DE69813181T2

DE69813181T2 - Icam-4 und dessen diagnostische verwendungen

Info

Publication number: DE69813181T2
Application number: DE69813181T
Authority: DE
Inventors: D. Patrick KILGANNON; Michael W. Gallatin
Original assignee: Icos Corp
Current assignee: Icos Corp
Priority date: 1997-10-02
Filing date: 1998-10-02
Publication date: 2004-03-04
Anticipated expiration: 2018-10-03
Also published as: CN1246923A; EP0956508A1; ES2201547T3; AU735917B2; NO992666L; EP1338896A2; EP1338896A3; IL130228A0; BR9806294A; EP0956508B1; RU2208230C2; CN1132014C; DE69813181D1; DK0956508T3; AU1066999A; NO992666D0; JP2001508181A; ATE237140T1; CA2273195A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen zelluläre Adhäsionsmoleküle und insbesondere die Klonierung und Expression von DNA, die für ein bisher unbekanntes Polypeptid, das als "ICAM-4" bezeichnet wird, kodiert, das strukturelle Verwandtheit mit den interzellulären Adhäsionsmolekülen ICAM-1, ICAM-2 und ICAM-R besitzt.
Hintergrund der Erfindung
Die über das letzte Jahrzehnt hinweg andauernde Forschung hat signifikant die molekularen Ereignisse aufgeklärt, die an den Zell-Zell-Interaktionen im Körper teilnehmen, insbesondere diejenigen Ereignissen, die an der Bewegung und Aktivierung von Zellen im Immunsystem beteiligt sind und, kürzlich, diejenigen, die an der Entwicklung und normalen physiologischen Funktion von Zellen im Nervensystem beteiligt sind. Siehe im allgemeinen Springer, Nature, 346: 425–434 (1990), in Bezug auf Zellen des Immunsystems und Yoshihara, et al. Neurosci. Res. 10: 83–105 (1991) und Sonderegger und Rathjen, J. Cell Biol. 119: 1387–1394 (1992), im Hinblick auf Zellen des Nervensystems. Zelloberflächenproteine und insbesondere die sogenannten zellulären Adhäsionsmoleküle ("CAMs") waren entsprechender weise das Subjekt pharmazeutischer Forschung und Entwicklung, die als ihr Ziel einen Eingriff in die Prozesse der Leukozytenextravasation an Stellen von Entzündung und Leukozytenbewegung zu distinkten Zielgeweben sowie neuronale Differenzierung und Bildung von komplexen neuronalen Netzwerken hatten. Die Isolierung und Charakterisierung von zellulären Adhäsionsmolekülen, die Klonierung und Expression von DNA-Sequenzen die für solche Moleküle kodieren, und die Entwicklung von therapeutischen diagnostischen Mitteln, die für entzündliche Prozesse und die Entwicklung und Funktion des Nervensystems relevant sind, waren ebenfalls die Subjekte von zahlreichen U.S.- und ausländischen Patentanmeldungen. Siehe Edwards, Current Opinion in Therapeutic Patents, 1(11): 1617–1630 (1991) und insbesondere die darin zitierten publizierten "Patentliteratur-Referenzen".
Von fundamentalem Interesse für den Hintergrund der vorliegenden Erfindung sind die vorangegangene Identifizierung und Charakterisierung von bestimmten Mediatoren von Zellad häsionsereignissen, den "Leukointegrinen", LFA-1, MAC-1 und gp 150.95 (nach der WHO-Nomenklatur als jeweils CD 18/CD 11a, CD 18/CD 11b und CD 18/CD 11c bezeichnet), die eine Unterfamilie von heterodimeren "Integrin"-Zelloberflächeproteinen bilden, die auf B-Lymphozyten, 7-Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten vorhanden sind. Siehe, z. B. Tabelle 1 von Springer, supra, auf Seite 429. Auch von Interesse sind andere Einzelkettenadhäsionsmoleküle (CAMs), die an Leukozytenaktivierung, -adhäsion, -bewegung und Ähnlichem beteiligt sind, die den inflammatorischen Prozeß begleitende Ereignisse sind. Zum Beispiel wird im Augenblick angenommen, daß vor der Leukozytenextravasation, die die inflammatorischen Prozesse kennzeichnet, eine Aktivierung von Integrinen auftritt, die konstitutiv auf Leukozyten exprimiert werden und durch eine enge Liganden/Rezeptorinteraktion zwischen den Integrinen (z. B. LFA-1) und einem oder beiden der zwei distinkten intrazellulären Adhäsionsmolekülen (CAMs), bezeichnet als ICAM-1 und ICAM-2, die auf Blutgefäß-Endothelzelloberflächen und auf anderen Leukozyten exprimiert werden, gefolgt wird.
Wie die anderen bis jetzt charakterisierten CAMs [z. B. vaskuläres Adhäsionsmolekül (VCAM-1), wie beschrieben in PCT WO 90/13300, veröffentlicht am 15. November 1990; und Blutplättchen-Endothelzelladhäsionsmolekül (PECAM-1) wie beschrieben in Newman et al., Science, 247: 1219–1222 (1990) und PCT WO 91/10683, veröffentlicht am 25. Juli 1991] sind ICAM-1 und ICAM-2 zu anderen Mitgliedern der Immunglobulingen-Superfamilie strukturell homolog, wobei der extrazelluläre Teil eines Jeden aus einer Serie von Domänen zusammengesetzt ist, die ein ähnliches Carboxy-terminales Motiv teilen. Eine "typische" Immunglobulin-ähnliche Domäne enthält eine Schleifenstruktur, die gewöhnlicherweise durch eine Disulfidbrücke zwischen zwei Cysteinen an den äußersten Seiten jeder Schleife verankert ist. ICAM-1 enthält fünf Immunglobulin-ähnliche Domänen; ICAM-2, das sich von ICAM-1 im Hinblick auf die Zellverteilung unterscheidet, enthält zwei solcher Domänen; PECAM-1 enthält sechs; VCAM schließt, in Abhängigkeit von Splice-Variationen, sechs oder sieben ein, usw. Darüber hinaus enthalten CAMs typischerweise eine hydrophobe "Transmembran"-Region, von der geglaubt wird, daß sie an der Orientierung des Moleküls an der Zelloberfläche beteiligt ist, und eine Carboxy-terminale "zytoplasmatische" Region. Graphische Modelle der operativen Anordnung von CAMs zeigen im allgemeinen das Molekül als an der Transmembranregion in der Zellmembran verankert, wobei sich der zytoplasmatische "Schwanz" in das Zellzytoplasma hinein erstreckt und sich eine oder mehrere Immunglobulin-ähnliche Schleifen von der Zelloberfläche nach außen erstrecken.
Eine Zahl von neuronalen Zellen exprimiert Oberflächenrezeptoren mit extrazellulären Ig- ähnlichen Domänen, die strukturell zu den ICAMs ähnlich sind. Siehe zum Beispiel Yoshihara et al., supra. Zusätzlich zu Ig-ähnlichen Domänen enthalten viele Adhäsionsmoleküle des Nervensystems auch in Tandem wiederholte Fibronectin-ähnliche Sequenzen in der extrazellulären Domäne.
Eine Vielzahl von therapeutischen Verwendungen wurde für interzelluläre Adhäsionsmoleküle vorgesehen, einschließlich Verwendungen, die auf der Fähigkeit von ICAM-1 beruhen, menschlichen Rhinovirus zu binden. Europäische Patentanmeldung 468 257 A, veröffentlicht am 29. Januar 1992, betrifft zum Beispiel die Entwicklung von multimeren Konfigurationen und Formen von ICAM-1 (einschließlich Vollängen und verkürzten molekularen Formen), die als eine verbesserte Liganden/Rezeptor-bindende Aktivität aufweisend vorgeschlagen werden, insbesondere bei der Bindung an Viren, Lymphozyten assoziierten Antigenen und Pathogenen, wie zum Beispiel Plasmodium falciparum.
Auf eine ähnliche Weise wurde eine Vielzahl von Verwendungen für Proteine vorgeschlagen, die immunologisch mit interzellulären Adhäsionsmolekülen verwandt sind. WO 91/16928, veröffentlicht am 15. November 1991, betrifft zum Beispiel humanisierte chimäre anti-ICAM-1-Antikörper und deren Verwendung bei der Behandlung von spezifischer und nicht-spezifischer Entzündung, viraler Infektion und Asthma. Anti-ICAM-1-Antikörper und Fragmente davon werden als brauchbar bei der Behandlung von endotoxischem Schock in WO 92/04034, veröffentlicht am 19. März 1992, beschrieben. Die Inhibierung von ICAM-1 abhängigen entzündlichen Antworten mit anti-ICAM-1 anti-idiotypischen Antikörpern und Antikörperfragmenten wird in WO 92/06119, veröffentlicht am 16. April 1992, adressiert.
Trotz der fundamentalen Einsichten in Zelladhäsions-Phänomene, die durch die Identifizierung und Charakterisierung von interzellulären Adhäsionsproteinen, wie zum Beispiel ICAM-1 und Lymphozyten interaktiven Integrinen, wie zum Beispiel LFA-1, erhalten wurden, ist das Bild von einer Vollständigkeit weit entfernt. Es wird allgemein geglaubt, daß zahlreiche andere Proteine an inflammatorischen Prozessen und bei der gerichteten Lymphozytenbewegung durch den Körper beteiligt sind. Zum Beispiel beschreibt die veröffentlichte PCT-Anmeldung WO 93/14776 (veröffentlicht am 5. August 1993) die Klonierung und Expression eines ICAM verwandten Proteins, ICAM-R. Die DNA- und Aminosäuresequenzen von ICAM-R sind hier in SEQ ID NO: 4 angegeben. Von diesem neuen Liganden wurde gefunden, daß der auf menschlichen Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten exprimiert wird.
Als von besonderem Interesse für die vorliegende Anmeldung wurde noch ein weiteres ICAM-ähnliches Oberflächenmolekül identifiziert, das eine Gewebe-spezifische Expression aufweist, die sich von jedem anderen bekannten ICAM-Molekül unterscheidet. Mori, et al., [Proc.Natl.Acad.Sci. (USA) 84: 3921–3925 (1987)] berichteten die Identifizierung eines Telencephalon-spezifischen Antigens im Kaninchenhirn, das spezifisch mit monoklonalem Antikörper 271A6 immunreaktiv war. Dieses Oberflächenantigen wurde Telencephalin genannt. Imamura et al., [Neurosci.Letts. 119: 118–121 (1990)] bestätigten unter der Verwendung eines polyklonalen Antikörpers, um die lokalisierte Expression zu ermitteln, daß die Expression von Telencephalin im visuellen Cortex von Katzen Unterschiede in Lagen des Gewebes zeigte und berichteten auch, daß die Telencephalin-Expression als eine Funktion der Entwicklung variabel war. Oka et al., [Neuroscience 35: 93–103 (1990)] berichteten anschließend über die Isolierung von Telencephalin unter der Verwendung von monoklonalem Antikörper 271A6. Die Publikation berichtet ein Molekulargewicht für das Oberflächenmolekül von ungefähr 500 kD und daß das Molekül aus vier Untereinheiten zusammengesetzt war, jede mit einem Molekulargewicht von 130 kD und im Anschluß an N-Glycanase-Behandlung ungefähr 100 kD. Yoshihiro, et al., [Neuroscience, Research Supplement 18. S. S83 (1994)] berichteten die cDNA- und Aminosäuresequenzen für Kaninchen-Telencephalin auf dem 17. Annual Meeting of the Japan Neuroscience Society in Nagoya, Japan, 7.–9. Dezember 1993 und dem 23. Annual Meeting of the Society for Neuroscience in Washington, D.C., 9. November 1993 [Society for Neuroscience Abstracts 19 (1–3) S. 646 (1993)]. Die abgeleitete Aminosäuesequenz, die berichtet wurde, ließ vermuten, daß das 130 kD Telencephalon ein integrales Membranprotein mit neun extrazellulären Immunglobulin (Ig)-ähnlichen Domänen ist. Die distalen acht dieser Domänen zeigten Homologie zu anderen ICAM Ig-ähnlichen Domänen. Dieselbe Information wurde durch Yoshihara, et al., in Neuron 12: 543–553 (1994) berichtet.
Die PCT-Anmeldung WO 96/40916 (veröffentlicht am 19. Dezember 1996) beschreibt ICAM-4 Polynukleotide und Polypeptide sowie ein Verfahren zum Screening auf Neuopathologie durch Nachweisen und Quantifizieren von ICAM-4 in einer Körperflüssigkeit.
Es besteht daher weiterer Bedarf im Stand der Technik an der Entdeckung von zusätzlichen Proteinen, die an menschlichen Zell-Zell-Interaktionen teilnehmen und insbesondere ein Be darf an Information, die dazu dient, solche Proteine im Hinblick auf ihre Aminosäuresequenz spezifisch zu identifizieren und zu charakterisieren. Darüber hinaus ist es in dem Ausmaß, in dem solche Moleküle vielleicht die Basis für die Entwicklung von therapeutischen diagnostischen Mitteln bilden, wichtig, daß die DNA, die für diese kodiert, aufgeklärt wird. Solche grundlegende Information würde unter anderem die Produktion dieser Proteine im großen Maßstab ermöglichen, die Identifizierung von Zellen, die diese natürlich produzieren ermöglichen und die Herstellung von Antikörpersubstanzen oder anderen neuen Bindeproteinen, die spezifisch damit reaktiv sind und/oder inhibitorisch für Liganden/Rezeptorbindungsreaktionen sind, an denen sie beteiligt sind, ermöglichen.
Kurze Zusammenfassang der Erfindung
Hier beschrieben sind gereinigte und isolierte Polynukleotide (z. B. DNA-Sequenzen, RNA-Transkripte und anti-Sense Oligonukleotide davon), die für ein neues Polypeptid, "ICAM-4", kodieren, sowie Polypeptidvarianten (einschließlich Fragmente und Deletions-, Substitutionsund Additions-Analoga) davon, die eine oder mehrere Ligand/Rezeptorbindungs-biologische Aktivitäten und/oder immunologische Eigenschaften zeigen, die für ICAM-4 spezifisch sind. ICAM-4 spezifische Ligand/Rezeptor bindende biologische Aktivitäten umfassen Interaktionen von sowohl den ICAM-4 extrazellulären und zytoplasmatischen Domänen mit anderen Molekülen (z. B. in Prozessen von Zell-Zell-Adhäsion und/oder Signaltransduktion). Bevorzugte Sequenzen schließen genomische und cDNA-Sequenzen sowie ganz oder teilweise chemisch synthetisierte DNA-Sequenzen ein. Ein im Augenblick bevorzugtes Polynukleotid ist in SEQ ID NO: 1 angeführt und kodiert für Ratten-Spezies ICAM-4. Biologische Repliken (d. h. Kopien von isolierten DNA-Sequenzen, die in vivo oder in vitro hergestellt sind) der beschriebenen DNA-Sequenzen sind vorgesehen. Auch beschrieben sind autonom replizierende rekombinante Konstruktionen, wie zum Beispiel Plasmid- und virale DNA-Vektoren, die ICAM-4-Sequenzen enthalten und insbesondere Vektoren, worin die DNA, die für ICAM-4 oder eine ICAM-4-Variante kodiert, operativ mit einer endogenen oder exogenen Expressionskontroll-DNA-Sequenz verbunden ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt werden Wirtszellen, insbesondere einzelzellige Wirtszellen, wie zum Beispiel prokaryontische und eukaryontische Zellen stabil mit den beschriebenen DNA-Sequenzen auf eine Weise transformiert, die es ermöglicht, die gewünschten Polypeptide darin zu exprimieren. Wirtszellen, die solche ICAM-4 und ICAM-4-Variantenprodukte exprimieren, können zu einer Vielzahl von brauchbaren Verwendungen dienen. In dem Ausmaß, in dem die exprimierten Produkte auf den Wirtszelloberflächen "gezeigt" werden, können die Zellen ein wertvolles Immunogen für die Entwicklung von Antikörpersubstanzen darstellen, die spezifisch mit ICAM-4 und ICAM-4-Varianten immunreaktiv sind. Wirtszellen sind bemerkenswert brauchbar in Verfahren für die Produktion von ICAM-4 und ICAM-4-Varianten in großem Maßstab, wobei die Zellen in einem geeigneten Kulturmedium angezogen werden und die gewünschten Polypeptidprodukte von den Zellen oder aus dem Medium, in dem die Zellen angezogen werden, isoliert werden.
Neues ICAM-4, wie hier beschrieben, kann als Isolat aus natürlichen Zellquellen erhalten werden, wird jedoch bevorzugterweise gemeinsam mit ICAM-4-Variantenprodukten durch rekombinante Verfahren hergestellt werden, die Wirtszellen einschließen. Eine im Augenblick bevorzugte Aminosäuresequenz für ein ICAM-4 Polympeptid ist in SEQ ID NO: 2 angegeben. Die Produkte können vollständig oder teilweise glycosyliert, teilweise oder vollständig deglycosyliert oder in nicht-glycosylierten Formen erhalten werden, in Abhängigkeit von der für die , rekombinante Produktion ausgewählten Wirtszelle und/oder der post-Isolierungsverarbeitung. ICAM-4-Varianten können wasserlösliche oder unlösliche Monomere, Multimere oder zyklische ICAM-4-Fragmente umfassen, die alle oder ein Teil einer oder mehrerer der Domänenregionen einschließen, die oben angegeben sind und eine biologische oder immonologische Eigenschaft von ICAM-4 aufweisen, z. B. die Fähigkeit, an einen Bindungspartner von ICAM-4 zu binden und/oder die Bindung von ICAM-4 an einen natürlichen Bindungspartner zu inhibieren. ICAM-4-Varianten können auch Polypeptid-Analoga umfassen, worin eine oder mehrere der angegebenen Aminosäuren deletiert oder ersetzt sind: (1) ohne Verlust und bevorzugterweise mit Verstärkung von einer oder mehrerer biologischer Aktivitäten oder für ICAM-4 spezifischen immunologischen Charakteristika; oder (2) mit spezifischer Veränderung einer bestimmten Liganden/Rezeptorbindungsfunktion. Analoge Polypeptide, die zusätzliche Aminosäurereste (z. B. Lysin oder Cystein) einschließen, die die Multimerbildung erleichtern, sind vorgesehen.
Auch umfaßt sind Antikörpersubstanzert (z. B. monoklonale und polyklonale Antikörper, Antikörperfragmente, Single-Chain-Antikörper, chimäre Antikörper, CDR-grafted Antikörper und ähnliches) und andere Bindungsproteine (z. B. Polypeptide und Peptide), die spezifisch sind (d. h. nicht-reaktiv mit den ICAM-1, ICAM-2 und ICAM-R interzellulären Adhäsionsmolekülen, mit denen ICAM-4 strukturell verwandt ist) für ICAM-4 oder ICAM-4-Varianten.
Auch umfaßt sind Hybridomzellinien, die spezifisch die offenbarten monoklonalen Antikörper sekretieren. Im Augenblick bevorzugte Hybridome schließen diejenigen ein, die als 127A, 127H, 173E, 179I und 179H bezeichnet werden. Die Antikörpersubstanzen können unter der Verwendung von isoliertem natürlichem oder rekombinantem ICAM-4 oder ICAM-4-Varianten oder Zellen entwickelt werden, die solche Produkte auf ihren Oberflächen exprimieren. Bindungsproteine sind weiterhin für die Charakterisierung von Bindungsstellenstrukturen brauchbar (z. B. Epitopen und/oder der Sensitivität von Bindungseigenschaften gegenüber Modifikationen in der ICAM-4 Aminosäuresequenz).
Im Gegenzug dazu sind Bindungsproteine in Zusammensetzungen zur Immunisierung sowie zur Reinigung von Polypeptiden und der Identifizierung von Zellen, die die Polypeptide auf ihre Oberflächen zeigen, brauchbar. Sie sind auch offenkundig bei der Modulation (z. B. Blockierung, Inhibierung oder Stimulierung) von Liganden/Rezeptorbindungs-biologischen Aktivitäten, die ICAM-4 einschließen, brauchbar, insbesondere denjenigen ICAM-4 Effektorfunktionen, die an spezifischen und nicht-spezifischen Immunsystemantworten beteiligt sind. Für anti-ICAM-4-Antikörpersubstanzen spezifische anti-idiotypsiche Antikörper und die Verwendungen von solchen anti-idiotypischen Antikörpersubstanzen bei der Modulation von Immunantworten werden ebenfalls vorgesehen. Die Erfindung beschreibt weiter Verfahren von Screening auf Neuropathologie in einem Individuum, umfassend die Schritte von: a) Erhalten einer flüssigen Probe von dem Individuum; b) in Kontakt bringen der Probe mit einem Antikörper, der spezifisch mit ICAM-4 immunreaktiv ist; c) Messen des Spiegels von ICAM-4/Antikörperbindung in der Probe; und d) Vergleichen des Spiegels von ICAM-4/Antikörperbindung in der Probe mit dem Spiegel von ICAM-4/Antikörperbindung in Individuen (Kontrollen), die als frei von der Neuropathologie bekannt sind. Tests für den Nachweis und die Quantifizierung von ICAM-4 auf Oberflächen und in Körperflüssigkeiten, wie zum Beispiel Serum oder cerebrospinaler Flüssigkeit, können zum Beispiel eine einzelne Antikörpersubstanz oder mehrere Antikörpersubstanzen in einem "Sandwich"-Testformat einschließen. Beim Nachweis von ICAM-4 in einer Körperflüssigkeit sind Antikörper auch zur Ermittlung des Auftretens von Neuropathologien, die mit erhöhten Spiegeln von zirkulierenden ICAM-4 korreliert werden können, brauchbar. Solche Neuropathologien schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, cerebrale Ischämie (d. h. Schlaganfall), die sich aus verschiedenen Erkrankungen ergibt, einschließlich, zum Beispiel, Thrombose, Embolie, cerebraler aneurysmaler Haemorrhagie, Vasospasmie und Ähnlichem. Die Mengenbestimmung von zirkulierendem ICAM-4 kann auch zwischen verschiedenen Formen von Epilepsie unter scheiden und auch die Bestimmung der Phase von AIDS-Progression erlauben. Noch andere neurodegenerative Erkrankungen, für die eine Messung von zirkulierendem ICAM-4 für die Diagnose brauchbar sein kann, schließen verschiedene Formen von Alzheimer-Erkrankung und andere kortikale Demenz (wie zum Beispiel Pick's-Erkrankung, diffuse kortikale Lewy's-Körpererkrankung und Frontallappen-Degenerierung) ein, subkortikale Demenzen (einschließlich Parkinsons-Erkrankung, Huntington's-Erkrankung und progressive Supranuklear), eine Zahl der primären psychiatrischen Erkrankungen (wie zum Beispiel Depression, Schizophrenie und Psychose) sowie nicht genetische Demenzen, die sich zum Beispiel aus Infektionen, Vaskulitis, Stoffwechsel- und Nährstoff-Erkrankungen (z. B. Thyroid, Vitamin B12-Defizienz), vaskulären Erkrankungen (multipler Infarkt, lakunärer Zustand, Binswanger's-Erkrankung), toxischen Encephalopathien (z. B. Aussetzen gegenüber Kohlenmonoxid, Schwermetallen oder anderen industriellen Verschmutzungen) und Tumoren ergeben.
Der wissenschaftliche Wert der Information, die durch die Veröffentlichungen von DNA- und Aminosäuresequenzen von ICAM-4 beigetragen wird, ist offensichtlich. Als eine Serie von Beispielen macht das Wissen der Sequenz einer cDNA für ICAM-4 die Isolierung von genomischen DNA-Sequenzen, die für ICAM-4 kodieren und die Spezifizierung von ICAM-4 Expressionskontroll-Tegulatorischen Sequenzen, wie zum Beispiel Promotoren, Operatoren und ähnliches möglich. Von den DNA/DNA-Hybridisierungsverfahren, die mit den beschriebenen DNA-Sequenzen unter stringenten Bedingungen durchgeführt werden, wird ähnlich erwartet, daß diese die Isolierung von DNAs ermöglichen, die für allelische Varianten von ICAM-4 kodieren, anderen strukturell verwandten Proteinen, die eine oder mehrere der biologischen und/oder immunologischen Eigenschaften teilen, die spezifisch für ICAM-4 sind, und Proteine aus anderen Spezies, die zu ICAM-4 homolog sind. DNAs sind in DNA/RNA-Hybridisierungstests brauchbar, um die Fähigkeit von Zellen zu testen, ICAM-4 zu synthetisieren. Auch durch diese Offenbarung erhältlich gemacht werden anti-Sense Polynukleotide, die für die Regulation der Expression von ICAM-4 durch diejenigen Zellen relevant sind, die Dasselbe normalerweise exprimieren. Als eine weitere Serie von Beispielen macht das Wissen der DNA- und Aminosäuresequenzen von ICAM-4 die Erzeugung von ICAM-4-Varianten durch rekombinante Mittel, wie zum Beispiel Mittel Hybridfusionsproteine (manchmal als "Immunadhäsionen"), die durch die Anwesenheit von ICAM-4 Proteinsequenzen und Immunglobulin schwere Ketten konstante Regionen und/oder Gelenkregionen gekennzeichnet sind, möglich. Siehe, Capon et al., Nature, 337: 525–531 (1989); Ashkenazi at al., P.N.A.S. (USA), 88: 10535–10539 (1991); und PCT WO 89/02922, veröffentlicht am 6.
April 1989. Die ICAM-4-Varianten Fusionsproteine können auch zum Beispiel ausgewählte extrazelluläre Domänen von ICAM-4 und Teile von anderen Zelladhäsionsmolekülen enthalten.
Die hier offenbarte DNA ermöglicht auch die Identifizierung von nicht translatierten DNA-Sequenzen, die spezifisch die Expression von Polynukleotiden unterstützen, die operativ mit den Promotorregionen verbunden sind. Die Identifizierung und Verwendung von solchen Promotorsequenzen ist besonders in Fällen wünschenswert, zum Beispiel Gentransfer, die spezifisch eine heterologe Genexpression in einer begrenzten neuronalen Umgebung erfordern können. Auch vorgesehen sind Vektoren, die die offenbarten Promotoren, sowie chimäre Genkonstrukte umfassen, worin der Promotor operativ mit einer heterologen Polynukleotidsequenz und einem Transkriptionsterminationssignal verbunden ist.
Die durch die vorliegende Offenbarung zur Verfügung gestellte DNA- und Aminosäuresequenzinformation macht auch die systematische Analyse der Struktur und Funktion von ICAM-4 und Definitionen von denjenigen Molekülen möglich, mit denen es auf extrazellulärem und interzellulärem Niveau interagieren wird. Die Idiotypen von anti-ICAM-4 monoklonalen Antikörpern sind für solche Moleküle repräsentativ und können natürliche Bindungsproteine (Peptide und Polypeptide) nachahmen, durch die die ICAM-4 intrzellulären und intrazellulären Aktivitäten moduliert werden oder durch die ICAM-4 intrzellulären und intrazellulären Ereignisse moduliert. Wechselweise können sie neue Klassen von Modulatoren von ICAM-4 Aktivitäten darstellen. Anti-idiotypische Antikörper können wiederum neue Klassen von biologisch aktiven ICAM-4 Äquivalenten darstellen. In vitro-Tests zur Identifizierung von Antikörpern oder anderen Verbindungen, die die Aktivität von ICAM-4 modulieren, können zum Beispiel das Immobilisieren von ICAM-4 oder eines natürlichen Liganden, an das ICAM-4 bindet, nachweisbares Markieren des nicht-immobilisierten Bindungspartners, Inkubieren der Bindungspartner miteinander und Nachweisen des Effekts einer Testverbindung auf die Menge von gebundenen Marker einschließen, wobei eine Verringerung in dem gebundenen Marker in der Anwesenheit der Testverbindung verglichen mit der Menge von Marker, die in der Abwesenheit der Testverbindung gebunden ist, anzeigt, daß das Testmittel ein Inhibitor der ICAM-4 Bindung ist.
Die hier offenbarte DNA-Sequenzinformation macht auch die Entwicklung von Nagern durch homologe Rekombination oder "Knockout"-Strategien [siehe, z. B. Kapecchi, Science, 244: 1288–1292 (1989)] möglich, die dabei versagen, ein funktionelles ICAM-4-Protein zu exprimieren oder die ein Varianten-ICAM-4-Protein exprimieren. Solche Nager sind als Modelle zur Untersuchung der Aktivitäten von ICAM-4 und ICAM-4-Modulatoren in vivo brauchbar. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Unterscheidung zwischen verschiedenen Formen von Epilepsie zur Verfügung gestellt, umfassen die Schritte von: a) in Kontakt bringen einer flüssigen Probe, die von einem ersten Individuum erhalten wurde mit einem Antikörper, der spezifisch mit ICAM-4 immunreaktiv ist; b) Quantifizieren des Spiegels von ICAM-4/Antikörperbindung in der Probe; und c) Vergleichen des Spiegels von ICAM-4/Antikörperbindung in der Probe mit dem Spiegel von ICAM-4/Antikörperbindung in einem zweiten Individuum, das eine bekannte Form von Epilepsie aufweist, ausgewählt aus Grand Mal-Grenzen, Synkope oder Schläfenlappenepilepsie (SLE).
Genaue Beschreibung der Erfindung
Relevant für die Offenbarung der vorliegenden Erfindung sind der Aufbau und die Konstruktion von Oligonukleotidsonden für die PCR-Amplifikation von ICAM-verwandten DNAs; die Verwendung der Sonden zur Amplifikation eines menschlichen genomischen Fragments homolog zu, jedoch distinkt von DNAs, die ICAM-1 und ICAM-2 kodieren; das Screening von cDNA-Bibliotheken mit dem genomischen Fragment, um zusätzliche ICAM-R kodierende Sequenzen zu isolieren, das Screening von cDNA-Bibliotheken, um eine Vollängenmenschliche cDNA-Sequenz zu isolieren, die für ICAM-R kodiert; die Charakterisierung von DNA- und Aminosäuresequenzinformation für ICAM-R, insbesondere wie mit ICAM-1 und ICAM-2 verwandt, die Entwicklung von Säugetier-Wirtszellen, die ICAM-R exprimieren; die Ermittlung von Hinweisen der ICAM-R-Beteiligung an Adhäsionsereignissen, die CD18-abhängige und CD18-unabhängige Signalwege einschließen; die Inhibierung von Zelladhäsion an ICAM-R durch ICAM-R-abgeleitete Peptide; die Expression von Varianten von ICAM-R; die Präparation und Charakterisierung von anti-ICAM-R-Antikörpern und Fragmenten davon; die Kartierung von ICAM-R-Epitopen, die durch anti-ICAM-R monoklonale Antikörper erkannt werden; die Bestimmung der Verteilung und die biochemische Charakterisierung von ICAM-R und RNA, die für Dasselbe kodiert; die Ermittlung von ICAM-R in homotypischer Zell-Zell-Adhäsion und Immunzellaktivierung/-proliferation; die Charakterisierung von ICAM-R monoklonalen Antikörpern; und die Ermittlung von differenziellen Phosphorylierungs- und Zytoskelettassozüerungen der zytoplasmatischen Domäne von ICAM-R. Auch beschrieben wurde die Identifizierung einer Nagetier-ICAM-kodierenden DNA, die zu der Zeit das Rattenhomolog von menschlichen ICAM-R zu sein schien und die Verwendung dieser DNA, um DNAs zu konstruieren und zu exprimieren, die für Glutathion-S-Transferase-Fusionsproteine kodieren. Die genaue Beschreibung, wie diese Nagetier-DNA identifiziert wurde, ist hier als Beispiel 1 wiedergegeben. Während mehr der Nagetier ICAM-kodierenden Sequenz identifiziert wurde, wurde ersichtlich, daß die Nagetier ICAM-DNA nicht für ein Ratten-spezifisches Homolog von menschlichem ICAM-R kodiert, sondern tatsächlich für ein neues ICAM-Polypeptid kodiert, das hier als ICAM-4 bezeichnet ist. Um die Ereignisse zu verstehen, die zu der Identifizierung von ICAM-4 führten, wird eine Chronologie zur Verfügung gestellt, die von einer genauen Beschreibung der Erfindung gefolgt wird.
Eine erste Nagetier-genomische ICAM-4-Sequenz wurde identifiziert, die für eine Region kodierte, die homolog zur Domäne 2 (hier SEQ ID NO: 3) von menschlichem ICAM-R (hier als SEQ ID NO: 4) war. Eine zweite überlappende genomische DNA (hier SEQ ID NO: 5) wurde ebenfalls identifiziert, die sowohl die Domäne 2 Region von SEQ ID NO: 2 und Sequenzen für ICAM-1 kodierte. Unter der Verwendung von SEQ ID NO: 3 als einer Sonde wurde eine Nagetier-Milz-cDNA (hier SEQ ID NO: 6) identifiziert, die für Domänen 2 bis 5 kodierte, sowie für eine fünfte Domäne, die vorher nicht als eine ICAM-Domäne beobachtet wurde. Zu dieser Zeit schienen diese neu identifizierten Nagetier-DNAs für ein Nagetier-Homolog von menschlichem ICAM-R zu kodieren, jedoch erwiesen sich Alignments der 3'-Regionen dieser DNAs mit anderen ICAMs als schwierig.
Die anschließende Isolierung eines 1 kb-cDNA-Klons aus einer Rattenmilz-Bibliothek und die Amplifikation eines RT-PCR-Fragments zeigten, daß ein Teil von sowohl dem cDNA und genomischen Klonen nicht sequenziert war. Ein weiteres RT-PCR-Amplifikationsprodukt (SEQ ID NO: 7) bestätigte diese Auslassung. Es wurde bestimmt, daß ein Fragment von 177 bp durch EcoRI-Verdau der Klone aus den genomischen und cDNA-Klonen ausgeschnitten wurde, um diese Sequenzen aus λ-Phage for DNA-Sequenzierungsstudien zu isolieren. Die Re-Analyse von SEQ ID NO: 5 und 6 im Hinblick auf diese anderen Sequenzen ermöglichte die Identifizierung von genaueren und vollständigeren Sequenzen für die anfangs isolierten genomischen und cDNA-Klone, die hier als SEQ ID NO: 8 und 9 in korrigierter Form präsentiert werden.
Um eine vollständige kodierende Sequenz für ICAM-4 zu identifizieren, wurde eine Rattengehirn-cDNA (SEQ ID NO: 10) isoliert und dies 5'-Ende-Sequenz durch 5'- Schnellamplifikation von cDNA-Enden (5'-RACE) bestimmt, wobei das Amplifikationsprodukt in SEQ ID NO: 11 angegeben ist. Die Kombination der Information aus dem RT-PCR-Klon (SEQ ID NO: 7), der Hirn-cDNA (SEQ ID NO: 10) und dem Race-Amplifikationsprodukt (SEQ ID NO: 11) ermöglichte die Identifizierung der vollständigen kodierenden Sequenz für ICAM-4 (SEQ ID NO: 1).
Die folgende Erfindung wird daher durch die folgenden Beispiele verdeutlicht. Genauer gesagt, betrifft Beispiel 1 die Klonierung einer teilweisen Nagetier-ICAM-4-DNA. Beispiel 2 beschreibt die Northern-Blot-Analyse von Nagetier-ICAM-4-Transkription. Beispiel 3 beschreibt die Isolierung einer Vollängen-Nagetier-ICAM-4-cDNA. Beispiel 4 betrifft die in situ-Hybridisierung von Nagetier-ICAM-4 in Hirngewebe. Beispiel 5 betrifft die Erzeugung von ICAM-4-Fusionsproteinen in Prokaryonten. Beispiel 6 beschreibt die Produktion von monoklonalen Antikörpern, die spezifisch für Ratten-ICAM-4/GST-Fusionsproteine sind. Beispiel 7 beschreibt die Expression von löslichen Ratten-ICAM-4-Proteinen in einem Baculovirus-Expressionssystem. Beispiel 8 betrifft die Produktion von monoklonalen Antikörpern, spezifisch für Ratten-ICAM-4, das in einem Baculovirus-System exprimiert wurde. Beispiel 9 beschreibt die Immunzytochemische Analyse von Ratten-ICAM-4-Expression. Beispiel 10 betrifft die Klonierung einer für ICAM-4 kodierenden menschlichen genomischen DNA. Beispiel 11 betrifft die Klonierung einer menschlichen für ICAM-4 kodierenden DNA. Beispiel 12 beschreibt die Northern-Analyse von menschlicher ICAM-4-Expression. Beispiel 13 beschreibt die Erzeugung von menschlichen ICAM-4/GST-Fusionsproteinen. Beispiel 14 betrifft die Produktion von monoklonalen Antikörpern, die für menschliches ICAM-4 immunspezifisch sind. Beispiel 15 beschreibt die Entwicklung eines Fangtests zur Bestimmung der Konzentration von löslichem ICAM-4 in einer bestimmten Flüssigkeit. Beispiel 16 wendet die Fangtestmethode bei der Bestimmung der ICAM-4-Konzentration im Serum von Schlaganfall-Patienten an. Beispiel 17 betrifft die Ermittlung von ICAM-4 Transkription in einem Ratten-Epilepsiemodell. Beispiel 18 beschreibt die Messung von zirkulierender ICAM-4-Konzentration als eine Bestimmung von verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen. Beispiel 19 betrifft die Klonierung einer Promotorregion für menschliches ICAM-4.
Beispiel
Konierung von Ratten-ICAM-verwandter DNA
A. Isolierung einer Ratten genomischen ICAM-verwandten Domäne 2 DNA
Eine Ratten genomische Bibliothek, die in λ-EMBL3 konstruiert wurde, wurde mit einer [³²P]-markierten Probe gescreent, die durch PCR aus DNA erzeugt wurde, die für die menschliche ICAM-3 Domäne 2 kodierte. Die Sequenz der Probe ist in SEQ ID NO: 12 angegeben. Bibliotheks-Plaques wurden auf Hybond N+ Nylon-Membranen (Amersham, Arlington Heights, IL) transferiert. Das Screening aller cDNA- und genomischen Bibliotheken wurde gemäß Standardprotokollen duchgeführt. Die Prähybridisierung und Hybridisierungen wurden in einer Lösung von 40–50% Formamid, 5X Denhardt's, 5X SSPE und 1,0% SDS bei 42°C durchgeführt. Sonden ([³²P]-markiert) wurden in einer Konzentration von 10⁵–10⁶ cpm/ml von Hybridisierungslösung hinzugefügt. Im Anschluß von 16–18 Stunden von Hybridisierung wurden die Nylon-Membranen extensiv bei Raumtemperatw in 2X SSPE mit 0,1% SDS gewaschen und anschließend bei –80°C über Nacht gegenüber einem Röntgenfilm ausgesetzt. Positive Plaques wurden einer oder mehrere Runden Hybridisierung unterzogen, um einen klonalen Phagen zu erhalten. Die DNA, die aus Lysat der positiven Klone präpariert wurde, wurden in pBS+ subkloniert und sequenziert.
Ein erster genomischer Klon wurde identifiziert, der für eine Ratten-ICAM-verwandte Domäne 2 kodierte, der als homolog zu Domäne 2 Regionen in anderen ICAM-Familienmitgliedern bestimmt wurde, jedoch verschieden von dem vorher berichteten Nukleotidsequenzen für Ratten-ICAM-1 [Kita, et al., Biochem. Biophys. Acta 1131: 108–110 (1992)] oder Maus-ICAM-2 [Xu, et al., J.Immunol. 149: 2560–2565 (1992)] war. Die Nukleinsäure und abgeleiteten Aminosäuresequenzen für diesen Klon wurden offenbart, wie die behaupteten Variantenformen von ICAM-R und sind jeweils in SEQ ID NO: 3 und 13 hier angegeben.
Ein zweiter überlappender Klon wurde ebenfalls mit denselben Sonden identifiziert und wurde als die ICAM-Domäne 2 Sequenz von SEQ ID NO: 3 und 5'-DNA, die für mindestens einen Teil von Ratten-ICAM-1 kodierte, enthaltend bestimmt. Die Nukleinsäuresequenz für diesen Klon ist hier als SEQ ID NO: 5 angegeben. Dieser zweite Klon zeigte, daß das ICAMverwandte Genfragment des ersten Klons und das Gen, das für Ratten-ICAM-1 kodiert, innerhalb von 5 kb voneinander auf demselben Rattenchromosom lokalisiert sind.
B. Isolierung von Ratten-ICAM-verwandter cDNA
Um eine vollständigere Protein-kodierende Sequenz für das ICAM-verwandte Polypeptid zu identifizieren, wurde [³²P]-markierte DNA, die für die Domäne 2 Sequenz von dem in Teil A identifizierten Ratten genomischen Klon (SEQ ID NO: 3), supra, kodierte, dazu verwendet, um eine Zahl von cDNA-Bibliotheken von verschiedenen Ratten- und Mauszelltypen, einschließlich Rattenmakrophagen (Clontech, Palo Alto, CA), peripheren Blutlymphozyten (PBL) (Clontech), T-Zellen (in-Haus konstruiert) und Milz (Clontech) und Maus-PBL (Clontech), T-Zellen (in-Haus konstruiert) und B-Zellen (in-Haus konstruiert) zu screenen.
Ein einzelner Klon wurde in einer Rattenmilz-cDNA-Bibliothek (Clontech) identifiziert, der fünf Ig-ähnliche Domänen enthielt, von denen vier homolog zu Domänen 3 bis 5 in sowohl ICAM-1 und ICAM-R waren. Darüber hinaus enthielt dieser Klon 3'-DNA, die für eine offensichtliche fünfte Ig-ähnliche Domäne kodierte, die bisher nicht in irgendeinem anderen ICAM-Polypeptid identifiziert wurde. Zusätzlich enthielt der Klon eine ungewöhnliche 3'-Sequenz, die anschließend als ein partielles Intron (diskutiert infra) bestimmt wurde, das zwischen Domänen 4 und 5 lokalisiert war, was vermuten läßt, daß der Klon das Produkt eines unreifen oder fehlerhaft prozessierten Transkripts war. Die Anwesenheit der einmaligen Domäne und der Nachweis, daß die 3'-Region nicht mit anderen bekannten ICAMs geeignet übereinstimmte, ließ vermuten, daß die ICAM-verwandte DNA potentiell für ein neues Ratten-ICAM-Polypeptid kodierte. Die Nukleinsäuresequenz für diesen Milz-cDNA-Klon ist in SEQ ID NO: 6 angegeben.
C. Re-Analyse von Ratten cDNA und genomischen DNAs Anschließend wurde nachgewiesen, daß das dem partiellen Rattenmilz-cDNA-Klon (hier SEQ ID NO: 6) und dem Rattenleber genomischen Klon (hier SEQ ID NO: 5) ein internes 177 bp EioRI-Fragment fehlte, das Teil jedes dieser Klone war, jedoch in einem Subklonierungsschritt verloren wurde, als die Bibliotheksinserts aus dem λ-Vektor durch EioRI Verdau entfernt wurden und in einen Sequenzierungsvektor ligiert wurden. Die Beobachtung, daß den cDNA und genomischen Klonen möglicherweise ein kodierendes Fragment fehlt, wurde nach Alignments der Ratten-genomischen und cDNA-Sequenzen mit verschiedenen RT-PCR-Amplifikationsprodukten, einschließlich SEQ ID NO: 7, ersichtlich, die eine Lücke in der Rattensequenz ergaben.
Die anschließende Isolierung und das Sequenz-Alignment einer cDNA aus einer Milzbibliothek unter der Verwendung des Milz-cDNA-Klons (SEQ ID NO: 6) als eine Sonde, stellte einen ersten Hinweis zur Verfügung, daß ein Teil der Milz-cDNA und der genomischen Klone nicht sequenziert wurde. Eine weitere Bestätigung dieser Idee wurde nach Amplifikation eines RT-PCR-Fragments ersichtlich, das die Domänen 3 bis 5 überspannte, unter der Verwendung eines 5'-Primers (RRD3 5'-Xho, der eine 5' XhoI-Restriktionsstelle enthält, um die Klonierung zu erleichtern), der in SEQ ID NO: 14 angegeben ist und einen 3'-Primer (RRDS 3'-Rind, der eine HindIII-Stelle enthält, um die Klonierung zu erleichtern), angegeben in SEQ ID NO: 15.
Das Alignment dieser zwei DNAs zeigte deutlich, daß die cDNA und genomischen Klone ein Fragment vor der Sequenzierung verloren hatten; diese Idee wurde weiter im Anschluß an die Sequenzierung der RT-PCR-DNA, die infra diskutiert wird, unterstützt. Es wurde geschlossen, daß der Restriktionsverdau mit EioRI, um die cDNA und genomischen Fragmente vor der Sequenzierung zu entfernen, zu der Exzision eines 177 bp Fragments führte, die nicht visuell in der Agarosegel-Auftrennung der Klone von den λ-Phagen Sequenzen nachgewiesen wurde. Die anschließende Sequenzanalyse bestätigte die Anwesenheit von zwei EioRI-Stellen, die ein 177 bp Fragment in beiden der originalen Klone flankierten.
Das 177 bp EioRI-Fragment liegt zwischen Nukleotiden 719 und 896 im Ratten-partiellen cDNA-Klon, wie in SEQ ID NO: 9 angegeben und zwischen Nukleotiden 2812 und 2989 in dem teilweisen genomischen Klon, wie in SEQ ID NO: 8 angegeben.
D. Durch den RT-PCR-Klon isolierte DNA RT-PCR wurde verwendet, um eine vollständigere Sequenzinformation für das Ratten-ICAMverwandte Gen zu erzeugen. Die Sequenzinformation von dem genomischen Klon (SEQ ID NO: 3) wurde verwendet, um Sense-Primer aufzubauen, die komplementär zu einer Region 5' zu der Protein-kodierenden Region waren, wie aus dem cDNA-Klon bestimmt und anti-Sense-Primer, die komplementär zu kodierenden Sequenzen und Regionen 3' zu der kodierenden Sequenz in dem cDNA-Klon aufgebaut waren (SEQ ID NO: 6).
Die Templat-cDNA für PCR-Reaktionen wurde wie folgt hergestellt. Ungefähr 2μg von Poly A⁺RNA, isoliert aus Ratten Milz-Zellen wurden durch Erhitzen auf 65°C in einem 10 μl-Volumen denaturiert. Im Anschluß an die Denaturierung wurden 0,1 μl RNasin (Invitrogen, San Diego, CA), 5 μl 5X RTase Puffer (BRL), Bethesda, MD), 2 μl Random-Hexamere (pd(N)6 bei 100 μg/ml) (Pharmacia, Piscataway, NJ), 6 μ1 dNTPs (jeweils 2 mM) und 2 μ1 AMV RTase (BRL) hinzugefügt und die Reaktion wurde bei 42°C für 60–90 Minuten inkubiert. Die Reaktionen wurden bei –20°C bis zum Gebrauch gelagert.
Eine anfängliche Serie von Experimenten wurde durchgeführt, um Oligonukleotid-Primerpaare zu identifizieren, die ein Amplifikationsprodukt in PCR-Reaktionen unter der Verwendung von Rattenmilz-cDNA als Templat produzieren. Verschiedene 5'-Sense-Primer wurden in PCR mit einem 3'-Primer gepaart, der so aufgebaut war, um komplementär zu einer internen kodierenden Sequenz zu sein: der 3'-Primer wurde als RRD2- 3–1 bezeichnet und ist in SEQ ID NO: 16 angegeben.
(In dem letztendlich isolierten RT-PCR-Produkt, SEQ ID NO: 7, infra, entsprach der Primer RRD2 3-1 zu Nukleotiden 719 bis 1736). Ähnlich wurden verschiedene 3'-anti-Sense-Primer mit einem 5'-Primer gepaart, der so aufgebaut war, um komplementär zu einer anderen internen kodierenden Sequenz zu sein; der 5'-Primer in diesen Reaktionen wurden als RGen3900S bezeichnet und ist in SEQ ID NO: 17 angegeben.
(In SEQ ID NO: 7, infra, entsprach Primer RGen3900S den Nukleotiden 1719 bis 1736.) Basierend auf der Größe der Amplifikationsprodukte und der Fähigkeit dieser Produkte, mit dem partiellen cDNA-Klon zu hybridisieren, wurde ein Paar von Primern als am effizientesten bestimmt und wurde in den nachfolgenden PCR-Amplifikationen verwendet. Der 5'-Primer wurde als RGen780S (SEQ ID NO: 18) bezeichnet, und der 3'-Primer wurde als RGen 4550S (SEQ ID NO: 19) bezeichnet.
(In SEQ ID NO: 7, infra, entsprach Primer RGen780S den Nukleotiden 1 bis 18 und Primer RGen4550AS entsprach den Nukleotiden 2197 bis 2214).
Dieses Primerpaar wurde in PCR unter einer Anzahl von Bedingungen verwendet, um die Amplifikation zu optimieren. Eine Gesamtzahl von 15 verschiedenen PCR-Puffern, die sich in pH und Mg⁺⁺ Konzentration unterschieden, wurden bei zwei verschiedenen Annealing-Temperaturen verwendet und eine Probe des Produkts aus jeder Reaktion wurde auf einem 1% Agarosegel aufgetrennt. Da kein Amplifikationsprodukt durch visuelle Inspektion auf dem Ethidiumbromid gefärbten Gel von allen diesen Reaktionsbedingungen nachgewiesen werden konnte, wurde eine empfindlichere Southern-Hybridisierung verwendet, um die PCR-Produkte nachzuweisen.
Aliquots der amplifizierten DNA wurden durch Elektrophorese aufgetrennt, auf eine Hybond N+ Nylon-Membran unter Verwendung von herkömmlichen Southern-Blood Dochttechniken transferiert und mit der gesamten Ratten cDNA hybridisiert, die [³²P]-markiert wurde. Die Hybridisierungsbedingungen waren im wesentlichen dieselben, wie für das Bibliotheksscreening-Verfahren in Teil A, supra, beschrieben. Die Autoradiographie zeigte an, daß eine kleine Menge an DNA von ungefähr 2,2 kb in zwei der Reaktionen erzeugt wurde, und der Rest des Amplifikationsprodukts aus den zwei Reaktionen wurde auf einem Agarosegel aufgetrennt. Die 2,2 kb Region wurde aus dem Gel eluiert, obwohl kein Bande nach visueller Inspektion ersichtlich war und als ein Templat in einer weiteren PCR-Reaktion unter der Verwendung derselben Primer (SEQ ID NO: 18 und 19), tris-HCl-Puffer, pH 8,0, 1 mM Mg⁺⁺ und 55°C Annealing-Temperatur verwendet. Das Amplifikationsprodukt aus der sekundären PCR war in dem Gel sichtbar und wurde zur Sequenzanalyse in ein pBS⁺-Plasmid (Stratagene, La Jolla, CA) eluiert und kloniert.
Der erhaltende RT-PCR-Klon wurde als 2214 by enthaltend bestimmt, wie in SEQ ID NO: 7 angegeben. Der Klon kodierte für Domänen 2 bis 6, die in dem Rattenmilz-cDNA-Klon gefunden wurden, eine weitere Amino-terminale Domäne 1, eine weitere Carboxy-terminale Domäne 7 und 164 by von etwas, das eine weitere Carboxy-terminale Domäne 8 zu sein schien. Unmittelbar 5' zu Domäne 1 war eine zusätzlich 144 by Sequenz, von der vermutet wurde, daß sie aus einem Intron zwischen dem Leader und der ersten Domäne stammte. Die ser Klon enthielt keine 5'-Leadersequenz oder 3'-Transmembran- und zytoplasmatische Regionen. Zusätzlich zu der vorher identifizierten Domäne 6 in dem Milz-cDNA-Klon unterstützte die 7. und B. Domäne in dem RT-PCR-Klon die Hypothese, daß dieser Klon eine neue Nagetier-ICAM war.
Beispiel 2
Northern-Blot-Analyse
Um die Möglichkeit weiter zu untersuchen, daß die in Beispiel identifizierten ICAMverwandten Klone für ein neues ICAM-Polypeptid kodierten, wie durch die einmaligen Igähnlichen Domäne vermutet, wurde die Gewebe-spezifische Expression durch Nothern-Blot-Analyse untersucht, um einen Vergleich mit den früher berichteten Expressionsmustern von menschlichen ICAMs zu ermöglichen. [ICAM-1, Dustin, et al., J.Immunol. 137: 245–254 (1986); ICAM-2, Staunton, et al., Nature 339: 61–64 (1990); ICAM-R, de Fourgerolles and Springer, J. Exp. Med. 175: 185–190 (1992)].
Gesamte zelluläre RNA aus Rattenlunge, -hirn, -rückenmark, -leber -verdauungstrakt, - thymus, -lymphknoten und -milz wurde unter der Verwendung von STAT60 RNA-Isolationsreagenzien (Tel-Test "B", Inc. Friendswood, Texas) gemäß dem durch den Hersteller vorgeschlagenen Protokoll präpariert. Poly A⁺ RNA wurde aus Gesamt-RNA unter der Verwendung von Oligo-dT-Zellulosesäulen gereinigt. Ungefähr 5 μg an RNA, abgeleitet aus jedem Gewebe, wurde auf einem 1% Formaldehyd Agarosegel aufgetrennt und auf Hybond-C Nitrozellulose-Membran (Amersham) transferiert.
Ein Fragment der Rattenmilz-cDNA aus Beispiel , das den Domänen 2 bis 4 (Nukleotide 1 bis 724 in SEQ ID NO: 6) entsprach, wurde in pBluescript SK⁺ (Stratagene) subkloniert und eine anti-Sense Ribosonde wurde durch in vitro-Transkription unter der Verwendung von ³²Pmarkiertem UTP und ungefähr 500 ng an linearisiertem Templat gemäß dem durch den Hersteller vorgeschlagenen Protokoll (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) erzeugt. Die Membran-gebundene RNA wurde in einer Lösung prähybridisiert, die 50% Formamid, 5X SSC, 1X PE (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1% Natriumpyrophosphat, 0,2% Polyvinylpyrrolidon, 0,2% Ficoll, 5 mM EDTA, 1% SDS) und 150 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA enthielt. Die radiomarkierte Probe wurde durch Kochen denaturiert und zu der Prähybridisierungslösung in einer finalen Konzentration von 1 × 10⁶ cpm/ml hinzugefügt. Der Hybridisie rung wurde ermöglicht, für 16 bis 18 Stunden bei 65°C fortzuschreiten. Die Membran wurden dann bei 65°C in 2X SSC, enthaltend 0,1% SDS, gewaschen und anschließend für 3–16 Stunden einem Röntgenfilm ausgesetzt.
Die Northern-Blood-Analyse zeigte, daß die in Beispiel identifizierte ICAM-verwandte cDNA nur im Rattenhirn exprimiert wurde, eine Gewebespezifität, die bisher für kein anderes der ICAM-Polypeptide berichtet wurde. Dieses Expressionsmuster, in Kombination mit den einmaligen Ig-ähnlichen Domänen, von denen bisher nicht bekannt war, daß sie in anderen ICAM-Polypeptiden existieren, zeigte, daß der ICAM-verwandte Klon ein neues Mitglied der ICAM-Familie von Proteinen war, und wurde ICAM-4 benannt.
Die Tatsache, daß die anfänglich identifizierten cDNA-Klone in einer Rattenmilz-Bibliothek nachgewiesen wurden, ließ vermuten, daß eine Untergruppe von Zellen in der Milz vielleicht ICAM-4 in niedrigert Spiegeln exprimiert. Jedoch konnte ein richtig gesplicter Klon nicht in zahlreichen hämopoetischen cDNA-Bibliotheken nachgewiesen werden, was zu Zweifeln führte, ob das ICAM-4-Protein wirklich in anderen Geweben als Hirn exprimiert wurde. Eine Erklärung für den Nachweis von ICAM-4-cDNA in Milz ist die, daß die Sensitivität der PCR möglicherweise eine Spurenmenge von Transkript amplifiziert hat, obwohl diese Gewebe das kodierte Protein nicht exprimieren.
Beispiel 3
Isolierung von Vollängen-Ratten ICAM-4-cDNA
A. Identifizierung eines Rattenhirn-cDNA-Klons
Im Hinblick auf die Gewebe-spezifische Expression von ICAM-4 wurde Hirngewebe-mRNA in einem Versuch verwendet, eine Vollängen-cDNA zu isolieren, die für ICAM-4 kodiert. Zwei Sonden, eine komplementär zu Domänen 1 bis 2 und eine zweite, komplementär zu Domänen 3 bis 5 des in Beispiel identifizierten Milz-cDNA-Klons (SEQ ID NO: 7), wurden radiomarkiert und dazu verwendet, um eine Rattenhirn-cDNA-Bibliothek in λ-gt10 zu screenen, die vorher in-Haus konstruiert wurde. Die Hybridisierungsbedingungen waren wie in Beispiel beschrieben, und positive Plaques wurden einer oder mehrerer Runden von Screening unterzogen, um einen klonalen Phagen zu erhalten.
Neun positive Klone wurden identifiziert, von denen zwei an beide Sonden hybridisierten. Der längste der zwei Klone, bezeichnet als Klon 7, enthielt 2550 bp, die für vier der fünf Igähnlichen Domänen kodierten, die in der Sonden-cDNA gefunden wurden. Zusätzlich kodierte Klon 7 vier Ig-ähnliche Domänen, die nicht in der Sonde gefunden wurden. Mögliche Transmembran- und zytoplasmatische Domänen wurden identifiziert, die von einem Stopp-Kodon, einem Poly-Adenylierungssignal und einem Poly-A-Schwanz gefolgt wurden. Klon 7 fehlte mindestens eine 5' Ig-ähnliche Domäne, wie durch Vergleich mit dem RT-PCR-Klon (SEQ ID NO: 7) bestimmt, und es fehlte ihm auch eine Leadersequenz; ein Re-Screening der Bibliothek ergab keine längeren Klone, die diese Sequenzen enthielten. Die Nukleinsäuresequenz für Klon 7 ist in SEQ ID NO: 10 angegeben.
B. Bestimmung des 5'-Endes
Um Domäne 1 und andere 5'-Sequenzen zu isolieren wurde eine PCR-Technik verwendet, genannt 5'-Schnellamplifikation von cDNA-Enden (RACE) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis, et al., (eds) Academic Press: New York (1990) pp:28–38] unter der Verwendung eines 5'-RACE-Kits (Clontech) angewendet. Diese Technik verwendet einen internen Primer, der mit einem zweiten Primer paart, der komplementär zu der Sequenz ist, die an das 5'-Ende von cDNA-Bibliotheksmolekülen ligiert wird. PCR mit diesem Primerpaar wird daher die dazwischen liegenden Sequenzen amplifizieren und deren Identifizierung erleichtern. Überlappende Sequenzinformation kann dann dazu verwendet werden, eine voll-ständige Sequenz des Gens zu erzeugen.
RACE-fertige cDNA aus Rattenhirn (mit dem Kit geliefert) wurde in einer PCR mit dem Kit-Oligonukleotid und einem anti-Sense-Primer, der auf einer internen ICAM-4-Sequenz basierte, verwendet. Der 3'-anti-Sense-Primer, der als Spot714AS bezeichnet wurde, wurde gemäß einer ICAM-4-Domäne 4 Sequenz aufgebaut und ist in SEQ ID NO: 20 angegeben.
Das aus diesem Primerpaar resultierende Amplifikationsprodukt wurde anschließend einer sekundären PCR unter der Verwendung des selben 5'-Kit-Primers, gepaart mit einem 3'-Primer komplementär zu einer Region in der ICAM-4 Domäne 1, unterzogen. Der zweite 3'-Primer wurde als RRACE2 bezeichnet und ist in SEQ ID NO: 21 angegeben.
Jeder in der sekundären PCR verwendete Primer enthielt eine EcoRI-Stelle, um die Klonierung der erhaltenen Amplifikationsprodukte in pBS+ (Stratagene) zu erleichtern. Die erhaltene Plasmid-DNA, die das 5'-Ende des Gens enthielt, wurde durch Hybrtdisierung an eine Ratten-ICAM-4 Domänen 1 und 2-Sonde identifiziert, die den Nukleotiden 1 bis 736 in SEQ ID NO: 7 entsprach. Partielle Sequenzinformation für Domäne 1 und den hydrophoben Leader wurde aus dem sich ergebenden Amplifikationsprodukt bestimmt.
Das Produkt aus dem 5'-RACE-Verfahren war ein DNA-Fragment, das 222 by lang war und 60 by stromaufwärts des Start-Methioninrests, eine 82 by Leadersequenz und 80 by Sequenz aus Domäne 1 enthielt. Das Amplifikationsprodukt ist in SEQ ID NO: 11 angegeben.
C. Vollänegen-Sequenz von Ratten-ICAM-4
Ein zusammengesetzter Klon des Vollängen-ICAM-4 wurde aus der Sequenzinformation konstruiert, die aus dem 5'=RACE-Verfahren (SEQ ID NO: 11), dem RT-PCR-Klon (SEQ ID NO: 7) und dem Hirn-cDNA-Klon 7 (SEQ ID NO: 10) erhalten wurde. Das Vollängengen für Ratten ICAM-4 wurde als 2985 by enthaltend bestimmt, mit einem einzigen offenen Leserahmen, der für ein abgeleitetes 917 Aminosäure-Protein kodierte. Eine putative Kozak-Sequenz ist stromaufwärts von dem Methioninrest in der Leadersequenz lokalisiert. Eine 27 Aminosäuren-hydrophobe Leadersequenz wird von neun Ig-ähnlichen Domänen gefolgt, eine Transmembranregion und einen 58 Aminosäure zytoplasmatischen Schwanz. Die zusammengesetzte ICAM-4 cDNA ist in SEQ ID NO: 1 angegeben und die abgeleitete Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO: 2 angegeben.
Wie andere ICAM-Polypeptide enthält ICAM-4 extrazelluläre, Transmembran- und zytoplasmatische Domänen. In der extrazellulären Domäne ist der Aminoterminus von ICAM-4 eine Leadersequenz, die Aminosäuren 1 bis 27 umfaßt, die gefolgt wird von neun Immunglobulin (Ig)-ähnlichen Domänen, eine für ICAM-4 einmalige Charaktertstik, da ICAM-1, ICAM-2 und ICAM-R jeweils fünf, zwei und fünf extrazelluläre Ig-ähnlich Domänen enthalten. In ICAM-4 umfaßt Domäne 1 Aminosäuren 28 bis 118; Domäne 2 umfaßt Aminosäuren 119 bis 224; Domäne 3 umfaßt Aminosäuren 225 bis 321; Domäne 4 umfaßt Aminosäuren 322 bis 405; Domäne 5 umfaßt Aminosäuren 406 bis 488; Domäne 6 umfaßt Aminsäuren 489 bis 56; Domäne 7 umfaßt Aminosäuren 570 bis 662; Domäne 8 umfaßt Aminosäuren 663 bis 742; Domäne 9 umfaßt Aminosäuren 743 bis 830. Innerhalb jeder Domäne wird eine charakteristische "Schleifen"-Struktur durch eine Disulfidbrücke zwischen Cysteinresten gebildet, die im allgemeinen an gegenüberliegenden Enden der Domänen-Aminosäuresequenz lokalisiert sind. Andere strukturelle Eigenschaften von ICAM-4 schließen die Transmembranregion ein, die Aminosäuren 831 bis 859 umfaßt und die zytoplasmatische Region, die Aminosäuren 860 bis 91 umfaßt.
Der Vergleich der Aminosäurehomologie von jeder Domäne in Ratten-ICAM-4 mit den anderen Mitgliedern der ICAM-Familie wurde auf die entsprechenden Sequenzen von humanem ICAM-1, ICAM-2 und ICAM-R begrenzt, da Sequenzinformation für alle drei Nager homologe vorher nicht berichtet wurde. In der ersten Domäne zeigt die Nagetier-ICAM-4 21, 3 und 28 Prozent Identität mit jeweils menschlichem ICAM-1, ICAM-2 und ICAM-R. Die zweite Domäne ist konservierter, wobei die Prozent-Identität der Aminosäuren 60, 42 und 62 mit jeweils ICAM-1, –2 und –3 sind. Die Domänen 3-5 zeigen Prozent-Identitäten von jeweils 48, 49 und 40 mit ICAM-1 und 60, 59 und 29 mit ICAM-R. Interessanterweise sind die Ratten-ICAM-4 Domänen 6 bis 8 am meisten homolog mit Domäne 5 (in einem Bereich von 29-42% Identität), was sich möglicherweise aus einem Gensegment-Duplikationsereignis ergibt. Die neunte und letzte extrazelluläre Domäne stimmt wenig mit anderen ICAM-Domänen überein, weist jedoch 22% Identität mit der dritten und sechsten Domäne von menschlichem VCAM-1 auf, einem anderen Mitglied der Ig-Familie von Proteinen, die an der Zelladhäsion beteiligt sind. Der zytoplasmatische Schwanz ist 58 Aminosäuren lang. Dies ist länger als die anderen Mitglieder der ICAM-Familie, wobei menschliches ICAM-1, –2 und –3 jeweils 28, 26 und 37 Aminosäuren enthalten. Wie mit der neunten Domäne ist der Ratten-ICAM-4 zytoplasmatische Schwanz am meisten mit dem zytoplasmatischen Schwanz von menschlichem VCAM-1 homolog, der nur 19 Aminosäuren enthält. Die Membran-proximalen 19 Aminosäuren von Ratten-ICAM-4 teilen 7 Aminosäurereste mit VCAM-1 (37%).
Zuletzt kartiert die funktionelle Bindung an LFA-1 (CD 11a/CD 18) auf die erste Domäne in den ICAMs. Vonderheide et al., [J. Cell. Biol., 125: 215–222 (1994)] identifizierten ein Sequenzmotiv, von dem behauptet wurde, daß es an der Integrinbindung beteiligt ist. Trotz der relativ niedrigen Homologie zwischen Ratten-ICAM-4 und anderen ICAMs in Domäne 1 ist dieses Bindungsmotiv konserviert, was vermuten läßt, daß Ratten-ICAM-4 möglicherweise ein Ligand für LFA-1 und möglicherweise andere Integrine sein kann.
Beispiel 4
In situ-Hybridisierung in Hirngewebe
Um das spezifische Hirngewebe zu lokalisieren, das ICAM-4 exprimierte, wurde in situ-Hybridisierung mit ICAM-4 Domäne 1 und ICAM-4 Domänen 3 bis 4 anti-Sense-Ribosonden angewendet. Die Proben wurden durch in vitro-Transkrtption unter der Verwendung von ³⁵S-markiertem UTP markiert.
Gefrorene Gewebeschnitte von normalem Rattenhirn wurden in 4% Paraformaldehyd für 20 Minuten fixiert, gespült und dehydriert und die fixierte RNA für 2 Minuten in 2X SSC, 70% Formamid bei 70°C vor der Hybrtdisierung denaturiert. Gewebeschnitte wurden über Nacht bei 50°C in einer Lösung hybrtdisiert, die 50% Formamid, 0,3 M NaCl, 20 mM Trts-HCl, pH 7,4, 5 mM EDTA, 10% Dextransulfat, 1X Denhardt, 0,5 mg/ml Hefe-RNA, 10 mM DTT und eine Probenkonzentration von 50.000 cpm/μl enthielt. Die Schnitte wurden einmal in 4X SSC, 10 mM DTT bei Raumtemperatw für 60 Minuten, einmal in 50% Formamid, 2X SSC, 10 mM DTT bei 60°C für 40 Minuten und einmal in jeweils 2X SSC und 1X SSC für 30 Minuten jeweils bei Raumtemperatw gewaschen. Die Spezifität der Hybrtdisierung wurden in parallelen Experimenten bestimmt, die mit dem selben Protokoll durchgeführt wurden, jedoch auch eine stringentere Waschung in 50% Formamid, 1X SSC, 10 mM DTT bei 60°C für 40 Minuten einschlossen. Nach Waschen wurden die Schnitte in NTB2-Emulsion (Kodak, Rochester, NY) eingetaucht und von 2 bis 21 Tage vor der Entwicklung und Gegenfärbung exponiert. Negative Kontrollen schlossen Sense-Sonden, erzeugt aus ICAM-4 Domäne 1 und ICAM-4 Domäne 3 bis 4 Sense-Ribosonden ein, zusätzlich zu einer menschlichen Immundefizienzvirus (HIV-1)-Ribosonde.
Das in Hirnschnitten nachgewiesene Signal war primär in der grauen Substanz lokalisiert, mit dem stärksten Signal im cerebralen Cortex und Hippocampus. Das Hybridisierungsprofil war mit der ICAM-4 Expression konsistent, primär in cerebralen Neuronen.
Beispiel 5
Erzeugung von ICAM-4 Fusionsproteinen
Ratten-ICAM-4/Glutathion-S-Transferase (GST) Fusionsproteine wurden unter der Verwendung des Prokaryonten-Expressionsvektors pGEX (Pharmacia, Alameda, CA) erzeugt, um monoklonale Antikörper gegen spezifische ICAM-4 Polypeptid-Fragmente zu erzeugen.
PCR-Primer, die den 5'- und 3'-Enden von Domäne 1 und den 5'- und 3'-Enden von Domäne 2 entsprachen wurden dazu verwendet, um DNA-Fragmente zu amplifizieren, die für die individuellen Domänen kodierten. Die erhaltenen Fragmente wurden getrennt in eine EioRI-Stelle von pGEX-2T kloniert, die DNA-Sequenzanalyse bestätigte die korrekte Orientierung und das Leseraster. Transformanten wurden anschließend auf ihre Fähigkeit hin gescreent, Fusionsprotein des korrekten Molekulargewichts zu produzieren.
Sowohl ICAM-4 Domäne 1/GST- und ICAM-4 Domäne 2/GST-Fusionsproteine verblieben in der unlöslichen Fraktion, nachdem die Bakterien durch Beschallung in PBS, enthaltend 1% SDS, lysiert wurden. Die unlösliche Proteinfraktion aus 100 ml Kultwen wurden in SDS Ladefarbstoff gekocht und auf einem 10% präparativen Polyacrylamid-SDS-Gel aufgetrennt. Das Gel wurde in eiskaltem 0,4 M KCl gefärbt und die Fusionsproteinbanden wurden ausgeschnitten. Die Fusionsproteine wurden auf den Gelscheiben in Dialyseröhrchen in Puffer, enthaltend 25 mM Tris-HCl und 192 mM Glycin, elektroeluiert. Ungefähre Proteinkonzentration wurde durch OD₂₈₀ bestimmt und die Reinheit der Präparation auf einem SDS-PAGE, gefärbt mit Coomassie-Blau, bestimmt.
Beispiel 6
Produktion von monoklonalen Antikörpern gegen Ratten ICAM-4/GST-Fusionsproteine
Balb/c-Mäuse wurden durch subkutane Injektion mit 40–50 μg ICAM-4 Domäne 2/GST-Fusionsprotein (beschrieben in Beispiel 5), emulgiert in Freund's vollständigen Adjuvans (FCA), immunisiert. Zwei Wochen später wurden die Mäuse nochmals durch subkutante Injektion mit demselben Protein, jedoch in Freund's unvollständigem Adjuvans emulgiert, immunisiert. Zwei finale intraperitoneale Immunisierungen, gegeben zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung, enthielten lösliches Antigen mit keinem Adjuvants, gegeben in zweiwöchigen Intervallen. Serum aus jeder immunisierten Maus wurde durch ELISA auf seine Fähigkeit hin getestet, spezifisch mit Ratten-ICAM-4 zu reagieren, das durch das Baculovirus-Expressionssystem produziert wurde, das infra beschrieben wird.
Die Milz aus Maus # 1654 wurde steril entfernt und in 10 ml Serum-freies RPMI 1640 plaziert. Eine Einzel-Zellsuspension wurde durch Zermahlen des Milzgewebes zwischen mattierten Enden von zwei Glasmikroskop-Objektträgern, die in Serum-freien RPMI 1640 (Gibco, Burlington, Ottawa, Kanada) untergetaucht waren, das mit 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin ergänzt war, gebildet. Die Zellsuspension wurde durch einen sterilen 70-Mesh Nitex Zelldurchschlag (Becton Dikkinson, Parsippany, NJ) filtriert und zweimal mit RPMI gewaschen, gefolgt von Zentrifugation bei 200 x g für 5 Minuten. Das sich ergebende Pellet aus dem letzten Waschen wurde in 20 ml Serum-freiem RPMI resuspendiert. Thymocyten, die aus drei naiven Balb/c-Mäusen entnommen wurden, wurden auf eine identische Weise präpariert.
Vor der Fusion wurden NS-1 Myelomzellen in Logphasewachstum in RPMI mit 11% fötalem Klonserum (FBS) (Hyclone Laboratories, Logan, Utah) für drei Tage gehalten. Sobald geerntet, wurden die Zellen bei 200 x g für 5 Minuten zentrifugiert und das Pellet wurde zweimal wie in dem voranstehenden Absatz beschrieben gewaschen. Nach dem Waschen wurde die Zellsuspension auf ein finales Volumen von 10 ml in Serum-freiem RPMI gebracht. Ein 20 μ1 Aliquot wurde entfernt und 1 : 50 mit Serum-freien RPMI verdünnt und ein 20 μ1 Aliquot dieser Verdünnung wurde entfernt, mit 20 μ1 0,4% Trypan-blaue Farbe in 0,85% Kochsalzlösung (Gibco) gemischt, auf ein Hämazytometer (Baxter Healthcare, Deerfield, IL) geladen und die Zellen gezählt. Ungefähr 2,425 × 10⁸ Milzzellen wurden mit 4,85 × 10⁷ NS-1 Zellen kombiniert, das Gemisch zentrifugiert und der Überstand entfernt. Das erhaltene Pellet wurde durch Klopfen des Röhrchens losgelöst und 2 ml von 50% PEG 1500 in 75 mM Hepes, pH 8,0 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) wurden mit Rühren über den Verlauf von 1 Minute hinweg hinzugefügt. Anschließend wurden weitere 14 ml Serum-freies RPMI über 7 Minuten hinweg hinzugefügt. Die Zellsuspension wurde bei 200 × g für 10 Minuten zentrifugiert und der Überstand abgegossen. Das Pellet wurde in 200 ml RPMI, enthaltend 15% FBS, 100 μM Natriumhypoxanthin, 0,4 μM Aminopterin, 16 μM Thymidin (HAT) (Gibco), 25 Einheiten/ml IL-6 (Boehringer Mannheim) und 1,5 × 10⁶ Thymocyten/ml resuspendiert. Die Suspension wurde zuerst in eine 225 cm² Flasche (Corning, Essex, Großbritannien) bei 37°C für 4 Stunden plaziert, bevor sie in zehn 96-Tüpfel Flachboden-Gewebekulturplatten (Corning) bei 200 μl/Tüpfel verteilt wurde. Die Zellen in den Platten wurden an Tagen 3, 4, 5 und 6 Post-Fusion durch Absaugen von ungefähr 100 μ1 aus jedem Tüpfel mit einer 20 G Nadel (Bacton Dickinson) und Hinzufügen von 100 μl/Tüpfel Plattierungsmedium wie oben be schrieben mit der Ausnahme, daß es 10 Einheiten/ml IL-6 enthielt und ihm Thymocyten fehlten, geüttert.
Die Fusionsplatten wurden anfänglich durch Antigen-Fang-ELISA wie folgt gescreent. Immulon 4-Platten (Dynatech, Cambridge, MA) wurden über Nacht bei 4°C mit 100 ng/Tüpfel von entweder Domäne 1-GST- oder Domäne 2-GST-Fusionsprotein in 50 mM Carbonatpuffer beschichtet. Die Platten wurden mit 100 μl/Tüpfel 0,5% Fischhautgelatine (Sigma, St. Louis, MO) in PPS für 30 Minuten bei 37°C blockiert. Nach der Blockierung wurden die Platten 3X mit PPS, enthaltend 0,05% Tween 20 (PBST) gewaschen und 50 μl/Tüpfel von Hybridom-Überstand aus jeder Fusion wurden hinzugefügt. Nach Inkubation bei 37°C für 30 Minuten wurden die Platten wie oben beschrieben gewaschen und 50 μ1 1 : 3500 Verdünnung von Meerrettichperoxidase-konjugiertem Ziege-anti-Maus IgG (Fc) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania) wurden hinzugefügt. Die Platten wurden nochmals für 30 Minuten inkubiert und 4X mit PBST gewaschen. Substrat, 100 μl/Tüpfel, bestehend aus 1 mg/ml o-Phenylendiamin (Sigma) und 0,1 μl/ml 30% H₂O₂ in 100 mM Citrat, pH 4,5, wurden hinzugefügt. Der Farbreaktion wurde es erlaubt, für 10 Minuten fortzuschreiten und wurde dann durch die Zugabe von 50 μl/Tüpfel von 15% H₂SO₄ gestillt. Die Absorption bei 490 nm wurde dann auf einem automatisierten Plattenlesegerät (Dynatech) bestimmt.
Tüpfel, die für Domäne 2-GST-Protein positiv waren, jedoch nicht auf Domäne 1-GST-Protein, wurden dann durch ELISA gegen einen Baculovirus-Überstand (beschrieben infra) gescreent. ELISA wurde wie oben beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Immulon 4-Platten anfangs über Nacht mit Baculovirus-Überstand, verdünnt 1 : 4 in 50 mM Carbonatpuffer, beschichtet wurden. Drei Tüpfel (103A, 103B und 103F) wurden zwei- bis drei- mal nacheinander kloniert, durch verdoppelnde Verdünnung in RPMI, 15% FBS, 100 μ1 Natriumhypoxanthin, 16 μM Thymidin und 10 Einheiten/ml IL-6. Tüpfel von Klonplatten wurden visuell nach 4 Tagen bewertet und die Zahl von Kolonien in den am wenigsten dichten Tüpfel wurde aufgezeichnet. Ausgewählte Tüpfel von jeder Klonierung wurden nochmals durch ELISA nach 7 bis 10 Tagen gegen entweder Domäne 1-GST-Protein und Domäne 2-GST-Protein oder Baculovirus-Überstand getestet.
Die durch die Hybridome produzierten monoklonalen Antikörper wurden durch ELISA isotypisiert. Immulon 4-Platten (Dynatech) wurden bei 4°C mit 50 μl/Tüpfel Ziege-anti-Maus IgA, IgG oder IgM (Organon Teknika, Durham, NC), verdünnt 1 : 5000 in 50 mM Carbonatpuffer, pH 9,6 beschichtet. Die Tüpfel wurden für 30 Minuten bei 37°C mit 1% BSA in PBS blokkiert, 3X gewaschen mit PBST. Eine 1 : 10 Verdünnung von Hybridomkultur-Überstand (50 μ1) wurde zu jeder Platte hinzugefügt, inkubiert und wie oben beschrieben gewaschen. Nach Entfernen der letzten Waschung wurden 50 μ1 Meerrettichperoxidase-konjugiertes Kaninchen-anti-Maus IgG₁, G_2a, G_2b oder G₃ (Zymed, San Francisco, CA) (verdünnt 1 : 1000 in PBST mit 1% normalen Ziegenserum) hinzugefügt. Die Platten wurden wie oben inkubiert, 4X mit PBST gewaschen und 100 μ1 Substrat wurden hinzugefügt. Die Farbreaktion wurde nach 5 Minuten durch die Zugabe von 50 μ1 50% H₂SO₄ gestoppt und die Absorption bei 24 nm auf einem Plattenlesegerät bestimmt (Dynatech).
Die Ergebnisse zeigten, daß die Antikörper 103A, 1038 und 103F alle IgG₁-Isotypen waren. Diese Antikörper wurden anschließend in immuncytochemischen Analysen, Western-Blots, und zur Reinigung von in Baculovirus-exprimiertem Protein verwendet.
Beispiel 7
Baculovirus-Expression von Ratten-ICAM-4
Ein Baculovirus-Expressionssystem (Invitrogen) wurde dazu verwendet, um lösliches Protein zu erzeugen, das Domänen 1 bis 6 von ICAM-4 entsprach. Weil die Leadersequenz von ICAM-4 zu der Zeit nicht bekannt war, wurde das Expressionskonstrukt hergestellt, wobei es die kodierende Sequenz für ICAM-4 enthielt, fusioniert 3' an die ICAM-1-Leadersequenz in korrektem Leserahmen. Spezifische Details betreffend die Konstruktion des ICAM-1/ICAM-4-Expressionsplasmids sind wie folgt.
Ratten-ICAM-I-DNA, die für die fünf Ig-ähnlichen Domänen kodierte, wurde durch PCR unter der Verwendung von Primern amplifiziert, die verschiedene Merkmale enthielten, um die Konstruktion des Fusionsplasmids zu erleichtern. Der 5'-Oligonukleotidprimer schloß HindIII- und BglII-Stellen ein, zusätzlich zu einer Konsensus-Kozak-Sequenz stromaufwärts des ersten Methionins in der Leadersequenz. Der 3'-Oligonukleotidprimer schloß eine kodierende Sequenz für sechs Histidine ein, gefolgt von einem Stoppkodon und einer HindIII-Klonierungsstelle. Das PCR-Amplifikationsprodukt wurde in einen HindIII-verdauten pBS⁺-Vektor kloniert und die Sequenzanalyse bestätigte die richtige Konstruktion. Eine interne SmaI-Stelle in der ICAM-1-Leadersequenz und eine andere SmaI-Stelle in der Multiple-Cloning-Region des Vektors (3' zur ICAM-1 Ig-ähnlichen Domäne 5) wurden verdaut, was das meiste der ICAM-1 kodierenden Sequenz entfernte. Nach diesen Manipulationen enthielt der linearisierte, Blunt-endige Vektor einen Teil der stromaufwärts multiplen Klonierungsregion (diejenigen Restriktionsstellen 5' der originalen HindIII-Stelle in der multiplen Klonierungs-Region), die Kozak-Sequenz und das Meiste der ICAM-1-Leadersequenz.
Die kodierende Sequenz für Ratten-ICAM-4 Domänen 1 bis 6 wurde durch PCR unter der Verwendung von Primern amplifiziert, die so aufgebaut waren, um eine Klonierung dieser Sequenz in den linearisierten Vektor wie oben beschrieben zu ermöglichen. Der 5'-Oligonukleotidprimer schloß eine EcoRV-Stelle und die Kodons, die dazu benötigt wurden, um die ICAM-1-Leadersequenz zu vervollständigen, ein. Der 3'-Oligonukleotidprimer schloß Kodons für sechs Histidinreste, ein Stoppkodon und HindIII- und EcoRV-Restriktionsstellen ein. Das Amplifikationsprodukt aus dieser PCR wurde mit EcoRV verdaut, um eine Bluntendige Sequenz zu produzieren, die dann in den Blunt-endigen SmaI-verdauten pBS+ lineartsierten Vektor ligiert wurde. Die gesamte Sequenz, die die ICAM-1-Leadersequenz 5' zu den ICAM-4 Domänen 1 bis 6 enthielt, wurde aus dem Konstrukt mit BglII- und HindIII-Verdau entfernt und die gereinigte ICAM-1/ICAM-4 Fusionssequenz direkt in einen BglII/HindIII verdauten pBluesac III-Vektor (Invitrogen) kloniert.
Auf die Proteinproduktion durch den rekombinanten Virus wurde durch ELISA getestet, wobei anfänglich Immunseren von Mäusen verwendet wurden, die mit Ratten-ICAM-4 Domäne-2/GST Fusionsprotein, wie beschrieben in Beispiel 5, immunisiert waren. Bei späterer Arbeit wurden monoklonale Antikörper, die aus diesen Mäusen erzeugt wurden, dazu verwendet, um ICAM-4 Protein zu reinigen, das durch den rekombinanten Baculovirus in SF9-Zellen produziert wurde.
Beispiel 8
Produktion von monoklonalen Antikörpern gegen Baculovirus-exprimiertes Ratten-ICAM-4
Die Ratten-ICAM-4 Domänen 1-6 wurden in den Baculovirus-Expressionssystem, wie beschrieben in Beispiel 7, exprimiert. Das rekombinante Protein wurde unter der Verwendung von monoklonalem Antikörper 103A (wie beschrieben in Beispiel 6) gereinigt.
Kurz gesagt, wurden 30 mg von gereinigtem monoklonalem 103A (in 100 mM Natriumborat, 500 mM Natriumchlorid) an 3 g von aktivierter Cyanogenbromidsepharose 4B (Pharmacia, Piscataway, NJ) gekoppelt. Der Baculovirus-Überstand, der rekombinantes ICAM-4 (Domänen 1-6) enthielt, wurde über Nacht bei 4°C auf die Sepharosesäule geladen. Die Säule wurde in Calcium-Magnesium-freier Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (CMF-PBS) gewaschen und das gebundene Material wurde in 50 mM Zitronensäure, 500 mM NaCl, pH 4,0, eluiert. Die Probe wurde mit 1/10 Volumen Tris, pH 10, neutralisiert und bei –20°C gelagert. Das auf SDS-PAGE abgetrennte gereinigte Protein schien mehr als 90% rein und wanderte bei ungefähr 80 kD.
Mäuse wurden mit dem gereinigten rekombinanten Ratten-ICAM-4 Domänen 1-6 Protein auf ähnliche Weise wie in Beispiel 6 beschrieben immunisiert. Die Milz von Maus #1945 wurde für die Fusion #127 verwendet. Das Fusionsprotokoll war wie in Beispiel 6 beschrieben. Die Fusionstüpfel wurden durch ELISA auf das rekombinante ICAM-4-Protein hin gescreent. Der sekundäre Screen schloß Immuncytochemie an Rattenhirnschnitten (wie unten beschrieben in Beispiel 9) ein. Vier zusätzliche Antikörper, die spezifisch für Ratten-ICAM-4 waren, wurden von dieser Fusion kloniert: 127A, 127E, 127F und 127H. Die immuncytochemischen Färbemuster von jedem Antikörper auf Rattenhirnschnitten waren dieselben, wie mit monoklonalen Antikörper 103A beobachtet (siehe Beispiel 9). Die monoklonalen Antikörper wurden auf ihre Fähigkeit hin getestet, die D1/GST- und D2/GST-Fusionsproteine (beschrieben in Beispiel 5) zu binden. Der monoklonale Antikörper 127A erkannte das D 1 /GST-Fusionsprotein und 127H erkannte das D2/GST-Fusionsprotein. Diese zwei distinkten Bindungsspezifitäten, gemeinsam mit den anderen, die nicht jedes GST-Protein binden, lassen vermuten, daß mindestens drei verschiedene Epitope durch das Sortiment von Antikörpern erkannt wurden. Die Hybridome 127A und 127H wurden jeweils am 31. Mai 1995 und 1. Juni 1995 bei der American Type Cultwe Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 hinterlegt und erhielten jeweils Zugangsnummern HB 11905 und HB 11911.
Beispiel 9
Immuncytochemie von Ratten-ICAM-4-Expression
Es wurde eine Immuncytochemie mit monoklonalem Antikörper 103A durchgeführt, um die Proteinproduktion innerhalb des Rattenhirns zu lokalisieren.
Ein Hirn wurde von einer normalen erwachsenen Lewis-Ratte geerntet, saggital geschnitten und in RNase-freiem 1X PBS auf Eis für 30 Minuten gewaschen. Die Hirnschnitte wurden dann in Tissue-Tek II Cryoformen (Miles Laboratories, Inc., Naperville, IL) mit einer kleinen Menge von O.C.T.-Verbindung (Miles Inc., Elkhart, IN) plaziert. Die Hirne wurden in der Cryoform zentriert, die Cryoform mit der OCT-Verbindung gefüllt und dann in einen Behälter mit 2-Methylbutan (Aldrich Chemical Company, Inc., Milwaukee, WI) plaziert und die Behälter in flüssigem Stickstoff plaziert. Sobald das Gewebe und die OCT-Verbindung in der Cryoform gefroren waren, wurden die Blöcke bei –80°C bis zum Zerschneiden gelagert.
Das Gewebe wurde bei 6 μm Dicke geschnitten, an Vectabond (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) beschichtete Objektträger angeheftet und es ihnen erlaubt, bei Raumtemperatur über Nacht bis zur Verwendung luftzutrocknen. Die Schnitte wurden in Ethylether (Malinckrodt, Paris, KY) für 5 Minuten bei Raumtemperatur fixiert. Sobald die Objektträger aus dem Ether entfernt wurden, wurde es dem Reagenz ermöglicht, abzudampfen. Jeder Gewebeschnitt wurde mit 150 μ1 50% normalem Rattenserum (Sigma) und 2% Rinderserumalbumin (BSA) (Sigma) in 1X PBS (hergestellt nur mit Natriumphosphaten) für 30 Minuten bei Raumtemperatw blockiert. Nach Blockierung wurde die Lösung sanft von den Schnitten abgetupft und der gereinigte Überstand-Antikörper 103A (1,65 mg/ml) wurde 1 : 10 in der Blokkierungslösung verdünnt und 150 μ1 auf jeden Gewebeschnitt aufgetragen. Die Schnitte wurden in einer Feuchtigkeitskammer plaziert und bei 4°C über Nacht inkubiert.
Am nächsten Tag wurde die Antikörperlösung sanft von den Schnitten abgetupft und die Objektträger wurden dreimal in 1X PBS bei jeder Waschung für 4 Minuten gewaschen. Das überschüssige PBS wurde von dem Objektträger abgesaugt und 100 μ1 des sekundären Ratteanti-Maus-Biotin konjugierten Antikörpers (Jackson ImmunoResearch Laboratories), verdünnt 1 : 100 in einer Lösung von 10% normalem Rattenserum und 2% BSA in 1X PBS, auf die Gewebe aufgetragen. Der Inkubation wurde es ermöglicht, für 1 Stunde bei Raumtemperatur fortzuschreiten. Die Schnitte wurden zweimal in 1X PBS für 4 Minuten bei jeder Waschung gewaschen, dann wurden 100 μ1 von ABC-Reagenz von einem Elite-Ratten IgG Vectastain ABC-Kit (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA), hergestellt nach der Produktbeilage, auf jeden Schnitt aufgetragen. Der Inkubation wurde es ermöglicht, für 30 Minuten bei Raumtemperatur fortzuschreiten. Nach der Inkubation wurden die Objektträger zweimal in 1X PBS (10 Minuten jede Waschung) gewaschen und 150 μ1 von Vektor VIP-Peroxidasesubstratlösung (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA) auf jeden Schnitt für ungefähr 10 Minuten aufgetragen. Nach der Farbentwicklung wurden die Schnitte unter laufendem Leitungswasser für 5 Minuten gespült, mit Mayers-Hämatoxylin (Sigma) für 20 Minuten gegengefärbt und nochmal in sanft laufenden Leitungswasser für 5 Minuten gespült. Die Objektträger wurden über eine abgestufte Serie von Ethanolen dehydriert, durch Xylen passiert und mit Accumount 60 (Stephens Scientific, Riverdale, NJ montiert.
Die Immunhistochemie von Rattenhirnschnitten, die mit mAb 103A gefärbt wurden, zeigte, daß Ratten-ICAM-4 in den neuronalen Zellen des Hippocampus exprimiert wird. Die Färbemuster ließen vermuten, daß das Protein möglicherweise auf die neuronalen Fortsätze (Dendriten) beschränkt ist. Hirnschnitte, gefärbt auf ähnliche Weise mit einem inelevanten Antikörper oder zweiten Schrittreagenz allein zeigten nicht das distinkte Expressionsmuster, das mit mAb 103A gesehen wird.
Beispiel 10
Klonierung einer menschlichen ICAM-4 genomischen DNA
Während der Klonierung von Ratten-ICAM-4 aus genomischer DNA wurde entdeckt, daß ICAM-4 und ICAM-1 innerhalb von 5 kb voneinander lokalisiert waren und diese Information wurde in einem Versuch verwendet, das menschliche Homolog von ICAM-4 zu klonieren.
Genome Systems Inc. (St. Louis, MO) amplifizierte Fragmente in einer menschlichen P1-Bibliothek durch PCR unter der Verwendung von menschlichem ICAM-1 Domäne 3 Primern, einem Sense-Primer, der komplementär zu menschlicher ICAM-1 Domäne 3 aufgebaut war (H-1/D3 S) und einem anti-Sense-Primer, der komplementär zu menschlicher ICAM-1 Domäne 3 aufgebaut war (H-1/D3 AS). Diese Primer sind in jeweils SEQ ID NO: 22 und 23 angegeben.
Zwei Klone, bezeichnet als 1566 und 1567 wurden identifiziert und einer weiteren Analyse unterzogen. Beide P1-Klone enthielten ungefähr 75–95 kb genomische DNA-Inserts. Die Klone wurden mit BamHI verdaut, mit Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und auf Ny lon-Membranen geblottet. Southern Blot Hybrtdisierung wurde durchgeführt unter entweder geringer Stingenz (30% Formamid) oder hoher Stringenz (60% Formamid) bei 42°C mit menschlichen ICAM-1, ICAM-3 oder Ratten-ICAM-4 radiomarkierten Sonden; andere Bestandteile der Hybrtdisierungslösung waren wie in Beispiel beschrieben. Die geringe Stingenz-Hybrtdisierungsserten wurden bei Raumtemperatw in 2X SSPE, enthaltend 0,1% SDS,. gewaschen. Die hohe Stringenz-Hybrtdisierung wurde bei 65°C und 0,2X SSPE, enthaltend 0,1 % SDS, gewaschen. Die gewaschenen Membran wurden für 3,5 Stunden gegenüber Röntgenfilm ausgesetzt.
Die differenzielle Hybrtdisierung zeigte, daß menschliches ICAM-1 auf einem 5,5 kb BamHI-Fragment enthalten war, während menschliches ICAM-3 auf einem 4,0 kb und einem 1,5 kb BamHI-Fragment lokalisiert war. Die menschlichen ICAM-1 und ICAM-R Fragmente wurden in pBS⁺ subkloniert und deren Identität durch begrenzte Sequenzanalyse bestätigt.
Ein 7,0 kb BamHI-Fragment, das mit Ratten-ICAM-4 unter hoch stringenten Bedingungen hybridisierte wurde subkloniert und wurde weiter durch RsaI-Restriktionsverdau fragmentiert. Drei RsaI-Fragmente, die mit Ratten-ICAM-4 hybridisierten, wurden identifiziert und deren Sequenzen bestimmt. Basierend auf Homologie zu Ratten-ICAM-4 schienen diese Fragmente die Domänen 2, 3, 4, 5 und einen Teil von Domäne 6 zu enthalten.
Beispiel 11
Klonierung einer menschlichen ICAM-4-cDNA
Die Fragmente von genomischer DNA, die den Domänen 2–5 von menschlichen ICAM-4 (beschrieben in Beispiel 10) entsprachen, wurden als Sonden verwendet, um eine λgt10 menschliche Hippocampus-cDNA-Bibliothek (Clontech, Palo Alto, CA) zu screenen. Das Bibliotheks-Screeningprotokoll war im wesentlichen dasselbe, wie in Beispiel beschrieben.
Der längste menschliche ICAM-4-Klon (#18), der in dieser Bibliothek gefunden wurde, war nur 992 by (SEQ ID: 24) und entsprach zu ungefähr der Mitte des vorhergesagten 3 kb Gens. Das 992 by DNA-Insert von Klon 18 (SEQ ID: 24) wurde als eine Sonde verwendet, um eine λZAPII menschliche Hippocampus-cDNA-Bibliothek (Stratagene, La Jolla, CA) zu screenen. Diese Bibliothek ergab eine Zahl von positiven Klonen. Der längste Klon, #34, war 2775 by (SEQ ID: 25). Basierend auf den Alignments mit dem Vollängen-Ratten-ICAM-4, wurde vor hergesagt, daß diesem Klon die Leadersequenz und ungefähr 30 kb vom 5'-Ende von Domäne 1 fehlten. Der Poly-A⁺-Schwanz am 3'-Ende fehlte, jedoch war das Translations-Stoppkodon vorhanden.
Ein Fragment von DNA, das den ersten drei Domänen (Nukleotide 1 bis 840 in Klon #34) entsprach, wurde als eine Sonde verwendet, um eine λgt10 cDNA-Bibliothek zu screenen, die von menschlichem cerebralem Cortex abgeleitet war (Clontech, Palo Alto, CA). Ein Klon, 16-1 (SEQ ID NO: 26), wurde als 1557 by aufweisend identifiziert und enthielt 39 by von 5' nicht-translatierter DNA, eine Leadersequenz und Sequenzinformation durch die fünfte Domäne. Überlappende Klone #34 (SEQ ID NO: 25) und 16-1 (SEQ ID NO: 26) wurden dazu verwendet, um einen Verbund der Vollängen-menschlichen ICAM-4-Sequenz (SEQ ID NO: 27) zu erzeugen.
Das Vollärtgen-Gen ist 2927 by lang und kodiert ein 924 Aminosäureprotein. Die ICAM-4 Nukleotidsequenz ist in SEQ ID NO: 27 angegeben und die Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO: 28 angegeben. Das Sequenzalignment mit dem Vollängen-Ratten-ICAM-4-Gen (SEQ ID NO: 11) ergab eine gesamte DNA-Sequenzidentität von 82% und 85% auf dem Aminosäureniveau. Die ersichtliche 9 Ig-ähnliche extrazelluläre Domänenstruktur des Proteins ist zwischen Ratte und Mensch konserviert. Die Leadersequenz erstreckt sich von Aminosäure 1 bis 28; Domäne 1 von Aminosäure 29 bis 117; Domäne 2 von Aminosäure 118 bis 224; Domäne 3 von Aminosäure 225 bis 320; Domäne 4 von Aminosäure 321 bis 405; Domäne 5 von Aminosäure 406 bis 488; Domäne 6 von Aminsäure 489 bis 570; Domäne 7 von Aminosäure 571 bis 663; Domäne 8 von Aminosäure 664 bis 743; Domäne 9 von Aminosäure 744 bis 837; die Transmembranregion von Aminosäure 838 bis 857 und der zytoplasmatische Schwanz von Aminosäure 858 bis 924.
Zusätzlich dazu, daß menschliches ICAM-4 (HuICAM-4) genetisch mit ICAM-1 und ICAM-R verwandt ist, zeigte auch bestimmte gemeinsame strukturelle Eigenschaften, die diese als eine Familie von Molekülen zusammenfaßt. Ein Domäne-für-Domäne-Alignment von HuI-CAM-4 mit den anderen Mitgliedern der ICAM-Familie zeigt verschiedene Ausmaße an Homologie. Die Domäne 1 Aminosäuresequenz von HuICAM-4 ist 21, 30 und 26% identisch zu jeweils Domäne 1 von ICAMs-1, 2 und 3. Domäne 2 von HuICAM-4 ist 61, 39 und 62% identisch zu jeweils ICAMs-1, 2 und 3. Domäne 3 von HuICAM-4 ist 50 und 65% identische zu jeweils ICAMs-1 und 3. Domäne 4 von HuICAM-4 ist 54 und 64% identisch zu jeweils ICAMs-1 und 3. Die Domänen 5–8 von HuICAM-4 sind am meisten homolog zu den fünften Domänen von ICAM-1 und 3, mit Prozent-Identitäten, die von 33–47 für ICAM-1 Domäne 5 und 21–31 für ICAM-R Domäne 5 reichen. Die neunte Domäne von HuICAM-4 stimmt wenig mit den anderen Mitgliedern der ICAM-Familie überein, ist jedoch homolog zu Domänen 3 (24% identisch) und 6 (23% identisch) von HuICAM-1.
Beispiel 12
Northern-Analyse von menschlicher ICAM-4-Expression
Zwei menschliche multiple Gewebe Northern (MTN) Blots wurden von Clontech (Palo Alto, CA) erworben. Diese enthielten mindestens 2 μg an Poly-A⁺-RNA aus 16 verschiedenen menschlichen Geweben (wie in Tabelle 1 gezeigt), die auf einem denaturierenden Formaldehyd 1,2% Agarosegel laufen gelassen wurde und auf Nylon-Membran transferiert wurde. Die Blots wurden für 3 Stunden bei 42°C in 10 ml einer Lösung, die 5X SSPE, 10X Denhardt's-Lösung, 50% Formamid, 2% SDS und 100 μg/ml denaturierte Lachssperma DNA enthielt, prähybridisiert. Die Blots wurden in der oben genannten Lösung mit einer radiomarkierten menschlichen ICAM-4-Sonde (Klon #18, SEQ ID NO: 24) für 16 Stunden bei 42°C hybridisiert. Am folgenden Tag wurden die Blots in einer Lösung von 0,1X SSC/0,1% SDS bei Raumtemperatur gewaschen, gefolgt von einem Waschen bei 50°C. Die Blots wurden gegenüber Röntgenfilm bei –80°C für 24 Stunden exponiert. Die Ergebnisse der Analyse sind unten in Tabelle 1 gezeigt.
Nur die Spur, die RNA aus dem Hirn enthielt, hybridisierte mit der ICAM-4 Sonde und ergab eine einzelne Bande bei ungefähr 3 kb. Eine längere Exponierung (5 Tage) bestätigte, daß nur das Hirn einen nachweisbaren Spiegel von Messenger aufwies. Um zu bestimmen, ob alle Spuren vergleichbare Mengen von RNA von vergleichbarer Qualität enthielten, wurde derselbe Blot mit einer Kontroll-β-Actinsonde hybridisiert. Die Blots wurden durch Behandlung mit einer kochenden Lösung von 0,1% SDS für 15 Minuten gestrippt und anschließend auf eine ähnliche Weise mit einer β-Actinsonde sondiert, die durch den Hersteller zur Verfügung gestellt wurde. Außer kleineren Unterschieden in den Mengen wurde von allen Spuren gezeigt, daß sie eine RNA guter Qualität aufweisen.
Tabelle 1 Nothern Gewebeanalyse von menschlicher ICAM-4-Expression
Zwei weitere Nort Blotherns wurden von Clontech erworben, die Poly-A⁺-RNA aus 16 verschiedenen Unterregionen von menschlichem Hirn enthielten (wie in Tabelle 2 gezeigt). Die Blots wurden auf eine ähnliche Weise, wie die, für die Gewebeanalyse sondiert, und die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Die RNA-Qualität und Quantität, die geladen wurde, wurde durch Sondieren der Blots mit einer β-Actinsonde überprüft.
Alle die Regionen, die ICAM-4 Expression zeigten, sind Teile des Telencephalons, mit der Ausnahme des Thalamus, der als Teil des Diencephalons betrachtet wird. Der Hippocampus und cerebrale Cortex schienen die höchste Spiegel an Expression aufzuweisen. Die Transkriptgröße war in allen Fällen dieselbe, 3kb. Die auserlesene Gewebeverteilung der ICAM-4 Expression läßt vermuten, daß die Promotonegion vielleicht Elemente enthält, die die beobachtete Entwicklungs- und spatiale Expression des Genprodukts bewirken. Die Anwendung solcher Information kann Einsichten in das Verständnis der Kontrolle der neuralen Genexpression im Allgemeinen zur Verfügung stellen.
Tabelle 2 Nothern Hirnzelltypanalyse von menschlicher ICAM-4-Expression
Beispiel 13
Erzeugung von menschlichen ICAM-4/IgG Fusionsproteinen
Menschliche ICAM-4/IgG1Fusionsprotein-Expressionsplasmide wurden konstruiert, um Proteine zur Erzeugung von monoklonalen Antikörpern herzustellen und für die Verwendung in Adhäsionstests, um potentielle ICAM-4 Liganden zu identifizieren. Zwei Konstrukte wurden hergestellt; das Erste enthielt DNA, die für Domänen 1-3 von HuICAM-4 kodierte und das Zweite Domänen 4-8. Beide wurden an die Fc-Region von menschlichem IgG1 in Vektor pDCS1 gekoppelt, der den Cytomegalovirus (CMV) Promotor verwendet, um die Expression anzutreiben und die Signalsequenz von IgG4, um die Sekretion der Moleküle zu erleichtern.
Die PCR-Primen (unten als SEQ ID NO: 29–32 gezeigt) wurden so aufgebaut, um die nötigen DNA-Fragmente für Subklonierung zu erzeugen. Der "Sense"-Primen für das 5'-Ende von Domäne 1 (HI4-D1(s), SEQ ID NO: 29) wurde so aufgebaut, um 30 Basenpaare von Domäne 1 aufzufüllen, die in Klon #34 fehlten. Die Primen HI4-D1(s), SEQ ID NO: 29) und HI4-D3(AS), SEQ ID NO: 30) wurden dazu verwendet, um ein DNA-Fragment zu erzeugen, daß für Domänen 1-3 von menschlichem ICAM-4 kodierte, die einer Region in SEQ ID NO: 1 von Nukleotid 130 bis Nukleotid 996 entsprachen. Die Primen HI4-D3(s) (SEQ ID NO: 31 und HI4-D8(s) (SEQ ID NO: 32) wurden dazu verwendet, um ein DNA-Fragment zu erzeugen, das für die Domänen 4-8 von menschlichen ICAM-4 kodierte, die einer Region in SEQ ID NO: 30 von Nukleotid 997 bis Nukleotid 2268 entsprachen. Jeder 5'-Primen kodierte für eine BamHI- Restriktionsstelle (GGATCC, unten fett angegeben) und jeder 3' (Antisense)-Primer enthielt eine XhoI-Stelle (CTCGAG, unten fett angegeben), um die Subklonierung 5' an das IgGI-Gen zu erleichtern. Alle Oligonukleotide enthielten Spacer-Nukleotide (unten unterstrichen), am 5'-Ende, um einen Restriktionsverdau zu ermöglichen.
Die PCR-Reaktionen wurden in einem 50 μl-Volumen unter der Verwendung von Puffern durchgeführt, die durch Perkin Elmer mit dem AmpliTaq-Enzym zur Verfügung gestellt wurden. Die Primer wurden bei einer finalen Konzentration von 10 μg/ml hinzugefügt, alle vier dNTPs waren bei 2 mM enthalten. Die Reaktionen wurden über 30 Zyklen von Denaturierung (94°C für 4 Minuten), Annealing (50°C für 2 Minuten) und Verlängerung (72°C für 1 Minute) fortgeführt. Die PCR-Produkte wurden auf Agarosegelen visualisiert, und ein Aliquot von jeder Reaktion wurde dazu verwendet, um die PCR-Produkte in Vektor PCRII (Invitrogen, San Diego, CA) subzuklonieren. Sequenzanalyse wurde durchgeführt, um mögliche Fehler nachzuweisen, die sich aus dem Amplifikationsprozeß ergeben und um die richtige Orientierung zu bestätigen. Geeignete Klone wurden mit BamHI und XhoI verdaut und die Fragmente mit Agarosegelelektrophorese aufgetrennt. Die gereinigten Fragmente wurden in einen pDSCI Vektor ligiert, der vorher mit BamHI und XhoI verdaut wurde, und die erhaltenen Plasmide wurde sequenziert, um die richtige Orientierung und das Leseraster zu bestätigen.
Menschliche ICAM-4 Domänen 1-3- und 4-8/IgGI-Fusionsproteine wurden, im Anschluß an die transiente Transfektion der Expressionsplasmide, erhalten in COS7-Zellen und die Isolie rung des sekretierten Proteins aus dem Kulturmedium. Die Transfektion wurde wie folgt durchgeführt. Adhärente COS7-Zellen bei ungefähr 50–60% Konfluenz wurden mit CMF-PBS gewaschen und anschließend mit 10–15 μg von Plasmid-DNA in 7,5 ml Serum-freiem DMEM-Medium (Gibco, Gaithersburg, MD), das 6 μ1 von 0,25 M Chloroquin (Sigma, St. Louis, MO) enthielt. Weiteres 7,5 ml Serum-freies Medium, das 150 μ1 von DEAE-Dextran (50 mg/ml) (Sigma, St. Louis, MO) enthielt, wurden hinzugefügt und die Platten 2-3 Stunden inkubiert, bevor das Medium entfernt wurde und mit 10% DMSO (Mallinckrodt, McGaw Park, Illinois) in PBS ersetzt wurde. Nach einer einminütigen Inkubation wurde die DMSO-Lösung entfernt und durch frisches Medium ersetzt, das 5% FBS enthielt. Jede Transfektion enthielt mehrere Platten, und Medien von Zellen, die das selbe Protein exprtmierten, wurden für die Proteinisolation vereinigt.
Die Medien wurden alle drei Tage über den Verlauf von 3–4 Ernten hinweg gesammelt. Die Proteine wurden unter der Verwendung einer 0,4–0,8 ml Procep-A-Säule (Bioprocessing Ltd., England) gereinigt, die mit 35 mM Trts, 150 mM NaCl, pH 7,5 pre-äquilibrtert war. Das Kulturmedium wurde auf die Säule zweimal bei einer Flußrate von weniger als 60 Säulenvolumen pro Stunde geladen: Die Säule wurde einmal mit jedem von 20 Säulenvolumen Tris/NaCl-Puffer, 20 Säulenvolumen von 0,55 M Diethanolamin, pH 8,5 und 20 Säulenvolumen von 50 mM Zitronensäure, pH 5,0 gewaschen. Die Fusionsproteine wurden in 1 ml Fraktionen unter der Verwendung von 50 mM Zitronensäure, pH 3,0, eluiert und jede Fraktion wurde mit 1/10 Volumen 1M Trts, pH 9,5, neutralisiert. Die Proteinkonzentration wurde durch OD₂₈₀ bestimmt und die Reinheit wurde unter der Verwendung von SDS-PAGE bestimmt.
Eine signifikante Kontamination von Rinder-IgG (vorhanden im FBS) wurde bemerkt. Obwohl das Domänen 1-3-Fusionsprotein als kleiner als das Domänen 4-8-Fusionsprotein vorhergesagt wurde, wanderten beide bei ungefähr 90 kD. Eine mögliche Erklärung für diese Beobachtung ist, daß das kleinere Domänen 1-3-Fusionsprotein stärker glycosyliert sein kann, als das größere Domänen 4-8-Fusionsprotein.
Zusätzlich zur Verwendung der gereinigten Proteine für die monoklonale Antikörperproduktion, beschrieben unten, werden die Proteine auch in Adhäsionstests verwendet, um ICAM-4-Liganden zu identifizieren.
Beispiel 14
Monoklonale Antikörperproduktion
Das in Beispiel 13 beschriebene gereinigte Protein wurde dazu verwendet, um monoklonale Antikörper zu erzeugen, unter der Verwendung eines wie in Beispiel 6 beschriebenen Immunisierungsprotokolls.
Die Milz von Maus #2250 (immunisiert mit HuICAM-4 D1-3/IgG1) wurde für Fusion 172 verwendet und die Milz von Maus #2272 (immunisiert mit HuICAM-4 D4-8/IgGl) wurde für Fusion 173 verwendet. Das verwendete Fusionsprotokoll war wie in Beispiel 6 beschrieben. Die Fusionsplatte wurden durch ELISA gescreent (im wesentlichen wie in Beispiel 6 beschrieben) unter der Verwendung jedes HuICAM-4/IgG1-Fusionsproteins. Fusionstüpfelüberstände, die das immunogene Protein und kein anderes erkannten, wurden für Klonierung berücksichtigt. Immuncytochemie an menschlichen Hippocampusschnitten wurde als ein sekundärer Screen verwendet.
Ein primärer Klon aus jeder Fusion war bei Immuncytochemie positiv und wurde kloniert. Einer der zwei Klone versagte dabei, nach der Klonierung zu wachsen, was nur einen Kandidaten, Klon 173E, zur Fortsetzung übrig ließ, der von der HuICAM-4 D4-8/IgG1 immunisierten Maus abgeleitet war. Hybridom 173E wurde am 1. Juni 1995 bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 hinterlegt und bekam Zugangsnummer HB 11912 zugeteilt.
Aus einer anderen Fusion, die von einer Maus abgeleitet wurde, die mit einem löslichen ICAM-4-Fragment immunisiert wurde, das Domänen 1-3 entsprach, wurden sechs Klone (179A, 179B, 179D, 179H, 179I und 179K) als spezifisch für HuICAM-4 Domänen 1–3 (D1-3) gefunden. Alle sechs Antikörper in der 179-Serie banden an die dendritischen Fortsätze im Dentatgyrus, sowie den polymorphen und pyramidialen Zellagen. Der monoklonale Antikörper 179A färbte zusätzlich zu den dendritischen Fortsätzen neuronale Zeltkörper aus diesen Bereichen. Die Hybridomzeltinien, die Antikörper 179I und 179H produzierten, wurden am 10. Juni 1996 bei der American Type Culture Collection 12301 Parklawen Drive, Rockville, Maryland, 20852 hinterlegt und ihnen wurden jeweils Zugangsnummern HB 12123 und HB 12124 zugeteilt.
Zusätzliche Fusionen werden ähnlich durchgeführt, um andere Antikörper zu erzeugen, die spezifisch mit bestimmten ICAM-4-Regionen immunreaktiv sind.
Beispiel 15
Fangtestentwicklung
Die sechs monoklonalen Antikörper aus Fusion 179 wurden in verschiedenen Kombinationen auf ihre Fähigkeit hin getestet, lösliches ICAM-4 in Lösung zu fangen und nachzuweisen. Dieser Test, wie unten beschrieben, wurde etabliert, um lösliche ICAM-4-Spiegel in menschlichen Flüssigkeiten im Hinblick auf normale und Erkankungszustände zu evaluieren.
Antikörper 179I wurde auf Immulon 4 (Dynatech) 96-Tüpfelplatten bei 3 μg/ml beschichtet, 125 μl/Tüpfel für 2 Stunden bei 37°C. Die Antikörperlösung wurde durch Absaugen entfernt und die Tüpfel wurden für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 300 μ1 Blocklösung blockiert, die 5% Teleosteangelatine in Calcium-freiem, Magnesium-freiem PBS (CMF-PBS) enthielt.
Die Blockierungslösung wurde durch Absaugen entfernt, 100 μ1 von Probenflüssigkeit, verdünnt in Omni-Diluent (CMF-PBS, 1% Gelatine und 0,05% Tween 20) wurde zu jedem Tüpfel hinzugefügt und das Gemisch bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Die Platten wurden dreimal mit PBST (CMF-PBS, 0,05% Tween 20) gewaschen. Der Antikörper 179A wurde bei 1,5 mg/ml unter der Verwendung von NHS-LC-Biotin (Pierce) biotinyliert, wobei das durch den Hersteller vorgeschlagene Protokoll befolgt wurde, 1 : 2000 verdünnt und zu den Tüpfeln hinzugefügt (100 μ1/Tüpfel). Das erhaltene Gemisch wurde für 30 Minuten bei 37°C inkubiert und die Platten dreimal mit PBST gewaschen. Streptavidin-HRP (Pierce) wurde (100 μ1, 0,25 μg/ml) zu jedem Tüpfel hinzugefügt und dieses Gemisch bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Die Platten wurden, vor der Zugabe von 100 μ1 Tetramethylbenzidin (Sigma) (10 mg/ml Vorrat an DMSO), verd,nnt 1 : 100 in gepufferten Substrat (13,6 g/l Natriumacetattrihydrat, pH bis 5,5 mit 1 mM Zitronensäure, mit 150 μl/l 30% Wasserstoffperoxid, hinzugefügt gerade vor der Entwicklung) viermal mit PBST gewaschen. Der Reaktion wurde ermöglicht, sich für 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunklen zu entwickeln, wonach die Reaktion durch die Zugabe von 15 μl/Tüpfel von 15% H₂SO₄ gestoppt wurde. Die Absorption wurde bei 450 nm abgelesen.
Die Ergebnisse zeigten an, daß der Test in der Lage war, lösliches HuICAM-4 D1-3 rekombinantes Protein bei einer Konzentration so gering wie 5–10 ng/ml nachzuweisen, wobei der lineare Teil der Kurve im 10–100 ng/ml Bereich liegt. Keine Kreuzreaktivität mit HuICAM-4 D4-8 wurde beobachtet, wenn diese Proteinregion bei 1 und 10 μg/ml getestet wurde.
Beispiel 16
Untersuchung von löslichem ICAM-4 in Serum aus Schlaganfallpatienten
Um die Rolle von ICAM-4 in neurologischen Erkrankungen und Zuständen zu ermitteln, wurde Serum von 28 Patienten, die an akutem Schlaganfall litten und 20 jungen gesunden Freiwilligen (nicht altersangepaßt), wie oben beschrieben, auf Unterschiede in der Serumkonzentration von löslichen ICAM-4 hin getestet.
Die Ergebnisse zeigten, daß Serum von den gesunden Freiwilligen keinen nachweisbaren Spiegel von ICAM-4 aufwies. 20 von 28 akuten Schlaganfallpatienten wiesen jedoch nachweisbare Spiegel von löslichen ICAM-4 auf. Das Signal von den positiven Schlaganfallpatienten entsprach einem Bereich von 5–38 ng/ml des Standards (lösliches ICAM-4 D1-4 rekombinantes Protein).
Beispiel 17
ICAM-4 mRNA-Spiegel im Hippocampus in einem Rattenmodell von Epilepsie Spiegel von exprimierter Ratten-ICAM-4 mRNA wurden im Hippocampus von Ratten untersucht, die auf eine Weise behandelt wurden, um ein Entfachungs-Epileptogenese-Tiermodell zu erzeugen [Lothmann, et al., Brain Res. 360: 83–91 (1985)]. In diesem Modell wird der Ratten-Hippocampus mit einer Serie von subkonvulsiven elektrischen Schocks durch eine Elektrode stimuliert, die in der Region des Hirns implantiert ist, was allmählich schwere Anfallsverhalten hervorruft. Das Entfachungsverfahren schließt 12 Stimulation pro Tag, verabreicht jeden zweiten Tag für 8 Tage ein. Sobald vollständig entfacht, kann ein einzelner Stimulus krampfartiges Verhalten und histologische Veränderungen, die ähnlich sind zu menschlicher Epilepsie, hervorrufen. Vollständig entfachte Ratten erhielten zwei Stimulationen pro Tag über eine zweiwöchige Zeitdauer hinweg und die Tiere wurden 24 Stunden nach der letzten Stimulation getötet. Der Hippocampus wurde entfernt und für RNA-Präparation präpariert.
Aus jeder Probe wurde Gesamt-RNA unter der Verwendung des Guanidium/Phenol/Chloroform-Extraktionsverfahrens [Chomezynski and Sacchi, Anal. Biochem. 162: 156–159 (1987)] präpariert. Die RNA wurde auf denaturterenden Formaldehydagarosegelen aufgetrennt, auf Nylon-Membran transferiert und mit radiomarkierten Ratten-ICAM-4 und Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) spezifischen DNA-Sonden hybridisiert. GAPDH ist ein basal exprimiertes Gen, das gewöhnlich als eine Kontrolle verwendet wird, um Spur-zu-Spurvariationen in der Menge an RNA nachzuweisen, die auf ein Gel geladen wurden. Fluktuationen in Verhältnis von ICAM-4/GAPDH werden als Veränderungen im Spiegel von ICAM-4 Expression – interpretiert. Hybridisierende Banden für ICAM-4 und GAPDH wurden mit einem Phosphorimager quantifiziert und ein Verhältnis von ICAM-4/GAPDH bestimmt.
Das Verhältnis von ICAM-4/GAPDH war in den Kontrolltieren, die nicht entfacht wurden (n = 5) signifikant höher, verglichen mit der entfachten Gruppe (n = 5), was vermuten läßt, daß ICAM-4 als eine Konsequenz des Entfachungsprozesses herunterreguliert wurde. Es sollte jedoch bemerkt. werden, daß die Kontrollgruppe keiner Scheinbehandlung unterzogen wurde, so daß die Möglichkeit besteht, daß die ICAM-4-mRNA-Spiegel in Antwort auf die chirurgische Behandlung, die mit der Entfachung assoziiert ist, moduliert wurden.
Beispiel 18
Serum-ICAM-4-Konzentration als ein Marker für neurodegenerative Erkrankungen
Zirkulierende Serumkonzentrationen von ICAM-4 wurden als ein möglicher Indikator für verschiedene neurodegenerative Erkrankungen untersucht. Serum- und/oder Plasmaproben von anonymen Spendern wurden wie in Beispiel 16 oben getestet und verglichen mit Proben, die von Kontrollspendern mit einer vorhergehenden Historie von neurologischen Erkrankungen abgenommen wurden.
Kontrollspender
Um einen Basisliniendurchschnitt für zirkulierenden ICAM-4 in normalen gesunden Individuen zu etablieren, wurden Serumproben von 100 Spendern untersucht. Die Ergebnisse zeigten, daß 12 Individuen (12%) zirkulierende Spiegel von ICAM-4 von mehr als 10 ng/ml aufwiesen. Von diesen 12 betrug die ICAM-4-Konzentration in fünf Proben im Durchschnitt 10- 20 ng/ml, drei Proben zeigten eine durchschnittliche ICAM-4-Konzentration von 20–100 ng/ml, zwei Proben zeigten ICAM-4-Spiegel zwischen 100–500 ng/ml, und zwei Proben enthielten ICAM-4 bei einer Konzentration von mehr als 500 ng/ml.
Proben wurden zur selben Zeit von den beiden Spendern mit sehr hohen Spiegeln zu verschiedenen Zeitpunkten über eine achtmonatige Zeitdauer hinweg genommen, um die Stabilität der Beobachtungen über die Zeit hinweg zu ermitteln. Es wurde beobachtet, daß die Ablesung über eine Zeitdauer von Monaten, en schwankten. Keine medizinische Information war über diese Spender erhältlich, was Korrelationen mit den ICAM-4-Spiegeln und der physikalischen Gesundheit der Spender nicht möglich machte. Wenn sowohl Serum- und Plasmaproben von demselben Individuum hergestellt wurden, wurde kein Unterschied im vorhandenen Spiegel von ICAM-4 beobachtet.
Diese Beobachtung zeigte an, daß ein Test für lösliches ICAM-4 in seiner Verwendung von entweder Serum oder Plasma sehr vielseitig wäre. Zusätzlich zeigten die Ergebnisse, daß ICAM-4 sehr stabil im Blut ist, was vermuten läßt, daß ein erhöhter Spiegel von ICAM-4 als ein Ergebnis von einigen pathologischen Zuständen möglicherweise nicht nur vorübergehend wäre. Zuletzt, aufgrund der ersichtlichen Stabilität von ICAM-4 in einer Blutumgebung, können Tests auf lösliches ICAM-4 Blutbankproben verwenden, was daher den Bedarf an frischem Blut für jeden Test verringert.
Um zu bestimmen, ob die Verfahren der Sammlung und/oder Lagerung die Beobachtungen beeinträchtigten, wurde die Stabilität von ICAM-4-Serum durch Behandlung der Proben von dem einen Individuum mit den höchsten Spiegel von zirkulierendem ICAM-4 in einer Auswahl von Wegen ermittelt, gefolgt von einer Messung der Spiegel von ICAM-4. Weder die Inkubation bei 37°C für 24 Stunden noch von einem bis drei Einfrier-/Auftauzyklen veränderten den Spiegel von nachweisbarem ICAM-4 im Serum.
Spender mit Epilepsie
Die Serumkonzentration von ICAM-4 in Proben von 20 Patienten mit Schläfenlappen-Epilepsie (TLE) wurde gemessen und mit Serumproben von Kontrollgruppenpatienten verglichen, die Grand Mal-Krämpfe (38 verschiedene Patienten), Synkope (8 Patienten) erfahren hatten oder normale gesunde Spender (20 Individuen) waren. Das in Beispiel 1 beschriebene Testverfahren wurde nochmals angewendet und die Ergebnisse als ng/ml relativ zu dem für den Test verwendeten Standard, lösliches HuICAM-4 D1-3 rekombinantes Protein (beschrieben in Beispiel 13) angegeben.
Serum von allen 20 Patienten mit TLE wies meßbare Spiegel von ICAM-4 mit einem Durchschnitt von ungefähr 140 ng/ml auf. In Serumproben von allen drei Kontrollgruppen, einschließlich der Grand Mal-Krampfgruppe, befand sich die ICAM-4-Konzentration durchschnittlich unterhalb von 10 ng/ml. Diese Beobachtungen lassen vermuten, daß ein ICAM-4-Serumspiegel eines Individuums einen biochemischen Marker darstellen kann, der zwischen fokussierten Krämpfen, wie denjenigen, die bei TLE erfahren werden und allgemeineren Grand Mal-Krämpfen unterscheiden kann.
Spender mit AIDS
Die Serumkonzentration von ICAM-4 in den Seren aus einer begrenzten Zahl von AIDS-Patienten wurde ebenfalls untersucht. Die Patienten wurden gemäß den CD4-Zahlen und der Anwesenheit von irgendwelchen Anzeichen von Demenz gruppiert. Eine erste Gruppe, die 16 Frühphasen-asymptomatische Patienten mit CD4-Zahlen von größer als 500 umfaßte, wurde getestet. Eine zweite Gruppe umfaßte sieben spätere-Phasenpatienten mit CD4-Zahlen von weniger als 300; Anzeichen von Demenz wurden für diese Gruppe nicht bestimmt. Die letzte Gruppe umfaßte neuen späte-Phasen AIDS-Patienten, die alle Anzeichen von Demenz zeigten.
Die Ergebnisse zeigten, daß Serumproben von vier der sechzehn (25%) Frühphasen asymptomatischen Patienten nachweisbare Spiegel von löslichem ICAM-4 aufwiesen; drei der vier Proben wiesen eine ICAM-4-Konzentration im Überschuß von 500 ng/ml auf. Vier der sieben (57%) Serumproben von Patienten späterer Phase waren ebenfalls für ICAM-4 positiv, wobei zwei der vier ICAM-4-Konzentrationen einen Überschuß von 500 ng/ml aufwiesen. Proben von den Patienten der späten Phase, die Anzeichen von Demenz aufwiesen, wiesen keinen nachweisbaren Spiegel von ICAM-4 auf. Die Ergebnisse dieser vorläufigen Studie lassen vermuten, daß ICAM-4 ein früher Marker der Neurodegeneration sein kann, die mit AIDS-Demenz assoziiert ist.
Sender mit anderen neurodegenerativen Erkrankungen
Die Ergebnisse aus der Studie von Epilepsie- und AIDS-Spendern ließen vermuten, daß ICAM-4-Spiegel im Blut Beschädigung der Neuronen wiederspiegeln kann, die dies normalerweise exprimieren. Es gibt eine Zahl von anderen neurologischen Erkrankungen, die als Teil ihrer Ätiologie auch Schaden an spezifisch ICAM-4 exprimierenden Neuronen zeigen könnten, die zu Veränderungen in der Serumkonzentration von ICAM-4 in der Peripherie führen könnten.
Zum Beispiel ist Alzheimers-Erkrankung mit extensiver neuronaler Schädigung in den Regionen des Telencephalons assoziiert, wo ICAM-4 exprimiert wird. Die Ermittlung von ICAM-4-Spiegeln in Serum von Patienten mit der frühen Ausbruchs-familiären Form der Erkrankung, sowie Patienten mit der sporadischen Form der Erkrankung könnten einen Marker für die verschiedenen Phasen der Erkrankung zur Verfügung stellen, wodurch eine Untersuchung von möglichen therapeutischen Eingriffen ermöglicht würde.
Als ein. anderes Beispiel, weil andere kortikale Demenzen, wie zum Beispiel Pick's-Erkrankung, diffuse kortikale Lewy-Körper-Erkrankung und Frontlappen-Degenerierung manchmal mit Alzheimer verwechselt werden, könnten sie jedoch voneinander und von Alzheimer's-Erkrankung durch Serum ICAM-4-Analyse unterscheidbar sein. Als ein weiteres Beispiel kann die Serum ICAM-4-Konzentration in Patienten, die an einer subkortikalen Demenz, einschließlich Parkinsons-Erkrankung, Huntington's-Erkrankung und progressiven Supranuklear-Leiden als ein Ergebnis von gemeinsamen pathologischen Indikationen dieser Klasse von Erkrankungen erhöht sein.
Als ein weiteres Beispiel sind eine Zahl der primären psychiatrischen Erkrankungen, wie zum Beispiel Depression, Schizophrenie und Psychose teilweise durch die Ausmaße von Neurodegeneration charakterisiert, die mit nachweisbaren Spiegel von ICAM-4 in Blut assoziiert sein können.
Als ein weiteres Beispiel können erhöhte Spiegel von ICAM-4 mit einer Zahl von nicht genetischen Demenzen assoziiert sein, die von Infektionen, Vaskulitis, Stoffwechsel- und Nährstofferkrankung (z. B. Thyroid, Vitamin B12-Defizienz), vaskulären Erkrankungen (multipler Infarkt, lakunärer Zustand, Binswanger's-Erkrankung), toxische Encephalopathien (z. B. Aus setzen gegenüber Kohlenstoffmonoxid, Schwermetalle oder anderen industriellen Umweltgiften) und Tumore.
Beispiel 19
Konierung und Analyse der menschlichen ICAM-4 stromaufwärts regulatorischen DNA
Die ICAM-4-Genexpression ist spatial und temporal geregelt, wobei die Expression auf die am meisten anteriore oder ventrale Region des Hirns begrenzt ist, das Telencephalon. In einem Versuch Gensequenzen zu identifizieren, die für die begrenzte transkriptionelle Regulation von ICAM-4 verantwortlich sind, wurde die Nukleotidregion 5' zu menschlichen ICAM-4 kodierenden Sequenzen untersucht.
Ein 2607 Basenpaar BamHI/PstI-Fragment, abgeleitet von einem 7,0 kb genomischen Bam-HI-Fragment (beschrieben in Beispiel 10) wurde sequenziert und als 1684 Nukleotide stromaufwärts von dem ATG-Startkodon enthaltend gefunden. Die vollständige Sequenz für diese stromaufwärts-Region ist in SEQ ID NO: 33 angegeben. Im Hinblick auf die Position der ICAM-4 kodierenden Region, ist das "A" im ATG-Startkodon (numeriert in SEQ ID NO: 33 als Nukleotide 1685–1687) als das +1 Nukleotid bezeichnet und das Nukleotid unmittelbar 5' zu dem A⁺¹-Nukleotid wird als –1 bezeichnet. Daher ist die Gesamtsequenz als sich von Nukleotid –1684 bis Nukleotid +3 erstreckend gezeigt, entsprechend der Numerierung im Sequenzprotokoll Nukleotid 1 bis Nukleotid 1687.
Basierend auf der genomischen HuICAM-4 Sequenz wurden Oligonukleotide synthetisiert und in PCR verwendet, um DNA-Moleküle von veränderlichen Längen innerhalb der stromaufwärts regulatorischen Region zu erzeugen. Jedes in Tabelle 3 abgegebene Oligonukleotid enthielt eine Spacerregion (kursiv gezeigt) von ungefähr 6–10 bp, um enzymatischen Verdau des PCR-Produkts zu ermöglichen, eine NheI- oder HindIII-Restriktionsstelle (fett dargestellt), und eine spezifische Hybridisierungs-Primersequenz (unterstrichen). Die Oligonukleotidnamen enthalten Nummern, die ihren Ort innerhalb der stromaufwärts regulatorischen Region bezeichnen. In den PCR-Amplifikationen wurden die Oligonukleotide wie in Tabelle 4 gepaart, um DNA-Fragmente zu erzeugen, die spezifische Regionen der stromaufwärts regulatorischen Region enthalten.
Die Restriktionsstellen und Spacenegion, die mit jedem Oligonukleotid erzeugt wurden, ermöglichten den enzymatischen Verdau und die anschließende gerichtete Klonierung von individuellen PCR-Produkten in den pGL3-Basisvektor (Promega, Madison, WI), der ein Luciferase-Reportergen unmittelbar stromabwärts einer Multiple-Cloning-Site (MCS) enthält. Eine Promotor-Aktivität, kloniert in die MCS-Region des Vektors, treibt die Expression des Luciferase-Reportergens in transfizierten Zellinien an, und Lichtproduktion von exprtmierter Luciferase kann als ein Indikator von Promotor-Aktivität gemessen werden. Der pGL3-Basisvektor weist keinen Promotor auf und diente daher als die negative Kontrolle, während ein pGL3-Vektor, der einen SV40-Promotor enthielt, als eine positive Kontrolle diente. Die Sequenz jedes Expressionskonstrukts wurde durch Restrtktionsanalyse und DNA-Sequenzierung vertfiziert.
Tabelle 3

Für die Amplifikation von HuICAM-4 Stromaufwärts-Region verwendete PCR-Primer

Plasmide, die jedes der in Tabelle 4 beschriebenen amplifizierten Sequenzen enthielten, wurden unter der Verwendung eines Transfektions-MBS-Säuger-Transfektionskits (Stratagene, La Jolla, CA) gemäß dem durch den Hersteller vorgeschlagenen Protokoll in Säugetierzellen transfiziert. Jedes Plasmid wurde in zwei verschiedene Zellinien, COS 7- und NT2-Vorläuferzellen (Ntera2/D1 von Stratagene), eingeführt. COS 7-Zellen sind eine herkömmlich verwendete Affenfibroblasten-ähnliche Zellinie, transformiert mit SV40, was sie für das Antreiben der Expression eines Gens unter der Kontrolle des SV40-Promotors in Zellen, die mit dem positiven Kontrolle-pGL3-Promotor-Vektor transfiziert wurden, geeignet macht. NT2-Vorläuferzellen sind eine vorbestimmte neuronale Vorläuferzellinie und obwohl sie nicht ICAM-4 exprimieren, können sie eher für einen Zelltyp repräsentativ sein, der ICAM-4 exprimiert. Tabelle 4 Primerpaare und amplifizierte Regionen

Oliaonukleotidpaare	Entsprechende stromaufwärts regulatorische Region
HI4-19 (AS) mit HI4-114	-19 → –114
HI4-19 (AS) mit HI4-149	-19 → –149
HI4-19 (AS) mit HI4-206	-19 → –206
HI4-19 (AS) mit HI4-270	-19 → –270
HI4-19 (AS) mit HI4-408	-19 → –408
HI4-19 (AS) mit HI4-480	-19 → –480
HI4-19 (AS) mit HI4-560	-19 → –560
HI4-19 (AS) mit HI4-817	-19 → –817

Jeder Tüpfel einer 6-Tüpfel Flachboden-Gewebekulturplatte (Falcon) wurde mit 2,5 × 10-⁵ Zellen beimpft. Die Transfektionen von COS 7- und NT2-Ze11en wurden Seite an Seite in zweifachen Ansätzen unter der Verwendung von 5 μg Plasmid-DNA für jeden Tüpfel durchgeführt. Die Zellen wurden bei 37°C für 48 Stunden kultiviert, lysiert und auf Luciferase-Aktivität mit einem Luciferase-Testsystem (Promega) getestet.
Die Ergebnisse des Experiments, zusammengefaßt in Tabelle 5, zeigen einen hohen Spiegel von Promotor-Aktivität, der innerhalb der –408 bis –19 und –480 bis -19 Regionen der stromaufwärts regulatorischen Region von ICAM-4 in NT2-Ze11en enthalten ist. Weil NT2-Zellen neuronalen Ursprungs sind, können sie bestimmte Transkrtptionsfaktoren exprimieren, die den ICAM-4-Promotor erkennen, die nicht in anderen Zelltypen gefunden werden. Der höchste Spiegel von Promotor-Aktivität in COS-Zell-Transfektanten wurde mit dem Plasmid erhalten, das Nukleotide –560 bis -19 enthielt. Während der positive Kontrolle-pGL3-Promotor-Vektor in COS-Zellen gut funktionierte, zeigte er sehr geringe Promotor-Aktivität in NT2-Zellen, wodurch eine Zelltyp-spezifische Präferenz für bestimmte Promotor-Sequenzen verdeutlicht wurde.
Tabelle 5 Promotor-Aktivität von 5' ICAM-4-Regionen
Da weder COS 7- noch N72-Zellen normalerweise ICAM-4 exprimieren, wird dasselbe Experiment unter der Verwendung von prtmären kultivierten Ratten-Hippocampus-Neuronen wiederholt werden, die ICAM-4 exprimieren und nötigerweise die transkrtptionelle Maschinerie exprimieren, die für die ICAM-4 Promotor-Aktivität erforderlich ist. Durch transfizieren der hier beschriebenen einzelnen Promotorkonstrukte, sowie anderen, in die natürlichere Umgebung kann es möglich sein genauer zu identifizieren, welche Nukleotide in der stromauf wärts regulatorischen Region für die enge Regulierung des ICAM-4-Gens im Hirn verantwortlich sind.
Die vorangehenden illustrativen Beispiele betreffen augenblicklich bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung und zahlreiche Modifikationen und Variationen davon werden als dem Durchschnittsfachmann in den Sinn kommen, erwartet. Daher sollten nur solche Begrenzungen, wie sie in den beigefügten Ansprüchen erscheinen auf den Bereich der vorliegenden Erfindung plaziert werden.

Claims

Verfahren zur Unterscheidung von verschiedenen Formen von Epilepsie, ausgewählt aus Grand mal – Krämpfen, Synkope oder Schläfenlappen-Epilepsie (SLE), umfassend die Schritte von: a) in Kontakt bringen einer Flüssigkeitsprobe, die von einem ersten Individuum erhalten wurde, mit einem spezifisch mit ICAM-4 immunreaktiven Antikörper; b) Quantifizieren des Spiegels von ICAM-4/Antikörper-Bindung in der Probe; und c) Vergleichen der Spiegel von ICAM-4/Antikörper-Bindung in der Probe mit dem Spiegel von ICAM-4/Antikörper-Bindung in einem zweiten Individuum, das eine bekannte Form von Epilepsie, ausgewählt aus Grand mal – Krämpfen, Synkope oder Schläfenlappen-Epilepsie (SLE) aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Flüssigkeitsprobe Serum ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Flüssigkeitsprobe Plasma ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Flüssigkeitsprobe cerebrospinale Flüssigkeit ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die ICAM-4/Antikörper-Bindung durch Radioimmunassay (RIA) quantifiziert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die ICAM-4/Antikörper-Bindung durch Enzymgekoppelten Immunsorbent-Assay (ELISA) quantifiziert wird.