ES2254173T3

ES2254173T3 - Familia de inmunoreguladores designados receptores de leucocitos del tipo de la inmunoglobulina (lir).

Info

Publication number: ES2254173T3
Application number: ES00928985T
Authority: ES
Inventors: David J. Cosman; Dirk M. Anderson; Luis Borges
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1999-05-12
Filing date: 2000-05-12
Publication date: 2006-06-16
Anticipated expiration: 2020-05-12
Also published as: EP1199362A2; WO2000068383A3; EP1177292B8; US6384203B1; JP2002543787A; CY1105687T1; EP1177292B1; AU4713700A; EP1772515A1; EP1199362A3; US7875703B2; ATE312917T1; DK1177292T3; US20030027358A1; CA2371193A1; US20030060614A1; DE60024808T2; DE60024808D1; EP1177292A2; WO2000068383A2

Abstract

Una molécula aislada de ácido nucleico que codifica a un polipéptido LIR, en donde dicho polipéptido LIR comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO:30, la SEQ ID NO:32, la SEQ ID NO:34, y la SEQ ID NO:36.

Description

Familia de inmunoreguladores designados receptores de leucocitos del tipo de la inmunoglobulina (LIR).

Antecedentes de la invención

La actividad celular del sistema inmune se controla por medio de una red compleja de interacciones de las superficies celulares y de procesos asociados de señalización. Cuando un receptor de superficie de la célula se activa por medio de su ligando, se envía una señal a la célula, dependiendo de la vía empleada de traducción de la señal, la señal puede ser inhibidora o activadora. Para muchos sistemas receptores la actividad celular está regulada por medio de un balance entre las señales activadoras y las señales inhibidoras. En algunas de estas, se sabe que las señales positivas asociadas con la captación de un receptor de superficie de la célula por su ligando están moduladas en forma reductora o inhibidas por señales negativas enviadas por la captación de un receptor de superficie diferente de la célula por su ligando.

Los mecanismos bioquímicos de estas vías de señalización positivas y negativas han sido estudiados para un cierto número de receptores conocidos del sistema inmune y de interacciones de ligando. Muchos receptores que median la señalización positiva tienen colas citoplasmáticas que contienen sitios de fosforilación de tirosína fosfatasa conocidos como motivos de activación basados en inmunoreceptores de tirosína (ITAM). Una ruta de mecanismo común para la señalización positiva que involucran la activación de tirosín quinasas con sitios dos fosforilados sobre los dominios citoplasmáticos de los receptores y sobre otras moléculas de señalización. Una vez que los receptores están fosforilados, se crean los sitios de enlazamiento para las moléculas de traducción de la señal que inician las rutas de señalización y activan a la célula. Las rutas de inhibición involucran a receptores que tienen motivos inhibidores basados en el inmunoreceptor de tirosína (ITIM) los cuales, al igual que los ITAM, son fosforilados por las tirosín quinasas. Los receptores que tienen estos motivos están involucrados en la señalización inhibidora debido a que estos motivos proporcionan sitios de enlazamiento para las tirosín fosfatasas que bloquean la señalización por medio de la remoción de la tirosína de los receptores activados o de las moléculas para traducción de la señal. Mientras que muchos de los detalles de los mecanismos de activación e inhibición son desconocidos, es claro que el balance funcional en el sistema inmunológico depende de señales activadoras e inhibidoras opuestas.

Un ejemplo de actividad del sistema inmunológico que está regulada por medio de un balance de señales positivas y negativas es la proliferación de células B. El receptor del antígeno de células de B es una inmunoglobulina en la superficie de una célula B que, cuando está enlazada al antígeno, media una señal positiva que conduce a la proliferación de células B. Sin embargo, las células B también expresan Fc\gammaRIIb1, un receptor IgG de baja afinidad. Cuando un antígeno es parte de un complejo inmunológico con inmunoglobulina soluble, el complejo inmunológico puede enlazar células B atrayendo tanto al receptor del antígeno de células B a través del antígeno, como a Fc\gammaRIIb1 a través de la inmunoglobulina soluble. La atracción conjunta de Fc\gammaRIIb1 con el complejo receptor de las células B, modula en forma reductora la señal de activación y previene la proliferación de células B. los receptores Fc\gammaRIIb1 contienen motivos ITIM que se piensa que envían señales de inhibición a las células B a través de la interacción de los ITIM con las tirosín fosfatasas por atracción conjunta con los receptores de las células B.

La actividad citolítica de las células Asesinas Naturales (NK) es otro ejemplo de la actividad del sistema inmunológico que está regulada por un balance entre las señales positivas que inician la función celular, y las señales inhibidoras que previenen la actividad. Los receptores que activan la actividad citotóxica de las NK no se entienden completamente. Sin embargo, si las células objetivo expresan antígenos de superficie MCH clase I para la célula, para las cuales las células NK tienen un receptor específico, las células objetivo se protegen del asesinato parte de las NK. Estos receptores específicos, conocidos como Receptores Inhibidores Asesinos (KIR) envían una señal negativa cuando son atraídos por sus ligandos MHC, regulando en forma reductora la actividad citotóxica de las células NK.

Los KIR pertenecen a la superfamilia de las inmunoglobulinas o a la familia de la lectina tipo C (ver Lanier y colaboradores, Immunology Today 17:86-91, 1996). Los KIR conocidos de las NK humanas son miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas y muestra diferencias y similitudes en sus regiones extracelular, transmembrana y citoplasmática. Una secuencia de aminoácidos de dominio citoplasmático común a muchos de los KIR, es un motivo ITIM que tiene la secuencia YxxL/V. En algunos casos, se ha mostrado que los ITIM fosforilados reclutan tirosín fosfatasas que desfosforilan moléculas en la ruta de la transducción de señales y previenen la activación celular (ver Burshtyn y colaboradores, Immunity 4:77-85, 1996). Los KIR tienen comúnmente dos de estos motivos separados por 26 aminoácidos [YxxL/V(x)_{26}YxxL/V]. Al menos dos receptores de las células NK, cada una específica para un alelo C (una molécula MHC clase I) del antígeno de leucocito humano (HLA), que existe como un receptor inhibidor y como un receptor activador. Estos receptores son altamente homólogos en las porciones extracelulares, pero tienen diferencias importantes en sus porciones transmembrana y citoplasmática. Una de las diferencias es la apariencia del motivo ITIM en el receptor inhibidor y la carencia del motivo ITIM en el receptor activador (ver Biassoni y colaboradores, Journal. Exp. Med, 183:645-650, 1996).

Un inmunoreceptor expresado por mastocitos de ratón, gp49B 1, también miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas, se sabe que regula forma reductora las señales de activación y contiene un par de motivos ITIM. gp49B1 comparte un alto grado de homología con los KIR humanos (Katz y colaboradores, Cell Biology, 93:10809-10814, 1996). Las células NK de ratón también expresan una familia de inmunoreceptores, la familia Ly49, que contienen al motivo ITIM y funciona en forma similar a los KIR humanos. Sin embargo, los inmunoreceptores Ly49 no tienen homología estructural con los KIR humanos y contienen un dominio extracelular de lectina tipo C, haciéndolos miembros de la superfamilia de moléculas de la lectina (ver Lanier y colaboradores, Immunology Today, 17:86-91, 1996).

Claramente, las señales activadoras e inhibidoras del sistema inmunológico mediadas por quinasas y fosfatasas opuestas son muy importantes a mantener el balance en el sistema inmunológico. Los sistemas con una predominancia de las señales activadoras conducirán a autoinmunidad y a inflamación. Los sistemas inmunológicos con una predominancia de señales inhibidoras son menos capaces de desafiar a las células infectadas o a las células cancerosas. El aislamiento de nuevos receptores activadores o inhibidores es altamente deseable para el estudio de la(s) señal(es) biológica(s) transducida(s) a través del receptor. Adicionalmente, la identificación de tales moléculas proporciona un medio para regular y para tratar estados de enfermedad asociados con autoinmunidad, inflamación e infección.

Por ejemplo, puede utilizarse la captación del receptor recientemente descubierto de la superficie de la célula que tienen motivos ITEM con anticuerpo agonístico o ligando para regular en forma reductora una función celular en estados de enfermedad en los cuales el sistema inmunológico está hiperactivo y está presente una inflamación o una inmunopatología excesivas. Por otro lado, utilizando un anticuerpo antagonista específico para el receptor, o una forma soluble del receptor, pueden ser utilizados para bloquear la interacción del receptor de superficie de la célula con él ligando del receptor para activar la función específica inmune en estados de enfermedad asociados con una función inmunológica suprimida. En forma inversa, ya que los receptores que carecen del motivo ITIM envían señales activadoras una vez se ha efectuado la captación descrita anteriormente, el efecto de los anticuerpos y de los receptores solubles es la opuesta aquella recientemente descrita.

Una nueva familia de moléculas inmunoreceptoras de la superfamilia de las inmunoglobulinas, designada como la de los polipéptidos del Receptor Como el de la Inmunoglobulina Leucocítica (LIR) es revelada en WO 98/48107.

Resumen de la invención

La presente invención provee un nuevo miembro familiar de polipéptidos del Receptor Como el de la Inmunoglobulina Leucocítica (LIR). Dentro del alcance de la presente invención se encuentran las secuencias de ADN que codifican al nuevo miembro familiar del LIR y sus secuencias deducidas de aminoácidos reveladas allí. Además, se incluyen en la presente invención se a los puente que los codificados por ADN que se hibridan hasta sondas de oligonucleótidos que tienen secuencias definidas, o al ADN o ARN complementarios de las sondas. La presente invención también incluye a vectores de expresión recombinante que comprenden ADN que codifican al nuevo miembro familiar del LIR. También se encuentran dentro del alcance de la presente invención las secuencias de nucleótidos que, debido a la degeneración del código genético, codifican polipéptidos que son idénticos a los polipéptidos codificados por las secuencias de ácido nucleico descritas anteriormente, y secuencias complementarias de aquellas secuencias del nucleótido.

Además, la presente invención incluye procesos para producir polipéptidos del miembro familiar del LIR, por medio del cultivo de células huésped transformadas con un vector de expresión recombinante que contiene a un miembro familiar del LIR que codifica a la secuencia de ADN bajo condiciones apropiadas para la expresión de un miembro familiar del polipéptido LIR, luego recuperar del cultivo al polipéptido expresado LIR.

La invención también provee anticuerpos agonistas y antagonistas para la proteína familiar del LIR.

Además, aún dentro de la presente invención se encuentran las proteínas de fusión se incluyen una porción soluble del miembro familiar del LIR y la porción Fc de Ig.

Ciertos desórdenes autoinmunes están asociados con la falla de un LIR de señalización negativo para la función de la célula regulada en forma reductora. Tales desórdenes pueden ser tratados por medio de la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo agonista o ligando de uno aún más miembros familiares del LIR a un paciente afligido con un desorden así. Los desórdenes mediados por estados enfermizos asociados con una función inmune suprimida pueden ser tratados por medio de la administración de una forma soluble del LIR de señalización negativo. Recíprocamente, los desórdenes mediados por enfermedades asociadas con la falla del LIR de señalización activador, pueden ser tratados por medio de administración de un anticuerpo agonista del receptor activador. Los desórdenes mediados por los estados asociados con una función autoinmune pueden ser tratados por medio de la administración de una forma soluble del receptor activador.

Descripción detallada de la invención

Se ha utilizado una glicoproteína viral que tienen una secuencia similar a la de los antígenos MHC clase 1 para aislar e identificar a un nuevo polipéptido, designado como LIR-P3G2, y a diferentes miembros de una nueva familia de polipéptidos de la superficie de la célula que han sido designados como la familia de polipéptidos LIR. La presente invención abarca moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican a los polipéptidos LIR, y además abarca los polipéptidos aislados LIR. Ejemplos de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos LIR de acuerdo con la presente invención incluyen a aquellas secuencias de nucleótidos mostrada en las SEQ ID NOS: 29, 31, 33 y 35, y se muestran ejemplos de secuencias de polipéptidos en las SEQ 30, 32, 34 y 36.

Los miembros familiares de polipéptidos LIR poseen regiones extracelulares que tienen dominios como los de la inmunoglobulina, colocando a los miembros en una nueva subfamilia de la superfamilia de la inmunoglobulina. Mientras que los miembros familiares del LIR se caracterizan por tener porciones extracelulares similares, la familia incluye tres grupos de polipéptidos que se distinguen por sus regiones transmembrana y sus regiones citoplasmáticas. Un grupo de los polipéptidos LIR tiene una región transmembrana que incluye un residuo posiblemente cargado y una cola citoplasmática corta, y un segundo grupo tienen una región transmembrana y una cola citoplasmática larga. Un tercer grupo incluye polipéptidos expresados como proteínas solubles que no tienen región transmembrana o cola citoplasmática. Una de las proteínas LIR tienen características de ambos grupos uno y dos, y puede representar un cuarto grupo. Un cierto número de reportes recientes han descrito moléculas de ácido nucleico que tienen secuencias relacionadas con la familia de proteínas LIR (Hillier y colaboradores, GenBank Accession Number N95687, April 9, 1996; Colonna, M., GenBank Accession Nos. AF041261 y AFo41262, Enero 7, 1999; Lamerdin y colaboradores, GenBank Accession No. AC006293, Enero 6, 1999; Steffans y colaboradores, GenBank Accession Nos. AH007466 y AH007465, Marzo 4, 1999; Cosman y colaboradores, Immunity 7:273-282 (1997); Borges y colaboradores, J. Imunol. 159:5192-96 (1997); Samaridis y Colonna, Eur. J. Immunol 27:660-665 (1997); Colonna y colaboradores, J. Exp. Med. 186:1809-1818 (1997); Wagtmann y colaboradores, Curr. Biol. 7:615-618 (1997); Rojo y colaboradores, J. Immunol. 158:9-12 (1997); Arm y colaboradores, J. Immunol. 159:2342-2349 (1997); Cella y colaboradores, J. Exp. Med. 185:1743-51 (1997); Torkar y colaboradores, Eur. J. Immunol. 28:3959-67 (1998); Yamashita y colaboradores, J. Biochem. 123:358-68 (1998); WO 98/31806; WO 98/24906; WO 98/09638).

Los polipéptidos LIR abarcados por el objeto de la invención que contienen al menos un dominio como el de Ig en la región extracelular de la proteína, contienen preferiblemente o bien dos o cuatro dominios como los de Ig en la región extracelular. Algunos polipéptidos LIR pueden contener más de cuatro dominios como los de Ig. Un dominio como el de Ig es una unidad estructural que ha sido identificada en una gran variedad de proteínas celulares. Los dominios como los de Ig contienen una pliegue común que forma un sándwich de dos láminas \beta que se estabiliza por medio de un enlace disulfuro característico dentro de la cadena. Los dominios como los de Ig se reconocen fácilmente por medio de la referencia a un gran cuerpo de conocimiento relacionado con esta entidad estructural (Williams y Barclay, Ann. Rev. Immunol. 6:381-405 (1988)). Típicamente, los dominios como los de Ig contienen aproximadamente 100 aminoácidos, aunque el número aminoácidos puede variar, por ejemplo, desde aproximadamente 85 hasta 105 aminoácidos. Las moléculas que exhiben dominios como los de Ig generalmente juegan un papel de reconocimiento en la superficie de la célula, a menudo mediante interacciones célula-célula en una variedad de sistemas
biológicos.

LIR-P3G2 (SEQ ID NO:2) se expresa por medio de una variedad de células y reconoce moléculas HLA-44, moléculas MHC HLA-A2 y a los anhelos descritos en el Ejemplo 14. Otro miembro familiar del LIR, designado como LIR-pbm8 (SEQ ID NO.9) se expresa por medio de una variedad de células y también reconoce a un número de moléculas MHC clase I. Por analogía con moléculas conocidas, los miembros LIR-P3G2, LIR-pbm8 y LIR tienen un papel el reconocimiento inmunológico y en la discriminación propia/no propia.

Los Ejemplos 1-3 más adelante describen el aislamiento de ADNc que codifican a P3G2 (LIR-P3G2) y a un polipéptido sustancialmente idéntico designado como 18A3 (LIR-18A3). En resumen, el miembro familiar del LIR-P3G2 se aisló expresando primero a UL18, una molécula como la de MCH Clase I y utilizando a UL18 para aislar e identificar a P3G2 y a 18A3, que están cercanamente relacionadas y probablemente son variaciones del mismo gen, que se designa como "LIR-1". Las secuencias de nucleótidos del ADNc de P3G2 aislado y del ADNc de 18A3 están presentes en la SEQ ID NO:1 y en la SEQ ID NO:3, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos codificadas por el ADNc presente en la SEQ ID NO:1 y en la SEQ ID NO:3 están presentes en las SEQ ID NO:2 y en la SEQ ID NO:4, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de P3G2 (SEQ ID NO:2) tiene un dominio extracelular predicho de 458 aminoácidos (1-458) que incluye a un polipéptido señal de 16 aminoácidos (1-16 aminoácidos); un dominio transmembrana de 25 aminoácidos (459-483 aminoácidos) y, un dominio citoplasmático de 167 aminoácidos (484-650 aminoácidos). El dominio extracelular incluye cuatro dominios como los de la inmunoglobulina. Un dominio I como el de Ig incluye aproximadamente 17-118 aminoácidos; un dominio II como el de Ig incluye aproximadamente 119-220 aminoácidos; un dominio III como el de Ig incluye aproximadamente 221-318 aminoácidos; y un dominio IV como el de Ig incluye aproximadamente 319-419 aminoácidos. Significativamente, el dominio citoplasmático de este polipéptido incluye cuatro motivos ITIM, cada uno con la secuencia de consenso de YxxL/V. El primer motivo para ITIM se encuentra en los aminoácidos 533-536 y 562-565, y el segundo par se encuentra en los aminoácidos 614-617 y 644-647. Esta característica es idéntica a los motivos ITIM encontrados en los KIR excepto porque los KIR contienen solamente un par de motivos ITIM.

La secuencia de aminoácidos de 18A3 (SEQ ID NO:4) tiene una región extracelular predicha de 459 aminoácidos (1-459) que incluye un péptido señal de 16 aminoácidos (1-16 aminoácidos); un dominio transmembrana de 25 aminoácidos (460-484 aminoácidos) y un dominio citoplasmático de 168 aminoácidos (485-652). La secuencia de aminoácidos de 18A3 (SEQ ID NO:4) es sustancialmente idéntica a aquella de P3G2 (SEQ ID NO:2) excepto porque 18A3 tiene dos aminoácidos adicionales (en los aminoácidos 438 y 552) y 18A3 posee un residuo de isoleucina en el aminoácido 142 en contraste con un residuo de treonina para P3G2. Adicionalmente, 18A3 tiene un residuo de serina en el aminoácido 155 y P3G2 tiene una isoleucina en 155. Finalmente, el polipéptido 18A3 tiene un ácido glutámico en el aminoácido 627 y P3G2 tiene una lisina en 625 que se alinea con el residuo 627 del polipéptido 18A3. Los cuatro motivos ITIM en el dominio citoplasmático de 18A3 están en los aminoácidos 534-537 y 564-567 y 616-619 y 646-649. Los sitios de glicosilación se presentan en el triplete aminoácido Asn-X-Y, en donde X es cualquier aminoácido excepto Pro y Y es Ser o Thr. Así, los sitios potenciales de glicosilación sobre LIR-P3G2 se presentan en los aminoácidos 140-142; 281-283; 302-304; y 341-343. Los sitios sobre LIR-18A3 están en 281-283; 302-304; y 341-343. Los rasgos de estos polipéptidos codificados son consistentes con las glicoproteínas transmembrana del tipo I.

Los Ejemplos 8-10 describen el aislamiento y la identificación de ocho miembros adicionales familiares de polipéptidos LIR probando las genotecas de ADNc para plásmidos que hibridan a una sonda obtenida a partir de ADN que codifican a la región extracelular de LIR-P3G2. Las secuencias de nucleótidos (ADNc) de los miembros aislados familiares del LIR se presentan en la SEQ ID NO:7 (designada como pbm25, o LIR-4), SEQ ID NO:9 (designada como pbm8, o LIR-2), SEQ ID NO:11 (designada como pbm36-2, o LIR-6b), SEQ ID NO:13 (designada como pbm36-4, o LIR-6a), SEQ ID NO:15 (designada como pbmhh, o LIR-7), SEQ ID NO:17 (designada como pbm2, o LIR-5), SEQ ID NO:19 (designada como pbm17, o LIR-3) y Andrés SEQ ID NO:21 (designada como pbmnew, o LIR-8). Las secuencias de aminoácidos codificadas allí se presentan en las SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20 y SEQ ID NO:22, respectivamente.

El Ejemplo 15 describe el aislamiento de LIR-9m1 (SEQ ID NOS:29, 30), LIR-9m2 (SEQ ID NOS:31, 32), LIR-9s1 (SEQ ID NOS:33, 34), y LIR-9s2 (SEQ ID NOS:35, 36), que son cuatro variaciones empalmadas alternativamente de LIR-9, un nuevo miembro familiar del LIR. La primera etapa para la identificación de este grupo LIR-9 de clones fue el aislamiento de un clon de ADNc corto que se obtuvo a partir de una genoteca de células dendríticas humanas cuyo análisis de secuencia indicó que había significativa homología con la familia LIR, particularmente con las secuencias mostradas en SIQ ID NOS:11, 13 y 15. Utilizando cebadores PCR con base en este clon, esfuerzos adicionales de clonación cuatro ADNc de longitud completa correspondientes a LIR-9m1, -9m2, -9s1 y -9s2. LIR-9m1 y LIR-9m2 son proteínas transmembrana que difieren en 12 aminoácidos que se encuentran en la región extracelular de LIR-9m1, pero que están ausentes en LIR-9m2. Estos 12 aminoácidos corresponden a los aminoácidos 29-40 de SEQ ID NO:30. Los LIR-9s1 y -9s2 no contienen un dominio transmembrana, que codifiquen así a las versiones solubles de LIR-9. El polipéptido LIR-9s1 (SEQ ID NO:34) incluye el inserto de 12 aminoácidos que está presente en LIR-9m1. Los aminoácidos 1-238 de LIR-9s1 (SEQ ID NO:34) y LIR-9m1 (SEQ ID NO:30) son idénticos, pero el residuo de la secuencia de LIR-9s1 no es idéntico a la región correspondiente de LIR-9m1. Los aminoácidos 1-226 de LIR-9s2 (SEQ ID NO:36) son idénticos a los primeros 226 aminoácidos de LIR-9m2 (SEQ ID NO:32), pero la secuencia restante de aminoácidos de LIR-9s2 diverge de aquella de LIR-9m2.

Los mismos cebadores PCR que fueron utilizados para aislar a los clones LIR-9 produjeron un ADNc clonado adicional de LIR que ha sido designado como LIR-10 (SEQ ID NOS:37 y 38). Comparando la secuencia de nucleótidos de LIR-10 con los LIR más cercanamente relacionados que fueron previamente identificados, esto es, con SEQ ID NOS:13 y 15, se ha determinado que el ADNc de LIR-10 es un clon incompleto que carece de las secuencias localizadas en el extremo 5' del ARNm correspondiente, incluye a la región 5' no traducida, y a los nucleótidos que codifican a los primeros 26 aminoácidos de la proteína LIR-10.

Las regiones extracelular, transmembrana y citoplasmática identificadas para los polipéptidos de los miembros familiares del LIR mostradas en las SEQ ID NOS:10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 30, 32, 34, 36 y 38 se presentan más adelante. Los polipéptidos presentados en las SEQ ID NOS:8, 34 y 36 son proteínas solubles que no tienen regiones transmembrana o citoplasmáticas. Como lo comprenderán aquellas personas entrenadas en la materia, las regiones transmembrana de P3G2 y de 18A3 descritas más arriba, y aquellas de los miembros familiares del polipéptido LIR que se presentan más adelante, se identifican de acuerdo a criterios convencionales para la identificación de dominios hidrófobos asociados con tales regiones. Por lo tanto, los límites precisos de cualquier región transmembrana seleccionada pueden variar de aquellos presentados aquí. Típicamente, los dominios transmembrana no varían en más de cinco aminoácidos en cualquier extremo del dominio como se describe aquí. Los programas de computador conocidos en el estado de la técnica y que son útiles para identificar a tales regiones hidrófobas en las proteínas se encuentran disponibles.

El polipéptido presente en SEQ ID NO:8 (LIR-pbm25) tienen un dominio extracelular que incluye la secuencia completa de aminoácidos de los aminoácidos 1-439 y un péptido señal de los aminoácidos 1-16. La secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO:10 (LIR-pbm8) tiene una región extracelular predicha de 458 aminoácidos (1-458) que incluye un péptido señal de 16 aminoácidos (1-16 aminoácidos); un dominio transmembrana que incluye 459-483 aminoácidos; y un dominio citoplasmático que incluye 484-598 aminoácidos. El dominio extracelular incluye cuatro dominios como los de la inmunoglobulina y el dominio citoplasmático incluye un motivo ITIM en los aminoácidos 533-536 y 562-565.

La secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO:12 (LIR-pbm36-2) tiene un dominio extracelular predicho de aminoácidos que incluye un péptido señal de 16 aminoácidos, de los aminoácidos 1-16; un dominio transmembrana que incluye 262-280 aminoácidos y un dominio citoplasmático en los aminoácidos 281-289. El dominio transmembrana incluye un residuo cargado de arginina en 264 y un dominio citoplasmático es corto, con una longitud de solo 9 aminoácidos.

La secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO:12 (LIR-pbm36-2) tiene un dominio extracelular predicho de aminoácidos que incluye un pequeño señal de 16 aminoácidos desde los aminoácidos 1-16; un dominio transmembrana que incluye 262-280 aminoácidos y un dominio citoplasmático en los aminoácidos 281-289. El dominio transmembrana incluye un residuo de arginina cargado en 264 y un dominio citoplasmático es corto, teniendo solamente una longitud de 9 aminoácidos.

La secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO:14 (LIR-pbm36-4) tiene un dominio extracelular predicho de 1-461 aminoácidos que incluye un péptido señal de 1-16 aminoácidos; un dominio transmembrana que incluye 462-480 aminoácidos y posee un residuo cargado de arginina en el aminoácido 464; y un dominio citoplasmático que incluye 481-489 aminoácidos. La SEQ ID NO:14 es casi idéntica a aquella de SEQ ID NO:12 excepto porque posee cuatro dominios de inmunoglobulina en contraste con los dos dominios encontrados en la región extracelular de SEQ ID NO:12. Las secuencias de aminoácidos presentadas en SEQ ID NO:12 y SEQ ID NO:14 son principalmente proteínas codificadas por transcripciones empalmadas alternativamente a partir el mismo gen.

La secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO:16 (LIR-pbmhh) tiene un dominio extracelular predicho que incluye a los aminoácidos 1-449 y un péptido señal desde los aminoácidos 1-16; un dominio transmembrana que incluye a los aminoácidos 450-468 con un residuo cargado de arginina en el aminoácido 452; y un dominio citoplasmático que incluye a los aminoácidos 469-483. El dominio citoplasmático es corto con una longitud de 15 aminoácidos. El dominio extracelular incluye cuatro dominios como los de la inmunoglobulina.

La secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO:18 (LIR-pbm2) tiene una región extracelular predicha que incluye a los aminoácidos 1-259 y un péptido señal de los aminoácidos 1-16; un dominio transmembrana que incluye a los aminoácidos 260-280; y un dominio citoplasmático que incluye a los aminoácidos 281-448. Este miembro familiar del LIR tiene un dominio citoplasmático que incluye un motivo ITIM en los aminoácidos 412-415 y 442-445. El dominio extracelular incluye dos dominios como los de la inmunoglobulina.

La secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO:20 (LIR-pbm17) tiene un dominio extracelular predicho de los aminoácidos 1-443 que incluye un péptido señal de los aminoácidos 1-16; un dominio transmembrana que incluye a los aminoácidos 444-464; y un dominio citoplasmático de los aminoácidos 465-631. El dominio extracelular tiene cuatro dominios como los de la inmunoglobina. La SEQ ID NO:20 tiene dos pares de motivos ITIM YxxL/V en el dominio citoplasmático. Un primer par está en los aminoácidos 514-517 y 543-546, y un segundo par está en los aminoácidos 595-598 y 625-628.

La secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO:22 (LIR-pbmnew) tiene un dominio extracelular predicho de los aminoácidos 1-456 que incluye un péptido señal de los aminoácidos 1-16; un dominio transmembrana que incluye a los aminoácidos 457-579; y un dominio citoplasmático de los aminoácidos 580-590. El dominio extracelular incluye cuatro dominios como los de la inmunoglobina. La SEQ ID NO:22 tiene un motivo ITIM en los aminoácidos 554-557 y 584-587.

La proteína LIR-9ml tiene un dominio extracelular localizado en los aminoácidos 1-262 de la SEQ ID NO: 30, que incluye un pequeño señal en los aminoácidos 1-34 de la SEQ ID NO: 30. Los aminoácidos 263-284 de la SEQ ID NO: 30 definen la región transmembrana de LIR-9ml, y los aminoácidos 285-299 de la SEQ ID NO: 30 forman la región citoplasmática. Para LIR-9m2, la región extracelular corresponde a los aminoácidos 1-250 de la SEQ ID NO: 32, que incluye una secuencia señal en los aminoácidos 1-35 de la SEQ ID NO: 32, una región transmembrana en los residuos 251-272 de la SEQ ID NO: 32, y una región citoplasmática en los aminoácidos 273-287 de la SEQ ID NO: 32. LIR-9s1 (SEQ ID NO: 34) y LIR-9s2 (SEQ ID NO: 36) consisten, respectivamente, de 265 y 253 aminoácidos, con sus secuencia de señal que se encuentran en los aminoácidos 1-34 de la SEQ ID NO: 34, y los aminoácidos 1-35 de la SEQ ID NO: 36.

Para LIR-10, los aminoácidos 1-393 de la SEQ ID NO: 38 corresponden a la mayor parte de la porción extracelular de la proteína LIR-10, aunque las secuencias de codificación para aproximadamente 26 aminoácidos en el amino terminal de esta proteína, que incluye al péptido señal, se cree que está perdido desde el clon ADNc de LIR-10 que se describe aquí. La región transmembrana de LIR-10 está definida por los aminoácidos 394-417 de la SEQ ID NO: 38, y la región intracelular por los aminoácidos 418-449. Un motivo único ITIM se localiza en los aminoácidos 438-443 de la SEQ ID NO: 38.

Las secuencias de aminoácidos presentadas en las SEQ ID NOS: 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 30, 32, 34, 36 y 38 revelan que la familia LIR, con la excepción de LIR-10, pueden categorizarse en tres grupos de polipéptidos. Un grupo incluye a los polipéptidos de las SEQ ID NOS: 12, 16, 30 y 32, que se distinguen por un residuo cargado de arginina en sus regiones transmembrana y en sus regiones citoplasmáticas cortas. Un segundo grupo incluye a las SEQ ID NOS: 2, 4, 10, 18, 20 y 22 que se distinguen por sus dominios citoplasmáticos hidrófobos y la presencia de uno o más motivos ITIM en sus regiones citoplasmáticas. Un tercer grupo incluye a los polipéptidos de las SEQ ID NOS: 8, 34 y 36, que se expresan como polipéptidos solubles y no tienen regiones transmembrana o citoplasmáticas. Estos polipéptidos solubles pueden actuar para bloquear las interacciones de los miembros familiares de la superficie celular con sus receptores. Alternativamente, los polipéptidos solubles pueden actuar como una señal activadora cuando se enlazan al receptor. Como los miembros del grupo uno, LIR-10 tiene un dominio citoplasmático relativamente corto y un residuo cargado en su dominio transmembrana, aunque su residuo cargado es histidina en vez de arginina. Sin embargo, LIR-10 también tiene un motivo ITIM en su dominio citoplasmático, como las membranas del grupo dos. Así, LIR-10 tiene algunas de las características de ambos grupos de ambos grupos uno y dos, y pueden representar un cuarto grupo de proteínas LIR. Los polipéptidos LIR se caracterizan generalmente por la capacidad de su ADN de codificación para hibridar al ADN que codifica a la región extracelular de
P3G2.

Debe entenderse que la invención abarca a moléculas aisladas de ácido nucleico que codifican a los polipéptidos LIR que tienen las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NOS: 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 29, 31, 33, 35 y 37.

Las regiones extracelulares de las proteínas miembro familiares del LIR presentadas en las SEQ ID NOS: 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 30, 32, 34, 36 y 38 tienen un alto grado de homología, que varía entre el 59-84%. Varios de los LIR aislados están estrechamente relacionados, por lo cual deben representar variaciones alélicas o variaciones de empalme. Por ejemplo, las regiones extracelulares de la SEQ ID NO: 12 y la SEQ ID NO: 14 comparten homología de secuencia es cercana al 100%, indicando así que éstos polipéptidos se derivan del mismo gen. Además, las SEQ ID NOS: 2 y 4 comparten homología de secuencia está por encima del 95%, representando por lo tanto probablemente a dos alelos del mismo gen. Además, como se discutió antes, las regiones extracelulares de las SEQ ID NOS: 30, 32, 34 y 36 son casi idénticas, indicando así que estas cuatro proteínas se derivan de los ARNm que son variaciones de empalme.

Mientras comparten algunas similitudes estructurales con otros miembros de la superfamilia de la inmunoglobulina, los miembros familiares del LIR tienen homología limitada por otros miembros de la superfamilia de la inmunoglobulina. Las moléculas que tienen la similitud estructural más cercana por los LIR son los KIR humanos y gp49 de ratón. Sin embargo, las regiones extracelulares de LIR comparten solamente un 38-42% de identidad con las regiones extracelulares de NKAT3 y P58 Cl-39, repetidamente. Las regiones extracelulares de los miembros familiares del LIR tienen solamente una homología de 35-47% con aquella del ratón gp49. En contraste, los KIR en general se sabe que comparten al menos 80% de identidad de los aminoácidos, con NKAT3 y p58 CL-39 siendo un 81% homólogos. Adicionalmente, ninguna de las moléculas KIR conocidas tiene cuatro dominios extracelulares de inmunoglobulina que son característicos para todas menos para dos de los miembros conocidos familiares del LIR. En vista de la alta homología de secuencia entre los polipéptidos relacionados con LIR revelados aquí y su relativa baja homología con los KIR, los péptidos LIR son miembros de una nueva familia de inmunoreguladores.

Un análisis de las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos LIR revela que tramos específicos de aminoácidos de los polipéptidos LIR están altamente conservados. Una región conservada es una secuencia de 46 aminoácidos encontrada en los aminoácidos 5-50 de la SEQ ID NO:2. Una búsqueda en base de datos determinó que los miembros familiares del LIR difieren sustancialmente de la mayoría de polipéptidos estructuralmente similares del estado de la técnica en esta región conservada de LIR. La búsqueda en base de datos y el análisis estructural se realizaron utilizando BLAST NB1, una herramienta de búsqueda de alineamiento local para las bases de datos de búsqueda y alineamiento de las secuencias de aminoácidos para determinar identidades y variaciones en una secuencia dada. Se puede acceder al software BLAST NB1 por Internet en http://www3.ncb1.n1m-nih.gov/entrez/blast. La búsqueda en BLAST NB1 de las secuencias que tienen homología con la secuencia aminoácidos 5 a 50 de la SEQ ID NO:2 y encontró la mayoría de las proteínas estructuralmente similares son Fc\gamma11R, gp49B forma 2, y gp49B forma 1 tienen identidad con los aminoácidos 5 a 50 de la SEQ ID NO:2 del 63%, 67%, y 67%, respectivamente. Esto contrasta con la identidad familiar del LIR con los aminoácidos 5 a 50 de la SEQ ID NO:2 que se encuentran el rango entre 71% y 100%. Específicamente, los miembros familiares del LIR descritos aquí contienen regiones conservadas cerca de sus aminoácidos terminales que tienen las siguientes identidades con los aminoácidos 5-50 de las SEQ ID NO:2: SEQ ID NO:8 tiene una identidad de 96%; SEQ ID NO:10 tiene una identidad del 90%; SEQ ID NO:12 tiene una identidad de 96%; SEQ ID NO:14 tiene una identidad del 91%; SEQ ID NO:16 tiene una identidad de 97%; SEQ ID NO:18 tiene una identidad del 77%; SEQ ID NO:20 tiene una identidad de 80%; SEQ ID NO:22 tiene una identidad del 80%; SEQ ID NO:30 tiene una identidad de 78%; SEQ ID NO:32 tiene una identidad del 71%; SEQ ID NO:34 tiene una identidad de 78%; SEQ ID NO:36 tiene una identidad del 71%. Esta región conservada parece estar presente también en LIR-10 (SEQ ID NO:38), pero está incompleta debido a que el clon de ADNc de LIR-10 revelado aquí está truncado en su extremo 5'.

La identidad de secuencia como se la utiliza aquí es el número de aminoácidos alineados que son idénticos, dividido por el número total de aminoácidos en la más corta de las dos secuencias que están siendo comparadas. Un gran número de programas de computador se encuentran disponibles comercialmente para alinear secuencias y determinar identidades de secuencia y variaciones. Estos programas proporcionan información sobre identidad con base en la definición de identidad establecida más arriba. Un programa adecuado de computador es el programa GAP, versión 6,0, descrito por Devereux y colaboradores (Nucl. Acids Res. 12:387, 1984) y disponible con la University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). El programa GAP utiliza el método de alineación de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), revisado por Smith y Waterman (Adv. Appl. Math 2:482, 1981). Los parámetros preferidos por defecto para el programa GAP incluyen: (1) una matriz de comparación unaria (que contiene un valor de 1 para las identidades y de 0 para las no identidades) para los nucleótidos o aminoácidos, y la matriz de comparación ponderada de Gribskov y Burgués, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986, como lo describen Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, págs. 353-358, 1979; (2) una penalización de 3, 0 por cada vacío y una penalización adicional de 0,10 por cada símbolo en cada vacío; y (3) ninguna penalización por vacíos en los extremos. Otro programa similar, también disponible con la University of Wisconsin como parte del paquete de computador GCG para manipulaciones secuencias es el programa
BESTFIT.

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En otro aspecto, los criterios del presente intención tienen regiones conservadas que se caracteriza únicamente por tener la secuencia aminoácidos (SEQ ID NO:28):

1

donde Xaan es Gly o Arg; Xaab es Leu o Val; Xaac es Gly o Asp; Xaad es His Arg o Cys; Xaae es Val o Met; Xaaf es Ala o Thr; Xaag es His Pro o Thr; Xaah Leu Ile o Phe; Xaai es Gly Asp o Ala; Xaaj es Thr Ile Ser o Ala; Xaak es Gly o Val; Xaam es Met o Ala; y Xaa70 es una secuencia de 70 aminoácidos.

Como se mencionó antes, ciertos miembros familiares del LIR tienen motivos ITIM (YxxL/V_{25-26}YxxL/V) en sus dominios citoplasmáticos. Se sabe que muchos receptores para regulación inmunológica tales como los KIR, CD22, FC\gammaR11b1 tienen también los ITIM en sus dominios citoplasmáticos y funcionan para enviar señales de inhibición que regulan en forma reductora o inhiben la función celular. Se ha mostrado que estos receptores se asocian con SHP-1 fosfatasa a través del enlazamiento a los motivos ITIM. Parece que se requiere el restablecimiento de la SBP-1 fosfatasa por parte del receptor para las rutas de señalización intracelular que regulan la función inhibidora de los receptores. El experimento descrito en el Ejemplo 11 demuestra que los polipéptidos LIR-P3G2 y LIR-pbm8 se asocian con la SHP-1 fosfatasa por fosforilación y generan señales inhibidoras a través de rutas de activación monolíticas. Se sabe que muchos receptores para regulación inmunológica tales como los KIR, CD22, FC\gammaR11b1 tienen también los ITIM en sus dominios citoplasmáticos y funcionan para enviar señales de inhibición que regulan en forma reductora o inhiben la función celular. Así, por analogía con los KIR, CD22 y Fc\gammaR11b1, los miembros familiares del LIR presentados en las SEQ ID NOS:2, 4, 10, 18, 20, 22 y 38 que tienen los motivos ITIM envían una señal inhibidora a través de la interacción de su ITIM con SBP-1 tirosín fosfatasa, u otras tirosín fosfatasas, cuando el LIR está coligado con un receptor apropiado. También por analogía con receptores inmunoreguladores poseen los ITIM, los miembros familiares del LIR tienen una influencia reguladora sobre las respuestas humorales, inflamatorias y alérgicas.

Los miembros familiares del LIR presentados en las SEQ ID NOS: 12, 14, 16, 30 y 32 tienen dominios citoplasmáticos relativamente cortos, tienen regiones transmembrana que poseen al menos un residuo cargado, y no poseen el motivo ITIM. Por analogía con las proteínas de la membrana que carecen de los motivos ITIM y que tienen regiones transmembrana cargadas, estos miembros familiares median señales estimuladoras o activadoras para la célula. Por ejemplo, las proteínas enlazadas a la membrana que contienen un residuo cargado en las regiones transmembrana son conocidas por asociarse con otras proteínas enlazadas la membrana que poseen colas citoplasmáticas que tienen motivos conocidos como los motivos de activación basados en el inmunoreceptor tirosína (ITIM). Por asociación, los ITAM se fosforilan y propagan una señal de activación.

El polipéptido LIR designado como LIR-P3G2 se expresa sobre la superficie de células transfectadas o células normales. Esto se evidencia por los resultados de los experimentos descritos en el Ejemplo 3 y en el Ejemplo 5 en cuya citometría de flujo y técnicas de precipitación se demuestra que LIR-P3G2 se encuentra en monocitos, una subpoblación de células NK, y células B. P3G2 fue detectado sobre un pequeño subconjunto de células T. P3G2 se expresa como una glicoproteína de 110-120 kDa. Ya que P3G2 tiene cuatro sitios potenciales de glicosilación, el tamaño molecular de esta proteína variará con el grado de su glicosilación. Los sitios de glicosilación se presentan en la tripleta de aminoácidos Asn-X-Y, en donde X es cualquier aminoácido excepto Pro y Y es Ser o Thr. Los sitios potenciales de glicosilación sobre P3G2 se presentan en los aminoácidos 139-141; 280-282; 302-304; y 340-342.

P3G2-LIR aislado como se describe en el Ejemplo 3 fue analizado por su capacidad para enlazarse a los ligandos de la superficie la célula distintos de UL18. Como se demostró por medio de los resultados experimentales detallados en el Ejemplo 7, P3G2 se enlaza a los antígenos MHC clase I HLA-B 44 y HLA-A2. En forma similar, como se demuestra en el Ejemplo 14, LIR-P3G2 y LIR-pbm8 se enlazan a una variedad de alelos HLA-A, -B, y -C y reconocen a un amplio espectro de especificidades MHC clase I. Ya que las moléculas MHC Clase I juegan un papel central en la vigilancia inmunológica, la discriminación propia/no propia, la respuesta inmunológica a la infección, etc., los polipéptidos LIR-P3G2 y LIR-pbm8 tienen un papel en la regulación de las respuestas inmunológicas. Se sabe que la actividad citolítica de la NK para matar células tumorales y células infectadas con un virus, se regulan por medio de una delicada modulación de señales activadoras e inhibidoras. Se ha mostrado que receptores específicos para las mismas moléculas HLA clase I a las cuales se enlazan LIR-P3G2 y LIR-pbm8, pueden ser activadores o inhibidores en su mecanismo disparador. Por analogía, LIR-P3G2 y LIR-pbm8, que se enlazan a moléculas MHC clase I, pueden jugar un papel en el balanceo de la actividad celular del sistema ideológico, y son útiles en el tratamiento de estados de enfermedad en los cuales el balance del sistema inmunológico se rompe.

Dentro del alcance la presente invención se encuentran los fragmentos de polipéptido LIR que retienen una propiedad biológica deseada de un miembro familiar del polipéptido LIR tal como el lanzamiento a MHC clase I o a otro ligando. En una modalidad tal, los fragmentos de polipéptido LIR son polipéptidos LIR solubles que comprenden todo o parte del dominio extracelular, pero carecen de la región transmembrana que causaría la retención del polipéptido sobre una membrana celular. Los polipéptidos solubles LIR de ser segregados de las células en las cuales ellas se expresan. Convenientemente, un péptido de señal heteróloga se fusiona al N-terminal de tal manera que se segrega LIR soluble durante la expresión. Los polipéptidos LIR solubles incluyen dominios extracelulares que incorporan al péptido señal y a aquellos en los cuales el péptido señal es un péptido señal escindido.

El uso de formas solubles de un miembro familiar del LIR es conveniente para ciertas aplicaciones. Una de tales ventajas es la facilidad para purificar formas solubles de células huésped recombinantes. Ya que las proteínas solubles se segregan de las células, la proteína no necesita ser extraída de las células durante el proceso de recuperación. Adicionalmente, las proteínas solubles son generalmente más adecuadas para administración intravenosa y pueden ser utilizadas para bloquear la interacción de la superficie celular de los miembros familiares del LIR con sus ligandos con el propósito de mediar una función inmunológica deseable.

Abarcados además dentro de la presente invención se encuentran los polipéptidos solubles LIR, < que pueden incluir al dominio extracelular completo o a cualquier fragmento deseable del mismo, incluidos los dominios extracelulares que excluyen a los péptidos de señal. Así, por ejemplo, los polipéptidos solubles LIR incluyen a los aminoácidos x_{11} hasta 262 de la SEQ ID NO:30, en donde x_{11} es el aminoácido 1 ó 35; los aminoácidos x_{12} hasta 250 de la SEQ ID NO:32, en donde x_{12} es el aminoácido 1 ó 36; los aminoácidos x_{13} hasta 265 de la SEQ ID NO:34, en donde x_{13} es el aminoácido 1 ó 35; y los aminoácidos x_{14} hasta 253 de la SEQ ID NO:36, en donde x_{14} es el aminoácido 1 ó 36. Los polipéptidos solubles LIR anteriormente identificados incluyen a las regiones extracelulares de LIR que incluyen y excluyen a los péptidos señal. También se incluye aquí a aquellos LIR que carecen de una región transmembrana y citoplasmática, tales como las SEQ ID NOS: 34 y 36. Los polipéptidos solubles LIR adicionales incluyen fragmentos de los dominios extracelulares de los miembros familiares que retienen una actividad biológica deseada, tales como el lanzamiento de ligandos que incluyen a las moléculas MHC clase I.

Los fragmentos de los miembros familiares del LIR, que incluyen polipéptidos solubles, pueden prepararse por medio de cualquiera de las diferentes técnicas convencionales. Una secuencia de ADN que codifica a un fragmento de codificación de un polipéptido deseado LIR, puede ser subclonado dentro de un vector de expresión para la producción del fragmento de polipéptido de LIR. La secuencia seleccionada de codificación de ADN se fusiona convenientemente a una secuencia que codifica a un péptido adecuado guía o de señal. El fragmento de ADN que codifica al miembro LIR adecuado puede ser sintetizado químicamente utilizando técnicas conocidas de síntesis de ADN. Los fragmentos de ADN pueden producirse también por medio de digestión con una endonucleasa de restricción de una secuencia clonada de ADN de longitud completa, y aislada por medio de electroforesis sobre un gel apropiado. Si es necesario, los oligonucleótidos que reconstruyen a los terminales 5' o 3' hasta un punto deseado, pueden ligarse a un fragmento de ADN generado por medio de digestión con una enzima de restricción. Tales oligonucleótidos pueden contener adicionalmente un sitio de escisión para una endonucleasa de restricción secuencia arriba de la secuencia de codificación deseada, y un codón para posición e iniciación (ATG) en el N-terminal de la secuencia de codificación.

Otra técnica útil para obtener una secuencia de ADN que codifique a un fragmento deseado de proteína es el bien conocido procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los oligonucleótidos que definen a los terminales del ADN deseado son utilizados cebadores para la síntesis adicional de ADN a partir de un molde deseado de ADN. Los oligonucleótidos pueden contener también sitios de reconocimiento para endonucleasas de restricción, para facilitar la inserción del fragmento de ADN amplificado dentro de un vector de expresión. Las técnicas de PCR son descritas, por ejemplo, en Saiki y colaboradores, Science 239:487(1988): Recombinant DNA Methodology, Wu y colaboradores, eds., Academic Press, Inc., San Diego (1989), págs. 189-196; y PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis y colaboradores, eds., Academic Press, Inc. (1990).

Las moléculas de ácido nucleico de LIR de la presente invención incluyen ADNc aislado, ADN químicamente sintetizado, ADN aislado por PCR, ADN genómico clonado, y combinaciones de los mismos. El ADN genómico familiar de los LIR puede aislarse por medio de hibridación del ADNc familiar del LIR revelado aquí utilizando técnicas estándar. El ARN aislado transcrito a partir de moléculas de ADN familiares del LIR es también abarcado por la presente invención.

Dentro del alcance la presente invención se encuentran fragmentos de ADN tales como las regiones que codifican al polipéptido LIR y fragmentos de ADN que codifican polipéptidos solubles. Ejemplos de fragmentos de ADN que codifican a polipéptidos solubles incluyen al ADN que codifica regiones extracelulares completas de los miembros familiares del LIR y ADN que codifica fragmentos de la región extracelular tales como las regiones que carecen del péptido señal. Más específicamente, la presente invención incluye a los nucleótidos 69-968 de la SEQ ID NO:29 (la región de codificación de LIR-9ml) es los nucleótidos x_{11}-854 de la SEQ ID NO:29, en donde x_{11} es 69 ó 170 (codifica al dominio extracelular LIR-9m1); a los nucleótidos 95-958 de la SEQ ID NO:31 (la región de codificación de LIR-9m2) y a los nucleótidos x_{12}-844 de la SEQ ID NO:31, en donde x_{12} es 95 ó 200 (que codifica al dominio extracelular LIR-9m2); a los núcleos x_{13}-912 de la SEQ ID NO:33, en donde x_{13} es 115 ó 216 (la región de codificación y la región extracelular LIR-9s1); y a los nucleótidos x_{14}-834 de la SEQ ID NO:35, en donde x_{14} es 73 ó 178 (la región de codificación y la región extracelular LIR-9s2).

Incluidos en la presente invención están los ADN que codifican fragmentos biológicamente activos de las proteínas LIR cuyas secuencias de aminoácidos se presentan en las SEQ ID NO:30, 32, 34 y 36.

La presente invención abarca a las secuencias de nucleótidos que, debido a la degeneración del código genético, codifican polipéptidos que son idénticos a los polipéptidos codificados por las secuencias de ácido nucleico descritas anteriormente, y secuencias complementarias de ellas. Por lo tanto, dentro de la presente invención se encuentra ADN que codifica a miembros familiares del LIR biológicamente activos, que incluyen a la región de codificación de un ADNc miembros familiares del LIR humano nativo, o fragmentos del mismo, y ADN que está degenerado como resultado del código genético para la secuencia de ADN del polipéptido LIR nativo, o el ADN de los miembros familiares del LIR nativo descritos aquí.

En otros aspecto, la presente invención incluye variaciones y derivados de LIR así como variación y derivados de los polipéptidos familiares del LIR, tanto recombinantes como no recombinantes, que retienen una actividad biológica deseada. Una variación de LIR, como la mencionada aquí, es un polipéptido sustancialmente homólogo al polipéptido LIR nativo, como se describe aquí, excepto que la secuencia de aminoácidos de la variación difiere de aquella del polipéptido nativo debido un a una o más supresiones, inserciones o situaciones.

Las variaciones familiares del LIR pueden obtenerse a partir un de mutaciones de las secuencias de nucleótidos del LIR nativo. Dentro de la presente invención se encuentran tales mutaciones o variaciones de ADN que incluyen secuencias de nucleótidos que tienen una o más adiciones de nucleótido, supresiones de nucleótido, o sustituciones de nucleótido comparadas con los miembros familiares del LIR y que codifican variaciones de polipéptidos LIR o variaciones de los miembros familiares del LIR que tienen una actividad biológica deseada. Preferiblemente, la actividad biológica es sustancialmente la misma que aquella del polipéptido LIR nativo.

Las variaciones de secuencias de aminoácidos y las variaciones de secuencias de nucleótidos de la presente invención son preferiblemente al menos 80% idénticas a aquellas de la secuencia del miembro familiar del LIR. Un método para determinar el grado de homología o de identidad entre un aminoácido nativo o secuencia de nucleótidos, y una variación de un aminoácido o secuencia de nucleótidos es comparar las secuencias utilizando programas de computador adecuados para tales propósitos. Un programa adecuado de computador es el programa GAP, versión 6.0, descrito por Devereux y colaboradores (Nucl. Acids Res. 12:387, 1984) y disponible en la University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). El programa GAP utiliza el método de alineación de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), como el revisado por Smith y Waterman (Adv. Appl. Math 2:482, 1981). En resumen, el programa GAP define la identidad, el número de símbolos alineados (esto es, nucleótidos o aminoácidos) que son idénticos, divididos por el número total de símbolos en la más corta de las dos secuencias que están siendo comparadas. Los parámetros preferidos por defecto para el programa GAP incluyen: (1) una matriz de comparación unaria (que contiene un valor de 1 para las identidades y de 0 para las no identidades) para los nucleótidos o aminoácidos, y la matriz de comparación ponderada de Gribskov y Burgués, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986, como lo describen Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, págs. 353-358, 1979; (2) una penalización de 3, 0 por cada vacío y una penalización adicional de 0,10 por cada símbolo en cada vacío; y (3) ninguna penalización por vacíos en los extremos.

Las alteraciones de las secuencias de aminoácidos del LIR nativo pueden ser proveídas utilizando cualquiera entre un número de técnicas conocidas. Como se describió antes, las mutaciones pueden introducirse en sitios seleccionados de la secuencia por medio de oligonucleótidos para síntesis que contienen una secuencia mutante de codificación, flanqueada por sitios de restricción que permiten su unión a fragmentos de la secuencia nativa. Después de unir a los oligonucleótidos sintetizados a los fragmentos de la secuencia nativa, la secuencia de nucleótidos reconstruida resultante codificará a un polipéptido análogo o a una variante que tenga la inserción, sustitución o supresión deseada de aminoácidos. Otro procedimiento adecuado para reparar variaciones de polipéptidos son los procedimientos de mutagénesis específica dirigida al sitio del oligonucleótido que proporcionan genes que tienen codones específicos alterados de acuerdo a la sustitución, supresión, o inserción deseada. Las técnicas para lograr tales alteraciones incluyen aquellas reveladas en las siguientes referencias: Walder y colaboradores Gene, 42:133, 1986; Bauer y colaboradores, Gene 37:73, 1985; Craik, BioTechniques, 12-19 Enero, 1985; Smith y colaboradores, Genetic Engineering: Principles and Methods. Plenum Press, 1981; y las patentes estadounidenses 4.518.584 y 4.737.462, las cuales se incorporan aquí como referencia.

Las variaciones de los polipéptidos de la presente invención pueden tener secuencias de aminoácidos que están sustituidas conservadoramente, lo cual significa que uno o más de los residuos aminoácidos de un miembro familiar del polipéptido nativo LIR se reemplazan por diferente residuos, de tal forma que la variación del polipéptido retienen una actividad biológica deseada que es esencialmente equivalente a aquella de un miembro familiar del LIR nativo. En general, se conocen en el estado de la técnica un gran número de aproximaciones para las sustituciones conservadoras y pueden aplicarse a la preparación de una variante de la presente invención. Por ejemplo, los aminoácidos de la secuencia nativa de los polipéptidos pueden ser sustituidos por aminoácidos que no alteren la estructura secundaria y/o terciaria del polipéptido LIR. Otras sustituciones adecuadas incluyen aquellas que involucran aminoácidos por fuera del dominio de enlazamiento con el ligando de interés. Una aproximación a sustituciones conservadoras de aminoácidos involucra el reemplazo de uno o más aminoácidos por aquellos que tienen características fisicoquímicas similares, por ejemplo, la sustitución de un residuo alifático por otro tal como Ile, Val, Leu, o Ala; la sustitución de un residuo polar por otro (tal como entre Lys y Arg; Glu y Asp; o Gln y Asn); o la sustitución de regiones enteras que tienen características de hidrofobicidad o hidrofílicas similares.

Las variantes del polipéptido LIR pueden ser analizadas en cuanto a su enlazamiento a las células como se describe en los Ejemplos 5 y 6 y a la actividad de enlazamiento de fosfatasa como se describe en el Ejemplo 11 para confirmar la actividad biológica. Otras variaciones de LIR dentro de la presente invención incluyen a los polipéptidos que se alteran por medio del cambio de la secuencia de nucleótidos que codifican al polipéptido para que los residuos Cys del polipéptido seleccionado sean suprimidos o reemplazados con uno o más aminoácidos alternativos. Estas variaciones de LIR no formarán puentes disulfuro intramoleculares después de la renaturalización. Los polipéptidos LIR de ocurrencia natural seleccionados para alteración por medio de la supresión hubo alteración de los residuos Cys, preferiblemente no tienen actividad biológica que dependa de los puentes disulfuro formados por el residuo Cys. Otras variantes posibles se preparan por medio de técnicas que causan la modificación de los residuos aminoácidos dibásicos adyacentes para mejorar la expresión en sistemas de levadura en los cuales la actividad de la KEX2 proteasa está presente. EP 212.914 revela técnicas mutagénicas específicas para el sitio destinadas a inactivar a los sitios de procesamiento de la KEX2 proteasa en una proteína. Los sitios de procesamiento de la KEX2 proteasa se inactivan por medio de supresión, adición o sustitución de residuos para alterar a los pares Arg-Arg, Arg-Lys, y Lys-Arg para eliminar la ocurrencia de estos residuos básicos adyacentes. Lys-Lys y los apareamientos son considerablemente menos susceptibles a escisión por parte de la KEX2, la conversión de Arg-Lys o Lys-Arg a Lys-Lys representa una aproximación preferida y conservadora para la inactivación de los sitios KEX2.

Las variantes de LIR de ocurrencia natural también están comprendidas dentro de la presente invención. Ejemplos de tales variantes son las proteínas que resultan de los eventos alternativos de empalme de ARNm o de la escisión proteolítica de un polipéptido LIR. El empalme alternativo de ARNm puede producir un polipéptido LIR truncado pero biológicamente activo tal como una forma soluble de la proteína de ocurrencia natural. Las variaciones atribuibles a proteólisis incluyen una diferencia en los terminales N- o C- para la expresión en diferentes tipos de células huésped, debido a la remoción proteolítica de uno o más aminoácidos terminales del polipéptido LIR. Además, la escisión proteolítica puede liberar una forma soluble de LIR a partir de una forma enlazada a la membrana del polipéptido. Otras variaciones de LIR de ocurrencia natural son aquellas en las cuales las diferencias en la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOS:30, 32, 34 y 36 son atribuibles a polimorfismo genético, la variación alélica entre individuos.

Dentro del alcance de la presente invención se encuentran los polipéptidos derivados de la familia del LIR que incluyen polipéptidos LIR nativos o sus variantes modificadas para formar conjugados con fracciones químicas seleccionadas. Los conjugados pueden formarse por medio del enlazamiento covalente de otra fracción a un LIR nativo o a una variante, por medio del enlazamiento no covalente de otra fracción a grupos glicosilo, lípidos, fosfatos, grupos acetilo, y a otras proteínas o fragmentos de las mismas. Las técnicas para el enlazamiento covalente de fracciones químicas a las proteínas, son bien conocidas en el estado de la técnica y son generalmente adecuadas para preparar polipéptidos derivados de LIR. Por ejemplo, los grupos activos o los grupos funcionales activados sobre las cadenas laterales de aminoácidos, pueden utilizarse como sitios de reacción para el enlazamiento covalente de una fracción química a un polipéptido LIR. En forma similar, el N-terminal o el C-terminal pueden proveer un sitio de reacción para una fracción química. Los polipéptidos LIR o los fragmentos conjugados con otras proteínas o fragmentos de proteína, pueden prepararse en un cultivo recombinante como productos de fusión N-terminal o el C-terminal. Por ejemplo, el conjugado o las porciones de fusión pueden incluir una secuencia señal o líder unida a una molécula del LIR en su N-terminal. El péptido señal o el péptido líder dirigen la transferencia del conjugado en forma de traducción conjunta o de traducción posterior desde su sitio de síntesis hasta un sitio dentro o fuera del membrana celular.

Un conjugado útil de un polipéptido LIR es uno que incorpora una poli-His o a los péptidos de identificación antigénica descritos en la patente estadounidense No. 5.011.912 y en Hopp y colaboradores, Biol Technology 6:1124, 1988. Por ejemplo, el péptido FLAG®, Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (SEQ ID NO:39) es altamente antigénico y proporciona un epítopo enlazado en forma reversible por medio de un anticuerpo monoclonal específico, permitiendo así un ensayo rápido y la fácil purificación de la proteína recombinante expresada. Esta secuencia se escinde específicamente por medio de la enteroquinasa de mucosa bovina en el residuo inmediatamente siguiente al par Asp-Lys. Las proteínas de fusión restringidas con este péptido pueden ser resistentes a degradación intracelular en E. coli. El hibridoma de murino designado como 4E11 produjo un anticuerpo monoclonal que enlaza al péptido de la SEQ ID NO:39 en presencia de ciertos cationes metálicos divalentes, y que ha sido depositado en la American Type Culture Collection bajo el número de acceso HB 9259. Los sistemas de expresión útiles para producir proteínas recombinantes fusionadas al péptido FLAG®, y los anticuerpos monoclonales que enlazan al péptido y son útiles en la purificación de proteínas recombinantes, pueden obtenerse con Eastman Kodak Company, Scientific Imaging Systems, New Haven, Connecticut.

Las proteínas de fusión LIR particularmente adecuadas son aquellas en las cuales un polipéptido LIR está en la forma de un oligómero. Los oligómeros pueden formarse por medio de enlaces disulfuro entre residuos de cisteína en más de un polipéptido LIR, o por medio de interacciones no covalentes entre cadenas de polipéptidos LIR. En otra aproximación, los oligómeros LIR pueden formarse por medio de la unión de polipéptidos LIR o de fragmentos de los mismos a través de interacciones covalentes o monovalentes entre fracciones de péptido fusionadas al polipéptido LIR. Las fracciones adecuadas de polipéptido incluyen enlazadores o espaciadores de péptido, o péptidos que tienen la propiedad de promover la oligomerización. Los cierres de leucina y ciertos polipéptidos derivados de los anticuerpos están entre los péptidos que pueden promover la oligomerización de los polipéptidos LIR unidos a ellos.

Otras proteínas de fusión LIR que promueven la formación de oligómero son las proteínas de fusión que tienen polipéptidos heterólogos fusionados a diferentes porciones de polipéptidos derivados de anticuerpo (incluido el dominio Fc). Los procedimientos para preparar a dichas proteínas de fusión se describen en Ashkenazi y colaboradores, PNAS USA 88:10535, 1991; Byrne y colaboradores, Nature 344:667, 1990, y Hollenbaugh y Aruffo, Current Protocols in Immunology, Suplemento 4, páginas 10.19.1-10.19.11, 1992; todos los cuales se incorporan aquí como referencia. El Ejemplo 1 y el Ejemplo 5 describen más adelante métodos para preparar UL 18: Fc y P3G2:proteínas de fusión Fc, respectivamente, por medio de la fusión de P3G2 y UL 18 a un polipéptido en la región Fc derivado de un anticuerpo. Esto está acompañado de la inserción dentro de un vector de expresión de una fusión génica que codifica a la proteína de fusión P3G2:Fc y la expresión de la proteína de fusión P3G2:Fc. A las proteínas de fusión se les permite juntarse muy parecido como a las moléculas anticuerpo, después de lo cual se forman enlaces disulfuro dentro de la cadena entre los polipéptidos Fc, produciendo un polipéptido P3G2 divalente. En una aproximación similar, P3G2 o cualquier polipéptido LIR pueden ser sustituidos por la porción variable de un anticuerpo de cadena pesada o liviana. Si las proteínas de fusión se elaboran con cadenas pesadas y livianas de un anticuerpo, es posible formar un oligómero de LIR con tantas como cuatro regiones LIR.

Así, la invención abarca ácidos nucleicos que codifican proteínas de fusión que incluyen a la región Fc de Ig, y una secuencia de aminoácidos que incluye a la región extracelular de cualquiera de las proteínas miembro de la familia del LIR. Tales regiones extracelulares incluyen, por ejemplo, a los aminoácidos x_{11} hasta 262 de la SEQ ID NO:30, en donde x_{11} es el aminoácido 1 ó 35; los aminoácidos x_{12} hasta 250 de la SEQ ID NO:32, donde x_{12} es el aminoácido 1 ó 36; los aminoácidos x_{13} hasta 265 de la SEQ ID NO:34, donde x_{13} es el aminoácido 1 ó 35; y los aminoácidos x_{14} hasta 253 de la SEQ ID NO:36, donde x_{14} es el aminoácido 1 ó 36.

Como se lo utiliza aquí, un polipéptido Fc incluye formas nativa y muteina, así como polipéptidos truncados Fc que contienen a la región de articulación que promueve la dimerización. Un polipéptido Fc adecuado es el polipéptido nativo de la región Fc derivado de un IgGI humano, que se describe en la solicitud PCT WO 93/10151, incorporado aquí como referencia. Otro polipéptido Fc útil es la muteina Fc descrita en la patente estadounidense No. 5.457.035. La secuencia de aminoácidos de la muteina es idéntica a aquella secuencia nativa Fc presentada en WO 93/10151, excepto porque el aminoácido 19 ha sido cambiado de Leu Ala, el aminoácido 20 ha sido cambiado de Leu a Glu, y el aminoácido 22 ha sido cambiado de Gly a Ala. Esta muteina Fc exhibe una afinidad reducida por los receptores de la inmunoglobulina.

Alternativamente, las variantes del polipéptido oligomérico LIR pueden incluir dos o más péptidos LIR unidos a través de enlazadores de péptidos. Los ejemplos incluyen a aquellos enlazadores de péptidos descritos en la patente estadounidense No. 5.073.627, incorporada aquí como referencia. Las proteínas de fusión que incluyen múltiples polipéptidos LIR separados por enlazadores de péptidos pueden ser producidas por medio de tecnología convencionales de ADN recombinante. Otro método para preparar variantes de polipéptido oligomérico LIR involucra el uso de un cierre de leucina. Los dominios del cierre de leucina son péptidos que promueven la oligomerización de las proteínas en las cuales se encuentran. Los cierres de leucina fueron identificados primero en diferentes proteínas de enlazamiento de ADN (Landschulz y colaboradores, Science 240:1759, 1988). Entre los cierres de leucina conocidos están los péptidos de ocurrencia natural y los péptidos derivados que dimerizan o trimerizan. Ejemplos de dominios de cierre de leucina adecuados para la producción de polipéptidos oligoméricos solubles LIR o polipéptidos oligoméricos de la familia del LIR son aquellos descritos en la solicitud PCT WO 94/10308, incorporada aquí como referencia. Las proteínas recombinantes de fusión que tienen un polipéptido soluble LIR fusionado a un péptido que dimeriza o trimeriza en solución, puede ser expresado en células huésped adecuadas, y el polipéptido oligomérico soluble LIR resultante recuperado del sobrenadante del cultivo.

Se conocen numerosos reactivos útiles para el entrecruzamiento de moléculas de proteína entre sí. Los enlazadores heterobifuncionales y homobifuncionales pueden adquirirse para este propósito por ejemplo con Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois. Tales enlazadores contienen dos grupos funcionales (por ejemplo ésteres y/o maleimidas) que reaccionaran con ciertos grupos funcionales sobre cadenas laterales de aminoácidos, enlazando así a un polipéptido con otro.

Un tipo de enlazador de péptidos que puede emplearse en la presente invención separa los dominios del polipéptido una distancia suficiente para asegurarse de que cada dominio se doble adecuadamente dentro de las estructuras secundaria y terciaria necesarias para la actividad biológica deseada. El enlazador también permitirá a la porción extracelular asumir la orientación espacial adecuada para formar los sitios de enlazamiento para los ligandos.

Los enlazadores adecuados de péptido son conocidos en el estado de la técnica, y pueden emplearse de acuerdo a técnicas convencionales. Entre los enlazadores adecuados de péptido se encuentran aquellos descritos en las patentes estadounidenses Nos. 4.751.180 y 4.935.233, que se incorporan aquí como referencia. Un enlazador de péptido puede ser unido a polipéptidos LIR por medio de cualquiera de los procedimientos convencionales utilizados para unir a un polipéptido con el otro. Los reactivos de entrelazamiento disponibles con Pierce Chemical Company como se describió antes, están entre aquellos que pueden ser empleados. Los aminoácidos que tienen cadenas laterales reactivas con tales reactivos pueden ser incluidos en los enlazadores de péptido, por ejemplo, en los terminales del mismo. Preferiblemente, Las proteínas de fusión formadas a través de un enlazador de péptido se preparan a través de tecnología de ADN recombinate.

Las proteínas de fusión de la presente invención incluyen construcciones en las cuales la porción C-terminal de una proteína se fusiona al enlazador que se fusiona a la porción N-terminal de otra proteína. Los péptidos enlazados de tal manera que produce una proteína única que retiene la actividad biológica deseada. Los componentes de la proteína de fusión e enlistan en orden de ocurrencia (estos es, el polipéptido N-terminal se enlista primero, seguido por el enlazador y luego por el polipéptido C-terminal).

Una secuencia de ADN que codifica a una proteína de fusión se construye utilizando técnicas de ADN recombinante para insertar fragmentos separados de ADN que codifican a las proteínas deseadas dentro de un vector de expresión apropiado. El extremo 3' de un fragmento de ADN que codifica una proteína está ligado (a través de un enlazador) al extremo 5' del fragmento de ADN que codifica a otra proteína con los marcos de lectura de las secuencias en fase para permitir la traducción del ARNm en una proteína única de fusión biológicamente activa. Una secuencia de ADN que codifica a una secuencia señal N-terminal puede ser retenida sobre la secuencia de ADN que codifica al puede péptido N-terminal, mientras que los codones de detención, que prevendrían la translectura para la segunda secuencia de ADN, son eliminados. En forma inversa, se retiene un codón de detención requerido para terminar la traducción sobre la segunda secuencia de ADN. El ADN que codifica una secuencia señal es removido preferiblemente de la secuencia de ADN que codifica al polipéptido C-terminal.

Una secuencia de ADN que codifica a un polipéptido enlazador puede ser insertada entre, y en el mismo marco de lectura que, las secuencias de ADN que codifican a las dos proteínas utilizando cualquier técnica adecuada convencional. Por ejemplo, un oligonucleótido sintetizado químicamente que codifica al enlazador y que contiene sitios apropiados de escisión para la endonucleasa de restricción, puede estar ligado entre las secuencias que codifican al polipéptido Fc y al polipéptido P3G2.

Dentro del alcance de la presente invención se encuentran los vectores de expresión recombinante para expresar polipéptidos de la familia del LIR, y células huésped transformadas con los vectores de expresión. Los vectores de expresión de la invención incluyen ADN que codifica a un miembro de la familia del LIR operativamente enlazado a secuencias transcripcionales adecuadas de nucleótidos o a secuencias de nucleótidos reguladoras de traducción, tales como aquellas que se derivan de un gen de mamífero, microbial, viral, o de insecto. Ejemplos de secuencias reguladoras incluyen promotores, operadores, o potenciadores transcripcionales, un sitio de enlazamiento ribosomal de ARNm, y secuencias apropiadas que controlan la iniciación y la terminación de la transcripción y la traducción. Las secuencias de nucleótidos se enlazan operativamente cuando la secuencia reguladora se relaciona funcionalmente a la secuencia de ADN del LIR. Así, una secuencia nucleótida promotora se enlaza operativamente a una secuencia de ADN del LIR si la secuencia nucleótida promotora controla la transcripción de la secuencia de ADN del LIR. Un origen de replicación que confiere la capacidad de replicación en las células huésped deseadas, y un gen de selección por medio del cual se identifican los transformantes, se incorporan generalmente en el vector de expresión.

Además, una secuencia que codifica a un péptido señal apropiado puede ser incorporada dentro de los vectores de expresión. Una secuencia de ADN para un péptido señal (guía de secreción) puede fusionarse en el marco a la secuencia del LIR de tal manera que el LIR se traduzca inicialmente como una proteína de fusión que comprende al péptido señal. Un péptido señal que es funcional en las células huésped deseadas promueve una secreción extracelular del polipéptido LIR. El péptido señal se escinde de polipéptido LIR por secreción del polipéptido LIR de la célula.

Los vectores de expresión recombinante de la presente invención pueden incluir a cualquier ADN que codifica a un polipéptido LIR. Ejemplos de ADN para inclusión en tales vectores de expresión incluyen a las moléculas de ácido nucleico cuyas secuencias se muestran en las SEQ ID NOS:29, 31, 33 Y 35.

Las células huésped adecuadas para expresión de los polipéptidos LIR incluyen a las células procariotas, levaduras o a las células eucariotas superiores. Los vectores apropiados de clonación y de expresión para uso con bacterias, hongos, levaduras y huéspedes celulares de mamífero se describen, por ejemplo en Pouwels y colaboradores, Coning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985). Los sistemas de traducción libres de células podrían emplearse para producir polipéptidos P3G2 utilizando los ARN derivados de las construcciones de ADN reveladas aquí.

Las células huésped procariotas adecuadas en la práctica de la presente invención incluyen organismos gram negativos o gram positivos, por ejemplo, E. coli o Bacilli. Las células huésped procariotas adecuadas para transformación incluyen, por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, y diferentes otras especies tales como Pseudomonas, Streptomyces, y Staphylococcus. En una célula huésped procariota, tal como E. coli, un polipéptido P3G2 pueden incluir un residuo de metionina N-terminal para facilitar la expresión del polipéptido recombinante. El residuo de metionina N-terminal puede escindirse del polipéptido LIR recombinante expresado.

Los vectores de expresión para ser usados en células huésped procariotas incluyen generalmente uno o más genes marcadores fenotípicos seleccionables. Un gen marcador fenotípico seleccionable es, por ejemplo, un gen que codifica a una proteína que confiere resistencia antibiótica o que suministra un requerimiento autotrófico. Ejemplos de vectores es de expresión útiles para células huésped procariotas incluyen a aquellos derivados de plásmidos comercialmente disponibles tales como el vector de clonación pBR322 (ATCC37017). pBR322 contiene genes para resistencia a la ampicilina y a la tetraciclina y provee así un medio simple para identificar células transformadas. Un promotor apropiado y un ADN de la familia del LIR pueden insertarse dentro el vector pBR322. Otros vectores comercialmente disponibles incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) y pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA).

Las secuencias del promotor comúnmente utilizadas para los vectores de expresión recombinante de las células huésped procariotas incluyen \beta-lactamasa (penicilinasa), sistema promotor de lactosa (Chang y colaboradores, Nature 75:615, 1978; y Goeddel y colaboradores, Nature 281:544, 1979), sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel y colaboradores, Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980); y EP-A-36776) y promoter tac (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, pág. 412, 1982). Un sistema de expresión de célula huésped procariota particularmente útil emplea una fase promotora lPL y una secuencia represora termolábil cI857ts. Los vectores plásmidos obtenibles del American Type Culture Collection que incorpora derivados del promotor lPL incluyen al plástido pHUB2 (residente en la cepa JMB9 de E. coli, ATCC 37092) y pPLc28 (residente en RR1 de E. coli, ATCC 3082).

Alternativamente, los polipéptidos LIR pueden expresarse en células huésped de levadura, preferiblemente del género Saccharomyces (por ejemplo, S. cerevisiae). Otros géneros de levadura, tales como Pichia o Kluyveromyces pueden también ser empleados. Los vectores de levadura a menudo contendrán un origen de secuencia de replicación de un plásmido de levadura de 2 \mu, una secuencia de replicación autónoma (ARS), una región promotora, secuencias para poliadenilación, secuencias para terminación de transcripción, y un gen marcador seleccionable. Las secuencias promotoras adecuadas para vectores de levadura incluyen, entre otros, a promotores para metalotioneina, 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman y colaboradores, J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) u otras enzimas glicolíticas (Hess y colaboradores, J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968); y Holland y colaboradores, Biochem. 17:4900, 1978), tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosefosfato isomerasa, fosfo-glucosa isomerasa, y glucoquinasa. Otros vectores y promotores adecuados para ser usados en expresión de levadura son descritos además en Hitzeman, EPA-73.675. Otra alternativa es el promotor ADH2 reprimible por glucosa descrito por Russell y colaboradores (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) y Beier y colaboradores (Nature 300:724, 1982). Los vectores lanzadera replicables tanto en levadura como en E. coli pueden ser construidos por medio de la inserción de ADN de pBR322 para selección y replicación en E. coli (gen Amp^{r} y origen de replicación) dentro de los vectores de levadura descritos anteriormente.

La secuencia guía del factor \alpha de levadura puede ser empleada para dirigir la secreción del polipéptido LIR. La secuencia guía del factor \alpha se inserta a menudo entre la secuencia del promotor y la secuencia del gen estructural. Ver, por ejemplo, Kurjan y colaboradores, Cell 30:933,1982 y Bitter y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330, 1984. Otras secuencias guía adecuadas para facilitar la secreción de polipéptidos recombinantes de huéspedes de levadura, son conocidas por aquellos entrenados en la técnica. Una secuencia guía puede ser modificada cerca de su extremo 3' para contener uno o más sitios de restricción. Esto facilitará la fusión de la secuencia guía al gen
estructural.

Los protocolos para transformación de levadura son conocidos aquellos entrenados en la técnica. Uno de tales protocolos es descrito por Hinnen y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978. El protocolo de Hinnen selecciona a los transformantes Trp en un medio selectivo, en donde medio selectivo consiste de una base nitrogenada de levadura al 0,67%, ácidos casamino al 0,5%, glucosa al 2%, 10 \mug/mL de adenina y 20 \mug/mL de uracilo.

Las células huésped de levadura transformadas por los vectores que contienen una secuencia de promotor ADH2 pueden ser cultivadas para inducir la expresión en un medio "rico". Un ejemplo de un medio rico es uno que tiene extracto de levadura al 1%, peptona al 2%, y glucosa suplementada al 1% con 80 \mug/mL de uracilo. La depresión del promotor ADH2 ocurre cuando glucosa se agota en el medio.

Los sistemas de cultivo de células huésped de mamífero o de insecto pueden ser utilizados para expresar polipéptidos recombinantes LIR. Los sistemas de Baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insecto, son revisados por Luckow y Summers, Bio/Technology 6:47 (1988). Las líneas celulares establecidas de origen mamífero también pueden ser empleadas. Ejemplos de líneas adecuadas de células huésped de mamífero incluyen a la línea COS-7 de células de riñón de mono (ATCC CRL 1651)(Gluzman y colaboradores, Cell 23:175, 1981), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, y líneas celulares BHK (ATCC CRL 10), y el cline celular CVI/EBNA derivado de la línea celular de mono verde africano CVI (ATCC CCL 70) como lo describen McMahan y colaboradores, (EMBO J. 10:2821, 1991). COS-1 (ATCC CRL-1650).

Las secuencias de control transcripcional y de traducción para vectores de expresión de células huésped de mamífero pueden ser cortadas a partir de genomas virales. Las secuencias promotoras comúnmente utilizadas y las secuencias potenciadoras se derivan del virus Polioma, del Adenovirus 2, del Virus Simio 40 (SV40), y de citomegalovirus humano. El ADN derivado del genoma viral SV40, por ejemplo, SV40 de origen, promotor temprano y promotor tardío, potenciador, empalme, y sitios de poliadenilación, pueden ser utilizados para proporcionar otros elementos genéticos para la expresión de una secuencia génica estructural en una célula huésped de mamífero. Los promotores virales temprano y tardío son particularmente útiles debido a que ambos se obtienen fácilmente a partir de un genoma viral como un fragmento que puede contener también un origen viral de replicación (Fiers y colaboradores, Nature 273:113, 1978). Los fragmentos más pequeños o más grandes de SV40 pueden ser usados también, dado a que está incluida la secuencia de aproximadamente 250 bp que se extiende desde el sitio HIND III hacia el sitio Bg/I localizado en el sitio de origen viral de replicación SV40.

Los vectores de expresión adecuados para ser usados en células huésped de mamífero pueden construirse como lo revelan Okayama y Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983). Un sistema útil para expresión estable de alto nivel de los ADNc del receptor de mamífero en células epiteliales mamarias de murino C127, pueden ser construido sustancialmente como lo describen Cosman y colaboradores, (Mol. Immunol. 23:935, 1986). Un vector de alta expresión, PMLSV N1/N4, descrito por Cosman y colaboradores, Nature 312:768, 1984, ha sido depositado como ATCC 39890. Vectores adicionales de expresión de mamífero son descritos en EP-A-0367566, y en WO 91/18982. Rectores adicionales de expresión aún para uso en células huésped de mamífero incluyen a pDC201 (Sims y colaboradores, Science 241:585, 1988), pDC302 (Mosley y colaboradores, Cell 59:335, 1989), y pDC406 (McMahan y colaboradores, EMBO J. 10:2821, 1991). Los vectores derivados de retrovirus también pueden ser empleados. Un sistema preferido de expresión emplea pDC409 como se discute en el Ejemplo 5 más adelante.

Para la expresión de los polipéptidos LIR, el de toros de expresión puede comprender ADN que codifica a un péptido señal o guía. En lugar de la secuencia señal nativa, puede añadirse una secuencia señal heteróloga, tal como la secuencia señal para la interleuquina-7 (IL-7) descrita en la patente estadounidense No. 4.965.195; la secuencia señal para el receptor de la interleuquina-2 descrito en Cosman y colaboradores, Nature 312:768, 1984; el péptido señal de la interleuquina-4 descrito en EP 367.566; el péptido señal del receptor de interleuquina-1 tipo I descrito en la patente estadounidense No. 4.968.607; y el péptido señal del receptor de interleuquina-1 tipo II descrito en EP 460.846.

Se contemplan además dentro de la presente invención los polipéptidos purificados de la familia del LIR, y los procesos para su purificación. Los polipéptidos purificados de la presente invención pueden purificarse a partir de los sistemas de expresión recombinante descritos anteriormente, o pueden ser purificados a partir de células de ocurrencia natural. El grado deseado de pureza puede depender del uso pretendido para la proteína con un grado preferido relativamente alto de pureza cuando la proteína se desea para uso in vivo. Preferiblemente, el proceso de purificación del péptido LIR es tal que no son detectables las bandas de proteína correspondientes a las proteínas diferentes a la proteína LIR deseada por medio de electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE). Será reconocido por aquellos entrenados la técnica que las bandas múltiples corresponden a cualquiera de los polipéptidos LIR que pueden ser detectados por medio de SDS-PAGE, debido a mi glicosilación diferencial, a variaciones en el procesamiento postraducción, y similares, como se discutió antes. Más preferiblemente, cualquier polipéptido específico LIR se purifica hasta homogeneidad sustancial, como indica una coloración única, o una autorradiografía o fluorescencia si la proteína es marcada adecuadamente.

Un proceso para proveer polipéptidos purificados LIR incluye cultivar primero una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica al polipéptido deseado bajo condiciones que promueven la expresión del polipéptido deseado LIR y luego la recuperación del polipéptido LIR. Como lo reconocerá una persona capacitada en el tema, los procedimientos para recuperar al polipéptido variarán de acuerdo con factores tales como el tipo de células huésped empleadas y si el polipéptido que es secretado en el medio de cultivo es extraído de las células.

Cuando el sistema de expresión secreta al polipéptido dentro del medio de cultivo, el medio puede ser concentrado primero utilizando un filtro para concentración de proteína comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Después de la etapa de concentración, el concentrado puede aplicarse a una matriz de purificación adecuada tal como un medio de filtración por gel. Alternativamente, pueden emplearse una resina de intercambio aniónico, tal como una matriz de resina o un sustrato de resina que tiene grupos colgantes dietiaminoetilo (DEAE). Las matrices pueden ser de archilamida, azarosa, dextrano, celulosa o de otro tipo comúnmente empleados en purificación de proteínas. En forma similar, pueden utilizarse una matriz de purificación que tiene grupos de intercambio catiónico tale como las funcionalidades sulfopropilo o carboximetilo sobre una matriz insoluble. Se prefieren los grupos sulfopropilo. Otras matrices de purificación y métodos adecuados para proveer LIR purificados son la cromatografía líquida de alta resolución divisando medios hidrófobos en fase reversa (RP-HPLC). Alguien entrenado en la técnica reconocerá que cualquiera, o todas las etapas de purificación anteriores, en diferentes combinaciones, pueden emplearse para proveer un polipéptido purificados LIR.

Alternativamente, los polipéptidos LIR pueden ser purificados por medio de cromatografía de inmunoafinidad. Una columna de afinidad que contiene un anticuerpo que enlaza a un polipéptido LIR, puede prepararse por medio de procedimientos convencionales y emplearse en purificación de LIR. El Ejemplo 5 describe un procedimiento para generar anticuerpos monoclonales dirigidos contra P3G2 que puede ser utilizado en cromatografía de inmunoafinidad.

La proteína recombinante producida en un cultivo bacterial puede aislarse por medio de la alteración de las células huésped por medio de cualquier método conveniente, incluidos los ciclos de congelación-descongelación, sonicación, alteración mecánica, o el uso de agentes para lisado de células y luego extrayendo al polipéptido del precipitado celular si el polipéptido es insoluble, o a partir del fluido sobrenadante si el polipéptido es soluble. Después de la etapa inicial de aislamiento, el proceso de purificación puede incluir una o más etapas de purificación como concentración, precipitación por salado, intercambio iónico, afinidad, o cromatografía de exclusión por tamaño. Para muchas aplicaciones es benéfica una etapa de purificación final por RP-HPLC.

Otros métodos para proveer polipéptidos LIR y polipéptidos LIR purificados involucran levadura fermentativa que expresa proteínas como una proteína secretada. Las proteínas recombinantes secretadas resultantes de una fermentación a gran escala pueden purificarse por métodos análogos a aquellos revelados por Urdal y colaboradores (J. Chromatog. 296:171, 1984), que involucran dos etapas secuenciales por HPLC en fase reversa por purificación de una proteína recombinante sobre una columna preparativa de HPLC.

El ADN de LIR-P3G2 en el vector pDC406 fue depositado en la American Type Culture Collection el 22 de abril de 1997, y acceso asignado No. 97995. El depósito se hizo bajo los términos del Tratado de Budapest.

Como se describió antes y se muestra en los Ejemplos 6 y 14, LIR-P3G2 y LIR-pbm8 son moléculas receptoras MHC clase I encontradas sobre la superficie de ciertos monocitos, células B, y células NK. Con respecto a los monocitos, la expresión de los LIR que son proteínas de enlazamiento MHC clase I sugiere que existe algún requerimiento por monocitos para reconocer moléculas MHC clase I. LIR-P3G2, LIR-pbm8, LIR y ciertos miembros adicionales de la familia del LIR contienen motivos ITIM citoplasmáticos. Por analogía con la estructura y la función de moléculas receptoras conocidas MHC clase I, estos LIR son receptores inhibidores que intervienen en la señalización negativa. En realidad, los resultados demostrados en el Ejemplo 11 revelan que los LIR se asocian con SBP-1 e inhiben los eventos de activación mediados por FcR. Así, los monocitos pueden expresar receptores clase I con el propósito de suprimir los mecanismos líticos mediados por la célula. Los monocitos rápidamente fagocitan a los patógenos extracelulares a través de FcR y, la captación monolito-FcR induce la propagación de respuestas inmunológicas por medio de la producción de más mediadores sistémicos, particularmente TNF-\alpha, IL-6 e IL-8. Por tanto, los LIR gran papel en la regulación de los monocitos y de los macrofagos de las respuestas citolítica e inflamatoria contra los propios tejidos. La interrelación entre las señales activadoras de FcR y la señal inhibidora de LIR puede permitir que existan bajos niveles de IgG autorreactivo en circulación y que se enlace a la membrana del monocito con el inicio de una respuesta inmune. Por ejemplo, la expresión de estos receptores inhibidores puede proteger el desarrollo embrionario a partir del reconocimiento alogénico mediado por anticuerpo materno.

Con respecto a los LIR sobre células del linaje DC, como se describe en el Ejemplo 13, LIR-P3G2 y LIR-pbm8 expresan en forma conjunta a CD33^{+}CD14^{-}CD16^{-}HLA^{-}DR^{+} DC. Se sugiere que DC FcR juega un papel en el enlazamiento de complejos inmunológicos y en el desencadenamiento de la activación de la señal DC después del enlazamiento. Así, los LIR expresados sobre DC pueden suprimir la activación de DC a través de interacciones de FcR.

Muchos miembros de la familia LIR carecen del motivo ITIM y por analogía con la estructura y función de receptores conocidos MHC clase I que carecen de los ITIM, son receptores activadores. La falla de un receptor que media una señalización negativa podría resultar en enfermedades autoinmunes. Así, la captación de un miembro de la familia del LIR que tiene motivos ITIM como un anticuerpo agonista o un ligando podría ser usada para regular en forma productora una función celular en estados de enfermedad en los cuales el sistema inmunológico es hiperactivo y está presente una excesiva inflamación una inmunopatología. Por otro lado, utilizando un anticuerpo antagonista específico para el ITIM que posee el receptor LIR o una forma soluble del receptor, puede usarse para bloquear la interacción del receptor de la superficie de la célula con él ligando del receptor para activar la función inmunológica específica en estados de enfermedad asociados con una función inmunológica suprimida. Ya que receptores que carecen del motivo ITIM envían señales de activación una vez capturados como se describe más arriba, la falla de un receptor que media una señal activadora podría resultar en una función inmunológica suprimida. La captación del receptor con su anticuerpo agonista o ligando, puede ser utilizada para tratar enfermedades asociadas con la función inmunológica suprimida. Utilizando un anticuerpo antagonista específico para el receptor activador LIR o una forma soluble del receptor, pueden usarse para bloquear la interacción del receptor activador con él ligando del receptor para regular en forma productora la señalización activadora.

Ya que LIR-P3G2 se enlaza con diferentes células, LIR-P3G2 puede ser utilizado para purificar o aislar a estas células de las preparaciones heterogéneas. Adicionalmente, las sondas P3G2 pueden ser utilizadas para aislar e identificar moléculas relacionadas.

Los péptidos LIR de la presente invención pueden ser utilizados en el desarrollo de tratamientos para cualquier mediado directa o indirectamente por cantidades anormales o insuficientes de cualquiera de los péptidos LIR. Una cantidad terapéuticamente efectiva de proteína purificada LIR se administra a un paciente afligido con tal desorden. Alternativamente, el ADN del LIR puede ser empleado el desarrollo de una aproximación de terapia génica para tratar tales desórdenes. La revelación que se hace aquí de la secuencia nativa de nucleótidos LIR, permite la detección de genes defectuosos LIR, y el reemplazo de los mismos con genes que codifican a un LIR normal. Los genes defectuosos pueden detectarse en ensayos diagnósticos in vitro, y por medio de la comparación de la secuencia nativa de nucleótidos LIR revelada aquí con aquella de un gen LIR derivado de una persona que se sospecha que alberga un defecto en el gen.

La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que pueden incluir a un polipéptido LIR, o fragmentos o variantes del mismo como un vehículo o diluyente fisiológicamente aceptable. Tales vehículos y diluyentes serán no tóxicos para los usuarios en las dosis y concentraciones empleadas. Tales composiciones pueden incluir además búferes, antioxidantes tales como el ácido ascórbico, polipéptidos de bajo peso molecular (aproximadamente con menos de 10 residuos), proteínas, aminoácidos, carbohidratos incluida glucosa, sacarosa o dextrinas, agentes quelantes tales como EDTA, glutationa y otros estabilizadores y excipientes comúnmente utilizados en composiciones farmacéuticas. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser formuladas como un liofilizado utilizando soluciones excipientes apropiadas como diluyentes. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir un polipéptido LIR en cualquiera de las formas descritas aquí, incluyendo pero no limitándose a, variantes activas, fragmentos, y oligómeros. Los polipéptidos LIR pueden ser formulados de acuerdo a métodos conocidos que son utilizados para preparar composiciones farmacéuticamente útiles. Los componentes que son comúnmente empleados en formulaciones farmacéuticas incluyen a aquellas descritas en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16^{ava} edición (Mack Publishing Company, Easton, PA, 1980).

Las preparaciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser administradas a un paciente, preferiblemente humano, en una forma apropiada de acuerdo con la indicación. Así, por ejemplo, las composiciones pueden ser administradas por medio de una inyección intravenosa, administración local, infusión continúa, liberación sostenida desde un implante, etc. Las dosis apropiadas y la frecuencia en la administración dependerá de factores tales como la naturaleza y la severidad de la indicación que está siendo tratada, de la respuesta deseada, la condición del paciente, etc.

En las modalidades preferidas un polipéptido LIR utilizado en las composiciones farmacéuticas de la presente invención se purifica de tal manera que el polipéptido LIR está sustancialmente libre de otras proteínas de origen natural o endógeno, conteniendo deseablemente aproximadamente menos del 1% en peso de residuos contaminantes de proteína de los procesos de producción. Tales composiciones, sin embargo pueden contener otras proteínas añadidas como estabilizadores, vehículos, excipientes o terapéuticos conjuntos.

Los ADN que codifican a los LIR y los fragmentos de ADN revelados aquí, encuentran uso en la producción de polipéptidos LIR, como se describió antes. En una modalidad, tales fragmentos comprenden al menos aproximadamente 17 nucleótidos consecutivos, más preferiblemente al menos 30 nucleótidos consecutivos, de ADN del LIR. Los complementos de ADN y ARN de los fragmentos tienen utilidad similar. Entre los usos de los fragmentos de ácido nucleico de LIR están los de sondas o cebadores en las reacciones en cadena de la polimerasa. Por ejemplo, una sonda correspondiente a un fragmento de ADN que codifican al dominio extracelular de LIR, puede ser empleada para detectar la presencia de hacerlo créditos de LIR en ensayos in vitro y en otros ensayos de prueba tales como los ensayos Northern Blot y Southern Blot. Los tipos de células que expresan a un polipéptido LIR pueden ser identificadas utilizando sondas de ácido nucleico de la familia del LIR, utilizando procedimientos de prueba bien conocidos en el estado de la técnica. Aquellos capacitados en el arte tienen conocimiento para escoger una sonda de longitud adecuada y aplicar técnicas PCR convencionales para aislar y amplificar una secuencia de ADN.

Los fragmentos de ácido nucleico pueden ser usados también como una sonda en los procedimientos cruzados de hibridación de especies para aislar ADN del LIR de otras especies de mamíferos. Como ejemplo, pueden emplearse una sonda correspondiente al dominio extracelular de un polipéptido LIR. Las sondas pueden ser marcadas por medio de técnicas convencionales (por ejemplo, con ^{32}P).

Otros fragmentos útiles de ácidos nucleicos de LIR son oligonucleótidos sentido o antisentido, que pueden incluir ya sea ARN o ADN, y que corresponden en secuencia a una ARNm de LIR (sentido), para el complemento de un ARNm de LIR (antisentido), o para la cadena que no codifica de un ADN de LIR bicatenario, tal como el ADN de P3G2 (antisentido). Así, un oligonucleótido antisentido formará un híbrido doble con una secuencia de ARNm. Tales oligonucleótidos generalmente tienen al menos 14 nucleótidos, y preferiblemente tienen aproximadamente entre 14 y 30 nucleótidos. La capacidad para crear un oligonucleótido antisentido o sentido con base en una secuencia de ADNc para una proteína dada, se describe en, por ejemplo, Stein y Cohen, Cancer Res. 48: 2659, 1988 y van der Krol y colaboradores, Bio Techniques 6:958, 1988.

El enlazamiento de oligonucleótidos antisentido o sentido a secuencias de ácido nucleico objetivo, resulta en la formación de dobletes que bloquean la traducción (ARN) o la transcripción (ADN) por uno de diferentes medios, incluida la degradación potenciada de los dobletes, la terminación prematura de la transcripción o la traducción, o por otros medios. Estos oligonucleótidos pueden ser utilizados así para bloquear la expresión del LIR.

En una modalidad los oligonucleótidos LIR antisentido o sentido utilizados en los procedimientos de enlazamiento pueden abarcar oligonucleótidos que tienen columnas vertebrales modificadas azúcar-fosfodiéster (u otros enlaces con azúcar, tales como aquellos descritos en WO 91/06629) y en donde los enlaces con azúcar son resistentes a las nucleasas endógenas. Los oligonucleótidos que tienen enlaces con azúcar resistentes a las nucleasas endógenas son estables in vivo (esto es como capaces de resistir degradación enzimática) pero retienen la especificidad de la secuencia al ser capaces de enlazarse a secuencias de nucleótidos objetivo. Otros ejemplos de oligonucleótidos sentido o antisentido incluyen a aquellos oligonucleótidos que están covalentemente enlazados a fracciones orgánicas, tales como aquellos descritos en WO 90/10448, y otras fracciones que incrementan la afinidad del oligonucleótido por una secuencia de ácido nucleico objetivo, tal como poli-(L-lisina). Aún más, los agentes de intercalación, tales como la elipticina, y agentes de alquilación o complejos metálicos, pueden unirse a los oligonucleótidos sentido o antisentido para modificar las especificaciones del enlazamiento del oligonucleótido antisentido o sentido para la secuencia de nucleótidos objetivo.

Los oligonucleótidos antisentido o sentido puede ser introducidos en una célula que contenga la secuencia de ácido nucleico objetivo por cualquier método de transferencia génica, que incluye, por ejemplo, transfección de ADN mediada por CaPO_{4}, electroporación, o por medio del uso de vectores de transferencia génica tales como el virus de Epstein-Barr. Los oligonucleótidos antisentido o sentido se introducen preferiblemente en una célula que contenga la secuencia de ácido nucleico objetivo por medio de la inserción del oligonucleótido antisentido o sentido dentro de un vector retroviral adecuado, poniendo el contacto luego a la célula con el vector retroviral que contiene a la secuencia insertada, ya sea in vivo o ex vivo. Los vectores retrovirales adecuados incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados del retrovirus de murino M-MuLV, N2 (un retrovirus derivado de M-MuLV), o los vectores de copia doble designados como DCT5A, DCT5B y DCT5C (ver solicitud PCT US 90/02656).

Los oligonucleótidos sentido o antisentido pueden también introducirse en células que contienen la secuencia de nucleótidos objetivo por medio de la formación de un conjugado con una molécula ligando de enlazamiento, como se describe en WO 91/04753. Las moléculas ligando de enlazamiento adecuadas incluyen, pero no se limitan a, receptores de la superficie de la célula, factores de crecimiento, otras citoquinas, u otros ligandos que se enlazan a los receptores de la superficie de la célula. Preferiblemente, la conjugación de la molécula ligando de enlazamiento no interfiere sustancialmente con la capacidad de la molécula ligando de enlazamiento para enlazar molécula o receptor correspondiente, o bloquear la entrada del oligonucleótido sentido o antisentido o su versión conjugada dentro de la célula.

Alternativamente, un oligonucleótido sentido o antisentido puede ser introducido dentro de una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico objetivo por medio de la formación de un complejo oligonucleótido-lípido, como se describe en WO 90/10448. El complejo oligonucleótido-lípido sentido o antisentido se disocia preferiblemente dentro de la célula por medio de una lipasa endógena.

En aún otro aspecto, la presente inversión provee anticuerpos que enlazan específicamente polipéptidos LIR, esto es, anticuerpos que se enlazan a polipéptidos LIR a través de un sitio de enlazamiento con el antígeno del anticuerpo (en forma opuesta a un enlazamiento no específico). Los anticuerpos de la presente inversión pueden generarse utilizando polipéptidos LIR o fragmentos inmunogénicos de los mismos. Los anticuerpos policlonales y monoclonales pueden ser preparados por medio de técnicas convencionales. Ver, por ejemplo, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet y colaboradores (eds.), Plenum Press, New York 1980; y Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988. Un ejemplo de un procedimiento para producir anticuerpos monoclonales inmunoreactivos con P3G2-LIR es ilustrado además en el Ejemplo 5 más adelante.

Incluidos dentro del alcance de la presente invención están los fragmentos de enlazamiento de antígeno de los anticuerpos que se enlazan específicamente a un polipéptido LIR. Tales fragmentos incluyen, pero no se limitan a, Fab, F(ab'), y F(ab')_{2}. Las variantes del anticuerpo y los derivados producidos por técnicas de ingenierota genética están contempladas dentro de la presente invención.

Los anticuerpos monoclonales de la presente invención incluyen anticuerpos quiméricos, por ejemplo, versiones humanizadas de anticuerpos monoclonales de murino. Tales anticuerpos pueden prepararse por medio de técnicas conocidas y ofrecen la ventaja de una inmunogenicidad reducida cuando los anticuerpos se administran a humanos. En una modalidad, un anticuerpo monoclonal humanizado comprende la región variable de un anticuerpo de murino (o justamente el sitio de enlazamiento del antígeno del mismo) y una región constante derivada de un anticuerpo humano. Alternativamente, un fragmento de anticuerpo humanizado puede comprender al sitio de enlazamiento del antígeno de un anticuerpo monoclonal de murino y un fragmento de región variable (carece del sitio de enlazamiento de antígeno) derivado de un anticuerpo humano. Los procedimientos para la producción de anticuerpos monoclonales quiméricos y además modificados genéticamente incluyen a aquellos descritos en Riechmann y colaboradores, Nature 332:232, 1988; Lie y colaboradores. PNAS 84:3439, 1987; Larrick y colaboradores. Bio/Technology 7:934, 1989; y Winter y Harris TIPS 14:139, 1993.

Como se mencionó antes, los anticuerpos de la presente invención son útiles en ensayos in vitro o in vivo para detectar la presencia de polipéptidos LIR y en la purificación de un polipéptido LIR por medio de cromatografía de afinidad.

Adicionalmente, los anticuerpos capaces de bloquear a un LIR de enlazarse a células objetivo pueden ser usados para inhibir una actividad biológica de un polipéptido LIR. Más específicamente, las composiciones terapéuticas de un anticuerpo antagonista a uno o más miembros de la familia del LIR que tienen al motivo ITIM, pueden administrarse a un individuo con el propósito de bloquear la interacción de una LIR de la superficie de la célula con su ligando. El resultado es una activación de una función inmune y es particularmente benéfica en estados de enfermedad en los cuales el sistema inmunológico es hiposensible o está suprimido. Contrariamente, las composiciones terapéuticas de un anticuerpo antagonista a uno o más miembros de la familia del LIR que carece del motivo ITIM, pueden ser utilizadas para obtener el efecto opuesto y ser benéficos en estados de enfermedad en los cuales el sistema inmunológico es hiperactivo y está presente una inflamación excesiva o inmunopatología.

Las composiciones farmacéuticas que incluyen al menos un anticuerpo que es inmunorreactivo con un polipéptido LIR y un diluyente, excipiente o vehículo apropiado, están consideradas dentro de la presente invención. Los diluyentes, excipientes y vehículos apropiados están descritos en el contexto de composiciones farmacéuticas que incluyen polipéptidos de la presente invención.

Se incluyen los siguientes ejemplos para ilustrar ciertas modalidades de la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Aislamiento y Expresión de Proteína Viral

El ADN que codifica al polipéptido P3G2 de la presente invención fue identificado por medio de aislamiento y expresión de una glicoproteína viral, UL18, conocida por expresarse sobre células infectadas con HCMV, y luego la expresión y el uso de una proteína de fusión UL18/Fc para buscar receptores para UL18. El ADN que codifica a UL18 y su secuencia de aminoácidos son conocidos y se describen en Beck, S., B.G. Barrell, Nature 331:269-272, 1988. A continuación se describe el aislamiento de UL18 y la preparación de la proteína de fusión UL18/Fc.

Utilizando técnicas estándar, se aisló el ARN total de Fibroblastos de Prepucio Humano infectados con HCMV (AD169) en tres diferentes etapas de transcripción-inmediata temprana (IE, 8 p.i.h.), temprana (24 p.i.h.) y tardía (48 p.i.h.). Debido a que UL18 es conocido por ser transcrito temprano en la infección, el ARN total IE fue poliA + seleccionado y utilizado para construir una genoteca de ADNc HCMV-IE utilizando un kit de ADNc de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Pharmacia TIME SAVER cDNA Kit). Con el propósito de aislar la longitud completa del gen UL18, se sintetizaron dos cebadores oligonucleótidos conocidos por incluir las secuencias terminales del gen UL18, y se usaron para aislar y amplificar al gen UL18 de la genoteca de ADNc HCMV-IE. Los cebadores tenían las siguientes secuencias e incluían sitios de restricción Not I que se incorporan dentro del producto PCR:

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\hskip3.4cm

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Las condiciones de la PCR incluyeron un ciclo de 5 minutos a 95ºC seguido por 30 ciclos de 45 segundos a 95ºC, 45 segundos a 58ºC y 45 segundos a 72ºC, y luego un ciclo de 5 minutos a 72ºC. El producto de la PCR fue sometido a electroforesis en gel de agarosa al 1% y medido utilizando bromuro de etidio para visualizar los productos ADN separados. Se confirmo la presencia de ADN que tenía el tamaño esperado aproximadamente 1,1 kb.

El vector de expresión pDC409, un vector derivado de pDC406 (McMahan y colaboradores, EMBO J. 10:2821, 1991) pero teniendo un sitio único Bgl II, se seleccionó por el proceso de clonación. El producto de la PCR fue subclonado dentro de un vector de expresión pDC409 a través de los sitios Not I, secuenciado y la secuencia de aminoácidos deducida a partir de la secuencia de ADN. La secuencia determinada de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos fueron idénticas a las secuencias previamente publicadas (ibid.).

Una proteína de fusión de la región extracelular de UL18 y una región IgG1 Fc de muteina humana (UL18:Fc) se preparó aislando primero al ADNc que codifica a la región extracelular de UL18 utilizando cebadores que flanquean a la región extracelular de UL18. Los cebadores se sintetizaron con los sitios de restricción Sal I y BgI II insertados en los terminales 5' y 3' de modo que el ADNc amplificado por PCR introdujo a los sitios de restricción Sal I y BgI II en los extremos 5' y 3', respectivamente. Los cebadores tenían las siguientes secuencias.

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Las condiciones para la reacción PCR fueron como se describió antes excepto porque el molde fue el gen de longitud completa como se acaba de describir.

Para preparar una construcción de un vector para expresar una proteína de fusión, sUL18:Fc, para utilizarlo en estudios de enlazamiento celular, un fragmento de ADN que codifica a la región Fc de un anticuerpo IgG1 humano, fue aislado de un plásmido utilizando a las enzimas de restricción Bgl II y Not I. La porción Fc codificada fue la muteina Fc descrita en la patente estadounidense 5.457.035 que tiene afinidad reducida por receptores de inmunoglobulina. El sitio Bgl II sobre el gen sUL18 fue utilizado para ligar el ADN del gen sUL18 al sitio Bgl II sobre el gen Fc para formar una construcción de ADN de fusión sLTL18:Fc que tiene un sitio de restricción Sal I N-terminal y un sitio de restricción Not I C-terminal. Esta construcción ADN de fusión sUL18:Fc fue ligada entonces dentro del vector de expresión pDC409 en sus sitios Sal I y Not I para formar una construcción de ADN 409/sUL18/Fc.

La línea celular de mono COS-1 (ATCC CRL-1650) fue utilizada para confirmar la expresión de la proteína de fusión. Las células COS-1 fueron transfectadas en placas de 6 pozos ( 2 X 10^{5} células por pozo) aproximadamente con 2 mg de la construcción de ADN 409/sUL18/Fc por pozo. Las células fueron cultivadas durante 2-3 días en FBSDMEM/F12 al 5% disponible con GIBCO), luego lavado dos veces con PBS, mantenidas en ayuno durante 1 hora en RPMI agotada en cisteina/metionina (disponible con GIBCO como RPMI 1640) y marcada metabólicamente con 100 mCi/mL de 35S-Met/Cys durante 4 horas. Se aclaró el sobrenadante para remover las células perdidas y se incubaron 150 \muL del sobrenadante con 100 \muL de RIPA (Tween 20 al 0.05%, SDS al 0.1%, Triton X-100 al 1%, desoxicolato al 0.5% en PBS) búfer y 50 \muL de cuentas de Sefarosa como soporte sólido para Proteína-A al 50% a 4ºC durante 1 horas. La proteína A-Sefarosa es un soporte sólido de Sefarosa (disponible con Pharmacia) que tiene Proteína A inmobilizada que enlaza a la porción Fc de la proteína de fusión. Después de lavar el soporte sólido con RIPA para remover el material no enlazado, se eluyó la proteína de fusión enlazada al soporte sólido Proteína A-Sefarosa a partir de la Proteína A-Sefarosa utilizando 35 \muL de búfer de reducción de muestra SDS -PAGE y luego se calentó a 100ºC durante 5 minutos. Se sometió el eluyente a electroforesis sobre un gel en gradiente de poliacrilamida SDS al 4-20% con marcadores con peso molecular de proteína marcados con ^{14}C. Después de la electroforesis, el gel fue fijado con ácido acético al 8% y mejorado a temperatura ambiente durante 20 minutos con un Amplificador de Amersham. Después de secar el gel al vacío, se lo expuso a una película de rayos X. El análisis de la película confirmó que la proteína esperada se expresó, una proteína de 100-120 kDa que incluye a la región Fc de muteina de IgG y dominios extracelulares de UL18 fusionados a la Fc.

Una vez que las células que expresan a la proteína de fusión fueron identificadas, se cultivaron a gran escala células transfectadas para acumular sobrenadante de las células que expresan a la proteína de fusión. Este procedimiento involucró la transfección de células COS-1 en frascos T175 con 15 mg del ADN de fusión UL18/Fc/409 por frascos. Después de 7 días de cultivo en un medio que contenía suero bovino bajo en inmunoglobulina al 0.5%, se añadió una solución de azida al 0.2% al sobrenadante y éste fue filtrado a través de un filtro de 0.22 mm. Luego, se pasó aproximadamente 1 L de cultivo sobrenadante a través de un sistema BioCad Protein A de purificación de proteína por HPLC, utilizando una columna Protein A de 4.6 x 100 mm (POROS 20A de PerSeptive Biosystems) a10 mL/min. La columna Protein A enlaza a la porción Fc de la proteína de fusión sUL18/Fc en el sobrenadante, inmovilizando a la proteína de fusión y permitiéndole a otros componentes del sobrenadante pasar a través de la columna. La columna fue lavada con 30 mL de solución PBS y la sUL18/Fc enlazada fue eluida de la columna de HPLC con ácido cítrico ajustado a un pH 3.0. La sUL18/Fc purificada y eluida fue neutralizada en la medida en que era eluida utilizando una solución Hepes 1 M a pH 7.4. La proteína eluida reunida fue analizada utilizando SDS PAGE con coloración de plata, confirmando la expresión de la proteína de fusión UL18/Fc de100-120 kDa.

Ejemplo 2 Muestreo de líneas celulares por enlazamiento a UL18

La proteína sUL18/Fc aislada como se describió el Ejemplo 1 fue utilizada para muestrear líneas celulares a las cuales se enlaza utilizando estudios cuantitativos del lanzamiento de acuerdo a metodologías estándar de citometría de flujo. Para cada línea celular muestreada, el procedimiento involucró la incubación aproximada de 100.000 de las células bloqueadas con FCS al 2% (suero fetal de ternera), suero normal de cabra al 5% y suero de conejo al 5% en PBS durante1 hora. Luego fueron incubadas las células bloqueadas con 5 \mug/mL de proteína de fusión sUL18/Fc en FCS al 2%, suero de cabra al 5% y suero de conejo al 5% en PBS. Después de la incubación, se lavó la muestra 2 veces con búfer FACS (FCS al 2% en PBS) y luego se trató con Fc/biotina antihumana de ratón (adquirida a Jackson Research) y SAPE (estreptavidina-ficoeritrina adquirida a Molecular Probes). Este tratamiento causa que la Fc/biotina antihumana se enlace a cualquier sUL18/Fc enlazada y que la SAPE se enlace a la Fc/biotina antihumana resultando en una marca de identificación fluorescente sobre la sUL18/Fc que está enlazada a las células. Las células fueron analizadas para cualquier proteína enlazada utilizando detección de fluorescencia por citometría de flujo. Los resultados indicaron que UL18 se enlaza bien a las líneas de células B CB23, RAJI y MP-1; a las líneas celulares monocíticas Thp-1 y U937; y a las células primarias B y a los monocitos primarios. UL18 no se enlaza en forma detectable a las líneas de células T, ni tampoco lo hace con las células T primarias.

Ejemplo 3 Aislamiento de ADNc de P3G2 y del Polipéptido

A continuación se escribe el muestreo de ADNc de una de las líneas celulares que se encontró que enlaza UL18 y el aislamiento de un nuevo polipéptido expresado por la línea celular. Se obtuvo una genoteca de ADNc de CB23 en el vector de expresión de mamífero pDC406, preparada como se describe en la patente estadounidense No. 5.350.683, y se aisló el ADN del plásmido a partir de los reservorios que consistían aproximadamente de 2000 clones por reservorio. El ADN aislado fue transfectado en células CV1-EBNA (ATCC CRL 10478) utilizando DEAE-dextrano seguido por tratamiento con cloroquina. Las células CV1-EBNA fueron mantenidas en medio completo (medio de Eagles modificado de Dulbecco que contenía suero fetal de ternera al 10% (v/v), 50 U/mL de penicilina, 50 U/mL de estreptomicina, y L-glutamina 2 mM) y se sembró en placas con una densidad aproximada de 2 x 10^{5} células/pozo en laminas portaobjeto con cámara de un solo pozo. Las láminas portaobjeto habían sido previamente tratadas con 1 mL de una solución de 10 \mug/mL de fibronectina humana en PBS durante 30 minutos seguido de un lavado sencillo con PBS. El medio fue removido de las células adheridas que crecieron en una capa y se lo reemplazó con 1,5 mL de medio completo que contenía sulfato de cloroquina 66,6 \muM. Se añadieron aproximadamente 0,2 mL de una solución de ADN (2 \mug de ADN, 0,5 mg/mL de DEAE-dextrano en medio completo que contenía cloroquina) a las células y se incubó la mezcla a 37ºC aproximadamente durante cinco horas. Después de la incubación, se removió el medio y las células fueron chocadas por medio de la adición de medio completo que contenía DMSO al 10% (dimetilsulfóxido) durante 2,5 minutos. El choque fue seguido por el reemplazo de la solución con medio completo fresco y las células fueron cultivadas en medio de cultivo durante dos o tres días para permitir la expresión transitoria de las secuencias insertadas de ADN. Estas condiciones condujeron a una frecuencia de transfección entre el 30% y el 80% en células sobrevivientes CV1-EBNA.

Cada lámina portaobjetos fue incubada con 1 mL de UL18:Fc a una concentración de 1 \mug/mL en búfer de enlazamiento (RPMI 1640 que contenía 25 mg/mL de albúmina de suero bovino, 2 mg/mL de azida de sodio, Hepes 20 mM a pH 7,2, y 50 mg/mL de leche seca libre de grasa) a temperatura ambiente durante 1 hora. Las láminas portaobjeto incubadas fueron lavadas con el búfer de en lanzamiento y luego incubadas con IgG antihumano de ratón ^{125}I específico para Fc (ver Goodwin y colaboradores, Cell 73:447-456, 1993). Esto fue seguido por un segundo lavado con búfer después de lo cual las láminas portaobjeto fueron fijadas con una solución de glutaraldehido/PBS al 2,5%, lavadas con solución PBS, y se les permitió secarse al aire. Las láminas portaobjeto secas fueron sumergidas en emulsión fotográfica GTNB-2 de Kodak (6x dilución en agua). Después del secado al aire, las láminas portaobjeto fueron colocadas en una caja oscura y refrigeradas. Después de tres días, las láminas portaobjeto se desarrollaron en revelador D19 de Kodak, se enjuagaron en agua y se fijaron en fijador G433C de Agfa. Las láminas portaobjeto fijadas fueron examinadas individualmente bajo un microscopio a 25-40x de magnificación. Las células positivas que demostraron enlazamiento de sUL18:Fc fueron visualizadas por medio de la presencia de granos en plata autorradiográficos contra el fondo de la película. Se identificaron dos reservorios positivos. Los clones bacteriales de cada reservorio, fueron titulados y sembrados en placa para proveer placas que contenía aproximadamente 200 colonias cada una. Cada placa fue raspada para proveer reservorios de ADN de plásmido para transfección en células CV1-EBNA y muestreadas como se describió anteriormente. Después de subsiguientes interrupciones y muestreos, se obtuvieron dos colonias positivas individuales. Los insertos de ADNc de los dos clones positivos fueron nucleótidos de 2922 y 2777 de longitud como se determinó por medio de las secuencias automatizadas de ADN. Las regiones de codificación de los dos insertos, designadas como P3G2 y 18A3 fueron de 1953 (nucleótidos 310-2262) y 1959 (nucleótidos 168-2126) nucleótidos, respectivamente. Los dos clones de ADNc codifican proteínas que son sustancialmente similares y probablemente representan a diferentes alelos del mismo gen.

La secuencia de ADNc y el aminoácido codificado de P3G2 se presentan en las SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2, respectivamente. La secuencia de ADNc y el alumno ha sido codificado de 18A3 se presentan en las SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de P3G2 (SEQ ID NO:2) tiene un péptido señal predicho de 16 aminoácidos (aminoácidos 1-16); un dominio extracelular de 442 aminoácidos (aminoácidos 17-458); un dominio transmembrana de 25 aminoácidos (aminoácidos 459-483) y, un dominio citoplasmático de 167 aminoácidos (aminoácidos 484- 650). El dominio extracelular incluye cuatro dominios como los de la inmunoglobulina. El dominio como el de Ig incluye aproximadamente 17- 118 aminoácidos; el dominio II como el de Ig incluye aproximadamente 119- 220 aminoácidos; el dominio III como el de Ig incluye aproximadamente 221- 318 aminoácidos; y el dominio IV como el de Ig incluye aproximadamente 319- 419 aminoácidos; significativamente, el dominio citoplasmático de este polipéptido incluye cuatro motivos ITIM, cada uno teniendo la secuencia de consenso de YxxL/V. El primer par de motivos TTIM se encuentra en los aminoácidos 533- 536 y 562- 565, y el segundo par se encuentra en los aminoácidos 614- 617 y 644- 647. La secuencia de aminoácidos de 18A3 es casi idéntica, teniendo las características descritas anteriormente.

Las características de estos polipéptidos codificados son consistentes con una glicoproteína transmembrana tipo I.

Ejemplo 4 Preparación de la Proteína de Fusión P3G2

A continuación se describen los procedimientos utilizados para generar una proteína de fusión P3G2 que fue utilizada entonces para identificar líneas de células a las cuales se enlaza, y finalmente aislar un ligando normal P3G2 de la superficie de la célula, que es distinto de UL18. Se preparó una proteína de fusión de la región extracelular de P3G2 y de la región Fc humana de muteina (sP3G2:Fc) aislando primero el ADNc que codifica a la región extracelular de P3G2 utilizando cebadores que flanquean a la región extracelular de P3G2. Los cebadores fueron sintetizados con los sitios de restricción Sal I y Bgl II insertados en los terminales 5' y 3' de modo que el ADNc amplificado por PCR introdujo los sitios de restricción Sal I y Bgl II en los extremos 5' y 3', respectivamente. Los cebadores tenían las siguientes secuencias:

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Las condiciones para la reacción por PCR fueron como se describió anteriormente, y el molde fue el gen P3G2 de longitud completa aislado como se describió en el Ejemplo 3 más arriba.

Para preparar una construcción de un vector para expresar a la proteína de fusión sP3G2:Fc un para ser usada en estudios de enlazamiento, se cortó a la región Fc de muteina humana de IgG1 del plásmido descrito anteriormente en el Ejemplo 1 utilizando a las enzimas de restricción Bgl II y Not I. Se utilizó al sitio Bgl II sobre gen P3G2 para ligar al ADN del gen sP3G2 al sitio Bgl II sobre el gen Fc de muteina humana para formar una construcción de ADN de fusión sP3G2/Fc que tiene un sitio de restricción Sal I N-terminal y un sitios restricción Not I Terminal. Esta construcción de ADN de fusión sP3G2:Fc fue ligada entonces dentro de un vector de expresión pDC409 a sus sitios Sal I y Not I para formar una construcción de ADN de 409/sP3G2/Fc.

La línea celular de mono COS-1 (ATCC CTL-1650) fue utilizada para confirmar la expresión de la proteína de fusión. Las células COS-1 fueron transfectadas a placas de 6 pozos (2 x 10^{5} células por pozo) con aproximadamente 2 \mug de la construcción de ADN 409/sP3G2/Fc por pozo. Las células fueron cultivadas en FBS/DMEM/F12 al 5% (disponible con GIBCO) y el día dos o tres después de la transfección, las células fueron mantenidas en ayuno durante 1 hora en RPMI agotada en cisteina/metionina y las células transfectadas fueron marcadas metabólicamente con 100 \muCi/mL de ^{35}S-Met/Cys durante cuatro horas.

Se aclaró el sobrenadante para remover las células perdidas y los residuos y se incubaron 150 \muL del sobrenadante con 100 \muL de búfer RIPA y 50 \muL de cuentas de Sefarosa como soporte sólido para Proteína-A al 50% a 4ºC durante 1 hora. Después de lavar el soporte sólido con RIPA para remover el material no enlazado, se eluyó la proteína de fusión enlazada al soporte sólido Proteína A-Sefarosa a partir de la Proteína A-Sefarosa utilizando 30 \muL de búfer de reducción de muestra SDS -PAGE y luego se calentó a 100ºC durante 5 minutos. Se sometió el eluyente a electroforesis sobre un gel en gradiente de poliacrilamida SDS al 4-20% con marcadores con peso molecular de proteína marcados con ^{14}C. Después de la electroforesis, el gel fue fijado con ácido acético al 8% y mejorado a temperatura ambiente durante 20 minutos con un Amplificador de Amersham. Después de secar el gel al vacío, se lo expuso a una película de rayos X. El análisis de la película confirmó que la proteína esperada se expresó, teniendo un peso molecular de 100-120 kDa.

Una vez que se verificó la expresión de la proteína de fusión, se cultivaron a gran escala células transfectadas para acumular sobrenadante de las células COS-1 que expresan a la proteína de fusión como se describió en el Ejemplo 1 más arriba. La proteína de fusión P3G2 fue purificada de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 3 más arriba utilizando el sistema BioCad y la columna POROS 20A de PerSeptive Biosystems. La proteína eluida reunida fue analizada utilizando SDS PAGE con coloración de plata, confirmando la expresión.

Ejemplo 5 Generación del Anticuerpo LIR-P3G2

El siguiente ejemplo describe la generación del anticuerpo monoclonal para P3G2 que fue utilizado en el análisis por citometría de flujo para identificar células sobre las cuales se expresa P3G2. La proteína de fusión purificada P3G2/Fc se preparó por medio de la expresión de células COS-1 y purificación por afinidad como se describió el Ejemplo 4. La proteína purificada o las células transfectadas con un vector de expresión que codifica a la proteína de longitud completa, puede generar anticuerpos monoclonales contra P3G2 utilizando técnicas convencionales, por ejemplo aquellas técnicas descritas en la patente estadounidense No. 4.411.993. En resumen, los ratones BALB-C fueron inmunizados en las semanas 0, 2 y 6 con 10 \mug de P3G2/Fc. La inmunización primaria fue preparada con adyuvante TITERMAX, de Vaxcell, Inc., y la inmunización posterior se preparó con adyuvante incompleto de Freund (IFA). A las 11 semanas, los ratones recibieron estimulo IV con 3-4 \mug de P3G2 en PBS. Tres días después, los esplenocitos con estímulo IV fueron recogidos y fusionados con un compañero de fusión del mieloma Ag8.653 usando una solución acuosa PEG 1500 al 50%. Los hibridomas sobrenadantes fueron muestreados por medio de ELISA utilizando células COS-1 transfectadas con P3G2 en PBS a razón de 2 x 10^{3} células por pozo, y secadas para las placas de microtitulación en poliestireno de 96 pozos como el antígeno para recubrimiento de la placa. Los sobrenadantes positivos fueron confirmados posteriormente por medio del análisis FACS y RIP, utilizando células COS-1 transfectadas con P3G2. Los hibridomas fueron clonados y observados utilizando los mismos análisis. Los cultivos monoclonales fueron expandidos y los sobrenadantes purificados por medio de cromatografía de afinidad utilizando agarosa con Proteína A de BioRad.

Los anticuerpos monoclonales para P3G2/Fc fueron utilizados para muestrear células y líneas celulares utilizando procedimientos estándar de citometría de flujo para identificar células sobre las cuales se expresa P3G2. Las líneas celulares y las células muestreadas en los análisis de citometría de flujo fueron CB23, CB39, RAJI, AK778, K299, PS-1, U937, THP-1, JURKAT y HSB2. Para cada línea celular o muestra celular muestreada, el procedimiento implicó la incubación de aproximadamente 100.000 de las células bloqueadas con FCS al 2% (suero fetal de ternera), suero normal de Cabra al 5% y suero de conejo al 5% en PBS con 5 \mug de anticuerpo anti-P3G2 de ratón conjugado con FITC durante 1 hora. Después de la incubación, la muestra fue lavar a 2 veces con búfer FACS (FCS al 2% en PBS). Las células fueron analizadas por cualquier proteína enlazada utilizando detección fluorescente por citometría de flujo para detectar FITC. Los resultados indicaron que el anticuerpo LIR-P3G2 se enlaza bien con las líneas de células B, CB23 y RAJI1; las líneas celulares monocíticas THP-1 y U937; y las células primarias B y los monocitos primarios. La expresión más alta de LIR-P3G2 se mostró sobre monocitos que se colorearon en forma más brillante para CD16 y en forma menos brillante para CD14 y CD64. El anticuerpo no enlaza en forma detectable a las líneas celulares T ni tampoco en forma detectable a las células primarias T.

En un experimento relacionado, el anticuerpo P3G2 generado como se describió antes, fue utilizado en experimentos de inmunoprecipitación. Los análisis de inmunoprecipitación involucraron primero a la superficie de biotinilación de 2,5 x 10^{6} monocitos por medio del lavado de las células con PBS y suspendiendo las células en un búfer de biotinilación de borato de sodio 10 mM y NaCl 150 mM a pH 8,8, seguido por la adición de 5 \muL de una solución de 10 mg/mL de boitin-CNHS-éster (Éster D-biotinoil-e-ácido aminocapróico-N-hidroxisuccinimida adquirido a Amersham) en DMSO para las células. Después de apagar la reacción con 10 \muL de cloruro de amonio 1 M por 1 mL de células, y lavar las células en PBS, las células fueron lisadas en 1 mL de NP40-PBS al 0,5% y el lisado fue recuperado después de centrifugación. Luego se añadieron 100 \muL de NP40-PBS al 0,5% a 150 \muL del lisado y la mezcla resultante se incubó con 2 \mug/mL de anticuerpo, a 4ºC durante 16 horas. Se añadieron cincuenta microlitros de suspensión de Proteína A-Sefarosa al 50% a la mezcla de anticuerpo y se agitó la suspensión a 4ºC durante 1 hora. Se centrifugó la suspensión y el precipitado resultante se lavó con 0,75 ml de NP40 en PBS al 0,5% seis veces. La proteína enlazada a la Proteína A-Sefarosa fue eluida con 30 \muL de búfer de reducción de muestra SDS-PAGE y calentado a 100ºC durante cinco minutos.

Las proteínas eluidas fueron analizadas utilizando un SDS-PAGE en un gradiente de 4-20% con marcadores de proteína con quimioluminiscencia mejorada (ECL). Luego, las muestras sometidas a electroforesis fueron transferidas en un Western Blot sobre membranas de celulosa. Las membranas fueron tratadas con reactivo de bloqueo (Tween-20 al 0,1% y leche seca libre grasa al 3% en PBS) durante una hora a temperatura ambiente luego fueron lavadas una vez durante 15 minutos y dos veces durante 5 minutos con Tween-20 al 0,1% en PBS. Las membranas lavadas se incubaron con 10 mL de HRP-Estreptavidina 1:100 durante 30 minutos y luego lavadas 1 vez durante 15 minutos, seguido por 4 veces durante 5 minutos con Tween-20 al 0,1% en PBS.

La estreptavidina HRP enlazada fue detectada con ECL Detection Reagents adquirido a Amersham y utilizado de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las membranas desarrolladas fueron expuestas a una película de rayos X y luego visualizadas. Los resultados mostraron que LIR-P3G2 se inmunoprecipitó de las células CB23 y de las células COS-1 transfectadas de P3G2, indicando que P3G2 se expresa por medio de estas células.

Ejemplo 6 Muestreo de Células y de Líneas Celulares para el Enlazamiento a P3G2

A continuación se describen los análisis por citometría de flujo utilizados para identificar células y líneas celulares que enlazan a P3G2. Las células y las líneas celulares analizadas fueron CB23, HSB2, MP-1, Jurkat, células T primarias, células B primarias, y células NK primarias. Por cada línea celular o línea celular probada, el procedimiento involucró el lavado de las células tres veces con búfer FACS (FCS al 2% en PBS con azida al 0,2%) y la incubación de cada muestra (10^{5} células) en 100 \muL de búfer de bloqueo (FCS al 2%, NGS al 5%, suero de conejo al 5% en PBS) durante una hora. Para cada línea celular se prepararon 4 muestras para ensayo, cada una conteniendo 0, 2, 5, ó 10 \mug de W6/32 (ATCC HB-95) en 100 \muL de búfer de bloqueo añadido a las muestras, respectivamente. W6/32 es un anticuerpo contra cadenas pesadas de MHC Clase I (una molécula anti HLA-A, B, C). Después de la adición de la solución de W6/32, las muestras fueron incubadas sobre hielo durante 1 hora y luego lavadas tres veces con 200 \muL de búfer FACS. Luego se añadieron 5 \mug de P3G2/Fc en búfer de bloqueo a cada muestra y se incubaron sobre hielo durante una hora. El P3G2/Fc compite con W6/32 por los sitios de enlazamiento sobre las células.

Después de la incubación, las células fueron lavadas tres veces con 200 \muL de búfer FACS y tratadas con Fc/biotina antihumana de ratón y SAPE durante 45 minutos. Este tratamiento causa que Fc/biotina antihumana se enlace a cualquier célula enlazada a sP3G2/Fc y que SAPE se enlace a Fc/biotina antihumana. Ya que SAPE es un compuesto fluorescente, su detección utilizando condiciones apropiadas de excitación y emisión identifica positivamente a P3G2 enlazado a la célula. Finalmente, las células tratadas fueron lavadas tres veces con búfer FACS y sometidas a citometría de flujo para identificar células enlazadas a la proteína.

Los resultados demostraron que W6/32 compitió con P3G2 por enlazarse a todas las células y a todas las líneas celulares analizadas. El enlazamiento de P3G2 y fue totalmente bloqueado con 5 \mug de W6/32 indicando que W6/32 y P3G2 se enlazan o se superponen a los mismos sitios sobre las cadenas pesadas MHC Clase I.

Ejemplo 7 Muestreo de la Genoteca de ADNc de HSB2 para Aislar un Ligando de Enlazamiento de P3G2

A continuación se describe el muestreo de una genoteca de ADNc de una de las líneas celulares, HSB-2, una línea celular de leucemia linfoblástica T, que se encontró que enlaza P3G2, e identifica a un ligando de enlazamiento P3G2. Se preparó una genoteca de ADNc de HSB2 en el vector de expresión pDC302, como se describe generalmente en la patente estadounidense No. 5.516.658 y específicamente en Kozlosky y colaboradores, Oncogene 10:299-306, 1995. En resumen, el ARNm fue aislado a partir de células escogidas HSB-2 y se sintetizó una primera cadena de ADNc utilizando 5 \mug de poliA^{+}, y la transcriptasa reversa AMV RTase de Life Science. La segunda cadena de ADNc fue sintetizada utilizando ADN polimerasa I de BRL en una concentración de 1,5 U/\muL. Utilizando técnicas estándar como se describe en Haymerle y colaboradores, Nucl. Acids Res. 14:8615, 1986, se dijo el ADNc dentro del sitio apropiado del vector pDC302.

Las células DH5\alpha de la cepa de E. coli son transformadas con la genoteca de ADNc en pDC302. Después de amplificar la genoteca, una revisión del título indicó que había en un total de 157.200 clones. Las células transformadas fueron sembradas en placas, en 15 placas diferentes. Se aisló el ADN del plásmido a partir de los reservorios que consistían aproximadamente de 2000 clones por reservorio. El ADN aislado fue transfectado dentro de células CV1-EBNA (ATCC CRL 10478) utilizando DEAE-dextrano seguido por tratamiento con cloroquina. Las células CV1-EBNA fueron mantenidas en medio completo (medio de Eagles modificado de Dulbecco que contenía suero fetal de ternera al 10% (v/v), 50 U/mL de penicilina, 50 U/mL de estreptomicina, y L-glutamina 2 mM) y fueron sembradas sobre placas con una densidad aproximada de 2 x 10^{5} células/pozo en láminas porta objeto con una cámara de un solo pozo. Las láminas porta objeto habían sido pretratadas con 1 mL de una solución de 10 \mug/mL de fibronectina humana en PBS durante 30 minutos seguido por un lavado simple con PBS. El medio fue removido de las células adheridas que crecieron en una capa y se lo reemplazó con 1,5 mL de medio completo que contenía sulfato de cloroquina 66,6 \muM. Se añadieron aproximadamente 0,2 mL de una solución de ADN (2 \mug de ADN, 0,5 mg/mL de DEAE-dextrano en medio completo que contenía cloroquina) a las células y se incubó la mezcla a 37ºC aproximadamente durante cinco horas. Después de la incubación, se removió el medio y las células fueron chocadas por medio de la adición de medio completo que contenía DMSO al 10% (dimetilsulfóxido) durante 2,5 minutos. El choque fue seguido por el reemplazo de la solución con medio completo fresco y las células fueron cultivadas en medio de cultivo durante tres días para permitir la expresión transitoria de las secuencias insertadas de ADN. Estas condiciones condujeron a una frecuencia de transfección entre el 30% y el 80% en células sobrevivientes CV1-EBNA.

Cada lámina portaobjetos fue incubada con 1 mL de P3G2:Fc a una concentración de 0,45 \mug/mL en búfer de enlazamiento (RPMI 1640 que contenía 25 mg/mL de albúmina de suero bovino, 2 mg/mL de azida de sodio, Hepes 20 mM a pH 7,2, y 50 mg/mL de leche seca libre de grasa) a temperatura ambiente durante 1 hora. Las láminas portaobjeto incubadas fueron lavadas con el búfer de enlazamiento y luego incubadas con IgG antihumano de ratón ^{125}I específico para Fc (ver Goodwin y colaboradores, Cell 73:447-456, 1993). Esto fue seguido por un segundo lavado con búfer después de lo cual las láminas portaobjeto fueron fijadas con una solución de glutaraldehido/PBS al 2,5%, lavadas con solución PBS, y se les permitió secarse al aire. Las láminas portaobjeto secas fueron sumergidas en emulsión fotográfica GTNB-2 de Kodak (6x dilución en agua). Después del secado al aire, las láminas portaobjeto fueron colocadas en una caja oscura y refrigeradas. Después de tres días, las láminas portaobjeto fueron desarrolladas en revelador D19 de Kodak, enjuagadas en agua y fijadas en fijador G433C de Agfa. Las láminas portaobjeto fijadas fueron examinadas individualmente bajo un microscopio a 25-40x de magnificación. Los reservorios positivos que demostraron enlazamiento de sP3G2:Fc fueron visualizadas por medio de la presencia de granos de plata autorradiográficos contra el fondo de la película. Se titularon dos reservorios positivos y se sembraron sobre placas para proveer placas que contenía aproximadamente 200 colonias cada una. Cada placa fue raspada para proveer reservorios de ADN de plásmido para transfección en células CV1-EBNA y muestreadas como se describió anteriormente. Después de subsiguientes interrupciones y muestreos, se obtuvo una colonia positiva individual para cada reservorio. El inserto de ADNc de los clones positivos fue identificado como HLA-B44 y HLA-A2, antígenos MHC clase I.

Ejemplo 8 Análisis de Northern Blot

Ya que los experimentos descritos en el Ejemplo 4 resultaron en la detección de expresión en la superficie de LIR-P3G2 sobre un cierto número de líneas celulares, se utilizaron procedimientos convencionales de análisis Northern Blot para estudiar la expresión de LIR-P3G2 y a cualquier ARNm relacionado con LIR-P3G2 en diferentes tipos de tejido. Las líneas celulares seleccionadas por el análisis Northern Blot fueron RAJI, PBT, PBM, YT, HEP3B, HELA, KB, KG-1, IMTLH, HPT, HFF, THP-1, y U937. A continuación se describe el análisis Northern Blot y los resultasdos de los análisis.

El ADNc que codifica a la región extracelular de P3G2 fue aislado utilizando cebadores que flanquean a la región extracelular de P3G2 y que tienen las siguientes secuencias:

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El molde PCR fue el gen P3G2 de longitud completa aislado como se describió en el Ejemplo 3 más arriba. Las condiciones para la reacción PCR fueron las siguientes: un ciclo a 95ºC durante 5 minutos; 30 ciclos que incluyeron 95ºC durante 45 segundo, 64ºC durante 45 segundos y 72ºC durante 45 segundos; y, un ciclo a 72ºC durante 5 minutos. El producto PCR fue clonado dentro del vector PCR II, adquirido a Invitrogen, de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El ADN aislado que codifica a la región extracelular de P3G2, fue utilizado para elaborar una ribosonda con el Kit MAXISCRIPT de Ambion de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se prepararon Northern blots que contenían ARN seleccionado de poliA^{+} o ARN total de una variedad de líneas celulares humanas por medio de la resolución de muestras de ARN sobre un gel de agarosa-formaldehído al 1,1%, transfiriendo sobre Hybond-N como lo recomendado por el fabricante (Amersham Corporation) y coloración con azul de metileno para hacer seguimiento a las concentraciones de ARN. Las transferencias fueron preparadas utilizando 1 \mug del ARN de PoliA^{+} o 10 \mug de ARN total, y cada transferencia fue probada con 10^{6} cpm/mL de ARN extracelular de la ribosonda P3G2, preparada como se acaba de describir, a 63ºC durante 16 horas. Las transferencias probadas fueron lavadas con 2x SSC a 63ºC durante 30 minutos 2 veces: 1 x SSC a 63ºC durante 30 minutos 2 veces; y, 0,1x SSC a 63ºC durante 5 minutos 2 veces.

Las transferencias probadas fueron autoradiográficamente desarrolladas. Las transferencias desarrolladas mostraron que el ARN de P3G2 hibridó hasta un ARN de 3,5 kb expresado por RAJI, CB23, y U937; un ARN aproximadamente de 1,5 kb expresado por THP-1; y múltiples ARN en el rango entre 1,5 kb a 3,5 kb expresados por PBM. Estos resultados sugieren que genes diferentes que tienen dominios extracelulares similares en estructura a aquel de P3G2, pueden ser expresados por medio de monocitos de sangre periférica.

Ejemplo 9 Sondeo de Genoteca de ADNc de PBM para Aislar Polipéptidos LIR

A continuación se describen las etapas seguidas para muestrear una genoteca de ADNc de monocitos de sangre periférica para aislar a los polipéptidos relacionados con el polipéptido P3G2 utilizando metodologías Southern Blot convencionales. Se preparó una genoteca de ADNc de monocitos de sangre periférica utilizando sustancialmente los mismos procedimientos descritos en el Ejemplo 7.

El ADN de 15 reservorios iniciales de ADNc que tenían 10.000 clones por reservorio fue digerido con la enzima de restricción Bgl II y se lo sometió a electroforesis sobre un gel de agarosa al 1%, a 100 V durante 2 horas. Los Southern Blot fueron preparados por medio de electrotransferencia del ADN sometido a electroforesis en búfer de TBE al 0,55% sobre membranas Hybond. El ADN de transferencia fue desnaturalizado en NaOH 0,5 M en solución de NaCl 0,6 M durante 5 minutos y luego neutralizado en TRIS 0,5 M en NaCl 1,5 M a pH 7,8 durante 5 minutos. Las membranas fueron colocadas en un entrelazador STRATALINKER UV durante 20 segundos para entrelazar al ADN de transferencia a la membrana. La membrana y el ADN enlazado fueron colocados en una solución de hibridación previa de Solución de Denhart 10X, TRIS 0,05 M a pH 7,5, NaCl 0,9 M, pirofosfato de sodio al 0,1%, SDS al 1% y 200 \mug/mL de ADN de esperma de salmón a 63ºC durante 2 horas y luego el ADN enlazado fue probado con una sonda de ADN marcada con ^{32}P que codifica a la región extracelular de LIR-P3G2, que incluye al péptido señal y a los sitios de restricción Sal I y Bgl II. La concentración de la sonda de ADN en solución de hibridación fue de 10^{6} CPM por mL de solución de hibridación. Las transferencias probadas fueron incubadas durante 16 horas a 63ºC y luego lavadas con 2x SSC a 63ºC durante 1 hora con un cambio de solución; 1x con SSC a 63ºC durante 1 hora con un cambio de solución; y, 0,1x SSC a 68ºC durante 45 minutos con un cambio de solución. Después de secar las transferencias, fueron autoradiográficamente desarrolladas y visualizadas por medio de las bandas de ADN que hibridaron a la sonda extracelular de ADN de P3G2.

Los resultados de la visualización por autorradiografía indicaron que todos los reservorios contenían ADN que hibridó a la sonda. Se seleccionó un reservorio mostrando 7 posibles bandas de ADN y posteriormente se lo subdividió en 10 reservorios conteniendo 3000 clones por reservorio. Aplicando posteriormente metodologías Southern Blot a los 10 reservorios resultó en un reservorio mostrando nueve posibles secuencias de hibridación de ADN. Los clones de hibridación sencillos fueron aislados por medio de técnicas estándar de hibridación de colonias.

Los duplicados de las colonias bacteriales sobre los filtros fueron probados con la sonda extracelular P3G2 anteriormente descrita con una concentración de 500.000 cpm/mL a 63ºC durante 16 horas. Los filtros hibridados fueron lavados con 2x SSC a 63ºC durante 30 minutos; con 1x SSC a 63ºC durante 30 minutos; y finalmente con 0,1x SSC a 68ºC durante 15 minutos.

Se visualizaron cuarenta y ocho clones híbridos sobre duplicados de los filtros por autorradiografía y el ADN obtenido a partir de estos clones utilizando metodologías estándar de preparación de ADN, se digirieron con Bgl II. Se obtuvieron luego los Southern Blots de las digestiones y se probaron con la sonda extracelular P3G2 descrita anteriormente. Siete insertos clonados de diferente tamaño fueron identificados como hibridando posiblemente a la sonda P3G2. Se obtuvo la secuencia de nucleótidos de cada uno de los insertos utilizando tecnología automatizada de secuenciación. De los 8 diferentes insertos clonados, uno fue idéntico en secuencia a LIR-P3G2. Los otros fueron identificados como ADN que codifica a los polipéptidos de la nueva familia del LIR de polipéptidos. Las secuencias de nucleótidos (ADNc) de los miembros aislados de la familia del LIR se presentan en la SEQ ID NO:7 (designada como pbm25), la SEQ ID NO:9 (designada como pbm8), la SEQ ID NO:11 (designada como pbm36-2), la SEQ ID NO:13 (designada como pbm36-4); la SEQ ID NO:15 (designada como pbmhh); la SEQ ID NO:17 (designada como pbm2) y la SEQ ID NO:19 (designada como pbm17). Las secuencias de aminoácidos codificadas así se presentan en la SEQ ID NO:8 (designada como pbm25), la SEQ ID NO:10 (designada como pbm8), la SEQ ID NO:12 (designada como pbm36-2), la SEQ ID NO:14 (designada como pbm36-4); la SEQ ID NO:16 (designada como pbmhh); la SEQ ID NO:18 (designada como pbm2) y la SEQ ID NO:20 (designada como pbm17).

Ejemplo 10 Muestreo de una Genoteca de ADNc de Células Dendríticas Humanas para las Secuencias de ADNc de LIR

A continuación se describe el aislamiento y la identificación de un miembro de la familia del LIR por medio del muestreo de una genoteca de ADNc de células dendríticas derivadas de médula ósea humana en el vector \lambda Zap con un fragmento de ADNc de Hh0779 radiomarcado. El fragmento de ADNc de Hh0779 es un inserto de 0,7 kb del clon Hh0779 previamente aislado de una genoteca de ADNc de células dendríticas humanas, y obtenido por medio de digestión de restricción con las enzimas Pstf y Spef. El fragmento de ADNc de Hh0779 fue marcado con dCTP [a-^{32}P] utilizando el kit demarcación de ADN DECAprime II adquirido a Ambion.

La genoteca de ADNc de \lambda Zap fue sembrada en placa con una densidad de 20.000 pfu por placa para proveer un total de 480.000 plagas para el muestreo inicial. El ADNc de \lambda Zap fue transferido por duplicado sobre membranas Hybond, adquiridas a Amersham, y luego desnaturalizadas en una solución de NaOH 0,5 N y NaCl 0,5 M durante cinco minutos. Las membranas fueron desnaturalizadas en una solución Tris 0,5 M (pH 7,8) y NaCl 1,5 M durante cinco minutos, y luego lavadas en 2x SSC durante 3 minutos. El ADNc fue entrelazado a las membranas Hybond utilizando un entrelazador STRATALINKER UV en la autorregulación.

Las membranas fueron previamente hibridadas a 65ºC durante 2,25 horas en búfer de hibridación que contenía Denhardt 10x, Tris 0,05 M (pH 7,5), NaCl 0,9 M, pirofosfato de sodio al 0,1%, SDS al 1% y 4 mg/mL de ADN de esperma de salmón desnaturalizado con calor. Después de la hibridación previa, se añadió el ADNc radiomarcado de Hh0779 al búfer de hibridación hasta una concentración final de 0,54 x 10^{6} cpm/mL. Después de 24 horas de hibridación, las membranas fueron lavadas en 0,25x SSC, SDS al 0,25% a 65ºC durante 1,5 horas. Las transferencias fueron expuestas entonces a una película autorradiogtráfica para visualizar los clones positivos.

Se identificaron un total de 146 clones positivos mostrando señales de hibridación en ambas membranas de un juego por duplicado, aislado, y guardado para uso futuro. De los 146 clones, 35 fueron seleccionados para muestreo secundario. Los clones seleccionados fueron sembrados en placa a baja densidad y los clones sencillos fueron aislados después de hibridación de la sonda HH0779 utilizando las condiciones de hibridación descritas anteriormente. Los plásmidos fueron aislados entonces de los clones \lambda Zap utilizando al fago auxiliar VCSM13 adquirido a Stratagene. El ADN del plásmido fue analizado por medio de digestión de restricción y PCR, y se seleccionaron los clones que contenían los 24 insertos más grandes y se secuenciaron. De los 24 clones secuenciados, 6 codificaron.

LIR-P3G2, 3 codificaron LIR-pbm2, 8 codificaron LIR-pbm36-4 y LIR-pbm36-2, 1 codificó LIR-pbm8, 2 codificaron LIRpmbhh, y 1 codificó una nueva secuencia designada LIR-pbmnew. Tres clones fueron identificados como codificando secuencias de aminoácidos que no son relevantes para familia de polipéptidos LIR.

Ejemplo 11 Asociación de LIR-P3G2 y LIR-pbm8 con Tirosín Fosfatasa, SHP-1 Largo

A continuación se describen los ensayos realizados para demostrar que LIR-P3G2 y LIR-pbm8 se asocian con SHP-1. Los monocitos humanos fueron cultivados en medio RPMI suplementado con FBS al 10%, concentrados por medio de centrifugación y finalmente subdivididos en dos alícuotas. Una alícuota fue estimulada con una solución de pervanadato de sodio 50 mM/mL durante 5 minutos. La segunda alícuota no fue estimulada. Después de la estimulación, las células en cada alícuota fueron lisadas inmediatamente en búfer RIPA que contenía NP-40 al 1%, desoxicolato de sodio al 0,5%, Tris 50 mM pH 8, EDTA 2 mM, ortovanadato de sodio 0,5 mM, fluoruro de sodio 5 mM, \beta-glicerol fosfato 25 mM, e inhibidores de proteasa. Las muestras de 24 x 10^{6} células equivalentes fueron incubadas durante 2 horas a 4ºC ya sea con 5 \mug/mL de anticuerpo anti-SHP-1 adquirido a Transduction Laboratories, o con 5 \mug/mL de un anticuerpo isotipo equivalente de control (IgG1 M5 anti-Señal). Los inmunocomplejos resultantes fueron precipitados por medio de incubación con proteína G-agarosa (Boehringer Mannheim), lavados, y resuspendidos en 40 mL de búfer de muestra 2x SDS-PAGE. Veinte microlitros de cada inmunoprecipitados fueron cargados sobre los geles para electroforesis, sometidos a electroforesis bajo condiciones reductoras, y transferidos a membranas de nitrocelulosa adquiridas a Amersham. Los Western blots fueron probados con sueros de anticuerpo monoclonal anti-LIR-P3G2 y antisueros de anticuerpo monoclonal anti-LIR-pbm8, y se detectaron los inmunocomplejos por medio de quimioluminiscencia mejorada (NEN).

Se detectó fácilmente una proteína que tenía un peso molecular aproximadamente de 120 kDa, correspondiente a LIR-P3G2 en inmunoprecipitados de SHP-1, pero no los inmunoprecipitados generados con el anticuerpo M5 anti-Señal de control. En forma similar, se detectó una proteína de 90-100 kDa, correspondiente a LIR-pbm8, en inmunoprecipitados de SBP-1, pero no en los inmunoprecipitados de control. Ni la banda LIR-P3G2 ni la banda LIR-pbm8 fueron vistas en ausencia de tratamiento con pervanadato de sodio. Esto confirma que la fosforilación de la tirosina de LIR-P3G2 es esencial para la asociación de LIR-P3G2 y SHP-1, y la fosforilación de LIR-pbm8 es esencial para la asociación de LIR-pbm8 y SHP-1.

Para estudiar la inhibición de eventos de fosforilación de la tirosina mediada por Fc\gammaRI por coligación de LIR, se incubaron monocitos de sangre periférica con o sin 10 \mug/mL de versión F(ab)_{2} de un número de anticuerpos (\alpha-LIR-1+ \alpha -LIR-2, \alpha-CD11c, \alphaCD14, \alphaCD64, \alpha-CD64+ \alpha-LIR-1, \alpha-CD64+ \alpha-LIR-2, \alpha-CD64+ \alpha-LIR-1+ \alpha-LIR-2, \alphaCD64+ \alpha-CD11c, \alpha-CD64+ \alpha-CD14). Esto fue seguido de entrelazamiento con 30 \mu/mL de anti-ratón de cabra F(ab)_{2} policlonal. Los lisados celulares fueron inmunoprecipitados durante la noche con agarosa conjugada anti-fosfotirosina, sometidas a electroforesis, y transferidas sobre transferencias sobre nitrocelulosa. Las transferencias de Western fueron realizadas utilizado una combinación de mAbs anti-fosfotirosina conjugada con PY-20 y 4G10 HRP. Los datos demuestran la inhibición específica de los eventos de fosforilación de tirosina mediada por Fc\gammaRI sobre la coligación de LIR-P3G2 y LIR-pbm8.

Ejemplo 12 Generación de Anticuerpos Inmunorreactivos con Polipéptidos LIR

A continuación se describe la generación monoclonal de anticuerpos inmunorreactivos con miembros de la familia del LIR. Un polipéptido purificado LIR se prepara por medio de la expresión de células COS-1 y purificación por afinidad como se describe en el Ejemplo 4. La proteína purificada o las células transfectadas con un vector de expresión que codifica a la proteína de longitud completa, puede generar anticuerpos monoclonales contra el polipéptido LIR utilizando técnicas convencionales, por ejemplo aquellas técnicas descritas en la patente estadounidense No 4.411.993. En resumen, los ratones BALB-C se inmunizan en las semanas 0, 2 y 6 con 10 \mug del polipéptido LIR. La inmunización primaria se prepara con adyuvante TITERMAX, y la inmunización posterior se prepara con adyuvante incompleto de Freund (IFA). A las 11 semanas, los ratones reciben estimulo IV con 3-4 \mug del polipéptido LIR en PBS. Tres días después, los esplenocitos con estímulo IV se recogen y se fusionan con un compañero de fusión del mieloma Ag8.653 usando una solución acuosa PEG 1500 al 50%. Los hibridomas sobrenadantes se muestrean por medio de ELISA utilizando células LIR transfectadas en PBS a razón de 7 x 10^{3} células por pozo, y secadas para las placas de microtitulación en poliestireno de 96 pozos como el antígeno para recubrimiento de la placa. Los sobrenadantes positivos son confirmados posteriormente por medio del análisis FACS y RIP, utilizando células transfectadas LIR. Los hibridomas se clonan y se observan utilizando la misma forma de muestreo. Los cultivos monoclonales se expanden y los sobrenadantes se purifican por medio de cromatografía de afinidad.

Ejemplo 13 Análisis Citométrico de Flujo para la Expresión de LIR-P3G2 y LIR-pbm8 sobre Células Linfoideas y Mieloideas

Con el propósito de comparar la expresión diferencial y la distribución de LIR-P3G2 y LIR-pbm8 sobre poblaciones de linfocitos, se colorearon células mononucleares de sangre periférica aislada en forma fresca (PBMC) con mAb anti-CD3, anti-CD10, o anti-CD56 marcados con PE en presencia ya sea de mAB anti-LIR-pbm8 o anti-LIR-P3G2 marcados con biotina. Luego, las células coloreadas fueron tratadas con estreptavidina marcada con APC. Se recolectaron representaciones gráficas de densidad representando 5 x 10^{4} eventos sobre un FACScaliper (de Beckton Dickinson). Los resultados demostraron que LIR-P3G2 se expresa sobre 80%-95% de células B CD19^{+}, sobre 5%-15% de células T CD3^{+}, y sobre 10%-30% de células NK CD56^{+}. Sobre las células examinadas de los mismos 12 donantes, la expresión de LIR-pbm8 no fue detectada sobre células B CD3^{+}, células T CD3^{+}, y células NK CD56^{+}.

Se obtuvieron las fracciones elutriadas en contracorriente que contenían un alto porcentaje de monocitos circulantes y células dendríticas (DC). Los monocitos fueron caracterizados de acuerdo a los subconjuntos de fenotipos CD14^{+}CD16- y CD 14^{+}CD16^{+}. Se caracterizan las DC y de los sangre periférica con el fenotipo CD33^{+}CD14-CD16-HLA-DR^{+}. Los subconjuntos de monocitos y los de DC fueron coloreados con antiCD14 marcado con FITC, anti CD3 marcado con PE, antiHLA-DR marcado con perCp, y o bien anti-CD16 marcada con biotina, anti-LIR-P3G2, o anti LIR-pbm8. Luego, las células coloreadas fueron tratadas con estreptavidina marcada con APC. Ambos subconjuntos de monocitos co-expresan niveles similares de LIR-P3G2 y LIR-pbm8, con la expresión más alta de LIR-P3G2 y de LIR-pbm8 detectada sobre el subconjunto CD14^{+}CD16^{+}. La sangre de DC expresa los niveles más bajos de LIR-P3G2 y LIR-pbm8 comparada con los monocitos. Los resultados de estos experimentos demuestran que el LIR-P3G2 se expresa sobre linfocitos, monocitos y DC, y LIR-pbm8 se expresa sobre monocitos y DC.

Ejemplo 14 Muestreo de LIR-P3G2 y LIR-pbm8 para el Enlazamiento a Alelos HLA Clase I

A continuación se describen los análisis por citometría de flujo usados para muestrear LIR-P3G2 y LIR-pbm8 para el enlazamiento a alelos HLA Clase I. La línea celular 721.221 deficiente en linfoblastoides B clase I, no transfectada o transfectada con un panel de alelos HLA clase I fue usada para coloración. Las proteínas de fusión LIR-P3G2/Fc y LIR-pbm8/Fc fueron utilizadas en los estudios de enlazamiento y ambas se enlazaron en forma detectable a siete de los once alelos HLA-A, HLA-B y HLA-C que fueron analizados. En general, LIR-P3G2/Fc y LIR-pbm8/Fc se enlazan con afinidad más alta a los alelos HLA-B que a los alelos HLA-A o HLA-C. W6/32 (ATCC HB-95), un anticuerpo contra cadenas pesadas MHC Clase I (una molécula anti HLA-A, B, y C) inhibe el enlazamiento de LIR-P3G2/Fc y de LIR-pbm8/Fc a todos los transfectantes clase I. Finalmente, el enlazamiento de LIR-P3G2 y de LIR-pbm8 no se correlaciona con los niveles de expresión de MHC clase I. Así, LIR-P3G2 y LIR-pbm8 enlazan a diferentes alelos HLA-A, -B, y -C, y reconocen a un amplio espectro similar de especificidades de MHC clase I.

Ejemplo 15 Aislamiento de LIR-9m1, LIR-9m, LIR-9s1, LIR-9s2 y LIR-10

En el curso del secuenciamiento de alta producción de una genoteca de ADNc de células dendríticas humanas, se observó que la secuencia de un ADNc incompleto (clon ss4894) fue sorprendentemente similar a las secuencias de nucleótidos de los LIR 6a, 6b y 7, sugiriendo así que ss4894 era un miembro de la familia de genes del LIR. Para obtener el resto de este clon de ADNc, se utilizó el sistema de Extensión de ADNc de Rápida Amplificación (RACE) para amplificar una genoteca de ADNc de leucocitos humanos (Chenchik y colaboradores, A new method for full-length cDNA cloning by PCR, En A Laboratory Guide to RNA: Isolation, Analysis, and Synthesis, Ed. Kreig, P.A. (Wiley-Liss, Inc.), páginas 273-321). La primera ronda de amplificación empleó un cebador correspondiente al adaptador de RACE en el extremo 5' de los ADNc, y un segundo cebador correspondiente a las secuencias cercanas al extremo 3' de ss4894. Este esfuerzo produjo diferentes clones que contenían secuencias que eran altamente homólogas aunque no idénticas a aquellas de ss4894 y que se extendieron secuencia arriba más allá de un codón de iniciación de metionina. Estos clones, sin embargo, carecían de alguna de las secuencias en el extremo 3' de la región de codificación. En un esfuerzo por obtener una región de codificación entera, se llevó a cabo otra ronda de secuenciación RACE, esta vez utilizando un primer cebador cerca del extremo 5' de los primeros productos de RACE, y un segundo cebador correspondiente al adaptador 3'. Este esfuerzo produjo cinco clones que contenían insertos del LIR, cuatro de los cuales están estrechamente relacionados y parece que codifican variantes del mismo gen. Estas cuatro secuencias de ADNc estrechamente relacionadas fueron designadas como LIR-9m1, LIR-9m2, LIR-9s1 y LIR-9s2 (SEQ ID NOS:29, 31, 33 y 35). El quinto de los clones obtenidos utilizando este ultimo juego de cebadores representó a un gen diferente que había sido designado LIR-10 (SEQ ID NO:37).

Todos los cuatro clones LIR-9 codifican variantes de la misma proteína, y se presume que son los productos de empalme alternativo. Las proteínas codificadas por LIR-9ml (SEQ ID NO:30) y LIR-9s1 (SEQ ID NO:34) contienen un inserto de 12 aminoácidos que esta ausente de LIR-9m2 (SEQ ID NO:32) y LIR-9s2 (SEQ ID NO:36). Las formas solubles de la proteína LIR-9, esto es, LIR-9s1 y LIR-9s2, divergen cerca de sus carboxi terminales de las formas de la membrana, esto es, LIRs-9m1 y -9m2. Esta divergencia es debida presumiblemente a los diferentes exones que están siendo utilizados por las formas soluble y de membrana para codificar esa región de la proteína.

<110> Immunex Corporation

\hskip1cm

Cosman, David J.

\hskip1cm

Anderson, Dirk M.

\hskip1cm

Borges, Luis

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<120> Familia de Inmunoreguladores Designados Receptores Como los de la Inmunoglobuina Leucocitaria

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<130> 2624A-WO

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\vskip0.400000\baselineskip

<140> para ser asignado

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<141> 2000-05-12

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<150> 08/842,248

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<151> 199-05-12

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<160> 39

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 2922

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<212> ADN

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<213> humano

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<220>

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<221> CDS

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<222> (310)..(2262)

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<400> 1

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7

8

9

10

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<210> 2

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<211> 650

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<212> PRT

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<213> humano

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

11

12

13

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<210> 3

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<211> 2777

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<212> ADN

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<213> humano

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<220>

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<221> CDS

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<222> (168)..(2126)

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<400> 3

14

15

16

17

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<210> 4

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<211> 652

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<212> PRT

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<213> humano

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<400> 4

18

19

20

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<210> 5

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> humano

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

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\hskip-.1em\dddseqskip

tatgtcgacc atgaccccca tcctcacggt

\hfill

30

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

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<211> 52

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<212> ADN

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<213> humano

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

tatgggctct gctccaggag aagatcttcc ttctataacc cccaggtgcc tt

\hfill

52

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<210> 7

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<211> 1605

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<212> ADN

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<213> humano

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<220>

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<221> CDS

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<222> (93)..(1412)

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<400> 7

21

22

23

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<210> 8

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<211> 439

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<212> PRT

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<213> humano

\newpage

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<400> 8

24

25

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<210> 9

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<211> 2221

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<212> ADN

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<213> humano

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<220>

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<221> CDS

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<222> (184)..(1980)

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<400> 9

26

27

28

29

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<210> 10

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<211> 598

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<212> PRT

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<213> humano

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

30

31

32

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<210> 11

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<211> 2446

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<212> ADN

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<213> humano

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<220>

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<221> CDS

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<222> (171)..(1040)

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<400> 11

33

34

35

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<210> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 289

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

36

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1910

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (183)..(1652)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

38

39

40

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 489

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

41

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1725

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (40)..(1491)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

43

44

45

46

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 483

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

47

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1625

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (30)..(1376)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

49

50

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 448

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

52

53

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2194

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (67)..(1962)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

54

55

56

57

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 631

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

58

59

60

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2061

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (67)..(1839)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

61

62

63

64

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 590

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

65

66

67

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tatgcggccg ccatgatgac aatgtggt

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tatgcggccg ccccttgcga tagcg

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atagtcgaca acgccatcat gagatgtggt g

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taaagatctg ggctcgttag ctgtcgggt

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tatagatcta cccccaggtg ccttcccaga cca

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Gly o Arg

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Leu o Vat

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Gly o Asp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es His, Arg o Cys

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Val o Met

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Ala o Thr

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es His, Pro o Thr

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Leu, Ile o Phe

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222>(18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Gly, Asp o Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222>(26)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Thr, Ile, Ser o Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (30)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Thr, Ile, Ser o Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (31)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es una secuencia de 70 aminoácidos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (37)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Gly o Val

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (40)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Met o Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

68

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1016

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (69)...(968)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

69

70

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 299

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1007

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (95)..(958)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

72

73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 287

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

74

740

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 956

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (115)..(912)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

75

76

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 265

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

77

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 997

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (73)..(834)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

78

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 253

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

80

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1451

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(1347)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

81

82

83

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 449

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

84

85

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys}

Claims

1. Una molécula aislada de ácido nucleico que codifica a un polipéptido LIR, en donde dicho polipéptido LIR comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO:30, la SEQ ID NO:32, la SEQ ID NO:34, y la SEQ ID NO:36.

2. La molécula aislada de ácido nucleico de la Reivindicación 1, en donde la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO:29, la SEQ ID NO:31, la SEQ ID NO:33, y la SEQ ID NO:35.

3. La molécula aislada de ácido nucleico de acuerdo con las Reivindicaciones 1 ó 2, en donde la molécula de ácido nucleico comprende a los nucleótidos 69-968 de la SEQ ID NO:29, 95-958 de la SEQ ID NO:31, 115-912 de la SEQ ID NO:33, o 73-834 de la SEQ ID NO:35.

4. Una molécula aislada de ácido nucleico que codifica a un polipéptido soluble LIR, en donde dicho polipéptido LIR comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de:

: el dominio extracelular de un miembro de la familia del LIR, en donde el dominio extracelular se selecciona del grupo que consiste de:

: los aminoácidos x_{11} hasta 262 de la SEQ ID NO:30, en donde x_{11} es el aminoácido 1 ó 35;

: los aminoácidos x_{12} hasta 250 de la SEQ ID NO:32, en donde x_{12} es el aminoácido 1 ó 36;

: los aminoácidos x_{13} hasta 265 de la SEQ ID NO:34, en donde x_{13} es el aminoácido 1 ó 35;

: y los aminoácidos x_{14} hasta 253 de la SEQ ID NO:36, en donde x_{14} es el aminoácido 1 ó 36.

5. Una molécula aislada de ácido nucleico que codifica a un polipéptido soluble LIR, que comprende al menos un dominio como el de Ig, en donde dicho polipéptido LIR comprende al menos 85 aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de:

6. Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende la región

Fc de Ig y una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de:

7. Un polipéptido aislado que tiene una secuencia de aminoácidos que es codificada por una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1, 4, 5 ó 6.

8. Un anticuerpo que es capaz de enlazarse específicamente a un polipéptido de la Reivindicación 7.

9. Un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1, 4, 5 ó 6.

10. Un proceso para preparar un polipéptido LIR, el proceso comprendiendo cultivar una célula huésped transformada con un vector de expresión de la Reivindicación 9 bajo condiciones que promueven la expresión de dicho polipéptido, y recuperar dicho polipéptido.

\newpage

11. Una composición que comprende un vehículo fisiológicamente aceptable y un polipéptido de la Reivindica-
ción 7.

12. Una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión de acuerdo a la Reivindicación 9.