DE60024808T2

DE60024808T2 - Familie von immunregulatoren mit der bezeichnung 'leukozyten-immunoglobulin-ähnliche rezeptoren' (lir)

Info

Publication number: DE60024808T2
Application number: DE60024808T
Authority: DE
Inventors: J. David COSMAN; M. Dirk ANDERSON; Luis Borges
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1999-05-12
Filing date: 2000-05-12
Publication date: 2006-10-05
Anticipated expiration: 2020-05-13
Also published as: DE60024808D1; EP1199362A3; EP1177292B1; ATE312917T1; US6384203B1; US20030027358A1; JP2002543787A; US20100080801A1; EP1199362A2; US20030060614A1; WO2000068383A3; ES2254173T3; EP1177292B8; CA2371193A1; US7875703B2; AU4713700A; WO2000068383A2; CY1105687T1; EP1177292A2; DK1177292T3

Description

Die zelluläre Aktivität des Immunsystems wird durch ein komplexes Netzwerk aus Wechselwirkungen auf der Zelloberfläche und damit verbundenen Signalprozessen geregelt. Wenn ein Rezeptor auf der Zelloberfläche durch seinen Liganden aktiviert wird, wird ein Signal an die Zelle gesandt, und je nach dem Weg, der für die Signaltransduktion benutzt wird, kann das Signal inhibierend oder aktivierend wirken. Bei vielen Rezeptorsystemen wird die zelluläre Aktivität durch ein Gleichgewicht zwischen aktivierenden Signalen und inhibierenden Signalen reguliert. Es ist bekannt, dass in einigen Fällen positive Signale, die durch die Wechselwirkung eines Rezeptors auf der Zelloberfläche mit seinem Liganden ausgelöst werden, durch negative Signale, die von einem anderen Rezeptor auf der Zelloberfläche und seinem Liganden stammen, moduliert oder inhibiert werden.
Die biochemischen Mechanismen dieser positiven und negativen Signalwege sind bei einer Reihe von bekannten Wechselwirkungen von Rezeptoren und Liganden des Immunsystems untersucht worden. Viele Rezeptoren, die positive Signale vermitteln, haben zytoplasmatische Enden (tails), die Orte für die Tyrosinphosphatase-Phosphorylierung enthalten, welche als auf Tyrosin basierende Aktivierungsmotive für Immunrezeptoren (immunoreceptor tyrosin-based activation motifs) (ITAM) bekannt sind. Ein üblicher mechanistischer Weg für positive Signale schließt die Aktivierung von Tyrosinkinasen ein, die Orte in der zytoplasmatischen Domäne des Rezeptors und in anderen Signalmolekülen phosphorylieren. Wenn die Rezeptoren phosphoryliert sind, werden Bindungsstellen für Signale übertragende Moleküle geschaffen, welche die Signalübertragung initiieren und die Zellen aktivieren. Die inhibierenden Signalwege schließen Rezeptoren ein, die auf Tyrosin basierende inhibierende Immunrezeptormotive (immunoreceptor tyrosine based inhibitory motifs) (ITIM) aufweisen, die, ähnlich wie die ITAMs, durch Tyrosinkinasen phosphoryliert werden. Rezeptoren mit diesen Motiven sind an der Transduktion inhibierender Signale beteiligt, weil diese Motive einen Bindungsort für Tyrosinphosphatasen darstellen, die die Weiterleitung der Signale blockieren, indem sie Tyrosin von den aktivierten Rezeptoren oder Signal transduzierenden Molekülen entfernen. Wenn auch viele der Einzelheiten der aktivierenden oder inhibierenden Mechanismen noch unbekannt sind, so ist doch klar, dass das funktionelle Gleichgewicht im Immunsystem auf gegensätzlich wirkenden aktivierenden und inhibierenden Signalen beruht.
Ein Beispiel für eine Aktivität des Immunsystems, die durch ein Gleichgewicht von positiven und negativen Signalen reguliert wird, ist die Proliferation der B-Zellen. Der Antigenrezeptor der B-Zellen ist ein Immunoglobulin auf der B-Zellenoberfläche, das, wenn ein Antigen an es bindet, ein positives Signal auslöst, welches zur Proliferation der B-Zelle führt. B-Zellen exprimieren aber auch FcγRIIb1, einen IgG-Rezeptor von niedriger Affinität. Wenn ein Antigen ein Teil eines Immunkomplexes mit löslichem Immunoglobulin ist, kann dieser Immunkomplex an die B-Zellen binden, indem sowohl der Antigenrezeptor der B-Zelle mit dem Antigen als auch FcγRRIIb1 mit dem löslichen Immunoglobulin in Wechselwirkung treten. Das gleichzeitige Engagement von FcγRIIb1 mit dem B-Zellrezeptorkomplex moduliert das Aktivierungssignal herunter und verhindert die Proliferation der B-Zelle. FcγRIIb1-Rezeptoren enthalten ITIM Motive, von denen man annimmt, dass sie mittels einer Wechselwirkung der ITIMs mit Tyrosinphosphatasen inhibierende Signale an B-Zellen geben, wenn gleichzeitig B-Zellrezeptoren tätig werden.
Die cytolytische Aktivität von natürlichen Killerzellen (NK Zellen) ist ein anderes Beispiel für eine Aktivität des Immunsystems, die durch eine Balance zwischen positiven Signalen, die die Zellfunktion initiieren, und inhibierenden Signalen, die die Aktivität verhindern, reguliert wird. Die Rezeptoren, die die cytotoxische Aktivität der NK Zellen aktivieren, sind noch nicht völlig aufgeklärt. Wenn jedoch die Zielzellen auf ihrer Oberfläche MHC Antigene der Klasse I exprimieren, für die die NK Zellen einen speziellen Rezeptor besitzen, dann ist die Zielzelle vor der Vernichtung durch eine NK Zelle geschützt. Diese spezifischen Rezeptoren, die als Killer-Inhibitor-Rezeptoren (KIRs) bekannt sind, senden ein negatives Signal aus, wenn sie mit ihrem MHC Liganden in Wechselwirkung treten, wodurch die cytotoxische Aktivität der NK Zelle heruntergeregelt wird.
KIRs gehören zu einer Superfamilie von Immunglobulinen oder der Lectinfamilie vom C-Typ (siehe Lanier et al., Immunology Today 17:86-91, 1996). Bekannte humane NK KIRs gehören zu der Superfamilie der Immunoglobuline und zeigen Ähnlichkeiten und Unterschiede in ihren extrazellulären, Transmembran- und zytoplasmatischen Regionen. Eine Aminosäuresequenz in der zytoplasmatischen Domäne, die in vielen der KIRs vorkommt, ist ein ITIM Motiv mit der Sequenz YxxL/V. In manchen Fällen konnte gezeigt werden, dass phosphorylierte ITIMs Tyrosinphosphatasen anziehen, die Moleküle in der Signaltransduktionskette dephosphorylieren und die Aktivierung der Zelle verhindern (siehe Burshtyn et al., Immunity 4:77-85, 1996). Die KIRs haben gewöhnlich zwei dieser Motive, die durch 26 Aminosäuren getrennt sind [YxxL/V(x)₂₆YxxL/V]. Mindestens zwei Rezeptoren von NK Zellen, von denen jeder spezifisch für ein humanes Leukozyten-Antigen (HLA) C-Allel ist (ein MHC Molekül der Klasse I), existieren als inhibierender und aktivierender Rezeptor. Diese Rezeptoren sind in ihren extrazellulären Teilen in hohem Maße homolog, zeigen jedoch erhebliche Unterschiede in ihren Transmembran- und zytoplasmatischen Teilen. Einer dieser Unterschiede ist der, dass in dem inhibierenden Rezeptor das ITIM Motiv vorkommt, während in dem aktivierenden Rezeptor das ITIM Motiv fehlt (siehe Biassoni et. al., Journal Exp. Med. 183:645-650,1996).
Von einem Immnunorezeptor, gp49B1, der von Mastzellen der Maus exprimiert wird und ebenfalls ein Mitglied der Superfamilie der Immunglobuline ist, weiß man, dass er Zellen aktivierende Signale herunterreguliert und ein Paar von ITIM Motiven enthält. gp49B1 ist humanen KIRs in hohem Maße homolog (Katz et al., Cell Biology, 93:10809-10814, 1996). NK Zellen der Maus exprimieren ebenfalls eine Familie von Immunrezeptoren, die Ly49-Familie, die das ITIM Motiv enthält und auf eine Art und Weise funktioniert, die der von humanen KIRs ähnlich ist. Die Ly49 Rezeptoren weisen jedoch keine strukturelle Homologie mit humanen KIRs auf und enthalten eine extrazelluläre Lektin-Domäne vom C-Typ, die sie zu Mitgliedern der Lektin-Superfamilie von Molekülen macht. (siehe Lanier et al., Immunology Today 17:86-91, 1996).
Es ist klar, dass die aktivierenden und inhibierenden Signale des Immunsystems, die durch entgegengesetzt wirkende Kinasen und Phosphatasen vermittelt werden, sehr wichtig für die Aufrechterhaltung der Balance im Immunsystem sind. Systeme mit einem überwiegenden Anteil von aktivierenden Signalen führen zur Autoimmunität und zu Entzündungen. Immunsysteme, in denen inhibierende Signale überwiegen, können infizierten Zellen oder Tumorzellen weniger gut widerstehen. Die Isolierung von neuen aktivierenden oder inhibierenden Rezeptoren ist in hohem Maße erwünscht für das Studium der biologischen Signale, die über den Rezeptor transduziert werden. Weiterhin eröffnen solche Moleküle neue Möglichkeiten für die Regulierung und die Behandlung von Krankheitszuständen, die mit Autoimmunität, Entzündungen und Infektionen zu tun haben.
Beispielsweise kann man bei Krankheitszuständen, bei denen das Immunsystem überaktiv ist und die durch exzessive Entzündungen oder Immunopathologie gekennzeichnet sind, einen neu entdeckten Zelloberflächenrezeptor mit ITIM Motiven mit einem agonistischen Antikörper oder Liganden kombinieren und die Kombination verwenden, um eine Zellfunktion herunter zu regulieren. Andererseits kann ein antagonistischer Antikörper, der für einen Rezeptor oder für eine lösliche Form des Rezeptors spezifisch ist, verwendet werden, um die Wechselwirkung des Zelloberflächenrezeptors mit dem Liganden des Rezeptors zu blockieren, um bei Krankheitszuständen, die mit einer unterdrückten Immunfunktion verbunden sind, die spezifische Immunfunktion zu aktivieren. Da Rezeptoren, denen das ITIM Motiv fehlt, aktivierende Signale aussenden, wenn sie erst einmal wie zuvor beschrieben in Wechselwirkung getreten sind, zeigen Antikörper und lösliche Rezeptoren das Gegenteil des gerade beschriebenen Effekts. Eine neue Familie von Immunrezeptormolekülen aus der Superfamilie der Immunglobuline, die als Leukozyten-Immunglobulin-artige Rezeptorpolypeptide (LIR) bezeichnet werden, ist in WO 98/48017 beschrieben worden.
KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die. vorliegende Erfindung stellt ein neues Mitglied der Familie der Leukozyten-Immunglobulin-artigen Rezeptorpolypeptide (LIR) zur Verfügung. Zum Bereich der vorliegenden Erfindung zählen auch DNA Sequenzen, die für das neue Mitglied der LIR Familie kodieren, sowie die davon abgeleiteten, hierin offenbarten Aminosäuresequenzen. Weiterhin sind in die vorliegende Erfindung einbezogen Polypeptide, die durch DNA kodiert werden, welche mit Oligonukleotidsonden hybridisiert, die definierte Sequenzen haben, oder mit DNS oder RNS, die komplementär zu den Sonden ist. Die vorliegende Erfindung schließt auch rekombinante Expressionsvektoren ein, die DNA enthalten, die für das neue Mitglied der LIR Familie kodiert. Weiterhin gehören zum Bereich der Erfindung Nukleotidsequenzen, die infolge der Degeneration des genetischen Codes für Polypeptide kodieren, die identisch sind mit denjenigen, für die die zuvor beschriebenen Nukleotidsequenzen kodieren, sowie Sequenzen, die zu diesen Nukleotidsequenzen komplementär sind.
Weiterhin schließt die vorliegende Erfindung Verfahren für die Herstellung von Polypeptiden des neuen Mitglieds der LIR Familie ein, bei denen man Wirtszellen, die mit einem rekombinanten Expressionsvektor transformiert wurden, der eine für das neue Mitglied der LIR Familie kodierende DNA Sequenz enthält, unter für die Expression des Mitglieds der LIR Familie geeigneten Bedingungen kultiviert und dann das exprimierte LIR Polypeptid aus der Kultur abtrennt.
Die Erfindung stellt auch agonistische und antagonistische Antikörper gegen das Protein der LIR Familie zur Verfügung.
Weiterhin sind noch Fusionsproteine in die vorliegende Erfindung einbezogen, die einen löslichen Teil des Mitglieds der LIR Familie und den Fc-Anteil von Ig enthalten.
Bestimmte Autoimmunkrankheiten sind mit dem Fehlen eines ein negatives Signal gebenden LIRs verbunden, das die Zellfunktion herunter reguliert. Solche Krankheiten können behandelt werden, indem man einem an einer solchen Krankheit leidenden Patienten eine therapeutisch wirksame Menge eines agonistischen Antikörpers oder Liganden eines oder mehrerer Mitglieder der LIR Familie verabreicht. Störungen, welche durch Krankheitszustände vermittelt werden, die mit einer unterdrückten Immunfunktion verbunden sind, können behandelt werden, indem man eine lösliche Form des ein negatives Signal gebenden LIRs verabreicht. Umgekehrt können Störungen, die durch Krankheiten vermittelt werden, die mit dem Fehlen eines ein aktivierendes Signal gebenden LIRs verbunden sind, behandelt werden, indem man einen agonistischen Antikörper des aktivierenden Rezeptors zuführt. Störungen, welche durch Zustände vermittelt werden, die mit einer Autoimmunfunktion einher gehen, können behandelt werden, indem man eine lösliche Form des aktivierenden Rezeptors verabreicht.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Ein virales Glykoprotein mit einer Ähnlichkeit in der Sequenz mit MHC Antigenen der Klasse I ist verwendet worden, um ein neues Polypeptid zu isolieren und zu identifizieren, das als LIR-P3G2-Polypeptid bezeichnet wird, sowie mehrere Mitglieder einer neuen Familie von Zelloberflächenpolypeptiden, die als die LIR Polypeptidfamilie bezeichnet wurde. Die vorliegende Erfindung schließt isolierte Nukleinsäuremoleküle, die für LIR Polypeptide kodieren, und weiterhin die isolierten Polypeptide ein. Zu den beispielhaften, für LIR Polypeptide nach der vorliegenden Erfindung kodierenden Nukleinsäuren zählen die Nukleotidsequenzen, die in SEQ ID NOS: 29, 31, 33 und 35 dargestellt sind, und beispielhafte LIR Polypeptidsequenzen werden in SEQ ID NOS: 30, 32, 34 und 36 gezeigt.
Die Mitglieder der LIR Polypeptidfamilie besitzen extrazelluläre Regionen mit Immunglobulin-artigen Domänen, die sie zu Mitgliedern einer neuen Unterfamilie der Superfamilie der Immunglobuline macht. Während die Mitglieder der LIR Familie dadurch gekennzeichnet sind, dass sie sehr ähnliche extrazelluläre Anteile haben, schließt die Familie drei Gruppen von Polypeptiden ein, die durch ihre transmembranen Regionen und ihre zytoplasmatischen Regionen unterscheidbar sind. Die eine der Gruppen von LIR Polypeptiden besitzt eine transmembrane Region, die einen positiv geladenen Baustein und ein kurzes zytoplasmatisches Endstück (tail) enthält, und eine zweite Gruppe verfügt über eine unpolare transmembrane Region und über ein langes zytoplasmatisches Endstück. Eine dritte Gruppe schließt Polypeptide ein, die als lösliche Proteine ohne Membranregion oder zytoplasmatisches Endstück exprimiert werden. Eines der LIR Proteine zeigt Merkmale der beiden Gruppen eins und zwei und kann eine vierte Gruppe repräsentieren. Eine Reihe von kürzlichen Mitteilungen haben Nukleinsäuremoleküle mit Sequenzen beschrieben, die den Proteinen der LIR Familie verwandt sind (Hillier et al., GenBank Zugangsnummer N95687, 9. April 1996; Colonna, M., GenBank Zugangsnummern AF041261 und AF041262, 07. Januar 1999; Lamerdin et al., GenBank Zugangsnummer AC006293, 06. Januar 1999; Steffans et al., GenBank Zugangsnummern AH007466 und AH007465, 04. März 1999; Cosman et al., Immunity 7:273-282, (1997);; Borges et al., J. Immunol.159:5192-96 (1997); Samaridis und Colonna, Eur. J. Immunol. 27:660-665 (1997); Colonna et al., J. Exp. Med. 186:1809-1818 (1997); Wagtman et al., Curr. Biol. 7:615-618 (1997; Rojo et al., J. Immunol. 158:9-12 (1997); Arm et al., J. Immunol. 159:2342-2349 (1997); Cella et al., J. Exp. Med. 185:1743-51 (1997); Torkar et al., Eur. J. Immunol. 28:3959-67 (1998); Yamashita et al., J. Biochem 123:358-68 (1998); WO 98/31806; WO 98/24906; und WO 98/09638.
Die LIR Polypeptide, die in die vorliegende Erfindung einbezogen sind, enthalten mindestens eine Ig-artige Domäne in der extrazellulären Region des Proteins und enthalten vorzugsweise entweder zwei oder vier Ig-artige Domänen in der extrazellulären Region. Einige LIR Polypeptide können mehr als vier Ig-artige Domänen aufweisen. Eine Ig-artige Domäne ist eine strukturelle Einheit, die in einer großen Vielzahl von zellulären Proteinen identifiziert worden ist. Ig-artige Domänen enthalten eine gemeinsame Faltung, die ein Sandwich aus zwei β-Faltblättern (β sheets) bildet und das durch eine charakteristische Disulfidbrücke innerhalb der Kette stabilisiert wird. Ig-artige Domänen lassen sich leicht durch Bezugnahme auf ein umfangreiches Wissen in Bezug auf diese strukturelle Einheit erkennen (siehe z.B. Williams und Barclay, Ann. Rev. Immunol. 6:381-405 (1988). Typischerweise enthalten Ig-artige Domänen etwa 100 Aminosäuren, wenn auch die Anzahl der Aminosäuren variieren kann, z.B. von etwa 85 bis etwa 105 Aminosäuren. Moleküle mit Ig-artigen Domänen üben im allgemeinen eine erkennende Funktion auf der Zelloberfläche aus und vermitteln oft Wechselwirkungen von Zelle zu Zelle in verschiedenen biologischen Systemen.
LIR-P3G2 (SEQ ID NO:2) wird von verschiedenen Zellen exprimiert und erkennt HLA-B44 Moleküle, HLA-A2 MHC Moleküle, sowie die in Beispiel 14 beschriebenen Allele. Ein anderes Mitglied der LIR Familie, welches als LIR-pbm8 (SEQ ID NO:9) bezeichnet wird, wird von einer Reihe von Zellen exprimiert und erkennt ebenfalls eine Reihe von MHC Klasse I Molekülen. Aufgrund von Analogie mit bekannten Molekülen spielen LIR-P3G2, LIR-pbm8 und Mitglieder der LIR Familie eine Rolle bei der Immunerkennung und der Unterscheidung von körperfremden und körpereigenen Stoffen ((self/nonself discrimination).
Die späteren Beispiele 1 bis 3 beschreiben die Isolierung von cDNA, die für P3G2 (LIR-P3G2) und ein im wesentlichen identisches Polypeptid kodiert, welches als 18A3 (LIR-18A3) bezeichnet wird. Kurz gesagt wurde das Familienmitglied LIR-P3G2 isoliert, indem zunächst UL18 exprimiert wurde, ein MHC Klasse I-ähnliches Molekül, und UL18 verwendet wurde, um P3G2 und 18A3 zu isolieren und zu identifizieren, die eng miteinander verwandt sind und wahrscheinlich Varianten desselben Gens sind, das als „LIR-1" bezeichnet wird. Die Nukleotidsequenzen der isolierten cDNAs von P3G2 und von 18A3 sind in SEQ ID NO:1 bzw. SEQ ID NO:3 wiedergegeben. Die Aminosäuresequenzen, für die die in SEQ ID NO:1 und SEQ ID NO:3 wiedergegebenen Nukleotidsequenzen kodieren, finden sich in SEQ ID NO:2 bzw. SEQ ID NO:4. Die Aminosäuresequenz von P3G2 (SEQ ID NO:2) weist eine vorhergesagte extrazelluläre Domäne von 458 Aminosäuren (1 bis 458) auf, einschließlich eines Signalpeptids von 16 Aminosäuren (Aminosäuren 1 bis 16); eine Transmembrandomäne von 25 Aminosäuren (Aminosäuren 459 bis 483) sowie eine zytoplasmatische Domäne von 167 Aminosäuren (Aminosäuren 484 bis 650). Die extrazelluläre Domäne schließt vier Immunoglobulin-artige Domänen ein. Zu der Ig-artigen Domäne I zählen näherungsweise die Aminosäuren 17 bis 118; zu der Ig-artigen Domäne II gehören näherungsweise die Aminosäuren 119 bis 220,; die Ig-artige Domäne III schließt näherungsweise die Aminosäuren 221 bis 318 ein; und die Ig-artige Domäne IV umfasst näherungsweise die Aminosäuren 319 bis 419. Signifikanterweise schließt die zytoplasmatische Domäne vier ITIM Motive ein, von denen jedes die Konsensus Sequenz (consensus sequence) YxxL/V aufweist. Das erste Paar von ITIM Motiven befindet sich bei den Aminosäuren 533 bis 536 und 562 bis 565, und das zweite Paar befindet sich bei den Aminosäuren 614 bis 617 und 644 bis 647. Dieses Merkmal ist identisch mit den ITIM Motiven, die in KIRs enthalten sind, mit der Ausnahme, dass KIRs nur ein Paar von ITIM Motiven enthalten.
Die Aminosäuresequenz von 18A3 (SEQ ID NO:4) besitzt eine vorhergesagte extrazelluläre Region von 459 Aminosäuren (1 bis 459), einschließlich eines Signalpeptids von 16 Aminosäuren (Aminosäuren 1 bis 16); eine Transmembrandomäne von 25 Aminosäuren (Aminosäuren 460 bis 484) und eine zytoplasmatische Domäne von 168 Aminosäuren (Aminosäuren 485 bis 652). Die Aminosäuresequenz von 18A3 (SEQ ID NO:4) ist im wesentlichen identisch mit der von P3G2 (SEQ ID NO:2), außer dass 18A3 zwei zusätzliche Aminosäuren (bei den Aminosäuren 438 und 552) aufweist und 18A3 an der Aminosäureposition 142 ein Isoleucin besitzt, an Stelle des Threonins, das sich in dieser Position in P3G2 findet. Weiterhin hat 18A3 ein Serin in der Aminosäureposition 155, während P3G2 an dieser Stelle ein Isoleucin aufweist. Schließlich hat das Polypeptid 18A3 eine Glutaminsäure als Aminosäure 627, während P3G2 ein Lysin als Aminosäure 625 hat, die der Aminosäure 627 des Polypeptids 18A3 entspricht. Die vier ITIM Motive in der zytoplasmatischen Domäne von 18A3 sind an den Aminosäuren 534 bis 537 und 564 bis 567 sowie an 616 bis 619 und 646 bis 649. Glykosylierungsstellen finden sich an dem Aminosäuretriplett Asn-X-Y, wobei X eine beliebige Aminosäure mit Ausnahme von Pro bezeichnet und Y Ser oder Thr bedeutet. Somit befinden sich bei LIR-P3G2 potentielle Glykosylierungsstellen an den Aminosäuren 140 bis 142, 281 bis 283, 302 bis 304 und 341 bis 343, während bei LIR-18A3 die potentiellen Glykosylierungsstellen bei den Aminosäuren 281 bis 283, 302 bis 304 und 341 bis 343 liegen. Die Merkmale dieser kodierten Polypeptide stimmen mit denen von Transmembranproteinen vom Typ I überein.
Die Beispiele 8 bis 10 beschreiben die Isolierung und Identifizierung von acht weiteren Mitgliedern der LIR Polypeptidfamilie, indem cDNA Bibliotheken auf Plasmide hin untersucht werden, die mit einer Sonde hybridisieren, die von einer DNA erhalten wurde, welche für die extrazelluläre Region von LIR-P3G2 kodiert. Die Nukleotidsequenzen (cDNA) der isolierten Mitglieder der LIR Familie sind wiedergegeben in SEQ ID NO:7 (als pbm25 oder LIR-4 bezeichnet), in SEQ ID NO:9 (als pbm8 oder LIR-2 bezeichnet), in SEQ ID NO:11 (als pbm36-2 oder LIR-6b bezeichnet, in SEQ ID NO:13, (als pbm36-4 oder LIR-6a bezeichnet), in SEQ ID NO:15 (als pbmhh oder LIR-7 bezeichnet), in SEQ ID NO:17 (als pbm2 oder LIR-5 bezeichnet, in SEQ ID NO: 19 (als pbm17 oder LIR-3 bezeichnet) und in SEQ ID NO:21 (als pbmnew oder LIR-8 bezeichnet). Die Aminosäuresequenzen, die dadurch kodiert werden, sind wiedergegeben durch die Sequenzen SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20 bzw. SEQ ID NO:22.
Beispiel 15 beschreibt die Isolierung und identifizierung von LIR-9m1 (SEQ ID NOS: 29 und 30), LIR-9m2 (SEQ ID NOS: 31 und 32), LIR-9s1 (SEQ ID NOS: 33 und 34) und LIR-9s2 (SEQ ID NOS: 35 und 36). Dabei handelt es sich um vier alternativ gespleißte Varianten von LIR-9 einem neuen Mitglied der LIR Familie. Der erste Schritt bei der Isolierung dieser Klone der LIR-9 Gruppe war die Isolierung eines kurzen cDNA Klons, der aus einer humanen dendritischen Zellbibliothek erhalten wurde und dessen Sequenzanalyse angezeigt hatte, dass eine beträchtliche Homologie zu der LIR Familie bestand, insbesondere mit den Sequenzen, die in SEQ ID NOS:11, 13 und 15 aufgeführt sind. Unter Verwendung von PCR Primern auf der Grundlage dieses Klons ergaben weitere Klonierungsaktivitäten vier cDNAs von voller Länge, die LIR-9m1, -9m2, -9s1 und 9-s2 entsprachen. LIR-9m1 und LIR-9m2 sind Transmembranproteine, die sich um 12 Aminosäuren unterscheiden, die in der extrazellulären Region von LIR-9m1 vorhanden sind, aber in LIR-9m2 fehlen. Diese 12 Aminosäuren entsprechen den Aminosäuren 29 bis 40 von SEQ ID NO:30. LIR-9s1 und LIR-9s2 enthalten keine Transmembrandomäne und kodieren somit für lösliche Versionen von LIR-9. Das Polypeptid LIR-9s1 (SEQ ID NO:34) enthält das Inserat von 12 Aminosäuren, das auch in LIR-9m1 enthalten ist. Die Aminosäuren 1 bis 238 von LIR-9s1 (SEQ ID NO:34) und von LIR-9m1 (SEQ ID NO:30) sind identisch, aber die übrige Sequenz von LIR-9s1 ist nicht identisch mit der entsprechenden Region von LIR-9m1. Die Aminosäuren 1 bis 226 von LIR-9s2 sind identisch mit den ersten 226 Aminosäuren von LIR-9m2 (SEQ ID NO:32), aber die übrige Aminosäuresequenz von LIR-9s2 weicht von derjenigen von LIR-9m2 ab.
Die selben PCR Primer, die bei der Isolierung der LIR-9 Klone verwendet worden waren, ergaben eine weitere klonierte LIR cDNA, die als LIR-10 bezeichnet wurde (SEQ ID NOS:37 und 38). Durch Vergleich der Nukleotidsequenz von LIR-10 mit denen der am engsten verwandten zuvor isolierten LIRs. d.h. mit SEQ ID NOS:13 und 15, wurde festgestellt, dass die cDNA von LIR-10 ein unvollständiger Klon ist, dem Sequenzen, die am 5'-Terminus der entsprechenden mRNA lokalisiert sind, einschließlich der 5'-untranslatierten Region, sowie Nukleotide fehlen, die für die ersten 26 Aminosäuren des Proteins von LIR-10 kodieren.
Die identifizierten extrazellulären, transmembranen und zytoplasmatischen Regionen für die Polypeptide der Mitglieder der LIR Familie sind in der Sequenzliste unter den SEQ ID NOS:10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 30, 32, 34, 36 und 38 dargestellt. Die Polypeptide, die unter SEQ ID NOS:8, 34und 36 dargestellt sind, sind lösliche Proteine, die weder über eine zytoplasmatische, noch über eine transmembrane Region verfügen. Wie der Fachmann verstehen wird, werden die zuvor beschriebenen transmembranen Regionen von P3G2 und von 18A3 sowie die in der Folge angegebenen Regionen der Familie der LIR Polypeptide in Übereinstimmung mit üblichen Kriterien für die Identifizierung von hydrophoben Domänen, die mit solchen Regionen verbunden sind, identifiziert. Daher können die genauen Grenzen einer ausgewählten transmembranen Region von den hierin angegebenen abweichen. Typischerweise variiert die transmembrane Region um nicht mehr als fünf Aminosäuren an jedem Ende der Domänen, wie sie hierin beschrieben sind. In der Technik bekannte Computerprogramme, die sich für die Identifizierung solcher hydrophoben Regionen in Proteinen eignen, stehen zur Verfügung.
Das in SEQ ID NO:8 (LIR-pbm25) wiedergegebene Polypeptid hat eine extrazelluläre Domäne, die die gesamte Aminosäuresequenz der Aminosäuren 1 bis 439 und eine Signalpeptidsequenz der Aminosäuren 1 bis 16 einschließt. Die in SEQ ID NO:10 (LIR-pbm8) wiedergegebene Aminosäuresequenz hat eine vorhergesagte extrazelluläre Region von 458 Aminosäuren (1 bis 458), einschließlich eines Signalpeptids von 16 Aminosäuren (Aminosäuren 1 bis 16); eine transmembrane Domäne, die die Aminosäuren 459 bis 483 einschließt, sowie eine zytoplasmatische Domäne, die die Aminosäuren 484 bis 598 einschließt. Die extrazelluläre Domäne enthält vier Immunoglobulin-artige Domänen, und die zytoplasmatische Domäne schließt ein ITIM Motiv an den Aminosäuren 533 bis 536 sowie 562 bis 565 ein.
Die in SEQ ID NO:12 (LIR-pbm36-2) dargestellte Aminosäuresequenz hat eine vorhergesagte extrazelluläre Domäne aus den Aminosäuren 1 bis 261, einschließlich eines Signalpeptids von 16 Aminosäuren (Aminosäuren 1 bis 16); eine transmembrane Domäne, welche die Aminosäuren 262 bis 280 einschließt; und eine zytoplasmatische Domäne mit den Aminosäuren 281 bis 289. Die transmembrane Domäne schließt ein geladenes Arginin-Molekül in der Position 264 ein, und die zytoplasmatische Domäne ist kurz, mit einer Länge von nur neun Aminosäuren.
Die in SEQ ID NO:14 (LIR-pbm36-4) angegebene Aminosäuresequenz hat eine vorhergesagte extrazelluläre Domäne aus den Aminosäuren 1 bis 461, die ein Signalpeptid von 16 Aminosäuren mit den Aminosäuren 1 bis 16 einschließt; eine transmembrane Domäne, welche die Aminosäuren 462 bis 480 umfasst und ein geladenesn Arginin-Molekül als Aminosäure 464 besitzt, und eine zytoplasmatische Domäne, die die Aminosäuren 481 bis 489 einschließt. SEQ ID NO:14 ist nahezu identisch mit SEQ ID NO:12, außer dass sie vier Immunglobulin-artige Domänen aufweist, im Gegensatz zu den nur zwei Domänen, die sich in der extrazellulären Region von SEQ ID NO:12 befinden. Die in SEQ ID NO:12 und SEQ ID NO:14 angegebenen Aminosäuresequenzen sind wahrscheinlich Proteine, die durch alternativ gespleißte Transkripte des selben Gens kodiert werden.
Die in SEQ ID NO:16 (LIR-pbmhh) dargestellte Aminosäuresequenz hat eine vorhergesagte extrazelluläre Domäne von Aminosäuren, die die Aminosäuren 1 bis 449 und ein Signalpeptid von 16 Aminosäuren mit den Aminosäuren 1 bis 16 umfasst; eine transmembrane Domäne, welche die Aminosäuren 450 bis 468 einschließt, mit einem geladenen Arginin an der Aminosäureposition 452; und eine zytoplasmatische Domäne mit den Aminosäuren 469 bis 483. Die zytoplasmatische Domäne ist kurz, mit einer Länge von 15 Aminosäuren. Die extrazelluläre Region schließt vier Immunglobulin-artige Domänen ein.
Die in SEQ ID NO:18 (LIR-pbm2) dargestellte Aminosäuresequenz hat eine vorhergesagte extrazelluläre Domäne von Aminosäuren, die die Aminosäuren 1 bis 259 und ein Signalpeptid von 16 Aminosäuren mit den Aminosäuren 1 bis 16 umfasst; eine transmembrane Domäne, welche die Aminosäuren 260 bis 280 einschließt; und eine zytoplasmatische Domäne mit den Aminosäuren 281 bis 448. Dieses Mitglied der LIR Familie besitzt eine zytoplasmatische Domäne, die ein ITIM Motiv bei den Aminosäuren 412 bis 415 und 442 bis 445 enthält. Die extrazelluläre Domäne weist zwei Immunglobulin-artige Domänen auf.
Die in SEQ ID NO:20 (LIR-pbm17) dargestellte Aminosäuresequenz hat eine vorhergesagte extrazelluläre Domäne von Aminosäuren, die die Aminosäuren 1 bis 443 und ein Signalpeptid von 16 Aminosäuren mit den Aminosäuren 1 bis 16 umfasst; eine transmembrane Domäne, welche die Aminosäuren 444 bis 464 einschließt; und eine zytoplasmatische Domäne mit den Aminosäuren 465 bis 631. Die extrazelluläre Domäne enthält vier Immunglobulin-artige Domänen. SEQ ID NO:20 weist zwei Paar ITIM YxxL/V Motive in der zytoplasmatischen Domäne auf. Das erste Paar ist bei den Aminosäuren 514 bis 517 und 543 bis 546, und das zweite Paar ist bei den Aminosäuren 595 bis 598 und 625 bis 628.
Die in SEQ ID NO:22 (LIR-pbmnew) dargestellte Aminosäuresequenz hat eine vorhergesagte extrazelluläre Domäne von Aminosäuren, die die Aminosäuren 1 bis 456 und ein Signalpeptid von 16 Aminosäuren mit den Aminosäuren 1 bis 16 umfasst; eine transmembrane Domäne, welche die Aminosäuren 457 bis 579 einschließt; und eine zytoplasmatische Domäne mit den Aminosäuren 580 bis 590. Die extrazelluläre Domäne enthält vier Immunglobulin-artige Domänen. SEQ ID NO:22 weist ein ITIM Motiv bei den Aminosäuren 554 bis 557 sowie 584 bis 587 auf.
Das Protein LIR-9m1 hat eine extrazelluläre Domäne, die die Aminosäuren 1 bis 262 von SEQ ID NO:30 umfasst, einschließlich eines Signalpeptids mit den Aminosäuren 1 bis 34 von SEQ ID NO:30. Die Aminosäuren 263 bis 284 von SEQ ID NO:30 definieren die transmembrane Region von LIR-9m1, und die Aminosäuren 285 bis 299 von SEQ ID NO:30 bilden die zytoplasmatische Region. Die extrazelluläre Region von LIR-9m2 entspricht den Aminosäuren 1 bis 250 von SEQ ID NO:32, einschließlich einer Signalsequenz mit den Aminosäuren 1 bis 35 von SEQ ID NO:32, die transmembrane Region umfasst die Aminosäuren 251 bis 272 von SEQ ID NO:32, und die zytoplasmatische Region schließt die Aminosäuren 273 bis 287 von SEQ ID NO:32 ein. LIR-9s1 (SEQ ID NO:34) und LIR-9s2 (SEQ ID NO:36) bestehen aus 265 bzw. 253 Aminosäuren, wobei sich die Signalsequenzen bei den Aminosäuren 1 bis 34 von SEQ ID NO:34 und bei den Aminosäuren 1 bis 35 von SEQ ID NO:36 befinden.
Bei LIR-10 entsprechen die Aminosäuren 1 bis 393 von SEQ ID NO:38 dem überwiegenden Teil der extrazellulären Region des Proteins LIR-10, obwohl vermutet wird, dass in dem hierin beschriebenen cDNA Klon die kodierenden Sequenzen für etwa 26 Aminosäuren am Aminoterminus dieses Proteins, einschließlich des Signalpeptids, fehlen. Die transmembrane Region von LIR-10 wird durch die Aminosäuren 394 bis 417 von SEQ ID NO:38 definiert, und die intrazelluläre Region durch die Aminosäuren 418 bis 449. Ein einzelnes ITIM Motiv ist bei den Aminosäuren 438 bis 443 von SEQ ID NO:38 gelegen.
Aus den Aminosäuresequenzen, die in SEQ ID NOS: 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 30, 32, 34, 36 und 38 wiedergegeben sind, geht hervor, dass die LIR Familie, mit Ausnahme von LIR-10, in drei Gruppen von Polypeptiden eingeteilt werden kann. Eine der Gruppen schließt die Polypeptide der SEQ ID NOS: 12, 14, 16, 30 und 32 ein, die dadurch unterscheidbar sind, dass sie in ihren transmembranen Regionen ein geladenes Arginin-Molekül enthalten und kurze zytoplasmatische Regionen aufweisen. Eine zweite Gruppe schließt die Polypeptide SEQ ID NOS: 2, 4, 10, 18, 20 und 22 ein, die aufgrund ihrer hydrophoben zytoplasmatischen Domänen und der Anwesenheit von einem oder mehreren ITIM Motiven in ihren zytoplasmatischen Regionen unterscheidbar sind. Eine dritte Gruppe schließt die Polypeptide von SEQ ID NOS:8, 34 und 36 ein, die als lösliche Polypeptide exprimiert werden und weder eine transmembrane, noch ein zytoplasmatische Region besitzen. Diese löslichen Polypeptide funktionieren möglicherweise, indem sie die Wechselwirkungen von Mitgliedern der Zelloberflächen-Familie mit ihren Rezeptoren blockieren. Alternativ können die löslichen Polypeptide als als aktivierendes Signal wirken, wenn sie an den Rezeptor gebunden werden. Wie die Mitglieder der ersten Gruppe hat LIR-10 eine relativ kurze zytoplasmatische Domäne und in seiner transmembranen Domäne ein Molekül, das eine Ladung trägt, wenn auch das ladungstragende Molekül Histidin statt Arginin ist. LIR-10 hat jedoch auch ein ITIM Motiv in seiner zytoplasmatischen Region, wie die Mitglieder der Gruppe zwei. LIR-10 weist somit einige der Merkmale sowohl der Gruppe 1 als auch der Gruppe 2 auf und kann daher einer vierten Gruppe von LIR Proteinen angehören. Die LIR Polypeptide sind allgemein dadurch charakterisiert, dass ihre kodierende DNA mit DNA hybridisiert, die für die extrazelluläre Region von P3G2 kodiert.
Es sollte verstanden werden, dass die Erfindung isolierte Nukleinsäuremoleküle einschließt, die für die LIR Polypeptide mit den Aminosäuresequenzen kodieren, die in SEQ ID NOS:30, 32, 34 und 36 wiedergegeben sind. Bei einer Ausführungsform der Erfindung haben diese Nukleinsäuremoleküle die Nukleotidsequenzen, die in SEQ ID NOS: 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 29, 31, 33, 35 und 37 wiedergegeben sind.
Die extrazellulären Regionen der Proteine der Mitglieder der LIR Familie , die in SEQ ID NOS: 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 30, 32, 34, 36 und 38 wiedergegeben sind, weisen ein hohes Maß von Homologie auf, die von 59% bis 84% variiert. Verschiedene LIR Isolate sind eng miteinander verwandt, sie müssen somit allelische Varianten oder Spleißvarianten sein. Beispielsweise zeigen die extrazellulären Regionen von SEQ ID NO: 12 und SEQ ID NO: 14 eine Sequenzhomologie, die nahe bei 100% liegt, was beweist, dass sich diese Polypeptide von dem selben Gen ableiten. Weiterhin zeigen SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 4 eine Sequenzhomologie von mehr als 95% und repräsentieren daher wahrscheinlich zwei Allele des selben Gens. Überdies sind, wie zuvor diskutiert, die extrazellulären Regionen von SEQ ID NOS: 30, 32, 34 und 36 nahezu identisch, woraus hervorgeht, dass diese vier Proteine von mRNAs abstammen, die Spleißvarianten sind.
Während die Mitglieder der LIR Familie einige strukturelle Ähnlichkeiten mit anderen Mitgliedern der Superfamilie der Immunoglobuline aufweisen, so zeigen sie doch eine nur begrenzte Homologie mit anderen Mitgliedern der Superfamilie der Immunoglobuline. Moleküle mit der größten strukturellen Ähnlichkeit zu den LIR Polypeptiden sind die humanen KIRs und das gp49 der Maus. Die extrazellulären Regionen der LIRs zeigen jedoch nur eine Identität von 38- bis 42% mit den extrazellulären Regionen von NKAT3 bzw.p58C1-39. Die extrazellulären Regionen der Mitglieder der LIR Familie sind nur zu 35- bis 47% homolog mit derjenigen des murinen gp49. Im Gegensatz dazu sind KIRs im allgemeinen dafür bekannt, dass sie eine mindestens 80%-ige Identität der Aminosäuren aufweisen, wobei NKAT3 und p58 Cl-39 zu 81% homolog sind. Weiterhin hat keines der bekannten KIR Moleküle vier extrazelluläre Immunoglobulin-Domänen, die für alle Mitglieder, mit Ausnahme von zwei Mitgliedern, der LIR Familie charakteristisch sind. Im Hinblick auf die große Sequenzhomologie der hierin offenbarten, verwandten LIR Polypeptide und ihre verhältnismäßig niedrige Homologie mit KIRs sind die LIR Polypeptide Mitglieder einer neuen Familie von Immunregulatoren.
Eine Analyse der Aminosäuresequenzen der LIR Polypeptide zeigt, dass spezifische Bereiche von Aminosäuren der LIR Polypeptide hochkonserviert sind. Eine der konservierten Regionen ist eine Sequenz von 46 Aminosäuren, die durch die Aminosäuren 5 bis 50 von SEQ ID NO: 2 repräsentiert wird. Eine Suche in einer Datenbank ergab, dass die Mitglieder der LIR Familie sich in dieser konservierten LIR Region wesentlich von den meisten strukturell ähnlichen Polypeptiden des Standes der Technik unterscheiden. Die Suche in der Datenbank und die strukturelle Analyse wurde unter Verwendung von BLAST NB1 durchgeführt, eine Search-Software (local alignment search tool) für die Suche in Datenbanken und einen Vergleich von Aminosäuresequenzen, um Identitäten und Variationen in einer gegebenen Sequenz zu bestimmen. Die BLAST NB1 Software ist aus dem Internet unter http://www3.ncbl.nlmnih.gov/entrez/blast herunter zu laden. Die Suche nach Sequenzen mit einer Homologie zu der Sequenz der Aminosäuren 5 bis 50 von SEQ ID NO: 2 mittels BLAST NB1 ergab, dass die strukturell ähnlichsten Proteine Fc?IIR, gp49B Form 2 und gp49B Form 1 sind, welche Identitäten im Bereich der Aminosäuren 5 bis 50 von SEQ ID NO: 2 von 63%, 67% bzw. 67% aufwiesen. Dies steht in einem Gegensatz zu einer Identität der Aminosäuren 5 bis 50 von SEQ ID NO:2 innerhalb der LIR-Famile von etwa 71 % bis 100%. Hierin beschriebene Mitglieder der LIR Familie enthalten konservierte Regionen in der Nähe ihrer Aminotermini mit den folgenden Identitäten mit den Aminosäuren 5 bis 50 von SEQ ID NO:2: SEQ ID NO:8 hat eine 96%-ige Identität; SEQ ID NO: 10 hat eine 90%-ige Identität; SEQ ID NO: 12 hat eine 96%-ige Identität; SEQ ID NO: 14 hat eine 91%-ige Identität; SEQ ID NO: 16 hat eine 97%-ige Identität; SEQ ID NO: 18 hat eine 77%-ige Identität; SEQ ID NO: 20 hat eine 80%-ige Identität; SEQ ID NO: 22 hat eine 80%-ige Identität; SEQ ID NO: 30 hat eine 78%-ige Identität; SEQ ID NO: 32 hat eine 71%-ige Identität; SEQ ID NO: 34 hat eine 78%-ige Identität und SEQ ID NO: 36 hat eine 71%-ige Identität. Diese konservierte Region scheint auch in LIR-10 (SEQ ID NO: 38) vorhanden zu sein, ist jedoch unvollständig, weil der hierin offenbarte LIR-10 cDNA Klon, wie bereits erwähnt, an seinem 5'-Ende verkürzt war.
Die Bezeichnung Sequenzidentität bedeutet hierin die Zahl der einander entsprechenden Aminosäuren, die identisch sind, dividiert durch die Gesamtzahl der Aminosäuren in der kürzeren der beiden verglichenen Ketten. Eine Anzahl von Computerprogrammen für die Anpassung oder Zuordnung der Sequenzen und die Bestimmung der Identitäten und der Variationen sind im Handel erhältlich. Diese Programme liefern Ergebnisse über Identitäten auf der Grundlage der zuvor gegebenen Definition von Identität. Eines der geeigneten Computerprogramme ist das GAP Programm in der Version 6.0, das von Devereux et al. in Nucl. Acids Res. 12:387, 1984 beschrieben wurde und von der University of Wisconsin Genetics Computer Group, (UWGCG) erhältlich ist. Das GAP Programm arbeitet nach der Anpassungs- oder Zuordnungsmethode (alignment method) von Needleman und Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), überarbeitet von Smith und Waterman, beschrieben in Adv Appl. Math. 2:482, 1981. Die bevorzugten Fehlerparameter (default parameters) des GAP Programms schließen ein: (1) Eine unäre (unary) Vergleichsmatrix (die eine Wert von 1 für Identitäten und einen Wert von 0 für Nichtidentitäten enthält) für Nukleotide oder Aminosäuren sowie die gewichtete Vergleichsmatrix von Gribskov und Burgess, Nucl. Acids. Res. 14:6745, 1986, wie beschrieben von Schwartz und Dayhoff (Herausgeber), Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Seiten 353 bis 358 (1979); (2) eine Strafe (penalty) von 3,0 für jede Lücke (gap) und eine zusätzliche Penalty von 0,10 für jedes Symbol in jeder Lücke; und (3) keine Penalty bei Endlücken. Ein anderes, ähnliches Programm, das ebenfalls von der University of Wisconsin als Teil des GCG Computer Pakets für die Sequenzmanipulation erhältlich ist, ist das Programm BESTFIT.
Nach einem anderen Aspekt haben die Polypeptide nach der vorliegenden Erfindung konservierte Regionen, die in besonderer Weise dadurch charakterisiert sind, dass sie die Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 28) haben:
Leu Xaa_a Leu Ser Xaa_b Xaa_c Pro Arg Thr Xaa_d Xaa_e Gln Xaa_f Gly Xaa_g Xaa_h, Pro Xaa_i Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Xaa_j Ser Phe Ile Xaa_j Xaa₇₀ Ser Asp Pro Lys Leu Xaa_k Leu Val Xaa_m Thr Gly,
wobei Xaa_a für Gly oder Arg steht; Xaa_b Leu oder Val bedeutet; Xaa_c Gly oder Asp bedeutet; Xaa_d für His, Arg oder Cys steht; Xaa_e Val oder Met bedeutet; Xaa_f Ala oder Tyr bedeutet; Xaa_g für His, Pro oder Thr steht; Xaa_h Leu, Ile oder Phe bedeutet; Xaa_i Gly, Asp oder Ala bezeichnet; Xaa_j für Thr, Ile, Ser oder Ala steht; Xaa_k Gly oder Val bedeutet; Xaa_m Met oder Ala bezeichnet; und Xaa₇₀ für eine Sequenz von 70 Aminosäuren steht.
Wie bereits zuvor erwähnt, haben bestimmte Mitglieder der LIR Familie ITIM Motive (Yxxl/V_25-26YxxL/V) in ihren zytoplasmatischen Domänen. Es ist bekannt, dass viele immunregulierende Rezeptoren, wie z.B. KIRs, CD22 oder Fc?IIb1, ebenfalls ITIMs in ihren zytoplasmatischen Domänen haben und funktionieren, indem sie inhibierende Signale senden, die Zellfunktionen herunter regulieren oder inhibieren. Es ist gezeigt worden, dass diese Rezeptoren sich mittels einer Bindung an die ITIM Motive mit SHP-1 Phosphatase assoziieren. Eine Bindung von SHP-1 Phosphatase an den Rezeptor scheint für die intrazellulären Signalwege erforderlich zu sein, die die inhibierende Funktion der Rezeptoren regulieren. Das im Beispiel 11 beschriebene Experiment zeigt, dass die Polypeptide LIR-P3G2 und LIR-pbm8 sich nach Phosphorylierung mit SHP-1 Phosphatase assoziieren und auf dem Wege über eine Monocytenaktivierung (monocyte activation pathways) inhibierende Signale generieren. Es ist bekannt, dass viele immunregulierende Rezeptoren, wie z.B. KIRs, CD22 und Fc?RIIb1, in ihren zytoplasmatischen Domänen ITIMs aufweisen und funktionieren, indem sie inhibierende Signale aussenden, die Zellfunktionen herunter regulieren oder inhibieren. Aus Gründen der Analogie mit KIRs, CD22 und Fc?RIIb1, senden somit die Mitglieder der LIR Familie, die durch die Sequenzen gemäß SEQ ID NOS: 2, 4, 10, 18, 20, 22 und 38 repräsentiert werden und über ITIM Motive verfügen, über die Wechselwirkung ihrer ITIM Motive mit SHP-1 Tyrosinphosphatase oder anderen Tyrosinphosphatasen ein inhibierendes Signal, wenn das LIR Polypeptid an einem geeigneten Rezeptor co-ligiert ist. Ebenfalls aufgrund von Analogie mit immunregulierenden Rezeptoren, die über ITIM Motive verfügen, haben Mitglieder der LIR Familie einen regulatorischen Einfluss auf humorale, entzündliche und allergische Reaktionen.
Die Mitglieder der LIR Familie, die durch die Sequenzen in SEQ ID NOS:12, 14, 16, 30 und 32 wiedergegeben sind, haben relativ kurze zytoplasmatische Domänen, haben transmembrane Regionen mit mindestens einer eine Ladung tragenden Aminosäure und besitzen kein ITIM Motiv. Aus Gründen der Analogie mit Membranproteinen, die ebenfalls keine ITIM Motive haben und ebenfalls transmembrane Regionen mit eine Ladung tragenden Aminosäuren besitzen, vermitteln diese Mitglieder der LIR Familie stimulierende oder aktivierende Signale an Zellen. Beispielsweise ist bekannt, dass an Membranen gebundene Proteine, die in ihren transmembranen Regionen eine Aminosäure besitzen, die eine Ladung trägt, sich mit anderen an eine Membran gebundenen Proteinen assoziieren, welche über zytoplasmatische Enden mit Motiven verfügen, die als Immunrezeptor-Aktivierungs-Motive auf Basis von Tyrosin (ITAM) (immunoreceptor tyrosine-based activation motifs) bekannt sind. Nach der Assoziierung werden die ITAMs phosphoryliert und leiten (propagate) ein Aktivierungssignal weiter.
Das als LIR-P3G2 bezeichnete LIR Polypeptid wird auf der Oberfläche von transfizierten oder normalen Zellen exprimiert. Dies wird durch die Resultate der Experimente bewiesen, die in Beispiel 3 und Beispiel 5 beschrieben sind, in denen mittels Methoden der Durchflusszytometrie (flow cytometry) und Fällungstechniken gezeigt wird, dass LIR-P3G2 auf Monocyten, einer Subpopulation von NK Zellen, und auf B-Zellen nachweisbar ist. P3G2 wurde auf einer kleinen Untergruppe (subset) von T-Zellen entdeckt. P3G3 wird als Glykoprotein von 110 bis 120 Dalton exprimiert. Da P3G2 vier potentielle Glykosylierungsstellen besitzt, wird die Molekülgröße je nach dem Grad der Glykosylierung variieren. Eine Glykosylierung kann an den Aminosäuretripletten der Formel Asn-X-Y auftreten, in der X eine beliebige Aminosäure außer Pro bedeutet und Y für Ser oder Thr steht. Potentielle Glykosylierungsstellen in P3G2 finden sich an den Aminosäuren 139 bis 141, 280 bis 282, 302 bis 304 und 340 bis 342.
Das LIR Protein P3G2, isoliert wie beschrieben in Beispiel 3, wurde im Hinblick auf sein Bindungsvermögen an Liganden auf der Zelloberfläche untersucht, die von UL18 verschieden sind. Wie aus den experimentellen Ergebnissen hervorgeht, die im Beispiel 7 detailliert aufgeführt sind, bindet P3G2 an HLA-B 44 und HLA-A2, MHC Antigene der Klasse I. In ähnlicher Weise binden, wie aus Beispiel 14 hervorgeht, LIR-P3G2 und LIR-pbm8 an eine Vielzahl von HLA-A, -B und -C-Allelen und erkennen ein breites Spektrum von MHC Spezies (specifities) der Klasse I. Da MHC Moleküle der Klasse I eine zentrale Rolle bei der Immunüberwachung, bei der Unterscheidung von körpereigenen und körperfremden Stoffen, bei der Immunantwort auf Infektionen usw. spielen, haben die Polypeptide LIR-P3G2 und LIR-pbm8 eine Funktion bei der Regulierung der Immunantwort. Es ist bekannt, dass die zytolytische Aktivität von NK Zellen zur Zerstörung von Tumorzellen und von Zellen, die mit einem Virus infiziert sind, durch eine delikate Modulierung von aktivierenden und inhibierenden Signalen reguliert wird. Es ist gezeigt worden, dass Rezeptoren, die spezifisch für die selben HLA Moleküle der Klasse I sind, an die LIR-P3G2 und LIR-pbm8 binden, in ihren auslösenden Mechanismen aktivierend oder inhibierend wirken können. Aus Gründen der Analogie spielen LIR-P3G2 und LIR-pbm8, die an MHC Moleküle der Klasse I binden, eine Rolle beim Ausbalancieren der Zellaktivitäten des Immunsystems und sind nützlich für die Behandlung von Krankheitszuständen, bei denen die Balance des Immunsystems gestört ist.
Innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung liegen auch Fragmente von LIR Polypeptiden, die noch eine erwünschte physiologische Aktivität eines Mitglieds der Familie der LIR Polypeptidfamilie aufweisen, beispielsweise an ein MHC der Klasse I oder einen anderen Liganden zu binden. Bei einer solchen Ausführungsform sind die Fragmente der LIR Polypeptide lösliche LIR Polypeptide, die einen Teil der oder die gesamte extrazelluläre Domäne umfassen, denen aber die transmembrane Region fehlt, die eine Haftung des Polypeptids an der Zellmembran bewirken würde. Lösliche LIR Polypeptide können aus den Zellen sekretiert werden, in denen sie exprimiert werden. Vorteilhaft wird ein heterologes Signalpeptid an den N-Terminus angefügt, so dass das lösliche LIR nach seiner Expression sekretiert wird. Zu den löslichen LIR Peptiden gehören extrazelluläre Domänen, die das Signalpeptid enthalten, und solche Domänen, bei denen das Signalpeptid ein abgespaltenes (cleaved) Signalpeptid ist.
Die Verwendung von löslichen Formen eines Mitglieds der LIR Familie ist für manche Anwendungen von Vorteil. Ein solcher Vorteil liegt darin, dass sich lösliche Formen von den rekombinanten Wirtszellen leicht abtrennen und reinigen lassen. Da die löslichen Proteine von den Zellen sekretiert werden, braucht das Protein während der Aufarbeitung nicht aus den Zellen extrahiert zu werden. Weiterhin eignen sich lösliche Proteine im allgemeinen besser für die intravenöse Verabreichung und können verwendet werden, um die Wechselwirkung von Mitgliedern der LIR Familie auf der Oberfläche von Zellen mit ihren Liganden zu blockieren, um eine erwünschte Immunfunktion einzustellen.
Weiterhin sind in den Umfang der vorliegenden Erfindung lösliche LIR Polypeptide einbezogen, die die gesamte extrazelluläre Domäne oder einen Teil davon enthalten können, einschließlich von extrazellulären Domänen, die Signalpeptide ausschließen. So schließen z.B. lösliche LIR Polypeptide ein: die Aminosäuren x₁₁ bis 262 von SEQ ID NO: 30, wobei x₁₁ für die Aminosäure 1 oder 35 steht; die Aminosäuren x₁₂ bis 250 von SEQ ID NO: 32, wobei x₁₂ die Aminosäure 1 oder 36 bedeutet; die Aminosäuren x₁₃ bis 265 von SEQ ID NO: 34, wobei x₁₃ die Aminosäure 1 oder 35 bedeutet; und die Aminosäuren x₁₄ bis 253 von SEQ ID NO: 36, wobei x₁₄ die Aminosäure 1 oder 36 bedeutet. Die zuvor identifizierten löslichen LIR Polypeptide schließen extrazelluläre Regionen von LIR Polypeptiden ein, die Signalpeptide enthalten oder aber nicht enthalten können. Weiterhin eingeschlossen in die Erfindung sind LIRs, denen eine transmembrane oder zytoplasmatische Region fehlt, wie z.B. die Sequenzen SEQ ID NOS: 34 und 36. Weitere lösliche LIR Polypeptide schließen Fragmente der extrazellulären Domänen von Mitgliedern der LIR Familie ein, die noch eine gewünschte biologische Aktivität aufweisen, beispielsweise die Bindung an Liganden, zu denen die MHC Moleküle der Klasse I gehören.
Fragmente von Mitgliedern der LIR Familie, einschließlich von löslichen Polypeptiden, können nach einer Reihe verschiedener üblicher Techniken hergestellt werden. Eine DNA Sequenz, die für ein gewünschtes Fragment eines LIR Polypeptids kodiert, kann in einen Expressionsvektor für die Herstellung des LIR Polypeptidfragments subkloniert werden. Die ausgewählte kodierende DNA Sequenz wird vorteilhaft mit einer Sequenz fusioniert, die für ein geeignetes Leit- (leader) oder Signalpeptid kodiert. Das DNA Fragment, das für das gewünschte LIR Polypeptidfragment kodiert, kann unter Verwendung bekannter Techniken für die DNA-Synthese chemisch hergestellt werden. DNA Fragmente können auch hergestellt werden, indem man eine in voller Länge klonierte DNA Sequenz mit Restriktionsendonukleasen verdaut und aus dem Verdau das gewünschte Fragment durch Elektrophorese auf einem geeigneten Gel abtrennt. Falls erforderlich können Oligonukleotide, die den 3'- oder den 5'-Terminus bis zu einem gewünschten Punkt rekonstruieren, mit einem DNA Fragment, welches durch Verdauung mit einem Restriktionsenzym erhalten wurde, ligiert werden. Diese Oligonukleotide können zusätzliche Spaltstellen für den Angriff von Endonukleasen oberhalb (upstream) der gewünschten kodierenden Sequenz enthalten und ein Initiierungskodon (ATG) am N-Terminus der kodierenden Sequenz aufweisen.
Ein anderes Verfahren, das für die Herstellung einer DNA Sequenz brauchbar ist, welche für ein gewünschtes Proteinfragment kodiert, ist die gut bekannte Polymerasekettenreaktion (PCR). Oligonukleotide, die die Termini der gewünschten DNA definieren, werden als Primer verwendet, um weitere DNA von einem gewünschten DNA Templat zu synthetisieren. Die Oligonukleotide können auch Erkennungsstellen für Restriktionsendonukleasen enthalten, um die Insertierung der amplifizierten DNA Fragmente in einen Expressionsvektor zu erleichtern. PCR-Verfahren werden z.B. beschrieben in Saiki et al., Science 239:487 (1988); Recombinant DNA Methodology, Wu et al., (Herausgeber) Academic Press, Inc., San Diego (1989), Seiten 189 bis 196; und PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., (Herausgeber), Academic Press, Inc. (1990).
Die LIR Nukleinsäuremoleküle nach der vorliegenden Erfindung schließen isolierte cDNA, chemisch synthetisierte DNA, mittels PCR isolierte DNA, klonierte genomische DNA sowie Kombinationen der genannten Moleküle ein. Genomische DNA der LIR Familie kann durch Hybridisierung mit der hierin beschriebenen cDNA der LIR Familie unter Verwendung üblicher Methoden isoliert werden. Weiterhin ist isolierte RNA, die von DNA-Molekülen der LIR Familie transskribiert wurde, in den Umfang der vorliegenden Erfindung einbezogen.
Innerhalb des Bereichs der Erfindung liegen auch DNA Fragmente, wie z.B. für LIR Polypeptide kodierende Regionen, sowie DNA Fragmente, die für lösliche Polypeptidide kodieren. Zu den Beispielen für DNA Fragmente, die für lösliche Polypeptide kodieren, gehört DNA, die für die gesamten extrazellulären Regionen von Mitgliedern der LIR Familie kodiert, sowie DNA, die nur für Fragmente der extrazellulären Region kodiert, wie z.B. für Fragmente, denen das Signalpeptid fehlt. Die vorliegende Erfindung schließt insbesondere ein die Nukleotide 69 bis 968 von SEQ ID NO: 29 (die für LIR-9m1 kodierende Region) und die Nukleotide x₁₁ bis 854 von SEQ ID NO: 29, wobei x₁₁ 69 oder 170 bedeutet (die für die extrazelluläre Domäne von LIR-9m1 kodierende Region); die Nukleotide 95 bis 958 von SEQ ID NO: 31 (die für LIR-9m2 kodierenden Region) und die Nukleotide x₁₂ bis 844 von SEQ ID NO: 31, wobei x₁₂ für 95 oder 200 steht (die für die extrazelluläre Domäne von LIR-9m2 kodierende Region); die Nukleotide x₁₃ bis 912 von SEQ ID NO:33, wobei x₁₃ für 115 oder 216 steht (die für LIR-9s1 kodierende Region und extrazelluläre Region); und die Nukleotide x₁₄ bis 834 von SEQ ID NO: 35, wobei x₁₄ für 73 oder 178 steht (die für LIR-9s2 kodierende Region und extrazelluläre Region).
Eingeschlossen in die vorliegende Erfindung sind auch DNA Moleküle, die für biologisch aktive Fragmente der LIR Proteine kodieren, deren Aminosäuresequenzen in SEQ ID NOS: 30, 32, 34 und 36 dargestellt sind.
Die vorliegende Erfindung schließt Nukleotidsequenzen ein, die infolge der Degeneration des genetischen Codes für Polypeptide kodieren, die identisch mit den Polypeptiden sind, für die die zuvor beschriebenen Nukleinsäuresequenzen kodieren, sowie Sequenzen, die komplementär zu diesen Sequenzen sind. Dementsprechend gehören zum Bereich der vorliegenden Erfindung DNA Moleküle, die für biologisch aktive Mitglieder der LIR Familie kodieren und die die kodierende Region der nativen cDNA eines Mitglieds der humanen LIR Familie oder Fragmente davon einschließen, sowie DNA, die als Ergebnis des genetischen Codes degeneriert ist zu der DNA Sequenz eines nativen LIR Polypeptids oder zu DNA von hierin beschriebenen Mitgliedern der nativen LIR Familie.
Nach einem anderen Aspekt schließt die vorliegende Erfindung LIR Varianten und Derivate ebenso ein wie Varianten und Derivate von Polypeptiden der LIR Familie, rekombinante oder nicht rekombinante, die die gewünschte biologische Aktivität aufweisen. Eine LIR-Variante ist im Zusammenhang mit dieser Erfindung ein Polypeptid, das im wesentlich homolog zu einem nativen LIR Polypeptid, wie hierin beschrieben, ist, außer dass die variierte Aminosäuresequenz von der des nativen Polypeptids infolge einer oder mehrerer Deletionen, Einfügungen oder Substitutionen abweicht.
Varianten der LIR Familie können durch Mutationen von nativen LIR Nukleotidsequenzen erhalten werden. Innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung liegen solche DNA Mutationen oder Varianten, welche Nukleotidsequenzen einschließen, die im Vergleich mit der DNA von nativen Mitgliedern der LIR Familie durch die Addition, Deletion oder Substitution von einem oder mehreren Nukleotiden gekennzeichnet sind und die für Varianten von LIR Polypeptiden oder für Varianten von Mitgliedern der LIR Familie kodieren, die die gewünschte biologische Aktivität aufweisen. Vorzugsweise ist die biologische Aktivität im wesentlichen dieselbe wie die der nativen LIR Polypeptide.
Variierte Aminosäuresequenzen und variierte Nukleotidsequenzen sind vorteilhaft zu mindestens 80% identisch mit der nativen Sequenz von Mitgliedern der LIR Familie. Eine der Methoden zur Bestimmung des Grades der Homologie oder Identität zwischen einer nativen Aminosäure- oder Nukleotidsequenz und einer variierten Aminosäure- oder Nukleotidseuenz besteht darin, dass man die Sequenzen mittels eines Computerprogramms vergleicht, das für solche Zwecke zur Verfügung steht. Eines der geeigneten Computerprogramme ist das GAP Programm in der Version 6.0, das von Devereux et al. in Nucl. Acids Res. 12:387, 1984 beschrieben wurde und von der University of Wisconsin Genetics Computer Group, (UWGCG) erhältlich ist. Das GAP Programm arbeitet nach der Anpassungs- oder Zuordnungsmethode (alignment method), beschrieben von Needleman und Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), revidiert von Smith und Waterman (Adv. Appl. Math. 2:482, 1981). Kurz gesagt definiert das Programm Identität als die Anzahl von zugeordneten Symbolen (Aminosäuren oder Nukleotiden), die identisch sind, dividiert durch die Gesamtzahl der Symbole der kürzeren der beiden verglichenen Sequenzen. Die bevorzugten Fehlerparameter (default parameters) für das GAP Programm schließen ein: (1) Eine unäre (unary) Vergleichsmatrix (die einen Wert von 1 für Identitäten und einen Wert von 0 für Nichtidentitäten enthält) für Nukleotide oder Aminosäuren sowie die gewichtete Vergleichsmatrix von Gribskov und Burgess, Nucl. Acids. Res. 14:6745, 1986, wie beschrieben von Schwartz und Dayhoff (Herausgeber) im Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Seiten 353 bis 358 (1979); (2) eine Strafe (penalty) von 3,0 für jede Lücke (gap) und eine zusätzliche Penalty von 0,10 für jedes Symbol in jeder Lücke; und (3) keine Penalty bei Endlücken.
Änderungen von nativen LIR Aminosäuresequenzen können vorgenommen werden, indem man mit einer beliebigen der bekannten geeigneten Techniken arbeitet. Wie zuvor beschrieben, können Mutationen an ausgewählten Stellen eingeführt werden, indem man Oligonukleotide synthetisiert, die eine mutierte kodierende Sequenz enthalten, wobei die Mutationsstellen flankiert sind von Restriktionsstellen, die die Ligierung mit oder in Fragmente(n) mit der nativen Sequenz ermöglichen. Nachdem die synthetisierten Oligonukleotide mit den oder in die nativen Fragmente ligiert sind, kodiert die resultierende rekonstruierte Nukleotidsequenz für ein analoges oder variiertes Polypeptid, das die gewünschte Einfügung, Deletion oder Substitution einer Aminosäure aufweist. Ein anderes für die Herstellung von variierten Polypeptiden geeignetes Verfahren ist die Oligonukleotid-gerichtete, ortsspezifische Mutagenese (oligonucleotide-directed site-specific matagenesis), welche zu Genen mit spezifischen Kodons führt, die je nach der gewünschten Substitution, Deletion oder Einführung verändert sind. Verfahren zur Generierung solcher Änderungen schließen diejenigen ein, die in den folgenden Druckschriften beschrieben sind: Walder et al., Gene 42:133, 1986; Bauer et al., Gene 37:73, 1985; Craik, BioTechniques 12–19 January, 1985; Smith et al., Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981; und die U.S. Patente Nrn. 4,518,584 und 4,737,462. Alle Druckschriften sind durch das Zitat in die vorliegende Offenbarung einbezogen.
Variierte Polypeptide nach der vorliegenden Erfindung können auch Aminosäuresequenzen haben, die konservativ substituiert (conservatively substituted) sind, d.h. dass eine oder mehrere Aminosäuren eines Mitglieds der nativen LIR Familie durch eine oder mehrere andere Aminosäuren ersetzt ist bzw. sind, so dass das variierte Polypeptid eine erwünschte biologische Eigenschaft beibehält, die im wesentlichen äquivalent zu derjenigen des Mitglieds der nativen LIR Familie ist. Allgemein gesprochen ist eine Anzahl von Ansätzen für konservative Substitutionen in der Technik gut bekannt; sie können für die Herstellung von Varianten der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Beispielsweise können in der nativen Polypeptidsequenz Aminosäuren durch andere Aminosäuren ersetzt werden, die die sekundäre oder tertiäre Struktur des LIR Polypeptids nicht verändern. Zu den anderen geeigneten Substitutionen zählen diejenigen, die Aminosäuren außerhalb der interessierenden Liganden bindenden Domäne involvieren. Bei einem der Ansätze für konservative Substitutionen von Aminosäuren ersetzt man eine oder mehrere Aminosäuren durch eine oder mehrere Aminosäuren mit ähnlichen physiochemischen Eigenschaften, indem man z.B. eine aliphatische Aminosäure gegen eine andere aliphatische Aminosäure austauscht (beispielsweise einen Austausch innerhalb der Gruppe Ile, Val, Leu oder Ala vornimmt); eine polare Aminosäure durch eine andere polare Aminosäure ersetzt (beispielsweise einen Austausch zwischen Lys und Arg; Glu und Asp; oder Gln und Asn bewirkt); oder ganze Regionen mit ähnlichen hydrophoben oder hydrophilen Eigenschaften austauscht.
Varianten von LIR Polypeptiden können im Hinblick auf ihre Bindung an Zellen untersucht werden, wie in den Bespielen 5 und 6 beschrieben ist, und auf ihre Phosphatase bindenden Eigenschaft hin, wie in Beispiel 11 beschrieben wird, um biologische Aktivitäten nachzuweisen. Zu den anderen Varianten von LIR Polypeptiden im Bereich der vorliegenden Erfindung gehören Polypeptide, die variiert wurden, indem die für das Polypeptid kodierende Nukleotidsequenz so verändert wurde, dass ausgewählte Cys-Bausteine in der Polypeptidkette entfallen oder durch eine oder mehrere alternative Aminosäure(n) ersetzt werden. Diese LIR Varianten können bei der Renaturierung keine intramolekularen Disulfidbrücken ausbilden. Natürlich vorkommende LIR Polypeptide, die für eine Veränderung durch Deletion oder Substitution von Cys-Bausteinen ausgewählt wurden, haben vorteilhaft keine biologischen Eigenschaften, die von den Disulfidbrücken abhängen, welche von dem Cys-Baustein ausgebildet werden. Andere mögliche Varianten werden durch Verfahren hergestellt, die zu einer Modifikation von benachbarten zweibasischen Aminosäuren führen, um eine Expression in Hefesystemen zu steigern, in denen KEX2 Protease Aktivität vorhanden ist. EP 212 914 offenbart Techniken für die ortsspezifische Mutagenese zur Inaktivierung von für KEX2 Protease relevanten Orten (protease processing sites) in einem Protein. Für KEX2 Protease relevante Orte werden inaktiviert, indem man Aminosäuren einfügt, deletiert oder substituiert, um Arg-Arg-, Arg-Lys- oder Lys-Arg-Paare zu verändern, so dass diese Paare von benachbarten basischen Aminosäuren nicht mehr vorkommen. Lys-Lys-Paare neigen erheblich weniger dazu, durch KEX2 gespalten zu werden, und die Umwandlung von Arg-Lys oder Lys-Arg in Lys-Lys stellt einen konservativen und bevorzugten Ansatz für die Inaktivierung von KEX2 Orten dar.
Natürlich vorkommende LIR Varianten sind ebenfalls in die vorliegende Erfindung einbezogen. Beispiele für solche Varianten sind Proteine, die aus alternativer Spleißung von mRNA oder aus einer proteolytischen Spaltung eines LIR Polypeptids resultieren. Alternative Spleißung von mRNA kann ein verkürztes, aber biologisch aktives LIR Polypeptid ergeben, wie z.B. eine natürlich vorkommende lösliche Form des Proteins. Zu den Variationen, die auf eine proteolytische Spaltung zurückgehen, zählen Unterschiede an den N- oder C-Termini nach Expression in unterschiedlichen Wirtszellen, verursacht durch proteolytische Abspaltung einer oder mehrerer Aminosäuren von dem LIR Polypeptid. Zusätzlich kann eine proteolytische Spaltung eine lösliche Form eines LIR aus einer an eine Membran gebundenen Form des Polypeptids freisetzen. Andere natürlich vorkommende Varianten sind diejenigen, in denen Abweichungen von den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NOS: 30, 32, 34 und 36 auf genetische Polymorphie zurückzuführen sind, die allelische Variation unter Individuen.
Innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung befinden sich auch Derivate von Polypeptiden der LIR Familie, zu denen native oder variierte LIR Polypeptide zählen, die durch Bildung von Konjugaten mit ausgewählten chemischen Individuen modifiziert wurden. Diese Konjugate können hergestellt werden, indem ein anderer Baustein kovalent mit einem nativen oder variierten LIR verbunden wird oder indem ein anderer Baustein nicht kovalent mit einem nativen oder variierten LIR verbunden wird. Zu den geeigneten chemischen Bausteinen oder Funktionen zählen, wenn auch nicht ausschließlich, Glykosylgruppen, Lipide, Phosphate, Acetylgruppen sowie andere Proteine oder Fragmente davon. Methoden zur kovalenten Verknüpfung von chemischen Bausteinen oder Gruppen mit Proteinen sind in der Technik gut bekannt und sind ganz allgemein geeignet für die Herstellung von Derivaten von LIR Peptiden. Beispielsweise können aktive oder aktivierte funktionelle Gruppen an Aminosäureseitenketten als Reaktionsorte für die kovalente Verknüpfung eines chemischen Bausteins mit einem LIR Polypeptid dienen. In ähnlicher Weise kann der N-Terminus oder der C-Terminus einen Reaktions- ort für die Verknüpfung mit einem Baustein aufweisen. LIR Polypeptide oder Fragmente davon, die mit anderen Proteinen oder Proteinfragmenten konjugiert sind, können in rekombinanter Kultur als N-terminale oder C-terminale Fusionsprodukte hergestellt werden. Beispielsweise können die konjugierten oder fusionierten Anteile eine Signal- oder Leitsequenz aufweisen, die an ein LIR Molekül an dessen N-Terminus angefügt ist. Das Signal- oder Leitpeptid dirigiert während oder nach der Translation den Transfer des Konjugats vom Ort seiner Synthese zu einem Ort innerhalb oder außerhalb der Zellmembran.
Ein nützliches LIR Polypeptidkonjugat ist dasjenige, in das ein poly-His oder eines der antigenischen Identifikationspeptide, die im U.S. Patent Nr. 5,011,912 sowie in Hopp et al., Bio/Technology 6:1124, 1988 beschrieben sind, inkorporiert wurden. Beispielsweise ist das FLAG^® Peptid, Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (SEQ ID NO:39) in hohem Maße antigenisch und stellt ein Epitop dar, das reversibel von einem spezifischen monoklonalen Antikörper gebunden wird, was einen schnellen Assay und eine leichte Reinigung von exprimiertem rekombinantem Protein möglich macht. Diese Sequenz wird durch bovine mucosale Enterokinase spezifisch an dem Baustein gespalten, der auf das Paar Asp-Lys unmittelbar folgt. Fusionsproteine, die mit diesem Peptid verkappt sind, können gegen intrazellulären Abbau in E.coli beständig sein. Murine Hybridoma, die als 4E11 bezeichnet werden, produzierten einen monoklonalen Antikörper, der an das Peptid von SEQ ID NO: 39 in Gegenwart von bestimmten zweiwertigen Metallkationen bindet und bei der American Typ Culture Collection unter der Zugangsnummer HB 9259 deponiert worden ist. Expressionssysteme, die sich für die Herstellung von rekombinanten, mit dem FLAG^®-Peptid fusionierten Proteinen eignen sowie monoklonale, das Peptid bindende Antikörper sind nützlich für die Reinigung der rekombinanten Proteine sind, können von Eastman Kodak Company, Scientific Imaging Systems. New Haven, Connecticut bezogen werden.
Besonders geeignete LIR-Fusionsproteine sind solche, in denen das Polypeptid in Form eines Oligmers vorliegt. Oligomere können durch Disulfidbrücken zwischen Cystein-Molekülen in mehr als einem Polypeptid oder durch nicht kovalente Wechselwirkungen zwischen LIR Polypeptidketten entstehen. Nach einem anderen Ansatz können LIR-Oligomere gebildet werden, indem man LIR Polypeptide oder deren Fragmente über kovalente oder nicht kovalente Wechselwirkungen zwischen Peptidbausteinen, die mit den LIR Polypeptiden fusioniert sind, miteinander verknüpft. Zu den geeigneten Peptidbausteinen zählen Peptidverbinder (peptide linkers) oder Peptidabstandshalter (spacers) oder Peptide, die die Eigenschaft besitzen, Oligomerisierungen zu fördern. Leucinzipper und bestimmte Polypeptide, die sich von Antikörpern ableiten, gehören zu den Peptiden, die die Oligomerisierung von LIR Polypeptiden, mit denen sie verbunden sind, fördern können.
Andere LIR Fusionsproteine, die die Bildung von Oligomeren fördern können, sind Fusionsproteine, bei denen heterologe Polypeptide mit verschiedenen Teilen von von Antikörpern abgeleiteten Polypeptiden (einschließlich der Fc-Domäne) fusioniert sind. Verfahren zur Herstellung solcher von Antikörpern abgeleiteten Polypeptide sind beschrieben in Ashkenazi et al., PNAS USA 88:10535, 1991; Byrne et al., Nature 344:667, 1990; und Hollenbaugh und Aruffo, Current Protocols in Immunology, Supplement 4, Seiten 10.19.1 bis 10.19.11, 1992. All diese Referenzen sind durch das Zitat in die vorliegende Offenbarung einbezogen. Beispiel 1 und Beispiel 5 beschreiben in der Folge Verfahren zur Herstellung von Fusionsproteinen UL18:Fc bzw. P3G2:Fc, wobei P3G2 und UL18 mit einem Polypeptid mit Fc-Region fusioniert werden, das von einem Antikörper stammt. Dies wird bewirkt, indem in einen Expressionsvektor ein fusioniertes Gen eingefügt wird, das für das Fusionsprotein P3G2:Fc kodiert und das Fusionsprotein P3G2:Fc exprimiert. Man lässt die Fusionsproteine sich aufbauen (assemble) sehr ähnlich wie Antikörpermoleküle, worauf sich von Kette zu Kette Disulfidbrücken zwischen den Fc-Polypeptiden ausbilden, wodurch divalente P3G2 Polypeptide entstehen. Bei einem ähnlichen Ansatz können P3G2 oder andere LIR Polypeptide für den variablen Teil einer schweren oder leichten Kette eines Antikörpers (for the variable portion of an antibody heavy or light chain) ersetzt werden. Wenn Fusionsproteine mit schweren oder leichten Ketten eines Antikörpers hergestellt werden, ist es möglich, ein LIR Oligomer mit so vielen wie vier LIR Regionen zu bilden.
Die vorliegende Erfindung schließt somit Nukleinsäuren ein, die für Fusionsproteine kodieren, die die Fc-Region von Ig sowie eine Aminosäuresequenz einschließen, die die extrazelluläre Region von jedem der Proteine der Mitglieder der LIR Familie enthält. Diese extrazellulären Regionen schließen z.B. ein: die Aminosäuren x₁₁ bis 262 von SEQ ID NO: 30, wobei x₁₁ die Aminosäure 1 oder 35 bezeichnet; die Aminosäuren x₁₂ bis 250 von SEQ ID NO:32, wobei x₁₂ für die Aminosäuren 1 oder 36 steht; die Aminosäuren x₁₃ bis 265 von SEQ ID NO: 34, wobei x₁₃ die Aminosäure 1 oder 35 bezeichnet; und die Aminosäuren x₁₄ bis 253 von SEQ ID NO:36, wobei x₁₄ für die Aminosäure 1 oder 36 steht.
Im Sinne dieser Erfindung schließt Fc native und mutein Formen ein, ebenso verkürzte Fc-Polypeptide, die die Scharnier (hinge)-Region enthalten, welche die Dimerisierung fördert. Eines der geeigneten Fc-Polypeptide ist das native Polypeptid mit Fc-Region, das sich von humanem IgG1 ableitet und in der PCT-Anmeldung WO 93/10151 beschrieben ist, deren Inhalt durch das Zitat in die vorliegende Offenbarung einbezogen ist. Ein anderes brauchbares Fc-Polypeptid ist das Fc-Mutein, das im U.S. Patent Nr. 5,457,035 beschrieben ist. Die Aminosäuresequenz des Fc-Muteins ist identisch mit der nativen Fc-Sequenz, die in WO 93/10151 beschrieben wird, außer dass die Aminosäure 19 von Leu zu Ala verändert ist, die Aninosäure 20 von Leu zu Glu verändert ist und die Aminosäure 22 von Gly zu Ala verändert ist. Dieses Fc-Mutein zeigt eine verminderte Affinität zu Immunglobulinrezeptoren.
Alternativ können oligomere Varianten von LIR Polypeptiden ein oder mehrere LIR Peptide einschließen, die durch Peptidverbinder (peptide linkers) verbunden sind. Zu den Beispielen zählen die Peptidverbinder, die im U.S. Patent Nr. 5,073,627 offenbart sind, das durch das Zitat in die vorliegende Offenbarung einbezogen wird. Fusionsproteine mit einer Mehrzahl von LIR Polypeptiden, die durch Peptidverbinder getrennt sind, können durch übliche rekombinante DNA Technologie hergestellt werden.
Bei einem anderen Verfahren zur Herstellung von oligomeren Varianten von LIR Polypeptiden verwendet man Leucinzipper. Leucinzipper Domänen sind Peptide, die die Oligomerisierung von Proteinen fördern, in denen sie vorkommen. Leucinzipper wurden zuerst in verschiedenen DNA bindenden Proteinen gefunden (siehe Landschulz et al., Science 240:1759, 1988). Unter den bekannten Leucinzippern finden sich natürlich vorkommende Peptide und Peptidderivate, die dimerisieren oder trimerisieren. Beispiele für Leucinzipper Domänen, die sich für die Herstellung von löslichen oligomeren LIR Polypeptiden oder von oligomeren Polypeptiden der LIR Familie eignen, sind in der PCT-Anmeldung WO 94/10308 beschrieben, deren Inhalt durch das Zitat in die vorliegende Offenbarung einbezogen wird. Rekombinante Fusionsproteine, bei denen lösliche LIR Polypeptide mit einem Peptid fusioniert sind, das in Lösung dimerisiert oder trimerisiert, können in geeigneten Wirtszellen exprimiert und das resultierende lösliche oligomere LIR Polypeptid kann aus dem Überstand der Kultur isoliert werden.
Zahlreiche Reagenzien sind bekannt, die für die Vernetzung (cross-linking) eines Proteins mit einem anderen Protein brauchbar sind. Heterobifunktionelle und homobifunktionelle Verbinder sind für diesen Zweck verfügbar und können z.B. von Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois bezogen werden. Solche Verbinder enthalten zwei funktionelle Gruppen (z.B. Ester- und/oder Maleinimidgruppen), die mit bestimmten funktionellen Gruppen in Aminosäureseitenketten reagieren und so ein Polypeptid mit einem anderen verbinden.
Ein Typ von Peptidverbindern, der in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, hält Polypeptid Domänen in einem genügend großen Abstand, der sicherstellt, dass jede Domäne sich richtig in die sekundären und tertiären Strukturen faltet, die für die gewünschte biologische Aktivität erforderlich sind. Der Verbinder sollte weiterhin zulassen, dass der extrazelluläre Teil die richtige räumliche Orientierung findet, um Bindungsstellen für Liganden bereit zu stellen.
Geeignete Peptidverbinder sind in der Technik bekannt und können auf übliche Art und Weise verwendet werden. Zu den geeigneten Peptidverbindern zählen die in den U.S. Patenten Nrn. 4,751,180 und 4,935,233 beschriebenen, deren Inhalt durch das Zitat in die vorliegende Offenbarung einbezogen wird. Ein Peptidverbinder kann mit LIR Polypeptiden auf jede bekannte Art und Weise verbunden werden, wie sie für die wechselseitige Verbindung von Polypeptiden üblich ist. Die vernetzenden (cross-linking) Reagenzien, die von Pierce Chemical Company, wie zuvor beschrieben, erhältlich sind, gehören zu den verwendbaren vernetzenden Reagenzien. Aminosäuren mit Seitenketten, die mit solchen Reagenzien reaktiv sind, können in dem Peptidverbinder enthalten sein, z.B. an deren Enden. Vorteilhaft werden die Fusionsproteine, die mittels eines Peptidverbinders erhalten werden, durch rekombinante DNA Technologie hergestellt.
Zu den Fusionsproteinen nach der vorliegenden Erfindung gehören Konstrukte, bei denen der C-terminale Anteil mit dem Verbinder fusioniert ist, der wiederum mit dem N-terminalen Anteil eines anderen Proteins fusioniert ist. Auf solche Weise verbundene Peptide ergeben ein einzelnes Protein, das die gewünschten biologischen Aktivitäten behält. Die Komponenten der Fusionsproteine werden in der Reihenfolge ihres Vorkommens aufgeführt (d.h. zuerst wird das N-terminale Polypeptid genannt, dann der Verbinder und danach das C-terminale Polypeptid).
Eine DNA Sequenz, die für ein Fusionsprotein kodiert, wird konstruiert unter Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken, um getrennte DNA Fragmente, die für die gewünschten Proteine kodieren, in einen geeigneten Expressionsvektor einzusetzen. Das 3'-Ende eines DNA Fragments, das für eines der Proteine kodiert, wird (über den Verbinder) mit dem 5'-Ende des DNA Fragments ligiert, das für ein anderes Protein kodiert, wobei die Leseraster der Sequenzen in Phase sind, um die Translation der mRNA in ein einziges, biologisch aktives Fusionsprotein zu ermöglichen. Eine DNA Sequenz, die für eine N-terminale Signalsequenz kodiert, kann in der DNA Sequenz, die für das N-terminale Polypeptid kodiert, zurückbehalten werden, während Stopkodons, die ein Durchlesen bis zu der zweiten (C-terminalen) DNA Sequenz verhindern würden, eliminiert werden. Umgekehrt wird ein Stopkodon, das für die Beendigung der Translation erforderlich ist, in der zweiten DNA Sequenz zurückbehalten. Eine DNA, die für eine Signalsequenz kodiert, wird vorteilhaft aus der DNA Sequenz entfernt, die für das C-terminale Polypeptid kodiert.
Eine DNA Sequenz, die für einen gewünschten Polypeptidverbinder kodiert, kann zwischen die DNA Sequenzen, die für die beiden Proteine kodieren, inseriert werden, und zwar mit dem selben Leseraster wie diese Sequenzen und unter Verwendung beliebiger geeigneter Methoden des Standes der Technik. Beispielsweise kann ein chemisch synthetisiertes Oligonukleotid, das für den Verbinder kodiert und über geeignete Restriktionsendonukleaseschnittstellen verfügt, zwischen die Sequenzen ligiert werden, die für Fc und ein P3G2 Polypeptid kodieren.
Innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung befinden sich rekombinante Expressionsvektoren für die Expression von Polypeptiden der LIR Familie, sowie Wirtszellen, die mit diesen Expressionsvektoren transformiert sind. Zu den Expressionsvektoren nach der Erfindung zählt DNA, die für ein Mitglied der LIR Familie kodiert, das mit geeigneten transkriptionellen oder translationellen regulatorischen Nukleotidsequenzen funktionell verbunden ist, beispielsweise mit Nukleotidsequenzen, die sich von einem Gen ableiten, das von einem Säugetier, Mikroorganismus, Virus oder Insekt stammt. Zu den Beispielen für regulatorische Sequenzen gehören transkriptionelle Promotoren, Operatoren (operators) oder Verstärker (enhancers), ein Ribosomen Bindungsort auf mRNA und geeignete Sequenzen, die die Initiation und das Ende der Transkription und der Translation regeln. Nukleotidsequenzen sind mit der DNA funktionell verbunden, wenn die regulatorische Sequenz in einer funktionellen Beziehung zu der LIR-DNA Sequenz steht. Somit ist eine als Promotor bezeichnete Nukleotidsequenz mit einer LIR-DNA Sequenz funktionell verbunden, wenn die als Promotor bezeichnete Nukleotidsequenz die Transkription der LIR-DNA-Sequenz regelt. In dem Expressionsvektor befinden sich in der Regel ein Replikationsursprung (origin of replication), der die Fähigkeit zur Replikation in der betreffenden Wirtszelle vermittelt, sowie ein Selektionsgen, durch das die Transformanten identifiziert werden.
Weiterhin kann eine Sequenz, die für ein geeignetes Signalpeptid kodiert, in die Expressionsvektoren eingebaut sein. Eine DNA Sequenz für ein Signalpeptid (sekretorische Leitsequenz) kann mit der LIR Sequenz im Leseraster fusioniert sein, so dass das LIR zunächst als Fusionsprotein mit darin enthaltener Signalsequenz translatiert wird. Ein Signalpeptid, das in den vorgesehen Wirtszellen funktioniert, fördert die extrazelluläre Sekretion des LIR Polypeptids. Das Signalpeptid wird von dem LIR Polypeptid abgespalten, sobald dieses aus der Zelle abgeschieden ist.
Die rekombinanten Expressionsvektoren nach der vorliegenden Erfindung können jede beliebige DNA enthalten, die für ein LIR Polypeptid kodiert. Beispiele für DNAs, die in den Expressionsvektoren enthalten sein können, schließen die Nukleinsäuremoleküle ein, deren Sequenzen in SEQ ID NOS: 29, 31, 33 und 35 aufgeführt sind.
Zu den geeigneten Wirtszellen für die Expression von LIR Polypeptiden gehören prokaryotische Zellen, Hefen oder höhere eukaryotische Zellen. Geeignete Klonierungs- und Expressionsvektoren zur Verwendung in bakteriellen, von Pilzen, Hefen oder Säugern stammenden Wirtszellen sind z.B. beschrieben von Pouwels et al. in Cloning Yectors; A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985. Zellfreie Translationssysteme könnten ebenfalls für die Herstellung von P3G2 Polypeptiden verwendet werden, wobei man RNA von DNA Konstrukten verwendet, die hierin beschrieben sind.
Zu den prokaryotischen Wirtszellen, die sich für die Ausführung der vorliegenden Erfindung eignen, gehören gramnegative und grampositive Organismen, z.B. Ecoli oder Bacilli. Zu den für eine Transformation geeigneten prokaryotischen Wirtszellen zählen u.a. Ecoli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene andere Spezies, wie z.B. Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus. In einer prokaryotischen Wirtszelle, wie z.B. E.coli, kann ein P3G2 Polypeptid ein N-terminales Methionin enthalten, das die Expression des rekombinanten LIR Polypeptids erleichtert. Das N-teminale Methionin kann von dem exprimierten, rekombinanten LIR Polypeptid abgespalten werden.
Expressionsvektoren zur Verwendung in prokaryotischen Wirtszellen enthalten im allgemeinen ein oder mehrere phänotypisch selektierbare Markergen(e). Ein phänotypisches, selektierbares Markergen ist z.B. ein Gen, das für ein Protein kodiert, welches Resistenz gegen Antibiotika vermittelt oder ein autotrophes Erfordernis überträgt. Zu den Beispielen für brauchbare Expressionsvektoren zur Verwendung in prokaryotischen Wirtszellen zählen die von im Handel erhältlichen Plasmiden abgeleiteten Vektoren, wie z.B. der Klonierungsvektor pBR322 (ATCC 37017). pBR322 enthält Gene für Resistenz gegen Ampicillin und Tetracyclin und stellt ein somit ein einfaches Mittel dar, um transformierte Zellen zu identifizieren. Ein geeigneter Promotor und eine DNA der LIR Familie können in den Vektor pBR322 insriert werden. Andere im Handel erhältliche Vektoren schließen z.B. ein pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und pGEMI (Promega Biotec, Madison, WI, USA).
Zu den Promotorsequenzen, die üblicherweise für Vektoren in prokaryotischen Wirtszellen verwendet werden, zählen β-Lactamase (Penicillinase), das Lactosepromotorsystem (Chang et al., Nature 75:615,1978 und Goeddel et al., Nature 281:544, 1979), das Tryptophan (trp) Promotorsystem (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980) und EP-A- 036 776) sowie der tac Promotor (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Seite 412, 1982). Bei einem besonders nützlichen Expressionssystem für prokaryotische Wirtszellen werden ein Phase ?P_L Promotor und eine c1875ts thermolabile Repressorsequenz verwendet. Zu den Plasmid-Vektoren, die von der American Type Culture Collection erhältlich sind und Derivate des ?P_L Promotors einschließen, gehören die Plastide pHUB2 (enthalten in dem E.coli Stamm JMB9, ATCC 37092) und pPLc28 (enthalten in Ecoli RR1, ATCC 53082).
Alternativ können LIR Polypeptide in Hefen als Wirtszellen exprimiert werden, vorteilhaft von denen des Genus Saccharomyces (wie z.B. S. cerevisiae). Andere Genera von Hefe, wie z.B. Pichia oder Kluyveromyces, können ebenfalls verwendet werden. Hefevektoren enthalten oft eine „Replikationsursprung"-Sequenz (origin of replication sequence) von einem 2μ Hefeplasmid, eine autonom replizierende Sequenz (ARS), eine Promotorregion, Sequenzen für die Polyadenylierung, Sequenzen für die Beendigung der Transkription und ein selektierbares Markergen. Zu den geeigneten Promotorsequenzen für Hefevektoren gehören u.a. Promotoren für Metallothionein, 3-Phosphoglycerat Kinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al, J. Adv, Enzyme Reg. 7:149, 1968; und Holland et al., Biochem. 17:4900, 1978), wie z.B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphat Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvat decarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphat Isomerase, 3-Phosphogycerat Mutase, Pyruvat Kinase, Triosephosphat Isomerase, Phosphoglucose Isomerase und Glukokinase. Andere geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung in Hefeexpressionssystemen sind weiterhin beschrieben von Hitzeman, EP-A- 73 675. Eine andere Alternative ist der Glukose-repressible Promotor ADH2, der von Russell et al. (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) und Beier at al (Nature 300:724, 1982) beschrieben wurde. Shuttle-Vektoren, die sowohl in Hefen als auch in E.coli replizieren, können konstruiert werden, indem man DNA von pBR322 für die Selektion und die Replikation in E.coli (Amp^r Gen und „Replikationsursprung") in die zuvor beschriebenen Hefevektoren einbaut.
Die a-Faktor Leitsequenz der Hefe kann verwendet werden, um die Sekretion des LIR Polypeptids zu leiten. Die a-Faktor Leitsequenz wird oft zwischen die Promotorsequenz und die strukturelle Gensequenz eingefügt. Siehe z.B. Kurjan et al., Cell 30:933, 1982 und Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330, 1984. Andere Leitsequenzen, die sich zur Förderung der Sekretion von rekombinanten Polypeptiden aus Hefezellen eignen, sind dem Fachmann bekannt. Die Leitsequenz kann in der Nähe ihres 3'-Terminus modifiziert sein, um eine oder mehrere Restriktionsorte vorzusehen. Dies erleichtert die Fusion der Leitsequenz mit dem strukturellen Gen.
Protokolle für die Transformation von Hefezellen sind dem Fachmann bekannt. Ein solches Protokoll ist beschrieben von Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978. Das Protokoll von Hinnen et al. wählt die Trp' Transformanten in einem selektiven Medium aus, das aus 0,67% Hefestickstoffbase, 0,5 % Casaminosäuren, 2% Glucose, 10 μg/ml Adenin und 20 μg/ml Uracil besteht.
Hefewirtszellen, die mit Vektoren transformiert wurden, welche eine ADH2 Promotorsequenz enthalten, können in einem „reichen" Medium kultiviert werden, um die Expression zu induzieren. Ein Beispiel für ein „reiches" Medium ist ein solches Medium, das 1% Hefeextrakt, 2% Peptone sowie 1 % Glukose enthält und mit 80 μg/ml Uracil angereichert ist. Eine Derepression des ADH2 Promotors findet statt, wenn die Glukose aus dem Medium verbraucht ist.
Auch Zellkultursysteme auf Basis von Säuger- oder Insektenzellen können verwendet werden, um rekombinante LIR Polypeptide zu exprimieren. Eine Übersicht über Baculovirus-Systeme für die Herstellung von heterologen Proteinen in Zellen von Insekten geben Luckow und Sommers in Bio/Technology 6:47, 1988. Von Säugetieren stammende etablierte Zelllinien können ebenfalls verwendet werden. Zu den Beispielen für geeignete Zelllinien von Säugetieren zählen die COS7 Linie von Affennierenzellen (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., Cell 23:175,1981), L-Zellen, C127 Zellen, 3T3 Zellen (ATCC CCL 163); Ovarialzellen von chinesischen Hamstern (CHO Zellen), HeLa Zellen und BHK Zelllinien (ATCC CRL 10) sowie die Zelllinie CVI/EBNA, die sich von der von afrikanischen grünen Affen stammenden Zelllinie CVI (ATCC CCL 70) ableitet, wie von McMahan et al. beschrieben (EMBO J. 10:2821, 1991). COS-1 (ATCC CRL-1650).
Transkriptionelle und translatorische Regulationssequenzen für Vektoren zur Expression in Säugetierwirtszellen können aus viralen Genomen entnommen werden. Üblicherweise verwendete Promotorsequenzen und Verstärker (enhancer)sequenzen leiten sich vom Polyomavirus, Adenovirus 2, Simianvirus 40 (SV40) und dem humanen Cytomegalievirus ab. Von dem viralen SV40 Genom abgeleitete DNA, wie z.B. SV40 Orte für Ursprung (origin), frühe und späte Promotoren, Verstärker, Spleißungs- und Polyadenylierungsstellen von SV40, können verwendet werden, um andere genetische Elemente für die Expression einer strukturellen Gensequenz in einer von einem Säugetier stammenden Wirtszelle zu ergeben. Virale frühe und späte Promotoren sind besonders nützlich, weil sich beide leicht aus einem viralen Genom als Fragment gewinnen lassen, das auch einen viralen Ursprung der Replication (origin of replication) enthält (Fiers et al., Nature 273:113, 1978). Auch kleinere oder größere Fragmente von SV40 können verwendet werden, vorausgesetzt sie enthalten die Sequenz von etwa 250 bp, die sich von der HIND III Schnittstelle bis zur Bg/I Schnittstelle im Replikationsursprung von SV40 erstreckt.
Geeignete Vektoren zur Verwendung bei der Expression in Säugetierwirtszellen können konstruiert werden, wie von Okayama und Berg in Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983 beschrieben wurde. Ein brauchbares System für eine stabile Expression der cDNA von Säugetierrezeptoren auf hohem Level in marinen Brustepithelzellen C 127 kann im wesentlichen so konstruiert werden, wie von Cosman et al. in Mol. Immunol. 23:935, 1986 beschrieben wurde. Ein starker Expressionsvektor, PMLSV N1/N4, beschrieben von Cosman et al. in Nature 312:768, 1984, ist als ATCC 39890 hinterlegt worden. Weitere Vektoren für die Expression in Säugerzellen sind in EP-A-0 367 566 und in WO 91/18982 beschrieben worden. Zu den noch weiteren Expressionsvektoren zur Verwendung in Säugerzellen gehören pDC201 (Sims et al., Science 241:585, 1988), pDC302 (Mosley et al., Cell 59:335, 1989 und pDC406 (McMahan et al., EMBO J. 10;2821, 1991). Auch Vektoren, die von Retroviren abgeleitet sind, können verwendet werden. Bei einem bevorzugte Expressionssystem wird pDC409 verwendet, wie in dem folgenden Beispiel 5 diskutiert wird.
Für die Expression von LIR Polypeptiden kann der Expressionsvektor eine DNA enthalten, die für ein Signal- oder Leitpeptid kodiert. An Stelle der nativen Signalsequenz kann eine heterologe Signalsequenz eingefügt werden, wie z.B. die Signalsequenz für Interleukin-7 (IL-7), die im U.S. Patent Nr. 4,965,195 beschrieben wurde; die Signalsequenz für den Rezeptor für Interleukin-2, beschrieben von Cosman et al., Nature 2:768, 1984; das Signalpeptid für Interleukin-4, das im EP 367 566 beschrieben wurde; das Typ I Interleukin-1 Rezeptor Signalpeptid, das im U.S. Patent Nr. 4,968,607 beschrieben wurde, und das Typ II Interleukin-1 Rezeptor Signalpeptid, beschrieben in EP 460 846 .
Weiterhin werden als im Bereich der vorliegenden Erfindung liegend gereinigte Polypeptide der LIR Familie sowie Verfahren zu deren Reinigung angesehen. Die gereinigten Polypeptide nach der vorliegenden Erfindung können durch Reinigung der in den obengenannten rekombinanten Expressionssystemen exprimierten LIR Polypeptide oder durch Reinigung der aus natürlichen Zellen stammenden LIR Polypeptide erhalten werden. Der gewünschte Reinheitsgrad kann von der beabsichtigten Verwendung des Proteins abhängen, wobei ein relativ hoher Reinheitsgrad erforderlich ist, wenn das Protein in vivo verwendet werden soll. Vorteilhaft haben die LIR Polypeptide einen solchen Reinheitsgrad, dass bei der SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese (SDS PAGE) keine Banden von Proteinen zu entdecken sind, die von denen des LIR Polypeptids verschieden sind. Dem Fachmann wird bewusst sein, dass mittels SDS PAGE infolge von differentieller Glykosylierung, Variationen in postranslationalem Prozessieren und ähnlichen Einflüssen, wie zuvor diskutiert, mehrere Banden vom jeweiligen LIR Polypeptid gesehen werden können. Es wird besonders bevorzugt, dass ein spezifisches LIR Polypeptid so weit gereinigt wird, dass es im wesentlichen homogen ist, was sich darin ausdrückt, dass bei SDS PAGE nur eine einzige Proteinbande nachweisbar ist. Die Proteinbande kann durch Anfärbung mit Silber, Anfärbung mit Coomassie Blau oder durch Autoradiographie oder durch Fluoreszenz sichtbar gemacht werden, sofern das Protein entsprechend markiert ist.
Bei einem der Verfahren zur Herstellung von gereinigten LIR.Polypeptiden kultiviert man eine Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor transformiert wurde, der eine DNA enthält, die für das gewünschte Polypeptid kodiert, und zwar unter Bedingungen, die die Expression des gewünschten LIR Polypeptids begünstigen, und trennt das LIR Polypeptid aus dem Kulturmedium ab. Wie der Fachmann erkennen wird, hängt die Wahl des Verfahrens zur Abtrennung des LIR Polypeptids von Faktoren ab, wie dem Typus der verwendeten Wirtszellen und davon, ob das LIR Polypeptid in das Kulturmedium sekretiert wird oder aus den Zellen extrahiert werden muss.
Wenn das Expressionsystem das Polypeptid in das Kulturmedium sekretiert, kann das Medium zunächst konzentriert werden, z.B. unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Konzentrationsfilters, wie z.B. einer Amicon oder Millipore Pellicon Ultrafiltrationseinheit. Nach der Konzentrierung kann das Konzentrat einer geeigneten Reinigungsmatrix zugeführt werden, wie z.B. einem Gelfiltrationsmedium. Alternativ kann ein Anionenaustauschharz verwendet werden, wie z.B. eine Harzmatrix oder ein Harzsubstrat mit anhängenden Diethylaminoethyl (DEAE) -Gruppen. Die Matrices können auf Acrylamid, Agarose, Dextran, Zellulose oder anderen Arten von üblicherweise bei der Reinigung von Proteinen verwendeten Stoffen basieren. In ähnlicher Weise kann man eine Reinigungsmatrix mit Kationen austauschenden Gruppen, wie z.B. mit Sulfopropyl- oder Carboxymethyl-Funktionalitäten, die an einer unlöslichen Matrix hängen, verwenden. Dabei werden Sulfopropylgruppen bevorzugt. Noch andere Reinigungsmatrices und -methoden, die sich für die Herstellung von gereinigtem LIR eignen, sind die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) unter Verwendung von umgekehrten Phasenmedien (reversed phase media) (RP-HPLC). Der Fachmann wird erkennen, dass jeder der zuvor beschriebenen Reinigungsschritte in verschiedenen Kombinationen benutzt werden kann, um ein gereinigtes LIR Polypeptid zu erzeugen.
Alternativ können LIR Polypeptide durch Immunoaffinitätschromatographie gereinigt werden. Eine Affinitätssäule, die einen Antikörper enthält, der an ein LIR Polypeptid bindet, kann nach üblichen Verfahren hergestellt und für die Reinigung von LIR verwendet werden. Beispiel 5 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die gegen P3G2 gerichtet sind und bei der Immunoaffinitätschromatographie verwendet werden können.
Rekombinantes Protein, das in Bakterienkulturen hergestellt wurde, kann gewonnen werden, indem man zuerst auf beliebige, übliche Weise die Wirtszellen zerstört, z.B. durch Gefrier- und Auftau-Zyklen, Beschallung, mechanische Zerstörung oder mittels zelllysierender Reagenzien, und dann das Polypeptid aus den Zellpellets extrahiert, wenn es unlöslich ist, oder aus dem fluiden Überstand abtrennt, wenn das Polypeptid darin löslich ist. Nach dem anfänglichen Isolierungsschritt kann das weitere Reinigungsverfahren Schritte umfassen, in denen man konzentriert, aussalzt, Ionenaustausch-, Affinitäts-, oder Größenausschluß-Chromatographie ausnutzt. Für viele Anwendungen ist als abschließender Reinigungsschritt eine RP-HPLC von Nutzen.
Weitere Methoden, die zu LIR Polypeptiden und gereinigten LIR Polypeptiden führen, schließen die Fermentierung von Hefe ein, die das Protein als ein sekretiertes Protein exprimieren. Sekretierte rekombinante Proteine, die aus Fermentationen in großem, kommerziellem Maßstab stammen, können nach Methoden gereinigt werden, die den von Urdal et al. in J. Chromatogr. 296:171, 1984 beschriebenen Methoden analog sind. Dabei werden zwei aufeinander folgende HPLC Stufen mit Phasenumkehr für die Reinigung eines rekombinanten Proteins an einer präparativen HPLC Säule angewandt.
DNA von LIR-P3G2 in dem Vektor pDC406 wurde bei der American Type Culture Collection am 22. April 1997 unter der Zugangsnummer 97995 hinterlegt. Das Deponat wurde gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags hinterlegt.
Wie zuvor beschrieben und in den Beispielen 6 und 14 dargestellt, sind LIR-P3G2 und LIR-pmb8 MHC-Rezeptormoleküle der Klasse I, die sich auf der Oberfläche von Monocyten, B-Zellen und NK Zellen befinden. Was Monozyten betrifft, so legt die Expression von LIRs, welche MHC bindende Proteine der Klasse I sind, die Vermutung nahe, dass für Monocyten eine Art von Erfordernis besteht, MHC Moleküle der Klasse I zu erkennen. LIR-P3G2 und LIR-pbm8 sowie gewisse weitere Mitglieder der LIR Familie enthalten zytoplasmatische ITIM Motive. Aufgrund von Analogie mit der Struktur und der Funktion von bekannten MHC-Rezeptormolekülen der Klasse I wirken diese LIRs als inhibierende Rezeptoren, die negative Signale vermitteln. In der Tat zeigen die in Beispiel 11 dargestellten Ergebnisse, dass LIRs mit SBP-1 assoziieren und FcR-vermittelte Aktivierungsereignisse inhibieren. Somit könnten Monocyten Rezeptoren der Klasse I exprimieren, um Zell-vermittelte lysierende (lytic) Mechanismen zu unterdrücken. Monocyten phagocytieren (phagocytose) rasch extrazelluläre Pathogene via FcR, und ein Monocyten FcR-Engagement induziert die Verstärkung von Immunantworten, indem es mehr systemische Mediatoren produziert, insbesondere TNF-a, IL-6 und IL-8. Somit spielen die LIRs eine Rolle bei der Monocyten- und Makrophagen-Regulierung von cytolytischen und entzündlichen Reaktionen (responses) gegen körpereigene Gewebe (self tissues). Das Wechselspiel von aktivierenden FcR-Signalen und inhibierenden LIR-Signalen, kann es möglich machen, dass geringe Mengen von selbstreaktiven IgG im Kreislauf existieren und an die Membran von Monocyten binden, wodurch sie eine Immunantwort auslösen. Beispielsweise kann die Expression dieser inhibierenden Rezeptoren den sich entwickelnde Embryo vor durch Antiköper der Mutter vermittelten allogeneischen (allogeneic) Erkennungen schützen.
Was die LIRs auf Zellen der DC-Linie (DC lineage) angeht, so co-exprimieren CD33⁺CD14^–CD16^–HLA^–DR⁺ DC LIR-P3G2 und LIR-pbm8, wie in Beispiel 13 beschrieben. Es wird vermutet, dass die DC FcR eine Rolle bei der Bindung von Immunkomplexen spielen und nach der Bindung ein DC Aktivierungssignal auslösen. Somit können LIRs, die auf DC exprimiert werden, die Aktivierung von DC durch Wechselwirkungen mit FcR unterdrücken.
Vielen Mitgliedern der LIR Familie fehlen die ITIM Motive, und aufgrund von Analogie mit der Struktur und der Funktion von bekannten MHC-Rezeptoren der Klasse I sind diese LIR's aktivierende Rezeptoren. Das Fehlen eines Rezeptors, der negative Signale vermittelt, könnte zu Autoimmunkrankheiten führen. Somit könnte die Verbindung eines Mitglieds der LIR Familie, das über ITIM Motive verfügt, mit einem agonistischen Antikörper oder Liganden benutzt werden, um bei einem Krankheitszustand, bei dem das Immunsystem überaktiv ist und eine exzessive Entzündung oder Immunpathologie vorliegt, eine Zellfunktion herunter zu regulieren. Andererseits kann ein antagonistischer Antikörper, der für den LIR Rezeptor mit dem ITIM Motiv spezifisch ist, oder eine lösliche Form des Rezeptors verwendet werden, um die Wechselwirkung des Rezeptors auf der Zelloberfläche mit dem Liganden des Rezeptors zu blockieren und dadurch die spezifische Immunfunktion in diesem Krankheitszustand, der mit einer unterdrückten Immunfunktion einher geht, zu aktivieren. Da Rezeptoren, denen ein ITIM Motiv fehlt, aktivierende Signale aussenden, wenn sie mit ihrem Liganden verbunden sind, wie zuvor beschrieben, könnte das Fehlen eines Rezeptors, der ein aktivierendes Signal vermittelt, zu einer unterdrückten Immunfunktion führen. Die Verbindung des Rezeptors mit seinem agonistischen Antikörper oder Liganden kann verwendet werden, um Krankheiten zu behandeln, die mit einer unterdrückten Immunfunktion verbunden sind. Die Verwendung eines antagonistischen Antikörpers, der für den aktivierenden LIR Rezeptor spezifisch ist, oder eine lösliche Form des Rezeptors kann benutzt werden, um die Wechselwirkung des aktivierenden Rezeptors mit dem Liganden des Rezeptors zu blockieren und dadurch das aktivierende Signal herunter zu regulieren.
Da LIR-P3G2 an verschiedene Zellen bindet, kann LIR-P3G2 verwendet werden, um diese Zellen aus heterogenen Präparationen zu reinigen oder zu isolieren. Weiterhin können P3G2 Sonden verwendet werden, um verwandte Moleküle zu isolieren und zu identifizieren.
LIR Polypeptide nach der vorliegenden Erfindung können benutzt werden, um Behandlungsmethoden für Störungen oder Krankheiten zu entwickeln, die direkt oder indirekt durch schadhafte oder ungenügende Mengen an einem oder mehreren LIR Polypeptiden vermittelt werden. Eine therapeutisch wirksame Menge eines gereinigten LIR Polypeptids wird einem Patienten verabreicht, der an einer solchen Störung oder Krankheit leidet. Alternativ kann für LIR Polypeptide kodierende DNA verwendet werden um einen gentherapeutischen Ansatz für die Behandlung solcher Störungen oder Krankheiten zu entwickeln. Die Offenbarung von nativen LIR Nukleotidsequenzen in dieser Patentanmeldung erlaubt die Entdeckung von defekten LIR Genen und deren Ersatz durch Gene, die für normales LIR kodieren. Defekte Gene können mittels in vitro durchgeführter diagnostischer Assays und durch Vergleich der hierin offenbarten Nukleotidsequenz eines nativen LIRs mit derjenigen eines Gens entdeckt werden, das von einer Person stammt, die im Verdacht steht, ein defektes Gen zu tragen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verfügung, die ein LIR Polypeptid oder ein Fragment oder eine Variante davon enthalten können, zusammen mit einem physiologisch akzeptablen Trägerstoff oder Verdünnungsmittel. Diese Trägerstoffe oder Verdünnungsmittel dürfen für die Empfänger in den angewandte Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch sein. Die Zusammensetzungen können weiterhin Pufferstoffe, Antioxidantien, wie z.B. Ascorbinsäure, niedermolekulare Polypeptide (mit weniger als etwa zehn Bausteinen), Proteine, Aminosäuren, Kohlenhydrate, wie z.B. Glukose, Saccharose oder Dextrine, chelatisierende Stoffe, wie z.B. EDTA, Glutathion und andere Stabilisatoren und Hilfsstoffe (excipients), enthalten, die üblicherweise in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen nach der vorliegenden Erfindung können mittels geeigneter Hilfsstoffe als Verdünnungsmittel in Form eines Lyophilisats formuliert werden. Die pharmazeutischen Zusammensetzung können ein LIR Polypeptid in jeder der hierin beschriebenen Formen enthalten, einschließlich von, aber nicht beschränkt auf aktive Varianten, Fragmente und Oligomere. LIR Polypeptide können nach bekannten Methoden formuliert werden, wie sie üblicherweise angewandt werden, um pharmazeutisch brauchbare Zusammensetzungen zu formulieren. Zu den Komponenten, die üblicherweise in pharmazeutischen Formulierungen verwendet werden, zählen die in Remington's Pharmaceutical Sciences,16. Auflage (Mack Publishing Company, Easton, PA, USA, 1980) beschriebenen Materialien.
Die pharmazeutischen Präparationen nach der vorliegenden Erfindung können einem Patienten, vorzugsweise einem menschlichen Patienten, auf eine Art und Weise verabreicht werden, die von der jeweiligen Indikation abhängt. So kann die Zusammensetzung z.B. durch intravenöse Injektion, lokale Administration, kontinuierliche Infusion, nachhaltige Freisetzung aus Implantaten usw. verabreicht werden. Zweckentsprechende Dosierungen und die Häufigkeit der Verabreichung hängen von solchen Faktoren ab, wie z.B. die Art und die Schwere der zu behandelnden Indikation, die gewünschte Reaktion und der Zustand des Patienten usw.
Bei bevorzugten Ausführungsformen ist ein LIR Polypeptid, das in einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach der vorliegenden Erfindung verwendet wird, im wesentlich frei von anderen Proteinen natürlichen oder endogenen Ursprungs; es ist erwünscht, dass das LIR Polypeptid weniger als etwa 1 Massenprozent an verunreinigenden Proteinen enthält, die als Rückstände aus dem Herstellungsverfahren stammen. Die Zusammensetzungen können jedoch andere Proteine enthalten, die als Stabilisatoren, Trägerstoffe, Hilfsstoffe oder zusätzliche Wirkstoffe fungieren.
DNA Moleküle und DNA Fragmente, die für LIRs kodieren und hierin offenbart sind, finden Verwendung bei der Herstellung von LIR Polypeptiden, wie zuvor beschrieben. Bei einer Ausführungsform enthalten die Fragmente mindestens etwa 17 aufeinander folgende Nukleotide, vorteilhaft mindestens 30 aufeinander folgende Nukleotide von DNA, die für LIR kodiert. DNA- und RNA-Komplemente der Fragmente haben eine ähnliche Verwendung. Unter den Verwendungen der LIR Nukleinsäurefragmente ist auch die als Sonden oder Primer in Polymerasekettenreaktionen. Beispielsweise kann eine Sonde verwendet werden, die einem DNA Fragment entspricht, das für die extrazelluläre Domäne eines LIR kodiert, um die Anwesenheit von LIR Nukleinsäure mittels eines in vitro Assays oder mit einem anderen Assays, wie z.B. dem Northern Blot oder dem Southern Blot Assay, nachzuweisen. Zelltypen, welche ein LIR Polypeptid exprimieren, können mit Hilfe von Nukleinsäuresonden aus der LIR Familie identifiziert werden, und zwar mittels Sonden verwendender Verfahren, die in der Technik gut bekannt sind. Der Fachmann verfügt über die Fähigkeit, eine Sonde von geeigneter Länge auszuwählen und übliche PCR Techniken anzuwenden, um eine DNA Sequenz zu amplifizieren und das Amplifikat zu isolieren.
Nukleinsäurefragmente können auch als Sonden bei Hybridisierungen über die Artengrenzen hinaus (cross species hybridization) zur Isolierung von DNA von LIR anderer Säugetierspezies dienen. Beispielsweise kann eine Sonde verwendet werden, die der extrazellulären Domäne eines LIR Polypeptids entspricht. Die Sonden können nach üblichen Methoden markiert werden (z.B. mit ³²P).
Andere nützliche Fragmente von LIR-Nukleinsäuren sind Sense- oder Antisense-Oligonukleotide, die entweder DNA oder RNA enthalten können und deren Sequenz einer LIR mRNA (sense) oder dem Komplement einer LIR mRNA (antisense) oder dem nicht kodierenden Strang einer doppelsträngigen DNA von LIR entspricht, z.B. der DNA von P3G2 (antisense). Ein antisense Oligonukleotid bildet somit einen Hybridduplex mit einer mRNA Sequenz. Solche Oligonukleotide enthalten im allgemeinen mindestens 14 Nukleotide und vorteilhaft mindestens etwa 14 bis etwa 30 Nukleotide. Die Fähigkeit, auf der Grundlage einer cDNA Sequenz eines gegebenen Proteins ein Antisense- oder Sense-Oligonukleotid zu schaffen, ist z.B. beschrieben in Stein und Cohen in Cancer Res. 48:2659, 1988 und van der Krol et al. in BioTechniques 6:958,1988.
Die Bindung von Sense- oder Antisense-Oligonukleotiden an Nukleinsäurezielsequenzen führt zur Entstehung von Duplexen, die auf die eine oder andere Weise die Translation (RNA) oder Transkription (DNA) blockieren, beispielsweise durch verstärkten Abbau des Duplexes, vorzeitige Beendigung der Transkription oder Translation oder auf andere Weise. Diese Oligonukleotide können somit verwendet werden, um die Expression von LIR zu blockieren.
Bei einer Ausführungsform schließen die Sense- oder Antisense-Oligonukleotide, die in den Bindungsverfahren eingesetzt werden, Oligonukleotide mit modifizierten Zucker-Phosphodiester-Gerüsten (oder andere Zuckerbindungen, wie z.B. die in WO 91/06629 beschriebenen) ein, wobei diese Zuckerbindungen resistent gegenüber endogenen Nukleasen sind. Oligonukleotide mit Zucker-Bindungen, die gegenüber endogenen Nukleasen resistent sind, sind in vivo stabil (d.h. sie vermögen enzymatischem Abbau zu widerstehen), aber ihre Sequenzspezifität, an Nukleotidzielsequenzen binden zu können, bleibt erhalten. Zu anderen Beispielen für Sense- oder Antisense-Oligonukleotide zählen diejenigen Oligonukleotide, die kovalent an organische Moleküle gebunden sind, wie die in WO 90/10448 beschriebenen, und an andere Bausteine, die die Affinität des Oligonukleotid zu der Nukleinsäurezielsequenz erhöhen, wie z.B. Poly-(L-lysin). Weiter noch können Interkalierungsmittel (intercalating agents), wie z.B. Ellipticin, und Alkylierungsmittel oder Metallkomplexe mit Sense- oder Antisense-Oligonukleotiden verbunden sein, um die Bindungsspezifitäten der Sense- oder Antisense-Oligonukleotide für die Nukleotidzielsequenz zu modifizieren.
Antisense- oder Sense-Oligonukleotide können in ein Zelle, die die Nukleotidzielsequenz enthält, nach beliebigen Methoden des Gentransfers eingeführt werden, z.B. mittels durch CaPO₄-vermittelte DNA-Transfektion, Elektroporation oder unter Verwendung von Gentransfervektoren, wie z.B. das Epstein-Barr-Virus. Antisense- oder Sense-Oligonukleotide werden vorteilhaft in eine Zelle eingeführt, die die Nukleinsäurezielsequenz enthalt, indem man das Antisense- oder Sense-Oligonukleotid in einen geeigneten retroviralen Vektor insertiert und dann die Zelle mit dem retroviralen Vektor, der die insertierte Sequenz enthält, in Kontakt bringt, entweder in vivo oder ex vivo. Zu den geeigneten retroviralen Vektoren zählen, wenn auch nicht ausschließlich, diejenigen, die sich von dem murinen Retrovirus M-MuLV, N2 (einem von M-MuLV abgeleiteten Retrovirus) oder von den Doppelkopievektoren, die als DCT5A, DCT5B und DCT5C bezeichnet werden (siehe die PCT Anmeldung US 90/02656), ableiten.
Sense- oder Antisense-Oligonukleotide können auch in Zellen eingeführt werden, die die Nukleinsäurezielsequenz enthalten, indem man ein Konjugat aus dem Sense- oder Antisense-Oligonukleotid und einem Liganden bindenden Molekül bildet, wie in WO 91/04753 beschrieben ist. Geeignete Liganden bindende Moleküle schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Zelloberflächenrezeptoren, Wachstumsfaktoren, andere Cytokine oder andere Liganden, die an Rezeptoren auf der Zelloberfläche binden. Vorzugsweise stört die Konjugation des Liganden bindenden Moleküls im wesentlichen nicht die Fähigkeit des Liganden bindenden Moleküls, an sein entsprechendes Molekül oder an seinen Rezeptor zu binden oder blockiert den Eintritt des Sense- oder Antisense-Oligonukleotids oder seiner konjugierten Version in die Zelle.
Alternativ kann ein Sense- oder Antisense-Oligonukleotid in eine Zelle eingeführt werden, die die Nukleinsäarezielsequenz enthält, indem man eine Oligonukleotid-Lipid-Komplex bildet, wie in WO 90/10448 beschrieben ist. Der Komplex aus dem Sense- oder Antisense-Oligonukleotid und dem Lipid dissoziiert vorteilhafterweise in der Zelle unter dem Einfluss einer endogenen Lipase.
In einem noch weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Antikörper zur Verfügung, die spezifisch an LIR Polypeptide binden, d.h. die Antikörper binden an LIR Polypeptide über einen Antigen-bindenden Ort des Antikörpers (im Gegensatz zu einer nicht spezifischen Bindung). Antikörper nach der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung von LIR Polypeptiden oder deren immunogenen Fragmenten hergestellt werden. Monoklonale und polyklonale Antikörper können nach üblichen Techniken hergestellt werden. Siehe z.B. Monoclonal Antibodies: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (Herausgeber), Plenum Press, New York, 1980; und Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow und Land (Herausgeber), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988. Ein beispielhaftes Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die immunoreaktiv mit P3G2 sind, findet sich im folgenden Bespiel 5
Innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung liegen auch Antigen-bindende Fragmente von Antikörpern, die spezifisch an ein LIR Polypeptid binden. Zu diesen Fragmenten zählt, wenn auch nicht ausschließlich, Fab, F(ab') und F(ab')₂. Varianten und Derivate der Antikörper, die durch gentechnische Methoden hergestellt werden, werden auch als im Bereich der vorliegenden Erfindung angesehen.
Zu den monoklonalen Antikörpern nach der vorliegenden Erfindung zählen auch chimäre (chimeric) Antikörper, d.h. humanisierte Versionen von murinen monoklonalen Antikörpern. Diese Antikörper können nach üblichen Verfahren hergestellt werden und haben den Vorteil einer verminderten Immunogenizität, wenn diese Antikörper menschlichen Patienten verabreicht werden. Bei einer anderen Ausführungsform enthält ein humanisierter Antikörper die variable Region eines murinen Antikörpers(oder nur dessen Antgen-bindenden Ort) sowie eine konstante Region, die sich von einem humanen Antikörper ableitet. Alternativ kann ein humanisiertes Antikörperfragment den Antigen-bindenden Ort eines murinen monoklonalen Antikörpers sowie ein Fragment einer variablen Region aufweisen (dem der Antigen-bindende Ort fehlt), die sich von einem humanen Antikörper ableitet. Zu den Verfahren zur Herstellung von chimären und weiteren technisch veränderten Antikörpern gehören diejenigen, die von Riechmann et al. in Nature 332:232, 1988, von Lie et al. in PNAS 84:3439, 1987; von Larrick et al. in BioTechnology 7:934, 1989; und von Winter und Harris, in TIPS 14:139, 1993 beschrieben sind.
Wie zuvor erwähnt, können die Antikörper nach der vorliegenden Erfindung bei in vitro oder in vivo Assays zum Nachweis der Anwesenheit von LIR Polypeptiden und zur Reinigung von LIR Polypeptiden durch Affinitätschromatographie verwendet werden.
Weiterhin können Antikörper, die ein LIR an der Bindung an Zielzellen hindern können, verwendet werden, um eine biologische Aktivität eines LIR Polypeptids zu inhibieren. Genauer gesagt können therapeutische Zusammensetzungen mit einem Antikörperantagonisten gegen ein Mitglied oder mehrere Mitglieder der LIR Familie mit einem ITIM Motiv einem Individuum zugeführt werden, um die Wechselwirkung eines an der Zelloberfläche lokalisierten LIR mit seinem Liganden zu blockieren. Das Ergebnis ist die Aktivierung einer Immunfunktion, und dies ist besonders nützlich bei Krankheitszuständen, bei denen das Immunsystem wenig empfindlich oder unterdrückt ist. Umgekehrt können therapeutische Zusammensetzungen mit einem Antikörperantagonisten gegen ein oder mehrere Mitglieder der LIR Familie, denen ein ITIM Motiv fehlt, verwendet werden, um den gegenteiligen Effekt zu erzielen. Dies ist nützlich bei Krankheitszuständen, in denen das Immunsystem überaktiv ist und exzessive Entzündungen oder Immunpathologie gegeben sind.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die mindestens einen Antikörper enthalten, der mit einem LIR Polypeptid immunoreaktiv ist, und die weiter ein geeignetes Verdünnungsmittel, einen Hilfsstoff oder Trägerstoff enthalten, werden als zu der vorliegenden Erfindung gehörig angesehen. Geeignete Verdünnungsmittel, Hilfsstoffe und Trägerstoffe sind im Zusammenhang mit den pharmazeutischen Zusammensetzungen beschrieben, die die Polypeptide nach der vorliegenden Erfindung enthalten.
Die folgenden Beispiele werden gegeben, um bestimmte Ausführungsformen der Erfindung zu erläutern.
BEISPIELE
Beispiel 1. Isolierung und Expression eines viralen Proteins
DNA, die für das Polypeptid P3G2 nach der vorliegenden Erfindung kodierte, wurde durch Isolierung und Expression eines viralen Glykoproteins, UL18, von dem bekannt ist, dass es auf Zellen exprimiert wird, die mit HCMV infiziert sind, und dann durch Expression eines UL18/Fc Fusionsproteins und dessen Verwendung für die Suche nach UL18 Rezeptoren identifiziert. Für UL18 und dessen Aminosäuresequenz kodierende DNA ist bekannt und beschrieben in Beck, S. und B.G. Barrell, Nature 331:269 bis 272, 1988. In der Folge werden die Isolierung von UL18 und die Herstellung des UL18/Fc Fusionsproteins beschrieben.
Unter Verwendung von Standardmethoden wurde die gesamte RNA von humanen Vorhautfibroblasten, die mit HCMV (AD169) infiziert waren, in drei verschiedenen Transscriptionsstadien, nämlich sehr früh (IE, 8 p.i.h.) früh (24 p.i.h.) und spät (48 p.i.h.), isoliert. Weil bekannt ist, dass UL18 früh in der Infektion transskribiert wird, wurde die I.E. Gesamt-RNA polyA⁺-selektiert und verwendet, um eine HCMV-IE cDNA Bibliothek zu konstruieren, wobei ein cDNA Kit entsprechend den Instruktionen des Herstellers (Pharmacia TIME SAVER cDNA Kit) verwendet wurde. Um das UL18 Gen in voller Länge zu isolieren, wurden zwei Oligonukleotid-Primer synthetisiert, von denen bekannt war, dass sie die bekannten terminalen Sequenzen von UL18 enthielten. Die Primer wurden verwendet, um das UL18 Gen aus der HCMV-IE cDNA Bibliothek zu isolieren und zu amplifizieren. Die Primer hatten die folgenden Sequenzen und schlossen Not I Restriktionsorte ein, die in dem PCR Produkt enthalten waren:
Die PCR-Bedingungen schlossen ein: Einen Zyklus von 5 Minuten bei 95°C, an den sich 30 Zyklen von 45 Sekunden bei 95°C, 45 Sekunden bei 58°C und 45 Sekunden bei 72°C anschlossen. Darauf folgte ein Zyklus von 5 Minuten bei 72°C. Das PCR Produkt wurde durch Elektrophorese an einem 1 % Agarosegel der Größe nach analysiert (sized), wobei Ethidiumbromid verwendet wurde, um die getrennten DNA-Produkte sichtbar zu machen. Die Anwesenheit einer DNA mit der erwarteten Größe von etwa 1,1 kb wurde bestätigt.
Der Expressionsvektor pDC409, ein Vektor, der von pDC406 (MeMahan et al., EMBO J. 10:2821, 1991) abgeleitet war, aber einen einzelnen Bgl II Ort hat, wurde für den Klonierungsprozess ausgewählt. Das PCR Produkt wurde in einen pDC409 Expressionsvektor durch die Not I Orte subkloniert und sequenziert, und die Aminosäuresequenz wurde aus der Nukleotidsequenz abgeleitet. Die so bestimmten Nukleotid- und Aminosäuresequenzen waren identisch mit den zuvor publizierten Sequenzen (ibid).
Ein Fusionsprotein aus der extrazellulären Region von UL 18 und einer muteinen humanen IgG1 Fc Region (UL18:Fc) wurde hergestellt, indem zunächst cDNA isoliert wurde, die für die extrazelluläre Region von UL18 kodiert, wobei Primer verwendet wurden, die die extrazelluläre Region von UL18 flankieren. Die Primer wurden synthetisiert mit Sal I und Bgl I Restriktionsorten, eingesetzt an den 3'- und 5'-Termini, so dass die mittels PCR amplifizierte cDNA Sal I und Bgl II Restriktionsorte an den 5'- bzw. 3'-Enden einführte. Die Primer hatten die folgenden Sequenzen:
Die Bedingungen für die PCR Reaktion waren dieselben wie zuvor beschrieben, außer dass die Matrize (template) das in voller Länge isolierte Gen war, wie gerade beschrieben.
Um ein Vektorkonstrukt für die Expression des Fusionsproteins, sUL18:Fc, zur Verwendung in Studien über die Bindung an Zellen herzustellen, wurde ein DNA-Fragment, das für die Fc Region von humanem IgG1 Antikörper kodiert, aus einem Plasmid isoliert, wobei Bgl II uns Not I Restriktionsenzyme verwendet wurden. Der kodierte Fc Anteil war das mutein Fc, das im U.S. Patent Nr. 5,457,035 beschrieben ist und eine verminderte Affinität zu Immunglobulinrezeptoren aufweist. Der Bgl II Ort in dem sUL18 Gen wurde verwendet, um die DNA des sUL18 Gens in den Bgl II Ort des Fc Gens zu ligieren, wodurch ein sUL18:Fc Fusions-DNA-Konstrukt entstand, das einen N-terminalen Sal I Restriktionsort und einen C-terminalen Not I Restriktionsort aufwies. Dieses fusionierte sUL18:Fc DNA-Konstrukt wurde dann an seinen Sal 1 und Not 1 Orten in den Expressionsvektor pDC4091igiert, so dass ein 409/sUL18/Fc DNA Konstrukt entstand.
Die Affenzelllinie COS-1 (ATCC CRL-1650) wurde verwendet, um die Expression des Fusionsproteins zu bestätigen. COS-1 Zellen in 6 Napfplatten (6-well plates) (2 × 10⁵ Zellen pro Napf) wurden mit etwa 2 μg pro Napf des DNA-Konstrukts 409/sUL18/Fc transfiziert. Die Zellen wurden 2 bis 3 Tage in 5% FBSDMEM/F12 (erhältlich von GIBCO) kultiviert, dann zweimal mit PBS gewaschen, eine Stunde in RPMI ohne Cystein/Methionin hungern gelassen (starved) (erhältlich von GIBCO als RPMI 1640) und metabolisch markiert mit 100 μCi/ml ³⁵S-Met/Cys für vier Stunden. Der Überstand wurde geklärt (spun clear), um lose Zellen zu entfernen, und 150 μl des Überstands wurden mit 100 μl RIPA (0,05% Tween 20, 0,1 % SDS, 1 % Triton X-100, 0,5% Deoxycholat in PBS) als Puffer und 50μl 50% Protein A Sepharose in Form von festen Träger -Perlen bei 4°C für 1 Stunde inkubiert. Protein A Sepharose ist ein fester Sepharose-Träger (erhältlich von Pharmacia) nit immobilisiertem Protein A, das an den Fc Teil des Fusionsproteins bindet. Nach dem Auswaschen des festen Trägers mit RIPA, um nicht gebundenes Material zu entfernen, wurde das an den festen Protein A Sepharose Träger gebundene Fusionsprotein von der Protein A Sepharose mittels 35 μl SDS-PAGE reduzierendem Puffer eluiert und 5 Minuten auf 100°C erhitzt. Das Eluat wurde auf einem 4 bis 20% SDS Polyacrylamid-Gradienten-Gel mit ¹⁴C-markierten Molekulargewichtsmarkern für Proteine einer Elektrophorese unterworfen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit 8% Essigsäure fixiert und bei Raumtemperatur 20 Minuten lang mit einem Amplifier von Amersham verstärkt (enhanced). Nachdem das Gel unter Vakuum getrocknet worden war, wurde es einem Röntgenfilm ausgesetzt. Die Filmanalyse bestätigte, dass das erwartete Protein, ein Protein von 100 bis 120 Dalton, das die mutein Fc Region von IgG und die extrazelluläre Region von UL18 fusioniert mit der Fc Region enthielt, exprimiert worden war.
Nachdem Zellen identifiziert worden waren, die das Fusionsprotein exprimierten, wurden in großem Stil Kulturen von transfizierten Zellen angelegt, um Überstände von Zellen anzusammeln, die das Fusionsprotein exprimierten. Bei dieser Prozedur wurden COS-1 Zellen in T175 Zellkulturflaschen mit 15 μg pro Flasche der Fusions-DNA von UL18/Fc/409 transfiziert. Nach 7 Tagen Kultivierung in einem Medium, das 0,5% bovines Serum mit niedrigem Gehalt an Immunglobulin (low immunoglobulin bovine serum) enthielt, wurde dem Überstand eine Lösung von 0,2% Azid zugesetzt, und der Überstand wurde durch ein 0,22 μm Filter filtriert. Dann wurde etwa 1 Liter des Kulturüberstands mit einer Rate von 10 ml/min durch ein BioCad Protein A HPLC Proteinreinigungssystem geführt, wobei eine 4,6 × 100 mm Protein A Säule (Poros 20A von PerSeptive Biosystems) verwendet wurde. Die Protein A Säule bindet den Fc Teil des sUL18/Fc Fusionsproteins, das in dem Überstand enthalten ist, immobilisiert dadurch das Fusionsprotein und lasst die anderen Komponenten des Überstands durch die Säule passieren. Die Säule wurde mit 30 ml PBS Lösung gewaschen, und das gebundene sUL18/Fc wurde von der HPLC Säule mit Zitronensäure eluiert, die auf einen pH von 3,0 eingestellt war. Das eluierte sUL18/Fc wurde sofort nach dem Eluieren mittels 1M Hepeslösung auf einen pH von 7,4 neutralisiert. Das gesammelte Protein wurde mittels SDS PAGE und Anfärbung mit Silber (silver staining) analysiert, Die Expression des U118/Fc Fusionsproteins von 100 bis 120 kDa wurde dadurch bestätigt.
Beispiel 2. Durchsuchen von Zelllinien auf Bindung von UL18
Das sUL18/Fc Fusionsprotein, isoliert wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde verwendet, um Zelllinien auf Bindung des Fusionsproteins hin zu durchsuchen, wobei quantitative Bindungsstudien mittels üblicher Durchflußcytometrie Methodik durchgeführt wurden. Die Studien liefen für jede Zelllinie so, dass etwa 100.000 Zellen, die mit 2% FCS (fötales Kälberserum), 5% normalem Ziegenserum und 5% Kaninchenserum in PBS blockiert waren, eine Stunde lang inkubiert wurden. Dann wurden die blockierten Zellen mit 5 μg/ml sUL18/Fc Fusionsprotein in 2% FCS, 5% Ziegenserum und 5% Kaninchenserum in PBS inkubiert. Nach der Inkubation wurde der Ansatz 2 mal mit FACS Puffer (2% FCS in PBS) gewaschen und darauf mit antihumanem FcBiotin der Maus (mouse anti human FcBiotin) (bezogen von Jackson Reearch) und mit SAPE (Streptavidin-Phycoerythrin, bezogen von Molecular Probes) behandelt. Diese Behandlung bewirkt, dass das antihumane Biotin an das gebundene sUL18/Fc bindet und das SAPE an das antihumane FcBiotin bindet, wodurch ein fluorescenter Identifizierungsmarker an sUL18/Fc gebunden wird, das seinerseits an Zellen gebunden ist. Die Zellen wurden mittels Durchflußcytometrie mit Fluoreszenzdetektierung auf gebundenes Protein hin analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass UL18 gut an die B-Zelllinien CB23, RAJI und MP-1; an die monocytischen Zelllinien Thp-1 und U937 sowie an primäre B-Zellen und primäre Monoeyten bindet. UL18 bindet nicht nachweisbar an T-Zelllinien und auch nicht an primäre T-Zellen.
Beispiel 3. Isolierung einer P3G2 cDNA und eines Polypeptids
In der Folge wird die Durchsuchung der cDNA von einer der Zelllinien, an die UL18 bindet, und die Isolierung eines neuen Polypeptids beschrieben, das von dieser Zellinie exprimiert wird. Eine CB23 cDNA Bibliothek in dem Säugerexpressionsvektor pDC406 wurde hergestellt, die wie im U.S. Patent Nr. 5,350,683 beschrieben ist, und plasmidische DNA wurde aus Pools isoliert, die aus etwa 2.000 Klonen pro Pool bestanden. Die isolierte DNA wurde in CV1-EBNA Zellen transfiziert (ATCC CRL 10478), wozu DEAE-Dextran verwendet wurde und worauf eine Behandlung mit Chloroquin folgte. Die CV-1 EBNA Zellen wurde in komplettem Medium (Dulbeccos modifiziertes Eagles Medium, enthaltend 10% (v/v) fötales Kälberserum, 50 U/ml Penicillin, 50 U/ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamin) gehalten und wurden auf eine Dichte von etwa 2 × 10⁵ Zellen pro Napf (well) in Slides mit nur einem Napf plattiert (plated). Die Slides waren 30 Minuten lang mit 1 ml einer Lösung von 10 μg/ml humanem Fibronektin in PBS vorbehandelt und darauf einmal mit PBS gewaschen worden. Das Medium wurde von den anhaftenden Zellen befreit, die in einer Schicht wuchsen, und durch 1,5 ml komplettes Medium, das 66,6 μM Chloroquinsulfat enthielt, ersetzt. Etwa 0,2 ml einer DNA Lösung (2 μg DNA, 0,5 mg/ml DEAE-Dextran in komplettern, Chloroquin enthaltendem Medium) wurde den Zellen zugesetzt, und die Mischung wurde für etwa 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Medium entfernt, und die Zellen wurden durch Zusatz von komplettem Medium, das 10% DMSO (Dimethylsulfoxid) enthielt, während 2,5 Minuten geschockt. Nach dem Schocken wurde die Lösung durch frisches komplettes Medium ersetzt. Die Zellen wurden zwei bis drei Tage kultiviert, um die Expression der insertierten DNA Sequenzen zu ermöglichen. Diese Bedingungen führten zu einer 30- bis 80%-igen Transfektionshäufigkeit in den CV1-EBNAZellen, die überlebt hatten.
Jedes Slide wurde mit 1 ml UL18/Fc in einer Konzentration von 1 μg/ml in bindendem Puffer (RPMI 1640, enthaltend 25 mg/ml bovines Serumalbumin, 2 mg/ml Natriumazid, 20 mM Hepes vom pH 7,2 und 50 mg/ml nicht fette Trockenmilch) eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die inkubierten Slides wurden mit bindendem Puffer gewaschen und dann mit Fc spezifischem ²⁵I-Maus antihumanem IgG (siehe Goodwin et al., Cell 73:447-456, 1993) inkubiert. Darauf erfolgte eine zweite Wäsche mi Puffer, worauf die Slides mit einer 2,5% Glutaraldehyd-PBS-Lösung fixiert wurden, mit PBS-Lösung gewaschen und an der Luft trocknen gelassen wurden. Die getrockneten Slides wurden in photographische Emulsion GTNB-2 von Kodak (auf das 6-fache mit Wasser verdünnt) getaucht. Nach dem Trocknen an der Luft wurden die Slides in eine Dunkelkammer platziert und gekühlt. Nach drei Tagen wurden die Slides in einem Entwicklungsapparat Kodak D19 entwickelt, mit Wasser gespült und mit dem Fixierer G433C von Agfa fixiert. Die fixierten Slides wurden individuell unter einem Mikroskop bei 25- bis 40-facher Vergrößerung untersucht. Positive Zellen, die eine Bindung von sUL18/Fc zeigten, wurden durch die Anwesenheit von autoradiographischer Silberfärbung gegenüber dem Hintergrund des Films sichtbar gemacht. Zwei positive Pools wurden identifiziert. Bakterienklone von jedem Pool wurden titriert (titered) und ausplattiert und ergaben Platten, von denen jede etwa 200 Kolonien aufwies. Jede Platte wurde abgekratzt (scraped) und ergab gepoolte plasmidische DNA zur Transfektion in CV-1 EBNA Zellen und zum Durchsuchen, wie zuvor beschrieben. Nach der folgenden Zerstörung (breakdown) der Zellen und dem Durchsuchen wurden zwei positive individuelle Kolonien erhalten. Die cDNA Inserate der beiden positiven Klone waren 2.922 bzw 2.777 Nukleotide lang, was durch automatisierte DNA Sequenzierung bestimmt wurde. Die kodierenden Regionen der beiden Inserate, als P3G2 bzw. 18A3 bezeichnet, umfassten 1.953 Nukleotide (von Nukleotid 310 bis Nukleotid 2.262) bzw. 1.959 Nukleotide (von Nukleotid 168 bis Nukleotid 2.126). Die beiden DNA Klone kodieren für Proteine, die im wesentlichen ähnlich sind und wahrscheinlich verschiedene Allele des selben Gens repräsentieren.
Die cDNA Sequenz und die kodierten Aminosäuren von P3G2 sind in SEQ ID NO: 1 bzw. SEQ ID NO:2 wiedergegeben. Die cDNA Sequenz und die kodierten Aminosäuren von 18A3 sind in SEQ ID NO: 3 bzw. SEQ ID NO: 4 wiedergegeben. Die Aminosäuresequenz von P3G2 (SEQ ID NO: 2) weist eine vorhergesagte Signalsequenz von 16 Aminosäuren (Aminosäuren 1 bis 16) auf; eine extrazelluläre Domäne von 442 Aminosäuren (Aminosäuren 17 bis 458), eine transmembrane Domäne von 25 Aminosäuren (Aminosäuren 459 bis 483); und eine zytoplasmatische Domäne von 167 Aminosäuren (Aminosäuren 484 bis 650). Die extrazelluläre Domäne enthält vier Immunglobulin-artige Domänen. Die IgG-artige Domäne I schließt etwa die Aminosäuren 17 bis 118 ein; die IgG-artige Domäne II umfasst etwa die Aminosäuren 119 bis 220; die IgG-artige Domäne III schließt etwa die Aminosäuren 221 bis 318 ein; und die IgG-artige Domäne IV umfasst etwa die Aminosäuren 319 bis 419. Bemerkenswerterweise enthält die zytoplasmatische Domäne dieses Polypeptids vier ITIM Motive, die alle die Konsensussequenzen YxxL/V aufweisen. Das erste ITIM Motivpaar befindet sich bei den Aminosäuren 533 bis 536 und 562 bis 565, und das zweite Paar ist bei den Aminosäuren 614 bis 617 bzw. 644 bis 647 lokalisiert. Die Aminosäuresequenz von 18A3 ist nahezu identisch mit derjenigen von P3G2 und weist die zuvor beschriebenen Merkmale auf.
Die Eigenschaften dieser kodierten Polypeptide stimmen mit denen eines transmembranen Glykoproteins der Klasse I überein.
Beispiel 4. Herstellung eines P3G2 Fusionsproteins
Im folgenden werden Prozeduren beschrieben, welche angewandt wurden, um ein P3G2 Fusionsprotein herzustellen, welches dann verwendet wurde, um Zelllinien zu identifizieren, an die es bindet, und schließlich einen normalen Zelloberflächen P3G2 Liganden zu isolieren, der von UL18 verschieden ist. Ein Fusionsprotein der extrazellulären Region von P3G2 mit der mutierten humanen Fc Region (sP3G2:Fc) wurde hergestellt, indem zunächst cDNA isoliert wurde, die die für die extrazelluläre Region von P3G2 kodiert, und zwar unter Verwendung von Primern, die die extrazelluläre Region von P3G2 flankieren. Die Primer wurden so konstruiert, dass sie Sal I und Bgl II Restriktionsorte an den 3'- und 5'-Termini aufwiesen, so dass in die mittels PCR amplifizierte cDNA ebenfalls Sal I und Bgl II Restriktionsorte an den 5'- bzw. 3'-Enden eingeführt wurden. Die Primer hatten die folgenden Sequenzen:
Die Bedingungen für die PCR Reaktion waren wie zuvor beschrieben, und als Templat diente das Gen für P3G2 in voller Länge, isoliert wie in Beispiel 3 beschrieben.
Um einen Vektor für die Expression des Fusionsproteins sP3G2:Fc zur Verwendung für Zellbindungsstudien zu konstruieren, wurde die mutierte humane Fc Region von IgG1 von dem zuvor in Beispiel 1 beschriebenen Plasmid abgetrennt, wozu Bgl II und Not I Restriktionsenzyme verwendet wurden. Der Bgl II Ort des sP3G2 Gens wurde verwendet, um die DNA des sP3G2 Gens an dem Bgl II Ort des humanen mutierten Fc Gens mit diesem zu ligieren und so ein sP3G2:Fc DNA Fusionskonstrukt zu schaffen, das einen N-terminalen Sal I Restriktionsort und einen C-terminalen Not I Restriktionsort aufweist. Dieses fusionierte sP3G2 DNA-Konstrukt wurde dann in den Expressionsvektor pDC409 über dessen Sal I und Not I Orte ligiert, wodurch ein 409/sP3G2/Fc DNA Konstrukt entstand.
Die Affenzelllinie COS-1 (ATCC CTL-1650) wurde verwendet, um die Expression des Fusionsproteins zu bestätigen. COS-1 Zellen wurden in 6-Napfplatten (2 × 10⁵ Zellen pro Napf) mit etwa 2 μg/pro Napf des DNA Konstrukts 409/sP3G2/Fc transfiziert. Die Zellen wurden in 5% FBS/DMEM/F2 (erhältlich von GIBCO) kultiviert, und am Tag 2 oder 3 nach der Transfizierung wurden die Zellen 1 Stunde in RPMI ohne Cystein/Methionin hungern gelassen, und die transfizierten Zellen wurden innerhalb von 4 Stunden metabolisch mit 100 μCi/ml ³⁵S-Met/Cys markiert. Der Überstand wurde geklärt (spun clear), um lose Zellen und Abfall zu entfernen, und 150 μl des Überstands wurden mit 100 μl RIPA Puffer und 50 μl 50% Protein A Sepharose in Form von festen Perlen als Trägerstoff bei 4°C für eine Stunde inkubiert. Nachdem der feste Trägerstoff mit RIPA gewaschen worden war, um nicht gebundenes Material zu entfernen, wurde das Fusionsprotein, das an den festen Trägerstoff Protein A Sepharose gebunden war, von der Protein A Sepharose eluiert, und zwar mittels 30 μl SDS PAGE reduzierendem Puffer (reducing sample buffer) und dann 5 Minuten auf 100°C erhitzt. Das Eluat wurde dann einer Elektrophorese an einem 4–20% SDS Polyacrylamidgradientengel mit ¹⁴C-enthaltendem Proteinmolekulargewichtmarker unterzogen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit 8% Essigsäure fixiert und bei Raumtemperatur 20 Minuten lang mit einem Amplifier verstärkt, der bei Amersham verfügbar ist. Nachdem das Gel im Vakuum getrocknet worden war, wurde es einem Röntgenfilm ausgesetzt. Die Analyse des Films bestätigte, dass das erwartete Protein mit einem Molekulargewicht von 120 bis 130 kDa exprimiert worden war.
Nachdem die Expression des Fusionsproteins bestätigt war, wurden Kulturen mit transfizierten Zellen in großem Maßstab angelegt, um Überstand von COS-1 Zellen , die das Fusionsprotein exprimieren, zu akkumulieren, wie in Beispiel 1 beschrieben. Das P3G2/Fc Fusionsprotein wurde nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren gereinigt, wobei das BioCad System und die POROS 20A Säule von PerSeptive Biosystems verwendet wurde. Das gepoolte eluierte Protein wurde unter Verwendung von SDS PAGE mit Silberanfärbung analysiert, wodurch die Expression bestätigt wurde.
Beispiel 5. Erzeugung von LIR-P3G2 Antikörper
Das folgende Beispiel beschreibt die Erzeugung von monoklonalen Antikörpern gegen P3G2, die bei der Durchflußcytometrie Analyse verwendet wurden, um Zellen zu identifizieren, die P3G2 exprimieren. Ein gereinigtes P3G2/Fc Fusionsprotein wurde durch Expression in COS-1 Zellen und Reinigung durch Affintätschromatographie hergestellt, wie in Beispiel 4 beschrieben. Das gereinigte Protein oder Zellen, die mit einem Expressionsvektor transfiziert sind, der für das Protein von voller Länge kodiert, können nach üblichen Methoden, wie sie z.B. im U.S. Patent 4,411,993 beschrieben sind, monoklonale Antikörper gegen P3G2 erzeugen. Kurz gesagt, es wurden BALB-C Mäuse im Alter von 0, 2 und 6 Wochen mit 10 μg P3G2/Fc immunisiert. Die primäre Immunisierung wurde mit TITERMAX Adjuvans von Vaxcell, Inc. durchgeführt, bei den darauf folgenden Immunisierungen wurde mit unvollständigem Freunds Adjuvans (IFA) gearbeitet. Im Alter von 11 Wochen wurde der Effekt durch IV Stimulierung verstärkt, indem die Mäuse 3 bis 4 μg P3G2 in PBS erhielten. Drei Tage nach der IV Stimulierung wurden Splenocyten geerntet und mit einem Ag8.653 Myelom als Fusionspartner fusioniert, wobei eine 50% wässrige Lösung von PEG 1500 verwendet wurde. Die Hybridomaüberstände wurden mittels ELISA durchmustert, wobei mit P3G2 transfizierte COS-1 Zellen in PBS mit 2 × 10³ Zellen pro Napf verwendet und auf Polystyrolmilkrotiterplatten mit 96 Näpfen als Platecoat Antigen getrocknet wurden. Positive Überstände wurden danach durch FACS Analyse und RIP unter Verwendung von mit P3G2 transfizierten COS-1 Zellen bestätigt. Hybridomas wurden kloniert und mit den selben Assays untersucht. Monoklonale Kulturen wurden vermehrt und die Überstände mittels Affmitätschromatographie unter Verwendung von BioRad Protein A Agarose gereinigt.
Die monoklonalen Antikörper gegen P3G2 wurden verwendet, um Zellen und Zelllinien unter Anwendung von üblichen Durchflußcytometrieverfahren zu durchmustern und um Zellen zu identifizieren, auf denen P3G2 exprimiert wird. Die mittels Durchflußcytometrie durchmusterten Zelllinien und Zellen waren CB23, CB39, RAJI, AK778, K299, PS-1, U397, THP-1; JURKAT und HSB2. Bei jeder durchmusterter Zelllinie oder Zellenprobe schloss das Verfahren eine einstündige Inkubation von etwa 100.000 Zellen, die mit 2% FCS (fötalem Kälberserum), 5% normalem Ziegenserum und 5% Kaninchenserum in PBS blockiert waren, mit 5 μg FITC konjugiertem Maus Anti-P3G2 Antikörper ein. Nach der Inkubation wurde der Ansatz 2 mal mit FACS Puffer (2% FCS in PBS) gewaschen. Die Zellen wurden auf etwa gebundenes Protein analysiert unter Verwendung von Durchflußcytometrie mit Fluoreszenzdetektion, um FITC nachzuweisen. Die Ergebnisse zeigten an, dass der Antikörper gegen LIR-P3G2 gut an die B-Zelllinien CB23 und RAJI1; an die monocytischen Zelllinien THP-1 und U937 sowie an primäre B-Zellen und primäre Monozyten bindet. Die stärkste Expression von LIR P3G2 wurde bei Monocyten beobachtet, die hell angefärbt wurde (stained brightly) bei CD16 und weniger hell angefärbt wurden (stained less brightly) bei CD 14 und CD 64. Der Antikörper bindet nicht an T-Zelllinien oder an primäre T-Zellen.
Bei einem verwandten Experiment wurde ein Antikörper gegen P3G2, der hergestellt worden war wie zuvor beschrieben, in Immunfällungsexperimenten verwendet. Für die Immunfällungsanalysen wurden 2,5 × 10⁶ Monocyten auf der Oberfläche biotinyliert, indem die Zellen mit PBS gewaschen und DNA in einem Biotinylierungspuffer, der 10 mM Natriumborat und 150 mM NaCl bei einem pH von 8,8 enthielt, suspendiert wurden, worauf den Zellen 5 μl einer Lösung von 10 mg/ml Biotin-CNHS-Ester (D-Biotinoyl-e-aminocapronsäure-N-hydroxysuc-cinimid-ester, bezogen von Amersham) in DMSO zugesetzt wurde. Nachdem die Reaktion durch Zusatz von 10 μl einer 1 M Lösung von Ammoniumchlorid pro 1 ml Zellen abgeschreckt (quenched) worden war und die Zellen mit PBS gewaschen worden waren, wurden die Zellen in 1 ml 0,5% NP40-PBS lysiert, und das Lysat wurde nach dem Zentrifugieren abgetrennt. Dann wurden 150 μl des Lysats 100 μl 0,5% NP40-PBS zugesetzt, und die entstehende Mischung wurde mit 2 μg/ml Antikörper 16 Stunden bei 4°C inkubiert. Fünfzig Mikroliter einer 50% Protein A-Sepharose Aufschlämmung wurden der Antikörpermischung zugesetzt, und die Aufschlämmung wurde 1 Stunde bei 4°C geschüttelt. Die Ausfschlämmung wurde zentrifugiert, und das erhaltene Pellet wurde sechs mal mit 0,75 ml einer 0,5% NP40 Lösung in PBS gewaschen. Das an die Protein A-Sepharose gebundene Protein wurde mit 30 μl SDS-PAGE reduzierendem Puffer (reducing sample buffer) eluiert und für 5 Minuten auf 100°C erhitzt.
Die eluierten Proteine wurden mittels 4–20% Gradienten SDS-PAGE mit verstärkten Chemolumineszenz (ECL) Proteinmarkern analysiert. Dann wurden die Elektrophoreseproben in einen Western Blot auf Nitrozellulosemembranen transferiert. Die Membranen wurden für eine Stunde mit einem Blockierungsmittel (0,1 Tween-20 und 3% nicht fette Trockenmilch in PBS) bei Raumtemperatur behandelt, und dann wurden sie einmal für 15 Minuten und danach 2 mal für 5 Minuten mit 0,1 % Tween-20 in PBS gewaschen. Die gewaschenen Membranen wurden mit 10 ml 1:100 HRP-Streptavidin für 30 Minuten inkubiert, und dann einmal für 15 Minuten und danach 4 mal für 5 Minuten mit 0,1 % Tween-20 in PBS gewaschen.
Das gebundene Streptavidin HRP wurde mittels ECL Nachweisreagenz, bezogen von Amersham und deren Anweisungen entsprechend verwendet, nachgewiesen. Die entwickelten Membranen wurden einem Röntgenfilm ausgesetzt und danach visuell geprüft. Die Ergebnisse zeigten, dass LIR-P3G2 von CB23 Zellen und von mit P3G2 transfizierten COS-1 Zellen immunopräzipitiert worden war, was beweist, dass P3G2 von diesen Zellen exprimiert worden war.
Beispiel 6. Durchsuchen von Zellen und Zelllinien auf Bindung von P3G2
In der Folge werden Durchflußcytometrieanalysen beschrieben, die verwendet wurden, um Zellen und Zelllinien zu identifizieren, die an P3G2 binden. Die untersuchten Zellen und Zellinien waren CB23, HSB2, MP-1, Jurkat, primäre T-Zellen, primäre B-Zellen und primäre NK Zellen. Bei jeder untersuchten Zelle oder Zelllinie schloss das Verfahren ein dreimaliges Waschen mit FACS Puffer (2% FCS in PBS mit 0,2% Azid) und Inkubieren jedes Ansatzes (10⁵ Zellen) in 100 μl blockierendem Puffer (2% FCS, 5% NGS, 5% Kaninchenserum in PBS) für eine Stunde ein. Bei jeder Zelllinie wurden vier Ansätze bereitet, wobei jedem Ansatz 0, 2, 5 bzw. 10 μg W6/32 (ATCC HB-95) in 100 μl blockierendem Puffer zugesetzt wurden. W6/32 ist ein Antikörper gegen MHC Klasse I schwere Ketten (MHC Class I heavy chains) (ein anti HLA-A, B und C Molekül). Nach der Zugabe der W6/32 Lösung wurden die Ansätze für eine Stunde auf Eis inkubiert und DNA 3 mal mit 200 μl FACS Puffer gewaschen. Dann wurden jedem Ansatz 5 μg P3G2/Fc in blockierendem Puffer zugesetzt, und die Ansätze wurden für eine Stunde auf Eis inkubiert. Das P3G2/Fc konkurriert mit W6/32 um die Bindungsstellen auf den Zellen.
Nach der Inkubation wurden die Zellen 3 mal mit 200 μl FACS Puffer gewaschen und für 45 Minuten mit antihumanem Fc/Biotin der Maus (mouse anti human Fc/biotin) und mit SAPE behandelt. Diese Behandlung bewirkt, dass das antihumane Fc/Biotin an alle an Zellen gebundene Fusionsproteine sP3G2/Fc bindet, und dass SAPE an das antihumane FcBiotin bindet. Da SAPE eine fluoreszierende Verbindung ist, identifiziert ihr Nachweis nach geeigneter Anregung und unter geeigneten Emissionsbedingungen positiv an Zellen gebundenes P3G2/Fc. Schließlich wurden die Zellen 3 mal mit FACS Puffer gewaschen und einer Durchflußcytometrie unterworfen, um Zellen zu identifizieren, die an Protein gebunden sind.
Die Resultate zeigten, dass W6/32 mit P3G2 um die Bindung an alle untersuchten Zellen und Zelllinien konkurrierte. Die Bindung an P3G2 wurde vollständig blockiert durch 5 μg W6/32, was anzeigt, dass W6/32 und P3G2 an die selben oder an überlappende Stellen der schweren Ketten der MHC Klasse I binden.
Beispiel 7. Durchsuchen einer HSB2 cDNA Bibliothek zur Isolierung eines P3G2 bindenden Liganden
Das folgende Beispiel beschreibt die Durchsuchung (oder Durchmusterung) einer cDNA Bibliothek von einer der Zelllinien, nämlich HSB-2, einer lymphoblastischen Leukämiezelllinie, die als an P3G2 bindend befunden wurden, und die Identifizierung eines P3G2 bindenden Liganden. Eine HSB-2 cDNA Bibliothek in dem Säugerexpressionsvektor pDC302 wurde hergestellt, wie allgemein in dem U.S. Patent Nr. 5,516658 und speziell von Kozlosky et al. in Oncogene 10.299 bis 306, 1995, beschrieben wurde. Kurz gesagt wurde cDNA aus HSB-2 Zellen (sorted HSB-2 cells) isoliert, und ein erster cDNA Strang wurde unter Verwendung von 5 μg PolyA⁺ und der reversen Transskriptase AMV RTase von Life Sciences synthetisiert. Der zweite cDNA Strang wurde unter Verwendung von DNA Polymerase I von BRL mit einer Konzentration von 1,5 U/μl synthetisiert. Die cDNA wurde mittels Standardverfahren, wie von Haymerle et al. in Nucl. Acids Res. 14:8615, 1986 beschrieben, in die geeignete Stelle des Vektors pDC302 ligiert.
Zellen des E.coli Stammes DH5a wurden mit der cDNA Bibliothek in pDC302 transformiert. Nach Amplifizierung; der Bibliothek zeigte eine Prüfung des Titers (titer check) an, dass insgesamt 157.200 Klone vorlagen. Die transformierten Zellen wurden auf 15 verschiedene Platten plattiert. Plasmidische DNA wurde aus Pools isoliert, die aus etwa 2000 Klonen pro Pool bestanden. Die isolierte DNA wurde in CV1-EBNA Zellen (ATCC CRL 10478) transfiziert, wozu DEAE-Dextran mit nachfolgender Behandlung mit Chloroquin verwendet wurde. Die CV-1-EBNA Zellen wurden in komplettem Medium ((Dulbeccos modifiziertes Eagles' Medium, enthaltend 10% (v/v) fötales Kälberserum, 50 U/ml Penicillin, 50 U/ml Strptomycin und 2 mM L-Glutamin) gehalten und mit einer Dichte von etwa 2 × 10⁵ Zellen pro Napf in Slides mit einem einzelnen Napf (single-well chamhered slides) plattiert. Die Slides waren 30 Minuten mit 1 ml einer Lösung von 10 μg/ml humanem Fibronectin in PBS vorbehandelt worden, gefolgt von einer einmaligen Waschung mit PBS. Das Medium wurde von den anhaftenden, in einer Schicht wachsenden Zellen entfernt und durch 1,5 ml 66,6 μM Chloroquinsulfat enthaltendes komplettes Medium ersetzt. Etwa 0,2 ml einer DNA Lösung (2 μg DNA und 0,5 mg/ml DEAE-Dextran in komplettem, Chloroquin enthaltendem Medium) wurde den Zellen zugesetzt, und die Mischung wurde für etwa 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Medium entfernt und wurden die Zellen durch Zugabe von komplettem Medium, das 10% DMSO enthielt, für 2,5 Minuten geschockt. Nachdem die Zellen geschockt worden waren, wurde das komplette Medium durch frisches komplettes Medium ersetzt, und die Zellen wurden 3 Tage lang in Kultur wachsen gelassen, um eine transiente Expression der insertierten DNA Sequenzen zu ermöglichen. Diese Bedingungen führten zu einer Transfektionsrate der überlebenden CV-1 EBNA Zellen von 30 bis 80%.
Jedes Slide wurde eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit 1 ml P3G2:Fc bei einer Konzentration von 0,45 μg/ml in bindendem Puffer (RPMI 1640, enthaltend 25 mg/ml bovines Serumalbumin, 2 mg/ml Natriumazid, 20 mM Hepes mit einem pH von 7,2 und 50 mg/ml nicht fette Trockenmilch) 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nachdem die Slides inkubiert worden waren, wurden sie mit bindendem Puffer gewaschen und dann mit Fc-spezifischem ²⁵I-antihumanem IgG der Maus (Fc specific ¹²⁵I-mouse anti human IgG) (siehe Goodwin et al., Cell 73:447 bis 456, 1993) inkubiert. Danach erfolgte eine zweite Wäsche mit Puffer, wonach die Slides mit einer 2,5% Glutaraldehyd/PBS Lösung fixiert, mit PBS gewaschen und an der Luft trocknen gelassen wurden. Die Slides wurden in eine sechsfach mit Wasser verdünnte Photoemulsion GTNB-2 von Kodak getaucht. Nach dem Trocknen an der Luft wurden die Slides in einen dunklen Behälter getan und gekühlt. Nach drei Tagen wurden die Slides in einen Entwickler D19 von Kodak (sechsfach mit Wasser verdünnt) entwickelt, mit Wasser gespült und mit einem Fixierbad GTNB-2 von Agfa fixiert. Die fixierten Slides wurden individuell unter einem Mikroskop bei 25- bis 40-facher Vergrößerung untersucht. Positive Pools, die eine Bindung von sP3G2:Fc zeigten, wurden durch die Anwesenheit von autoradiographischen Silberkörnern vor dem Hintergrund des Films sichtbar gemacht. Zwei positive Pools wurden titriert sowie plattiert und ergaben Platten, von denen jede etwa 200 Kolonien aufwies. Jede Platte wurde abgekratzt und ergab gepoolte plasmidische DNA zur Transfection in CV-1 EBNA Zellen und zum Durchsuchen, wie zuvor beschrieben. Nach nachfolgenden Zerstörungen (breakdowns) und Durchmusterungen wurde eine positive individuelle Kolonie für jeden Pool erhalten. Die insertierte cDNA der positiven Klone wurde als HLA-B44 und HLA-A2 identifiziert, MHC Antigene der Klasse I.
Beispiel 8. Northern Blot Analyse
Da die in Beispiel 4 beschriebenen Experimente zur Entdeckung einer LIR p3G2 Oberflächenexpression auf einer Anzahl von Zelllinien führten, wurden konventionelle Northern Blot Analysen angewandt, um die Expression von LIR-P3G2 sowie von mit LIR-P3G2 verwandten mRNAs in verschiedenen Gewebetypen zu studieren. Die Zelllinien, die für die Northern Blot Analysen ausgewählt wurden, waren RAJI, PBT, PBM, YT, HEP3B, HELA, KB, KG-1, IMTLH, HPT, HFF, THP-1 und U937. In der Folge werden die Norhhern Blot Analysen und ihre Ergebnisse beschrieben.
Die cDNA, welche für die extrazelluläre Region von P3G2 kodiert, wurde unter Verwendung von Primern isoliert, die die extrazelluläre Region von P3G2 flankieren und die folgenden Sequenzen haben
Das PCR Templat hat die volle Länge des P3G2 Gens, wie es gemäß dem obigen Beispiel 3 isoliert wurde. Die Bedingungen für die PCR Reaktion waren wie folgt: Ein Zyklus bei 95°C für 5 Minuten; 30 Zyklen, welche einschlossen 95°C für 45 Sekunden, 64°C für 45 Sekunden, und 72°C für 45 Sekunden; und ein Zyklus bei 72°C für 5 Minuten. Das PCR Produkt wurde in einen PCR II Vektor kloniert, der von Invitrogen bezogen und gemäß den Instruktionen des Lieferanten verwendet wurde. Die isolierte DNA, die für die extrazelluläre Region von P3G2 kodierte, wurde verwendet, um eine Ribosonde herzustellen, wozu das MAXISCRIPT Kit von Ambion gemäß den Instruktionen des Herstellers verwendet wurde.
Northern Blots, welche poly A+ ausgewählte RNA oder die gesamte RNA einer Reihe von humanen Zelllinien enthielten, wurden durch Auftrennung von RNA Proben auf einem 1,1 % Agarose-Formaldehyd Gel hergestellt, wobei man auf Hyobond-N übertrug (blotting on Hyobond-N), wie von dem Hersteller (Amersham Corporation) empfohlen wird, und mit Methylenblau anfärbte (staining), um die RNA Konzentrationen zu beobachten. Die Blots wurden hergestellt unter Verwendung von 1 μg der Poly A+ RNA oder 10 μg der gesamten RNA, und jeder Blot wurde mit 10⁶ cpm/ml RNA extrazellulärer P3G2 Ribosonde, hergestellt wie gerade beschrieben, für 16 Stunden bei 63°C sondiert. Die sondierten Blots wurden mit 2 × SSC bei 63°C für 30 Minuten 2 mal, mit 1 × SSC bei 63°C für 30 Minuten 2 mal und mit 0,1 × SSC bei 63°C für 5 Minuten 2 mal gewaschen.
Die sondierten Blots wurden autoradiographisch entwickelt. Die entwickelten Blots zeigten, dass die RNA von P3G2 mit einer RNA von 3,5 kB hybridisierte, die von RAJI, CB23 und U937 exprimiert wurde; mit einer RNA von etwa 1,5 kb, die von THP-1 exprimiert wurde; und mit verschiedenen RNAs von 1,5 bis 3,5 kb, die von PBM exprimiert wurden. Diese Resultate legen nahe, dass verschiedenen Gene mit extrazellulären Domänen, deren Strukturen denen von P3G2 ähnlich sind, durch periphere Blutmonocyten exprimiert werden können.
Beispiel 9. Durchsuchen einer cDNA Bibliothek von PBMzur Isolierung von LIR Polypeptiden
In der Folge werden die Schritte beschrieben, die unternommen wurden, um eine cDNA Bibliothek von peripheren Blutmonocyten zu durchmustern mit dem Ziel, Polypeptide zu isolieren, die in einer Beziehung zu dem P3G2 Polypeptid stehen, wobei übliche Southern Blot Methoden angewandt wurden. Eine cDNA Bibliothek von peripheren Blutmonocyten wurde im wesentlich so hergestellt, wie in Beispiel 7 beschrieben ist.
DNA von anfänglich 15 Pools von cDNA mit 10.000 Klonen pro Pool wurde mit dem Bgl II Restriktionsenzym verdaut und der Verdau durch zweistündige Elektrophorese mit 100 V auf einem 1 % Agarosegel getrennt. Southern Blots wurden durch Elektroblotting der einer Elektrophorese unterzogenen DNA in 0,55% TBE-Puffer auf Hybond Membranen aufgebracht. Die aufgebrachte DNA (blotted DNA) wurde durch 5-minütige Einwirkung von 0,5 M NaOH in 0,6 M NaCl Lösung denaturiert und wurde DNA in 0,5 M TRIS in 1,5 M NaCl Lösung bei einem pH von 7,8 5 Minuten neutralisiert. Die Membranen wurden für 20 Sekunden in einen STRATALINKER UV Vernetzer platziert, um die aufgebrachte DNA (blotted DNA) mit der Membran zu vernetzen. Die Membran mit der gebundenen DNA wurde für 2 Stunden in eine auf 63°C gehaltene Vorhybridisierungslösung aus 10X Denhart's Solution, 0,05M Tris mit pH 7,5 0,9 M NaCl, 0,1 % Natriumpyrophosphat, 1 % SDS und 200 μg/ml DNA von Lachssperma verbracht. Dann wurde die gebundene DNA mit einer mit ³²P markierten Sonde aus einer DNA sondiert, die für die extrazelluläre Region von LIR-P3G2 einschließlich des Signalpeptids und der Sal I und Bgl II Bindungsstellen kodierte. Die Konzentration der DNA Sonde in der Hybridisierungslösung betrug 10⁶ cpm pro ml der Hybridisierungslösung. Die sondierten Blots wurden 16 Stunden bei 63°C inkubiert und DNA 1 Stunde mit 2 × SSC bei 63°C und einmaligem Wechsel der Lösung; 1 Stunde mit 1 × SSC bei 63°C und einmaligem Wechsel der Lösung; und 45 Minuten mit 0,1 × SSC bei 68°C und einmaligem Wechsel der Lösung gewaschen. Nach dem Trocknen wurden die Blots autoradiographisch entwickelt und etwaige DNA Banden sichtbar gemacht, die mit der DNA Sonde, die für die extrazelluläre Region von P3G2 kodierte, hybridisiert waren.
Die Ergebnisse der autoradiopraphischen Visualisierung zeigte an, dass alle Pools DNA enthielten, die mit der Sonde hybridisierte. Ein Pool, der 7 positive DNA Banden zeigte, wurde ausgewählt und danach in 10 Pools unterteilt, von denen jeder etwa 3.000 Klone umfasste. Eine nachfolgende Behandlung der 10 Pools mit Southern Blot Methoden ergab einen Pool, der 9 positiv hybridisierende DNA Sequenzen zeigte. Einzelne hybridisierende Klone wurden mittels üblicher Techniken der Koloniehybridisierung isoliert.
Duplizierte Bakterienkolonien auf Filtern wurden mit der zuvor beschriebenen, für die extrazelluläre Region von P3G2 kodierenden Sonde mit einer Konzentration von 500.000 cpm/ml 16 Stunden bei 63°C sondiert. Die hybridisierten Filter wurden 30 Minuten mit 2 × SSC bei 63°C; 30 Minuten mit 1 × SSC bei 63°C; und schließlich 15 Minuten mit 0,1 × SSC bei 68°C gewaschen.
Achtundvierzig Klone wurden mittels Autoradiographie als auf den Duplikatfiltern hybridisierend visualisiert, und aus diesen Klonen mit Hilfe üblicher Methoden gewonnene DNA wurde mit Bgl II verdaut. Dann wurden Southern Blots aus dem Verdau erzeugt und diese mit den zuvor beschriebenen P3G2 Sonden sondiert. Sieben klonierte Inserate von verschiedenen Größen wurden identifiziert, welche positiv mit der P3G2 Sonde hybridisierten. Die Nukleotidsequenz jedes dieser Inserate wurde mittels automatisierter Sequenzierungstechnologie ermittelt. Von den 8 verschiedenen klonierten Inseraten war eines in der Sequenz identisch mit der von LIR-P3G2. Die anderen wurden als für Polypeptide der neuen Familie von für LIR Polypeptide kodierender DNA identifiziert. Die Nukleotidsequenzen (cDNA) der isolierten Mitglieder der neuen LIR Familie sind wiedergegeben in SEQ ID NO: 7 (als pm25 bezeichnet); in SEQ ID NO: 9 (als pbm8 bezeichnet); in SEQ ID NO: 11 (als pbm 36-2 bezeichnet; in SEQ ID NO: 13 (als pbm36-4 bezeichnet); in SEW ID NO: 15 (als pbmhh bezeichnet); in SEQ ID NO: 17 (als pbm2 bezeichnet); und in SEQ ID NO: 19 (als pbm17 bezeichnet). Die hierdurch kodierten Aminosäuresequenzen sind wiedergegeben in SEQ ID NO: 8 (als pbm25 bezeichnet); in SEQ ID NO: 10 (als pbm8 bezeichnet); in SEQ ID NO: 12 (als pbm36-2 bezeichnet); in SEQ ID NO: 14 (als pbm36-4 bezeichnet); in SEQ ID NO: 16 (als pbmhh bezeichnet); in SEQ ID NO: 18 (als pbm2 bezeichnet); und in SEQ ID NO: 20 (als pbm17 bezeichnet).
Beispiel 10. Durchmusterung einer humanen dendritischen Zell-cDNA Bibliothek auf Sequenzen von LIR cDNA
In der Folge wird die Isolierung und Identifizierung eines Mitglieds der LIR Familie mittels Durchmusterung einer humanen, von Knochenmark abgeleiteten dendritischen Zell-cDNA Bibliothek in einem λ Zap Vektor mit einem radioaktiv markierten Hh0779 cDNA Fragment beschrieben. Das Hh0779 cDNA Fragment ist ein Inserat von 0,7 kb aus dem Klon Hh0779, der kürzlich aus einer humanen dendritischen Zell-cDNA Bibliothek durch Restriktionsverdau mit den Enzymen PstI und SpeI erhalten wurde. Das Hh0779 Fragment war unter Verwendung eines von Ambion bezogenen DECAprime II DNA Markierungskits mit [a-³²-P]dCTP markiert worden.
Die λ Zap cDNA Bibliothek wurde mit einer Dichte von 20.000 pfu pro Platte plattiert und ergab insgesamt 480.000 Plagues für das anfängliche Durchmustern. Die λ Zap cDNA wurde in duplizierter Form auf Hybond Membranen übertragen (blotted), die von Amersham stammten, und dann 5 Minuten in einer Lösung von 0,5N NaOH und 0,5M NaCl denaturiert. Die Membranen wurden 5 Minuten in einer Lösung von 0,5M Tris (pH 7,8) und 1,5M NaCl neutralisiert und dann 3 Minuten in 2 × SSC gewaschen. Die cDNA wurde mittels eines STRATALINKER UV Vernetzers in der Einstellung „Auto" mit den Hybond Membranen vernetzt.
Die Membranen wurden 2,25 Stunden bei 65°C in einem Hybridisierungspuffer vorhybridisiert, der 10 × Denhardt's, 0,05M Tris (pH 7,5), 0,9M NaCl, 0,1% Natriumpyrophosphat, 1 % SDS und 4 mg/ml in der Hitze denaturierte DNA von Lachssperma enthielt. Nach der Vorhybridisierung wurde die radioaktiv markierte Hh0779 cDNA der hybridisierenden Pufferlösung zugesetzt, bis die Endkonzentration 0,54 × 10⁶ cpm/ml betrug. Nach 24 Stunden Hybridisierung wurden die Membranen 1,5 Stunden bei 65°C in 0,25 × SSC und 0,25% SDS gewaschen. Die Blots wurden dann autoradiographischem Film ausgesetzt, um positive Klone zu visualisieren. Insgesamt 146 positive Klone, die Hybridisierungssignale in beiden Membranen eines Duplikatsatzes zeigten, wurden identifiziert, isoliert und für zukünftige Verwendungen aufbewahrt. Von den 146 Klonen wurden 35 für eine zweite Durchmusterung ausgewählt. Die ausgewählten Klone wurden mit geringer Dichte plattiert, und einzelne Klone wurden nach Hybridisierung mit der Hh0779 Sonde, wobei die zuvor beschriebenen Hybridisierungsbedingungen angewandt wurden, isoliert. Die Plasmide wurden dann aus den λ Zap Klonen isoliert, wobei die von Stratagene erworbenen VCSM13 Helferphagen (helper phages) verwendet wurden. Die plasmidische DNA wurde durch Restriktionsverdauung und PCR analysiert, und die Klone, welche die 24 größten Inserate aufwiesen, wurden ausgewählt und sequenziert. Von den 24 sequenzierten Klonen kodierten 6 für LIR-P3G2, kodierten 3 für LIR-pbm2, kodierten 8 für LIR-pbm36-4 und LIR-pbm36-2, kodierte einer für LIR-pbm8, kodierten 2 für LIR-pbmhh und kodierte einer für eine neue Sequenz, die als LIR-pbmnew bezeichnet wurde. Drei Klone wurden identifiziert, die für Aminosäuresequenzen kodierten, die nicht Mitglieder der LIR Familie sind.
Beispiel 11. Assoziation von LIR-P3G2 und LIR-pbm8 mit Tyrosinphosphatase, SHP-1
In der Folge werden die Tests beschrieben, welche ausgeführt wurden, um zu zeigen, dass LIR-P3G2 und LIR-pbm8 mit SHP-1 assoziieren. Humane Monocyten wurden in RPMI Medium kultiviert, das durch 10% PBS ergänzt war, wurden durch Zentrifugieren konzentriert und schließlich in zwei aliquote Teile unterteilt. Ein aliquoter Teil wurde 5 Minuten mit einer Lösung von 50 mM/ml Natriumpervanadat stimuliert. Der zweite aliquote Teil wurde nicht stimuliert. Nach der Stimulierung wurden die Zellen in beiden aliquoten Teilen sofort in einem RIPA Puffer lysiert, der 1% NP-40, 0,5% Natriumdeoxycholat, 50 mM Tris vom pH 8, 2 mM EDTA, 0,5 mM Natriumorthovanadat, 5 mM Natriumfluorid, 25 mM β-Glycerinphosphat und Proteaseinhibitoren enthielt. Proben mit 24 × 10⁶ Zelläquivalenten wurden 2 Stunden bei 4°C entweder mit 5 μg/ml eines Anti-SHP-1 Antikörpers, der von Transduction Laboratories gekauft wurde, oder mit 5μg/ml einer Isotyp-angepassten Antikörper Kontrolle (isotype-matched antibody control) (anti-Flag-M5 IgG1) inkubiert. Die entstandenen Immunokomplexe wurden durch Inkubieren mit Protein G-Agarose (Boehringer Mannheim) gefällt, gewaschen und in 40 ml eines 2 × SDS-PAGE Probenpuffers (sample buffer) resuspendiert. Zwanzig Mikroliter jedes Immunopräzipitats wurden auf Elektrophoresegele geladen, einer Elektrophorese unter reduzierenden Bedingungen unterzogen und auf Nitrozellulosemembranen transferiert, die von Amersham bezogen wurden. Western Blots wurden mit Anti-LIR-P3G2 monoklonalen Antikörperseren und Anti-LIR-pbm8 monoklonalen Antikörperseren sondiert, und die Immunokomplexe wurden durch verstärkte Chemilumineszenz (NEN) detektiert.
Ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 120 kDa, was LIR-P3G2 entspricht, wurde ohne weiteres in SHP-1 Immunopräzipitaten nachgewiesen, nicht aber in den Immunopräzipitaten, die mit der Anti-Flag-M5 Antikörper Kontrolle generiert wurden. In ähnlicher Weise wurde ein Protein von 90 bis 100 kDa, was LIR-pmb8 entspricht, in SHP-1 Immunopräzipitaten nachgewiesen, nicht aber in den Kontrollimmunopräzipitaten. Weder die LIR-P3G2 Bande, noch die LIR-pbm8 Bande wurden gesehen, wenn die Behandlung mit Pervanadat unterlassen wurde. Dies bestätigt, dass die Tyrosinphosphorylierung von LIR-P3G2 wichtig für die Assoziierung von LIR-P3G2 und SHP-1 und die Phosphorylierung von LIR-pbm8 wichtig für die Assoziierung von LIR-pbm8 und SHP-1 ist.
Um die Inhibierung der durch Fc?R1 vermittelten Tyrosinphosphorylierungen auf die LIR Co-Ligierung (coligation) zu studieren, wurden periphere Blutmonocyten mit oder ohne 10 μg/ml einer F(ab)₂ Version einer Anzahl von Antikörpern (a-LIR-1 + a-LIR-2, aCD11c, aCD14, aCD64, aCD64 + aLIR-1, aCD64 + aLIR-2, aCD64 + aLIR-1 + aLIR-2, aCD64 + aCD11c, aCD64 + aCD14) inkubiert. Darauf folgte eine Vernetzung mit 30 μ/ml polyklonalem F(ab)₂ Anti-Maus der Ziege (goat anti-mouse). Die Zelllysate wurden über Nacht mit Anti-Phosphotyrosin-konjugierter Agarose immunopräzipitiert, einer Elektrophorese unterzogen und auf Nitrozellulosefilter übertragen. Western Blotting wurde durchgeführt unter Verwendung einer Kombination von pY-20 und 4G10 HRP-konjugierter Anti-Phosphotyrosin mAbs. Diese Daten zeigen die spezifische Inhibierung der durch Fc?RI-vermittelten Tyrosinphosphorylierung nach Co-Ligierung von LIR-P3G2 und LIR-pbm8.
Beispiel 12. Herstellung von mit LIR Polypentiden immunoreaktiven Antikörner
In der Folge wird die Herstellung von monoklonalen Antikörpern beschrieben, die mit Mitgliedern der LIR Familie immunoreaktiv sind. Ein gereinigtes LIR Polypeptid wird durch Expression in COS-1 Zellen und Affinitätsreinigung, wie in Beispiel 4 beschrieben, hergestellt. Das gereinigte Protein oder Zellen, die mit einem Expressionsvektor transfiziert sind, der für die volle Länge des Proteins kodiert, kann bzw. können monoklonale Antikörper gegen das LIR Polypeptid erzeugen. Dies kann mittels üblicher Techniken geschehen, z.B. mittels der Verfahren, die im U.S. Patent Nr. 4,411,993 beschrieben sind. Kurz gesagt werden BALB-C Mäuse im Alter von 0,2 und 6 Wochen mit 10 μg des LIR Polypeptids immunisiert. Die erste Immunisierungslösung wird mit TITERMAX Adjuvans hergestellt, und die folgenden Immunisierungslösungen werden mit unvollständigem Freund's Adjuvans (IFA) hergestellt. Im Alter von 11 Wochen werden die Mäuse IV stimuliert (IV boosted) mit 3 bis 4 μg des LIR Polypeptids in PBS. Drei Tage nach der IV Stimulierung werden Splenocyten geerntet und unter Verwendung einer 50 %-igen wässrigen Lösung von PEG mit einem Ag8.653 Myelomfusionspartner fusioniert. Die Überstände der Hybridomas werden mittels ELISA durchmustert, wobei die LIR-transfizierten Zellen in PBS mit 7 × 10³ Zellen pro Napf verwendet werden, und auf Mikrotiterplatten aus Polystyrol mit 96 Näpfen als Platten bedeckendes Antigen (plate coat antigen) getrocknet. Danach werden positive Überstände mittels FACS Analyse und RIP nachgewiesen, wobei LIR transfizierte Zellen benutzt werden. Die Hybridoma werden kloniert und auf die selbe Art und Weise durchmustert. Monoklonale Kulturen werden expandiert, und die Überstände werden durch Affinitätschromatographie gereinigt.
Beispiel 13. Durchflußcytometrische Analyse auf Expres-sion von LIR-P3G2 und LIR-pbm8 auf lymphoiden und myeloiden Zellen
Um die differentielle Expression und die Verteilung von LIR-P3G2 und LIR-pbm8 auf Lymphocytenpopulationen zu vergleichen, wurden frisch isolierte periphere mononukleare Blutzellen (PBMC), in Gegenwart entweder von mit Biotin markiertem Anti-LIR-P3G2 oder von Anti-LIR-pbm8 mAb, mit PE markierten Anti-CD3, Anti-CD19 oder Anti-CD56 mAb versehen (stained). Dann wurden die damit versehen Zellen mit APC markiertem Streptavidin behandelt. Dichteplots, (density plots) die 5 × 10⁴ Ereignisse repräsentierten, wurden auf einem FACScaliber (von Beckton Dickinson) gesammelt. Die Ergebnisse zeigten, dass LIR-P3G2 auf 80% bis 95% der CD19⁺ B-Zellen, auf 5% bis 15% der CD3⁺ T-Zellen und auf 10% bis 30% der CD56⁺ NK Zellen exprimiert wird. Auf den Zellen von den selben 12 Spendern (on the cells examiner from the saure 12 donors) wurde keine Expression von LIR-pbm8 auf CD19⁺ B-Zellen, CD3+ T-Zellen und CD56⁺ NK Zellen gefunden.
Durch eine Gegenstromeluierung wurden Fraktionen erhalten, die einen hohen Prozentsatz von zirkulierenden Monocyten und dendritischen Zellen (DC) aufwiesen. Die Monocyten wurden als zu den phänotypischen Untergruppen CD14⁺CD16^– und CD14⁺CD16⁺ gehörig charakterisiert. Die peripheren Blut DC wurden als Phänotypus CD33⁺CD14^– CD16^– HLA⁺-DR⁺ charakterisiert. Die Monocytenuntergruppen und die DCs wurden mit FITC markiertem Anti-CD14, PE-markiertem Anti-CD3, perCp-markiertem Anti-HLRA-DR und entweder mit Biotin-markiertem Anti-CD16, Anti-LIR-P3G2 oder Anti-LIR-pbm8 versehen (stained). Dann wurden die damit versehenen Zellen mit APC markiertem Streptavidin behandelt. Beide Monocytenuntergruppen exprimieren in ähnlichem Ausmaß LIR-P3G2 und LIR-pbm8, wobei die stärkste Expression von LIR-P3G2 und LIR-pbm8 auf der Untergruppe CD14⁺CD16⁺ beobachtet wurde. Blut DC exprimieren im Vergleich zu Monocyten geringere Mengen an LIR-P3G2 und LIR-pbm8. Die Ergebnisse dieser Experimente zeigen, dass LIR-P3G2 auf Lymphozyten, Monozyten und DC exprimiert wird und LIR-pbm8 auf Monozyten und DC exprimiert wird.
Beispiel 14. Durchmustern von LIR-P3G2 und LIR-pbm8 auf Bindung an HLA Klassel Allele
In der Folge werden durchflußcytometrische Analysen beschrieben, die verwendet werden, um LIR-P3G2 und LIR-pbm8 auf Bindung an HLA Klasse I Allele hin zu durchmustern. Die Zelllinie 721.221, der B-Lymphoblastoide der Klasse I fehlen, nicht transfiziert oder transfiziert mit einer Reihe (panel) von HLA Klasse I Allelen, wurde verwendet (used for staining). Bei den Bindungsstudien wurden LIR-P3G2/Fc und LIR-pbm8/Fc Fusionsproteine verwendet, und beide banden in nachweisbarem Ausmaß an sieben der elf HLA-A, HLA-B und HLA-C Allele, die untersucht wurden. Im allgemeinen binden LIR-P3G2/Fc und LIR-pbm8/Fc mit höherer Affinität an HLA-B Allele als an HLA-A oder HLA-C Allele. W6/32 (ATCC HB 95), ein Antikörper gegen MHC Klasse I schwere Ketten (ein Anti-HLA-A, -B und -C Molekül), inhibiert die Bindung von LIR-P3G2/Fc und von LIR-pbm8/Fc an alle Klasse I Transfektanten. Schließlich korreliert das Bindungsverhalten von LIR-P3G2 und von LIR-pbm8 nicht mit den MHC Klasse I Expressionsgraden. Somit binden LIR-P3G2 und LIR-pmb8 an mehrere HLA-A, -B und -C Allele und erkennen ein ähnlich breites Spektrum von MHC Klasse I Spezifitäten.
Beispiel 15. Isolierung von LIR-9m1, LIR-9m, LIR-9s1, LIR-9s2 und LIR-10
Im Verlauf der Sequenzierung mit hohem Durchsatz einer humanen dendritischen Zell-cDNA Bibliothek wurde bemerkt, dass die Sequenz eines unvollständigen cDNA Klons (Klon ss4894) den Nukleotidsequenzen der LIRs 6a, 6b und 7 verblüffend ähnlich war. Dies legte die Vermutung nahe, dass ss4894 ein Mitglied der LIR Genfamilie war. Um den fehlenden Teil dieses Klons zu erhalten, wurde das Rapid Amplification cDNA Extension System (RACE) verwendet, um eine humane Leukocyten cDNA Bibliothek zu amplifizieren (Chenchik et al., A new method for full-length cDNA cloning by PCR in A Laboratory Guide to RNA: Isolation, Analysis and Synthesis, Herausgeber Kreig, P.A. (Wiley-Liss), Seiten 273 bis 321). In der ersten Runde der Amplifizierung wurde ein Primer verwendet, der dem RACE Adapter an dem 5'-Ende der cDNAs entsprach, sowie ein zweiter Primer, der der Sequenz nahe dem 3'-Ende von ss4894 entsprach. Diese Bemühungen ergaben mehrere Klone, deren Sequenzen in hohem Maße homolog zu derjenigen von ss4898, aber nicht damit identisch waren und sich stromauf (upstream) über ein initiierendes Methionincodon hinaus erstreckten. Diesen Klonen mangelte es jedoch an einigen der Sequenzen am 3'-Ende der kodierenden Region. Mit dem Ziel, die gesamte kodierende Region zu erhalten, wurde eine zweite Runde RACE- Sequenzierung durchgeführt, wobei dieses Mal ein erster Primer aus der Nähe des 5-Endes der ersten RACE Produkte und ein zweiter Primer verwendet wurde, der dem 3'-Adapter entsprach. Dieser Ansatz ergab 5 Klone, die LIR Inserate enthielten, von denen 4 eng miteinander verwandt sind und Varianten des selben Gens zu kodieren scheinen. Diese vier eng verwandten cDNA Sequenzen wurden als LIR-9m1, LIR-9m2, LIR-9s1 und LIR-9s2 bezeichnet (SEQ ID NOS:29, 31, 33 und 35). Der fünfte der bei Verwendung des zweiten Satzes von Primern erhaltenen Klone repräsentierte ein verschiedenes Gen, das als LIR-10 (SEQ ID NO:37) bezeichnet wurde.
Alle vier LIR-9 Klone kodieren für Varianten des selben Proteins, und es wird vermutet, dass sie das Ergebnis einer alternativen Spleißung sind. Die Proteine, für die LIR-9m1 (SEQ ID NO: 30) und LIR-9s1 (SEQ ID NO: 34) kodieren, enthalten ein Inserat von 12 Aminosäuren, das bei LIR-pm2 (SEQ ID NO: 32) und LIR-9s2 (SEQ ID NO: 36) fehlt. Die löslichen Formen des LIR-9 Proteins, d.h. LIR-9s1 und LIR-9s2, unterscheiden sich in der Nähe ihrer Carboxytermini von den Membranformen, d.h. LIR-9m1 und LIR-9m2. Dieser Unterschied geht vermutlich auf verschiedene Exons zurück, die von den löslichen und den Membranformen verwendet werden, um für diese Region des Proteins zu kodieren.
SEQUENZLISTE

Claims

Isoliertes Nukleinsäuremolekül, kodierend für ein LIR-Polypeptid, wobei besagtes LIR-Polypeptid eine Aminosäuresequenz enthält, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus SEQ ID Nr. 30, SEQ ID Nr. 32, SEQ ID Nr. 34 und SEQ ID Nr. 36 besteht.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei das Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz enthält, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus SEQ ID Nr. 29, SEQ ID Nr. 31, SEQ ID Nr. 33 und SEQ ID Nr. 35 besteht.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach den Ansprüchen 1 oder 2, wobei das Nukleinsäuremolekül die Nukleotide 69–968 der SEQ ID Nr. 29, 95–958 der SEQ ID Nr. 31, 115–912 der SEQ ID Nr. 33 oder 73–834 der SEQ ID Nr. 35 enthält.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, kodierend für ein lösliches LIR-Polypeptid, wobei besagtes LIR-Polypeptid eine Aminosäuresequenz enthält, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: der extrazellulären Domäne eines Mitglieds der LIR-Familie, wobei die extrazelluläre Domäne ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: den Aminosäuren x₁₁ bis 262 der SEQ ID Nr. 30, wobei x₁₁ für die Aminosäure 1 oder 35 steht; den Aminosäuren x₁₂ bis 250 der SEQ ID Nr. 32, wobei x₁₂ für die Aminosäure 1 oder 36 steht; den Aminosäuren x₁₃ bis 265 der SEQ ID Nr. 34, wobei x₁₃ für die Aminosäure 1 oder 35 steht; und den Aminosäuren x₁₄ bis 253 der SEQ ID Nr. 36, wobei x₁₄ für die Aminosäure 1 oder 36 steht.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, kodierend für ein lösliches LIR-Polypeptid, das mindestens eine Ig-ähnliche Domäne enthält, wobei besagtes LIR-Polypeptid mindestens 85 Aminosäuren enthält, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus: den Aminosäuren x₁₁ bis 262 der SEQ ID Nr. 30, wobei x₁₁ für die Aminosäure 1 oder 35 steht; den Aminosäuren x₁₂ bis 250 der SEQ ID Nr. 32, wobei x₁₂ für die Aminosäure 1 oder 36 steht; den Aminosäuren x₁₃ bis 265 der SEQ ID Nr. 34, wobei x₁₃ für die Aminosäure 1 oder 35 steht; und den Aminosäuren x₁₄ bis 253 der SEQ ID Nr. 36, wobei x₁₄ für die Aminosäure 1 oder 36 steht.
Nukleinsäuremolekül, kodierend für ein Fusionsprotein, das die Fc-Region von Ig sowie eine Aminosäuresequenz enthält, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: den Aminosäuren x₁₂ bis 262 der SEQ ID Nr. 30, wobei x₁₁ für die Aminosäure 1 oder 35 steht; den Aminosäuren x₁₂ bis 250 der SEQ ID Nr. 32, wobei x₁₂ für die Aminosäure 1 oder 36 steht; den Aminosäuren x₁₃ bis 265 der SEQ ID Nr. 34, wobei x₁₃ für die Aminosäure 1 oder 35 steht; und den Aminosäuren x₁₄ bis 253 der SEQ ID Nr. 36, wobei x₁₄ für die Aminosäure 1 oder 36 steht.
Isoliertes Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1, 4, 5 oder 6 kodiert wird.
Antikörper, der spezifisch an ein Polypeptid nach Anspruch 7 zu binden vermag.
Rekombinanter Expressionsvektor, enthaltend ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1, 4, 5 oder 6.
Verfahren zur Herstellung eines LIR-Polypeptids, bei dem man eine Wirtszelle, die mit einem Vektor nach Anspruch 9 transformiert wurde, unter Bedingungen kultiviert, die die Expression des Polypeptids fördern, und das Polypeptid isoliert.
Zusammensetzung, enthaltend einen physiologisch akzeptablen Trägerstoff und ein Polypeptid nach Anspruch 7.
Wirtszelle, transformiert oder transfiziert mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 9.