MX2008007006A - Anticuerpos monoclonales contra la proteina amiloide beta y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a anticuerpos monoclinales (eg., 8F5 y 8C5) que se pueden utilizar, por ejemplo, en la prevención, tratamiento y diagnostico de la enfermedad de alzheimer o de otros trastornos neurodegenerativos.

Description

ANTICUERPOS MONOCLONALES CONTRA LA PROTEINA AMILOIDE BETA Y USOS DE LOS MISMOS Campo Técnico La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales (eg., 8F5 y 8C5) que se pueden utilizar, por ejemplo, en la prevención, tratamiento y diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer o de otros trastornos neurodegenerativos. Antecedentes de la Invención La enfermedad de Alzheimer (EA) es un trastorno neurodegenerativo causado por una progresiva pérdida de las capacidades cognitivas y por características neuropatológicas que comprenden depósitos amiloides, marañas neurofibrilares y pérdida neuronal en varias regiones del cerebro, véase Hardy y Selkoe (Science 297, 353 (2002); Mattson (Nature 431 , 7004 (2004). Los constituyentes principales de los depósitos amiloides son péptidos amiloides beta (?ß)., siendo el del tipo de 42 aminoácidos de longitud (?ß1-42) el más prominente. En particular, la proteína amiloide ß(1-42), es un polipéptido que tiene 42 aminoácidos que se deriva de la proteína precursora amiloide (PPA), por un procesamiento proteolítico. Esto también incluye, además de variantes humanas, isoformas de la proteína amiloide ß(1-42) en organismos diferentes de los seres humanos, en particular, otros mamíferos, especialmente ratas. Esta proteína, que tiene a polimerizarse en un ambiente acuoso, puede estar presente en muy diferentes formas moleculares. Una correlación simple de la deposición de proteína insoluble con la presencia o progreso de trastornos de demencia, tales como, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer, ha probado ser poco convincente (Terry et al., Ann. Neurol. 30. 572-580 (1991); Dickson et al., Neurobiol. Aging 16, 285-298 (1995)). En contraste, la pérdida de sinapsis y de percepción cognitiva parece correlacionarse mejor con las formas solubles de la ?ß(1-42) (Lúe er al., Am. J. Pathol. 155, 853-862 (1999); McLean et al., Ann. Neurol. 46, 860-866 (1999)). Aunque en el pasado se han preparado anticuerpos policlonales y monoclonales contra la ?ß(1-42), ninguno ha comprobado producir el efecto terapéutico deseado, sin también causar graves efectos secundarios en los animales y/o seres humanos. Por ejemplo, los resultados de inmunización pasiva en estudios preclínicos, en ratones APP23 muy viejos que recibieron un anticuerpo N-terminal dirigido contra ?ß(1-42) una vez a la semana durante 5 meses, indican efectos secundarios terapéuticamente relevantes. En particular, estos ratones mostraron un incremento en el número y gravedad de microhemorragias, en comparación con ratones tratados con solución salina (Pfeifer er al., Science 2002 298:1379). Un incremento similar en hemorragias, recientemente también fue descrito para ratones Tg2576 y PDAPP muy viejos (>24 meses) (Wilcock et al., J Neuroscience 2003, 23: 3745-51; Racke er al., J Neuroscience 2005, 25:629-636). En ambas cepas, la inyección de anti-AP( 1 -42) dio como resultado un incremento sign ificativo de las microhemorragias. Así pues, existe una gran necesidad terapéutica de q ue se desarrollen productos biológicos que prevengan o hagan más lento el prog reso de esta enfermedad , sin inducir efectos secundarios negativos y potencialmente mortales , en el cuerpo humano . Tal necesidad es particularmente evidente en vista de la creciente longevidad de la población general y , con este incremento, una elevación asociada del número de pacientes que an ualmente se diagnostican con Enfermedad de Alzheimer. Además, tales anticuerpos permitirán el diag nóstico apropiado de la Enfermedad de Alzheimer en un paciente que experimente síntomas, diagnóstico q ue en el presente sólo se puede confirmar por a utopsia. Ad icionalmente, los anticuerpos permitirán dilucidar las propiedades biológicas de las proteínas y otros factores biológicos responsables de esta debilitante enfermedad . Todos los pacientes y publicaciones referidos en la presente, se incorporan en su totalidad como referencia . Breve Descri pción de la I nvención La presente invención incluye u n anticuerpo aislado q ue se une con mayor especificidad a un globu lómero de proteína amiloide-beta (?ß) , q ue a un monómero de proteína amiloide-beta . Por lo tanto, se observa u na unión preferente. El anticuerpo puede ser, por ejemplo , u n a nticuerpo monoclonal , tal como 8F5 u 8C5. La relación de la especificidad de u nión al globulómero versus el monómero, es de cuando menos 1 .4. En particular, la relación de preferencia es cuando menos aproximadamente de 1.4 a cuando menos aproximadamente 16.9 (una relación de 1.0-17.5 incluyendo los extremos), también se considera que cae dentro de los alcances de la presente invención, así como los porcentajes decimales de la misma. Por ejemplo, 1.1, 1.2, 1.3 2.0, 2.1, 2.2 17.1, 17.2, 17.3, 17.4, 17.5, así como todos los números enteros entre estos valores y los porcentajes de los mismos, se consideran dentro de los alcances de la presente invención. La proteína amiloide-beta monomérica puede ser, por ejemplo, monómero ?ß(1-42) o monómero ?ß(1-40). Además, la presente invención también abarca un anticuerpo monoclonal (referido en la presente como "8F5") producido por un hibridoma que tiene el No. de designación en la Colección Norteamericana de Cultivos Tipo PTA-7238, así como el hibridoma que produce este anticuerpo monoclonal (Le., 8F5). La presente invención también incluye un anticuerpo monoclonal (referido en la presente como "8C5") producido por un hibridoma que tiene el no. de designación en la Colección Norteamericana de Cultivos Tipo PTA-7407, así como el hibridoma que produce este anticuerpo monoclonal (Le., 8C5). Adicionalmente, la presente invención incluye un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada variable codificada por la SEQ ID NO: 1. Este anticuerpo puede ser murino, humano o humanizado. Además, la presente invención incluye un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena ligera variable codificada por la SEQ ID NO: 2. Este anticuerpo también puede ser murino, humano o humanizado. El anticuerpo además puede comprender una cadena pesada ligera variable codificada por la SEQ ID NO: 1 y puede ser humano o humanizado. Además, la presente invención incluye un anticuerpo monoclonal que comprende la SEQ ID NO: 3. El anticuerpo puede ser murino, humano o humanizado. Además, la presente invención abarca un anticuerpo monoclonal que comprende la SEQ ID NO: 4. Este anticuerpo puede ser murino, humano o humanizado. Este anticuerpo además puede comprender la SEQ ID NO: 3 y puede ser murino, humano o humanizado. Adicionalmente, la presente invención incluye un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada variable codificada por la SEQ ID NO: 11. Este anticuerpo puede ser murino, humano o humanizado. Además, la presente invención incluye un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena ligera variable codificada por la SEQ ID NO: 12. Este anticuerpo también puede ser murino, humano o humanizado. El anticuerpo además puede comprender una cadena pesada variable codificada por la SEQ ID NO: 11 y puede ser humano o humanizado. Además, la presente invención incluye un anticuerpo monoclonal que comprende la SEQ ID NO: 19. El anticuerpo puede ser murino, humano o humanizado.

Además, la presente invención abarca un anticuerpo monoclonal que comprende la SEQ I D NO: 20. Este anticuerpo puede ser mu rino , h umano o humanizado. Este anticuerpo puede además comprende la SEQ I D NO : 1 9 y puede ser mu rino, humano o humanizado. La presente invención también incluye un anticuerpo aislado q ue se une con mayor especificidad a un globulómero de proteina amiloide-beta que a una proteína amiloide-beta fibrilar. Este anticuerpo puede ser, por ejemplo, monoclonal y puede ser el anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma q ue tiene el número de designación en la Colección Norteamericana de Cultivos Tipo PTA-7243 ó el hibridoma que tiene el número de designación de la Colección Norteamericana de Cultivos Tipo PTA-7407. Los hibridomas que producen estos anticuerpos monoclonales , también caen dentro de los alcances de la presente invención . Además , la presente invención incluye un anticuerpo en el cual cuando menos una de las regiones determ inantes de complementariedad (CDRs) de la cadena pesada variable, se selecciona del g rupo que consiste de la SEQ I D NO: 5, SEQ I D NO : 6 y SEQ I D NO : 7. Además, la presente invención también incluye un anticuerpo en el cual cuando menos una de las CDRs de la cadena ligera variable, se selecciona del grupo que consiste de la SEQ I D NO: 8 , SEQ I D NO : 9 y SEQ I D NO : 1 0. Este anticuerpo además puede comprender cuando menos una C DR de la cadena pesada variable que se selecciona del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7. La presente invención también incluye un anticuerpo en el cual cuando menos una de las CDRs de la cadena pesada variable, se selecciona del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15. Además, la presente invención también abarca un anticuerpo en el cual cuando menos una de las CDRs de la cadena ligera variable, se selecciona del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18. Este anticuerpo además puede comprender cuando menos una CDR de la cadena pesada variable que se selecciona del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15. Adicionalmente, la presente invención abarca un método para el tratamiento o prevención de la Enfermedad de Alzheimer en un paciente que necesite de dicho tratamiento o prevención. Este método comprende administrarle al paciente uno o más de los anticuerpos aislados anteriormente descritos, en una cantidad suficiente para efectuar el tratamiento o prevención. El anticuerpo aislado se puede administrar, por ejemplo, por una vía que se selecciona del grupo que consiste de administración intramuscular, administración intravenosa y administración subcutánea. La presente invención también incluye un método para diagnosticar la Enfermedad de Alzheimer en un paciente que se sospeche que la padece. Este método comprende los pasos de: 1) aislar una muestra biológica del paciente; 2) poner en contacto la muestra biológica <> con cuando menos uno de los anticuerpos anteriormente descritos , por un periodo de tiempo y bajo condiciones suficientes para la formación de complejos antígeno/anticuerpo; y 3) detectar la presencia de los complejos antígeno/anticuerpo en dicha muestra , en donde la presencia de los complejos indica u n diagnóstico de la Enfermedad de Alzheimer en el paciente. El antígeno puede ser, por ejemplo , un g lobulómero o u na porción o fragmento del mismo, que tenga las mismas propiedades funcionales que el globulómero completo (e.g . , actividad de unión) . Además, la presente invención incluye otro método para el diagnóstico de la Enfermedad de Alzheimer en un paciente q ue se sospeche que la padece. Este método comprende los pasos de: 1 ) aislar una muestra biológica del paciente; 2) poner en contacto la muestra biológica con cuando menos u n antígeno por un periodo de tiempo y bajo condiciones suficientes para la formación de complejos antígeno/anticuerpo ; 3) ag regar un conjugado a los complejos antígeno/anticuerpo resultantes, por un periodo de tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir que el conj ugado se u na al anticuerpo un ido, en donde el conjugado comprende u no de los anticuerpos anteriormente descritos, u nido a un compuesto generador de señales capaz de generar una señal detectable; y 4) detectar la presencia del anticuerpo que puede estar presente en la muestra biológica , mediante la detección de una señal generada por el compuesto generador de señales, en donde la señal indica un diagnóstico de Enfermedad de Alzheimer en el paciente. El antígeno puede ser un globulómero o una porción o fragmento del mismo, q ue tenga las mismas propiedades funcionales que el globulómero completo (e .g . , actividad de u nión) . La presente invención incluye otro método para el diagnóstico de la Enfermedad de Alzheimer en un paciente que se sospeche que la padece. Este método comprende los pasos de: 1 ) aislar una muestra biológica del paciente; 2) poner en contacto la muestra biológica con un anti-anticuerpo, en donde el anti-anticuerpo es específico contra uno de los anticuerpos anteriormente descritos, por u n periodo de tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir la formación de complejos anti-anticuerpo/anticuerpo, en donde los complejos contienen al anticuerpo presente en la muestra biológica ; 2) agregar u n conjugado a los complejos anti-anticuerpo/anticuerpo resultantes, por un periodo de tiempo y bajo cond iciones suficientes para permitir que el conjugado se u na al anticuerpo unido, en donde el conjugado comprende un antígeno, el cual se une a un compuesto generador de señales capaz de generar una señal detectable ; y 3) detectar u na señal generada por el compuesto generador de señales , en donde la señal indica un diagnóstico de Enfermedad de Alzheimer en el paciente. Además, la presente invención incluye una composición q ue comprende cualesqu iera u no o más de los anticuerpos anteriormente descritos (por ejemplo 8F5 y 8C5) . La presente invención incluye otro método para prevenir o tratar la Enfermedad de Alzheimer en un paciente que necesite de tal prevención o tratamiento. Este método comprende el paso de administrar la composición anteriormente descrita al paciente , en una cantidad suficiente para efectuar la prevención o tratamiento. Adicionalmente, la presente invención abarca una vacuna que comprende cuando menos uno de los anticuerpos anteriormente descritos y un adyuvante farmacéuticamente aceptable . Además, la presente invención incluye otro método para prevenir o tratar la Enfermedad de Alzheimer en un paciente q ue necesite de tal prevención o tratamiento. Este método comprende el paso de admin istrarle al paciente la vacuna anteriormente mencionada, en una cantidad suficiente para efectuar la prevención o tratamiento. Además, la presente invención abarca u n método para identificar compuestos adecuados para la inmu nización activa de un paciente q ue se predice que desarrollará la Enfermedad de Alzheimer. Este método comprende: 1 ) exponer uno o más compuestos de interés a uno o más de los anticuerpos anteriormente descritos, por un tiempo y bajo condiciones suficientes para q ue el uno o más compuestos se unan al anticuerpo o anticuerpos; 2) identificar aquellos compuestos que se unen al anticuerpo o anticuerpos, en donde los compuestos identificados se van a utilizar en la inmunización activa en u n paciente que se predice que desarrollará la Enfermedad de Alzheimer. Así mismo, la presente i nvención incluye u n paq uete que comprende: a) cuando menos uno de los anticuerpos aislados anteriormente descritos, y b) un conjugado que comprende un anticuerpo unido a un compuesto generador de señal, en donde el anticuerpo del conjugado es diferente del anticuerpo aislado. El paquete también puede incluir un inserto con instrucciones de cómo se van a utilizar los componentes del paquete. La presente invención también abarca un paquete que comprende: a) un anti-anticuerpo contra uno de los anticuerpos anteriormente descritos, y b) un conjugado que comprende un antígeno unido a un compuesto generador de señales. El antígeno puede ser un globulomero o un fragmento o porción del mismo, que tenga las mismas características funcionales que el globulomero (e.g., actividad de unión). Una vez más, el paquete también puede incluir un inserto con instrucciones de cómo se van a utilizar los componentes del paquete. Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 ilustra la selectividad del 8F5 por los globulómeros versus monómeros de ?ß(1-42), ?ß(1-40) y sAPP. Los factores de selectividad para el 8F5 se pueden calcular como la relación entre los valores CE50 (versus el monómero ?ß(1-42) en HIP: 555.8/90.74 = 6.1; versus el monómero ?ß(1-42) en NH4OH: 1007/90.74 = 11.1; versus el monómero ?ß(1-40): 667.8/90.74 = 7.4 versus sAPP: >100). La Figura 2 ilustra el análisis por Electroforesis en Gel de Poliacrilamida con Dodecilsulfato de Sodio (EGPA-DSS) de anticuerpos de cadena pesada y cadena ligera unido a fibrillas (carriles 4, 6, 8) y las correspondientes fracciones libres no unidas (carriles, 3, 5, 7) en el sobrenadante. La Figura 3 ilustra el contenido de ?ß42 y ?ß40 en muestras de líquido cefalorraquídeo LCR de pacientes con Alteración Cognitiva Leve (ACL) a la izquierda, o Enfermedad de Alzheimer (EA, a la derecha). En ambos grupos, puede observarse que el 8F5 recoge una mayor proporción de ?ß(1-42) y una cantidad menor o igual de ?ß(1-40) si se compara con un anticuerpo estándar 6E10 ó se compara con el análisis directo de la muestra, mediante las mismas pruebas de ELISA. La Figura 4 ilustra el índice de reconocimiento de objetos nuevos, a medida que pasa el tiempo, de un objeto desconocido versus un objeto familiar, en tres grupos de ratones transgénicos PPA (i.e., 6G1, 8F5, PBS) y un grupo de compañeros de carnada no transgénicos (tipo silvestre). Los animales (el número se presenta abajo de las columnas) se inmunizaron con anticuerpos monoclonales 6G1 u 8F5, o se trataron con un vehículo (i.e., solución reguladora de fosfatos; PBS, y tipo silvestre) mediante una inyección intraperitoneal una vez a la semana durante tres semanas. En el día de la última inyección, se realizó una tarea de reconocimiento de objetos nuevos. La diferencia entre los grupos de PBS y de tipo silvestre indicó un déficit cognitivo de los ratones transgénicos PPA en este paradigma. Los ratones inyectados con PBS se desempeñaron a un nivel casual (es decir, no significativamente diferente de 50), mientras que todos los demás ratones mostraron reconocimientos de objetos (t-prueba; estrellas). Cuando el desempeño de los ratones transgénicos PPA tratados con el anticuerpo se comparó con el de los grupos control, se encontró una significativa diferencia versus los ratones tratados con PBS, pero no versus los ratones de tipo silvestre (ANOVA con prueba t post-hoc; círculos), lo cual indica que el tratamiento con el anticuerpo revirtió el déficit cognitivo en estos ratones transgénicos PPA. La Figura 5(A) ilustra las secuencias de ADN (SEQ ID NO: 1) de la cadena pesada variable que codifica para el anticuerpo monoclonal referido en la presente como "8F5", y la Figura 5(B) ilustra la secuencia de ADN (SEQ ID NO: 2) de la cadena ligera variable que codifica para el anticuerpo monoclonal 8F5 (las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) están subrayadas en cada secuencia; véase también la Figura 6). La Figura 6(A) ilustra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 3) de la cadena pesada variable del anticuerpo monoclonal 8F5, y la Figura 6(B) ilustra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) de la cadena ligera variable del anticuerpo monoclonal 8F5. Una CDR de la cadena pesada variable está representada por la secuencia de aminoácidos SYGMS (SEQ ID NO: 5). Otra CDR de la cadena pesada variable, está representada por la secuencia de aminoácidos ASIINSNGGSTYYPDSVKG (SEQ ID NO: 6), y otra CDR de la cadena pesada variable, está representada por la secuencia de aminoácidos SGDY (SEQ ID NO: 7). Una CDR de la cadena ligera variable está representada por la secuencia de aminoácidos RSSQSLVYSNGDTYLH (SEQ ID NO: 8). Otra CDR de la cadena ligera variable está representada por la secuencia de aminoácidos KVSNRFS (SEQ ID NO: 9), y otra CDR de la cadena ligera variable, está representada por la secuencia de aminoácidos SQSTHVPWT (SEQ ID NO: 10). Todas las CDRs anteriormente descritas, están subrayadas en las Figuras 6(A) y 6(B). La Figura 7 muestra la unión de los anticuerpos, a diferentes concentraciones, a secciones transversales de las neocortezas de pacientes con Enfermedad de Alzheimer (EA) o de ratones transgénicos PPA viejos. En particular, la Figura 7(A) ilustra la verificación de depósitos amiloides mediante una tinción con Rojo Congo, en forma de placas en el tejido cerebral y en forma de angiopatía amiloide cerebral (AAC) en los vasos cerebrales, en la línea de ratones transgénicos PPA Tg2576 y en un paciente con EA (RZ55). La Figura 7(B) ilustra que la tinción de depósitos parenquimales de ?ß (placas amiloides) en un paciente con EA (RZ16), ocurrió sólo con el anticuerpo 6G1 y el anticuerpo disponible en el comercio 6E10, mientras que los anticuerpos 8F5 y 8C5 muestran una tinción considerablemente más débil. La Figura 7(C) ilustra que la fuerte tinción de depósitos parenquimales de ?ß (placas amiloides) en ratones TG2576, ocurrió solamente con el anticuerpo 6G1 y el anticuerpo disponible en el comercio 6E10, mientras que los anticuerpos 8F5 y 8C5 mostraron una tinción considerablemente más débil. Las Figuras 7(D)-(G) ilustran la cuantificación de los análisis de tinción de placas ?ß en las imágenes histológicas utilizando análisis de imágenes. Los valores de densidad óptica (0% = sin tinción) se calcularon a partir de valores en escala de gris de placas a las cuales se les sustrajeron los valores en escala de gris del tejido de fondo (Fig. (D) = unión de 0.7 pg/mL de anticuerpo en ratones Tg2576; Fig. (E) = unión de 0.07-0.7 pg/mL de anticuerpo en ratones APP/L; Fig. (F) = unión de 0.7 pg/mL de anticuerpo en un paciente con EA (RZ55); y Fig. (G) = unión de 0.07-0.7 pg/mL de anticuerpo en un paciente con EA (RZ16)). Las diferencias entre la tinción de los anticuerpos disponibles en el comercio 6E10 (estrellas) y 4G8 (círculos) y los anticuerpos 6G1, 8C5 y 8F5 (un asterisco/círculo: p < 0.05, dos asteriscos/círculos: p < 0.01 y tres asteriscos/círculos: p<0.001 versus el control; prueba t de Bonferroni post-hoc después de ANOVA con p<0.001) se evaluaron estadísticamente (Fig. (D) y Fig. (EE). En las Figs. (E) y (G), los anticuerpos 8C5 y 8F5 también mostraron significativamente menos tinción que los anticuerpos disponibles en el comercio 6E10 y 4G8 (p<0.05 en la prueba t post-hoc después p<0.001 en ANOVA). La Figura (H) ilustra que la fuerte tinción de depósitos vasculares de ?ß (flechas) ocurre sólo con el anticuerpo 6G1 y el anticuerpo disponible en el comercio 6E10, mientras que la tinción con los anticuerpos 8F5 u 8C5 fue mucho más débil. Se encontró una situación cualitativamente similar en ratones Tg2576 (no mostrado aquí). La Figura 8 ilustra la selectividad del 8C5 por globulómeros versus monómeros de ?ß(1-42), ?ß(1-40) y sAPP. Los factores de selectividad para el 8C5 se pueden calcular como la relación entre los valores de CE50 (versus el monómero ?ß(1-42) en HFIP: 2346/568.2 = 4.1; versus el monómero ?ß(1-42) en NH4OH: >100; versus el monómero ?ß(1-40): >100; versus sAPP: >100). La Figura 9(A) ilustra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 11) que codifica para la cadena pesada del 8C5 y la Figura 9(B) ilustra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 12) que codifica para la cadena ligera de 8C5. Las secuencias de nucleótidos que codifican para las correspondientes CDRs, presentes en las Figuras 10(A) y 10(B), están subrayadas. La Figura 10(B) ilustra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 19) de la cadena pesada variable del anticuerpo monoclonal 8C5, y la Figura 10(B) ilustra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 20) de la cadena ligera variable del anticuerpo monoclonal 8F5. Una CDR de la cadena pesada variable está representada por la secuencia de aminoácidos SYGMS (SEQ ID NO: 13). Otra CDR de la cadena pesada variable, está representada por la secuencia de aminoácidos SIKNNGGSTYYPDSLKG (SEQ ID NO: 14) y otra CDR de la cadena pesada variable está representada por la secuencia de aminoácidos SGDY (SEQ ID NO: 15). Una CDR de la cadena ligera variable está representada por la secuencia de aminoácidos RSSQSLVHSNGDTFLH (SEQ ID NO: 16). Otra CDR de la cadena ligera variable está representada por la secuencia de aminoácidos KVSNRFS (SEQ ID NO: 17) y otra CDR de la cadena ligera variable está representada por la secuencia de aminoácidos SQSIHVPWT (SEQ ID NO: 18). Todas las CDRs anteriormente descritas están subrayadas en las Figuras 10(A) y 10(B). Descripción Detallada de la I nvención La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal, referido en la presente como "8F5" , así como otros anticuerpos relacionados (e.g . , 8C5) . Estos anticuerpos se pueden utilizar, por ejemplo , en el diagnóstico, prevención y tratamiento de la Enfermedad de Alzheimer y otros trastornos neurodegenerativos. El anticuerpo monoclonal 8F5, así como el anticuerpo monoclonal 8C5 , tienen numerosas propiedades interesantes q ue les permiten ser extremadamente interesantes candidatos terapéuticos, así como candidatos de diagnóstico extremadamente útiles. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales 8F5 y 8C5 se u nen preferentemente a globulómeros de ?ß(1 -42) , en comparación con monómeros o fibrillas. El término "?ß(?-?)" en la presente, se refiere a la secuencia de aminoácidos desde la posición del aminoácido X hasta la posición del aminoácido Y de la proteína ß amiloide humana , incluyendo ambos extremos X y Y, en particula r, se refiere a la secuencia de aminoácidos desde el aminoácido de la posición X hasta el aminoácido de la posición Y de la secuencia de aminoácidos DAEFRH DSGY EVH HQKLVGG AEDVGSN KGA I IGLMVGGVV IA, o cualquiera de sus variantes de origen natu ral , en particu lar aquéllas con cuando menos una mutación que se selecciona del g rupo que consiste de A2T, H6R, D7N , A21 G ("Flemish") ; E22G ("Arctic") , E22Q ("Dutch") , E22K ("Italian") , D23N ("lowa") , A42T y A42V, en donde los números son en relación a la posición inicial del péptido ?ß, incluyendo tanto la posición X como la posición Y, o una secuencia con hasta tres sustituciones de aminoácidos adicionales, ninguna de las cuales pueda evitar la formación del globulómero. Una sustitución "adicional" de aminoácido, se define en la presente como cualquier desviación de la secuencia canónica, que no se encuentra en la naturaleza. Más específicamente, el término "?ß(1-42) en la presente, se refiere a la secuencia de aminoácidos desde al aminoácido de la posición 1 hasta el aminoácido de la posición 42 de la proteína ß amiloide humana, incluyendo tanto el 1 como al 42 y, en particular, se refiere a la secuencia de aminoácidos desde el aminoácido de la posición 1 hasta el aminoácido de la posición 42 de la secuencia de aminoácidos DAEFRHDSGY EVHHQKLVGG AEDVGSNKGA lIGLMVGGVV (que corresponde a los aminoácidos de las posiciones 1 a 42) o cualquier de sus variantes de origen natural. Tales variantes pueden ser, por ejemplo, aquéllas con cuando menos una mutación que se selecciona del grupo que consiste de A2T, H6R, D7N, A21G ("Flemish"); E22G ("Arctic"), E22Q ("Dutch"), E22K ("Italian"), D23N ("lowa"), A42T y A42V, en donde los números son en relación a la posición inicial del péptido ?ß, incluyendo tanto al 1 como al 42, o una secuencia con hasta tres sustituciones de aminoácidos adicionales, ninguna de las cuales pueda evitar la formación del globulómero. De manera similar, el término ?ß(1-40) en la presente se refiere a la secuencia de aminoácidos desde el aminoácido de la posición 1 hasta el aminoácido de la posición 40 de la proteína ß amiloide h umana , incluyendo tanto al 1 como al 40, y se refiere en particular a la secuencia de aminoácidos desde el aminoácido de la posición 1 hasta el aminoácido de la posición 40 de la secuencia de aminoácidos DAEFRH DSGY EVH HQ KLVFF AEDVGSN KGA I IGLMVGG VV, o cualquiera de sus variantes de origen natu ral . Tales variantes incluyen , por ejemplo , aq uéllas con cuando menos una mutación que se selecciona del g rupo q ue consiste de A2T, H6R, D7N , A21 G ("Flemish") ; E22G ("Arctic") , E22Q ("Dutch") , E22 K ("Italian") y D23N ("l owa") , en donde los números son en relación a la posición inicial del péptido ?ß, incluyendo tanto la posición 1 como la 40, o una secuencia con hasta tres sustituciones de aminoácidos adicionales, ning una de las cuales pueda evitar la formación del globu lómero. El término "globulómero ?ß(?-?)" (también conocido como "oligómero globular ?ß(?-?") , en la presente se refiere a una asociación globular, no covalente, soluble, de péptidos ?ß(?-?) , tal como se definieron anteriormente, que posee homogeneidad y características físicas distintas . Los globulómeros ?ß(?-?) son ensamblajes estables, no fibrilares , oligoméricos, de péptidos ?ß(?-Y) que se obtienen mediante la incubación con detergentes aniónicos. En contraste con los monómeros y las fibrillas , estos globulómeros están caracterizados por n úmeros de ensamblaje definidos de subunidades (por ejemplo, formas de ensamblaje temprano, n = 3-6, oligómeros "A" y formas de ensamblaje tard ío, n = 12-14, "oligómeros B", tal como se describen en la Solicitud Internacional de Patente PCT Publicación No. WO 04/067561). Los globulomeros tienen una estructura globular de tipo tridimensional (glóbulo fundido", véase Barghorn et al., 2005, J Neurochem, 95, 834-847). Éstos pueden estar caracterizados además por una o más de las siguientes características: la posibilidad de romper los aminoácidos N-terminales con proteasas promiscuas (tales como la termolisina o la endoproteinasa GluC), obteniendo formas truncadas de globulomeros ?ß (X-Y); la no accesibilidad de aminoácidos C-terminales 24-Y para proteasas promiscuas y anticuerpos; y Las formas truncadas de estos globulomeros ?ß (X-Y) mantienen la estructura tridimensional de los globulomeros, con una mejor accesibilidad del epítopo nuclear ?ß(20-?9 en su conformación de globulómero. De conformidad con la invención y en particular para el propósito de evaluar las afinidades de unión de los anticuerpos de la presente invención, el término "globulómero ?ß (X-Y)" en la presente se refiere a un producto que se obtiene mediante un proceso como el descrito en la Publicación Internacional de Patente WO 04/067561, la cual se incorpora en la presente en su totalidad como referencia. El proceso comprende desdoblar un péptido ?ß (X-Y) natural, recombinante o sintético, o un derivado del mismo; exponer el péptido cuando menos parcialmente desdoblado ?ß (X-Y) o un derivado del mismo, a un detergente, reduciendo la acción del detergente y continuando la incubación. Para el propósito de desdoblar el péptido, se pueden dejar actuar agentes que rompen enlaces de hidrógeno, tales como por ejemplo hexafluoroisopropanol (HFIP) sobre la proteína. Son suficientes tiempos de acción de unos cuantos minutos, por ejemplo de aproximadamente 10 a 60 minutos, cuando la temperatura de acción es de aproximadamente 20 a 50°C y, en particular, de aproximadamente 35 a 40°C. Después de la disolución del residuo evaporado a sequedad, de preferencia en forma concentrada, en disolventes orgánicos adecuados miscibles con soluciones reguladoras acuosas, tales como por ejemplo dimetilsulfóxido (DMSO), se obtiene una suspensión del péptido cuando menos parcialmente desdoblado o un derivado del mismo, que se puede utilizar posteriormente. Si se requiere, la suspensión concentrada se puede almacenar a baja temperatura, por ejemplo a aproximadamente -20°C, mientras tanto. Alternativamente, el péptido o derivado del mismo se puede recoger en una solución ligeramente ácida, preferiblemente acuosa, por ejemplo una solución de HCI acuoso aproximadamente 10 mM. Después de un tiempo de incubación de aproximadamente unos minutos, los componentes insolubles se remueven por centrifugación. Son suficientes unos cuantos minutos a 10,000g. Estos pasos de método de preferencia se llevan a cabo a temperatura ambiente; es decir, a una temperatura en el rango de 20 a 30°C. El sobrenadante obtenido después de la centrifugación , contiene el péptido ?ß (X-Y) o un derivado del m ismo, y se puede almacenar a temperatu ra baja, por ejemplo aproximadamente a -20°C por un periodo de tiempo. La posterior exposición a u n detergente se refiere a la oligomerización del péptido o derivado del mismo , para obtener el tipo intermediario de oligómeros (en la Publicación I nternacional de Patente WO 04/067561 , referidos como oligómeros A) . Para este propósito, se deja actuar u n detergente sobre el péptido opcionalmente al menos parcialmente desdoblado, o un derivado del mismo, hasta que se haya producido una cantidad suficiente de oligómero intermediario. Se prefieren utilizar detergente iónicos, en particular detergentes aniónicos. De conformidad con una modalidad particular, se utiliza u n detergente de la Fórmula (I ): R-X, en el cual el radical "R" es un radical alquilo ramificado o no ramificado q ue tiene de 6 a 20 y de preferencia de 1 0 a 14 átomos de carbono, o un radical alquenilo ramificado o no ramificado q ue tiene de 6 a 20 y de preferencia de 1 0 a 14 átomos de carbono, y el radical "X" es un grupo ácido o una sal del mismo , siendo X seleccionado preferiblemente de entre -COO"M+, -S03"M+ y, lo más preferible , -OS03"M + , y M+ es un catión de hidrógeno o un catión orgánico o inorgán ico, que de preferencia se selecciona del grupo que consiste de cationes de metales alcalinos, cationes de metales alcalinotérreos y cationes de amonio. Los más ventajosos son los detergentes de la Fórmu la (I) , en los cuales R es un radical alq uilo no ramificado, del cual se deberán mencionaren particular los rad icales alk-1 -ilo. Se tiene preferencia particular por el dodecilsulfato de sodio (DSS) . El ácido láurico y el ácido oleico también se pueden utilizar ventajosamente. La sal sódica del detergente lau roilsarcosina (también conocido como sarkosyl N L-30 ó Gardol®) , también es particularmente ventajoso. El tiempo de acción del detergente, en particular, depende de si el péptido o derivado del mismo sujeto a la oligomerización está desdoblado, y hasta qué g rado. Si de conformidad con el paso de desdoblamiento, el péptido o derivado del mismo ha sido tratado previamente con un agente de rompimiento de enlaces de hidrógeno (por ejemplo, en particular con hexafluoroisopropanol) , son suficientes tiempos de acción en el rango de unas cuantas horas, ventajosamente de aproximadamente 1 a 20 horas y en particular de aproximadamente 2 a 1 0 horas, cuando la temperatu ra de acción es de aproximadamente 20 a 50°C y, en particular, de aproximadamente 35 a 40°C . Si el punto de partida es un péptido menos desdoblado o esencialmente no desdoblado, o esencialmente no desdoblado, o u n derivado del mismo, se esperan tiempos de acción correspondientemente más largos. Si el péptido o derivado del mismo ha sido tratado previamente, por ejemplo, de conformidad con el procedimiento indicado anteriormente como alternativa al tratamiento con H FI P, o dicho péptido o derivado del mismo es sometido directamente a la oligomerización , son suficientes tiempos de acción en el rango de aproximadamente 5 a 30 horas y, en particular, de aproximadamente 1 0 a 20 horas , cuando la temperatu ra de acción es de aproximadamente 20 a 50°C y, en particula r, de aproximadamente 35 a 40°C . Después de la incu bación , los componentes insolubles ventajosamente son removidos por centrifugación . Son suficientes unos cuantos mi nutos a 1 0,000g . La concentración del detergente a ser elegida, depende del detergente que se utiliza. Si se emplea DSS, se espera una concentración en el rango de 0.01 a 1 % en peso, de preferencia de 0.05 a 0.5% en peso, por ejemplo de aproximadamente 0.2% en peso. Si se utiliza ácido láurico o ácido oleico, se esperan concentraciones u n poco más altas, por ejemplo, en el rango de 0.05 a 2% en peso, de preferencia de 0.1 a 0.5% en peso, por ejemplo de aproximadamente 0.5% en peso. La acción del detergente se debe llevar a cabo a u na concentración salina aproximadamente en el rango fisiológico. Así pues, en particular, las concentraciones de NaCI en el rango de 50 a 500 mM , de preferencia de 1 00 a 200 mM y más particu larmente a 140 mM , son convenientes . La subsiguiente reducción de la acción del detergente y la contin uación de la incubación , se refiere a una adicional oligomerización para obtener el globulómero ?ß (X-Y) de la invención (en la Publicación I nternacional de Patente WO 04/067561 , referido como oligómero B). Puesto que la composición obtenida a partir del paso precedente regularmente contiene detergente y una concentración de sal en el rango fisiológico, entonces se espera reducir la acción del detergente y, de preferencia , también la concentración de sal . Esto se puede lleva r a cabo reduciendo la concentración de detergente y sal , por ejemplo, d iluyendo convenientemente con ag ua o una solución reguladora con una menor concentración de sal, por ejemplo Tris-HCI , pH 7.3. Los factores de dilución en el rango de aproximadamente 2 a 1 0 , ventajosamente en el rango de 3 a 8 y, en particular, de aproximadamente 4, han comprobado ser adecuados. La red ucción de la acción del detergente, también se podría lograr ag rega ndo sustancias que puedan neutralizar la acción detergente. Ejemplos de éstos incluyen sustancias capaces de complejarse con los detergentes, como sustancias capaces de estabilizar células en el curso de la purificación y la extracción , por ejemplo, copol ímeros de bloques de EO/PO , en particular, el copolímero de bloques q ue tiene el nombre comercial Plu ronics® F 68. Igualmente se pueden utilizar alquilfenoles alcoxilados y, en particu lar, etoxilados, tales como t-octilfenoles etoxilados de la serie Tritón® X, en particu lar Tritón® X 1 00, 3-(3-cloramidopropildimetilamon io)-1 -propanosulfato (C HAPS®) o ésteres grasos de sorbitán alcoxilados y, en particular, etoxilados, como aq uéllos de la serie Tween®, en particular Tween® 20, en rangos de concentración alrededor o por arriba de la concentración micelar crítica particular. Posteriormente , la solución se incuba hasta que se ha producido suficiente globulómero ?ß (X-Y). Los tiempos de acción en el rango de varias horas, de preferencia en el rango de 1 0 a 30 horas y, en particular en el rango de aproximadamente 1 5 a 25 horas, son suficientes cuando la temperatura de acción es de aproximadamente 20 a 50°C y, en particular, de aproximadamente 35 a 40°C . Entonces, la solución se puede concentrar, y los posibles residuos se pueden remover por centrifugación . U na vez más, son suficientes unos cuantos minutos a 1 0,000g . ?G sobrenadante obtenido después de la centrifugación , contiene un g lobulómero de ?ß (X-Y) como el descrito en la presente. U n globulómero ?ß (X-Y) se puede recuperar finalmente, por ejemplo, por ultrafiltración , por diálisis, precipitación o centrifugación . Además se prefiere la separación electroforética de los globulómeros ?ß (X-Y) bajo condiciones desnatu ralizantes, por ejemplo por EG PA-DSS, si se produce una doble banda (por ejemplo, con un peso molecular aparente de 38/48 kDa para ?ß( 1 -42)) y se prefiere especialmente si después del tratamiento de los oligómeros con glutardialdeh ído, antes de la separación , estas dos bandas se mezclan en u na sola. También es preferido sí la cromatog rafía de exclusión de tamaño de los globulómeros da como resultado un solo pico (por ejemplo, correspondiente a u n peso molecular de aproximadamente 60 kDa para ?ß(1 -42)) . Partiendo del péptido ?ß(1 -42) , el proceso, en particular, es adecuado para obtener globulómeros de ?ß( 1 -42) . De preferencia, el globulómero muestra afinidad por células neu ronales y también exh ibe efectos neuromoduladores.

Un "efecto neuromodulador" se define como un efecto inhibitorio duradero de una neurona, que causa una disfunción de la neurona con respecto a la plasticidad neuronal. De conformidad con otro aspecto de la invención, el término "globulomero ?ß (X-Y)" en la presente se refiere a un globulomero que consiste esencialmente de subunidades ?ß (X-Y), en donde es preferido si en promedio cuando menos 11 de 12 subunidades son del tipo ?ß (X-Y), se prefiere más si menos del 10% de los globulómeros comprenden cualquier péptido ??-?ß (X-Y) y lo más preferible es si el contenido de péptido ??-?ß (X-Y) en la preparación, está por abajo del nivel de detección. Más específicamente, el término "globulomero ?ß (1-42)" en la presente se refiere a un globulomero que comprende unidades ?ß(1-42) como las anteriormente definidas; el término "globulomero ?ß(12-42) en la presente se refiere a un globulomero que comprende unidades ?ß(12-42) como las anteriormente definidas; y el término "globulomero ?ß(20-42)" en la presente se refiere a un globulomero comprendido por unidades ?ß(20-42) como las anteriormente definidas. El término globulomero ?ß(?-?) reticulado" en la presente se refiere a una molécula que se obtiene a partir de un globulomero ?ß(?-?) tal como se describió anteriormente, mediante una reticulación, de preferencia reticulación química, más preferiblemente reticulación con aldehido y, lo más preferible, reticulación con glutardialdehído de las unidades constituyentes del globulomero. En otro aspecto de la invención, un globulomero reticulado es esencialmente un globulómero en el cual las unidades se unen cuando menos parcialmente por enlaces covalentes, en vez de estar unidas únicamente por interacciones no covalentes. El término "derivado de globulómero ?ß(?-?)" en la presente se refiere, en particular, a un globulómero que está marcado mediante un enlace covalente con un grupo que facilita su detección, de preferencia, un fluoróforo, por ejemplo isotiocianato de fluoresceína, ficoeritrina, proteína fluorescente victoria Aequorea, proteína fluorescente Dictyosoma o cualquier combinación o derivados fluorescentes activos de los mismos; un cromóforo; un quimioluminóforo, por ejemplo luciferasa, de preferencia luciferasa de Photinus pyralis, luciferasa de Vibrio fischeri o cualquier combinación o derivado con actividad quimioluminiscente de los mismos; un grupo enzimáticamente activo, por ejemplo peroxidasa, tal como peroxidasa de rábano, o un derivado enzimáticamente activo de los mismos; un grupo electrodenso, por ejemplo un grupo que contiene un metal pesado, tal como un grupo que contiene oro; un hapteno, por ejemplo un hapteno derivado de fenol; una estructura fuertemente antigénica, por ejemplo una secuencia peptídica que se predice que es antigénica, tal como mediante el algoritmo de Kolaskar y Tongaonkar; un aptámero para otra molécula; un grupo quelante, por ejemplo hexahistidinilo; una estructura proteica natural o derivada de la naturaleza mediadora de interacciones proteína-proteína específicas, por ejemplo un miembro del par fos/jun; un grupo magnético por un ejemplo un grupo ferromagnético; o un grupo radioactivo, tal como un grupo que comprende 1H, C, 32P, 35S ó 25l, o cualquier combinación de los mismos; o a un globulomero marcado mediante la unión covalente o no covalente, de preferencia por interacción de alta afinidad, covalentemente enlazado a un grupo que facilita la inactivación, secuestramiento, degradación y/o precipitación, de preferencia marcado con un grupo que promueve la degradación in vivo, más preferiblemente con ubiquitina, en donde es particularmente preferido *si el oligómero marcado se ensambla in vivo; o a un globulomero modificado por cualquier combinación de los anteriores. Tales grupos marcadores y los métodos para unirlos a las proteínas, son conocidos en la técnica. La marcación puede realizarse antes, durante o después de la globulomerización. En otro aspecto de la invención, un derivado de globulomero es una molécula que se obtiene a partir de un globulomero, mediante un marcado y/o una reacción. De manera correspondiente, el término "derivado de monómero ?ß(?-?)" en la presente se refiere, en particular, a un monómero ?ß que está marcado de la manera ya descrita para el globulomero. El término "mayor afinidad" en la presente se refiere a un grado de interacción en donde el equilibrio entre el anticuerpo no unido y el globulomero no unido, por un lado, y el complejo anticuerpo-globulómero, por el otro, está más a favor del complejo anticuerpo-globulómero. De manera similar, el término "menor afinidad" en la presente se refiere a un grado de interacción en donde el equilibrio entre el anticuerpo no unido y el globulomero no unido, por u n lado, y el complejo anticuerpo-globulómero por el otro, está más a favor del anticuerpo no unido y el globulómero no u nido. El término "monómero de ?ß(?-?)" en la presente se refiere a la forma aislada del péptido ?ß(?-?) , de preferencia, una forma del péptido ?ß(?-?) que no está involucrada en esencialmente interacciones no covalentes con otros péptidos ?ß. Prácticamente, el monómero ?ß(?-?) normalmente se proporciona en forma de una solución acuosa . De preferencia , la solución acuosa del monómero contiene de 0.05 a 0.2% , más preferiblemente aproximadamente 0.1 % de NaO H cuando se utiliza, por ejemplo, para determinar la afinidad de unión del anticuerpo de la presente invención . En otra situación preferida , la solución acuosa de monómero contiene de 0.05 a 0.2% , más preferiblemente aproximadamente 0.1 % de NaOH . Cuando se utiliza, puede ser conveniente diluir la solución de una manera apropiada. Además, normalmente es mejor utilizar la solución en un periodo de 2 horas, en particular, dentro de un periodo de 1 hora , y especialmente, dentro de un periodo de 30 minutos después de su preparación . El término "fibrilla" en la presente se refiere a una estructu ra molecular que comprende ensamblajes no covalentemente asociados, péptidos ?ß(?-?) individ uales q ue muestran estructura fibrilar por microscopía electrónica, los cuales se u nen al rojo Congo, exh ibiendo una birrefringencia bajo luz polarizada y cuyo patrón de difracción de rayos X es una estructura ß-cruzada . La fibri lla también se puede definir como una estructu ra molecular que se obtiene mediante un proceso que comprende la agregación polimérica autoinducida de un péptido ?ß adecuado, en ausencia de detergentes, por ejemplo, en HCI 0.1M, causando la formación de agregados de más de 24, de preferencia más de 100 unidades. Este proceso es conocido en la técnica. De manera adecuada, las fibrillas ?ß(?-?) se utilizan en forma de solución acuosa. En una modalidad particularmente preferida de la invención, la solución acuosa de fibrillas se prepara disolviendo la solución ?ß en NH4OH al 0.1%, diluyéndolo en una razón 1:4 con NaH2P0420 mM, NaCI 140 mM, pH 7.4, seguido por un reajuste del pH a 7.4, incubando la solución a 37°C durante 20 horas, seguido por una centrifugación a 10000g durante 10 minutos y la resuspensión en NaH2P04 20 mM, NaCI 140 mM, pH 7.4. El término "fibrillas de ?ß(?-?)", en la presente se refiere a una fibrilla que comprende subunidades ?ß(?-?), en donde es preferible si en promedio cuando menos el 90% de las subunidades son de tipo ?ß(?-?), más preferiblemente si cuando menos el 98% de las subunidades son del tipo ?ß(?-?) y, lo más preferido, es si el contenido de péptidos que no son ?ß(?-?), está por abajo del límite de detección. Regresando al 8F5, tal como es evidenciado en la Figura 1, al igual que el 8C5 (Figura 8), los anticuerpos específicos contra el globulomero ?ß(1-42), los anticuerpos monoclonales 8F5 y 8C5, reconocen predominantemente las formas de globulomero ?ß(1-42) y no preparaciones estándar de monómeros ?ß (1-40) ó ?ß (1-42), incluyendo agregados de ?ß(1-42), en contraste con los anticuerpos no específicos 6G1 y 6E10. En particular, el anticuerpo 8F5 detecta globulómeros ?ß(1-42) solamente por (Western blot-EGPA) y no por análisis de Western-Blot-EGPA-DSS, lo cual indica la unión a un epítopo de intersubunidad disociable con detergente más complejo en el núcleo de la estructura globulomérica ?ß(1-42). Un epítopo de intersubunidad se define como un complejo no lineal a través del espacio epitópico, localizado en cuando menos dos subunidades. Más específicamente, el análisis por transferencia de punto (dot-blot) contra varias preparaciones estándar de ?ß(1-42) y ?ß(1-40), demostró diferencias significativas en el reconocimiento del globulomero ?ß(1-42) versus formas de ?ß no globuloméricas (preparación de monómero estándar ?ß(1 -40)/(1 -42), ?ß(1-42) agregado para 8F5 y 8C5 específico, pero no para la isoforma de anticuerpos no específicos 6G1 y 6E10. La especificidad de los anticuerpos 8F5 y 8C5 por el globulomero, pero no la de los anticuerpos 6G1 y 6E10, fue confirmada cuantificando el globulomero ?ß(1-42), monómero ?ß(1-42), monómero ?ß(1-4) y la proteína precursora amiloide soluble alfa, mediante la unión en pruebas de ELISA en emparedado. Además, como estos anticuerpos acceden al globulomero después de una inmunoelectrotransferencia tipo Western nativa, pero no después de una inmunoelectrotransferencia tipo Western con DSS, es probable que cada anticuerpo reconozca un epítopo estructural no lineal entre subunidades en la región de los aminoácidos del 20 a 30 del ?ß(1-42). Tal especificidad por los globulómeros es importante, debido a que hacer blanco específicamente en la forma globulomérica de ?ß, con un anticuerpo preferente para globulómeros, tal como por ejemplo el 8F5 ó el 8C5: 1) evitará hacer blanco en depósitos amiloides insolubles, cuya unión puede explicar los efectos secundarios inflamatorios observados durante inmunizaciones con ?ß insoluble; 2) separará el monómero ?ß y el PPA que se reporta que tienen funciones fisiológica precognitivas (Plan et al., J. of Neuroscience 23:5531-5535 (2003); y 3) incrementará la biodisponibilidad del anticuerpo, ya que éste no será ocultado ni será inaccesible por la extensa unión a depósitos insolubles. El objeto de la invención también incluye secuencias de nucleótidos aislados (o fragmentos de los mismos), que codifican para las cadenas ligeras y pesadas variables de los anticuerpos monoclonales 8F5 y 8C5, así como aquéllas secuencias de nucleótidos (o fragmentos de los mismos) que tienen secuencias que comprenden, que corresponden a, que son idénticas a, que son hidrolizables a, o que son complementarias a, cuando menos aproximadamente el 70% (e.g., 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 ó 79%), de preferencia cuando menos aproximadamente 80% (e.g., 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88 u 89%), y más preferiblemente cuando menos aproximadamente 90% (e.g., 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ó 99%) de identidad con estas secuencias nucleotídicas codificadoras (todos los números enteros (y porciones de los mismos) entre e incluyendo 70% y 100%, están considerados dentro de los alcances de la presente invención, con respecto al porcentaje de identidad). Tales secuencias pueden derivarse de cualquier fuente (por ejemplo, pueden ser aislada de una fuente natural, producidas por una vía semisintética, o pueden ser sintetizadas de novo). En particular, tales secuencias pueden ser aisladas o derivadas de fuentes diferentes a las descritas en los Ejemplos (por ejemplo, bacterias, hongos, algas, ratones o seres humanos). Además, de las secuencias nucleotídicas anteriormente descritas, la presente invención también incluye secuencias de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada variables del anticuerpo monoclonal 8F5 y del anticuerpo monoclonal 8C5 (o fragmentos de estas secuencias de aminoácidos). Además, la presente invención también incluye secuencias de aminoácidos (o fragmentos de las mismas), que comprenden, corresponden a, que son idénticas a, o que son complementarias a, cuando menos aproximadamente 70%, de preferencia cuando menos aproximadamente 80%, y más preferiblemente cuando menos aproximadamente 90% de identidad con las secuencias de aminoácidos de las proteínas de la presente invención (una vez más, todos los números enteros (y porciones de los mismos) entre e incluyendo el 70% y el 100% (como se mencionó en relación con las identidades de secuencias nucleotídicas anteriores) también están considerados dentro de los alcances de la presente invención, con respecto al porcentaje de identidad). Para los propósitos de la presente invención, un "fragmento" de una secuencia nucleotídica, se define como una secuencia contigua de aproximadamente cuando menos 6, de preferencia cuando menos aproximadamente 8, más preferiblemente cuando menos aproximadamente 10 nucleótidos, e incluso más preferiblemente cuando menos aproximadamente 15 nucleótidos, que corresponden a una región de la secuencia nucleotídica especificada. El término "identidad" se refiere a la relación de dos secuencias, en una base nucleótido por nucleótido, sobre una ventana o segmento de comparación particular. Así pues, la identidad se define como el grado de similitud, correspondencia o equivalencia, entre las mismas cadenas (ya sea de sentido o antisentido) de dos segmentos de ADN (o dos secuencias de aminoácidos). El "porcentaje de identidad de secuencia" se calcula comparando dos secuencias óptimamente alineadas, sobre una región particular, determinando el número de posiciones en las cuales existen bases idénticas o aminoácidos idénticos en ambas secuencias, con el fin de obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de tales posiciones entre el número total de posiciones del segmento que está siendo comparado y multiplicando el resultado por 100. La alineación óptima de las secuencias se puede llevar a cabo mediante el algoritmo de Smith y Waterman, Appl. Match. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de Needleman y Wunsh, J. Mol. Biol.48:443 (1970), mediante el método de Pearson y Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sc¡. USA 85:2444 (1989) y mediante programas de computadora que implementan los algoritmos relevantes (por ejemplo, Clustal Macaw Pileup (http://cmqm.standford.edu/biochem218/11 Multiple.pdf; Higgins et al., CABIOS. 5L151-153 (1989)), FASTDB (Intelligenetics), BLAST (National Center for Biomedical Information; Altschul et al., Nucleic Acids Research 25:3389-3402 (1997)); PILEUP (Genetics Computer Group, Madison, Wl) ó GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA (Wisconsin Genetics Software Package Reléase 7.0, Genetics Computer Group, Madison, Wl) (véase la Patente Norteamericana No. U.S.5,912,120). Para los propósitos de la presente invención, el término "complementariedad" se define como el grado de relación entre dos segmentos de ADN. Se determina midiendo la capacidad de la cadena de sentido de un segmento de ADN, para hibridizarse con la cadena antisentido de otro segmento de ADN, bajo condiciones apropiadas, para formar una doble hélice. El término "complemento" se define como una secuencia que se aparea con una secuencia dada, basándose en las reglas canónicas de apareamiento de bases. Por ejemplo, una secuencia A-G-T en una cadena nucleotidica, ese "complementaria" a una secuencia T-C-A en la otra cadena. En la doble hélice, cuando aparece adenina en una cadena, aparece timina en la otra cadena. De manera similar, siempre que se encuentre guanina, se encontrará citocina en la otra. Mientras mayor sea la relación entre las secuencias nucleotídicas de dos segmentos de ADN, mayor será la capacidad de formar duplas híbridas entre las cadenas de dos segmentos de ADN. La "similitud" entre dos secuencias de aminoácidos, se define como la presencia de una serie de residuos de aminoácido idénticos, así como conservados, en ambas secuencias. Mientras mayor sea el grado de similitud entre dos secuencias de aminoácidos, mayor será la correspondencia o equivalencia de las dos secuencias ("la identidad entre dos secuencias de aminoácidos, se define como la presencia de una serie de residuos de aminoácido exactamente similares o invariables, en ambas secuencias). Las definiciones de "complementariedad", "identidad" y "similitud", son conocidas por los técnicos en la materia. El término "codificado por" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica para una secuencia de polipéptido, en donde la secuencia de polipéptido o una porción de la misma, contiene una secuencia de aminoácidos de cuando menos 3 aminoácidos, de preferencia cuando menos 8 aminoácidos e incluso más preferiblemente cuando menos 15 aminoácidos, de un polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico. Adicionalmente, una molécula de ácido nucleico es "hibridizable" a otra molécula de ácido nucleico, cuando una forma de una sola cadena de la molécula de ácido nucleico se puede aparear con otra molécula de ácido nucleico, bajo las condiciones apropiadas de temperatura y fuerza iónica (véase Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York). Las condiciones de temperatura y fuerza iónica determinan el "rigor" de la hibridación. El término "hibridación" tal como se utiliza en la presente, generalmente significa la hibridación de ácidos nucleicos, en condiciones apropiadas de rigor, tal como será evidente para los técnicos en la materia, dependiendo de la naturaleza de la secuencia de sonda de las secuencias blanco. Las condiciones de hibridación y lavado son conocidas en la técnica, y el ajuste de las condiciones dependiendo del rigor deseado, mediante la variación del tiempo de incubación , temperatura y/o fuerza iónica de la solución , se pueden llevar a cabo fácilmente. Véase, por ejemplo, Sambrook, J . ef al. , Molecular Cloning : A Laboratory Man ual , 2a . Edición , Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N .Y. , 1 989, tal como se a notó anteriormente y se incorpora en la presente como referencia (véase también , Short Protocols in Molecular Biology, ed . Ausubel ef al. y Tijssen , Tech niques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, "Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" ( 1 993) , ambas incorporadas en la presente como referencia) . Específicamente, la selección de las condiciones está gobernada por la longitud de las secuencias q ue están siendo hibridizadas, en particula r, la longitud de la secuencia de sonda , el contenido relativo de G-C de los ácidos nucleicos y la cantidad de no apareamientos que se permite. Se prefieren condiciones poco rigurosas cuando se desea la hibridación parcial entre cadenas que tienen un menor grado de complementariedad . Cuando se desea una complementariedad perfecta o casi perfecta, se prefieren cond iciones altamente rigurosas. Para las condiciones altamente rig urosas típicas, la solución de hibridación contiene 6 X S.S.C., AEDT 0.01M, solución de Denhardt 1x y DSS al 0.5%. La hibridación se lleva a cabo a aproximadamente 68 grados Celsius durante aproximadamente 3 a 4 horas, para fragmentos de ADN clonado, y durante aproximadamente 12 a 16 horas, para ADN eucariótico total. Para condiciones moderadamente rigurosas, se podría utilizar un filtro prehibridación e hibridizar con una solución de cloruro de sodio 3X, citrato de sodio (SSC), formamida al 50% (0.1 M de esta solución, a pH 7.5) y solución de Denhardt 5X. Después, se podría hibridizar a 37 grados Celsius durante 4 horas, seguido por una hibridación a 37 grados Celsius con una cantidad de sonda marcada igual a 3,000,000 cpm total, durante 16 horas, seguido por un lavado con SSC 2X y solución DSS al 0.1%, un lavado de 4 veces por 1 minuto cada uno, a temperatura ambiente y 4 veces a 60 grados Celsius durante 30 minutos cada uno. Después de secar, se expone a una película. Para condiciones de menor rigor, la temperatura de hibridación se reduce a aproximadamente 2 grados Celsius por abajo de la temperatura de fusión (Tm) de la dupla. La Tm se sabe que es una función del contenido de G-C y la longitud de la dupla, así como de la fuerza iónica de la solución. La "hibridación" requiere que dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias. Sin embargo, dependiendo del rigor de la hibridación, pueden ocurrir no apareamientos entre las bases. Como se anotó anteriormente, e rigor asociado para hibridizar ácidos nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y del grado de complementación. Tales variables son conocidas en la técnica. Más específicamente, mientras más grande sea el grado de similitud y homología entre dos secuencias nucleotídicas, mayor será el valor de Tm para los híbridos de ácidos nucleicos que tengan esas secuencias. Para híbridos mayores de 100 nucleótidos de longitud, se han derivado ecuaciones para calcular el Tm (véase Sambrook, et al., supra). Para la hibridación con ácidos nucleicos más cortos, la posición de los no apareamientos se vuelve más importante, y la longitud del oligonucleótido determina su especificidad (véase Sambrook et al., supra). Tal como se utiliza en la presente, la expresión "fragmento o secuencia de ácido nucleico aislado" se refiere a un polímero de ARN o ADN que tiene una sola cadena o es de doble cadena, opcionalmente conteniendo bases nucleotídicas sintéticas, no naturales o alteradas. Un fragmento de ácido nucleico aislado en forma de un polímero de ADN, puede estar comprendido de uno o más segmentos de ADNc, ADN genómico o ADN sintético (un "fragmento" de una polinucleótido específico, se refiere a una secuencia polinucleotídica que comprende una secuencia contigua de cuando menos aproximadamente 6 nucleótidos, de preferencia cuando menos aproximadamente 8 nucleótidos, más preferiblemente cuando menos aproximadamente 10 nucleótidos e incluso más preferiblemente cuando menos aproximadamente 15 nucleótidos, y lo más preferible, cuando menos aproximadamente 15 nucleótidos idénticos o complementarios a una región de la secuencia nucleotídica especificada) . Los n ucleótidos (normalmente encontrados en su forma 5'-monofosfato) se denominan por su designación de una sola letra , de la siguiente manera : "A" para adenilato o desoxiadenilato (para ARN o ADN , respectivamente) , "C" para citidilato o desoxicitidilato, "G" para guanilato o desoxiguanilato, "U" para uridilato, "T" para desoxitimidilato, "R" para purinas (A ó G) , "Y" para pirimidinas (C ó T) , "K" para G ó T, "H" para A ó C ó T, "I" para inosina y "N" para cualquier nucleótido . Los términos "fragmento o subfrag mento que es funcionalmente equivalente" y "fragmento o subfragmento fu ncionalmente eq uivalente" se utilizan ind istintamente en la presente. Estos términos se refieren a una porción o secuencia de un fragmento de ácido nucleico aislado en el cual la capacidad de alterar la expresión gén ica o prod ucir ciertos fenotipos, q ueda retenida ya sea que el fragmento o subfragmento codifiq ue o no para una enzima . Por ejemplo, el fragmento o subfragmento se puede utilizar en el diseño de construcciones quiméricas, para prod ucir el fenotipo deseado en una planta transformada . Es posible diseñar construcciones quiméricas para utilizarse en cosupresión o antisentido, ligando un fragmento o subfragmento de ácido nucleico de las mismas, ya sea que codifique o no para u na enzima activa , en la orientación apropiada relativa a una secuencia promotora de u na planta . Los términos "homolog ía", "homólogo", "sustancialmente similar" y "sustancialmente correspond iente" , se utilizan indistintamente en la presente. Éstos se refieren a fragmentos de ácido nucleico en los que los cambios en una o más bases nucleotídicas no afectan la capacidad del fragmento de ácido nucleico para mediar la expresión génica o producir cierto fenotipo. Estos términos también se refieren a mod ificaciones de los fragmentos de ácido nucleico de la presente invención , tales como la deleción o inserción de uno o más nucleótidos, que no alteran sustancialmente las propiedades funcionales del fragmento de ácido nucleico resultante, en relación con el fragmento inicial sin modificación . Por lo tanto, los técnicos en la materia deberán entender que la invención abarca más que las secuencias específicas de ejemplo. El término "gen" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa u na proteína específica, incl uyendo las secuencias reg uladoras precedentes (secuencias 5' no cod ificadoras) y subsiguientes (secuencias 3' no codificadoras) a la secuencia codificadora. El término "gen nativo" se refiere a un gen tal como se encuentra en la naturaleza, con sus propias secuencias reguladoras. En contraste, el término "construcción quimérica" se refiere a una combinación de fragmentos de ácido n ucleico q ue normalmente no se encuentran juntos en la naturaleza . De conformidad con lo anterior, una construcción quimérica puede comprender secuencias reg uladoras y secuencias codificadoras que se derivan de diferentes fuentes, o secuencias reg uladoras y secuencias codificadoras derivadas de la misma fuente, pero arregladas de u na manera diferente a la normalmente encontrada en la natu raleza (el término "aislada" significa que la secuencia es removida de su ambiente natu ral) . El término gen "extraño" , se refiere a un gen que normalmente no se encuentra en el organismo h uésped , pero q ue es introducido a d icho organismo huésped mediante una transferencia génica . Los genes extraños pueden comprender genes nativos insertados en un organismo no nativo, o construcciones qu iméricas. El término "transgen" se refiere a un gen que ha sido introducido en el genoma mediante un proced imiento de transformación . El término "secuencia codificadora" se refiere a u na secuencia de ADN que codifica para una secuencia específica de aminoácidos. El término "secuencias reguladoras" se refiere a secuencias de n ucleótidos localizadas en dirección 5' (secuencias 5' no codificadoras) dentro de, o en d irección 3' (secuencias 3' no codificadoras) de una secuencia no codificadora, y las cuales influencian la transcripción , el procesamiento o estabilidad del ARN , o la trad ucción de la secuencia codificada asociada. Las secuencias reg uladoras pueden incluir, pero no se limitan a secuencias promotoras, secuencias líder de trad ucción , intrones y secuencias de reconocimiento de poliadenilación . Los términos "promotor" o "secuencia génica reguladora" se refieren a u na secuencia de ADN capaz de controlar la expresión de una secuencia codificadora o ARN funcional . La secuencia consiste de elementos en dirección 5' proximales y más d istales, en donde estos ú ltimos elementos a menudo son referidos como intensificadores. De conformidad con ello, u n "intensificador" es una secuencia de ADN que puede estimular al promotor o la actividad de una secuencia génica reg uladora y puede ser u n elemento in nato del promotor, o un elemento heterólogo insertado para intensificar el nivel o la especificidad tisular de u n promotor. Las secuencias promotoras también pueden estar localizadas dentro de las porciones transcritas de los genes y/o en di rección 3' de las secuencias transcritas. Los promotores se pueden derivar en su totalidad de un gen nativo, o pueden estar compuestos por diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados en la naturaleza , o incluso comprender segmentos de ADN sintéticos. Los técnicos en la materia deberán entender q ue diferentes promotores pueden d irigir la expresión de un gen en diferentes tej idos o tipos de células , o en diferentes etapas de desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones ambientales. Los promotores que causan que un gen se exprese en la mayoría de los tipos de células h uésped , en casi todo momento, comúnmente son referidos como "promotores constitutivos". Constantemente se descubren nuevos promotores de varios tipos útiles en células de plantas; se pueden encontrar numerosos ejemplos en la compilación de Okamuro y Goldberg , Biochemistry of Plants 1 5: 1 -82 ( 1 989) . Además, se reconoce que como en la mayoría de los casos los límites exactos de las secuencias reguladoras no se han definido completamente, fragmentos de ADN con alg unas variaciones podrían presentar actividad promotora idéntica. U n "intrón" es una secuencia interviniente en un gen , que no codifica para u na porción de la secuencia de proteí na . Entonces, tales secuencias son transcritas en ARN , pero después son cortadas y no traducidas. El término también se utiliza pa ra las secuencias de ARN escindida . Un "exón" es una porción de la secuencia gén ica q ue es transcrita y se encuentra en el ARN mensajero maduro derivado del gen , pero no necesariamente es parte de la secuencia que cod ifica para el prod ucto génico final. La expresión "secuencia l íder de traducción" se refiere a una secuencia de ADN localizada entre la secuencia promotora de un gen y la secuencia codificadora . La secuencia l íder de traducción está presente en el ARNm completamente procesado en d irección 5' de la secuencia de inicio de traducción . La secuencia líder de traducción puede afectar el procesamiento de la transcripción primaria en ARNm , la estabilidad del ARNm o la eficiencia de la traducción . Se han descrito ejemplos de secuencias l íder de traducción (Tu rner, R . y Foster, G . D. ( 1 995) Molecular Biotechnology 3:225) . La expresión "secuencias 3' no codificadoras" se refiere a secuencias de ADN localizadas en dirección 3' de una secuencia codificadora e incluyen secuencias de reconocimiento de poliadenilación y otras secuencias que codifican para señales reg uladoras capaces de afectar el procesamiento de ARNm o la expresión génica. La señal de poliadenilación normalmente está caracterizada porque afecta la adición de segmentos de ácido poliadenílico en el extremo 3' del precursor de ARNm. El uso de diferentes secuencias 3' no codificadoras se ejemplifica por Ingelbrecht et al., Plant Cell 1:671-680 (1989). El término "transcripción de ARN" se refiere al producto que resulta de la transcripción catalizada con ARN-polimerasa, de una secuencia de ADN. Cuando la transcripción de ARN es una copia complementaria perfecta de la secuencia de ADN, ésta se denomina como la transcripción primaria o puede ser una secuencia de ARN derivada del procesamiento postranscripcional de la transcripción primaria y es denominada como el ARN maduro. El término "ARN mensajero (ARNm)", se refiere al ADN que se encuentran sin intrones y que puede ser traducido en una proteína por la célula. El término "ADNc" se refiere a un ADN que es complementario a, y sintetizado a partir de, una plantilla de ARNm, utilizando la enzima transcriptasa reversa. El ADNc puede ser de una sola cadena o puede ser transformado en una forma de doble cadena, utilizando el fragmento de Klenow de la DNA polimerasa I. El término ARN "de sentido" se refiere a una transcripción de ARN que incluye el ARNm y que puede ser traducido en una proteína dentro de una célula o in vitro. El término "ARN antisentido" se refiere a una transcripción de ARN que es complementaria a la totalidad o a una parte de una transcripción primaria blanco o ARNm, y que bloquea la expresión de un gen blanco (Patente Norteamericana No. U .S. 5, 1 07,065) . La complementa riedad de un ARN antisentido puede ser con cualquier pa rte de la transcripción génica específica; es decir, en la secuencia 5' no codificadora, en la secuencia 3' no codificadora , en intrones o en la secuencia codificadora . El término "ARN fu ncional" se refiere a un ARN antisentido, ARN de ribozima u otro ARN , que pudiera no ser traducido, pero q ue sí tiene un efecto sobre los procesos celulares. Los términos "complemento" y "complemento reversa" se utilizan indistintamente en la presente con respecto a las transcripciones de ARNm y definen el ARN antisentido del mensaje. El término "ARN endógeno" se refiere a cualqu ier ARN que es codificado por una secuencia de ácido n ucleico presente en el genoma del huésped , antes de la tra nsformación con la construcción recombinante de la presente invención , ya sea de origen natu ral o de origen no natural ; es decir, introd ucido por medios recombinantes, mutagénesis, etcétera . El término "de origen no natural" , significa artificial , es decir, que no es consistente con lo q ue normalmente se encuentra en la naturaleza. El término "ligado de manera operable" se refiere a la asociación de secuencias de ácido nucleico en u n fragmento de ácido nucleico de una sola cadena , de tal modo q ue la fu nción de una es reg ulada por la otra . Por ejemplo, u n promotor está ligado de manera operable con una secuencia codificadora, cuando es capaz de regu lar la expresión de esa secuencia codificadora (es decir, que la secuencia codificadora está bajo el control transcripcional del promotor). Las secuencias codificadoras pueden estar ligadas de manera operable a secuencias reg uladoras, en u na orientación de sentido o de antisentido. En otro ejemplo, las regiones de ARN complementarias de la invención , pueden estar ligadas de manera operable, ya sea directa o indirectamente, en di rección 5' del ARNm blanco, o en dirección 3' al ARNm blanco, o dentro del ARNm blanco, o una primera región complementaria está en dirección 5' y su complemento está en dirección 3' del ARN blanco. El término "expresión" tal como se utiliza en la presente , se refiere a la producción de un producto fi nal funcional . La expresión de u n gen involucra la transcripción del gen y la traducción de ARNm en u n precursor o u na proteína mad ura . El término "inh ibición antisentido" se refiere a la producción de transcripciones de ARN antisentido capaces de suprimir la expresión de la proteína blanco. El término "cosupresión" se refiere a la producción de transcripciones de ARN de sentido capaces de suprimir la expresión de genes extraños o endógenos idénticos o sustancialmente similares (Patente Norteamericana No. U . S. 5,231 ,020) . El término proteína "madura" se refiere a u n polipéptido procesado posteriormente a la traducción ; es decir, u na forma en la que cualq uier prepéptido o propéptido presente en el producto de traducción primaria, ha sido removido. El término proteína "precursora" se refiere al producto primario de la traducción del ARNm ; es decir, cuando todavía están presentes prepéptido y propéptidos. Los prepéptidos y propéptidos pueden ser, pero no limitarse a señales de localización intracelular. El término "transformación estable" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico en un genoma de un organismo h uésped, q ue da como resultado u na herencia genéticamente estable. En contraste, el término "tra nsformación tra nsitoria" se refiere a la transferencia de u n fragmento de ácido n ucleico en el n úcleo, o en un organelo que contiene ADN , de u n organismo h uésped , q ue da como resultado la expresión génica sin integ ración o herencia estable . Los organismos huésped que contienen fragmentos de ácido nucleico transformados, se denominan organismos "transgénicos". El término "transformación" tal como se utiliza en la presente , se refiere tanto a la transformación estable como a la transformación transitoria . Las técnicas de ADN recombinante estándar y las técnicas de clonación molecular utilizadas en la presente , son conocidas en este campo y se describen de manera más completa en Sambrook , J . , Fritsch , E . F. y Maniatis, T. , Molecular Cloning : A Laboratory Manual ; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1 989 (denominado en lo sucesivo "Sambrook") . El término "recombinante" se refiere a una combinación artificial de dos segmentos separados de secuencias, por ejemplo, por síntesis qu ímica o por manipulación de los segmentos aislados de ácido n ucleico mediante técnicas de ingeniería genética . El término "RCP" o "Reacción en Cadena Catalizada por Polimerasa", es una técnica para la síntesis de grandes cantidades de segmentos de ADN específicos, que consiste de una serie de ciclos repetitivos (Perkin Elmer Cetus Instruments, Norwalk, CT). Típicamente, el ADN de doble cadena se desnaturaliza por calor, los dos cebadores complementarios a los extremos 3' del segmento blanco se aparean a baja temperatura y después se extienden a una temperatura intermedia. Un conjunto de estos tres pasos consecutivos se denomina un ciclo. La reacción en cadena catalizada por polimerasa ("RCP") es una poderosa técnica utilizada para amplificar ADN millones de veces, mediante la replicación repetida de una plantilla, en un corto periodo de tiempo (Mullís et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-273 (1986); Erlich et al., Solicitud de Patente Europea No. 50,424; Solicitud de Patente Europea No. 84,796; Solicitud de Patente Europea No. 258,017; Solicitud de Patente Europea No. 237,362; Mullís, Solicitud de Patente Europea No. 201,184; Mullís et al., Patente Norteamericana No. 4,683,202; Erlich, Patente Norteamericana No.4,582,788; y Saíki et al., Patente Norteamericana No. 4,683,194). El proceso utiliza conjuntos de oligonucleótidos específicos sintetizados in vitro, para cebar la síntesis de ADN. El diseño de los cebadores depende de la secuencia de ADN que va a ser analizada. La técnica se lleva a cabo a través de numerosos ciclos (normalmente de 20 a 50) de fusión de la plantilla a alta temperatura, permitiendo que los cebadores se apareen con secuencias complementarias en la plantilla y después replicando la plantilla con DNA polimerasa. Los prod uctos de las reacciones de RCP son analizados por separación en geles de agarosa, seg uido por u na tinción con bromuro de etidio y la visualización con transilu minación UV. Alternativamente, se puede ag regar d NTPs radioactivo a la RC P , con el fin de incorporar la marca en los productos. En este caso , los productos de la RC P son visualizados mediante la exposición del gel a una película de rayos X. La ventaja adicional de rad iomarcar los productos de RC P, es que las marcas de los prod uctos de amplificación individuales se pueden cuantificar. Los términos "construcción recombinante" , "construcción de expresión" y "construcción de expresión recombi nante", se utiliza n indistintamente en la presente. Estos términos se refieren a u na unidad funcional de material genético, que se puede insertar en el genoma de una célu la utilizando la metodolog ía estándar conocida por los técnicos en la materia . Tal construcción puede ser utilizada por sí misma o empleada en conjunto con u n vector. Si se usa un vector, entonces la elección del vector depende del método que se utilizará para transformar las plantas huésped , tal como es sabido por los técnicos en la materia . Por ejemplo, se puede usar un plásmido. Los técnicos en la materia están conscientes de los elementos genéticos que deben estar presentes en el vector, con el fin de transformar, seleccionar y propagar con éxito células h uésped que comprenden cualq uiera de los fragmentos de ácido nucleico aislados de la invención . Los técnicos en la materia también reconocerán que diferentes eventos de transformación independientes, darán como resultado diferentes niveles y patrones de expresión (Jones et al., (1985) EMBO J. 4:24 1-24 8; De Almeida et al., (1989) Mol. Gen. Genetics 218:78-86), y por lo tanto, que se deben seleccionar múltiples eventos con el fin de obtener líneas celulares que desplieguen el nivel y el patrón de expresión deseados. Tal selección se puede llevar a cabo por análisis de inmunoelectrotransferencia tipo Southern de ADN, análisis de inmunoelectrotransferencia tipo Northern de la expresión de ARNm, análisis de inmunoelectrotransferencia tipo Western de la expresión proteica, o análisis fenotípico. El término "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza en la presente, se refiere a una de una preparación de moléculas de anticuerpo que contienen anticuerpos que comparten una secuencia de aminoácidos de cadena pesada común y de cadena ligera común, en contraste con un anticuerpo proveniente de una preparación de anticuerpos "policlonales", que contienen una mezcla de diferentes anticuerpos. Los anticuerpos monoclonales se pueden generar mediante varias novedosas tecnologías tales como despliegue en fagos, bacterias, levaduras o ribosomal, así como los métodos clásicos ejemplificados por los anticuerpos derivados de hibridomas (por ejemplo, un anticuerpo secretado por un hibridoma preparado mediante la tecnología de hibridomas, tal como la metodología estándar de Kohier y Milstein (Hybridoma Methodology (1995) Nature 256:495-497). Así pues, un anticuerpo agonista no derivado de hibridomas de la presente invención , todavía se sigue refiriendo como anticuerpo monoclonal, aunq ue pudo haberse obten ido por metodolog ías no clásicas. El término "anticuerpo aislado" tal como se utiliza en la presente, se refiere a un anticuerpo q ue está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a u n globulomero, está sustancialmente libre de anticuerpos que se unan específicamente a antígenos diferentes de un globulomero) . Un anticuerpo aislado que se une específicamente a un globulomero, sin embargo, podría presentar reacciones cruzadas con otros antígenos. Además, u n anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celu lar y/o sustancias qu ímicas. El término "porción de unión al antígeno" de u n anticuerpo (o simplemente "porción de anticuerpo") , tal como se utiliza en la presente, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo q ue retienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno . Se he demostrado q ue la función de un ión al antígeno de u n anticuerpo , puede ser realizada por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Tales modalidades de anticuerpo también pueden ser formatos biespecíficos, específicos duales o multiespecíficos; un iéndose específicamente a dos o más diferentes antígenos. Ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro del término "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo, incluyen (i) u n fragmento Fab, que es un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, que es un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados mediante un puente de disulfuro en la región de bisagra; (iii) un fragmento Fd, que consiste de los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv, que consiste de los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al. (1989) Nature 341 : 544-546), que comprende un solo dominio variable; y (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, sea codificados por genes separados, éstos se pueden unir, empleando métodos recombinantes, mediante un ligando sintético que haga posible que formen una sola cadena proteica en la cual las regiones VL y VH sean apareadas para formar moléculas monovalentes (conocido como Fv de una sola cadena (scFv); véase por ejemplo Bird er al. (1988) Science 242: 423-426; y Huston er al. (1988) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Tales anticuerpos de una sola cadena también están abarcados dentro del término "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo. Otras formas de anticuerpos de una sola cadena, tales como los diacuerpos, también están abarcadas. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes, biespecíficos, en los cuales los dominios VH y VL son expresados en una sola cadena polipeptídica, pero utilizando un ligando que es demasiado corto como para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, forzando de esta manera a los dominios a aparearse con dominios complementarios de otra cadena, y creando dos sitios de unión al antígeno (véase por ejemplo, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123). Tales porciones de unión de los anticuerpos son conocidas en la técnica (Kontermann y Dubel eds., Antibodv Enqineering (2001) Springer-Verlag. Nueva York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5). Adicionalmente, un anticuerpo o porción de unión al antígeno del mismo, puede ser parte de una molécula de inmunoadhesión más grande, formada mediante la asociación covalente o no covalente del anticuerpo o porción de anticuerpo con una o más de otras proteínas o péptidos. Ejemplos de tales moléculas de inmunoadhesión incluyen el uso de la región de núcleo de la estreptavidina, para preparar una molécula scFv tetramérica (Kipriyanov, S.M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) y el uso de un residuo cisteína, un péptido marcador y una marca polihistidina C-terminal, para preparar moléculas scFv bivalentes y biotinadas (Kipriyanov, S.M., et al. (1994) Mol. Immunol. 3J_:1047-1058). Se pueden preparar porciones de anticuerpo, tales como fragmentos Fab y F(ab')2, a partir de anticuerpos completos mediante técnicas convencionales, tales como la digestión con papaína o pepsina, respectivamente, de anticuerpos completos. Además, los anticuerpos, porciones de anticuerpo y moléculas de inmunoadhesión, se pueden obtener utilizando las técnicas estándar de ADN recombinante tal como se describe en la presente.

El término "anticuerpo humano recombinante" tal como se utiliza en la presente, incluyen todos los anticuerpos humanos que son preparados, expresados, creados o aislados por medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados utilizando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped, anticuerpos aislados a partir de una biblioteca de anticuerpos humanos combinatoria recombinante (Hoogenboom H.R., (1997) TIB Tech. 15:62-70; Azzazy H., y Highsmith W.E., (2002) Clin. Biochem. 35.425-445; Gavilondo J.V., y Larrick J.W. (2002) BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom H., y Chames P. (2000) Immunology Today 21:371-378), anticuerpos aislados de un animal (e.g., un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana (véase por ejemplo, Taylor, L. D., et al. (1992) Nucí. Acids Res. 20:6287-6295; Kellermann S-A., y Green L.L. (2002) Current Opinión in Biotechnology 13:593-597; Little M. et al. (2000) Immunology Today 21:364-370) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que involucre el empalmamiento de secuencias de genes de inmunoglobulina humana con otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina germinal humana. Sin embargo, en ciertas modalidades, tales anticuerpos humanos recombinantes son sometidos a mutagénesis in vitro (o, cuando se utiliza un animal transgénico para secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo), y entonces las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes, son secuencias que, aunque se derivan y se relacionan con secuencias VH y VL de la línea germinal humana, podrían no existir naturalmente en el repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos, in vivo (véase también Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunoloqical Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, Publicación NIH No. 91-3242, 1991). Los anticuerpos humanos de la presente invención, no obstante, pueden incluir residuos de aminoácido no codificados por las secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo) (véase también Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Press, 1990). El término "anticuerpo quimérico" se refiere a anticuerpos que comprenden secuencias de la región de cadena pesada y cadena ligera variable de una especie y secuencias de la región constante de otra especie, tales como anticuerpos que tienen regiones variables de cadena pesada y ligera murinas ligadas con regiones constantes humanas. El término "anticuerpo con CDRs injertadas" se refiere a anticuerpos que comprenden secuencias de la región variable de cadena pesada y ligera de una especie, pero en las cuales las secuencias de una o más de las regiones CDR de VH y/o VL, son reemplazadas por secuencias CDR de otra especie, tales como anticuerpos que tienen regiones variables de cadena pesada y ligera murinas, en las cuales una o más de las CDRs murinas (por ejemplo, CDR3) ha sido reemplazada por secuencias CDR humanas. Los anticuerpos recombinantes humanos de la presente invención, tienen regiones variables y también pueden incluir regiones constantes, derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (véase Kabat et al. (1991) supra). Sin embargo, en ciertas modalidades, tales anticuerpos humanos recombinantes son sometidos a mutagénesis in vitro (o, cuando se utilizan secuencias de animales transgénicos para Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y entonces las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes, son secuencias que, aunque se derivan y se relacionan con secuencias VH y VL de la línea germinal humana, podrían no existir naturalmente en el repertorio germinal de anticuerpos humanos in vivo. No obstante, en ciertas modalidades, tales anticuerpos recombinantes son el resultado de mutagénesis selectiva o retromutación, o ambas. El término "retromutación" se refiere a un proceso en el cual alguno o la totalidad de los aminoácidos mutados somáticamente de un anticuerpo humano, son reemplazados por los correspondientes residuos de la línea germinal, provenientes de una secuencia de anticuerpo de línea germinal homologa. Las secuencias de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo humano de la invención, se alinean por separado con las secuencias de línea germinal en la base de datos VBASE, para identificar las secuencias con la más alta homología. La base de datos VBASE es un directorio extenso de todas las secuencias de región variable de línea germinal humana compiladas a partir de secuencias publicadas, incluyendo las actuales revelaciones de GenBank y de las bibliotecas de datos EMBL. La base de datos fue desarrollada en el Centro de Ingeniería en Proteínas MRC (Cambridge, GB) como depositario de genes de anticuerpos humanos secuenciados (sitio web: http://www.mrc-cpe.cam.ac. uk/vbase-intro.php? menú =901 ). Las diferencias en el anticuerpo humano de la invención, se regresan a la secuencia de línea germinal mediante mutaciones definidas en posiciones de nucleótidos que codifican para tales diferentes aminoácidos. La función de cada aminoácido ha sido identificada como candidato para una retromutación, se deberá investigar con respecto a un papel directo o indirecto en la unión al antígeno, y cualquier aminoácido que después de la mutación se encuentre que afecta cualquier característica deseable del anticuerpo humano, no se deberá incluir en el anticuerpo humano final. Para minimizar el número de aminoácidos sujetos a retromutación, aquellas posiciones de aminoácido que se encuentra que son diferentes de la secuencia de línea germinal más cercana, pero idénticas al aminoácido correspondiente en una segunda secuencia de línea germinal, pueden permanecer, siempre y cuando la segunda secuencia de línea germinal sea idéntica y colinear a la secuencia del anticuerpo humano de la invención, por al menos 10, de preferencia 12 aminoácidos, en ambos lados del aminoácido en cuestión . Puede ocurrir retromutación en cualquier etapa de la utilización de los anticuerpos. El término "proteína de u nión marcada" es una proteína en donde un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención se deriva o liga a otra molécula funcional (por ejemplo , otro péptido o proteína) . Por ejemplo, una proteína de unión marcada de la invención , se puede derivar mediante el ligamiento funcional de u n anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención (por acoplamiento qu ímico , fusión genética, asociación no covalente, o de otra manera) a una o más de otras entidades moleculares , tales como otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o un diacuerpo) , un agente detectable, un agente citotóxico, u n agente farmacéutico y/o una proteína o péptido que pueda regular la asociación del anticuerpo o porción de anticuerpo con otra molécula (ta l como una región de núcleo de estreptavidina , o una marca de polihistidina). Para los propósitos de la presente invención , una "proteína de un ión glucosilada" comprende una proteína de unión en la cual el anticuerpo o porción de unión al antígeno de mismo, comprende u no o más residuos carbohidrato. La n ueva proteína prod ucida in vivo puede ser sometida a procesamiento adicional, conocido como modificación postraduccional. En particular, se pueden ag regar enzimáticamente residuos de azúcar (glucosilo), proceso conocido como glucosilación . Las proteínas resultantes portadoras de cadenas laterales de oligosacárido enlazadas covalentemente, son conocidas como proteínas glucosiladas o glucoproteínas. Los anticuerpos son glucoproteínas con uno o más residuos carbohidrato en el dominio Fe, así como en el dominio variable. Los residuos de carbohidrato en el dominio Fe, tienen un efecto importante sobre la función efectora del dominio Fe, con un efecto mínimo sobre la unión al antígeno la vida media del anticuerpo (R. Jefferis, Biotechnol. Prog. 21 (2005), págs. 11-16). En contraste, la glucosilacion del dominio variable puede tener un efecto sobre la actividad de unión al antígeno del anticuerpo. La glucosilacion en el dominio variable, puede tener un efecto negativo sobre la afinidad de unión del anticuerpo, posiblemente debido a impedimentos estéricos (Co, M.S., et al., Mol. Immunol. (1993) 30:1361-1367), o como resultado de una mayor afinidad por el antígeno (Wallick, S.C., et al., Exp. Med. (1988) 168:1099-1109; Wright, A., et al. EMBO J. (1991) 10:2717-2723). Además, se pueden preparar mutantes de sitio de glucosilacion en las cuales el sitio de glucosilacion O-ligado ó N-ligado de la proteína de unión, ha sufrido mutaciones. Un técnico en la materia puede generar tales mutantes empleando las tecnologías estándar conocidas. Las mutantes de sitio de glucosilacion que retienen la actividad biológica, pero que tienen una mayor o menor afinidad de unión, también están contempladas. Además, la glucosilacion del anticuerpo o porción de unión al antígeno de la invención, se puede modificar. Por ejemplo, se puede preparar un anticuerpo aglucosilado (es decir, el anticuerpo carece de glucosilacion). La glucosilacion se puede alterar, por ejemplo, para incrementar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Tales modificaciones de carbohidratos se pueden llevar a cabo, por ejemplo, alterando uno o más sitios de glucosilación en la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden realiza r u na o más sustituciones de aminoácidos que den como resultado la eliminación de uno o más sitios de glucosilación de la región variable , para eliminar de esta manera la glucosilación en ese sitio. Tal glucosilación puede incrementa r la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Tal enfoque se describe más detalladamente en la Publicación I nternacional de Patente WO 03/01 6466A2 , y en las Patentes Norteamericanas Nos. U . S. 5,714,350 y 6, 350,861 , cada una de las cuales se incorpora en su totalidad como referencia . Adicional o alternativamente, se puede preparar un anticuerpo modificado que tenga un tipo alterado de g lucosilación , tal como un a nticuerpo hipofucosilado q ue tenga cantidades red ucidas de residuos fucosilo, o u n anticuerpo que tenga una mayor cantidad de estructuras GIcNAc biseccionantes. Se ha demostrado que tales patrones de glucosilación alterada incrementan la capacidad ADCC de los anticuerpos. Tales modificaciones de carbohidratos se pueden llevar a cabo, por ejemplo, expresando el anticuerpo en u na célula huésped con maq ui naria de glucosilación alterada . Se han descrito células con maquinaria de gl ucosilación alterada en la técnica , y se pueden utilizar como células h uésped en las cuales expresar anticuerpos recombinantes de la presente invención , para prod ucir de esta manera un anticuerpo con g lucosilación alterada (véase por ejemplo, Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem., 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1, así como la Patente Europea EP No. 1,176,195; las Publicaciones Internacionales de Patente WO Números 03/035835 y WO 99/5434280, cada una de las cuales se incorpora en la presente en su totalidad como referencia). La glucosilacion de proteínas depende de la secuencia de aminoácidos de la proteína de interés, así como de la célula huésped en la cual se expresa la proteína. Diferentes organismos pueden producir diferentes enzimas de glucosilacion (por ejemplo, glucosiltransferasas y glucosidasas) y pueden tener diferentes sustratos (nucleótidos, azúcares). Debido a tales factores, el patrón de glucosilacion de las proteínas y la composición de los residuos glucosilo, pueden diferir dependiendo del sistema huésped en el cual se expresa la proteína particular. Los residuos glucosilo útiles en la invención, pueden incluir, pero no se limitan a glucosa, galactosa, mañosa, fucosa, n-acetilglucosamina y ácido siálico. De preferencia, la proteína de unión glucosilada comprende residuos glucosilo de tal modo que el patrón de glucosilación sea humano. Es del conocimiento de los técnicos en la materia que diferentes patrones de glucosilación de proteínas pueden dar como resultado diferentes características de la proteína. Por ejemplo, la eficacia de una proteína terapéutica producida en un microorganismo huésped, tal como una levadura, y glucosilada utilizando la ruta endógena de la levadura, se puede reducir, en comparación con la eficacia de la misma proteína expresada en una célula de mamífero, tal como una línea celular CHO. Tales glucoproteínas también pueden ser inmunogénicas en seres humanos y mostrar una reducida vida media in vivo después de su administración. Receptores específicos en seres humanos y otros animales pueden reconocer residuos glucosilo específicos y promover la rápida depuración de la proteína del torrente sanguíneo. Otros efectos adversos pueden incluir cambios en el plegamiento de la proteína, en su solubilidad, en su susceptibilidad a las proteasas, en el tráfico, transporte, compartimentación, secreción, reconocimiento por otras proteínas o factores, antigenicidad o alergenicidad. De conformidad con lo anterior, un técnico en la materia podría preferir una proteína terapéutica con una composición específica y patrón de glucosilación, por ejemplo un patrón y composición de glucosilación idénticos, o al menos similares, a los producidos en las células humanas o en las células específicas de especie del animal pretendido como sujeto. La expresión de proteínas glucosiladas diferentes de aquéllas de una célula huésped, se puede lograr mediante la modificación genética de la célula huésped para expresar enzimas de glucosilación heterólogas. Con el uso de técnicas conocidas en este campo, un técnico en la materia podría generar anticuerpos o porciones de unión al antígeno de los mismos, que exhiban una glucosilación de proteína humana. Por ejemplo, se han modificado genéticamente cepas de levadura para expresar enzimas de glucosilación de origen no natural, de tal modo que las proteínas glucosiladas (glucoproteínas) producidas en estas cepas de levadura, exhiban una glucosilación idéntica a las de células animales, especialmente célu las humanas (Solicitudes Norteamericanas de Patente Nos. 2004001 8590 y 200201 371 34, y Publicación I nternacional de Patente WO 05/1 00584 A2). Además, los técn icos en la materia observa rán que una proteína de interés se puede expresar utilizando una biblioteca de células h uésped manipu ladas por ingeniería genética para expresa r varias enzimas de glucosilación , de tal modo que las célu las h uésped miembro de la biblioteca produzcan la prote ína de i nterés con varios patrones de glucosilación . Entonces, un técnico en la materia puede seleccionar y aislar la proteína de interés, con patrones de glucosilación novedosos particulares . De preferencia , la proteína q ue tiene u n patrón de g lucosilación novedoso particu larmente seleccionado, exhibe mejores o alteradas propiedades biológicas. La invención también proporciona un método para preparar anticuerpos monocionales de la invención a partir de animales no humanos, no murinos, mediante la inmun ización de animales transgénicos no h umanos que comprendan loci de inmu noglobulina humana. Se pueden prod ucir tales animales empleando métodos conocidos en la técnica . En u na modalidad preferida , los an imales no humanos pueden ser ratas, ovejas, cerdos, cabras, ganado bovino o caballos. Pueden prepararse hibridomas inmortalizados productores de anticuerpo, a partir del animal inmunizado. Después de la inmunización , el animal es sacrificado y las células B esplénicas son fusionadas con células de mieloma inmortalizadas, como es bien sabido en la técnica. Véase e.g . , Harlow y Lañe , supra. En u na modalidad preferida, las células de mieloma no secretan polipéptidos de inmunoglobulina (u na l ínea cel ular no secretoria) . Después de la fusión y selección con antibióticos, los hibridomas son clasificados utilizando un antígeno (por ejemplo, un globulómero) o una porción del mismo, o u na célula que exprese el antígeno de interés. En u na modalidad preferida, la clasificación inicial se lleva a cabo utilizando un inmunoensayo de enzima ligada (ELI SA) o un radioinmunoensayo (R IA) , de preferencia una ELI SA. U n ejemplo de selección o clasificación por ELISA, se proporciona en la Publicación I nternacional de Patente WO 00/37504, q ue se incorpora en la presente como referencia . Los hibridomas productores de anticuerpos se seleccionan , se clonan y se vuelven a seleccionar en busca de las características deseadas, incluyendo el crecimiento de un hibridoma robusto, u na alta producción de anticuerpos y características deseables de los anticuerpos, tal como se describe adicionalmente más adelante. Los hibridomas se pueden cultivar y expandir in vivo, en animales singénicos, q ue son animales que carecen de sistema inmunitario, por ejemplo ratones desn udos, o en cultivos celulares in vitro. Los métodos de selección , clonación y expansión de hibridomas, son conocidos para los técnicos en la materia . De preferencia , el animal inmunizado es u n animal no humano que expresa genes de inmunoglobulina humana , y las células B esplénicas se fusionan con un mieloma derivado de la misma especie que el animal no hu mano.

En un aspecto, la invención proporciona h ibridomas que producen anticuerpos monoclonales para ser utilizados en el tratamiento, diag nóstico y prevención de la E nfermedad de Alzheimer. En una modalidad preferida , los hibridomas son hibridomas mu rinos. En otra modalidad preferida , los h ibridomas se producen en una especie no h umana, no mu rina , tal como ratas, ovejas, cerdos, cabras, ganado bovino o caballos. En otra modalidad , los hibridomas son hibridomas humanos, en los cuales u n mieloma humano no secretor se fusiona con u na célula humana q ue expresa un anticuerpo contra un globulómero. Se pueden generar anticuerpos recombinantes a partir de linfocitos aislados , media nte el uso de un procedimiento referido en la técnica como método de anticuerpo de linfocito seleccionado (MALS) , tal como se describe en la Patente Norteamericana No. U .S . 5,627,052 , en la Publicación I nternacional de Patente WO 92/02551 y en Babcock, J . S. er al. ( 1 996) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 93 :7842-7848. En este método, células aisladas que secretan anticuerpos de interés (por ejemplo, linfocitos derivados del animal inmun izado) se seleccionan utilizando un ensayo en placa hemolítica específico del antígeno, en donde el antígeno (por ejemplo g lobulómero) o un fragmento del mismo, se acopla con eritrocitos de carnero utilizando un ligando, tal como biotina , y se emplea para identificar célu las aisladas que secreten anticuerpos con especificidad por el antígeno. Después de la identificación de las células secretoras de anticuerpo de interés, se rescatan los ADNc de la región variable de cadena pesada y de cadena ligera de las célu las, med iante u na RC P con transcriptasa reversa , y estas regiones variables, entonces, se pueden expresar, en el contexto de regiones constantes de inmunoglobulina apropiadas (por ejemplo, regiones constantes humanas) , en células huésped de mam ífero, tales como célu las COS o células C HO . Las células huésped transfectadas con la secuencia de inmunog lobulina amplificada , derivada de linfocitos seleccionados in vivo, posteriormente se pueden someter a análisis y selección adicionales in vitro, por ejemplo lavando y seleccionando las células transfectadas para aislar las células que expresen anticuerpos contra I L-1 8. Las secuencias de inmunoglobulina amplificadas, además se pueden man ipular in vitro, por ejemplo mediante métodos de mutación de afinidad in vitro, tales como los descritos en las Publicaciones I nternacionales de Patente Nos. WO 97/291 31 y WO 00/56772. El término "anticuerpo quimérico" se refiere a anticuerpos q ue comprenden secuencias de región variable de cadena pesada y cadena ligera provenientes de una especie y secuencias de región constante provenientes de otra especie, tales como anticuerpos q ue tienen regiones variables de cadena pesada y ligera muri nas ligadas con regiones constantes humanas. El término "anticuerpos con C DRs injertados" se refiere a anticuerpos que comprenden secuencias de región variable de cadena pesada y ligera provenientes de una especie, pero en las cuales las secuencias de una o más de las reg iones CDR de VH y/o VL, son reemplazadas por secuencias CDR de otra especie, tales como anticuerpos que tienen regiones variables de cadena pesada y ligera murina en las cuales una o más de las CDRs murinas (por ejemplo, CDR3) fue reemplazada por secuencias CDR humanas. El término "anticuerpo humanizado" se refiere a anticuerpos que comprenden secuencias de región variable de cadena pesada y ligera provenientes de una especie no humana (por ejemplo, un ratón), pero en las cuales cuando menos una porción de las secuencias VH y/o VL ha sido alterada para ser más "similar a humana"; es decir, más similar a las secuencias variables de línea germinal humana. Un tipo de anticuerpo humanizado es un anticuerpo con CDRs insertadas en el cual se introducen secuencias CDR humanas en secuencias VH y VL no humanas, para reemplazar las correspondientes CDRs no humanas. En particular, el término "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo o una variante, derivado, análogo o fragmento del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un antígeno de interés, y que comprende una región de marco estructural (FR) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo humano y una región determinante de complementariedad (CDR) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo no humano. Tal como se utiliza en la presente, el término "sustancialmente" en el contexto de una CDR, se refiere a una CDR que tiene una secuencia de aminoácidos con cuando menos 80%, de preferencia cuando menos 85%, cuando menos 90%, cuando menos 95%, cuando menos 98% o cuando menos 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de una CDR de anticuerpo no humano. Un anticuerpo humanizado comprende sustancialmente la totalidad de cuando menos una, y físicamente dos, dominios variables (Fab, FAb', F(ab')2, FabC, Fv), en los cuales la totalidad o sustancialmente la totalidad de las regiones CDR, corresponden a aquéllas de una inmunoglobulina no humana (es decir, anticuerpo donador) y la totalidad o sustancialmente la totalidad de las regiones de marco estructural, son aquéllas de una secuencia consensual de inmunoglobulina humana. De preferencia, un anticuerpo humanizado también comprende cuando menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe), típicamente la de una inmunoglobulina humana. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado contiene tanto la cadena ligera como cuando menos el dominio variable de una cadena pesada. El anticuerpo también puede incluir las regiones CH1, bisagra, CH2, CH3 y CH4 de la cadena pesada. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado sólo contiene una cadena ligera humanizada. En otras modalidades, un anticuerpo humanizado sólo contiene una cadena pesada humanizada. En modalidades específicas, un anticuerpo humanizado sólo contiene un dominio variable humanizado de una cadena ligera y/o pesada humanizada. El anticuerpo humanizado se puede seleccionar de cualquier clase de inmunoglobulina, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo, incluyendo sin limitaciones, lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4. El anticuerpo humanizado puede comprender secuencias provenientes de más de una clase o isotipo, y se pueden seleccionar dominios constantes particulares para optimizar las funciones efectoras deseadas, empleando técnicas conocidas en este campo. Las regiones de marco estructu ral y C DR de u n anticuerpo h umanizado, no necesitan corresponder precisamente a las secuencias progenitoras, por ejemplo , la CDR del anticuerpo donador o el marco estructural consensual pueden sufrir mutaciones por sustitución , inserción y/o deleción de cuando menos un residuo de aminoácido, de tal modo q ue el residuo de la C DR o del marco estructu ral en ese sitio no corresponda al anticuerpo donador n i al marco estructural consensual . Sin embargo, en u na modalidad preferida , tales mutaciones no serán extensas. Normalmente , cuando menos el 80% , de preferencia cuando menos el 85% , más preferiblemente cuando menos el 90% y todavía más preferiblemente cuando menos el 95% de los residuos del anticuerpo h uman izado , corresponderán a aquéllos de las secuencias FR y C D R progenitoras. Tal como se utiliza en la presente, el término "marco estructu ral consensual" se refiere a la región de marco estructu ral en las secuencias de inmunoglobulina consensúales. Además, tal como se utiliza en la presente, el término "secuencia de inmunoglobulina consensual", se refiere a la secuencia formada a partir de la mayoría de los aminoácidos (o nucleótidos) q ue se presentan más frecuentemente en una familia de secuencias de inmu nog lobu lina relacionadas (véase por ejemplo, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim , Alemania , 1 987) . En una familia de inmunoglobulinas, cada posición en la secuencia consensual está ocupada por el aminoácido que se presenta con más frecuencia en esa posición en la familia . Si se presentan dos aminoácidos con igual frecuencia, cualquiera puede ser incluido en la secuencia consensual . El término "actividad" incluye actividades tales como la especificidad/afinidad de unión de u n anticuerpo a su antígeno . El término "epítopo" incluye cua lq uier determinante polipeptídico capaz de unirse específicamente a un receptor de inmunoglobulina o de célula T. En ciertas modalidades , los determinantes epitópicos incluyen grupos de superficie qu ímicamente activos de moléculas, tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, g rupos fosforilo o sulfonilo, y en ciertas modalidades, pueden tener características estructurales trid imensionales específicas, y/o características de carga específicas. U n ep ítopo es u na región de u n antígeno q ue se une al anticuerpo. En ciertas modalidades, se d ice que u n anticuerpo se u ne específicamente a un a ntígeno, cuando éste reconoce preferentemente su antígeno blanco, en u na mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas. El término "resonancia de plasmón de superficie" tal como se utiliza en la presente, se refiere a u n fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones bioespecíficas en tiempo real , mediante la detección de alteraciones en la concentración de proteínas dentro de una matriz biosensible, por ejemplo utilizando el sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, U ppsala , Suecia y Piscataway, NJ) . Para otras descripciones, véase Jónsson, U. et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jónsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; y Johnsson, B., er al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277. El término "Kon" tal como se utiliza en la presente, se refiere a la constante de "velocidad de asociación" para la asociación de un anticuerpo con el antígeno, para formar el complejo anticuerpo/antígeno, tal como se sabe en la técnica. El término "K0ff" tal como se utiliza en la presente, se refiere a la constante de "velocidad de disociación" para la disociación de un anticuerpo del complejo anticuerpo/antígeno, tal como se sabe en la técnica. El término "Kd" tal como se utiliza en la presente, se refiere a la "constante de disociación" de una interacción anticuerpo-antígeno particular, como se sabe en la técnica. El término "proteína de unión marcada" tal como se utiliza en la presente, se refiere a una proteína con una marca incorporada, que proporciona la identificación de la proteína de unión. De preferencia, la marca es un marcador detectable, por ejemplo, la incorporación de un aminoácido radiomarcado o la unión a un polipéptido con porciones biotinilo que pueda ser detectado por avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina conteniendo un marcador fluorescente o actividad enzimática que pueda ser detectada por métodos ópticos o colorimétricos). Ejemplos de marcas de polipéptidos, incluyen pero no se limitan a los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 1 C, 35S, 90Y, "Te, 111ln, 125l, 3 l, 177Lu, 166Ho ó 53Sm); marcas fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina o fósforos lantánidos), marcas enzimáticas (por ejemplo, peroxidasa de rábano, luciferasa o fosfatasa alcalina); marcadores quimioluminiscentes; grupos biotinilo; epítopos polipeptídicos predeterminados, reconocidos por un reportero secundario (pares de secuencias de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales o marcas epitópicas); y agentes magnéticos, tales como quelatos de gadolinio. El término "anticuerpo conjugado" se refiere a una proteína de unión, tal como un anticuerpo, ligada químicamente a una segunda porción química, tal como un agente terapéutico o citotóxico. El término "agente" se utiliza en la presente para denotar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica o un extracto preparado a partir de materiales biológicos. De preferencia, los agentes terapéuticos o citotoxicos incluyen, pero no se limitan a toxina pertussis, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracinodiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1 -deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina, así como análogos y homólogos de estos agentes. Los términos "cristal" y "cristalizado" tal como se utilizan en la presente, se refieren a un anticuerpo o a una porción de unión al antígeno del mismo, que existe en forma de un cristal . Los cristales son una forma de estado sólido de la materia . El término "inmunizar" se refiere en la presente al proceso de presentar u n antígeno a un receptor inmu ne, ya sea que exista repertorio en un organismo natural genéticamente inalterado, o u n organismo transgénico modificado para desplegar u n repertorio inmune huma no artificial . De manera similar, u na "preparación inmunogénica" es una formación de antígeno que contiene adyuvantes u otros aditivos que intensifican la inmunogen icidad del antígeno. U n ejemplo de esto sería la coinyección de una forma purificada del receptor G LP-1 con adyuvante completo de Freund , en un ratón . El término "hiperinmunizacíón" tal como se define en la presente, es el acto de presentaciones en serie o múltiples de un antígeno en u na preparación inmunogénica , a un animal huésped , con la intención de desarrollar una fuerte respuesta inmunitaria . Una manera de medir la cinética de unión de u n anticuerpo, es por resonancia de plasmón superficial. El término "resonancia de plasmón superficial" tal como se utiliza en la presente, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones bioespecíficas en tiempo real , mediante la detección de alteraciones de la concentración de proteínas dentro de una matriz biosensible, por ejemplo utilizando el sistema Biacore (Biacore I nternational , U ppsala , Suecia y Piscataway, NJ) . Para mayores descripciones, véase Jónsson et al. ( 1 993) Annales de Biologie CMnique (parís) 51:19-26; Jónsson et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson et al. (1995) Journal of Molecular Recognition 8:125-131; y Johnsson et al. (1991) Analytical Biochemistry 198:268-277. Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antimicóticos, agentes isotónicos y de retraso de absorción, y similares, que sean fisiológicamente compatibles. Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de entre agua, solución salina, solución salina reguladora de fosfatos, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En cualquier caso, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio, en la composición. Los vehículos farmacéuticamente aceptables además pueden comprender cantidades menores de sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsificantes, conservadores o soluciones reguladoras, que mejoran la vida de anaquel o la efectividad del anticuerpo o porción de anticuerpo. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir una "cantidad terapéuticamente efectiva" o una "cantidad profilácticamente efectiva" de un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención. La expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosis y por periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo o porción de anticuerpo, puede ser determinada por los técnicos en la materia y puede variar según factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, sexo y peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo o porción de anticuerpo para inducir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva también es aquélla en la cual cualquier efecto tóxico o dañino del anticuerpo o porción de anticuerpo es superado por los efectos terapéuticamente benéficos. Una cantidad "profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva a dosis, y por periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente, como una dosis profiláctica se utiliza en sujetos antes o en una etapa temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva será menor que la cantidad terapéuticamente efectiva. Los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención, se pueden incorporar en una composición farmacéutica adecuada, por ejemplo, para administración parenteral. De preferencia, el anticuerpo o porción de anticuerpo se preparará en forma de una solución inyectable que contiene de 0.1 a 250 mg/mL de anticuerpo. La solución inyectable puede estar compuesta de un líquido o una forma farmacéutica liofilizada en un frasco o vial ámbar, en una ampolleta o en una jeringa previamente llenada. La solución reguladora puede ser L-histidina (1-50 mM), ópticamente 5-10 mM, a un pH de 5.0 a 7.0 (óptimamente, pH 6.0). Otras soluciones reguladoras adecuadas incluyen, pero no se limitan a, succinato de sodio, citrato de sodio, fosfato de sod io o fosfato de potasio. Se puede utilizar cloruro de sodio para modificar la toxicidad de la solución , a una concentración de 0-300 mM (óptimamente, 1 50 mM para una forma farmacéutica l íquida) . Se pueden incluir agentes crioprotectores para las formas farmacéuticas liofilizadas , principalmente de 0 a 1 0% de sacarosa (óptimamente de 0.5 a 1 .0%) . Otros agentes crioprotectores adecuados incluyen la trehalosa y la lactosa. Se pueden incluir agentes de volumen para las formas farmacéuticas liofilizadas, principalmente manitol de 1 a 1 0% (óptimamente, 2-4%) . Es posible emplear estabilizantes en formas farmacéuticas l íquidas y liofilizadas, principalmente L-metionina 1 -50 mM (óptimamente 5-1 0 mM) . Otros agentes de volumen adecuados incluyen la glicina, arginina , que se pueden inclui r en forma de 0-0.05% de polisorbato 80 (óptimamente de 0.005 a 0.01 %) . Algu nos tensoactivos adicionales incluyen , pero no se limitan a polisorbato 20 y tensoactivos BR IJ . Las composiciones de la presente invención pueden prepa rarse en u na variedad de formas. Éstas incluyen , por ejemplo, formas líquidas, semisólidas y sólidas , tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infundibles) , d ispersiones o suspensiones, tabletas, pildoras, polvos, liposomas y supositorios) . La forma preferida depende de la vía de admin istración pretendida y de la aplicación terapéutica . Las composiciones preferidas típicas están en forma de soluciones inyectables o infundibles, tales como composiciones similares a aquéllas utilizadas para la inmunización pasiva de seres humanos con otros anticuerpos. La vía de administración preferida es la parenteral (por ejemplo, intravenosa , subcutánea , intraperitoneal , i ntramuscular). En u na modalidad preferida , el anticuerpo se administra por infusión o inyección intravenosa. En otra modalidad , el anticuerpo se administra por inyección i ntramuscular o subcutánea . Las composiciones terapéuticas, típicamente deben ser estériles y estables bajo las condiciones de manufactura y almacenamiento . La composición se puede formular en forma de solución , microemu lsión , dispersión , liposomas u otras estructu ras ordenadas adecuadas para u na alta concentración de fármaco. Se pueden preparar soluciones inyectables estériles incorporando el compuesto activo (es decir, el anticuerpo o porción de anticuerpo) en la cantidad requerida de u n disolvente apropiada , con uno o una combinación de ingredientes como los anteriormente mencionados, según se requ iera , seguido por una esterilización por filtración . En general , las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un veh ículo estéril que contiene u n med io de dispersión básico y los demás ing redientes req ueridos como los anteriormente mencionados. En el caso de polvos liofilizados estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son la deshidratación al vacío y la deshidratación por aspersión , que producen u n polvo del ingrediente activo más cualquier ing rediente adicional deseado, a partir de u na solución previamente esterilizada por filtración del mismo. La fluidez apropiada de u na solución se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina , manteniendo el tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y med iante el uso de agentes tensoactivos. La absorción prolongada de composiciones inyectables, se puede log rar incluyendo, en la composición , un agente que retrase la absorción , por ejemplo sales de monoestearato y gelatina . Los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la presente invención , se pueden administrar por u na variedad de métodos conocidos en la técnica , aunque pa ra la mayoría de las aplicaciones terapéuticas , las vías/modos de administración preferidos son la inyección subcutánea, inyección o infusión intravenosa. Como observarán los técn icos en la materia, la vía/modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. En ciertas modalidades, el compuesto activo se puede preparar con un veh ículo que protegerá al compuesto contra la l iberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada , incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de distribución microencapsulados. Es posible emplear polímeros biodeg radables , biocompatibles , tales como vinilacetato de etileno, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágena , poliortoésteres y ácido poliláctico . Muchos para la preparación de tales formulaciones, están patentados o son del conocimiento general de los técnicos en la materia . Véase por ejemplo, Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems, J . R. Robinson , ed . , Marcel Dekker, I nc. , Nueva York, 1 978.

En ciertas modalidades , el anticuerpo o porción de anticuerpo de la presente invención se puede administrar por vía oral , por ejemplo con un diluyente inerte o un vehículo comestible asimilable. El compuesto (y los demás ing redientes, si se desea) , también se puede encerrar en una cápsula de gelatina d ura o blanda , se puede comprimir en tabletas o incorpora r d irectamente a la dieta del sujeto. Para administración terapéutica oral , los compuestos se pueden incorpora r con excipiente y utilizar en forma de tabletas ingeribles, tabletas bucales , trociscos, cápsulas, el íxires , suspensiones, jarabes, obleas y similares. Para administrar un compuesto de la invención por una vía diferente de la administración parenteral , pod ría ser necesario recubrir el compuesto o coadministrar el compuesto con un material, para prevenir su inactivación . También es posible incorporar compuestos activos suplementarios en las composiciones. En ciertas modalidades, el anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención se formula y/o se administra concomitantemente con uno o más agentes terapéuticos adicionales que son útiles para el tratamiento de la Enfermedad de Alzheimer o enfermedades o trastornos relacionados. Por ejemplo, uno de los anticuerpos de la presente invención , o porción del mismo, se puede formular y administrar concomitantemente con uno o más anticuerpos adicionales que se u nen a otros blancos. En ciertas modalidades, u n anticuerpo monoclonal de la presente invención o fragmento del mismo, se puede un ir a un vehículo de extensión de vida media conocido en la técnica. Tales vehículos incluyen, pero no se limitan al dominio Fe, polietilenglicol y dextrán. Tales vehículos se describen, por ejemplo, en la Solicitud de Patente Norteamericana No. 09/428,082 y en la Solicitud Internacional de Patente WO 99/25044, las cuales se incorporan en la presente como referencia para cualquier propósito. Además de los procedimientos anteriormente descritos, los practicantes están familiarizados con los materiales estándar que describen las condiciones y procedimientos específicos para la construcción, manipulación y aislamiento de macromoléculas (por ejemplo, moléculas de ADN, plásmidos, etc.), para la generación de organismos recombinantes y la selección y aislamiento de clonas (véanse por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989); Maliga et al., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Prress (1995); Birren et al., Genome Analysis: Detecting Genes, 1, Cold Spring Harbor, Nueva York (1998); Birren et al., Genome Analysis: Analyzing DNA, 2, Cold Spring Harbor, Nueva York (1998); Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, eds. Clark, Springer, Nueva York (1997)). Usos del Anticuerpo Monoclonal Los anticuerpos monoclonales de la presente invención (por ejemplo, 8F5 y 8CF) tienen numerosos usos interesantes. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden utilizar en la prevención, tratamiento y diagnóstico de la Enfermedad de Alzheimer, tal como se describió anteriormente. Además, los anticuerpos se pueden utilizar en el desarrollo de anti-anticuerpos. Además, los hibridomas productores de los respectivos anticuerpos, permiten la producción constante de una fuente continua de anticuerpos monoclonales idénticos (es decir, reactivos) , garantizando de esta manera la identidad entre los anticuerpos utilizados en varios experimentos, así como en usos terapéuticos. Así mismo, los métodos de la presente invención permiten preparar cantidades apropiadas de materias primas para utilizarse en la preparación de otros materiales q ue, a su vez, se pueden utilizar en la producción de anticuerpos monoclonales (u otros anticuerpos) para el tratamiento de la Enfermedad de Alzheimer. Como se mencionó anteriormente , los anticuerpos también se pueden emplear para la inmu nización pasiva, con el fin de prevenir la Enfermedad de Alzheimer u otros trastornos neurológicos relacionados , caracterizados por los mismos síntomas de la Enfermedad de Alzheimer, tales como las alteraciones cognitivas. En una modalidad de diagnóstico de la presente invención , un anticuerpo de la presente invención (por ejemplo 8F5), es revestido en u na fase sólida (o se presenta en una fase l íqu ida) . La muestra de prueba o biológica (por ejemplo, sang re calienta , líquido cefalorraquídeo, suero , etc.) entonces, se pone en contacto con la fase sólida. Si el antígeno (e.g . , globulómero) está presente en la muestra , tales antígenos se unen a los anticuerpos en la fase sólida y después son detectados por un método directo o indirecto . El método directo comprende simplemente detectar la presencia del complejo mismo y por lo tanto la presencia de los antígenos. En el método indirecto, se añade u n conjugado al antígeno u nido. El conjugado comprende un seg undo anticuerpo, que se une al anticuerpo u n ido, y q ue comprende un compuesto o marca generadora de señal . Si el segundo anticuerpo se une al antígeno que ya está unido, el compuesto generador de señal produce una señal med ible. Tal señal indica la presencia del antígeno en la muestra de prueba . Ejemplos de fases sólidas utilizadas en inmunoensayos de diagnóstico, son materiales porosos y no porosos, partículas de látex, partículas mag néticas, micropartículas (véase por ejemplo la Patente Norteamericana No. U .S . 5, 705,330) , cuentas, membranas, pozos para microtitulación y tubos de plástico. La elección del material de fase sólida y el método de marcado del antígeno o anticuerpo presente en el conj ugado, si se desea , se determinan basándose en las características de rendimiento del formato de ensayo deseado. Como se mencionó anteriormente, el conjugado (o reactivo indicador), comprenderá un anticuerpo (o q uizás un anti-anticuerpo, dependiendo del ensayo) , u nido a u n compuesto generador de señal o una marca . Este compuesto generador de señal o "marca" es detectable por sí mismo o puede ser leído con u no o más compuestos adicionales para generar u n producto detectable. Ejemplos de compuestos generadores de señal incluyen agentes cromógenos, radioisótopos (por ejemplo, 125l , , 1 3 l , 32P , 3H , 35S y C) , compuestos quimioluminiscentes (por ejemplo, acridinio) , partículas (visibles o fluorescentes) , ácidos nucleicos, agentes complejantes, o catalizadores tales como enzimas (por ejemplo, fosfatasa alcalina , fosfatasa ácida , peroxidasa de rábano, beta-galactosidasa y ribonucleasa) . En el caso del uso de enzimas (por ejemplo, fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano) , la adición de u n sustrato cromógeno, fluorogénico o luminogénico, dará como resu ltado la generación de una señal detectable. Otros sistemas de detección , tales como la fluorescencia resuelta al tiempo, fluorescencia de reflexión interna , amplificación (por ejemplo, reacción en cadena catalizada con polimerasa) y espectroscopia de Raman , también son útiles. Ejemplos de flu idos biológ icos que se pueden probar mediante los inmu noensayos anteriores, incluyen plasma, sangre completa , sangre completa deshidratada , suero, l íquido cefalorraqu ídeo o extractos acuosos u órgano-acuosos de tejidos y células. La presente invención también abarca un método para detectar la presencia de anticuerpos en una muestra de prueba . Este método comprende los pasos de : (a) poner en contacto la muestra de prueba que se sospecha que contiene anticuerpos , con antianticuerpos específicos contra los anticuerpos que están en la muestra del paciente, por u n tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir la formación de los complejos antianticuerpo/anticuerpo, en donde el anti-anticuerpo es u n anticuerpo de la presente invención q ue se une a un anticuerpo que está en la muestra del paciente; (b) ag regar un conjugado a los complejos antianticuerpo/anticuerpo resultantes, en donde el conjugado comprende un antígeno (que se une al anti-anticuerpo) un ido a u n compuesto generador de señal capaz de detectar una señal detectable; y (d) detectar la presencia de los anticuerpos que pudieran estar presentes en la muestra de prueba , mediante la detección de la señal generada por el compuesto generador de señal . Se puede utilizar u n control o calibrador que comprende u n anticuerpo contra el anti-anticuerpo. La presente invención también incluye una vacu na que comprende uno o más de los anticuerpos aqu í descritos o una porción de los mismos, y un adyuvante farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, adyuvante de Freund o solución salina reg uladora de fosfatos) . También se incluyen paq uetes dentro de los alcances de la presente invención . Más específicamente, la presente invención incluye paquetes para determinar la presencia de antígenos (por ejemplo, globulómeros) en un paciente que se sospecha que padece de la Enfermedad de Alzheimer u otro trastorno caracterizado por alteraciones cog nitivas. En particular, u n paquete para determinar la presencia de antígenos en una muestra de prueba , comprende (a) un anticuerpo como el defin ido en la presente o una porción del mismo; y (b) un conjugado que comprende u n segundo anticuerpo (que tiene especificidad por el antígeno) unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable. El paquete también puede contener u n control o calibrador que comprende un reactivo que se u ne al antígeno, así como una hoja de instrucciones que detalle cómo se debe usar el paquete y los componentes que hay en él. La presente invención también incl uye un paquete para detectar anticuerpos en una muestra de prueba. El paquete puede comprender (a) u n anti-anticuerpo específico (por ejemplo uno de la presente invención) contra el anticuerpo de interés, y b) un antígeno o porción del mismo tal como se defin ió anteriormente. También se puede inclu ir u n control o calibrador q ue comprende u n reactivo q ue se une al antígeno. Más específicamente, el paquete puede comprender a) u n anti-anticuerpo (tal como uno de la presente invención) específico contra el anticuerpo y b) u n conjugado que comprende un antígeno (por ejemplo, globulómero) unido a u n compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable. U na vez más , el paquete también puede comprender u n control o calibrador que comprende un reactivo que se une al antígeno y también puede comprender u n instructivo o inserto que describa cómo se debe usar el paquete y los componentes que hay en él . El paq uete también puede comprender u n recipiente , tal como u n vial , frascos o tiras, en donde cada recipiente tiene una fase sólida previamente preparada , y otros recipientes que contienen los respectivos conjugados. Estos paq uetes también pueden contener viales o recipientes de otros reactivos necesarios para realizar u n ensayo, tales como reactivos de lavado , procesamiento e indicadores. También se deberá observar que la presente invención no sólo incluye los anticuerpos de longitud completa anteriormente descritas, sino que también porciones o fragmentos de los mismos, por ejemplo, la porción Fab de los mismos. Adicionalmente, la presente invención abarca cualquier anticuerpo que tenga las mismas propiedades de los presentes anticuerpos, en términos de, por ejemplo, especificidad de unión, estructura, etcétera. Información de Depósito: El hibridoma (ML5-8F5.1 F2.2A2) que produce el anticuerpo monoclonal 8F5, fue depositado en la Colección Norteamericana de Cultivos Tipo (American Type Culture Collection), 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110, el 1 de diciembre del 2005, bajo los términos del Tratado de Budapest, y se le asignó el No. ATCC PTA-7238. El hibridoma ( L5-8C5.2C .8E6.2D5) que produce el anticuerpo monoclonal 8C5, fue depositado en la Colección Norteamericana de Cultivos Tipo (American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110, el 28 de febrero del 2006, bajo los términos del Tratado de Budapest, y se le asignó el No. ATCC PTA-7407. La presente invención se puede ilustrar mediante el uso de los siguientes Ejemplos no limitantes: EJEMPLO I (a) PRODUCCIÓN DE LOS ANTICUERPOS MONOCLONALES 8F5 Y 8C5 Se inmunizaron ratones Balb/c sub-q con 50 gg de globulómero A-beta (1-42), tal como se describe en Barghorn et al., 2005 J Neurochem, 95, 834-847 en CFA (Sigma) y se reforzaron dos veces a intervalos de un mes. Se colectaron los bazos y las células esplénicas se fusionaron con células de mieloma murino SP2/0 a una relación de 5:1, mediante un procedimiento con PEG. Las células fusionadas se colocaron en placas de 96 pozos en un medio de selección Azaserina/Hipoxantina, a 2x105 células/mL, 200 ml_ por pozo. Las células se dejaron crecer para formar colonias visibles, y los sobrenadantes se evaluaron con respecto a la reactividad del oligómero A-beta, mediante un ensayo de ELISA directo. Los hibridomas que secretaban anticuerpos contra oligomeros A-beta se subclonaron mediante dilución limitante, hasta que la expresión del anticuerpo apareciera estable. EJEMPLO II UNIÓN PREFERENTE DE 8F5 Y 8C5 A PREPARACIONES DEL GLOBULÓMERO, EN COMPARACIÓN CON PREPARACIONES DE MONÓMERO DE ?ß(1-40) Y ABd-42) Para probar la selectividad del anticuerpo 8F5, se utilizaron dos preparaciones del monómero ?ß(1-42) disueltas de manera diferente, así como ?ß(1-40) recién preparada como sustituto de los monómeros. Se llevaron a cabo dos tipos de experimentos. En un primer experimento, el anticuerpo 8F5 fue probado con respecto a la selectividad por el globulómero ?ß, mediante una prueba de ELISA en emparedado con el anticuerpo monoclonal 6G1 derivado de globulómero pero no específico (véase S. Barghorn et al.

J. Neurochemistry, 95:834 (2005)), como anticuerpo de captura. Se empleó el anticuerpo 8F5 biotinado como segundo anticuerpo y anticuerpo selectivo. Este experimento se describe en el Ejemplo 2.1 que se presenta más adelante. En un segundo ejemplo, descrito en el Ejemplo 2.2 que se presenta más adelante, se examinó la selectividad de oligómero versus el monómero ?ß(1-42) y monómero ?ß(1-40), mediante un inmunoensayo de transferencia de manchas (dot blot). En este experimento, el anticuerpo 8F5 exhibió una unión preferente al globulómero ?ß(1-42) (en comparación con un anticuerpo conocido, 4G8, mapeado en una región similar que el 8F5, pero derivado de la inmunización con un péptido lineal ?ß(17-24) (Abcam Ltd., Cambridge, MA)), en comparación con el monómero ?ß(1-42), así como en comparación con el monómero ?ß(1-40). El anticuerpo 8C5 fue probado mediante un protocolo idéntico al 8F5. EJEMPLO 2.1: SELECTIVIDAD DE OLIGÓMERO DE LOS ANTICUERPOS MONOCLONALES 8F5 Y 8C5 a) Preparación del globulómero ?ß(1-42): Se disolvieron 9 mg de ?ß(1-42) Fa. Bachem en 1.5 mL de HFIP (1 ,1 , 1 ,3,3,3-hexafluoro-2-propanol) y se incubó 1.5 horas a 37°C. La solución se evaporó en un aparato SpeedVac y se suspendió en 396 pL de dimetilsulfóxido (DMSO) (solución concentrada de ?ß 5 mM). La muestra se sometió a sonicación durante 20 segundos en un baño de agua sónico, se agitó durante 10 minutos y se almacenó durante una noche a -20°C.

La muestra se diluyó con 4.5 mL de PBS (NaH2P04 20 mM; NaCI 140 mM; pH 7.4) y se agregaron 0.5 mL de solución acuosa de DSS al 2% (0.2% de contenido de DSS). La mezcla se incubó durante 7 horas a 37°C, se diluyó con 16 mL de H20 y se incubó nuevamente durante 16 horas a 37°C. Después de esto, la solución de globulómero ?ß(1-42) se centrifugó durante 20 minutos a 3000g. El sobrenadante se concentró a 0.5 mL en una unidad centriprep de 30 kDa. El concentrado se dializó contra NaH2P04 5 mM; NaCI 35 mM; pH 7.4, toda la noche, a 6°C. Posteriormente, el concentrado de globulómero ?ß(1-42) se centrifugó durante 10 minutos a 10000g. Entonces, el sobrenadante se dividió en alícuotas y se almacenó a -20°C. b) Preparación del monómero ?ß(1-42), pretratado con HFIP: Se disolvieron 3 mg de ?ß(1-42) humano (Bachem Inc.) No. de Cat. H-1368, en 0.5 mL de HFIP (suspensión 6 mg/mL) en un tubo de Eppendorff de 1.7 mL y se agitó (aparato Eppendorff Thermo mixer, 1400 rpm) durante 1.5 horas a 37°C, hasta que se obtuviera una solución transparente. La muestra se secó en un concentrador Speed Vac (1.5 h) y se resuspendió en 13.2 \ L de DMSO, y se agitó durante 10 seg., seguido por una ultrasonificación (20 seg.) y agitación (e.g., en un aparato Eppendorff Thermo mixer, 1400 rpm) durante 10 minutos. Se agregaron 6 mL de NaH2P04 mM; NaCI 140 mM; Pluronic F68 0.1%; pH 7.4 y se agitó durante 1 h a temperatura ambiente. La muestra se centrifugó durante 20 min. a 3000g. El sobrenadante se desechó y el precipitado se disolvió en 0.6 mL de NaH2P04 20 mM; NaCI 140 mM; Pluronic F68 1%; pH 7.4. Se agregaron 3.4 mL de agua y la mezcla se agitó durante 1 h a temperatura ambiente, seguido por 20 min. de centrifugación a 3000g. El sobrenadante se dividió en 8 alícuotas de 0.5 mL y se almacenó a -20°C. c) Preparación del monómero ?ß(1-42) en NH4OH: Se disolvió 1 mg de ?ß(1-42) sólido en polvo (Bachem Inc., No. de Cat. H-1368) en 0.5 mL de NH OH al 0.1% en agua (recién preparado) (2 mg/mL) e inmediatamente se agitó durante 30 seg. a temperatura ambiente, hasta obtener una solución transparente. La mezcla se almacenó a -20°C para su uso posterior. d) Preparación del monómero ?ß(1-40): Se suspendió 1 mg de ?ß(1-40) humano (Bachem Inc.), No. de Cat. H-1194, en 0.25 mL de HFIP (suspensión 4 mg/mL) en un tubo de Eppendorff. El tubo se agitó (por ejemplo en aparato Eppendorff Thermo mixer, 1400 rpm) durante 1.5 horas a 37°C, hasta obtener una solución transparente, y después se secó en un concentrador Speed Vac (1.5 horas). La muestra se redisolvió en 46 µ? de DMSO (solución 21.7 mg/mL), se agitó durante 10 seg., seguido por 20 seg. de ultrasonificación. Después de 10 min. de agitación (por ejemplo, en un aparato Eppendorff Thermo mixer, 1400 rpm), la muestra se almacenó a -20°C para su uso posterior. e) Biotinación del anticuerpo monoclonal murino anti-?ß, 8F5: Se agregaron 500 L del anticuerpo monoclonal anti-?ß murina, 8F5 (0.64 mg/mL) en PBS a 2 µ?_ de una solución Sulfo-NHS-Biotina 20 mg/mL (Pierce Inc., No. de Cat. 21420) recién preparada en agua y se agitó (por ejemplo, en un aparato Eppendorff Thermo mixer, 1400 rpm), durante 30 min., se dializó durante 16 h a 6°C en un tubo de diálisis contra 500 mL de NaPi 20 mM, NaCI 140 mM; pH 7.4. El dializado se almacenó a -20°C para su uso posterior. El anticuerpo 8C5 fue biotinado de la misma manera. f) Prueba de ELISA en Emparedado para muestras de ?ß: g) Lista de reactivos: 1. Placa de 96 pozos F96 Cert. Maxisorp NUNC-lmmuno Píate, No. de Cat.439454 2. Anticuerpo de unión: Anticuerpo monoclonal anti-?ß murina, 6G1, disuelto en PBS; concentración: 0.4 mg/mL; almacenado a -20°C 3. Solución reguladora de recubrimiento: Carbonato ácido de sodio 100 mM, pH 9.6 4. Reactivo de bloqueo para ELISA; Roche Diagnostics GmbH No. de Cat.: 1112589 5. Solución reguladora PBST: NaH2P0420 mM, NaCI 140 mM, Tween 20 al 0.05%, pH 7.4 6. Albúmina bovina fracción V, libre de proteasa; Serva No. de Cat.: 11926.03; almacenar a 4°C 7. Solución reguladora PBST + 0.5% de ASB: NaH2P0420 mM, NaCI 140 mM; Tween 20 al 0.05%, pH 7.4 + ASB 0.5% 8. Solución estándar concentrada de globulómero ?ß(1-42): Solución en NaH2P04 5 mM; NaCI 35 mM; pH 7.4; concentración: 10.77 mg/mL; almacenar a -20°C 9. Solución estándar concentrada de monomero ?ß(1-42) tratado con HFIP: Solución en NaH2P043 mM; NaCI 21 mM; Pluronic F68 0.15%; pH 7.4; concentración: 0.45 mg/mL; almacenar a -20°C 10. Solución estándar concentrada de monomero ?ß(1-42) en NH OH; solución en NH4OH al 0.1%, concentración: 2 mg/mL; almacenar a -20°C 11. Solución estándar concentrada de monomero ?ß(1-40) tratado con HFIP; solución en DMSO; concentración: 21.7 mg/mL; almacenar a -20°C 12. Anticuerpo monoclonal anti-?ß murina biotinado 8F5; solución en PBS; concentración: 0.24 mg/mL; almacenar a -80°C 13. Conjugado estreptavidina-POD; Fa. Roche No. de Cat.: 14. Tinción: TMB; Roche Diagnostics GmbH No. de Cat.: 92817060; 42 mM en DMSO; H202 al 3% en agua; acetato de sodio 10 mM, pH 4.9 15. Detener la tinción agregando una solución de ácido sulfónico 2M Preparación de los reactivos: Se utilizó el siguiente protocolo: 1. Anticuerpo de unión Descongelar la solución concentrada de anticuerpo monoclonal 6G1 y diluir 1:400 en solución reguladora de recubrimiento. 2. Reactivo bloqueador: Disolver el reactivo bloqueador en 100 mL de agua para preparar la solución concentrada de bloqueo y almacénense las alícuotas de 10 mL a -20°C. Diluir 3 mL de solución concentrada de bloqueo con 27 mL de agua por cada placa que va a ser bloqueada. 3. Soluciones estándar de ?ß: a) globulómero ?ß(1-42) agregar 1 pL de solución estándar concentrada de globulómero ?ß(1-42) a 1076 pL de PBST + 0.5% de ASB = 10 pg/mL agregar 50 pL de solución estándar de globulómero ?ß(1-42) 10 pg/mL, a 4950 pL de PBST + 0.5% de ASB = 100 ng/mL b) monómero ?ß(1-42) tratado con HFIP agregar 10 µ?_ de solución estándar concentrada de monomero ?ß(1-42) pretratado con HFIP a 440 µ?_ de PBST + 0.5% de ASB = 10 g/mL agregar 50 µ?_ de solución estándar de monomero ?ß(1-42) pretratado con HFIP a 4950 µ?_ de PBST + 0.5% de ASB = 100 ng/mL monomero ?ß(1-42) en NH4OH agregar 5 µ?_ de monomero ?ß(1-42) en solución estándar concentrada de NH OH a 995 µ?_ de PBST + 0.5% de ASB = 10 pg/mL agregar 50 µ?. de monomero en solución estándar de NH4OH 10 µg/mL a 4950 µ?_ de PBST + 0.5% de ASB = 100 ng/mL monomero ?ß(1-40) pretratado con HFIP agregar 1 µ?_ de solución estándar concentrada de monomero ?ß(1-40) pretratada con HFIP a 49 µ?_ de PBST + 0.5% de ASB = 430 µg/mL agregar 10 µ?_ de solución estándar de monomero ?ß(1-40) pretratada con HFIP 430 µg/mL a 420 µ?_ de PBST + 0.5% de ASB = 10 g/mL agregar 50 µ?_ de solución estándar de monomero ?ß(1-40) pretratado con HFIP 10 µg/mL a 4950 µ?_ de PBST + 0.5% de ASB = 100 ng/mL Curvas estándar: No. Concentrado PBST + 0.5% de ASB Concentración final 1 2mL S 0 mL 100 ng/mL 2 0.633 mL (1) 1.367 mL 31.6 ng/mL 3 0.633 mL (2) 1.367 mL 10 ng/mL 4 0.633 mL (3) 1.367 mL 3.16 ng/mL 5 0.633 mL (4) 1.367 mL 1 ng/mL 6 0.633 mL (5) 1.367 mL 0.32 ng/mL 7 0.633 mL (6) 1.367 mL 0.1 ng/mL 1. Anticuerpo primario: anticuerpo monoclonal 8F5 biotinado: El anticuerpo monoclonal anti-?ß, 8F5 biotinado concentrado se diluyó en PBST + 0.5% de ASB-solución reguladora. El factor de dilución fue 1/1200 = 0.2 g/mL. El anticuerpo se utilizó de inmediato. 2. Reactivo de Marca: Reconstituir liofilizado de conjugado de estreptavidina-POD en 0.5 mL de agua. Agregar 500 pL de glicerol y almacenar alícuotas de 100 pL a -20°C para su uso posterior. Diluir el reactivo marcado concentrado en Solución reguladora PBST. El factor de dilución es 1/10000. Utilícese de inmediato. 3. Solución de Tinción TMB: Mezcle 20 mL de acetato de sodio 100 mM, pH 4.9, con 200 pL de la solución TMB y 29.5 pL de solución de peróxido al 3%. Utilícese de inmediato. Preparación de las Placas de Muestra: (nótese que todos os estándares se procesaron por duplicado).

Procedimiento Utilizado: 1. Aplique 100 µ? de solución de anticuerpo monoclonal anti-?ß 6G1 por pozo e incube durante una noche a 4°C. 2. Deseche la solución de anticuerpo y lave los pozos con 250 µ?_ de Solución reguladora PBST, tres veces. 3. Agregue 260 µ?_ de solución de bloqueo por pozo e incube durante 2 horas a temperatura ambiente. 4. Deseche la solución de bloqueo y lave los pozos con 250 µ?_ de Solución reguladora PBST, tres veces. 5. Después de la preparación de los estándares, aplique 100 µ?_ por pozo de estándares a la placa. Incube 2 h a temperatura ambiente y durante una noche a 4°C. 6. Deseche la solución estándar y lave los pozos con 250 µ?_ de Solución reguladora PBST, tres veces. 7. Agregue 200 µ?_ de solución de anticuerpo primario biotinado 8F5 por pozo e incube durante 1.5 h a temperatura ambiente. 8. Deseche la solución de anticuerpo y lave los pozos con 250 µ?_ de Solución reguladora PBST, tres veces. 9. Añada 200 µ?_ de solución de marcado por pozo e incube durante 1 h a temperatura ambiente. 10. Deseche la solución de marcado y lave los pozos con 250 µ?. de Solución reguladora PBST, tres veces. 11. Agregue 100 µ?_ de solución TMB a cada pozo e incube a temperatura ambiente (5-15 minutos). 12. Observe la tinción y aplique 50 pL de Solución de Paro por pozo, después de haber comenzado la tinción de fondo. 13. Léase bajo luz UV a 450 nm. 14. Calcule los resultados a partir de la curva estándar. 15. Evaluación. Los resultados se muestran en la Figura 1 para el anticuerpo 8F5 y en la Fig. 8 para el anticuerpo 8C5. Los valores de log CE50 son significativamente más bajos para el antígeno globulómero ?ß(1-42) (1.958), en comparación con los valores reducidos para dos diferentes monómeros de ?ß(1-42) preparados (2.745 y 3.003, respectivamente) y el monómero ?ß(1-40) (2.825). Estos datos indican una selectividad aproximadamente 10 veces mayor del anticuerpo 8F5 por el globulómero ?ß(1-42) versus el monómero ?ß(1-42). Se obtuvieron resultados casi idénticos con el anticuerpo 8C5, y se muestran en la Figura 8. EJEMPLO 2.2: SELECTIVIDAD DE OLIGÓMERO DE LOS ANTICUERPOS MONOCLONALES 8F5 Y 8C5 Discriminación del monómero ?ß contra el globulómero ?ß por el método de transferencia de manchas (dot blot): Comparación de los anticuerpos monoclonales 8F5 y 8C5 versus el 4G8. Se prepararon diluciones en serie del globulómero ?ß(1-42), monómero ?ß1-42 y monómero ?ß1-40 en el rango de 100 pmol/pL a 0.01 pmol/pL, en PBS. De tal muestra, se aplicó 1 pL en una membrana de nitrocelulosa . Los anticuerpos monoclonales murinos 4G8 y 8F5 (0.2 pg/mL) se utilizaron para la detección con un anticuerpo anti-lgG mu rina acoplado con fosfatasa alcalina como anticuerpo secundario y el reactivo de tinción N BT/BCI P (Roche Diagnostics, Mannheim) . La señal de detección fue analizada en su intensidad (densidad reflectiva = DR) mediante u n densitómetro (BS 800, Biorad , Hercules, CA, EUA) a una concentración de antígeno de 10 pmol . A esta concentración para cualq uier forma de ?ß, la densidad reflectiva medida estuvo dentro del rango lineal de detección del densitómetro. El otro anticuerpo, 8C5, se utilizó en un protocolo análogo. Los resultados se muestran en la Tabla 1 que se presenta a continuación : Tabla 1 : Discriminación de anticuerpo anti-?ß de monómero ?ß1 -40 y monómero ?ß1 -42. La discriminación se calculó como la relación de señal detectada de globulómero ?ß1 -42 y monómero ?ß1 -42 respectivamente, con respecto a monómero ?ß1 -40.

En particular, los resultados anteriores indican que los anticuerpos 8F5 y 8C5 muestran un perfil de unión diferente en comparación con el anticuerpo anti-A (1 -42) disponible en el comercio, 4G8, el cual se ubica en el mapa en ?ß(17-24) (es decir, una secuencia lineal). Más específicamente, los anticuerpos 8F5 y 8C5 demuestran una preferencia por unirse al globulómero versus monómero ?ß42 (véase la columna 4; compare 1.4 versus 1), así como una preferencia por unirse al globulómero versus ?ß40 (columna 5; compare 16.9 versus 4.2). Estas dos selectividades de unión mejoradas con respecto al estándar 4G8, dan como resultado la producción de menos efectos secundarios después del uso de los anticuerpos 8F5 y/u 8C5, tal como se describió anteriormente (e.g., unión de placas). EJEMPLO III UNIÓN DE LOS ANTICUERPOS 8F5 Y 8C5 A FIBRILLAS DE ABM-42) Como el anticuerpo 8F5 fue generado contra globulómeros solubles, se formuló la hipótesis de que el anticuerpo 8F5 no se debería unir a material depositado en placa o a fibrillas. Por lo tanto, se probó la unión del anticuerpo 8F5 a suspensiones de fibrillas de ?ß polimerizadas, de la manera descrita en el siguiente ejemplo: Preparación de fibrillas de ?ß(1-42): Se disolvió 1 mg de ?ß(1-42) (Bachem Inc., No. de Catálogo: H-1368) en 500 pL de una solución acuosa de NH4OH al 0.1% (tubo de Eppenderoff), y la muestra se agitó durante 1 min. a temperatura ambiente, seguido por 5 min. de centrifugación a 10000 g. El sobrenadante fue pipeteado a un nuevo tupo de Eppendorff, y la concentración de ?ß(1-42) se midió según el ensayo de concentración de proteína de Bradford (BIO-RAD Inc., procedimiento de ensayo). De esta solución de ?ß(1-42) recién preparada, se neutralizaron 100 µ?_ con 300 µ?_ de NaH2P04 20 mM, NaCI 140 mM¡ pH 7.4, seguido por la adición de HCI al 2% para ajusfar el pH a 7.4. La muestra se incubó durante otras 20 horas a 37°C y se centrifugó (10 min., 10000g). El sobrenadante se desechó y la pella de fibrillas se resuspendió en 400 pL de NaH2P0420 mM; NaCI 140 mM; pH 7.4, agitando durante 1 min. en una mezcladora Vórtex, seguido por centrifugación (10 min., 10000g). Después de desechar el sobrenadante, este procedimiento de resuspensión se repitió, y la suspensión final de fibrillas se sometió a otra centrifugación (10 min., 10000g). El sobrenadante, una vez más, fue desechado y la pella final se resuspendió en 380 pL de NaH2P0420 mM; NaCI 140 mM, pH 7.4, agitando durante 1 min. en una mezcladora Vórtex. El material se dividió en alícuotas, las cuales se almacenaron a -20°C en un congelador. Se mezclaron 80 pL de suspensión de fibrillas con 320 pL de NaH2P04 20 mM; NaCI 140 mM; Tween 20 al 0.05%; pH 7.4, solución amortiguadora y se agitó durante 5 min. a temperatura ambiente, seguido por una sonicación (20 segundos). Después de centrifugar (10 min., 10000 g), la pella se resuspendió en 190 pL de NaH2P0420 mM; NaCI 140 mM; Tween 20 al 0.05%; pH 7.4, agitando en una mezcladora Vórtex. Unión de los Anticuerpos a fibrillas de ?ß(1-42) Alícuotas de 10 µ?_ de esta suspensión de fibrillas, se incubaron con: a) 10 µ?_ de NaPi 20 mM; NaCM40 mM; pH 7.4 b) 10 µ?_ de anticuerpo monoclonal 6E100.1 pg/pL, Signet Inc. Cat. #9320 en 20 mM c) NaH2P04; NaCI 140 mM; pH 7.4 d) 10 µ?_ de anticuerpo monoclonal 4G8 0.1 pg/pL, Signet Inc. Cat. # 9220 en NaPi 20 mM; NaCI 140 mM; pH 7.4 e) 10 µ?_ de anticuerpo monoclonal 8F5 (8C5) 0.1 pg/pL en NaPi 20 mM; NaCI 140 mM; pH 7.4 Las muestras se incubaron durante 20 h a 378°C. Finalmente, las muestras se centrifugaron (10 min. a 10000g). Los sobrenadantes que contenían la fracción de anticuerpo no unida, se colectaron y se mezclaron con 20 pL de solución reguladora de muestra de EGPA-DSS. Las pellas se lavaron con 50 pL de solución reguladora de NaH2P04 20 mM; NaCI 140 mM; pH 7.4, agitando 1 min. en una mezcladora Vórtex, seguido por centrifugación (10 min., 10000g). Las pellas finales se resuspendieron en 20 pL de solución reguladora de NaPi 20 mM; NaCI 140 mM; Tween 20 al 0.05%; pH 7.4 y se disolvió en 20 pL de solución reguladora de EGPA-DSS. - Análisis de EGPA-DSS Los sobrenadantes y muestras de pellas resuspendidas se calentaron durante 5 min. a 98°C y se aplicaron en un Gel 4-20% Tris/Glicina, bajo las siguientes condiciones: Solución reguladora de muestra-DSS: 0.3 g de DSS; 0.77 g de DTT; 4 ml_ de Tris 1M/HCI, pH 6.8; 8 mL de glicerol; 1 ml_ de azul de bromofenol al 1% en etanol; agregar agua hasta 50 mL. Gel 4-20% Tris/Glicina: Invitrogen Inc., No.: EC6025BOX Solución reguladora de corrida: 7.5 g de Tris; 36 g de glicina; 2.5 g de DSS; agregar agua hasta 2.5 L La PAJE se realizó a 20 mA. Los geles se tiñeron con azul de Coomassie R250. Resultados: La tinción con azul de Coomassie de la EGPA-DSS indicó la presencia de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos, predominantemente en el sobrenadante de la suspensión de fibrillas (carril 7, Figura 2), el resto de la suspensión de fibrillas mostró muy poco material de anticuerpo, mientras que también mostró ?ß parcialmente despolimerizado a 4.5 kDa. En contraste a los anticuerpos 8F5 y 8C5, los otros anticuerpos anti-?ß no se encontraron en la fracción soluble (6E10, carril 3, Figura 2) o sólo parcialmente (4G8, carril 5, Figura 2), en comparación con la fracción unida a fibrillas (carril 6, Figura 2). La unión relativa a fibrillas tipo ?ß se evaluó a partir del análisis de EGPA-DSS, midiendo los valores de Densidad Reflectiva de la cadena pesada de los anticuerpos en la fracción unida a fibrillas y en la fracción de sobrenadante, y se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula: Fracción de anticuerpo unido a fibrillas 100%/(DRfracc¡ón fibrilla + D Rfracción sobrenadante) ¦ Se obtuvieron los siguientes valores Estos datos indican una reducción significativa de la unión de 8F5 y 8C5, en comparación con el anticuerpo estándar 6E10. EJEMPLO IV UNIÓN PREFERENTE DE GLOBULÓMEROS DE ???-42) ENDÓGENOS. EN COMPARACIÓN CON ABM-40) Basándose en el concepto de oligómero de ?ß, es importante que los anticuerpos anti-oligómero ?ß también puedan demostrar una unión preferente por los oligómeros ?ß(1-42) in vivo, en particular, sobre ?ß(1-40) en Alteraciones Cognitivas Leves y pacientes con EA. El concepto de disminuir la especie ?ß(1-42) con respecto a la ?ß(1-40), se utiliza en un enfoque terapéutico para el tratamiento de la EA con Fármacos Antiinflamatorios No Esteroides FAINEs (Weggen et al., Nature 414, 212-216 (2001)). Se supone que los FAINEs que disminuye la ?ß(1-42) en relación con la ?ß(1-40), muestran una mejor eficacia en el tratamiento de la Enfermedad de Alzheimer. La relación ?ß(1 -42)/?ß(1 -40) es importante para los propósitos de una terapia selectiva, así como para diagnóstico. Se llevó a cabo un análisis con muestras de LCR de pacientes con Enfermedad de Alzheimer y pacientes con ACL. A partir de los resultados mostrados en la Figura 3 y que se describen a continuación, puede concluirse que el anticuerpo 8F5 tiene una mayor ventaja sobre los anticuerpos contra ?ß como el 6E10, debido a que el 8F5 detecta una mayor relación de ?ß(1-42) con respecto a ?ß(1-40) que forma menos agregados. Esta ventaja permitirá diagnosticar con mayor selectividad y neutralizar oligómeros de tipo ?ß(1-42) en pacientes con ACL y EA. A) NIVELES DE AMILOIDE Bd-42) Y AMILOIDE 6(1-40) ENDÓGENOS EN LCR DE PACIENTES CON ACL Y EA. DESPUÉS DE INMUNOPRECIPITACIÓN CON EL ANTICUERPO MONOCLONAL 8F5 ANTI-AB MURINO SELECTIVO DE OLIGÓMERO: Inmovilización de los anticuerpos monoclonales anti-?ß en Sefarosa 4B activada con CNBr: a) Anticuerpo monoclonal 6E10 Signet Inc., No. de Cat. 9320 b) Anticuerpo monoclonal 8F5 Se agregaron 0.4 g de Sefarosa 4B activada con CNBr (Amersham Pharmacia Bio-Tech AB, Uppsala, Suecia, Inc., No.: 17-0430-01) a 10 mL de HCI 1 mM acuoso y se incubó durante 30 min. a temperatura ambiente. La Sefarosa 4B activada con CNBr se lavó tres veces con 10 mL de HCI 1 mM y dos veces con 10 mL de NaHC03 100 mM; NaCI 500 mM; pH 8.3. Para cada uno de los anticuerpos inmovilizados, se agregaron 100 µ?_ de Matriz de Sefarosa 4B activada con CNBr a 950 µ? de solución de anticuerpo monoclonal anti-?ß 0.5 mg/mL, en NaHC03 100 mM; NaCI 500 mM; pH 8.3. Después de 2 horas de agitación a temperatura ambiente, las muestras se centrifugaron durante 5 min. 10000g. Después, se agregaron 500 µ?. de solución reguladora de etanolamina 100 mM; NaHC03 100 mM; NaCI 50 mM; pH 8.3, a las cuentas y las muestras se agitaron durante 1 h a temperatura ambiente. Las muestras de anticuerpo monoclonal anti-Ap-Sefarosa se centrifugaron durante 5 min. a 10000g y se lavaron 5 veces con 500 µ?_ de solución reguladora NaH2P04 20 mM; NaCI 140 mM; pH 7.4. Antes de almacenar a 6°C, las muestras se estabilizaron agregando azida de sodio a una concentración final de 0.02%. Inmunoprecipitación: a) Anticuerpo monoclonal 6E10-Sefarosa b) Anticuerpo monoclonal 8F5-Sefarosa Se diluyeron 200 µ?_ de Líquido Cefalorraquídeo humano con 200 ÍL de solución reguladora NaH2P04 20 mM; NaCI 140 mM; Tween 20 al 0.05%; pH 7.4. Estas muestras fueron agregadas a 2 pL de Matriz de Sefarosa-anticuerpo monoclonal anti-?ß y se agitó durante 2 h a temperatura ambiente. Las muestras se centrifugaron durante 5 min. a 10000g. Los sobrenadantes se desecharon y el anticuerpo monoclonal anti-Ap-Sefarosa se lavó dos veces con 50 µ? de PBS, se agitó durante 1 min. y se centrifugó (5 min. a 10000g). Los sobrenadantes se desecharon y las cuentas se Sefarosa entonces se suspendieron en 50 µ?_ de solución reguladora NaH2P04 2 mM¡ NaCI 14 mM, pH 7.4, seguido por 1 min. de agitación a temperatura ambiente y 5 min. de centrifugación a 10000g. En un paso siguiente, las cuentas se anticuerpo monoclonal anti-?ß-Sefarosa, se trataron con 50 µ?_ de CH3CN 50%; TFA 0.2%, en agua. Después de agitar durante 10 min. a temperatura ambiente, las muestras se centrifugaron durante 5 min. a 10000g. Los sobrenadantes se colectaron y se transfirieron a tubos de Eppendorff de 1.5 ml_. Las muestras se mezclaron con 50 L de agua y se evaporaron en un concentrador Speed Vac. La pella se redisolvió en 4 L de HCOOH al 70%, se agitó durante 10 min. a temperatura ambiente y se neutralizó con 76 µ? de solución Tris 1M y 720 µ? de solución reguladora NaH2P04 20 mM; NaCI 140 mM; Tween 20 al 0.05%; pH 7.4. Muestras para la Determinación de Formas Monoméricas de ABd-40); (1-42) en LCR: a) Contenido de ?ß en muestras de LCR sin inmunoprecipitación: Se diluyeron 158 \ L de LCR con 342 iL de NaH2P04 20 mM; NaCI 140 mM; Tween 20 al 0.05%; pH 7.4. Esta dilución 1:3.16 se tomó para el ensayo de ELISA en emparedado y se tomó en cuenta durante la evaluación. b) Contenido de ?ß en muestras de LCR después de la inmunoprecipitación: Las muestras del procedimiento anteriormente mencionado, se tomaron para análisis. Protocolo de ELISA en Emparedado Utilizado para la Determinación de ???-40) en LCR Lista de Reactivos: 1. Placa de 96 pozos F96 Cert. Maxisorp NUNC-lmmuno Píate, No. de Cat.439454 2. Anticuerpo de unión Anticuerpo monoclonal anti-?ß, clona 6E10; Signet, No. de Cat. 9320; concentración: 0.4 mg/mL, Bradford (BioRad); almacénese a -20°C 3. Solución reguladora de acoplamiento: Carbonato ácido de sodio 100 mM; pH 9.6 4. Reactivo de bloqueo para ELISA; Roche Diagnostics GmbH No. de Cat.: 11 2589 5. Solución reguladora PBST: NaH2P0420 mM, NaCI 140 mM, Tween 20 al 0.05%, pH 7.4 6. Estándar de ?ß(1-40): ?ß(1-40) sólido en polvo; Bachem No. de Cat.: H- 194; almacenar a -20°C 7. Anticuerpo Primario: Anticuerpo policlonal de conejo anti-Ap(1 -40); purificado por afinidad; solución en PBS; concentración: 0.039 mg/mL; Signet No. de Cat. 9130-005; almacenar a -20°C 8. Reactivo de marca: Conjugado anti-conejo-POD; Fa. Jackson ImmunoResearch No. de Cat.: 111-036-045; 9. Tinción: TMB; Roche Diagnostics GmbH No. de Cat. 92817060; 42 mM en DMSO; H202 al 3% en agua; acetato de sodio 100 mM; pH 4.9 10. Solución de paro, ácido sulfónico 2M Protocolos Utilizados para la Preparación de los Reactivos: Preparación de los reactivos: 1. Anticuerpo de unión Anticuerpo monoclonal anti-?ß, 6E10 (Signet Inc., Catálogo # 9320) se diluye hasta una concentración final de 0.7 pg/mL. 2. Reactivo de bloqueo: Para la preparación de la solución concentrada de bloqueo, el reactivo de bloqueo se disuelve en 100 mL de H20 y se almacena a -20°C, en alícuotas de 10 mL cada una. Se diluyen 3 mL de la solución concentrada de bloqueo con 27 mL de H20 para bloquear una placa de ELISA. 3. Monómero ?ß(1-40) de la dilución estándar: A) Solución estándar concentrada de monómero ?ß(1- 40): disuelva 0.5 mg de ?ß(1-40) en 250 µ? de NH4OH al 0.1%, concentración: 2 mg/mL; recién preparado; utilícese de inmediato. B) Agregue 5 µ?_ de solución estándar concentrada de monómero ?ß(1-40) a 995 µ?_ de PBST = 10 pg/ml C) Agregue 5 µ?_ de solución estándar de monómero ?ß(1-40) 10 µg/mL, a 4995 µ?_ de PBST = 10 ng/mL Curva estándar: No. Concentrado PBST Concentración final 1 2 mL B 0 mL 10000 pg/mL 2 0.633 mL (1) 1.367 mL 3160 pg/mL 3 0.633 mL (2) 1.367 mL 1000 pg/mL 4 0.633 mL (3) 1.367 mL 316 pg/mL 5 0.633 mL (4) 1.367 mL 100 pg/mL 6 0.633 mL (5) 1.367 mL 31.6 pg/mL 7 0.633 mL (6) 1.367 mL 10 pg/mL 8 0 mL 2 mL 0.0 pg/mL Muestras: IP: Muestras de inmunoprecipitado No. Muestras PBST Factor de dilución 1 0.4 mL IP 0 mL directamente 2 0.1 mL (1) 0.4 mL 1:5 3 0.1 mL (2) 0.4 mL 1:25 4 0.1 mL (3) 0.4 mi 1:125 4. Anticuerpo primario: Diluya el anticuerpo policlonal anti-Ap(1 -40) concentrado en solución reguladora de PBST. El factor de dilución es 1/200 = 0.2 pg/mL. Utilícese de inmediato. 5. Anticuerpo secundario: Se disuelve conjugado anti-conejo-POD liofilizado en 0.5 mL de H20 y se mezcla con 500 pL de glicerol. El anticuerpo concentrado, entonces, se almacena a -20°C en alícuotas de 100 pL. El concentrado se diluye 1:10,000 en solución reguladora PBST. La solución de anticuerpo se utiliza de inmediato. 6. Solución de TMB: Mezcle 20 mL de acetato de sodio 100 mM, pH 4.9, con 200 pL de la solución TMB y 29.5 µ?_ de peróxido de hidrógeno al 3%. Esta solución se utiliza de inmediato. Preparación de las Placas de Muestra: (nótese que todos los estándares y las muestras se corren por duplicado).

U1-U# = muestras desconocidas Procedimiento Utilizado: 1. Aplique 100 µ?_ de solución de anticuerpo de unión por pozo e incube durante una noche a 4°C. 2. Deseche la solución de anticuerpo y lave los pozos con 250 pL de Solución reguladora PBST, tres veces. 3. Agregue 260 µ?_ de solución de bloqueo por pozo e incube durante 2 horas a temperatura ambiente. 4. Deseche la solución de bloqueo y lave los pozos con 250 pL de Solución reguladora PBST, tres veces. 5. Después de la preparación de los estándares y las muestras, aplique 100 µ!_ por pozo de estándares y muestras a la placa e incube durante 2 h a temperatura ambiente y durante una noche a 4°C. 6. Deseche la solución estándar/muestra y lave los pozos con 250 µ?_ de Solución reguladora PBST, tres veces. 7. Agregue 200 µ?_ de solución de anticuerpo primario por pozo e incube durante 1.5 h a temperatura ambiente. 8. Deseche la solución de anticuerpo y lave los pozos con 250 µ?_ de Solución reguladora PBST, tres veces. 9. Añada 200 µ?_ de solución de marcado por pozo e incube durante 1 h a temperatura ambiente. 10. Deseche la solución de marcado y lave los pozos con 250 µ?_ de Solución reguladora PBST, tres veces. 11. Agregue 100 µ?_ de solución TMB a cada pozo e incube a temperatura ambiente (5-15 minutos). 12. Observe el desarrollo del color y aplique 50 µ?_ de Solución de Paro por pozo. 13. Haga lecturas a 450 nm. 14. Calcule los resultados a partir de la curva estándar. 15. Evaluación: Si la extinción de muestras desconocidas no está en el rango de linearidad de la curva de calibración, repita la prueba de ELISA con la dilución apropiada de la muestra. Protocolo de ELISA en Emparedado Utilizado para la Determinación del Monómero ABd-42) en LCR Lista de Reactivos: 1. Placa de 96 pozos F96 Cert. Maxisorp NUNC-lmmuno Píate, No. de Cat.439454 2. Anticuerpo de unión Anticuerpo monoclonal anti-?ß, clona 6E10; Signet, No. de Cat. 9320; concentración: 0.4 mg/mL, Bradford (BioRad); almacénese a -20°C 3. Solución de revestimiento: Carbonato ácido de sodio 100 mM; pH 9.6 4. Reactivo de bloqueo para ELISA; Roche Diagnostics GmbH No. de Cat.: 1112589 5. Solución reguladora PBST: NaH2P0420 mM, NaCI 140 mM, Tween 20 al 0.05%, pH 7.4 6. Estándar de ?ß(1-42): ?ß(1-42) sólido en polvo; Bachem No. de Cat.: H-1368; almacenar a -20°C 7. Anticuerpo Primario: Anticuerpo policlonal de conejo anti-Ap(1-42); purificado por afinidad; biotinado; solución en PBS con 50% de glicerol; concentración: 0.25 mg/mL; Signet No. de Cat.9137-005; almacenar a -20°C 8. Reactivo de marca: Conjugado anti-conejo-POD; Fa. Jackson ImmunoResearch No. de Cat.: 111-036-045; 9. Tinción: TMB; Roche Diagnostics GmbH No. de Cat. 92817060; 42 mM en DMSO; H202 al 3% en agua; acetato de sodio 100 mM; pH 4.9 Solución de paro, ácido sulfónico 2M Método Utilizado en la Preparación de los Reactivos: Preparación de los reactivos: 1. Anticuerpo de unión Diluya el anticuerpo monoclonal anti-?ß, clona 6E10, 1:400 en solución reguladora de revestimiento. 2. Reactivo de bloqueo: Disuelva el reactivo de bloqueo en 100 mL de agua, para preparar la solución concentrada de bloqueo, y almacene alícuotas de 10 mL a -20°C. Diluya 3 mL de la solución concentrada de bloqueo con 27 mL de agua por cada placa por bloquear. 3. Monómero ?ß(1-42), dilución estándar: Solución estándar concentrada de monómero ?ß(1-42): disuelva 0.5 mg de ?ß(1-42) en 250 µ? de NH4OH al 0.1%; concentración: 2 mg/mL; recién preparado; utilícese de inmediato. Agregue 5 µ? de solución estándar concentrada de monomero ?ß(1-42) a 995 µ?_ de PBST = 10 Mg/mL Agregue 5 µ?_ de solución estándar de monomero ?ß(1 42) 10 Mg/mL, a 4995 pL de PBST = 10 ng/mL Curva estándar: No. Concentrado PBST Concentración final 1 2 mL B 0 mL 10000 pg/mL 2 0.633 mL (1) 1.367 mL 3160 pg/mL 3 0.633 mL (2) 1.367 mL 1000 pg/mL 4 0.633 mL (3) 1.367 mL 316 pg/mL 5 0.633 mL (4) 1.367 mL 100 pg/mL 6 0.633 mL (5) 1.367 mL 31.6 pg/mL 7 0.633 mL (6) 1.367 mL 10 pg/mL 8 0 mL 2 mL 0.0 pg/mL Muestras: IP: Muestras de ¡nmunoprecipitado No. Muestras Factor de dilución 1 0.4 ml_ IP directamente 2 0.1 ml_ (1) 1:5 3 0.1 ml_ (2) 1:25 4 0.1 ml_ (3) 1:125 Procedimiento utilizado: 1. Anticuerpo primario: Diluya el anticuerpo policlonal anti-Ap(1 -42) concentrado en solución reguladora PBST. El factor de dilución es 1/1250 = 0.2 g/mL. Utilícese de inmediato. 2. Reactivo de Marcado: Reconstituya el conjugado anti-conejo-POD liofilizado en 0.5 mL de agua. Agregue 500 µ?_ de glicerol y almacene alícuotas de 100 µ?_ a -20°C para su uso posterior. Diluya el reactivo de marcado concentrado con solución reguladora PBST. El factor de dilución es 1/5000. Utilícese de inmediato. 3. Solución de TMB: Mezcle 20 mL de acetato de sodio 100 mM, pH 4.9, con 200 µ?_ de la solución TMB y 29.5 µ?_ de peróxido de hidrógeno al 3%. Utilícese de inmediato. Preparación de las Placas de Muestra: (nótese que todos los estándares y las muestras se corren por duplicado).

U1-U# = muestras desconocidas Procedimiento Utilizado: 1. Aplique 100 µ?_ de solución de anticuerpo de unión por pozo e incube durante una noche a 4°C. 2. Deseche la solución de anticuerpo y lave los pozos con 250 µ?_ de solución reguladora PBST, tres veces. 3. Agregue 260 µ?_ de solución de bloqueo por pozo e incube durante 2 horas a temperatura ambiente. 4. Deseche la solución de bloqueo y lave los pozos con 250 iL de solución reguladora PBST, tres veces. 5. Después de la preparación de los estándares y las muestras, aplique 100 µ?_ por pozo de estándares y muestras a la placa. Incube durante 2 h a temperatura ambiente y durante una noche a 4°C. 6. Deseche la solución estándar/muestra y lave los pozos con 250 µ?_ de solución reguladora PBST, tres veces. 7. Agregue 200 µ?_ de solución de anticuerpo primario por pozo e incube durante 1.5 h a temperatura ambiente. 8. Deseche la solución de anticuerpo y lave los pozos con 250 µ?_ de Solución reguladora PBST, tres veces. 9. Añada 200 µ?_ de solución de marcado por pozo e incube durante 1 h a temperatura ambiente. 10. Deseche la solución de marcado y lave los pozos con 250 µ?_ de Solución reguladora PBST, tres veces. 11. Agregue 100 µ? de solución TMB a cada pozo e incube a temperatura ambiente (5-15 minutos). 12. Observe el desarrollo del color y aplique 50 µ?_ de Solución de Paro por pozo. 13. Haga lecturas a 450 nm. 14. Calcule los resultados a partir de la curva estándar.

. Evaluación: Si la extinción de las muestras desconocidas no está en el rango de linearidad de la curva de calibración , repita la prueba de ELISA con la dilución apropiada de la muestra . RESU LTADOS : Los resultados anteriores indican lo sig uiente: a. Un anticuerpo preferencial de globulomero como el 8F5 (u 8C5) en comparación con un anticuerpo no selectivo de globulomero como el 6E1 0, se une preferentemente a ?ß42 en comparación con ?ß40, independientemente del estado de la enfermedad . Este resultado indica un tratamiento exitoso para la Enfermedad de Alzheimer, debido a la eliminación preferente de ?ß42 con respecto a ?ß40, lo cual es un concepto en el tratamiento de la EA, por ejemplo, mediante el uso de R-flubiprofeno, Flurizan, que ha demostrado eficacia en el tratamiento de la EA, en un estudio clínico publicado por Myriad Inc. Este concepto fue publicado por Weggen et al. (J Biol Chem. (2003) 278(34):31831 -7). Los resultados se muestran en la Figura 3. b. Un anticuerpo preferencial de globulómero como el 8F5 (u 8C5), se une mucho más a ?ß42 que a ?ß40 en los pacientes, en comparación con los controles sanos. Este resultado es incluso más indicativo de un tratamiento exitoso de la Enfermedad de Alzheimer, debido a que, como se observó anteriormente, la eliminación preferente de ?ß42 con respecto a ?ß40 es un concepto en el tratamiento de la EA (por ejemplo, mediante el uso de fármacos antiinflamatorios no esferoides, como el R-flubiprofeno) (véase la Figura 3). B) NIVELES DE AMILOIDE B(1-42) Y AMILOIDE BM-40) ENDÓGENOS EN LCR HUMANO, DESPUÉS DE INMUNOPRECIPITACIÓN CON EL ANTICUERPO MONOCLONAL 8F5 U 8C5 ????-?ß MURINO SELECTIVO DE GLOBULÓMEROS. EN COMPARACIÓN CON EL ANTICUERPO NO SELECTIVO DE GLOBULÓMEROS, 6E10: b1 ) Inmunoprecipitación (IP) con Cuentas Dynabeads M-280 de Carnero anti-lgG Murino soluciones ?ß-anticuerpo Los siguientes anticuerpos puros se obtuvieron a partir de hibridomas, de acuerdo con los procedimientos de purificación estándar: Anticuerpo monoclonal 6E10; Fa. Signet No.: 9320; 1 mg/mL en solución reguladora PBS Anticuerpo monoclonal 8F5; 1.65 mg/mL en solución reguladora PBS Anticuerpo monoclonal 8C5; 1.44 mg/mL en solución reguladora PBS Cuentas Dynabeads M-280 de Carnero anti-lgG Murina: El anticuerpo de carnero anti-lgG murina (Invitrogen Inc., No. de Cat. 112.02) está unido covalentemente a cuentas magnéticas (Dynabeads). Activación de las cuentas Dynabeads con anticuerpos monoclonales murinos. La suspensión concentrada de cuentas dynabeads (Dynabeads M-280 de Carnero anti-lgG Murina, Invitrogen; Prod. No. 112.02) se agitó cuidadosamente para evitar la formación de espuma. Se removió asépticamente 1 mL y se transfirió a un vial de reacción de 1.5 mL. Las cuentas dynabeads se lavaron 3 veces durante 5 min. cada una con 1 mL de solución reguladora de inmunoprecipitación (IP)-lavado (solución reguladora de IP-lavado: PBS (NaH2P04 20 mM; NaCI 140 mM, pH 7.4, 0.1% (p/v) de Albúmina Sérica Bovina (ASB)).

Durante el procedimiento de lavado, el sobrenadante se removió cuidadosamente mientras que las cuentas se inmovilizaron a los lados del vial de reacción, con un soporte separador magnético (SSM). Las cuentas dynabeads lavadas se incubaron con 40 pg de ?ß-anticuerpo en 1 mL de PBS, ASB 0.1% (p/v). La activación se llevó a cabo mediante una incubación durante una noche en agitación, a 4°C. Las cuentas activadas se lavaron 4 veces durante 30 min. (nuevamente utilizando un SSM) con 1 mL de solución reguladora IP-lavado (PBS (NaH2P04 20 mM; NaCI 140 mM, pH 7.4), ASB 0.1% (p/v)). Las cuentas activadas se resuspendieron con 1 mL de PBS, ASB 0.1% (p/v), Azida de sodio 0.02% (p/v); se mezclaron en vórtex y se centrifugaron brevemente. Las cuentas activadas con anticuerpo se almacenaron a 4°C hasta su uso. Preparación de la Muestra de LCR: Se agregaron 400 pL de LCR de un paciente con Enfermedad de Alzheimer, a 4 pL de Coctail Inhibidor de Proteasa Completo (Roche Inc. No. de Cat.: 1697498, 1 tableta disuelta en 1 mL de agua) y 0.8 pL de PMSF 500 mM disuelto en metanol. Después de 10 min., se añadieron 1.6 mL de solución reguladora NaH2P0440 mM, NaCI 140 mM, Tween 200.05%, pH 7.4 (PBST).

Inmunoprecipitación de Especies ?ß de LCR-EA humanas: Se agregó una alícuota de 250 µ?_ de la muestra de LCR preparada, a 25 µ?_ de suspensión anti-Ap-Dynabeads. La inmunoprecipitación se llevó a cabo en agitación a 6°C durante 16 horas. Después, se realizaron tres lavados de las cuentas durante 5 min. con 1 ml_ de PBS/ASB 0.1% (p/v) y finalmente una vez durante 3 min. con 1 mL de solución reguladora Tris/HCI 10 mM, pH 7.5. Durante el procedimiento de lavado, el sobrenadante se removió cuidadosamente mientras las cuentas se inmovilizaban a los lados del vial de reacción con un soporte separador magnético (SSM). El sobrenadante residual se removió bien después del paso de lavado final. Los péptidos ?ß y los correspondientes anticuerpos se removieron de las cuentas Duynabeads, agregando 25 pL de solución reguladora de muestra, sin ß-mercaptoetanol (Bistris 0.36M, Bicine 0.16M, DSS 1% (p/v), sacarosa 15% (p/v), azul de bromofenol 0.004% (p/v)) al tubo de Eppendorff y se calentó durante 5 min. a 95°C en una plancha caliente. Después de enfriar a temperatura ambiente, las cuentas dynabeads se inmovilizaron a los lados del vial de reacción con un soporte separador magnético (SSM), y el sobrenadante se transfirió a otro tubo de Eppendorff (IP de eluato). Análisis de inmunoprecipitados de ?ß por urea-EGPA, seguido por un procedimiento de inmunoelectrotransferencia tipo Western (Western blot): La cuantificación de las especies ?ß1-40 y ?ß1-42 se llevó a cabo mediante una electroforesis en gel de poliacrilamida con urea 8M y un subsiguiente análisis de inmunoelectrotransferencia (Western blot) de acuerdo con el procedimiento descrito por primera vez por H.W. Klafki et al., Analytical Biochemistry 237, 24-29 (1996) y posteriormente también utilizado por J. Wiltfang et al., J. of Neurochemistry 81, 481-496, 2002. Éstos fueron los únicos dos cambios menores hechos en el procedimiento experimental: 1) La concentración de DSS en el gel se ajustó a 0.25% (p/v), en vez de 0.1% (p/v). 2) Para la inmunoelectrotransferencia (Western blot), el anticuerpo 1E8 (Senetek Drug Delivery Technologies Inc. St. Louis, MO, EUA) fue reemplazado por el anticuerpo monoclonal IgG murino anti-amiloide ß humano (N) (82E1) (IBL, No. de Cat. 10323). En el gel de EGPA-urea 8M se aplicaron alícuotas de 15 µ? de IP eluato de las muestras inmunoprecipitadas. La electroforesis se llevó a cabo a 100V (15 min.) y continuaron a 60V. La electroforesis se detuvo cuando el frente del colorante azul todavía estaba a 0.5 cm del extremo del gel. Procedimiento de inmunoelectrotransferencia (Western blot): El análisis de Western blot se llevó a cabo en una cámara semidesecada Semi Dry Blotting (BioRad, Inc., 45 min. a 75 mA) sobre 7.5 x 9 cm de nítrocelulosa con una porosidad de 0.45 m (BioRad, Inc.).

Solución reguladora de manchas: 6 g de Tris; 28.1 g de glicina; 500 mL de metanol; ajustar a 2.5 L con agua. La nitrocelulosa para transferencia de manchas se hirvió durante 10 min. en PBS a 100°C. Ésta se saturó mediante un tratamiento con 50 mL de ASB al 5% (p/v) en PBST durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de remover la fase líquida, el siguiente paso de lavado se llevó a cabo dos veces con: 50 mL de TTBS (solución reguladora de Tris/HCI 25 mM, NaCI 150 mM; Tween 20 al 0.05%; pH 7.5) durante 10 min. a temperatura ambiente y después con 50 mL de TBS (solución reguladora de Tris/HCI 25 mM; NaCI 150 mM; pH 7.5), durante 10 min. a temperatura ambiente. Para el posterior revelado, la solución de lavado final se desechó y se agregaron 15 mL de solución de anticuerpo I (0.2 pg/mL de 82E1 = 1:500 en leche descremada en polvo 3% (p/v) (Lasaña Inc.), en 15 mL de TBS) durante 20 horas a 6°C. La remoción de la solución reguladora fue seguida por tres lavados de la manera anteriormente descrita. La nitrocelulosa con las manchas se incubó con la solución de anticuerpo II (dilución 1:10000 del anti-murino-POD en 15 mL de leche descremada en polvo 3% (p/v), en 15 mL de TBS) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de remover la solución reguladora, se realizaron tres lavados de la manera anteriormente descrita. Después de remover la última solución reguladora de lavado, se mezclaron 2 mL de Mejorador de Máxima Sensibilidad de Sustrato Super Signal West Femto y 2 mL de Solución de Peróxido.

La solución recién preparada se vació en la nitrocelulosa con manchas, la cual fue incubada previamente en la oscuridad durante 5 minutos. La quimioluminiscencia se registró utilizando un sistema de imagen VersaDoc (BioRad). Parámetros de imagen: tiempo de exposición: 180 seg. Registre fotografías después de 30 seg., 60 seg., 120 seg. y 180 segundos. Los resultados se obtuvieron a partir de las fotografías con un tiempo de exposición de 180 segundos.

Los resultados anteriores indican que un anticuerpo preferencial de globulómeros como el 8F5 u 8C5, en comparación con un anticuerpo no selectivo de globulómeros, como el 6E10, se une más al ?ß42 que al ?ß40 en el LCR humano. Este resultado es indicativo de un tratamiento exitoso de la Enfermedad de Alzheimer, debido a que, como se anotó anteriormente, la eliminación preferencial de ?ß42 sobre ?ß40, sigue siendo un concepto en el tratamiento de la EA (por ejemplo, mediante el uso de R-flubiprofeno (véanse párrafos anteriores)). EJEMPLO V EL 8F5 MEJORA EL RECONOCIMIENTO DE OBJETOS NUEVOS EN RATONES TRANSGÉNICOS PPA Con el fin de probar un efecto positivo sobre la capacidad cognitiva mediante la neutralización interna del epítopo del globulómero ?ß(1-42) con el anticuerpo 8F5, se llevó a cabo un experimento de inmunización pasiva con ratones transgénicos PPA, en donde los ratones fueron probados con respecto a su capacidad de recordar objetos que pudieran haber investigado antes. Después de un tiempo, al retrasar entre el primero y segundo encuentro de los objetos, los ratones transgénicos PPA no fueron capaces de reconocer el objeto ya investigado. Este experimento se basó en la natural curiosidad de los animales, y una significativa falta de interés en los objetos ya investigados, demuestra el reconocimiento de dichos objetos. EJEMPLO V.1: INCREMENTO EN EL ÍNDICE DE RECONOCIMIENTO POR EL ANTICUERPO MONOCLONAL 8F5: Animales: Se utilizaron ratones hembra del modelo murino transgénico simple de Enfermedad de Alzheimer en fondo FVB x C57BI (APP/L, ReMYND, Leuven, Bélgica) y compañeros de carnada negativos como controles silvestres, en fondo FVB x C57BI, con una edad de 3 meses. Todos los ratones fueron genotipificados por reacción en cadena catalizada por polimerasa (RCP) a la edad de 3 semanas y recibieron un n úmero de identidad ú n ico, u na vez que se conocieron los resultados de la RCP y fueron verificados mediante una segunda RCP antes de iniciar el estudio. Todos los ratones fueron divididos aleatoriamente y ajustados a la edad ; es decir, se les asignó un n úmero aleatorio mediante una computadora y se colocaron aleatoriamente para recibir un tratamiento. Los animales fueron enjaulados en el grupo de tratamiento d urante 1 8 d ías antes de iniciar el estudio, con el fin de permitirles familiarizarse con el nuevo ambiente de las jaulas. Los ratones ten ían acceso libre a agua previamente filtrada y esterilizada (con lámpara UV) y alimento estándar para ratones. El alimento se almacenó en condiciones secas y frescas, en un cuarto de almacenamiento bien ventilado, la cantidad de agua y alimento se verificó diariamente, se suministró cuando fuera necesario y se cambió dos veces a la semana. Los ratones fueron mantenidos bajo un régimen de d ía-noche invertido: 14 horas de luz/1 0 horas de oscuridad , comenzando a las 7 p. m . en jaulas metálicas estándar, de tipo RVS T2 (540 cm2 de área) . Las jaulas estaban equipadas con piso sólido y una capa de aserrín para carnada. El n úmero de ratones por jaula se limitó seg ú n la legislación sobre el bienestar de animales. Cinco d ías antes de comenzar la prueba de comportamiento, los ratones fueron reubicadas en jaulas de macrolón tipo 2 y transportados al laboratorio, con el fin de adaptarlos al ambiente de laboratorio en la preparación de la prueba de comportamiento.

Tratamiento (in munización pasiva) : Se llevaron a cabo tres experimentos individuales, en los cuales los ratones (cuando 9 por grupo) recibieron inyecciones intraperitoneales (500 pg en 240 pL/ratón) en los d ías 1 , 8 y 1 5. Los ratones fueron tratados con los anticuerpos monoclonales 6G 1 , 8F5 y otros anticuerpos no descritos, todos disueltos en solución salina reguladora de fosfatos, o con 320 p L de solución salina reguladora de fosfatos. Prueba de reconocimiento de objetos n uevos : Esta prueba de reconocimiento de objetos nuevos se realizó en el d ía del tercer tratamiento. El protocolo utilizado se apegó al método descrito por Dewachter et al. (Jou rnal of Neu roscience, 2002 , 22(9) :3445-3453) . Los ratones fueron familiarizados durante una hora en una caja abierta de Plexiglás (52 x 52 x 40 cm) con paredes verticales negras y un piso trasl úcido, ligeramente iluminada por u na lámpara colocada bajo la caja . Al d ía siguiente, los animales fueron colocados en la misma caja y sometidos a un estudio de adquisición de 1 0 minutos. Durante este estudio, los ratones se colocaron individualmente en el campo abierto de la jaula , en presencia de dos objetos A idénticos (barril ana ranjado o cubo verde, de tamaño similar de ± 4 cm) , y se registró la duración (tiempoAA) y la frecuencia (FrecAA ) de exploración del objeto A (cuando el hocico de los animales estaba directamente dirigido hacia el objeto , a una distancia < 1 cm y los ratones olían activamente en d irección del objeto) , mediante u n sistema computarizado (Ethovision, Noldus Information Technology, Wageningen, Los Países Bajos). Durante un estudio de retención de 10 minutos (segundo estudio), realizado 2.5 horas después, se colocó un nuevo objeto (objeto B, cubo verde o barril anaranjado) junto con el objeto familiar (objeto A) en el campo abierto de la jaula (FrecA y FrecB, y tiempoA y tiempos, respectivamente). El índice de reconocimiento (IR), definido como la relación de duración en la cual el objeto nuevo era explorado, con respecto a la duración en la cual ambos objetos eran explorados [TiempoB / (TiempoA + TiempoB) x 100], se utilizó para medir la memoria no espacial. La duración y frecuencia con que el objeto A era explorado, durante el estudio de adquisición (TiempoAA y FrecAA) se utilizaron para medir la curiosidad. El análisis de datos se realizó combinando ratones transgénicos PPA que recibían anticuerpos monoclonales 6G1 u 8F5, o solución salina reguladora de fosfatos, y compañeros de camada no transgénicos que recibieran solución salina reguladora de fosfatos, de los tres estudios (Fig.4). Los ratones que no distinguen entre un objeto viejo y un objeto nuevo, tienen un índice de reconocimiento de 50. Los ratones que reconocen el objeto viejo de preferencia explorarán el objeto nuevo, de aquí que, el índice de reconocimiento se vuelve >50. Los ratones que exploran exclusivamente el objeto nuevo tienen un índice de reconocimiento de 100. El índice medio de reconocimiento por grupo se comparó contra el nivel de oportunidad; es decir, 50, por la prueba t. La media del índice de reconocimiento de todos los grupos también se comparó por ANOVA, seguido por una prueba t post-hoc. La diferencia entre los grupos tratados con PBS y los de tipo silvestre indicó un déficit cognitivo de los ratones transgénicos PPA en este paradigma. Los ratones inyectados con PBS se desempeñaron a nivel de oportunidad (es decir, no significativamente diferente de 50), mientras que todos los demás ratones mostraron reconocimiento del objeto (Fig. 4: estrellas). Cuando el desempeño de los ratones transgénicos PPA tratados con el anticuerpo se comparó con los grupos control, se encontró una diferencia significativa versus los ratones tratados con PBS, pero no versus los ratones tipo silvestre (Fig. 4: círculos), lo cual indica que el tratamiento con el anticuerpo 8F5 revirtió el déficit cognitivo en estos ratones transgénicos PPA. EJEMPLO VI ANÁLISIS IN SITU DE LA REACCIÓN ESPECÍFICA DE ANTICUERPOS 8F5 Y 8C5 CON EL PÉPTIDO AMILOIDE BETA FIBRILAR EN FORMA DE PLACAS AMILOIDES Y EN FORMA AMILOIDE EN VASOS MENÍNGEOS. EN RATONES TRANSGÉNICOS PPA VIEJOS Y EN PACIENTES CON ENFERMEDAD DE ALZHEIMER Los anticuerpos 8F5 y 8C5 mostraron una reducida tinción a los depósitos de péptido ?ß fibrilar, lo cual sugiere que su objeto terapéutico está mediado por la unión a formas globuloméricas solubles más que a formas depositadas fibrilares del péptido ?ß. Puesto que la unión del anticuerpo al péptido ?ß fibrilar puede causar una rápida disolución de los agregados y un subsiguiente incremento en la concentración de ?ß soluble, lo cual, a su vez, se piensa que es neurotóxico y puede causar microhemorragias, una terapia con anticuerpos que tenga efecto sobre los globulomeros solubles más que los monómeros, es preferida. Métodos: Para estos experimentos, se utilizaron varias muestras de material cerebral: tejido cortical de 2 pacientes con EA (RZ16 y RZ55) y tejido cortical de ratones Tg2576 de 19 meses de edad (APPSWE C 001349, Taconic, Hudon, NY, EUA) o ratones APP/L de 12 meses de edad (ReMYND, Leuven, Bélgica). Los ratones sobreexpresan PPA humano con una mutación de Enfermedad de Alzheimer familiar y a partir de depósitos ß-amiloides en el parénquima cerebral, a aproximadamente 11 meses de edad y depósitos ß-amiloides en vasos cerebrales grandes, aproximadamente a los 18 meses de edad. Los animales fueron sometidos a anestesia profunda y se les realizó una perfusión transcardiaca de solución salina reguladora de fosfatos 0.1M (PBS) para lavar la sangre. Después, se extirpó el cerebro del cráneo y se cortó longitudinalmente. Un hemisferio del cerebro se congeló y el otro se fijó por inmersión en paraformaldehído al 4%. El hemisferio fijado por inmersión fue crioprotegido sumergiéndolo en sacarosa al 30% en PBS y se montó en un microtomo congelado. El cerebro anterior completo se cortó en secciones transversales de 40 µ?t?, las cuales se colectaron en PBS y se utilizaron para el posterior procedimiento de tinción. Se obtuvieron muestras de neocorteza de pacientes con Enfermedad de Alzheimer en Brain-Net, Münich, Alemania, en forma de tejido congelado, se fijaron por inmersión en paraformaldehído al 4% durante el descongelamiento y después se trataron de la misma manera que el tejido murino. Se tiñeron cortes individuales con Rojo Congo, utilizando el siguiente protocolo: Material: Paquete de decolorante Rojo Congo amiloide (Sigma-Aldrich; HT-60), que consistía de solución de NaCI alcohólica, solución de NaOH y solución de Rojo Congo Cubetas para tinción Portaobjetos de microscopio SuperfrostPIus y cubreobjetos Etanol, xilol, medio de fijación Reactivos: NaOH diluido 1:100 con solución de NaCI, produciendo solución salina alcalina Solución salina alcalina diluida 1:100 con solución de Rojo Congo, produciendo solución de Rojo Congo alcalina (preparar no más de 15 min. antes de su uso, filtrar) Los cortes se montan en el portaobjetos y se dejan secar Los portaobjetos se incuban en cubetas de tinción, primero durante 30-40 minutos en solución salina alcalina, y después durante 30-40 minutos en solución de Rojo Congo alcalina Enjuagar tres veces con etanol fresco y fijar con xilol. La tinción fue fotografiada primero utilizando un microscopio Zeiss Axioplan (Zeiss, Jena, Alemania) y se evaluó cualitativamente. El color rojo indicaba depósitos amiloides tanto en forma de placas como en vasos meníngeos grandes. Posteriormente, la evaluación de la tinción de anticuerpos se enfocó en estas estructuras. La tinción se realizó incubando los cortes con una solución que contenía 0.07-0.7 pg/mL del respectivo anticuerpo, según el siguiente protocolo: Materiales: Solución de lavado TBST (Solución Salina Reguladora Tris con Tween 20; 10x concentrado; DakoCytomation S3306, DAKO, Hamburgo, Alemania), 1:10 en agua bidestilada) H202 al 0.3% en metanol Suero de burro (Serotec, Düsseldorf, Alemania), al 5% en TBST, como suero bloqueador Anticuerpo monoclonal contra globulómeros murinos diluido a las concentraciones dadas, en TBST Anticuerpo secundario: anticuerpo de burro anti-murino biotinado (Jackson Immuno / Dianova, Hamburgo, Alemania; 715-065-150; diluido 1 :500 en TBST) Complejo StreptAB (DakoCytomation K 0377, DAKO, Hamburgo, Alemania) Sustrato de peroxidasa del Paquete, diaminobencidina (=DAB; SK-4100; Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA) Portaobjetos y cubreobjetos para microscopio SuperFrost Plus Medio de fijación libre de xilol (Medite, Burgdorff, Alemania; X-tra Kitt) Procedimiento: Transfiera los cortes flotantes a H202 al 0.3% enfriada en hielo e incube durante 30 minutos Lave durante 5 min. con solución reguladora TBST - Incube con suero de burro/TBST durante 20 minutos Incube con anticuerpo primario durante 24 horas, a temperatura ambiente Lave con solución reguladora TBST durante 5 minutos Incube con suero bloqueador durante 20 minutos - Lave con solución reguladora TBST durante 5 minutos Incube con anticuerpo secundario durante 60 minutos, a temperatura ambiente Lave con solución reguladora TBST durante 5 minutos Incube con el Complejo StreptAB durante 60 minutos, a temperatura ambiente Lave con solución reguladora TBST durante 5 minutos Incube con DAB durante 20 minutos Monte los cortes en portaobjetos, séquelos al aire, deshidrate los portaobjetos con alcohol y fíjelos. Aparte de la inspección visual de los cortes bajo el microscopio, la tinción amiloide se cuantificó adicionalmente mediante la escisión óptica de 1 0 placas aleatoriamente seleccionadas de las imágenes histológicas, mediante el uso del sistema de análisis de imágenes I magePro 5.0 y determinando su valor promedio en escala de grises. Los valores de densidad óptica se calcularon a partir de los valores en escala de grises, restando la densidad de fondo promedio del material teñido de la densidad de las placas amiloides (0% - no hay tinción de placas mayor que el fondo que las rodea , 1 00% - no hay transmisión / tinción máxima) . Las diferencias entre los anticuerpos 6E 1 0 / 4G8 y 6G 1 , 8C5 y 8F5, respectivamente, se probaron con respecto a su significado estadístico, por ANOVA. Resultados: Todo el material de anticuerpos teñidos descrito , fueron depósitos amiloides congofílicos (Fig . 7(A)) . Los anticuerpos que prefieren globulómeros 8F5 y 8C5, tiñeron depósitos parenquimales y men íngeos congofílicos de péptido ?ß significativamente menos q ue los anticuerpos 6G 1 y 6E 1 0 (Fig . 7(B)-(C) , (H)) . El análisis cuantitativo de la tinción de placas amiloides parenquimales, reveló la unión de todos los anticuerpos a las placas (densidad estad ísticamente significativa por arriba del control) , pero la unión de los anticuerpos 8F5 y 8C5 fue significativamente menor que la unión del anticuerpo de referencia 6E 1 0 (dirigido contra la secuencia N-terminal de ?ß) y fue ig ual o más baja que el anticuerpo de referencia 4G8 (dirigido contra la secuencia N-terminal de ?ß) (Fig . 7(D)-(G)) .

Los anticuerpos 8F5 y 8C5 se unen menos a los depósitos amiloides que los anticuerpos que reconocen el monómero ?ß o una parte de la secuencia ?ß. El tratamiento con anticuerpos que se unen al péptido ?ß fibrilar, puede causar u na rápida disolución de las placas amiloides en el tejido cerebral y un consecuente incremento en la concentración de ?ß soluble , lo cual , a su vez, se piensa q ue es neu rotóxico y q ue puede causar microhemorragias, y/o una rápida disolución vascular amiloide, lo cual también puede causar microhemorragias. Por lo tanto, una terapia con anticuerpos q ue tienen su efecto en el globulómero sol uble en vez del monómero , es preferida .

Claims (56)

1. REIVINDICACIONES 1. Un anticuerpo aislado que se une con mayor especificidad a un globulómero de proteína amiloide beta (?ß) que a un monómero de proteína amiloide beta.
2. 2. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es monoclonal.
3. 3. El anticuerpo aislado de la reivindicación 2, en donde la relación de especificidad de unión al globulómero y al monómero, es de cuando menos 1.4.
4. 4. El anticuerpo aislado de la reivindicación 3, en donde la relación es de 1.4 a 16.9.
5. 5. El anticuerpo aislado de la reivindicación 4, en donde el monómero de proteína amiloide beta se selecciona del grupo que consiste de monómero ?ß(1-42) y monómero ?ß(1-40).
6. 6. El anticuerpo aislado de la reivindicación 5, en donde el anticuerpo monoclonal es producido por un hibridoma que tiene el número de designación en la Colección Norteamericana de Cultivos Tipo PTA-7238 ó PTA-7407.
7. 7. Un hibridoma que tiene el número de designación en la Colección Norteamericana de Cultivos Tipo PTA-7238.
8. 8. Un anticuerpo monoclonal (8F5) producido por el hibridoma de la reivindicación 7.
9. 9. Un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada variable codificada por la SEQ ID NO: 1.
10. 10. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 9, en donde el anticuerpo es humano o humanizado.
11. 11. Un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena ligera variable codificada por la SEQ ID NO: 2.
12. 12. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 11, en donde el anticuerpo es humano o humanizado.
13. 13. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 11, que además comprende una cadena pesada ligera variable codificada por la SEQ ID NO: 1.
14. 14. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 13, en donde el anticuerpo es humano o humanizado.
15. 15. Un anticuerpo monoclonal que comprende la SEQ ID NO: 3.
16. 16. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 15, en donde el anticuerpo es humano o humanizado.
17. 17. Un anticuerpo monoclonal que comprende la SEQ ID NO: 4.
18. 18. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 17, en donde el anticuerpo es humano o humanizado.
19. 19. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 17, que además comprende la SEQ ID NO: 3.
20. 20. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 19, en donde el anticuerpo es humano o humanizado.
21. 21. Un anticuerpo aislado que se une con mayor especificidad a un globulómero de proteína amiloide beta que a una fibrilla de proteína amiloide beta.
22. 22. El anticuerpo aislado de la reivindicación 22, en donde el anticuerpo es monoclonal.
23. 23. El anticuerpo aislado de la reivindicación 23, en donde el anticuerpo monoclonal es producido por un hibridoma que tiene el número de designación en la Colección Norteamericana de Cultivos Tipo PTA-7238 ó PTA-7407.
24. 24. Un hibridoma que tiene el número de designación en la Colección Norteamericana de Cultivos Tipo PTA-7407.
25. 25. Un anticuerpo monoclonal (8C5) producido por el hibridoma de la reivindicación 24.
26. 26. Un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada variable codificada por la SEQ ID NO: 11.
27. 27. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 26, en donde el anticuerpo es humano o humanizado.
28. 28. Un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena ligera variable codificada por la SEQ ID NO: 12.
29. 29. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 28, en donde el anticuerpo es humano o humanizado.
30. 30. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 28, que además comprende una cadena ligera variable codificada por la SEQ ID NO: 11.
31. 31. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 30, en donde el anticuerpo es humano o humanizado.
32. 32. Un anticuerpo monoclonal que comprende la SEQ ID NO: 19.
33. 33. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 32, en donde el anticuerpo es humano o humanizado. 34. Un anticuerpo monoclonal que comprende la SEQ ID
34. NO: 20.
35. 35. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 34, en donde el anticuerpo es humano o humanizado.
36. 36. anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada variable, en donde la cadena pesada variable comprende cuando menos una región determinante de complementariedad (CDR) que se selecciona del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15.
37. 37. anticuerpo monoclonal que comprende cadena libera variable, en donde la cadena ligera variable comprende cuando menos una CDR que se selecciona del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18.
38. 38. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 37, que además comprende una cadena pesada variable, en donde la cadena pesada variable comprende cuando menos una CDR que se selecciona del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15.
39. 39. Un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada variable, en donde la cadena pesada variable comprende cuando menos una región determinante de complementariedad (CDR) que se selecciona del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6y SEQ ID NO: 7.
40. 40. Un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena ligera variable, en donde la cadena ligera variable comprende cuando menos una CDR que se selecciona del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10.
41. 41. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 40, que además comprende una cadena pesada variable, en donde la cadena pesada variable comprende cuando menos una CDR que se selecciona del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7.
42. 42. Un método para el tratamiento o prevención de la Enfermedad de Alzheimer en un paciente que necesite dicho tratamiento o prevención, que comprende la administración del anticuerpo aislado de la reivindicación 1 ó de la reivindicación 6, al paciente, en una cantidad suficiente para efectuar el tratamiento o la prevención.
43. 43. El método de la reivindicación 42, en donde el anticuerpo aislado se administra a través de una vía que se selecciona del grupo que consiste de administración intramuscular, administración intravenosa y administración subcutánea.
44. 44. Un método para el diagnóstico de la Enfermedad de Alzheimer en un paciente que se sospecha que padece esta enfermedad, que comprende los pasos de: a. aislar una muestra biológica del paciente; b. poner en contacto la muestra biológica con el anticuerpo aislado de la reivindicación 1 ó de la reivindicación 6, por un periodo y bajo condiciones suficientes para la formación de complejos antígeno/anticuerpo; y c. detectar la presencia de los complejos antígeno/anticuerpo en la muestra , en donde la presencia de dichos complejos indica un diag nóstico de Enfermedad de Alzheimer en el paciente.
45. 45. El método de la reivindicación 44, en donde el antígeno es un globu lómero.
46. 46. Un método de diag nóstico de la Enfermedad de Alzheimer en un paciente que se sospecha que padece esta enfermedad , que comprende los pasos de: a. aislar una muestra biológica del paciente; b. poner en contacto la muestra biológica con un antígeno por un periodo y bajo condiciones suficientes para la formación de complejos anticuerpo/a ntíge no; c. agregar u n conjugado a los complejos anticuerpo/antígeno resultantes, por un periodo y bajo condiciones suficientes para permitir q ue el conjugado se u na al anticuerpo u nido, en donde el conjugado comprende el anticuerpo aislado de la reivindicación 1 ó de la reivindicación 6, unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable; y d . detectar la presencia de u n anticuerpo que puede estar presente en la muestra biológica , mediante la detección de u na señal generada por el compuesto generador de señal , en donde la señal indica u n diagnóstico de Enfermedad de Alzheimer en el paciente.
47. 47. El método de la reivindicación 46, en donde el antígeno ese u n globulómero.
48. 48. Un método para el diagnóstico de la Enfermedad de Alzheimer en un paciente q ue se sospecha que la padece, que comprende los pasos de : a . aislar una muestra biológica del paciente; b. poner en contacto la muestra biológica con un antianticuerpo, en donde el anti-anticuerpo es específico contra el anticuerpo de la reivindicación 1 ó de la reivindicación 6, por u n periodo y bajo condiciones suficientes para permiti r la formación de complejos anti-anticuerpo/anticuerpo, en donde los complejos contienen el anticuerpo presente en la muestra biológica, c. agregar u n conj ugado a los complejos antianticuerpo/anticuerpo resultantes, por un periodo y bajo condiciones suficientes para permitir q ue el conjugado se una al anticuerpo unido, en donde el conjugado comprende u n antígeno , el cual se une a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable; y d . detectar una señal generada por el compuesto generador de señal , en donde la señal indica u n diagnóstico de Enfermedad de Alzheimer en el paciente.
49. 49. Una composición que comprende el anticuerpo aislado de la reivindicación 1 ó la reivindicación 6.
50. 50. U n método pa ra prevenir o tratar la Enfermedad de Alzheimer en un paciente q ue necesite dicha prevención o tratamiento, que comprende el paso de administrar la composición de la reivindicación 49 al paciente, en una cantidad suficiente para efectuar la prevención o el tratamiento.
51. 51 . Una vacuna que comprende el anticuerpo aislado de la reivindicación 1 ó de la reivindicación 6, y un adyuvante farmacéuticamente aceptable.
52. 52. U n método para prevenir o tratar la Enfermedad de Alzheimer en un paciente que necesite de dicha prevención o tratamiento, que comprende el paso de administrar la vacuna de la reivindicación 51 , al paciente, en una cantidad suficiente para efectuar la prevención o el tratamiento.
53. 53. Un método para identificar compuestos adecuados para la inmunización activa de u n paciente que se predice que desarrollará la Enfermedad de Alzheimer, que comprende los pasos de: a) exponer uno o más compuestos de interés anticuerpo aislado de la reivindicación 1 ó de la reivindicación 6, por un tiempo y bajo condiciones suficientes para que d icho u no o más compuestos se una n al anticuerpo aislado de la reivindicación 1 ó de la reivindicación 6; y b) identificar los compuestos que se unieron anticuerpo aislado de la reivindicación 1 ó de la reivind icación 6, en donde los compuestos identificados se utilizan en la inmunización activa de un paciente que se predice que desarrollará Enfermedad de Alzheimer.
54. 54. Un paq uete que comprende: a) el anticuerpo aislado de la reivindicación 1 ó de la reivindicación 6, y b) un conjugado que comprende un anticuerpo u nido a un compuesto generador de señal , en donde el anticuerpo de dicho conjugado es d iferente del anticuerpo aislado .
55. 55. U n paq uete que comprende: a) un anti-anticuerpo contra el a nticuerpo aislado de la reivind icación 1 ó de la reivindicación 6 y b) un conjugado que comprende u n antígeno u nido a un compuesto generador de señal .
56. 56. El paquete de la reivindicación 55, en donde el antígeno es un globulómero.