wird 1 mM ADP zugegeben und 30 Minuten lang inkubiert. Dies ist
das Antigen. Das Antigen wird dann zur Immunisierung des gewünschten
Tiers verwendet entweder durch intracutane, subcutane, intramuskuläre, intraperitoneale
oder intravenöse
Injektion gemäß Standardprotokollen.
Gegebenenfalls werden Adjuvantien, wie Freund's komplettes Adjuvans, RIBI oder Aluminiumhydroxid
(alle von Sigma, USA) oder ein rekombinantes Cytokin, wie Interleukin-2,
verwendet.
-
Beispiel 10
-
Passive Immunisierung
mit konformationsspezifischen Antikörpern
-
Die
passive Immunisierung beinhaltet zuerst die Identifikation eines
mit einer Krankheit assoziierten Konformers eines Proteins. Monoklonale
Antikörper
oder Derivate davon mit der gewünschten
differenziellen Bindungsspezifität
werden wie oben beschrieben erzeugt. Diese monoklonalen Antikörper werden
so prozessiert, dass sie physiologisch annehmbar sind und die entsprechenden
pharmakologischen Standards für
die Verabreichung erfüllen.
Gewöhnlich
sind Antikörper
höchst
gereinigt, Pyrogene extrahiert und mögliche immunogene Epitope auf
dem monoklonalen Antikörper
durch genetische Modifikation des monoklonalen Antikörpers unterdrückt (z.B. "humanisierte Antikörper"). Ein pharmazeutisches
Präparat
des Antikörpers
wird dann einem Tier, das es benötigt,
je nach Krankheitsphänotyp
und Lokalisierung der Krankheit intravenös, subcutan, intramuskulär, intraventrikulär, intraperitoneal
oder lokal an cutanem oder Schleimhautgewebe gegeben. Diese Behandlung
wird so lange wiederholt, wie die Symptome der Krankheit fortbestehen
und bis der Schutz etabliert ist.
-
Beispiel 11
-
Erzeugung von
konformationsempfindlichen Antikörperchips
-
Konformationsempfindliche
Antikörperchips
zur Profilierung von Patientengewebe oder Flüssigkeitsproben zur High Throughput-Diagnose werden
wie folgt hergestellt. Eine Gruppe konformationsspezifischer Antikörper, die
mit den oben im Detail angegebenen Methoden gezüchtet werden, wird kovalent
an einem speziellen Mikroarray fixiert, bevorzugt einem adressierbaren
Mikroarray. Es gibt keine Beschränkung
in der Anzahl der konformationsspezifischen Antikörper, die
verwendet werden, da die einzelnen Unterschiede von Reaktivitäten einzelner
Antikörper
(in fixierten Mengen) mit dem jeweiligen Gewebe oder den Flüssigkeitsproben untersucht
und dokumentiert werden. Je größer die
Anzahl der verwendeten Antikörper
ist, desto höher
ist das Profilierungspotenzial. Da die Mikroarrays mit Standardverfahren
hergestellt werden (siehe z.B. die Anleitungen des Herstellers von
Affymetrix oder Ciphergen) und im Mikro- bis Nanomaßstab betrieben
werden, werden Hunderte von monoklonalen Antikörpern verwendet. Eine Gewebeprobe
oder Körperflüssigkeit
in einer geeigneten Pufferlösung
wird mit dem Chip in Kontakt gebracht und jegliches ungebundene
Material durch Waschen entfernt. Die Bindung wird z.B. mit biophysikalischen
Mitteln (z.B. Laserscanning und/oder Plamonresonanzmessung, Fluoreszenzlöschung)
oder immunologisch nachgewiesen. Beispiele für Nachweisverfahren schließen solche
ein, die für
Antikörperchips
verwendet werden (Becton & Dickinson,
Ciphergen und andere). Die Gegenwart der jeweiligen Konformere wird
erkennbar gemacht durch Nachweis der Bindung der monoklonalen Antikörper, die
auf dem Chip immobilisiert sind. Die Gegenwart oder Abwesenheit
spezieller Konformere wird dann verwendet, um ein Profil für den Patienten
zu entwickeln.
-
Wie
oben gezeigt, wurde eine einzigartige molekulare Struktur in PrPCTM
(das auch mit PrPsc assoziiert ist) gefunden
unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, der diese molekulare
Struktur differenziell erkennen kann. Diese einzigartige molekulare
Komponente, die mit PrPCTM und PrPsc assoziiert
ist, kann mit mAB 7VC unter definierten Bedingungen mit überschüssigen Kupferionen,
die in der Nähe
der Bindungsstelle von mAB 7VC vorhanden sind, gefärbt werden.
Bei pH 7,8 des TBS-T-Inkubationspuffers wurde ein differentielles
Bindungsprofil von PrPCTM (PrP-Immunoreaktivität in Tg(KH > II)-Mausgehirnen
gegenüber
sekretorischem PrP (PrP-Immunoreaktivität in Tg(7BHOZ)-Mausgehirnen)
etabliert. Es wurde gefunden, dass eine unterschiedliche bzw. differentielle
Immunoreaktivität
von Tg(KH > II) bei
CuSO4-Konzentrationen
zwischen 1 μM
und 50 μM
vorhanden war. Höhere
Konzentrationen schwächten
die Immunoreaktivität
signifikant und zogen schließlich
den Antikörper
vollständig
von dem Blot ab. Geringere Konzentrationen lieferten inkonsistente
Ergebnisse ohne klare Unterscheidung; daher wurden 100 mM EDTA zugegeben,
um Metallionen, die zufällig
in Blots und Puffern vorhanden sind, auszukomplexieren. Bei festen
Antikörper-(10μg/ml)- und
Kupfer-(25 μM)-Konzentrationen
wurde der pH in TBS-T variiert. Es wurde gefunden, dass bei einem
pH von 5 jegliche Immunoreaktivität verschwunden war, bei pH
7,8 die Immunoreaktivität
unterschiedlich war zwischen Tg(KH > II)- und Tg(7BHOZ)-Gehirnen und positiv,
aber nicht unterschiedlich bei pH 9 war. Diese molekulare Komponente
ist entweder eine kovalente Modifikation oder eine extrem enge Faltung
des Proteins oder beides. Die molekulare Ansteuerung von mAB 7VC
zu der Struktur ermöglicht
nun die differenzielle Erkennung von PrPCTM oder PrPSc gegenüber anderen
PrP-Arten.
-
Ein
zweiter mAB wurde identifiziert, 19B10, der differentiell an PrPNTM
bindet und die Zelloberfläche von
ScN2a-Zellen färbt.
Die Zugabe des Antikörpers
zu kultivierten N2a- oder Sc2a-Zellen führt zu einer Reduktion der
Zellzahl und Differenzierung der überlebenden Zellen nach 1 Woche
Behandlung bei mittleren Konzentrationen von etwa 25 bis 250 μg/ml. Behandelte
Zellen werden größer, haben
mehr axonale Extensionen und die PrP-Expression (alle konformationalen
Isoformen) ist hinunterreguliert. Die Behandlung ist reversibel. N2a-Zellen
sind empfindlicher auf die Behandlung und die Umkehr der Wirkungen
erfolgt schneller als mit ScN2a-Zellen. Es ist eine Hypothese der
Erfindung, dass 19B10 mAB an unglycosilierte und monoglycosilierte Formen
von PrP bindet.
-
Alle
Publikationen und Patentanmeldungen, die in dieser Beschreibung
erwähnt
werden, zeigen das Ausmaß des
Fachwissens des Fachmanns auf diesem Gebiet, an den sich die Erfindung
richtet. Alle Veröffentlichungen
und Patentanmeldungen werden hier durch Bezugnahme miteingeschlossen
in dem Ausmaß,
in dem die einzelne Veröffentlichung
oder Patentanmeldung spezifisch und einzeln angegeben ist.
-
Nachdem
die Erfindung nun vollständig
beschrieben wurde, ergibt sich für
den Fachmann auf diesem Gebiet, dass viele Veränderungen und Modifikationen
erfolgen können,
ohne von der Idee und dem Schutzbereich der beigefügten Ansprüche abzuweichen.
-