ES2315016T3 - Moleculas llamadas b7l-1. - Google Patents
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Abstract
Un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como se muestra en los SEQ ID NO: 2, 4, o 6, donde el polipéptido se une a un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 20 y el SEQ ID NO: 22.
Description
Moléculas llamadas B7L-1.
La presente invención se refiere a un
polipéptido novedoso, denominado B7L-1.
B7L-1 tiene una débil homología con numerosas
proteínas incluyendo B7-1, (CD80) y es una proteína
de unión para LDCAM. La invención incluye moléculas
B7L-1, ADN que codifica las moléculas de
B7L-1, procedimientos para la producción de
polipéptidos B7L-1 recombinantes, y composiciones
farmacéuticas que contienen tales polipéptidos
B7L-1.
B7-1 (CD80) es una molécula
co-estimuladora de las células T que se encuentra en
la superficie de las células presentadoras de antígenos (CPA).
Originalmente descrita como molécula de adherencia celular, se sabe
ahora que B7-1 envía importantes señales
co-estimuladoras a través de sus dos receptores de
la superficie de las células T, CD28 y CTLA4 (CD152).
B7-1 interacciona con CD28 para señalizar la
producción de citoquinas, la proliferación celular, y la generación
de células T efectoras y de memoria. Si la señal a través de CD28 es
bloqueada se puede producir anergia o desviación inmunitaria de las
células T, dando como resultado una respuesta inmunitaria
gravemente deprimida o alterada. Por ejemplo, cuando
B7-1 y (B7-2) interaccionan con CD28
(y CTLA4) es bloqueado con CTLA4Ig soluble, se han observado
tolerancia a aloinjertos y resistencia a enfermedades
autoinmunitarias.
B7-1 también interacciona con el
receptor CTLA4 de las células T. Su señalización es compleja, pero
un componente proporciona una señal de retroalimentación negativa,
haciendo que la célula T atenúe la señal de CD28. En ausencia de
esta señal durante un período de tiempo prolongado, la proliferación
de células T rampantes y la activación de las células efectoras
continúan. No obstante, la intervención a un plazo más corto puede
ser beneficiosa conduciendo a una respuesta inmunitaria más
vigorosa. Por ejemplo, cuando la interacción de
B7-1 (y B7-2) es bloqueada con
anticuerpos para CTLA4 se ha observado un aumento del rechazo de
tumores. Cuando esta regulación por retroalimentación funciona mal,
se pueden producir enfermedades autoinmunitarias y
linfoproliferación (refs). Por ejemplo, cuando la interacción de
CTLA4 y B7-1 es bloqueada con CTLA4Ig soluble, se ha
observado tolerancia a los aloinjertos y resistencia a las
enfermedades autoinmunitarias.
Además de B7-1, se sabe que
otras moléculas envían señales co-estimuladoras a
las células T. Por ejemplo, B7-2 (CD86), que es
expresado en diferentes células y en diferentes fases de la
activación de las CPA a partir de la de B7-1,
también libera su señal co-estimuladora para las
células T a través de CD28 y CTLA4. La señal de
B7-2 puede conducir respuestas inmunitarias que son
idénticas (refs), o diferentes (refs) de las respuestas
inmunitarias resultantes de la señalización de B7-1.
La naturaleza de la señalización de B7-2 depende del
contexto celular y del programa de
co-estimulación.
Cierta evidencia sugiere que se unen moléculas
adicionales a CTLA4 (ref). También existe evidencia de que otras
moléculas están implicadas en el envío de señales
co-estimuladoras importantes independientes de CD28
a las células T (ref).
Incluso aunque se unan a los mismos receptores
celulares, B7-1 y B7-2 sólo están
débilmente relacionados a nivel de aminoácidos. Ambos, sin embargo,
son miembros de la superfamilia que contiene dominios de
inmunoglobulina ampliados y mucha de su homología de secuencia
compartida se debe a restos concretos compartidos por sus dominios
de Ig comunes, que son característicos de la subfamilia con dominios
de Ig.
Claramente, la señalización
co-estimuladora por medio de receptores de la
superficie de las células T juega un importante papel en el
mantenimiento del equilibrio en el sistema inmunitario. Los sistemas
con un predominio de señales activadoras, tales como la
señalización co-estimuladora entre CD28 y
B7-1, pueden conducir a autoinmunidad e
inflamación. Los sistemas inmunitarios con un predominio de señales
inhibidoras, tales como la señalización
co-estimuladora entre CTLA4 y son menos capaces de
sensibilizar células infectadas o células cancerosas. El
aislamiento de nuevas moléculas implicadas en la señalización
co-estimuladora es muy deseable para estudiar la
señal o las señales biológicas transducidas por medio del receptor.
Adicionalmente, la identificación de tales moléculas proporciona un
método de regulación y tratamiento de enfermedades asociadas con la
autoinmunidad, la inflamación y la infección. Por ejemplo, se puede
utilizar el acoplamiento de una molécula que estimula la
señalización inhibidora o negativa con un anticuerpo o compañero de
señalización agonista para regular a la baja la función celular en
enfermedades en las cuales el sistema inmunitario es demasiado
activo y se encuentra presente inflamación o inmunopatología
excesivas. Por otra parte, utilizando un anticuerpo antagonista
específico para una molécula que estimula la señalización negativa,
o utilizando una forma soluble de la molécula para bloquear la
señalización, se puede activar la función inmunitaria específica en
enfermedades asociadas con una supresión de la función inmunitaria.
Por el contrario, se puede utilizar el acoplamiento de una molécula
que estimula la señalización positiva con un anticuerpo agonista
para regular al alza el efecto de la señalización de esa
molécula.
A la vista de la evidencia de que existen
moléculas co-estimuladoras de las células T
indefinidas y adicionalmente a la vista de la continua
investigación de nuevos agentes terapéuticos para tratar la
infección, las enfermedades autoinmunitarias, y la inflamación,
sería deseable identificar moléculas
co-estimuladoras de las células T adicionales. En
particular existe la necesidad de moléculas adicionales que alteren
la co-estimulación de las células T durante una
respuesta inmunitaria in vivo.
La presente invención proporciona polipéptidos
B7L1 de mamífero en forma de proteínas aisladas u homogéneas. La
presente invención incluye adicionalmente ADN aislados que codifican
B7L1 y vectores de expresión que comprenden ADN que codifica B7L1
de mamífero. Dentro del alcance de esta invención se encuentran las
células anfitrionas que han sido transfectadas o transformadas con
vectores de expresión que comprenden un ADN que codifica B7L1, y
los procedimientos para producir B7L1 cultivando tales células
anfitrionas en condiciones que conducen a la expresión de B7L1.
Adicionalmente se encuentran dentro de la presente invención las
composiciones farmacéuticas que comprenden formas solubles de las
moléculas de B7L-1.
En la presente memoria se proporcionan proteínas
novedosas, denominadas B7L-1, y el ADN que codifica
las proteínas B7L-1. Los polipéptidos
B7L-1 de la presente invención comparten una débil
homología con B7-1 y son proteínas de unión para
LDCAM, un polipéptido novedoso, descrito en la solicitud copendiente
S/N 60/095.672 presentada el 7 de Agosto de 1998. La secuencia de
nucleótidos de LDCAM humana y murina se describe en el SEQ ID NO:
19 y el SEQ ID NO: 21, respectivamente. Las secuencias de
aminoácidos codificadas por el SEQ ID NO: 19 y el SEQ ID NO: 21 se
muestran en el SEQ ID NO: 20 y el SEQ ID NO: 22, respectivamente.
Las proteínas B7L-1 de mamífero existen en
diferentes formas de empalme, denominadas formas extracelular larga
y extracelular corta.
En el Ejemplo 1 se describe la identificación y
EL aislamiento de un clon humano completo, denominado en la
presente memoria B7L-1 extracelular largo. La
secuencia de nucleótidos del ADN de B7L-1
extracelular largo humano, aislada como se describe en el Ejemplo
1, se presenta en el SEQ ID NO:1, y la secuencia de aminoácidos
codificada de ese modo se presenta en el SEQ ID NO: 2. La secuencia
de aminoácidos de B7L-1 humano extracelular largo
codificado (SEQ ID NO:2) tiene un dominio extracelular pronosticado
de 364 aminoácidos (1-364) incluyendo una secuencia
líder de 20 aminoácidos (1-20); un dominio
transmembrana de 21 aminoácidos (365-385) y un
dominio citoplásmico de 47 (386-432).
En el Ejemplo 3 se describe el aislamiento de un
ADN de B7L-1 murino con una región extracelular más
corta. Este ADN se describe en el SEQ ID NO: 3. La secuencia de
aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos del SEQ ID
NO: 3 se describe en el SEQ ID NO: 4. La secuencia de aminoácidos de
B7L-1 murino extracelular corta codificada (SEQ ID
NO:4) tiene un dominio extracelular pronosticado de 330 aminoácidos
(1-330), incluyendo una secuencia líder de 20
aminoácidos (1-20); un dominio transmembrana de 21
aminoácidos (331-351); y un dominio citoplásmico de
47 aminoácidos (352-398). La secuencia líder del SEQ
ID NO: 4 incluye los 8 primeros aminoácidos de la molécula larga de
B7L-1 humana aislada.
En el Ejemplo 3 también se describe una forma
"extracelular corta" de ADN de B7L-1 humana que
se piensa que es una variante de B7L-1 empalmada
alternativamente. La secuencia de nucleótidos para la forma
"extracelular corta" se describe en el SEQ ID NO:5 y la
secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia del SEQ ID
NO:5 se describe en el SEQ ID NO: 6. La secuencia de aminoácidos de
B7L-1 humana extracelular corta codificada (SEQ ID
NO:6) tiene un dominio extracelular pronosticado de 330 aminoácidos
incluyendo una secuencia líder de 20 aminoácidos; un dominio
transmembrana de 21 aminoácidos 331-351; y un
dominio citoplásmico de 47 aminoácidos 352-398. Las
secuencias descritas en los SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO: 6 se obtuvieron
aislando un clon de ADNc humano con cebadores diseñados para
flanquear el empalme alternativo potencial entre las formas
"larga" y "corta" y comparando después un fragmento
clonado resultante del SEQ ID NO:5 (nucleótidos
193-358), la forma extracelular corta murina
descrita en el SEQ ID NO: 3 y el SEQ ID NO: 4 y la forma
extracelular larga humana descrita en el SEQ ID NO:1 y el SEQ ID
NO: 2. La comparación confirmó la existencia de una forma
extracelular corta humana y proporcionó una base para las secuencias
de los SEQ ID NOS: 5 y 6.
Las moléculas de B7L-1 de
mamífero purificadas descritas en la presente memoria son proteínas
transmembrana de Tipo I que tienen una homología limitada con
B7-1, receptores de poliovirus, y proteína de
activación y desarrollo de timocitos. Para estas y otras muchas
proteínas débilmente homólogas, la homología reside en sus dominios
Ig. Como se describe más abajo, las proteínas B7L-1
se expresan en tejido cerebral, células dendríticas, subgrupos de
células dendríticas y células B activadas por el ligando CD40.
El descubrimiento de las secuencias de ADN
descritas en los SEQ ID NO: 1, 3 y 5 permite la construcción de
vectores de expresión que comprenden ADN que codifican proteínas
B7L-1 humanas y de ratón; de células anfitrionas
transfectadas o transformadas con los vectores de expresión; de
B7L-1 biológicamente activa en forma de proteínas
homogéneas; y de anticuerpos inmunorreactivos con
B7L-1.
Puesto que B7L-1 se encuentra en
células dendríticas derivadas de médula ósea y derivadas de
monocitos de la sangre periférica, estas moléculas se pueden
utilizar para regular la inflamación en un entorno terapéutico. Los
resultados de los estudios de unión descritos en el Ejemplo 13
muestran la unión de B7L-1 en líneas de células
tumorales. De este modo, la señalización biológica mediada por B7L1
podría mediar los efectos anti-tumorales funcionales
en estos tipos de tumores.
Según se utiliza en la presente memoria, el
término "B7L-1" hace referencia a un género de
polipéptidos que son proteínas de unión para LDCAM, polipéptidos
novedosos descritos en la solicitud copendiente S/N 60/095.672
presentada el 7 de Agosto de 1998, y estructuras complejas
encontradas en una variedad de líneas celulares incluyendo, pero no
limitadas a, células epiteliales de pulmón, células linfoblastoides
B y células B. El término B7L-1 abarca polipéptidos
que tienen la secuencia de los aminoácidos 1-432 del
SEQ ID NO: 2, la secuencia de aminoácidos 1-398 del
SEQ ID NO: 4; y los aminoácidos 1-398 del SEQ ID NO:
6. Además, B7L-1 abarca los polipéptidos que tienen
un alto grado de similitud o un alto grado de identidad con la
secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2, la secuencia de
aminoácidos del SEQ ID NO: 4, y la secuencia de aminoácidos del SEQ
ID NO: 6, y cuyos polipéptidos son biológicamente activos y se unen
con su contraestructura, LDCAM.
El término "B7L-1 murino"
hace referencia a productos génicos biológicamente activos del ADN
del SEQ ID NO: 3 y el término "B7L-1 humano"
hace referencia a productos génicos biológicamente activos del ADN
de los SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 5. Además están abarcadas en el
término "B7L-1" las proteínas solubles o
truncadas que incluyen la porción de unión de la proteína y
conservan la actividad biológica. Tales ejemplos específicos de
semejantes proteínas solubles son aquellas que comprenden la
secuencia de los aminoácidos 1-364 del SEQ ID NO:
2; aquellas que comprenden la secuencia de los aminoácidos
1-330 del SEQ ID NO: 4; y 1-330 del
SEQ ID NO: 6. Alternativamente, tales proteínas solubles pueden
excluir una secuencia líder y de este modo abarcan los aminoácidos
21-364 del SEQ ID NO: 2; los aminoácidos
21-330 del SEQ ID NO: 4; y los aminoácidos
21-330 del SEQ ID NO: 6.
El término "biológicamente activo" cuando
se refiere a B7L-1, significa que
B7L-1 es capaz de unirse a LDCAM, descrita en la
Solicitud de Patente de los Estados Unidos copendiente S/N
60/095.672 presentada el 7 de Agosto de 1998. LDCAM y
B7L-1 se denominan contraestructuras porque
B7L-1 es una proteína de unión para LDCAM.
"Aislado" significa que
B7L-1 está libre de asociación con otras proteínas o
polipéptidos, por ejemplo, en forma de producto de purificación de
un cultivo de células anfitrionas recombinantes o en forma de
extracto purificado.
Según se refiere en la presente memoria una
"variante de B7L-1", representa un polipéptido
sustancialmente homólogo al B7L-1 nativo, pero que
tiene una secuencia de aminoácidos diferente de la de
B7L-1 nativo (humano, murino o de otras especies de
mamífero) debido a una o más deleciones, inserciones o
sustituciones. (Para el estado contratante de Chipre solamente). La
secuencia de aminoácidos de la variante es preferiblemente idéntica
al menos en 80% a una secuencia de aminoácidos de
B7L-1 nativa, muy preferiblemente idéntica al menos
en 90%. El porcentaje de identidad puede ser determinado, por
ejemplo, comparando la información de la secuencia utilizando el
programa de ordenador GAP, versión 6.0 descrito por Devereux et
al. (Nucl. Acids Res. 12:387, 1984) y asequible del
University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). Los
parámetros por defecto preferidos para el programa GAP incluyen:
(1) una matriz de comparación unitaria (que contiene un valor de 1
para las identidades y de 0 para las no identidades) para los
nucleótidos, y la matriz de comparación pesada de Gribskov y
Burgess, Nucl. Acids Res. 14: 6745, 1986, como describen
Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure,
National Biomedical Research Foundation, págs.
353-358, 1979; (2) una penalización de 3,0 para
cada espacio y una penalización adicional de 0,10 para cada símbolo
en cada espacio; y (3) sin penalización para los espacios finales.
Las variantes pueden comprender secuencias sustituidas
conservativamente, que significa que un resto aminoácido dado es
remplazado por un resto que tiene características fisioquímicas
similares. Los ejemplos de las sustituciones conservativas incluyen
la sustitución de un resto alifático por otro, tal como Ile, Val,
Leu, o Ala entre sí, o sustituciones de un resto polar por otro, por
ejemplo entre Lys y Arg; Glu y Asp; o Gln y Asn. Son bien conocidas
otras de tales sustituciones conservativas, por ejemplo, las
sustituciones de regiones completas que tienen características de
hidrofobicidad similares. Las variantes o alelos de
B7L-1 de origen natural también están incluidas en
la invención. Los ejemplos de tales variantes son proteínas que
resultan de eventos de empalme de ARNm alternativos o de la escisión
proteolítica de la proteína B7L-1, donde se
conserva la propiedad de unión de B7L-1. El empalme
alternativo del ARNm puede producir una proteína
B7L-1 truncada pero biológicamente activa, tal como
una forma soluble de origen natural de la proteína, por ejemplo.
Las variantes atribuibles a la proteolisis incluyen, por ejemplo,
diferencias en los extremos N y C tras la expresión en diferentes
tipos de células anfitrionas, debido a la separación proteolítica de
uno o más aminoácidos terminales de la proteína
B7L-1 (generalmente de 1-5
aminoácidos terminales).
Como se ha mencionado antes, el Ejemplo 1
describe la identificación y aislamiento de la región codificante
completa del ADN de B7L-1 extracelular largo humano.
Este proceso implicó la búsqueda en un banco de datos de secuencias
de nucleótidos utilizando una secuencia de nucleótidos
B7-1 humana como secuencia problema. Se
identificaron dos archivos de etiquetas de secuencia expresada
(EST), números de acceso GenBank T08949 EST06841 y T32071 EST
43348, que tenían homología con una porción de B7-1
humana. El registro de GenBank no describe una región codificante
para los polipéptidos codificados por estas EST.
En el Ejemplo 5 se describe la construcción de
una proteína de fusión B7L-1/Fc humana novedosa que
puede ser utilizada en el escrutinio de líneas celulares para la
unión a B7L-1 y en el estudio de las características
de B7L-1. Otras regiones Fc de anticuerpos pueden
ser sustituidas por la región Fc de IgG1 humana descrita en el
Ejemplo. Otras regiones Fc adecuadas, son aquellas que se pueden
unir con elevada afinidad a una proteína A o una proteína G, e
incluyen fragmentos de la región Fc de IgG1 humana o murina, p. ej.,
fragmentos que comprenden al menos la región bisagra de manera que
se forman enlaces disulfuro intercatenarios. Además, la región Fc
puede ser alterada o mutada a una forma que tenga características de
unión al receptor de Fc inferiores. La proteína de fusión
B7L-1/Fc ofrece la ventaja de ser fácilmente
purificada. Otra ventaja es la formación de enlaces disulfuro entre
las regiones Fc de dos cadenas de proteínas de fusión separadas,
creando de este modo dímeros.
Como se ha descrito supra, un aspecto de
la invención son los polipéptidos B7L-1 solubles.
Los polipéptidos B7L-1 solubles comprenden todo o
parte del dominio extracelular de una B7L-1 nativa
pero carecen de la señal que ocasionaría la retención del
polipéptido sobre la membrana de una célula. Los polipéptidos
B7L-1 solubles comprenden ventajosamente el péptido
señal nativo (o uno heterólogo) cuando se sintetizan inicialmente
para promover la secreción, pero el péptido señal es escindido tras
la secreción de B7L-1 desde la célula. Los
polipéptidos B7L-1 solubles abarcados por la
invención conservan al menos una característica funcional y en una
realización son capaces de unirse a una contraestructura descrita en
la solicitud copendiente S/N 60/095.672 presentada el 7 de Agosto
de 1998. En efecto, el B7L-1 soluble también puede
incluir parte de la señal o parte del dominio citoplásmico u otras
secuencias, siempre que se pueda secretar la proteína
B7L-1 soluble.
La B7L-1 soluble puede ser
identificada (y distinguida de sus contrapartes unidas a membrana no
solubles) separando las células intactas que expresan la proteína
deseada del medio de cultivo, p. ej., mediante centrifugación, y
analizando el medio o el sobrenadante en cuanto a la presencia de la
proteína deseada. La presencia de B7L-1 en el medio
indica que la proteína fue secretada de las células y de este modo
es una forma soluble de la proteína deseada.
Las formas solubles de B7L-1
poseen muchas ventajas sobre la proteína B7L-1 unida
nativa. La purificación de las proteínas de las células anfitrionas
recombinantes es factible, puesto que las proteínas solubles son
secretadas desde las células. Adicionalmente, las proteínas solubles
son generalmente más adecuadas para la administración
intravenosa.
Los ejemplos de los polipéptidos
B7L-1 solubles incluyen aquellos que comprenden una
porción sustancial del dominio extracelular de una proteína
B7L-1 nativa. Un ejemplo de una proteína
B7L-1 soluble comprende los aminoácidos
1-364 del SEQ ID NO: 2 y los aminoácidos
1-330 del SEQ ID NO: 4, y 1-330 del
SEQ ID NO: 6. Además, las proteínas B7L-1 solubles
truncadas que comprenden menos del dominio extracelular completo
están incluidas en la invención. Cuando se expresa inicialmente en
una célula anfitriona, la B7L-1 soluble puede
comprender adicionalmente uno de los péptidos señal heterólogos
descritos más abajo que es funcional en las células anfitrionas
empleadas. Alternativamente, la proteína puede comprender el péptido
señal nativo. En una realización de la invención, la
B7L-1 soluble puede ser expresada como una proteína
de fusión que comprende (desde el extremo N al C) el péptido señal
del factor \alpha de levadura, un péptido FLAG® descrito más abajo
y en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.011.912, y la
B7L-1 soluble que consiste en los aminoácidos
21-364 del SEQ ID NO: 2 o 21-330
del SEQ ID NO: 4, o 21-330 del SEQ ID NO: 6. Esta
proteína de fusión recombinante es expresada y secretada de las
células de levadura. El péptido FLAG® facilita la purificación de la
proteína, y puede ser escindido con posterioridad de la
B7L-1 soluble utilizando enteroquinasa de mucosa
bovina. Las secuencias de ADN aisladas que codifican las proteínas
B7L-1 solubles están incluidas en la invención.
La B7L-1 truncada, incluyendo
los polipéptidos solubles, se pueden preparar mediante cualquiera de
las numerosas técnicas convencionales. Se puede sintetizar
químicamente una secuencia de ADN deseada utilizando mecanismos
conocidos per se. También se pueden producir fragmentos de
ADN mediante digestión con enzimas de restricción de una secuencia
de ADN clonada completa, y aislarlos mediante electroforesis sobre
geles de agarosa. Se pueden emplear conectores que contienen uno o
varios sitios de escisión para endonucleasas de restricción para
insertar el fragmento de ADN deseado en un vector de expresión, o
se puede digerir el fragmento en los sitios de escisión
naturalmente presentes allí. También se puede emplear el
procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa bien conocido
para amplificar una secuencia de ADN que codifica un fragmento de
proteína deseado. Como alternativa adicional, se pueden emplear
técnicas de mutagénesis conocidas para insertar un codón de
terminación en un punto deseado, p. ej., inmediatamente aguas abajo
del codón para el último aminoácido del dominio de unión al
receptor.
Como se ha establecido antes, la invención
proporciona polipéptidos B7L-1 aislados u
homogéneos, tanto recombinantes como no recombinantes. Se pueden
obtener variantes y derivados de proteínas B7L-1
nativas que conservan la actividad biológica deseada (p. ej., la
capacidad para unirse a LDCAM) por medio de mutaciones de secuencias
de nucleótidos que codifican los polipéptidos B7L-1
nativos. Se pueden lograr alteraciones de la secuencia de
aminoácidos nativa mediante cualquiera de los numerosos métodos
convencionales. Se pueden introducir mutaciones en loci concretos
sintetizando oligonucleótidos que contienen una secuencia mutante,
flanqueada por sitios de restricción que permiten la ligación a
fragmentos de la secuencia nativa. Tras la ligación, la secuencia
reconstruida resultante codifica un análogo que tiene la inserción,
sustitución, o deleción deseada.
Alternativamente, se pueden emplear
procedimientos de mutagénesis de sitio específico dirigida por
oligonucleótidos para proporcionar un gen alterado donde los
codones predeterminados pueden ser alterados por sustitución,
deleción o inserción. Los métodos ilustrativos de elaboración de las
alteraciones mostradas antes son descritas por Walder et al.
(Gene 42: 133, 1986); Bauer et al. (Gene
37: 73, 1985); Craik (BioTechniques, Enero 1985,
12-19); Smith et al. (Genetic Engineering:
Principles and Methods, Plenum Press, 1981); Kunkel (Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 82: 488, 1985); Kunkel et al. (Methods
in Enzymol. 154: 367, 1987); y Patentes de los Estados Unidos
Núms. 4.518.584 y 4.737.462.
Se puede modificar B7L-1 para
crear derivados de B7L-1 formando productos
conjugados covalentes o agregativos con otros radicales químicos,
tales como grupos glicosilo, lípidos, fosfato, grupos acetilo y
similares. Se pueden preparar derivados covalentes de
B7L-1 conectando los radicales químicos con grupos
funcionales de las cadenas laterales de los aminoácidos de
B7L-1 o en el extremo N o en el extremo C de un
polipéptido B7L-1 o en el dominio extracelular del
mismo. Otros derivados de B7L-1 dentro del alcance
de esta invención incluyen productos conjugados covalentes o
agregativos de B7L-1 o sus fragmentos con otras
proteínas o polipéptidos, por ejemplo mediante síntesis en cultivo
recombinante en forma de fusiones N-terminales o
C-terminales. Por ejemplo, el producto conjugado
puede comprender una secuencia polipeptídica señal o líder (p. ej.,
el líder del factor \alpha de Saccharomyces) en el extremo
N de un polipéptido B7L-1. El péptido señal o líder
dirige co-traduccionalmente o
post-traduccionalmente la transferencia del producto
conjugado desde su sitio de síntesis a un sitio dentro o fuera de la
membrana celular o la pared celular.
Las fusiones del polipéptido
B7L-1 pueden comprender péptidos añadidos para
facilitar la purificación e identificación de
B7L-1. Tales péptidos incluyen, por ejemplo,
poli-His o los péptidos de identificación antigénica
descritos en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.011.912 y Hopp
et al., Bio/Technology 6: 1204,1988.
La invención incluye adicionalmente polipéptidos
B7L-1 con o sin glicosilación de patrón nativo
asociado. La B7L-1 expresada en sistemas de
expresión de levadura o de mamífero (p. ej., células
COS-7) puede ser similar o significativamente
diferente del polipéptido B7L-1 nativo en el peso
molecular y el patrón de glicosilación, dependiendo de la elección
del sistema de expresión. La expresión de polipéptidos
B7L-1 en sistemas de expresión bacteriana, tales
como E. coli, proporciona moléculas no glicosiladas.
Los constructos de ADN equivalente que codifican
adiciones o sustituciones de restos aminoácido o secuencias, o
deleciones de restos terminales o internos o secuencias no
necesarios para la actividad biológica o la unión están incluidos
en la invención. Por ejemplo, se pueden modificar los sitios de
N-glicosilación del dominio extracelular de
B7L-1 para imposibilitar la glicosilación,
permitiendo la expresión de un análogo de carbohidrato reducido en
sistemas de expresión de mamífero y levadura. Los sitios de
N-glicosilación en los polipéptidos eucarióticos se
caracterizan por un triplete de aminoácidos
Asn-X-Y, donde X es cualquier
aminoácido excepto Pro e Y es Ser o Thr. Las proteínas
B7L-1 murina y B7L-1 humana
comprenden dos de tales tripletes. En la B7L-1
extracelular larga humana, los sitios de glicosilación se encuentran
en los aminoácidos 25-27 y en los aminoácidos
324-326. En la B7L-1 extracelular
corta murina y extracelular corta humana mostradas en el SEQ ID NO:
6, los sitios de glicosilación se encuentran en los aminoácidos
25-27 y en los aminoácidos 290-292.
Las sustituciones, adiciones o deleciones apropiadas en la
secuencia de nucleótidos que codifica estos tripletes darán como
resultado la prevención del anclaje de restos carbohidratados a la
cadena lateral de Asn. La alteración de un solo nucleótido, elegido
de manera que la Asn sea remplazada por un aminoácido diferente, por
ejemplo, es suficiente para inactivar un sitio de
N-glicosilación. Los procedimientos conocidos para
inactivar los sitios de N- glicosilación en las proteínas incluyen
aquellos descritos en la Patente de los Estados Unidos 5.071.972 y
EP 276.846.
En otro ejemplo, se pueden alterar secuencias
que codifican restos Cys que no son esenciales para la actividad
biológica para hacer que los restos Cys sean suprimidos o
remplazados por otros aminoácidos, evitando la formación de puentes
disulfuro intramoleculares incorrectos tras la renaturalización.
Otros equivalentes se preparan mediante modificación de restos
aminoácido dibásicos adyacentes para aumentar la expresión en
sistemas de levadura en los cuales se encuentra presente la
actividad proteasa KEX2. En la publicación EP 212.914 se describe
el uso de la mutagénesis específica del sitio para inactivar los
sitios de procesamiento de la proteasa KEX2. Los sitios de
procesamiento de la proteasa KEX2 son inactivados suprimiendo,
añadiendo o sustituyendo restos para alterar los pares
Arg-Arg, Arg-Lys, y
Lys-Arg para eliminar la aparición de estos restos
alcalinos adyacentes. Los emparejamientos Lys-Lys
son considerablemente menos susceptibles de escisión con KEX2, y la
conversión de Arg-Lys o Lys-Arg en
Lys-Lys representa un enfoque conservativo y
preferido para inactivar los sitios KEX2. La B7L-1
humana y la B7L-1 murina contienen un sitio de
procesamiento de la proteasa KEX2 en los aminoácidos
109-110 y 200-201 del SEQ ID NO: 2 y
los aminoácidos 75-76 y 166-167 del
SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 6.
Las secuencias de ácido nucleico dentro del
alcance de la invención incluyen secuencias de ADN y ARN aisladas
que hibridan con las secuencias de nucleótidos de
B7L-1 descritas en la presente memoria en
condiciones de restricción moderada o severa, y que codifican la
B7L-1 biológicamente activa. Las condiciones de
restricción moderada, según definen Sambrook et al. en
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. Vol. 1, págs.
101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
(1989), incluyen el uso de una solución de prelavado de 5 X SSC,
SDS al 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0) y condiciones de hibridación de
aproximadamente 55ºC, 5 X SSC, durante la noche. Las condiciones de
restricción severa incluyen temperaturas de hibridación y lavado más
elevadas. El experto en la técnica reconocerá que la temperatura y
la concentración salina de la solución de lavado pueden ser
ajustadas según sea necesario de acuerdo con factores tales como la
longitud de la molécula de ácido nucleico.
Debido a la conocida degeneración del código
genético en la que más de un codón puede codificar el mismo
aminoácido, una secuencia de ADN puede variar de aquella mostrada
en el SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 5 y todavía codificar
una proteína B7L-1 que tiene la secuencia de
aminoácidos del SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 6,
respectivamente. Tales secuencias de ADN variantes pueden ser el
resultado de mutaciones silenciosas (p. ej., que se producen
durante la amplificación mediante PCR), o pueden ser el producto de
una mutagénesis deliberada de una secuencia nativa.
La invención proporciona secuencias de ADN
aisladas equivalentes que codifican la B7L-1
biológicamente activa, seleccionada entre: (a) ADNc que comprende
la secuencia de nucleótidos presentada en el SEQ ID NO:1, SEQ ID
NO: 3, o SEQ ID NO:5; (b) ADN capaz de hibridar con un ADN de (a) en
condiciones moderadamente restrictivas y que codifica
B7L-1 biológicamente activa; y, (c) ADN que es
degenerado como resultado del código genético a un ADN definido en
(a), o (b) y que codifica la B7L-1 biológicamente
activa. Las proteínas B7L-1 codificadas por
semejantes secuencias equivalentes de ADN están incluidas en la
invención.
Los ADN que son equivalentes a la secuencia de
ADN del SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, o SEQ ID NO:5 hibridarán en
condiciones moderadamente y severamente restrictivas con secuencias
de ADN que codifican polipéptidos que comprenden los SEQ ID NO: 2,
SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o fragmentos y variantes de los SEQ ID
NO: 2, 4, y 6. Los ejemplos de las proteínas B7L-1
codificadas por semejante ADN incluyen, pero no están limitados a,
fragmentos de B7L-1 (solubles o unidos a membrana) y
proteínas B7L-1 que comprenden uno o varios sitios
de N-glicosilación inactivados, uno o varios sitios
de procesamiento de proteasa KEX2 inactivados, o una o varias
sustituciones de aminoácidos conservativas, como se ha descrito
antes. Las proteínas B7L-1 codificadas por ADN
derivado de otras especies de mamíferos, donde el ADN hibridará con
el ADNc del SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, o SEQ ID NO: 5 también están
incluidas en la presente invención.
Las variantes que poseen la capacidad para
unirse a contraestructuras de B7L-1, o compañeros de
unión, p. ej., LDCAM pueden ser identificadas mediante cualquier
análisis adecuado. La actividad biológica de B7L-1
puede ser determinada, por ejemplo, mediante competición por la
unión al ligando que se une al dominio de LDCAM (esto es análisis de
unión competitiva).
Un tipo de análisis de unión competiva para un
polipéptido B7L-1 utiliza una B7L-1
soluble, radiomarcada, y células intactas que expresan una
contraestructura de B7L-1, o células que expresan
LDCAM. En lugar de células intactas, se podrían sustituir las
proteínas de fusión de la contraestructura de B7L-1
soluble con Fc (tales como una proteína de fusión LDCAM/Fc) unidas
a una fase sólida por medio de la interacción de una Proteína A,
Proteína G o un anticuerpo para la contraestructura o porciones de
Fc de la molécula, por la región Fc de la proteína de fusión. Otro
tipo de análisis de unión competitiva utiliza proteínas de unión a
B7L-1 solubles radiomarcadas y células intactas que
expresan B7L-1.
Los análisis de unión competitiva se pueden
realizar siguiendo la metodología convencional. Por ejemplo, se
puede utilizar B7L-1 radiomarcado para competir con
un supuesto homólogo de B7L-1 para analizar la
actividad de unión frente a una proteína de unión a
B7L-1 unida a la superficie o una contraestructura
de unión, p. ej., LDCAM. Se pueden obtener resultados cualitativos
mediante análisis de unión competitiva en placa autorradiográfica,
o se pueden utilizar gráficos Scatchard para generar resultados
cuantitativos.
Las proteínas de unión para una contraestructura
de B7L-1, tales como la propia B7L-1
y anticuerpos anti-ligando de
B7L-1, se pueden unir a una fase sólida tal como una
matriz de cromatografía en columna o un sustrato similar adecuado
para identificar, separar o purificar células que expresan la
proteína de unión a B7L-1 en su superficie. La
unión de una proteína de unión a la contraestructura de
B7L-1 a una fase sólida en contacto con la
superficie se puede completar utilizando numerosas técnicas
diferentes. Por ejemplo, se puede construir una proteína de fusión
B7L-1/Fc y después anclarla a la fase sólida por
medio de la interacción de la Proteína A o la Proteína G. Se
conocen en la técnica otros diversos métodos para fijar proteínas a
una fase sólida y son arrogantes adecuados para su uso en la
presente invención. Por ejemplo, se pueden recubrir microesferas
magnéticas con B7L-1 y mantenerlas en el recipiente
de incubación a través de un campo magnético. Las suspensiones de
las mezclas celulares que contienen células que expresan una
contraestructura de B7L-1 se ponen en contacto con
la fase sólida que tiene los polipéptidos B7L-1 en
ella. Las células que tienen la contraestructura de
B7L-1 en su superficie se unen a los
B7L-1 fijados y las células no unidas se lavan. Este
método de unión por afinidad es útil para purificar, escrutar o
separar tales células que expresan la contraestructura de
B7L-1 de la solución. En particular, este método es
útil para separar las células que expresan LDCAM de las células que
no expresan una proteína de unión a B7L-1 o una
contraestructura de B7L-1.
Los métodos de liberación de las células
positivamente seleccionadas de la fase sólida son conocidos en la
técnica e incluyen, por ejemplo, el uso de enzimas. Tales enzimas
son preferiblemente no tóxicas y no dañinas para las células y
están dirigidas preferiblemente a escindir la pareja de unión de la
superficie celular. En el caso de las interacciones
LDCAM-B7L-1, la enzima escindiría
preferiblemente LDCAM liberando la suspensión celular resultante del
material B7L-1 "foráneo".
Alternativamente, se pueden incubar primero las
mezclas de células que se sospecha que contienen células LDCAM+ con
B7L-1 biotinilada. Los períodos de incubación tienen
típicamente al menos una hora de duración para asegurar una unión a
B7L-1 suficiente. La mezcla resultante se hace pasar
después a través de una columna cargada con cuentas recubiertas de
avidina, con lo que la alta afinidad de la biotina por la avidina
proporciona la unión de la célula a las cuentas. El uso de cuentas
recubiertas con avidina es conocido en la técnica. Véase Berenson,
et al. J. Cell. Biochem., 10D:239 (1986). El lavado
del material no unido y la liberación de las células unidas se
realizan utilizando métodos convencionales.
Como se ha descrito antes, se puede utilizar
B7L-1 para separar las células que expresan una
proteína a la cual se une. En un método alternativo, se puede
conjugar B7L-1 o un dominio extracelular o un
fragmento de la misma con un radical detectable tal como I^{125}
para detectar las células que expresan una proteína de unión a
B7L-1. El radiomarcaje con I^{125} se puede
realizar mediante cualquiera de los numerosos métodos
convencionales que producen una molécula de
B7L-1-I^{125} funcional marcada a
una actividad específica elevada. O se podría utilizar un
anticuerpo yodado o biotinilado frente a una región de
B7L-1 o la región Fc de la molécula. Se puede
utilizar otro radical detectable tal como una enzima que puede
catalizar una reacción colorimétrica o fluorimétrica, biotina o
avidina. Por ejemplo, las células que se van a someter a ensayo en
cuanto a la expresión de LDCAM se pueden poner en contacto con
B7L-1 marcada. Tras la incubación, la
B7L-1 marcada no unida se separa y se mide la unión
utilizando el radical detectable.
Las características de la unión de
B7L-1, los fragmentos de B7L-1 y las
variantes de B7L-1 también se pueden determinar
utilizando la proteína de unión a B7L-1 marcada (por
ejemplo, LDCAM:Fc-I^{125}) en análisis de
competición similares a los descritos antes. En este caso, no
obstante, las células intactas que expresan LDCAM unidas a un
sustrato sólido, se utilizan para medir el grado en el que una
muestra que contiene una supuesta variante de B7L-1
compite por la unión con una proteína de unión a
B7L-1.
Otros métodos para analizar la
B7L-1 incluyen el uso de anticuerpos
anti-B7L-1, líneas celulares que
proliferan en respuesta a B7L-1, o líneas celulares
recombinantes que expresan LDCAM y proliferan en presencia de
B7L-1.
Las proteínas B7L-1 descritas en
la presente memoria también pueden ser empleadas para medir la
actividad biológica de las proteínas LDCAM en términos de su
afinidad por B7L-1. Como ejemplo, se puede utilizar
B7L-1 para determinar si la actividad biológica es
conservada tras la modificación de una LDCAM (p. ej., modificación
química, truncamiento, mutación, etc.). La actividad biológica de
una proteína LDCAM se puede averiguar de este modo antes de que sea
utilizada en un estudio de investigación, o posiblemente en estudios
clínicos, por ejemplo.
Las proteínas B7L-1 encuentran
uso como reactivos que pueden ser empleados por aquellos que
realizan estudios de "garantía de calidad", p. ej., para
controlar la vida media en el estante y la estabilidad de las
proteínas a las cuales se une B7L-1 en diferentes
condiciones. Para ilustrar, se puede emplear B7L-1
en un estudio de afinidad de unión para medir la actividad
biológica de su proteína de unión que ha sido almacenada a
diferentes temperaturas, o producida en tipos celulares diferentes.
La afinidad de unión de la proteína modificada para
B7L-1 se compara con la de una proteína no
modificada para detectar cualquier impacto adverso de las
modificaciones sobre la actividad biológica de la proteína de unión
a B7L-1.
Los polipéptidos B7L-1 también
encuentran uso como portadores para liberar agentes anclados a ellos
en células que portan su contraestructura, LDCAM u otro receptor de
la superficie celular al cual se une B7L-1. Por
ejemplo, se pueden conjugar formas solubles de
B7L-1 con agentes tales como toxinas, inhibidores, o
antígenos y el agente conjugado resultante se puede liberar en las
células que portan la contraestructura de B7L-1
(LDCAM). Tales células incluyen células dendríticas linfoides que
son productoras conocidas de IL-12 durante una
respuesta inmunitaria y pueden inhibir la producción de citoquinas
por las células T. De este modo, estas células son una diana para
la inducción de tolerancia a antígenos y se pueden utilizar
productos conjugados con B7L-1 para bloquear,
potenciar o modificar la actividad de las células dendríticas
linfoides.
Los agentes diagnósticos y terapéuticos que se
pueden anclar a un polipéptido B7L-1 incluyen, pero
no están limitados a, fármacos, toxinas, radionúclidos, cromóforos,
enzimas que catalizan una reacción colorimétrica o fluorimétrica, y
similares, seleccionándose el agente concreto de acuerdo con la
aplicación pretendida. Los ejemplos de los fármacos incluyen
aquellos utilizados en el tratamiento de diversas formas de cáncer,
p. ej., mostazas nitrogenadas tales como mostazas nitrogenadas con
L-fenilalanina o ciclofosfamida, agentes
intercalantes tales como cis-diaminodicloroplatino,
antimetabolitos tales como 5-fluorouracilo,
alcaloides de vinca tales como vincristina, y antibióticos tales
como bleomicina, doxorrubicina, daunorrubicina, y derivados de los
mismos. Entre las toxinas se encuentran ricina, abrina, toxina de la
difteria, exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, proteínas
inactivadoras de ribosomas, micotoxinas tales como tricotecenos, y
derivados y fragmentos (p. ej., cadenas sencillas) de los mismos.
Los radionúclidos adecuados para el uso diagnóstico incluyen, pero
no están limitados a, I^{123}, I^{131}, Tc^{99m}, In^{111},
y Br^{76}. Los radionúclidos adecuados para
el uso terapéutico incluyen, pero no están limitados a, I^{131}, At^{211}, Br^{77}, Re^{186}, Re^{188}, Pb^{212}, Bi^{212}, Pd^{109}, Cu^{64}, y Cu^{67}.
el uso terapéutico incluyen, pero no están limitados a, I^{131}, At^{211}, Br^{77}, Re^{186}, Re^{188}, Pb^{212}, Bi^{212}, Pd^{109}, Cu^{64}, y Cu^{67}.
Tales agentes pueden ser anclados a
B7L-1 mediante cualquier procedimiento convencional
adecuado. B7L-1, que es una proteína, comprende
grupos funcionales en cadenas laterales de aminoácidos que se pueden
hacer reaccionar con grupos funcionales de un agente deseado para
formar enlaces covalentes, por ejemplo. Alternativamente, la
proteína o agente puede ser transformado para generar o anclar un
grupo funcional reactivo deseado. La transformación puede implicar
el anclaje de uno de los reactivos de acoplamiento bifuncionales
asequibles para anclar diversas moléculas a proteínas (Pierce
Chemical Company, Rockford, Illinois). Se conocen numerosas
técnicas de radiomarcaje de proteínas. Se pueden anclar metales
radionúclidos a B7L-1 utilizando un agente quelante
bifuncional adecuado, por ejemplo.
De este modo se preparan los productos
conjugados que comprenden B7L-1 y un agente
diagnóstico o terapéutico adecuado (preferiblemente unidos
covalentemente). Los productos conjugados se administran o se
emplean de otro modo en una cantidad apropiada para la aplicación
concreta.
Otro uso de la B7L-1 de la
presente invención es como herramienta de investigación para
estudiar el papel que puede jugar B7L-1, junto con
LDCAM, en la señalización y proliferación de las células T. Los
polipéptidos B7L-1 de la presente invención también
pueden ser empleados en análisis in vitro para la detección
de LDCAM o B7L-1 o las interacciones de los
mismos.
Como se ha comentado antes, cuando se analizaron
varios tejidos en busca de ARNm para B7L-1, se
detectaron transcritos en células dendríticas derivadas de CD34+
derivadas de médula ósea humana y células dendríticas derivadas de
sangre periférica, células B tras la estimulación con CD40L, células
dendríticas de cerebro y esplénicas de ratón, células B esplénicas
y de cerebro estimuladas con CD40L. Debido al patrón de expresión
restringido de B7L-1, se pueden utilizar anticuerpos
para B7L-1 para identificar, aislar, y purificar
células presentadoras de antígenos potentes, incluyendo células
dendríticas y células B activadas con el ligando CD40.
Adicionalmente, se puede explotar la presencia y el nivel de ARNm
para B7L-1 para determinar la pureza de
preparaciones de células dendríticas derivadas de médula ósea y
derivadas de sangre. Otros usos de anticuerpos para las moléculas
de B7L-1 incluyen el redireccionamiento de antígenos
a células dendríticas mieloides o la eliminación de células
dendríticas mieloides mediante agotamiento mediado por anticuerpos
anti-B7L-1 o con un producto
conjugado de una toxina y el anticuerpo.
Se pueden utilizar fragmentos solubles de
B7L-1, incluyendo, pero no restringidos a los
dominios extracelulares de los SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, y SEQ ID
NO: 6 para intensificar o inhibir la actividad de las células
dendríticas linfoides y/o las células B activadas para la
presentación por CD40-L.
Una realización de la presente invención está
dirigida a un método de tratamiento de trastornos mediados por la
interacción de B7L-1 y un compañero de unión e
implica administrar B7L-1 a un mamífero que tiene el
trastorno. Los polipéptidos B7L-1 de la invención
pueden ser formulados de acuerdo con los métodos conocidos
utilizados para preparar composiciones farmacéuticamente útiles. Se
puede combinar B7L-1 en una mezcla, o bien en forma
de una única sustancia activa o con otras sustancias activas
conocidas, con diluyentes farmacéuticamente adecuados (p. ej.,
Tris-HCl, acetato, fosfato), conservantes (p. ej.,
Timerosal, alcohol bencílico, parabenos), emulsionantes,
solubilizantes, coadyuvantes y/o portadores. Los portadores
adecuados y sus formulaciones se describen en Remington's
Pharmaceutical Sciences, 16ª ed. 1980, Mack Publishing Co. Además,
tales composiciones pueden contener B7L-1 formando
complejo con polietilenglicol (PEG), iones metálicos, o incorporado
a compuestos poliméricos tales como poli(ácido acético), poli(ácido
glicólico), hidrogeles, etc., o incorporado a liposomas,
microemulsiones, micelas, vesículas unilamelares o multilamelares,
eritrocitos fantasma o esferoblastos. Tales composiciones influirán
en el estado físico, la solubilidad, la estabilidad, la tasa de
liberación in vivo, y la tasa de aclaramiento in vivo
de B7L-1. También se puede conjugar
B7L-1 con anticuerpos contra receptores específicos
de tejidos, ligandos o antígenos, o acoplar a ligandos de receptores
específicos de tejidos. Para las células tumorales en las que se
encuentra LDCAM, se puede conjugar B7L-1 con una
toxina por medio de lo cual se utiliza B7L-1 para
liberar la toxina en el sitio celular específico.
Se puede administrar B7L-1
tópicamente, parenteralmente, o mediante inhalación. El término
"parenteral" incluye inyecciones subcutáneas, inyecciones
intravenosas, intramusculares, intracisternales, o técnicas de
infusión. Estas composiciones contendrán típicamente una cantidad
eficaz de B7L-1, sola o combinada con una cantidad
eficaz de cualquier otra sustancia activa. Tales dosificaciones y
concentraciones de fármaco deseadas contenidas en las composiciones
pueden variar dependiendo de muchos factores, incluyendo el uso
pretendido, el peso corporal del paciente y la edad, y la ruta de
administración. Las dosis preliminares pueden ser determinadas de
acuerdo con animales de ensayo, y se puede realizar el aumento a
escala de las dosificaciones para la administración a seres humanos
de acuerdo con las prácticas aceptadas en la técnica.
Los polipéptidos B7L-1 pueden
existir en forma de oligómeros, tales como dímeros o trímeros unidos
covalentemente o unidos no covalentemente. Los oligómeros pueden
estar unidos por enlaces disulfuro formados entre restos cisteína
de diferentes polipéptidos B7L-1. En una realización
de la invención, se crea un dímero de B7L-1
fusionando B7L-1 a la región Fc de un anticuerpo (p.
ej., IgG1) de manera que no interfiera en la unión de
B7L-1 al dominio de unión al ligando de
B7L-1. El polipéptido Fc se fusiona preferiblemente
con el extremo C de una B7L-1 soluble (que
comprende solamente la unión al receptor). La preparación general de
proteínas de fusión que comprenden polipéptidos heterólogos
fusionados a diversas porciones de polipéptidos derivados de
anticuerpos (incluyendo el dominio Fc) ha sido descrita, p. ej., por
Ashkenazi et al. (PNAS USA 88:10535, 1991) y Bym
et al. (Nature 344:677, 1990), incorporadas aquí como
referencia. Se inserta una fusión génica que codifica la proteína
de fusión B7L-1:Fc en un vector de expresión
apropiado. Se deja que las proteínas de fusión
B7L-1:Fc ensamblen moléculas de anticuerpo muy
similares, después de lo cual se forman enlaces disulfuro
intercatenarios entre los polipéptidos Fc, produciendo
B7L-1 divalente. Si las proteínas de fusión se
forman con las cadenas tanto pesadas como ligeras de un anticuerpo,
es posible formar un oligómero B7L-1 hasta con
cuatro regiones extracelulares de B7L-1.
Alternativamente, se pueden unir dos dominios de
B7L-1 solubles con un conector peptídico.
Las células anfitrionas adecuadas para la
expresión de B7L-1 incluyen procariotas, levaduras o
células eucarióticas superiores. Los vectores de clonación y
expresión apropiados para su uso con anfitriones celulares
bacterianos, fúngicos, de levadura, o de mamífero los describen,
por ejemplo, Pouwels et al. en Cloning Vectors: A
Laboratory Manual, Elsevier, Nueva York, (1985). También se
podrían emplear sistemas de traducción sin células para producir
polipéptidos B7L-1 utilizando ARN derivados de
constructos de ADN descritos en la presente memoria.
Los procariotas incluyen organismos gram
negativos o gram positivos, por ejemplo, E. coli o
Bacilli. Las células anfitrionas procarióticas adecuadas
para la transformación incluyen, por ejemplo, E. coli, Bacillus
subtilis, Salmonella typhimurium, y otras diversas especies de
los géneros Pseudomonas, Streptomyces, y
Staphylococcus. En una célula anfitriona procariótica, tal
como E. coli, un polipéptido B7L-1 puede
incluir un resto metionina N-terminal para facilitar
la expresión del polipéptido recombinante en la célula anfitriona
procariótica. La Met N-terminal puede ser escindida
del polipéptido B7L-1 recombinante expresado.
Los polipéptidos B7L-1 pueden
ser expresados en células anfitrionas de levadura, preferiblemente
del género Saccharomyces (p. ej., S. cerevisiae).
También se pueden emplear otros géneros de levadura, tales como
Pichia, K. lactis o Kluyveromyces. Los vectores de
levadura a menudo contendrán una secuencia de un origen de
replicación de un plásmido de levadura de 2 \mu, una secuencia
autónomamente replicante (ARS), una región promotora, secuencias
para la poliadenilación, secuencias para la terminación de la
transcripción, y un gen marcador seleccionable. Las secuencias
promotoras adecuadas para los vectores de levadura incluyen, entre
otros, promotores para la metalotioneína, la
3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman et al., J.
Biol. Chem. 255:2073, 1980) u otras enzimas glicolíticas
(Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; y
Holland et al., Biochem. 17:4900, 1978), tales como
la enolasa, la
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, la hexoquinasa, la piruvato descarboxilasa, la
fosfofructoquinasa, la
glucosa-6-fosfato isomerasa, la
3-fosfoglicerato mutasa, la purivato quinasa, la
triosafosfato isomerasa, la fosfoglucosa isomerasa, y la
glucoquinasa. Otros vectores y promotores adecuados para su uso en
la expresión en levaduras los describen adicionalmente Hitzeman,
EPA-73, 657 o Fleer et. al., Gene,
107: 285-195 (1991); y van den Berg et.
al., Bio/Technology, 8: 135-139 (1990).
Otra alternativa es el promotor ADH2 reprimible por glucosa descrito
por Russell et al. (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) y
Beier et al. (Nature 300:724, 1982). Se pueden
construir vectores lanzadera replicables tanto en levadura como en
E. coli insertando secuencias de ADN de pBR322 para la
selección y replicación en E. coli (gen Amp^{r} y origen
de replicación) en los vectores de levadura descritos antes.
Se puede emplear la secuencia líder del factor
\alpha de levadura para dirigir la secreción del polipéptido
B7L-1. La secuencia líder del factor \alpha se
inserta a menudo entre la secuencia promotora y la secuencia del
gen estructural. Véase, p. ej., Kurjan et al., Cell
30:933, 1982; y Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 81:5330, 1984; Patente de los Estados Unidos
4.546.082; y publicación EP 324.274. Otras secuencias líder
adecuadas para facilitar la secreción de polipéptidos recombinantes
a partir de anfitriones de levadura son conocidas por los expertos
en la técnica. Una secuencia líder se puede modificar cerca de su
extremo 3' para que contenga uno o más sitios de restricción. Esto
facilitará la fusión de la secuencia líder con el gen
estructural.
Los protocolos de transformación de levadura son
conocidos por los expertos en la técnica. Uno de tales protocolos
es descrito por Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
75:1929, 1978. El protocolo de Hinnen et al.
selecciona transformantes Trp^{+} en un medio selectivo, donde el
medio selectivo consiste en bases nitrogenadas de levadura al
0,67%, casaminoácidos al 0,5%, glucosa al 2%, 10 \mug/ml de
adenina y 20 \mug/ml de uracilo.
Las células anfitrionas de levadura
transformadas por vectores que contienen la secuencia promotora ADH2
se pueden hacer crecer para inducir la expresión en un medio
"rico". Un ejemplo de un medio rico es aquel que consiste en
extracto de levadura al 1%, peptona al 2%, y glucosa al 1% con un
suplemento de 80 \mug/ml de adenina y 80 \mug/ml de uracilo. La
des-represión del promotor ADH2 se produce cuando se
agota la glucosa del medio.
También se podrían emplear sistemas de cultivo
de células anfitrionas de mamífero o de insecto para expresar
polipéptidos B7L-1 recombinantes. Los sistemas de
Baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células
de insecto son revisados por Luckow y Summers, Bio/Technology
6: 47 (1988). Asimismo se pueden emplear líneas celulares
establecidas de origen mamífero. Los ejemplos de las líneas
celulares anfitrionas de mamífero adecuadas incluyen la línea de
células de riñón de mono COS-7 (ATCC CRL 1651)
(Gluzman et al., Cell 23:175, 1981), las células L,
las células C127, las células 3T3 (ATCC CCL 163), las células de
ovario de hámster Chino (CHO), las células HeLa, y las líneas
celulares BHK (ATCC CRL 10), y la línea celular derivada de
CV-1/EBNA-1 derivada de la línea
celular de riñón de mono verde Africano CVI (ATCC CCL 70) como
describen McMahan et al. (EMBO J. 10:2821,1991).
Las secuencias de control transcripcional y
traduccional para vectores de expresión en células anfitrionas de
mamífero pueden ser separadas por corte de genomas virales. Las
secuencias promotoras y las secuencias intensificadoras comúnmente
utilizadas derivan de virus Polioma, Adenovirus 2, Virus de Simios
40 (SV40), y citomegalovirus humano. Las secuencias de ADN
derivadas del genoma viral de SV40, por ejemplo, origen, promotor
temprano y tardío, intensificador, empalme, y sitios de
poliadenilación de SV40 se pueden utilizar para proporcionar otros
elementos genéticos para la expresión de una secuencia del gen
estructural en una célula anfitriona de mamífero. Los promotores
temprano y tardío son particularmente útiles porque ambos se
obtienen fácilmente de un genoma viral en forma de un fragmento que
también puede contener un origen de replicación viral (Fiers et
al., Nature 273: 113, 1978). También se pueden utilizar
fragmentos de SV40 más pequeños o más grandes, siempre que esté
incluida la secuencia de aproximadamente 250 pb que se extiende
desde el sitio Hind III hacia el sitio Bgl I localizado en el sitio
del origen de replicación viral de SV40.
Los vectores de expresión ilustrativos para su
uso en células anfitrionas de mamífero se pueden construir como
describen Okayama y Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280,
1983). Se puede construir un sistema útil para la expresión de
elevado nivel estable de ADNc de mamífero en células epiteliales
mamarias murinas C127 sustancialmente como describen Cosman et
al. (Mol. Immunol. 23:935, 1986). Un vector de expresión
elevada útil, PMLSV N1/N4, descrito por Cosman et al.,
Nature 312:768, 1984 ha sido depositado como ATCC 39890.
Se describen vectores de expresión en mamífero útiles adicionales
en la publicación EP-A-0367566, y en
la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Núm. de Serie
07/701.415, presentada el 16 de Mayo de 1991. Los vectores pueden
derivar de retrovirus. En lugar de la secuencia señal nativa, y
además de una metionina iniciadora, se puede añadir una secuencia
señal heteróloga, tal como la secuencia señal para la
IL-7 descrita en la Patente de los Estados Unidos
4.965.195; la secuencia señal para el receptor de
IL-2 descrita por Cosman et al., Nature
312:768 (1984); el péptido señal de IL-4
descrito en la publicación EP 367.566; el péptido señal del receptor
de IL-1 de tipo 1 descrito en la Patente de los
Estados Unidos 4.968.607; y el péptido señal del receptor de
IL-1 de tipo II descrito en la publicación EP
460.846.
La B7L-1 como proteína
purificada u homogénea, aislada de acuerdo con la invención puede
ser producida mediante sistemas de expresión recombinante como se
ha descrito antes o purificada de células de origen natural. La
B7L-1 puede ser purificada hasta una homogeneidad
sustancial, como indica una única banda de proteína tras el análisis
mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS
(SDS-PAGE).
Un procedimiento para producir
B7L-1 comprende cultivar una célula anfitriona
transformada con un vector de expresión que comprende una secuencia
de ADN que codifica B7L-1 en condiciones suficientes
para promover la expresión de B7L-1. La
B7L-1 es recuperada después del medio de cultivo o
de extractos celulares, dependiendo del sistema de expresión
empleado. Como es sabido por el experto en la técnica, los
procedimientos para purificar una proteína recombinante variarán de
acuerdo con factores tales como el tipo de células anfitrionas
empleadas y si la proteína recombinante es secretada o no al medio
de cultivo.
Por ejemplo, cuando se emplean sistemas de
expresión que secretan la proteína recombinante, el medio de cultivo
puede ser concentrado primero utilizando un filtro de concentración
de proteína disponible en el mercado, por ejemplo, una unidad de
ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Tras la etapa de
concentración, el producto concentrado puede ser aplicado a una
matriz de purificación tal como un medio de filtración en gel.
Alternativamente, se puede emplear una resina de intercambio
aniónico, por ejemplo, una matriz o sustrato que tiene grupos
dietilaminoetilo (DEAE) pendientes. Las matrices pueden ser
acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos comúnmente
empleados en la purificación de proteínas. Alternativamente, se
puede emplear una etapa de intercambio catiónico. Los
intercambiadores catiónicos adecuados incluyen diversas matrices
insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Se
prefieren los grupos sulfopropilo. Finalmente, se pueden emplear
una o más etapas de cromatografía líquida de alta resolución en fase
reversa (RP-HPLC) empleando medio de
RP-HPLC hidrófobo, (p. ej., gel de sílice que tiene
grupos metilo u otros grupos alifáticos pendientes) para purificar
adicionalmente la B7L-1. Algunas o todas las etapas
de purificación anteriores, en diversas combinaciones, son bien
conocidas y se pueden emplear para proporcionar una proteína
recombinante sustancialmente homogénea. Es posible utilizar una
columna de afinidad que comprende el dominio de unión a
B7L-1 de una proteína a la cual se une
B7L-1, tal como LDCAM, para purificar por afinidad
los polipéptidos B7L-1 expresados. Los polipéptidos
B7L-1 pueden ser separados de una columna de
afinidad utilizando técnicas convencionales, p. ej., en un tampón
de elución con alto contenido de sal y después sometidos a diálisis
en un tampón con un bajo contenido de sal para su uso o cambiando
el pH u otros componentes dependiendo de la matriz de afinidad
utilizada. Alternativamente, la columna de afinidad puede comprender
un anticuerpo que se une a B7L-1. En el Ejemplo 5
se describe un procedimiento para emplear la B7L-1
de la invención para generar anticuerpos monoclonales dirigidos
contra B7L-1.
La proteína recombinante producida en el cultivo
bacteriano puede ser aislada mediante desorganización inicial de
las células anfitrionas, centrifugación, extracción de sedimentos
celulares si es un polipéptido insoluble, o del sobrenadante si es
un polipéptido soluble, seguido de una o más etapas de
concentración, precipitación por adición de sal, intercambio
iónico, purificación por afinidad o cromatografía de exclusión por
tamaños. Finalmente, se puede emplear la RP-HPLC
para las etapas de purificación finales. Las células microbianas
pueden ser desorganizadas mediante cualquier método conveniente,
incluyendo ciclos de congelación-descongelación,
sonicación, desorganización mecánica, o utilización de agentes de
lisis celular.
Las células anfitrionas de levadura
transformadas son empleadas preferiblemente para expresar
B7L-1 en forma de un polipéptido secretado con el
fin de simplificar la purificación. El polipéptido recombinante
secretado de una fermentación de células anfitrionas de levadura
puede ser purificado mediante métodos análogos a los descritos por
Urdal et al. (J. Chromatog. 296:171, 1984). Urdal
et al. describen dos etapas de HPLC en fase reversa
sucesivas para la purificación de IL-2 humana
recombinante en una columna de HPLC preparativa.
Los fragmentos útiles de los ácidos nucleicos de
B7L-1 incluyen oligonucleótidos antisentido o
efectores que comprenden una secuencia de ácido nucleico de hebra
sencilla (ya sea ARN o ADN) capaz de unirse para buscar secuencias
de ARNm de B7L-1 (efector) o ADN de
B7L-1 (antisentido). Los oligonucleótidos
antisentido o efectores, de acuerdo con la presente invención,
comprenden un fragmento de la región codificante del ADNc de
B7L-1. Semejante fragmento comprende generalmente
al menos aproximadamente 14 nucleótidos, preferiblemente de
aproximadamente 14 a aproximadamente 30 nucleótidos. La capacidad
para derivar un oligonucleótido antisentido o efector, basándose en
una secuencia de ADNc que codifica una proteína dada la describen,
por ejemplo, Stein y Cohen (Cancer Res. 48:2659, 1988) y van
der Krol et al. (BioTechniques 6:958, 1988).
La unión de oligonucleótidos antisentido o
efectores a secuencias de ácido nucleico diana da como resultado la
formación de dúplex que bloquean la transcripción o la traducción de
la secuencia diana mediante uno de los diversos métodos, incluyendo
el aumento de degradación de los dúplex, la terminación prematura de
la transcripción o la traducción, o mediante otros métodos. Los
oligonucleótidos antisentido se pueden utilizar de este modo para
bloquear la expresión de proteínas B7L-1. Los
oligonucleótidos antisentido o efectores comprenden adicionalmente
oligonucleótidos que tienen esqueletos de
azúcar-fosfodiéster modificados (u otros enlaces
azúcar, tales como los descritos en la publicación W091/06629) y
donde tales enlaces azúcar son resistentes a nucleasas endógenas.
Tales oligonucleótidos con enlaces azúcar resistentes son estables
in vivo (esto es, capaces de resistir la degradación
enzimática) pero conservan una especificidad de secuencia para ser
capaces de unirse a secuencias de nucleótidos diana. Otros ejemplos
de oligonucleótidos efectores o antisentido incluyen aquellos
oligonucleótidos que están unidos covalentemente a radicales
orgánicos, tales como los descritos en la publicación WO 90/10448,
y otros radicales que aumentan la afinidad del oligonucleótido hacia
una secuencia de ácido nucleico diana, tal como
poli-(L-lisina). Más aún, se pueden anclar agentes
intercalantes, tales como elipticina, y agentes alquilantes o
complejos metálicos a oligonucleótidos efectores o antisentido para
modificar las especificidades de unión del oligonucleótido
antisentido o efector hacia la secuencia de nucleótidos diana.
\newpage
Se pueden introducir oligonucleótidos
antisentido o efectores en una célula que contiene la secuencia de
ácido nucleico diana mediante cualquier método de transferencia
génica, incluyendo, por ejemplo, la transfección de ADN mediada por
CaPO_{4}, la electroporación, o utilizando vectores de
transferencia génica tales como el virus
Epstein-Barr. Los oligonucleótidos antisentido o
efectores son introducidos preferiblemente en una célula que
contiene la secuencia de ácido nucleico diana mediante inserción del
oligonucleótido antisentido o efector en un vector retroviral
adecuado, poniendo en contacto después la célula con el retrovirus
vector que contiene la secuencia insertada, ya sea in vivo o
ex vivo. Los vectores retrovirales adecuados incluyen, pero
no están limitados a, aquellos derivados del retrovirus murino
M-MuLV, N2 (un retrovirus derivado de
M-MuLV), o los vectores de doble copia denominados
DCT5A, DCT5B y DCT5C (véase la Solicitud PCT US 90/02656).
También se pueden introducir oligonucleótidos
efectores o antisentido en una célula que contiene la secuencia de
nucleótidos diana mediante la formación de un producto conjugado con
una molécula de unión al ligando, como se describe en la
publicación WO 91/04753. Las moléculas de unión al ligando adecuadas
incluyen, pero no están limitadas a, receptores de la superficie
celular, factores de crecimiento, otras citoquinas, u otros
ligandos que se unen a los receptores de la superficie celular.
Preferiblemente, la conjugación de la molécula de unión al ligando
no interfiere sustancialmente en la capacidad de la molécula de
unión al ligando para unirse a su correspondiente molécula o
receptor, o bloquear la entrada del oligonucleótido efector o
antisentido o su versión conjugada en la célula.
Alternativamente, se puede introducir un
oligonucleótido efector o antisentido en una célula que contiene la
secuencia de ácido nucleico diana mediante la formación de un
complejo oligonucleótido-lípido, como se describe
en la publicación WO 90/10448. El complejo oligonucleótido efector o
antisentido-lípido es disociado preferiblemente
dentro de la célula por medio de una lipasa endógena.
Además de lo anterior, se proporcionan los
siguientes ejemplos para ilustrar realizaciones concretas y no para
limitar el alcance de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizó el ADN que codifica la
B7L-1 humana, una molécula
co-estimuladora de las células T y una proteína
SMARTLIST, en un análisis de secuencia BLAST para identificar las
EST que tenían homología con B7-1. Este análisis
BLAST dio como resultado la identificación de dos EST de GENBANK
Núm. de Archivo T08949 (EST06841) y Núm. de Archivo T32071 (EST
43348), TIGR (?) que tenía una homología baja pero significativa con
una porción de la molécula B7-1.
Las dos secuencias EST de GENBANK se utilizaron
para diseñar cebadores de PCR para sondear genotecas de ADNc con el
fin de identificar una fuente de ADNc para las EST. Las secuencias
de los cebadores fueron las siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
5' AGGGCGAGTACACCTG 3' (SEQ ID NO: 7) (bases
efectoras 22-37 de EST T32071)
\vskip1.000000\baselineskip
5' GTGGATCTGTCAGCTCC 3' (SEQ ID NO: 8) (bases
anti-sentido 376-360 de EST
T32071)
\vskip1.000000\baselineskip
Los cebadores oligonucleotídicos identificados
en los SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 se utilizaron para escrutar
genotecas de ADNc mediante PCR. De las 16 genotecas de ADNc
examinadas, el producto de la PCR se obtuvo solamente de una
genoteca lambda de cerebro humano (adquirida de Clonetech HL3002b).
El producto se clonó en bacterias y se secuenció para verificar que
el producto incluía un marco de lectura abierto.
La secuencia EST clonada se marcó
radiactivamente y se utilizó para sondear la genoteca lambda de
cerebro empleando técnicas de sondeo normalizadas, con el fin de
aislar los clones de la genoteca lambda de cerebro que incluían la
secuencia derivada de EST. Un clon, denominado
32071-2, ampliaba la secuencia de EST en el extremo
5' en 140 bases. El posterior análisis BLAST de la base de datos de
EST de GENBANK utilizando la secuencia EST ampliada como secuencia
problema condujo a la identificación de una EST solapante (H15268)
derivada del clon núm. 44904 de IMAGE Consortium.
Se obtuvo el clon de IMAGE Consortium (Research
Genetics, 07002) y se secuenció completamente para revelar un marco
de lectura abierto y una nueva secuencia de ADNc humano completo que
codificaba B7L-1. El SEQ ID NO: 1 proporciona el
ADNc completo de la B7L-1 humana y el SEQ ID NO: 2
proporciona la secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc. La
proteína completa codificada tiene una región extracelular
pronosticada de 364 aminoácidos (1-364), incluyendo
una secuencia líder de 20 aminoácidos (1-20); un
dominio transmembrana de 21 aminoácidos (365-385) y
un dominio citoplásmico de 47 aminoácidos
(386-432).
Para preparar un constructo vector para expresar
la B7L-1 extracelular larga humana, se obtuvo la
región codificante completa del SEQ ID NO: 1 a partir del clon núm.
49904. Primero, se separó por corte el inserto de
B7L-1 del clon utilizando los sitios HindIII y Not
l del clon. Después se utilizaron los oligonucleótidos identificados
en los SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 como adaptadores para cambiar
el extremo cohesivo HindIII a un extremo cohesivo SalI recociendo y
ligando los oligonucleótidos al inserto separado por corte que
contenía los restos nucleotídicos 1-1820 del SEQ ID
NO: 1. El constructo resultante se ligó en el vector de expresión
pDC409 que había sido cortado con SalI y NotI.
El constructo vector de expresión fue
transfectado después en células CV1/EBNA y B7L-1 fue
expresada utilizando las técnicas descritas por McMahan et al.,
EMBO J. 10: 2821, 1991.
Después de que las células fueron sometidas a
choque e incubadas durante varios días, las células sobrenadantes
que contenían cualquier forma soluble de la proteína se recogieron y
se recuperó la proteína B7L-1 utilizando técnicas
de HPLC. Para recuperar las formas de B7L-1 que
están unidas a la membrana, se cosecharon las células transfectadas,
se fijaron en paraformaldehído al 1%, se lavaron y se utilizaron en
su forma intacta.
\vskip1.000000\baselineskip
Para identificar una fuente de ADNc de
B7L-1 murina, se utilizó la información de la
secuencia obtenida a partir de B7L-1 humana
identificada en el Ejemplo 1 anterior para diseñar cebadores de la
PCR, uno de los cuales es el oligonucleótido del SEQ ID NO: 12; el
segundo de los cuales se describe en el SEQ ID NO: 13. Estos
cebadores de PCR se utilizaron para identificar genotecas de ADNc
que proporcionan productos de PCR cuando se utilizan como moldes en
reacciones de PCR. El producto de la PCR se identificó en reacciones
de PCR utilizando una genoteca de ADNc lambda de cerebro de ratón
(Clonetech ML3000a).
La genoteca de ADNc lambda de cerebro de ratón
se escrutó y se identificó un clon y se secuenció utilizando
técnicas convencionales. El clon secuenciado carecía del extremo 5'
de la región codificante como se determinó comparando el clon con
la B7L-1 humana. La RT-PCR off de
ARN de cerebro de ratón utilizando el oligonucleótido de entrada
del vector gt10 lambda y el oligonucleótido específico de
B7L-1 humana del SEQ ID NO: 7 amplió la secuencia
desde el extremo 3' hasta el extremo de la secuencia y 5' hasta casi
la longitud completa. El clon codifica un marco de lectura abierto
que comienza en una posición análoga al resto aminoácido 9 de la
B7L-1 humana (SEQ ID NO: 2) y termina en una
posición que es análoga al aminoácido terminal de la
B7L-1 humana. El ADNc de la B7L-1
murina clonada que tiene un líder compuesto murino/humano es
proporcionado en el SEQ ID NO: 3 y su polipéptido codificado es
proporcionado en el SEQ ID NO: 4. La secuencia líder compuesta
murina/humana incluye 7 aminoácidos de la secuencia humana y 12
aminoácidos de la secuencia murina. El clon de B7L-1
murino es idéntico en 95% a la B7L-1 humana del SEQ
ID NO: 1 como se determina mediante el programa GCG GAP. El clon
murino tiene un único espacio y representa una variante de empalme
más corta de B7L-1.
Para investigar la existencia de una variante de
empalme más corta humana de B7L-1, se utilizaron los
cebadores oligonucleotídicos descritos en el SEQ ID NO: 14 y SEQ ID
NO: 15 en reacciones de RT-PCR para sondear el ARN
de cerebro humano. Utilizando metodologías de análisis en gel de
agarosa con bromuro de etidio y Transferencia Southern
convencionales, se demostró que existía y predominaba una forma de
empalme más corta. El producto de la reacción de
RT-PCR se clonó y se sometió a análisis de la
secuencia con un terminador didesoxinucleotídico convencional. El
SEQ ID NO: 5 proporciona la secuencia de nucleótidos de la forma
extracelular larga humana de la B7L-1 y el SEQ ID
NO: 6 proporciona la secuencia de aminoácidos codificada.
Los resultados de este trabajo indican que
existen al menos 2 formas de empalme diferentes de
B7L-1 y la forma predominante es la forma corta que
fue identificada primero mientras se clonaba el homólogo de la
B7L-1 murina.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se describen métodos para
expresar un fragmento soluble y la forma extracelular corta murina
unida a la membrana de B7L-1.
Para preparar un constructo vector para expresar
la forma extracelular corta murina unida a membrana de
B7L-1, se preparó la región codificante del SEQ ID
NO: 3 utilizando una técnica de PCR SOEing. Los oligonucleótidos
utilizados se describen en los SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID
NO: 18. El oligonucleótido 5' más interno (SEQ ID NO: 16) incluyó
las bases para codificar la Met iniciadora y 5 aminoácidos más que
forman los primeros 6 restos del péptido señal de
B7L-1 humana extracelular larga. El oligonucleótido
5' más externo (SEQ ID NO: 17) estuvo presente en un exceso de 9
veces con respecto al oligonucleótido 5' más interno e incluyó un
sitio de restricción SalI. El oligonucleótido 3', descrito en el
SEQ ID NO: 18, incluyó un sitio de restricción NotI.
El producto de la PCR SOEing se sometió a
digestión con enzimas de restricción con SalI y NotI y después se
ligó en un vector de expresión pDC412. El vector de expresión fue
transfectado después en E. coli DH10B mediante
electroporación.
La B7L-1 se expresó utilizando
técnicas descritas por McMahan et al., EMBO J. 10:2821, 1991.
Para recuperar las formas de B7L-1 que están unidas
a la membrana, se cosecharon las células transfectadas, se fijaron
en paraformaldehído al 1%, se lavaron y se utilizaron en su forma
intacta.
Para preparar un constructo vector para expresar
un polipéptido B7L-1 extracelular corto murino
soluble, se preparó la región codificante extracelular del SEQ ID
NO: 3 utilizando una técnica PCR SOEing. Los oligonucleótidos
utilizados fueron idénticos a los utilizados para preparar el
constructo vector para el polipéptido unido a la membrana completo
murino excepto que el oligonucleótido del SEQ ID NO: 12 fue el
oligonucleótido 3', sustituyendo de este modo el SEQ ID NO: 18.
El producto de la PCR SOEing se sometió a
digestión con enzimas de restricción con los sitios SalI y BglII y
después se ligó en un vector Bluescript SK. Esta fusión de clones se
separó por corte con una digestión doble SalI//BglII y se ligó en
un vector de expresión pDC412 digerido con SalI/BglII. El vector de
expresión se transfectó después en E. coli DH10B por
electroporación y el polipéptido B7L-1 murino se
expresó como se ha descrito antes para la proteína
B7L-1 murina completa.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se describe la generación de la
proteína B7L-1/Fc humana que se utilizó para
estudiar las características de unión de B7L-1. La
proteína de fusión incluye la región extracelular pronosticada de la
B7L-1 humana y la región Fc humana de la
muteína.
Para aislar los nucleótidos que codifican el
dominio extracelular del SEQ ID NO: 2 (nucleótidos
108-1249 del SEQ ID NO: 1), se utilizaron los
oligonucleótidos que flanquean la región extracelular de
B7L-1 (SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12) como
cebadores en una reacción de PCR para obtener un producto de PCR del
clon núm. 44904 que fue el molde en la reacción. El producto de la
PCR resultante fue digerido con las enzimas de restricción SalI y
BglII en los sitios SalI y BglII incorporados por los cebadores. El
fragmento resultante se ligó en un vector de expresión (pDC409) que
contenía la región Fc de la IgG1 humana mutada para disminuir la
unión al receptor Fc.
El constructo de ADN resultante se transfectó en
la línea celular de riñón de mono CV-1/EBNA (con la
transfección simultánea de psv3neo). Después de 7 días de cultivo
en medio que contenía suero bovino con bajo contenido de
inmunoglobulina al 0,5%, se añadió al sobrenadante una solución de
azida al 0,2% y el sobrenadante se filtró a través de un filtro de
0,22 \mum. Después se hizo pasar aproximadamente 1 L de
sobrenadante de cultivo a través de un sistema de purificación de
proteína mediante HPLC BioCad Protein A utilizando una columna de
Proteína A de 4,6 x 100 mm (POROS 20A de PerSeptive Biosystems) a 10
mL/min. La columna de Proteína A se une a la Porción Fc de la
proteína de fusión del sobrenadante, inmovilizando la proteína de
fusión y permitiendo que otros componentes del sobrenadante pasen a
través de la columna. La columna se lavó con 30 mL de solución de
PBS y la proteína de fusión unida se hizo eluir de la columna de
HPLC con ácido cítrico ajustado a pH 3,0. La proteína de fusión
purificada eluida se neutralizó a medida que eluía utilizando
solución HEPES 1M a pH 7,4.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se describe la preparación de una
proteína de fusión con Fc murina que incluía la porción extracelular
soluble de la B7L-1 extracelular corta murina y el
péptido Fc de la muteína descrito en el Ejemplo 5. La región
codificante del dominio extracelular de la B7L-1
corta extracelular murina se separó por corte del vector descrito
en el Ejemplo 4 utilizando las enzimas de restricción SalI y BglII.
El fragmento separado por corte se ligó en un vector de expresión
pDC412 que incluía la región IgG1Fc humana.
El constructo de ADN resultante se transfectó en
la línea celular de riñón de mono CV-1/EBNA. Las
células se cultivaron y la proteína de fusión se recogió y se
purificó como se describe en el Ejemplo 5.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se describe la preparación de una
proteína de fusión B7L-1/poliHis humana
(B7L-1/poliHis). El procedimiento incluyó la
preparación de un constructo de ADN que codifica la proteína de
fusión, la transfección en una línea celular con el constructo de
ADN, y la recogida de los sobrenadantes de las células
transfectadas.
Los cebadores oligonucleotídicos descritos en
los SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13, que contenían un sitio de
restricción SpeI, se utilizaron para aislar los nucleótidos que
codificaban los aminoácidos 1-364 del SEQ ID NO: 2
del clon de IMAGE Consortium (H15268, clon núm. 49904). El producto
de la PCR se digirió con las enzimas de restricción SpeI y PstI,
cortando la enzima PstI el producto de la PCR en un sitio dentro de
la región codificante de B7L-1. El producto
separado por corte se ligó en un vector basado en Bluescript
digerido con SpeI/PstI que contenía un líder viral de CMV aguas
arriba y en marco con el sitio SpeI. El constructo de ADNc que
codificaba el líder viral y la B7L-1 fue separado
por corte del vector utilizando digestiones con las enzimas de
restricción SalI y PstI y el constructo separado por corte se ligó
después en una ligación de tres vías con un fragmento PstI/NotI que
contenía el resto del ADNc de la B7L-1 humana y un
vector de expresión pDC409 (McMahon et al., EMBO J. 10:2821,
1991).
El constructo de fusión poliHis se preparó
utilizando un cebador oligonucleotídico que ceba aguas arriba en el
vector preparado como se ha descrito antes (?) y un cebador que
incluye 1) nucleótidos complementarios a aquellos presentes en el
ADNc de la B7L-1 humana que están situados justo
antes del dominio transmembrana; 2) nucleótidos complementarios a
los nucleótidos poliHis; y, un sitio NotI. El fragmento que contiene
poliHis fue digerido con SalI y NotI y después ligado en un vector
pDC409 digerido de una manera similar.
El constructo de fusión de ADN resultante se
transfectó transitoriamente en la línea celular de riñón de mono
COS-1 (ATCC CRL-1650). Después de un
cultivo de 7 días en medio que contenía suero bovino con bajo
contenido de inmunoglobulina al 0,5%, se recogieron los
sobrenadantes celulares y se añadió una solución de azida de sodio
al 0,2% a los sobrenadantes. Los sobrenadantes se filtraron a través
de un filtro de 0,22 \mum, se concentraron 10 veces con un
concentrador a escala prep (Millipore; Bedford, MA) y se purificaron
en una purificación de proteína mediante HPLC BioCad equipada con
una columna de resina auto-empaquetada Nickel NTA
Superflow (Qiagen, Santa Clarita, CA). Después de que el
sobrenadante pasara a través de la columna, se lavó la columna con
Tampón A (NaPO_{4} 20 mM, pH 7,4; NaCl 300 mM; Imidazol 50 mM).
Después se hizo eluir la proteína de la columna utilizando técnicas
de elución en gradiente. Las fracciones que contenían la proteína se
recogieron y se analizaron en un gel reductor de
SDS-PAGE al 4-20%. Las fracciones
que contenían la proteína de fusión B7L-1/poliHis
soluble se reunieron, se concentraron 2 veces, y después se
sometieron a diálisis en PBS. La proteína de fusión
B7L-1/poliHis soluble resultante se filtró a través
de un filtro estéril de 0,22 \mum.
\vskip1.000000\baselineskip
La proteína de fusión B7L-1/Fc
preparada como se describe en el Ejemplo 5 se utilizó para escrutar
líneas celulares en cuanto a la unión utilizando estudios de unión
cuantitativos de acuerdo con las metodologías de citometría de
flujo convencionales. Para cada línea celular escrutada, el
procedimiento implicó incubar aproximadamente 250.000 a 1.000.000
de las células bloqueadas con FCS (suero de ternera fetal) al 2%,
suero de cabra normal al 5% y suero de conejo al 5% en PBS durante
1 hora. Después las células bloqueadas se incubaron con 5 \mug/mL
de proteína de fusión en FCS al 2%, suero de cabra al 5% y suero de
conejo al 5% en PBS. Después de la incubación la muestra se lavó 2
veces con tampón FACS (FCS al 2% en PBS) y después se trató con
Fc/biotina antihumana de ratón (adquirida de Jackson Research) y
SAPE (estreptavidina-ficoeritrina adquirida de
Molecular Probes). Este tratamiento hace que la Fc/biotina
antihumana se una a cualquier B7L-1/Fc unida y la
SAPE se una a la Fc/biotina antihumana dando como resultado una
marca de identificación fluorescente en la B7L-1/Fc
que está unida a las células. Se analizaron las células en busca de
cualquier proteína unida utilizando la citometría de flujo de
detección fluorescente. Los resultados indicaron que la
B7L-1 humana se une bien a la línea epitelial de
pulmón humano (WI-26), a líneas linfoblastoides B
humanas (Daudi y PAE8LBM1, a células B tonsilares recientes
humanas, a células dendríticas CD8+ murinas de bazos/nódulos
linfáticos de animales tratados con flt3-L y a
linfoma de células T murino (S49.1).
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo ilustra un método de preparación de
anticuerpos monoclonales para B7L-1. Se pueden
utilizar B7L-1 purificada, un fragmento de la misma
tal como el dominio extracelular, péptidos sintéticos o células que
expresan la B7L-1 para generar anticuerpos
monoclonales contra B7L-1 utilizando técnicas
convencionales, por ejemplo aquellas técnicas descritas en la
Patente de los Estados Unidos 4.411.993. Brevemente, se inmunizan
roedores con B7L-1 como inmunógeno en coadyuvante
completo de Freund, y se inyecta en cantidades que oscilan entre
10-100 \mug subcutáneamente o
intraperitonealmente. Diez a doce días más tarde, los animales
inmunizados reciben un refuerzo de B7L-1 adicional
emulsionada en coadyuvante incompleto de Freund. Los animales
reciben refuerzo periódicamente después de eso en un programa de
inmunización semanal a bisemanal. Se toman periódicamente muestras
de suero mediante sangría retro-orbital o
extirpación de la punta de la cola para realizar un ensayo en busca
de anticuerpos para B7L-1 mediante análisis de
transferencia puntual, ELISA (Análisis de Inmunoabsorción con
Enzima Ligada), inmunoprecipitación, u otros análisis adecuados,
incluyendo el análisis FACS.
Tras la detección de un título de anticuerpo
apropiado, se suministra a los animales positivos una última
inyección intravenosa de B7L-1 en solución salina.
Tres a cuatro días más tarde, los animales se sacrifican, se
recogen células del bazo, y se fusionan las células del bazo con una
línea celular de mieloma murina, p. ej., NS1 o preferiblemente
P3x63Ag8.653 (ATCC CRL 1580). Las fusiones generan células de
hibridoma, que se cultivan en placa en múltiples placas de
microtitulación en un medio selectivo HAT (hipoxantina, aminopterina
y timidina) para inhibir la proliferación de las células no
fusionadas, híbridos de mieloma, e híbridos de células de bazo.
Las células de hibridoma se escrutan mediante
ELISA en busca de reactividad contra B7L-1
purificada mediante adaptaciones de las técnicas descritas por
Engvall et al., Immunochem. 8:871, 1971 y en la
Patente de los Estados Unidos 4.703.004. Una técnica de escrutinio
preferida es la técnica de captura de anticuerpos descrita por
Beckmann et al., (J. Immunol. 144:4212, 1990). Las
células de hibridoma positivas se pueden inyectar
intraperitonealmente en ratones BALB/c singeneicos para producir
ascitis que contienen elevadas concentraciones de anticuerpos
monoclonales anti- B7L-1-L.
Alternativamente, se pueden hacer crecer células de hibridoma in
vitro en matraces o botellas rodadoras mediante diversas
técnicas. Los anticuerpos monoclonales producidos en las ascitis de
ratón pueden ser purificados mediante precipitación con sulfato de
amonio, seguido de cromatografía de exclusión en gel.
Alternativamente, también se pueden utilizar la cromatografía de
afinidad basada en la unión del anticuerpo a proteína A o proteína
G, como se puede utilizar la cromatografía de afinidad basada en la
unión a B7L-1.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se describen los experimentos de
RT-PCR y Transferencia Northern que se llevaron a
cabo para identificar tipos de tejidos y células que expresan los
polipéptidos B7L-1 humanos y murinos de la presente
invención.
El procedimiento de RT-PCR
implicó la transcripción inversa de aproximadamente 1 \mug de ARN
total de diversas fuentes de tejidos y células humanos para
elaborar ADNc de la primera hebra utilizando Pharmacia, First Strand
cDNA Synthesis Kit siguiendo las instrucciones del fabricante. Las
líneas celulares a partir de las cuales se transcribió el ARN total
incluyeron células dendríticas derivadas de médula ósea humana;
células CD34+ y células CD34-; células B de sangre periférica
humana cultivadas en IL-4, SAC o CD40L; células
dendríticas derivadas de monocitos humanos; monocitos humanos
cultivados en IFN gamma; cerebro humano y de ratón; células B
esplénicas de ratón cultivadas +/- CD40L; células T esplénicas de
ratón +/- estimulación con ConA.
Los resultados de la RT-PCR
indicaron que B7L-1 es expresada células dendríticas
derivadas de CD34+ de médula ósea humana y derivadas de sangre
periférica y células B de sangre periférica humana tras la
estimulación con CD40L. Adicionalmente se encontró ARNm en cerebro
y se encontró una débil señal de PCR en células de médula ósea
CD34-. Los resultados mostraron que la B7L-1 murina
es expresada en células dendríticas esplénicas murinas, células
esplénicas estimuladas con CD40L, y en cerebro murino.
Se realizó el análisis de Transferencia Northern
fraccionando 5 \mug o 10 \mug de ARN total sobre geles de
agarosa al 1,2% que contenían formaldehído. Después se transfirió el
ARN sobre membranas Hybond Nylon utilizando técnicas de
transferencia convencionales. Las transferencias de tejidos
múltiples Poli A+ que contenían 1 \mug de ARNm de ratón de
numerosas fuentes diferentes se adquirieron de Clonetech. Las
transferencias adquiridas fueron prehibridadas de acuerdo con las
instrucciones del fabricante durante al menos 6 horas a 68ºC. Se
generaron ribosondas, que contenían la región codificante de la
B7L-1 murina, utilizando Riboprobe Combination Kit
de Promega y ARN Polimerasa de T7 de acuerdo con las instrucciones
del fabricante. Se utilizaron procedimientos que generaban
Transferencias Northern convencionales como describe Maniatis,
(Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Lab. Press, 1989).
Los resultados del sondeo de las transferencias
Northern con las ribosondas y la visualización de la película de
rayos x resultante en busca de sondas que se unían positivamente
demuestran que se detectaba ARN hibridante en cerebro, hígado,
músculo esquelético y corazón. En el cerebro, se observaron dos
tamaños de bandas. Un ARN tenía aproximadamente 4,0 kB y el otro
aproximadamente 2,7 kB. En el hígado la banda predominante indicó
un ARN hibridante mayoritariamente de 2,7 kB y en el músculo
esquelético y el corazón solamente se observó la banda de ARN de 2,7
kB.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de estudiar la unión a células NK
murinas, se separaron células de bazo de ratones
CB-17/SCID tratados con IL-15 y se
utilizaron como fuente para células NK murinas altamente
enriquecidas y activadas. Las células de bazo aisladas de los
ratones SCID tratados con IL-15 son
DX-5 positivas en 60-80%.
DX-5 es un marcador pan-NK que es
expresado en células NK de muchas cepas de ratones diferentes. El
análisis citométrico de flujo se realizó para detectar la unión de
B7L1 y LDCAM a células NK murinas activadas con
IL-15 in vivo DX-5+. La Tabla
I proporciona los resultados de un estudio de unión con células NK
murinas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La unión de LDCAM y B7L1 se puede detectar en
células NK murinas activadas in vivo.
Los resultados de los experimentos dirigidos al
estudio de la unión de B7L1 y LDCAM a células endoteliales humanas
no demostraron unión en células endoteliales de vena umbilical
humana (HUVEC) de diferentes donantes. Sin embargo, para las HUVEC
de un donante, la B7L1 indujo niveles bajos de CD62E y CD106 en
comparación con la Fc de control.
\vskip1.000000\baselineskip
Basándose en los resultados de los experimentos
de unión descritos en el Ejemplo 8, se escrutaron reservas de ADNc
de una genoteca de expresión de la línea celular
WI-26 en busca de la unión a la proteína de fusión
B7L-1/Fc purificada preparada como se describe en el
Ejemplo 5. La genoteca de expresión se preparó utilizando
metodologías convencionales. Las reservas de ADNc se transfectaron
en células CV1/EBNA y después se incubaron durante 2 días con 1
\mug/mL de proteína de fusión B7L-1/Fc. Tras el
período de incubación con B7L-1/Fc las células se
incubaron con F(AB)_{2} anti-humano
marcado con I^{125}. Se obtuvieron autorradiografías y se
examinaron visualmente en busca de reservas de ADNc positivo que
tuviera B7L-1/Fc unida. Las reservas identificadas
positivamente se subdividieron y se volvieron a escrutar. Se
identificó un único clon que cuando fue transfectado en células
CV1/EBNA que se unía específicamente a la proteína de fusión
B7L-1/Fc.
El clon, denominado LDCAM, se describe más
completamente en la solicitud de patente copendiente S/N
60/
095.672 presentada el 7 de Agosto de 1998.
095.672 presentada el 7 de Agosto de 1998.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se describen experimentos de
unión celular FACS que demuestran las características de unión de
B7L-1 y una proteína para la cual es un compañero de
unión, LDCAM. Las células estudiadas incluyeron células T murinas,
células T humanas, células B murinas, células NK murinas, células
endoteliales humanas, y líneas celulares tumorales humanas.
Para estudiar la unión a las células T murinas,
se cultivaron células de nódulo linfático (LN) murino BALB/c en
medio de cultivo solo y en presencia de diferentes estímulos durante
18-20 horas. Las células cultivadas se cosecharon y
se prepararon para estudios de unión utilizando la proteína de
fusión B7L1/Fc, la proteína de fusión LDCAM/Fc y una proteína Fc de
control. Después de un cultivo durante la noche las células LN
murinas BALB/c son típicamente CD3+ en >90%. La proteína unida
se detectó utilizando un análisis citométrico de flujo. Los
resultados mostrados en la Tabla I indican la unión observada
expresada como las unidades de intensidad de fluorescencia media
(MFI) en células T no estimuladas (medio) y en células T estimuladas
(por medio de estímulos).
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando se analizaron por subgrupos de células T,
el 75-80% de las células T murinas LN CD4+
presentaron una unión a LDCAM detectable después de la estimulación
con anti-TCR in vitro. Aproximadamente el 50%
de las células T murinas LN CD8+ presentan una unión detectable.
Además, las células T CD4+ muestran niveles superiores de unión a
LDCAM que las células T murinas CD8+. Los resultados demuestran que
LDCAM/Fc se une a bajos niveles a las células T vírgenes. Sin
embargo, después de una activación durante la noche con estímulos
policlonales la unión aumento 5-20 veces
dependiendo del estímulo. De los estímulos estudiados, PMA induce la
mínima unión de LDCAM a las células T murinas, y
anti-TCR induce la unión más elevada.
Para estudiar las células T que se unen a LDCAM
y su contraestructura, B7L-1, se cultivaron células
T de sangre periférica humana (PB) en medio de cultivo solo o en
presencia de diferentes estímulos durante 18-20
horas. Las células cultivadas se recogieron y se prepararon para
los estudios de unión utilizando la proteína de fusión B7L1/Fc, la
proteína de fusión LDCAM/Fc y una proteína Fc de control. La
proteína unida en las células T PB humanas se determinó mediante
análisis citométrico de flujo. En la Tabla II se detallan los
resultados observados, expresados como MFI, en células T no
estimuladas (medio) y en células T estimuladas (por medio de
estímulos).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados muestran que, PMA induce una
unión a LDCAM mayor en células T humanas que en células T murinas.
La presencia de unión específica con LDCAM tanto a células T murinas
como humanas en ausencia de unión con B7L1 sugiere que LDCAM se
está uniendo a B7L1, o una molécula diferente y no a sí misma.
Debido a que los estudios indican que las células T expresan poca o
ninguna B7L1, LDCAM puede tener otro compañero de unión.
Se realizaron estudios similares a los descritos
antes para evaluar la unión de LDCAM y B7L1 a células B esplénicas
murinas. No se detectó la unión de B7L1 ni de LDCAM en células B
murinas no estimuladas. El cultivo de células B esplénicas murinas
con muCD40L o LPS indujo niveles bajos de unión a LDCAM pero no se
detectó un nivel apreciable de unión a B7L1.
Con el fin de estudiar la unión de células NK
murinas, se separaron los bazos de ratones
CB-17/SCID tratados con IL-15 y se
utilizaron como fuente de células NK murinas altamente enriquecidas
y activadas. Las células del bazo aisladas de ratones SCID tratados
con IL-15 son DX-5 positivas en
60-80%. DX-5 es un marcador pan NK
que es expresado en células NK de muchas cepas de ratones
diferentes. Se realizó un análisis citométrico de flujo como se a
descrito antes para detectar la unión de B7L1 y LDCAM a células NK
murinas activadas con IL-15 in vivo
DX-5+. La Tabla II proporciona los resultados de un
estudio de unión en células NK murinas.
En contraste con lo observado en las células T
murinas y humanas, la unión de LDCAM y B7L1 puede ser detectada en
células NK murinas activadas in vivo.
Los resultados de los experimentos dirigidos al
estudio de la unión de B7L1 y LDCAM a células endoteliales humanas
no demostraron unión en células endoteliales de vena umbilical
humana (HUVEC) de diferentes donantes. Sin embargo, para una HUVEC
de un donante, B7L1 indujo niveles bajos de CD62E y CD106 en
comparación con la Fc de control.
La Tabla IV detalla los resultados de los
experimentos dirigidos a evaluar la unión de B7L1 y LDCAM a líneas
celulares tumorales humanas. Los resultados se expresan como el
porcentaje de células que se unen a LDCAM o B7L1.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados muestran una unión a LDCAM
significativa en la línea celular de carcinoma de ovario y 2 de las
líneas tumorales de células B humanas (MP-1 y Tonsil
G). B7L1 también se une a estas tres líneas celulares tumorales pero
a niveles mucho menores. Estos resultados demuestran que LDCAM es un
marcador para ciertos tipos de linfomas de células B o diferentes
tipos de carcinomas. Además, la señalización biológica mediada por
LDCAM o B7L1 podría mediar los efectos
anti-tumorales funcionales en estos tipos de
tumores.
<110> Baum, Peter
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Moléculas llamadas B7L1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 2844-WO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> - - - a asignar
- - -
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1999-08-05
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/095,663
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1998-08-07
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1820
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Forma Larga de B7L-1
Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia codificante
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 157...1452
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 432
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Proteína
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Forma Larga de B7L-1
Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1273
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> B7L-1 de Múrido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia Codificante
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 13...1206
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 398
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Proteína
\vskip0.400000\baselineskip
<213> B7L-1 de Múrido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1718
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Forma Corta de B7L-1
Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia Codificante
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 157...1350
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 398
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Proteína
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Forma Corta de B7L-1
Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Cebador de Oligonucleótido
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Cebador de Oligonucleótido
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
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<212> Oligonucleótido
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Oligonucleótido
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Cebador de Oligonucleótido
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Múrido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Cebador de Oligonucleótido
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Múrido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Cebador de Oligonucleótido
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
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<211> 20
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<212> Cebador de Oligonucleótido
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Cebador de Oligonucleótido
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Múrido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Cebador de Oligonucleótido
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Múrido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Cebador de Oligonucleótido
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Múrido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1535
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> LDCAM Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia Codificante
\vskip0.400000\baselineskip
<212> 16...1341
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 442
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Proteína
\vskip0.400000\baselineskip
<213> LDCAM Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1935
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> LDCAM de Múrido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia Codificante
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 2...1272
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 423
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Proteína
\vskip0.400000\baselineskip
<213> LDCAM de Múrido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (13)
1. Un ácido nucleico aislado que codifica un
polipéptido que tiene una secuencia como se muestra en los SEQ ID
NO: 2, 4, o 6, donde el polipéptido se une a un polipéptido
seleccionado del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 20 y el SEQ ID
NO: 22.
2. Un ácido nucleico aislado que codifica un
polipéptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que
consiste en:
a) los aminoácidos X_{1} a 364 del SEQ ID NO:
2;
b) los aminoácidos X_{1} a 330 del SEQ ID NO:
4;
c) los aminoácidos X_{1} a 330 del SEQ ID NO:
6; y
donde X_{1} es de 1 a 21, y donde el
polipéptido se une a un polipéptido seleccionado del grupo que
consiste en el SEQ ID NO: 20 y el SEQ ID NO: 22.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Un ácido nucleico aislado que comprende un
miembro del grupo que consiste en:
a) los nucleótidos X_{1} a 1452 del SEQ ID NO:
1, donde X_{1} es el nucleótido 157 o 217;
b) los nucleótidos X_{1}' a 1206 del SEQ ID
NO: 3, donde X_{1}' es el nucleótido 13 o 73;
c) los nucleótidos X_{1} a 1350 del SEQ ID NO:
5, donde X_{1} es el nucleótido 157 o 217;
d) cualquiera de los ácidos nucleicos de a) a c)
donde el ácido nucleico es ARN; y
e) un ácido nucleico que, debido a la
degeneración del código genético, codifica un polipéptido
B7L-1 que tiene la secuencia de aminoácidos del
polipéptido codificado por una secuencia de a), b), c) o d).
\vskip1.000000\baselineskip
4. Un polipéptido purificado codificado por un
ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en:
a) el nucleótido X_{1} a 1452 del SEQ ID NO:
1, donde X_{1} es el nucleótido 157 o 217;
b) los nucleótidos X_{1}' a 1206 del SEQ ID
NO: 3, donde X_{1}' es el nucleótido 13 o 73;
c) los nucleótidos X_{1} a 1350 del SEQ ID NO:
5, donde X_{1} es el nucleótido 157 o 217; y
5. Un polipéptido purificado que tiene una
secuencia como se muestra en los SEQ ID NO: 2, 4, o 6, donde el
polipéptido purificado se une al polipéptido seleccionado del grupo
que consiste en el SEQ ID NO: 20 y el SEQ ID NO: 22.
6. Un polipéptido purificado que tiene una
secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
a) los aminoácidos X_{1} a 364 del SEQ ID NO:
2;
b) los aminoácidos X_{1} a 330 del SEQ ID NO:
4;
c) los aminoácidos X_{1} a 330 del SEQ ID NO:
6; y
donde X_{1} es de 1 a 21, y donde el
polipéptido se une a un polipéptido seleccionado del grupo que
consiste en el SEQ ID NO: 20 y el SEQ ID NO: 22.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Una proteína de fusión que comprende una
secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
a) los aminoácidos X_{1} a 364 del SEQ ID NO:
2;
b) los aminoácidos X_{1} a 330 del SEQ ID NO:
4;
c) los aminoácidos X_{1} a 330 del SEQ ID NO:
6; y
donde X_{1} es de 1 a 21, y donde el
polipéptido se une a un polipéptido seleccionado del grupo que
consiste en el SEQ ID NO: 20 y el SEQ ID NO: 22.
8. Un vector de expresión recombinante que
comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3.
9. Una célula anfitriona transformada o
transfectada con el vector de expresión recombinante de la
reivindicación 8.
10. Un método para preparar un polipéptido, que
comprende cultivar la célula anfitriona de la reivindicación 9 en
condiciones que promueven la expresión del polipéptido.
11. El método de la reivindicación 10, que
comprende adicionalmente la recuperación del polipéptido del
cultivo.
12. Un polipéptido producido a partir del
cultivo de una célula anfitriona de la reivindicación 9 en
condiciones adecuadas para expresar el polipéptido, donde el
polipéptido tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste
en:
a) los aminoácidos X_{1} a 364 del SEQ ID NO:
2;
b) los aminoácidos X_{1} a 330 del SEQ ID NO:
4;
c) los aminoácidos X_{1} a 330 del SEQ ID NO:
6; y
donde X_{1} es de 1 a 21, y donde el
polipéptido se une a un polipéptido seleccionado del grupo que
consiste en el SEQ ID NO: 20 y el SEQ ID NO: 22.
\vskip1.000000\baselineskip
13. Una composición que comprende un portador
adecuado y un polipéptido o proteína de cualquiera de las
reivindicaciones 4-7.
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