JP2003116561A

JP2003116561A - Ｔｓｌｌ１遺伝子

Info

Publication number: JP2003116561A
Application number: JP2001313966A
Authority: JP
Inventors: Yoshinori Murakami; 善則村上; Yukio Nomura; 幸男野村
Original assignee: BML Inc; National Cancer Center Japan
Current assignee: BML Inc; National Cancer Center Japan
Priority date: 2001-10-11
Filing date: 2001-10-11
Publication date: 2003-04-22
Also published as: US20030109016A1

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】癌抑制遺伝子ＴＳＬＣ１の他に、これと、構造
上または機能上の関連性を有する癌抑制遺伝子を見出し
て、さらに、癌予防や癌治療に関する新たな手段を提供
すること。【解決手段】癌抑制遺伝子ＴＳＬＣ１と相同性が認めら
れるが、これとは異なる第１染色体上に存在する癌抑制
遺伝子（ＴＳＬＬ１遺伝子）を新たに見出し、そのアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列を明らかにした。また、
これに関連するタンパク質、ベクター、形質転換体およ
び抗体を提供することにより、上記の課題を解決し得る
ことを見出した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、特定の遺伝子、さ
らに具体的には、癌抑制遺伝子と、これに関連するタン
パク質、ベクター、形質転換体および抗体に関する発明
である。

【０００２】

【従来の技術】癌に対する研究が進展するにつれて、癌
の発症を抑制する役割を担っている遺伝子である、癌抑
制遺伝子の存在がクローズアップされており、現在まで
に、数多くの癌抑制遺伝子が見出されている。

【０００３】例えば、網膜芽細胞腫におけるＲＢ遺伝
子、神経線維腫症のＮＦ１，ＮＦ２遺伝子、家族性大腸
ポリポーシスのＡＰＣ遺伝子、Wilms 腫瘍のＷＴ１遺伝
子、多発性内分泌腫瘍症のＭＥＮ１遺伝子、Li-Fraumen
i 症候群のｐ５３遺伝子、vonHippel-Lindau 症候群の
ＶＨＬ遺伝子、遺伝性乳癌のＢＲＣＡ１，ＢＲＣＡ２遺
伝子、遺伝性メラノーマのｐ１６遺伝子、結節性硬化症
（肉腫，脳腫瘍）のＴＳＣ１，ＴＳＣ２遺伝子、母斑性
基底細症候群のＰＴＣＨ遺伝子等が、現在までに見出さ
れている癌抑制遺伝子として挙げられる。

【０００４】癌抑制遺伝子は、主に、細胞の増殖を抑制
することにより、細胞の癌化を阻んでいることが知られ
ており、また、ミスマッチ修復遺伝子群や、細胞接着に
係わる遺伝子群も、癌の抑制に係わっているらしいこと
が知られている。

【０００５】癌抑制遺伝子は、癌の発症前診断、癌の質
的診断、癌治療の予後の予測、癌の転移性の予測、化学
療法や放射線療法に対する癌の感受性の予測、遺伝子治
療等に極めて有用な遺伝子であり、可能な限り多くの癌
抑制遺伝子を見出すべく、日夜、検討が行われている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、非小細
胞肺癌で、高頻度に染色体におけるヘテロ接合性の消失
を示す、第１１染色体長腕に位置する、癌抑制遺伝子Ｔ
ＳＬＣ１を新たに見出した。肺腺癌細胞Ａ５４９の腫瘍
原性の抑制を指標として見出された、この癌抑制遺伝子
ＴＳＬＣ１は、多数の進行癌細胞に対しても腫瘍抑制活
性を示すことから、新たな癌治療の標的になり得ると期
待されている。

【０００７】本発明が解決すべき課題は、この癌抑制遺
伝子ＴＳＬＣ１の他に、これと、構造上または機能上の
関連性を有する癌抑制遺伝子を見出して、さらに、癌予
防や癌治療に関する新たな手段を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者は、この課題の
解決に向けて、癌抑制遺伝子ＴＳＬＣ１について、さら
に深い検討を重ねた結果、この癌抑制遺伝子と相同性が
認められるが、これとは異なる、第１染色体上に存在す
る、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩
基配列を含む、新たな癌抑制機能を有する遺伝子を見出
して本発明を完成した。

【０００９】すなわち、本発明は、配列番号１で表され
るアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子（以
下、本遺伝子またはＴＳＬＬ１遺伝子ともいう）を提供
する発明である。

【００１０】本発明者が、本遺伝子を見出した過程につ
いては、本明細書の実施例の欄において開示する。ま
た、本明細書におけるアミノ酸の標記方法は、三文字法
と一文字法を併用する。すなわち、本明細書において
は、アラニンはＡｌａ（三文字法）〔Ａ（一文字法）〕
で、バリンはＶａｌ（Ｖ）で、ロイシンはＬｅｕ（Ｌ）
で、イソロイシンはＩｌｅ（Ｉ）で、プロリンはＰｒｏ
（Ｐ）で、フェニルアラニンはＰｈｅ（Ｆ）で、トリプ
トファンはＴｒｐ（Ｗ）で、メチオニンはＭｅｔ（Ｍ）
で、グリシンはＧｌｙ（Ｇ）で、セリンはＳｅｒ（Ｓ）
で、トレオニンはＴｈｒ（Ｔ）で、システインはＣｙｓ
（Ｃ）で、グルタミンはＧｌｎ（Ｑ）で、アスパラギン
はＡｓｎ（Ｎ）で、チロシンはＴｙｒ（Ｙ）で、リシン
はＬｙｓ（Ｌ）で、アルギニンはＡｒｇ（Ｒ）で、ヒス
チジンはＨｉｓ（Ｈ）で、アスパラギン酸はＡｓｐ
（Ｄ）で、グルタミン酸はＧｌｕ（Ｅ）として標記され
得る。

【００１１】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態を説明
する。Ａ．本遺伝子の内容本遺伝子は、前述したように、配列番号１で表されるア
ミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子である。

【００１２】本遺伝子は、９個のエクソンからなる、約
３０Kbにわたる遺伝子であり、エクソン１に次いで、７
か所の、９１〜１７１bpの範囲の比較的小さなエクソン
が続き、最後に大きなエクソン９が続いている。エクソ
ン１は、コザックのコンセンサス配列の下流に位置する
メチオニンの開始コドンを含んでいる。また、本遺伝子
の上流領域はグアニンとシトシンの含有量が多くなり、
７５４bpのＣｐＧのアイランド領域が認められる。

【００１３】本遺伝子の配列から予測されるアミノ酸配
列（配列番号２）から、本遺伝子は、３か所の潜在的な
Ｎ−糖鎖付加部位を有する免疫グロブリン様Ｃ２−タイ
プループと、１か所の細胞膜貫通領域と短い細胞質領域
をコードしていることを推測することができる。細胞質
領域における、本遺伝子と癌抑制遺伝子ＴＳＬＣ１との
アミノ酸配列の相同性は７６％であり、全配列における
本遺伝子と癌抑制遺伝子ＴＳＬＣ１とのアミノ酸配列の
相同性は３７％である。このことにより、本遺伝子がコ
ードするタンパク質は、免疫グロブリンのスーパーファ
ミリーに属するタンパク質であるということがわかる。

【００１４】また、本遺伝子の染色体上の座位は、第１
染色体上（１ｑ２１．２−２２）であり、ヒトの脳にお
いて特異的に発現している遺伝子である。本遺伝子は、
少なくとも、脳・神経系細胞由来の癌の発症に関して深
く係わっており、特に、かかる脳・神経系細胞における
発癌を抑制する機能を有する遺伝子である。

【００１５】Ｂ．本遺伝子の製造本遺伝子は、例えば、ヒト脳組織由来のｐｏｌｙ（Ａ）
⁺ＲＮＡからｃＤＮＡを調製して、これを鋳型としたＰ
ＣＲ法等の遺伝子増幅法を用いて得ることができる。

【００１６】具体的には、常法（例えば、ｐｏｌｙ
（Ａ）⁺ＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素を用いる方
法）で、ＴＳＬＬ１をコードし得るｃＤＮＡを調製し
て、ＰＣＲ法等の遺伝子増幅法を用いて、このｃＤＮＡ
を増幅する。

【００１７】また、ＰＣＲ法による増幅に必要なＰＣＲ
プライマーとして、例えば、ＴＳＬＬ１遺伝子に対する
特異的なプライマーを用いることができる。具体的に
は、後述のようにして決定された本遺伝子のコード領域
の５’末端側と同３’末端側の配列を含むＤＮＡ断片を
プライマーとして、本遺伝子を大量に増幅して、これを
用いることができる。

【００１８】遺伝子増幅用プライマーの塩基配列は、選
択する遺伝子増幅方法に応じた配列を用いることが可能
であり、特に限定されないが、通常、遺伝子増幅を行う
遺伝子領域の５’末端側と３’末端側のそれぞれに相補
的な塩基配列のプライマーを用いることにより、かかる
遺伝子増幅用プライマーに挟まれた、本遺伝子に相当す
る遺伝子を増幅することができる。遺伝子増幅用プライ
マーにおける塩基数は、特に限定されるものではない
が、通常は、１７〜３５塩基程度であり、２０〜３０塩
基程度が好適である。塩基数が少な過ぎると、本来、ハ
イブリダイズするべき領域へのハイブリダイズの精度が
下がり、多過ぎると、コスト高になったり、取扱いが煩
雑になる傾向が認められる。また、鋳型となるハイブリ
ダイズ領域との相補性は、ハイブリダイズの確実性を向
上させる上で、可能な限り高いことが好適である、特
に、プライマーの３’末端側は、鋳型配列との相補性は
高いことが好適である。

【００１９】遺伝子増幅用プライマーとしては、例え
ば、下記のような塩基配列のヌクレオチド鎖が例示され
るが、これに限定されるものではない。５’−ＣＣＴＴＴＣＧＧＴＣＡＡＣＡＴＣＧＴＡＧＴＣ
ＣＡＣＣＣＣＣＴ−３’（配列番号３）５’−ＴＡＣＡＡＧＴＣＣＧＧＧＴＴＧＧＴＧＡＣＧＧ
ＣＣＣＣＡＧＣＡ−３’（配列番号４）

【００２０】これらの特異的な遺伝子増幅用プライマー
は、通常は、化学合成により調製される。また、必要に
応じて、この遺伝子増幅用プライマーに適当な制限酵素
認識部位を含む塩基配列を付加することもできる。

【００２１】このようにして得られた遺伝子増幅産物か
ら、ＴＳＬＬ１遺伝子を含むものを濃縮することができ
る。例えば、ＴＳＬＬ１遺伝子に特異的な塩基配列を有
するポリヌクレオチドに標識を施したものを、プローブ
として、遺伝子増幅産物にハイブリダイズさせ、この標
識に基づいて、ＴＳＬＬ１遺伝子を含むｃＤＮＡ断片と
して選択することが可能である。

【００２２】ここで用いる標識は、上記選別方法を行う
ことが可能である限り特に限定されないが、可能な限り
標識と選別が簡便な手段を用いることが好ましいことは
勿論である。かかる点より、例えばビオチンでｃＤＮＡ
断片を標識して、標識されたｃＤＮＡ断片をストレプト
アビジンに吸着させる手法等を用いることが有利であ
る。

【００２３】このようにして、所望する本遺伝子ｃＤＮ
Ａを得ることができる。なお、このようにして調製した
本遺伝子を、適切な遺伝子導入用ベクターに組み込み、
これを選択した遺伝子導入用ベクターに適した宿主細胞
に導入することにより、本遺伝子が導入された形質転換
体を得ることができる。遺伝子導入用ベクターにｃＤＮ
Ａ断片が組み込まれたか否かは、このベクターが保有す
る，例えばlac Ｚ遺伝子活性によるカラーセレクション
等によって確認することができる。

【００２４】また、この遺伝子の導入工程を、市販の遺
伝子ライブラリー調製用キットを用いて行うことも可能
である。本遺伝子を有するクローンは、例えば、ＴＳＬ
Ｌ１遺伝子に特異的な塩基配列のヌクレオチド鎖を調製
し、これに標識を施して標識プローブとして、各クロー
ンのレプリカとハイブリダイズさせて、この標識プロー
ブとハイブリダイズするクローンを選別して、このクロ
ーンを本遺伝子であるＴＳＬＬ１遺伝子を保有するクロ
ーンとすることができる。

【００２５】上述のようにして得られた本遺伝子の塩基
配列の確認は、常法に従って行うことができる。例え
ば、マキサム−ギルバート法（Maxam,A.M.,and Gilber
t,W.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,74,560(1977)），ジ
デオキシ法（Sanger,F.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.
S.A.,74,5463(1977)），ゲノミック・シークエンス法
（Church,G.M.and Gilbert,W.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.
S.A.,81,1991(1984)），マルチプレックス法（Church,
G.M. and Kieffer-Higgins,S.,Science,240,185(198
8)），サイクルシークエンス法（Murray,V.,Nucleic Ac
ids Res.,17,8889(1989)）等の方法を用いて、対象の塩
基配列を確認することができる。

【００２６】なお、これらの原理を応用した塩基配列自
動解析装置を用いて、この塩基配列を確認することも勿
論可能である。さらに、ホスファイト−トリエステル法
（Ikehara,M.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,5
956(1984) ）等の通常公知の方法を用いて本遺伝子断片
を化学合成することも可能であり、これらの化学合成法
を応用したＤＮＡシンセサイザーを用いて本遺伝子断片
を合成することも可能である。

【００２７】なお、このようにして製造する本遺伝子の
塩基配列の一部を改変して、この塩基配列の一部の塩基
が欠失，置換若しくは挿入された塩基配列からなる改変
遺伝子（ただし、大規模な欠失，置換若しくは挿入を施
した塩基配列の場合は、非改変の本遺伝子と対応する部
分の相同性が概ね９０％以上である）の存在を本発明者
は認識し、このような改変遺伝子にも本発明の技術的範
囲は及ぶものである。

【００２８】この遺伝子改変法として、通常公知の方
法、例えばいわゆるサイト−スペシフィックミュータジ
ェネシス（Site-Specific Mutagenesis)（Mark,D.F.,et
al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 81,5662(1984) ）等
の方法を用いて、所望する遺伝子改変を行うことができ
る。

【００２９】この本発明の技術的範囲が及び得る本遺伝
子は、ストリンジェントな条件下｛系におけるＤＮＡ同
士のハイブリッドが形成しにくい条件〔具体的には、系
の温度（高い程ハイブリッドしにくい）や塩濃度（低い
程ハイブリッドしにくい）や、ホルムアミド等の変性剤
の濃度（高い程ハイブリッドしにくい）等に依存する〕
のことをいう。｝で配列番号２（後述する）で表される
塩基配列のＤＮＡとハイブリダイズし、さらに配列番号
１（後述する）で表されるアミノ酸配列を有するＴＳＬ
Ｌ１と実質的に同一の生物学的活性を有する、ＴＳＬＬ
１をコードする遺伝子である。

【００３０】ここにいう「実質的に同一」とは、その生
物学的活性が比較の対象となるＴＳＬＬ１の生物学的活
性と質的及び／又は量的に同一性を有することを意味す
る。

【００３１】Ｃ．本遺伝子の有用性（１）遺伝子診断における有用性本遺伝子を、癌に関する遺伝子診断に利用することが可
能である。つまり、本遺伝子は、脳・神経系細胞の癌抑制遺伝子であるた
めに、腫瘍の生検試料における、ヘマトキシリンエオジ
ン染色等の染色像の病理診断と共に、本遺伝子を、少な
くともターゲットの一つとした遺伝子の解析を行うこと
で、その生検試料の悪性度を検討することが可能であ
る。

【００３２】具体的には、生検試料のＤＮＡにおける、
本遺伝子の変異、欠失等の有無を検出することにより、
その試料提供者における腫瘍の悪性度を把握する一要素
とすることができる。すなわち、生検試料のＤＮＡにお
ける本遺伝子に、変異や欠失が認められない場合には、
本遺伝子が腫瘍抑制的に働いていることが推定され、悪
性度を低く判定する要素となり得るが、逆に、変異や欠
失が認められると、本遺伝子が正しく機能していないも
のと推測され、悪性度が高く判定される要素となり得
る。

【００３３】また、上記の変異や欠失を、被検者の予後
の判定要素とすることも可能である。特に、本遺伝子
は、細胞の接着等に関連していることも予想されるため
に、本遺伝子が、癌の浸潤や転移に抑制的に働いている
可能性が高い。よって、本遺伝子の変異や欠失を、対象
となる腫瘍の浸潤や転移の危険度を判定する要素とする
ことも可能である。

【００３４】腫瘍を発症する前に、本遺伝子の異常を
検出することで、被検者の脳・神経系腫瘍の発生の危険
度を判定する要素とすることが可能である。すなわち、
被検者の検体において、本遺伝子における、変異、欠失
等の異常が認められる場合には、本遺伝子が癌抑制遺伝
子として正常に機能しておらず、被検者の脳・神経系の
腫瘍発生頻度を高く判定する一要素となり得る。

【００３５】（２）遺伝子治療における有用性特に、上記の遺伝子診断において、本遺伝子における変
異や欠失が認められ、本遺伝子の機能が正常に働いてい
ないと判断される者（対象となる癌の未発症者と既発症
者の両者を含む）に対して、正常の本遺伝子を補うこと
により、癌の発症を抑制したり、発症した癌の治療を行
うことができる。

【００３６】すなわち、本遺伝子（好ましくは、本遺伝
子を発現させるための、プロモーター等を結合させた形
式であることが好適である）を、遺伝子治療において用
いられ得る遺伝子導入ベクター（例えば、レトロウイル
スベクターやアデノウイルスベクター等）に組み込ん
で、これを、対象者に投与することにより、対象者にお
ける本遺伝子の機能を回復させ、癌の発症の抑制や癌の
治療に用いることが可能である。

【００３７】Ｄ．ＴＳＬＬ１タンパク質の製造：さら
に、このようにして入手した、本遺伝子である、ＴＳＬ
Ｌ１遺伝子を用いて、組換えＴＳＬＬ１タンパク質（以
下、ＴＳＬＬ１タンパク質ともいう。このＴＳＬＬ１タ
ンパク質には、特に断らない限り上記の改変遺伝子から
翻訳され得るＴＳＬＬ１タンパク質が含まれ、勿論これ
らの改変遺伝子から翻訳され得る改変タンパク質は、改
変されていないＴＳＬＬ１タンパク質と実質的に同一の
生物学的活性を有する。）を製造することができる。

【００３８】このＴＳＬＬ１タンパク質は、上記本遺伝
子を利用して、通常公知の一般的な遺伝子組換え技術に
従って製造することができる。より具体的には、本遺伝
子が発現可能な形態の遺伝子発現用ベクターに本遺伝子
を組み込み、この遺伝子発現用ベクターの性質に応じた
宿主にこの組換えベクターを導入して形質転換し、この
形質転換体を培養等することにより所望のＴＳＬＬ１タ
ンパク質を製造することができる。

【００３９】ここで用いる遺伝子発現用ベクターは、通
常発現しようとする遺伝子の上流域に、エンハンサー、
プロモーター、翻訳開始配列、及び、下流域に転写終了
配列等を保有するものを用いるのが好適である。

【００４０】また、本遺伝子の発現は、直接発現系に限
らず、例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子，グルタチ
オン−Ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子やチオレドキシン
遺伝子を利用した融合タンパク質発現系とすることもで
きる。

【００４１】かかる遺伝子発現用ベクターとしては、例
えば宿主を大腸菌とするものとしては、ｐＱＥ，ｐＧＥ
Ｘ，ｐＴ７−７，ｐＭＡＬ，ｐＴｒｘＦｕｓ，ｐＥＴ，
ｐＮＴ２６ＣII等を例示することができる。また、宿主
を枯草菌とするものとしては、ｐＰＬ６０８，ｐＮＣ
３，ｐＳＭ２３，ｐＫＨ８０等を例示することができ
る。

【００４２】また、宿主を酵母とするものとしては、ｐ
ＧＴ５，ｐＤＢ２４８Ｘ，ｐＡＲＴ１，ｐＲＥＰ１，Ｙ
Ｅｐ１３，ＹＲｐ７，ＹＣｐ５０等を例示することがで
きる。

【００４３】また、宿主を哺乳動物細胞又は昆虫細胞と
するものとしては、ｐ９１０２３，ｐＣＤＭ８，ｐｃＤ
Ｌ−ＳＲα２９６，ｐＢＣＭＧＳＮｅｏ，ｐＳＶ２ｄｈ
ｆｒ，ｐＳＶｄｈｆｒ，ｐＡｃ３７３，ｐＡｃＹＭ１，
ｐＲｃ／ＣＭＶ，ｐＲＥＰ４，ｐｃＤＮＡＩ等を例示す
ることができる。

【００４４】これらの遺伝子発現ベクターは、ＴＳＬＬ
１タンパク質を発現させる目的に応じて選択することが
できる。例えば大量にＴＳＬＬ１タンパク質を発現させ
ることを企図する場合には、宿主として大腸菌，枯草菌
又は酵母等を選択し得る遺伝子発現ベクターを選択する
のが好ましく、少量でも確実に活性を有するようにＴＳ
ＬＬ１タンパク質を発現させることを企図する場合に
は、哺乳動物細胞や昆虫細胞を宿主として選択し得る遺
伝子発現ベクターを選択するのが好ましい。

【００４５】なお、上記のように既存の遺伝子発現ベク
ターを選択することも可能であるが、目的に応じて適宜
遺伝子発現ベクターを作出して、これを用いることも勿
論可能である。なお、これらの遺伝子発現用ベクターも
本発明の技術的範囲に入るものである。

【００４６】本遺伝子を組み込んだ上記遺伝子発現用ベ
クターの宿主細胞への導入及びこれによる形質転換法
は、一般的な方法、例えば宿主細胞が大腸菌や枯草菌で
ある場合には、塩化カルシウム法やエレクトロポレーシ
ョン法等を；宿主が哺乳動物細胞や昆虫細胞の場合はリ
ン酸カルシウム法，エレクトロポレーション法又はリポ
ソーム法等の手段により行うことができる。

【００４７】このようにして得られる形質転換体を常法
に従い培養することにより、所望するＴＳＬＬ１タンパ
ク質が蓄積される（このような形質転換体も本発明の技
術的範囲に含まれる。）。

【００４８】かかる培養に用いられる培地は、宿主の性
質に応じて適宜選択することができるが、例えば宿主が
大腸菌である場合には、ＬＢ培地やＴＢ培地等が、宿主
が哺乳動物細胞の場合には、ＲＰＭＩ１６４０培地等を
適宜用いることができる。

【００４９】この培養により得られる培養物からのＴＳ
ＬＬ１タンパク質の単離及び精製は、常法に従い行うこ
とが可能であり、例えば培養物を、ＴＳＬＬ１タンパク
質の物理的及び／又は化学的性質を利用した各種の処理
操作を用いて行うことが可能である。

【００５０】具体的には、タンパク沈澱剤による処理，
限外濾過，ゲル濾過，高速液体クロマトグラフィー，遠
心分離，電気泳動，特異抗体を用いたアフィニティクロ
マトグラフィー，透析法等を単独で又はこれらの方法を
組み合わせて用いることができる。

【００５１】このようにして、ＴＳＬＬ１タンパク質を
単離、精製することが可能である。ＴＳＬＬ１タンパク
質を抗原として用いることにより、ＴＳＬＬ１を特異的
に認識する抗体を製造することが容易となり、これを、
例えば、診断目的で利用することができる。また、ＴＳ
ＬＬ１タンパク質をもとにして、その類似構造体を製造
したり、また、その機能を活性化させる分子を単離、あ
るいは、合成し、神経膠腫の治療に役立てることができ
る。また、ＴＳＬＬ１タンパク質を、細胞内で発現させ
ることにより、その細胞内における局在部位を決定した
り、細胞内でＴＳＬＬ１タンパク質と結合し、相互作用
する、他のタンパク質を同定することもできる。これら
の結合タンパク質は、ＴＳＬＬ１タンパク質と共に、神
経膠腫等の脳腫瘍を抑制し得る経路の解明や、抑制する
物質の同定や合成等に利用することができる。

【００５２】Ｅ．ＴＳＬＬ１タンパク質に対する抗体の
製造：本発明は、ＴＳＬＬ１タンパク質に対する抗体
（以下、本抗体ともいい、本抗体が、ポリクローナル抗
体である場合には、本ポリクローナル抗体ともいい、本
抗体が、モノクローナル抗体である場合には、本モノク
ローナル抗体ともいう）にも関する。すなわち、本ポリ
クローナル抗体は、ＴＳＬＬ１タンパク質を免疫抗原と
して免疫した動物に由来する免疫血清から製造すること
ができる。

【００５３】ここで使用される免疫抗原としてのＴＳＬ
Ｌ１タンパク質は、特に限定されるものではなく、上記
のごとく調製される本遺伝子（その塩基配列の一部を改
変したものも含む）がコードするＴＳＬＬ１タンパク質
を用い得ることは勿論のこと、本遺伝子の一部断片がコ
ードするＴＳＬＬ１タンパク質断片やＴＳＬＬ１タンパ
ク質に直接酵素処理等を施して、又は化学合成して得ら
れるＴＳＬＬ１タンパク質の部分ペプチドをも本ポリク
ローナル抗体を製造する上での免疫抗原とすることがで
きる。なお、用いるＴＳＬＬタンパク質由来の部分ペプ
チドが小さい場合等、必要に応じて、ハプテンをかかる
ペプチドに結合させて、これを免疫抗原として用いるこ
とも可能である。

【００５４】また、免疫動物と同種・同系統の動物由来
の細胞株に、ＴＳＬＬ１タンパク質（ＴＳＬＬ１タンパ
ク質を含む）又はその一部をコードする遺伝子を組み込
んだ発現ベクターを導入して形質転換して、この形質転
換細胞をその免疫動物に移植することにより本ポリクロ
ーナル抗体を調製することができる。すなわち、形質転
換細胞を移植した動物の体内で、持続的に上記ＴＳＬＬ
１タンパク質がその形質転換細胞で作られ、それに対す
る抗体が産生されて、これをポリクローナル抗体とする
こともできる（Nemoto,T.,et al.,Eur.J.Immunol.,25,3
001(1995) ）。

【００５５】さらに、ＴＳＬＬ１タンパク質を発現する
発現ベクターを直接動物に筋注や皮下注等の手段で投与
することにより、その動物内でＴＳＬＬ１タンパク質を
継続的に産生させて、上記の形質転換細胞を移植した場
合と同様に本ポリクローナル抗体を製造することができ
る（Raz,E.,el al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,91,951
9(1994) ）。

【００５６】一方、本モノクローナル抗体は、本ポリク
ローナル抗体の場合と同様の方法で、免疫した動物の免
疫細胞と動物の骨髄腫細胞とのハイブリドーマを作出
し、これにより、ＴＳＬＬ１タンパク質を認識する抗体
を産生するクローンを選択し、このクローンを培養する
ことにより製造することができる。

【００５７】また、免疫される動物も特に限定されるも
のではなく、マウス，ラット等を広く用いることができ
るが、モノクローナル抗体を製造する場合には、細胞融
合に用いる骨髄腫細胞との適合性を考慮して選択するこ
とが望ましい。

【００５８】免疫は一般的方法により、例えば上記免疫
抗原を免疫の対象とする動物に静脈内，皮内，皮下，腹
腔内注射等で投与することにより行うことができる。よ
り具体的には、上記免疫抗原を所望により通常のアジュ
バントと併用して、免疫の対象とする動物に２〜１４日
毎に上記手段により数回投与し、ポリクローナル抗体製
造のための免疫血清又はモノクローナル抗体製造のため
の免疫細胞、例えば免疫後の脾臓細胞を得ることができ
る。

【００５９】モノクローナル抗体を製造する場合、この
免疫細胞と細胞融合する他方の親細胞としての骨髄腫細
胞としては、既に公知のもの、例えばＳＰ２／０−Ａｇ
１４，Ｐ３−ＮＳ１−１−Ａｇ４−１，ＭＰＣ11−４
５，６．ＴＧ１．７（以上、マウス由来）；２１０．Ｒ
ＣＹ．Ａｇ１．２．３（ラット由来）；ＳＫＯ−００
７，ＧＭ１５００６ＴＧ−Ａ１２（以上、ヒト由来）等
を用いることができる。

【００６０】上記免疫細胞とこの骨髄腫細胞との細胞融
合は、通常公知の方法、例えばケーラーとミルシュタイ
ンの方法（Kohler,G. and Milstein,C.,Nature,256,495
(1975)）等に準じて行うことができる。

【００６１】より具体的には、この細胞融合は、通常公
知の融合促進剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ），センダイウイルス（ＨＶＪ）等の存在下におい
て、融合効率を向上させるためにジメチルスルホキシド
等の補助剤を必要に応じて添加した通常の培養培地中で
行い、ハイブリドーマを調製する。

【００６２】所望のハイブリドーマの分離は、通常の選
別用培地、例えばＨＡＴ（ヒポキサンチン，アミノプテ
リン及びチミジン）培地で培養することにより行うこと
ができる。すなわち、この選別用培地において目的とす
るハイブリドーマ以外の細胞が死滅するのに十分な時間
をかけて培養することによりハイブリドーマの分離を行
うことができる。このようにして得られるハイブリドー
マは、通常の限界希釈法により目的とするモノクローナ
ル抗体の検索及び単一クローン化に供することができ
る。

【００６３】目的とするモノクローナル抗体産生株の検
索は、例えばＥＬＩＳＡ法，プラーク法，スポット法，
凝集反応法，オクタロニー法，ＲＩＡ法等の一般的な検
索法に従い行うことができる。

【００６４】このようにして得られるＴＳＬＬ１タンパ
ク質を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマは、通常の培地で継代培養することが可能であ
り、さらに液体窒素中で長時間保存することもできる
（本発明の技術的範囲には、このハイブリドーマも含ま
れる。）。

【００６５】このハイブリドーマからの所望のモノクロ
ーナル抗体の採取は、このハイブリドーマを常法に従っ
て培養して、その培養上清として得る方法や、ハイブリ
ドーマをこのハイブリドーマに適合性が認められる動物
に投与して増殖させ、その腹水として得る方法等を用い
ることができる。

【００６６】なお、インビトロで免疫細胞を、ＴＳＬＬ
１タンパク質又はその一部の存在下で培養し、一定期間
後に上記細胞融合手段を用いて、この免疫細胞と骨髄腫
細胞とのハイブリドーマを調製し、抗体産生ハイブリド
ーマをスクリーニングすることで所望するモノクローナ
ル抗体を得ることもできる（Reading,C.L.,J.Immunol.M
eth.,53,261(1982) ；Pardue,R.L.,et al.,J.Cell Bio
l.,96,1149(1983））。

【００６７】さらに、免疫原としてＴＳＬＬ１タンパク
質を用いることなしに、免疫原として直接本遺伝子又は
その一部を用いて所望するモノクローナル抗体を製造す
ることも可能である。

【００６８】すなわち、本遺伝子で直接動物を免疫して
（この免疫の際には、この遺伝子を含む遺伝子発現用組
換えベクターを免疫原として用いることができる）、そ
の遺伝子免疫動物の免疫細胞又は免疫血清を用いること
によって、ＴＳＬＬ１タンパク質を特異的に認識するモ
ノクローナル抗体を製造することができる。

【００６９】また、上記で得られるポリクローナル抗体
及びモノクローナル抗体は、更に塩析，ゲル濾過法，ア
フィニティクロマトグラフィー等の通常の手段により精
製することができる。

【００７０】このようにして得られるポリクローナル抗
体及びモノクローナル抗体は、ＴＳＬＬ１タンパク質に
特異反応性を有する抗体である。ＴＳＬＬ１に対する抗
体を用いることにより、細胞や組織におけるＴＳＬＬ１
タンパク質の発現を特異的に検出することができる。こ
れにより、神経膠腫をはじめとする、脳や神経の種々の
疾患の診断、鑑別診断、質的診断に利用することができ
る。

【００７１】

【実施例】以下、実施例により、本発明をさらに具体的
に説明する。ｃＤＮＡクローンの単離と塩基配列の決定４６アミノ酸残基のＴＳＬＣ１の全細胞質領域蛋白に対
して相同するアミノ酸配列は、advanced BLAST program
(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) を用いて検出し
た。成人ヒト脳由来のｃＤＮＡライブラリーであるLamb
da TriplExは、クローンテック社から購入した。ｃＤＮ
Ａライブラリーのスクリーニングに用いたプローブは、
下記のプライマーを用いて得られる１１０３bpのＴＳＬ
Ｌ１遺伝子に対するＰＣＲ由来のｃＤＮＡフラグメント
である。プライマー１：５’−ＡＣＡＧＣＣＡＧＣＣＣＴＧＧＡ
ＣＡＴ−３’（配列番号５）プライマー２：５’−ＣＴＡＧＡＴＧＡＡＡＴＡＴＴＣ
ＣＴＴＣＴＴＧＴ−３’（配列番号６）

【００７２】ＤＮＡの塩基配列は、ＡＢＩ３７７ＤＮＡ
オートシークエンサー（アプライドバイオシステム社
製）において、the BigDye terminator cycle sequenci
ngready kit（Perkin-Elmer社製）を用いることにより
決定した。

【００７３】まず、対応するヌクレオチド配列とのアミ
ノ酸配列の比較解析により、ヒト遺伝子の配列である、
1296bpのbk134P22.1(GenBank Accession No.CAB56227)
が、ＴＳＬＣ１遺伝子に対して相同する配列として確認
された。

【００７４】bk134P22.1は、118951bpのBAC クローン13
4P22(GenBank Accession No.AL035403) の遺伝子配列を
基礎とする予想遺伝子であると予想されている。bk134P
22.1の断片は、ヒト成人の脳組織において発現している
ので、ヒトの脳に由来するｃＤＮＡが、その配列のＲＴ
−ＰＣＲ産物をプローブとして用いることにより、選択
され、７つの別個のｃＤＮＡクローンが得られた。これ
らのクローンの塩基配列を比較することにより、同一遺
伝子に由来する２つの異なる選択的なポリアデニレーシ
ョンサイトにより終結する、２４１６bp（配列番号２の
１〜２４１６番目の塩基配列において、２４１６番目の
塩基の末端にポリＡが付加している配列）と３５５７bp
（配列番号２の１〜３５５７番目の塩基配列において、
３５５７番目の塩基の末端にポリＡが付加している配
列）の、２つの３’末端の異なるＴＳＬＬ１ｃＤＮＡ
（全長）分子の塩基配列を決定した。

【００７５】決定した本遺伝子であるＴＳＬＬ１の塩基
配列を配列番号２に示し、これから推定されるアミノ酸
配列を配列番号１に示す。この配列は、GenBank Access
ionNo.AF363367 に対応している。bk134P22.1は、1,296
bpのオープンリーディングフレーム(ORF) を含んでい
ると予測されているが、本発明者がクローン化したＴＳ
ＬＬ１ｃＤＮＡの２つのアイソフォームは、共に、398
個のアミノ酸からなるタンパク質をコードしている1,19
4 bpのより短いORF を含んでおり、その中には、bk134P
22.1において予測されたエクソン２に相当する配列は存
在していなかった。

【００７６】第２図には、ヒトＴＳＬＣ１、ヒトＴＳＬ
Ｌ１、ヒトＴＳＬＬ２（F22162 1をプローブとして用
いて得た、成人ヒト脳由来のｃＤＮＡライブラリーのス
クリーニングの結果得られた遺伝子で、2,176bp のＴＳ
ＬＬ２のｃＤＮＡは、388 個のアミノ酸からなるタンパ
ク質をコードしている1,164bp の一つのORF を含んでい
た：GenBank Accession No.AF363368 ）、human glycop
hirin Ｃ（ｈＧＬＰＣ）（GenBank Accession No.P0492
1)、ヒトコンタクチン結合蛋白２（ｈＣａｓｐｒ２）
（NP 054860)およびDrosophia melanogaster Neurexin
IV（ｄＮＲＸ）(X86685)蛋白の間でのアミノ酸配列の整
合性を示している。空白部分は、最良の整合を行うため
に導入されている。これらのアミノ酸配列間で保存され
ているアミノ酸残基は、黒く囲んである。ｈＧＬＰＣの
蛋白４．１に結合するために必要な１３アミノ酸(Marfa
tia et al.,1995)は、下線で示され、ＰＤＺが結合する
ためのＣＯＯＨ末端の３つのコンセンサスアミノ酸(Mar
fatia et al.,1997;Songyanget al.,1997) は、二本下
線で示されている。

【００７７】予測したアミノ酸配列は、ＴＳＬＬ１にお
いて、いくつかの潜在的なＮ−グリコシル化部位、１つ
の膜貫通ドメイン、および短い細胞質ドメインをもつ３
つの免疫グロブリン様Ｃ２タイプのループを含んでいる
細胞外ドメインを有する膜タンパク質をコードしている
ことを示している。第２図に示されているように、ＴＳ
ＬＣ１は、細胞質ドメイン中で高い相同性を示した（ア
ミノ酸配列中76％同一であった）。さらに、ＴＳＬＬ１
は、アミノ酸配列全体においても、ＴＳＬＣ１との顕著
な類似性を示した（アミノ酸配列中37％同一であっ
た）。このことは、ＴＳＬＬ１タンパク質が、免疫グロ
ブリンのスーパーファミリータンパク質に属しているこ
とを示している。

【００７８】遺伝子構造の決定ＲＰＣＩ−IIヒトＢＡＣライブラリーの高濃度フィルタ
ーは、ResearchGenetics社から購入し、添付の指示書に
従った。ＴＳＬＬ１遺伝子の全コード配列に相当するｃ
ＤＮＡプローブでハイブリダイズを行うことにより、Ｔ
ＳＬＬ１遺伝子を含む４３１Ａ２０クローン由来のＢＡ
ＣＤＮＡを同定した。ＴＳＬＬ１遺伝子の遺伝子構造
は、ＢＡＣクローン134P22(GenBank Accession No. AL0
35403)の既知のゲノム塩基配列に、各ｃＤＮＡ配列を並
べることによって決定した。ＴＳＬＬ１遺伝子のゲノム
配列の一部は、431A20クローン由来のＢＡＣＤＮＡク
ローンを、鋳型として用いて決定した。

【００７９】第３図は、ヒトＴＳＬＬ１遺伝子とヒトＴ
ＳＬＣ１遺伝子を図式化した図面である。翻訳領域のエ
クソンは、そのヌクレオチド長と共に黒く囲んで示し、
非翻訳領域のエクソンは、白抜きで示してある。エクソ
ンの数は、囲みの上に記載されている。

【００８０】ＴＳＬＬ１遺伝子は、約30kbの領域に及ぶ
９つのエクソンからなり、エクソン１の後に、大きさが
91〜171bp の７つの比較的小さいエクソン、そして最後
の大きなエクソン９が続く（第３図）。エクソン１は、
メチオニンの開始コドンを含んでおり、その前にコザッ
クのコンセンサス配列がある(Kozak, 1989) 。

【００８１】エクソン−イントロン構造は、ＴＳＬＣ１
遺伝子のエクソン８を除いて、ＴＳＬＣ１遺伝子とＴＳ
ＬＬ１遺伝子の間において、非常に強くに保存されてお
り、各遺伝子中の対応するエクソンは、ほぼ同じ大きさ
である。ＴＳＬＬ１遺伝子の上流の領域は、グアニンお
よびシトシン残基の含量に非常に富んでおり、754bpのC
pG アイランドの基準を満たしている(Antequeraら, 199
3) 。

【００８２】Fluorescene in situ hybridization （Ｆ
ＩＳＨ）ＴＳＬＬ１遺伝子の染色体位置を直接決定するために、
蛍光in situ ハイブリッド形成法(FISH)を行った。

【００８３】ＦＩＳＨは、既に確立している方法（Pink
el et al.,1986）により行った。ＢＡＣクローン431A20
から精製されたＤＮＡは、nick translation kit（ベー
リンガー社製）を用いて、Spectrum Green-dUTP （VISI
S 社製）で、既に報告されている方法（Shimura et a
l.,1999 ）により標識し、これを、ＴＳＬＬ１遺伝子の
染色体上の位置を決定するためのプローブとして用い
た。ヒト染色体１ｑのテロメア領域に対するプローブ
は、ＶＹＳＩＳ社から購入し、上記と同様にSpectrumOr
enge-dUTPで標識した。ハイブリダイゼーション後、細
胞と染色体を、０．１％ｐ−フェニレンジアミンと９０
％グリセロールを含有するアンチフェードソリューショ
ン（和光純薬社製）中において、4',6-diamidino-2-phe
nylindole （ＤＡＰＩ）で、対比染色した。デジタルイ
メージを、蛍光顕微鏡（オリンパス社製）で検出し、Ｃ
ｙｔｏＶｉｓｉｏｎ（Applied Imaging 社製）で解析
した。少なくとも２０個の中期染色体で検討し、ヒト染
色体１ｑ上で、特定のシグナルを検出した。

【００８４】第４図は、ＴＳＬＬ１の染色体上の位置を
示す図面である。緑色のシグナル（図中で、△印で示し
た部分）は、ＴＳＬＬ１を含むＤＮＡを示し、赤色のシ
グナル（図中で、矢印で示した部分）は、第１染色体長
腕上のテロメア領域を示している（図における色は、本
件出願における参考図面を参照のこと）。

【００８５】第４図に示されているように、BAC クロー
ン431A20を、通常のヒト中期染色体に対してハイブリッ
ド形成させた時に、１ｑ上で特定のシグナルを検出し
た。この結果は、ＴＳＬＬ１のｃＤＮＡ配列が、染色体
1q21.2-22 上のBAC クローン134P22の一部と同一である
という知見と一致している。

【００８６】細胞株ヒト前立腺癌の細胞株である、ＰＰＣ−１は、ユタ大学
のA.R.Brothman博士のご厚意で分けていただいた。ヒト
神経膠腫細胞の細胞株である、Ｈｓ６８３，ＳＷ１０８
８，ＳＷ１７８３，ＤＢＴＲＧ−０５ＭＧ，ＣＣＦ−Ｓ
ＴＴＧ１，Ｕ８７ＭＧ，Ｕ１１８ＭＧ，Ｕ３７３ＭＧ
と、ヒト前立腺癌の細胞株である、ＰＣ３，ＬＮＣａ
Ｐ，ＤＵ１４５は、アメリカンタイプカルチャーコレク
ション（ＡＴＣＣ）から入手した。ヒト神経膠腫細胞の
細胞株である、Ｔ９８Ｇ，Ａ１７２，ＹＫＧ−１，ＫＧ
１Ｃは、ヘルスサイエンスリサーチリソースバンク（大
阪）から入手した。これらの細胞株は、供給者の指示に
従って培養した。

【００８７】ノーザンブロット解析ヒトの多組織ノーザンブロット膜、ヒト成人脳、ｐｏｌ
ｙ（Ａ）⁺ＲＮＡとヒトβアクチン用のｃＤＮＡプロー
ブは、クローンテック社から購入した。神経膠腫細胞又
は前立腺癌の細胞株は、FastTrack2.0Kit （インビトロ
ゲン社製）を用いて抽出した。ｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡ
の１μg に対しては、２．１Ｍのホルムアミドを含有す
る１％アガロースゲルでの電気泳動を行い、これを、Hy
bond-N+nylon membrene （アマシャム社製）に移した。
ＴＳＬＬ１遺伝子のコードィング配列をプローブとして
用いた。ハイブリダイゼーションは、５×ＳＳＣ，４２
℃の２０mMナトリウム緩衝液，１×Denhardt's溶液，
０．２％ＳＤＳ，１００μg/ml変性サケ精子ＤＮＡ，１
０％デキストラン硫酸，および，５０％ホルムアミド，
中で１８時間行った。ハイブリダイゼーション終了後、
ＲＮＡを移したメンブレンは、４２℃の２×ＳＳＣ／
０．１％ＳＤＳで１５分間、および、５０℃の０．１×
ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで１５分間の洗浄を行った後、
増強用スクリーンと共に、１〜４日間，−７０℃で露光
した。

【００８８】第５図は、成人（１６種類）と胎児（４種
類）の組織における、ＴＳＬＬ１遺伝子のノーザンブロ
ット解析の結果を示した図面である。各々のレーンは、
２μg のｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡを含んでいる。レーン
１は、心臓；レーン２は、脳；レーン３は、胎盤；レー
ン４は、肺；レーン５は、肝臓；レーン６は、骨格筋；
レーン７は、腎臓；レーン８は、膵臓；レーン９は、脾
臓；レーン10は、胸腺；レーン11は、前立腺；レーン12
は、精巣；レーン13は、卵巣；レーン14は、小腸；レー
ン15は、結腸；レーン16は、末梢血細胞；レーン17は、
胎児の脳；レーン18は、胎児の肺；レーン19は、胎児の
肝臓；レーン20は、胎児の腎臓のｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮ
Ａである。

【００８９】第５図に示されているように、ＴＳＬＬ１
遺伝子は、成人および胎児のヒト脳中でのみ発現してい
た。ｃＤＮＡクローンの結果に対応して、3.6 および2.
4kbの２つの別個の転写物が、ほぼ同一の量で存在して
いた。

【００９０】第６図は、１２種類のヒト神経膠腫細胞の
細胞株における、ＴＳＬＬ１遺伝子のノーザンブロット
解析の結果を示した図面である。βアクチンは、各レー
ンの低い位置に示されている。各々のレーンは、５μg
のｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡを含んでいる。レーン１は、
Ｈｓ６８３；レーン２は、ＳＷ１０８８；レーン３は、
ＳＷ１７８３；レーン４は、ＤＢＴＲＧ−０５ＭＧ；レ
ーン５は、ＣＣＦ−ＳＴＴＧ１；レーン６は、Ｕ８７Ｍ
Ｇ；レーン７は、Ｕ１１８ＭＧ；レーン８は、Ｕ３７３
ＭＧ；レーン９は、Ｔ９８Ｇ；レーン10は、Ａ１７２；
レーン11は、ＹＫＧ−１；レーン12は、ＫＧ１−Ｃ；レ
ーン13は、成人の脳のｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡである。

【００９１】第６図は、ノーザンブロット解析におい
て、SW1783を除く全ての神経膠腫細胞で、ＴＳＬＬ１の
発現が失われていることを示していたが、これは、ＴＳ
ＬＬ１遺伝子が、ヒト神経膠腫の発生または進展におい
て、抑制的に機能していることを示している。このこと
により、本遺伝子が、癌抑制遺伝子としての機能を有し
ていることが明らかとなった。

【００９２】ＴＳＬＬ１に対する抗体の製造ＴＳＬＬ１タンパク質の一部分のアミノ酸配列（ＡＥＧ
ＧＱＳＧＧＤＤＫＫＥＹＦＩ：配列番号７）を、ペプチ
ド合成機を用いて合成し、かかるペプチドに、常法によ
り、キャリアタンパク質〔キーホール・リンペットヘ
モシアニン（ＫＬＨ）〕を結合し、免疫抗原を調製し
た。かかる免疫抗原を、ウサギに、１４日おきに、５回
免疫して、免疫血清を得た。これを、スルフォリンク・
カップリング・ゲル樹脂に、合成ペプチド（Ｃ）ＡＥＧ
ＧＱＳＧＧＤＤＫＫＥＹＦＩ：配列番号７）を結合させ
た、ペプチドアフィニティーカラムを用いて、常法によ
り精製して、ポリクローナル抗体（ＡＣ２と命名した）
を得た。

【００９３】従って、ＡＣ２の抗原認識部位は、ＡＥＧ
ＧＱＳＧＧＤＤＫＫＥＹＦＩ（配列番号７）であること
が判明した、この配列は、上記の合成ペプチドの配列と
同一であり、確かに、ＡＣ２が、ＴＳＬＬ１タンパク質
に対して特異的なポリクローナル抗体であることが判明
した。

【００９４】ＴＳＬＬ１に対する抗体によるＴＳＬＬ１
タンパク質の検出サル腎臓由来培養細胞ＣＯＳ−７に、ＴＳＬＬ１の発現
ベクター〔ヒト脳細胞由来のpoly(A) ⁺ＲＮＡから調製
したｃＤＮＡを鋳型とし、配列番号３，４で示される塩
基配列を有するヌクレオチドを増幅用プライマーとし
て、ＰＣＲ法を行うことによって得られたＤＮＡ断片
を、プラスミドベクターｐｃＤＮＡ３．１（インビトロ
ゲン社）に組み込んで得たベクター〕を導入し、発現し
た細胞を分離した。細胞抽出物のウエスタン・ブロット
は、常法に従って行った(Towbin et al.,1979,Burnctte
et al., 1981) 。すなわち、培養した細胞を集め、１
％ＳＤＳ，１mM ＥＤＴＡ，Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ
７．５）、１００μM Pefabloc and Complete （ベーリ
ンガー・マンハイム社製）を含む細胞融解液で可溶化
し、１００００×ｇで、１０分間遠心して、上清を回収
した。これにより得られた４０μg のタンパク質を、１
０〜２０％ＳＤＳ加ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
分離し、ポリビニル・リジン・ジフルオロライドフィル
ターに移した。このフィルターに、ＴＳＬＬ１タンパク
質に対する特異的ポリクローナル抗体ＡＣ２を加えて反
応させた。タンパク質は、アルカリフォスファターゼを
結合させたロバ抗ウサギIgG 抗体を用いて検出した。

【００９５】ＴＳＬＬ１の発現ベクターを導入して発現
させた、ＣＯＳ−７細胞の全細胞抽出物（レーン１）、
ＴＳＬＬ１の発現ベクターを導入していないＣＯＳ−７
細胞の抽出物をＴＳＬＬ１に対するポリクローナル抗体
ＡＣ２で免疫沈降したもの（レーン２）、ＴＳＬＬ１の
発現ベクターを導入したＣＯＳ−７細胞の全細胞抽出物
をＡＣ２で免疫沈降したもの（レーン３）を、それぞ
れ、ＳＤＳ加ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離
し、メンブレンに移した後、ＡＣ２で、ウエスタン・ブ
ロット法により、ハイブリダイズした（第７図）。その
結果、レーン１，３で、分子量約４０キロダルトンと約
４５キロダルトンの、翻訳後修飾を受けた２つのＴＳＬ
Ｌ１タンパク質が、特異的に検出された。なお、分子量
約５０キロダルトンのシグナルは、IgG のＨ鎖である。

【００９６】

【発明の効果】本発明により、新たな癌抑制遺伝子等が
提供され、これにより、癌予防や癌診断や癌治療に関す
る新たな手段が提供され得る。

【００９７】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> BML, INC <120> TSLL1 Gene <130> PBM63 <140> <141> <160> 7 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 398 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Ala Pro Ala Ala Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Phe Ala 1 5 10 15 Cys Cys Trp Ala Pro Gly Gly Ala Asn Leu Ser Gln Asp Asp Ser Gln 20 25 30 Pro Trp Thr Ser Asp Glu Thr Val Val Ala Gly Gly Thr Val Val Leu 35 40 45 Lys Cys Gln Val Lys Asp His Glu Asp Ser Ser Leu Gln Trp Ser Asn 50 55 60 Pro Ala Gln Gln Thr Leu Tyr Phe Gly Glu Lys Arg Ala Leu Arg Asp 65 70 75 80 Asn Arg Ile Gln Leu Val Thr Ser Thr Pro His Glu Leu Ser Ile Ser 85 90 95 Ile Ser Asn Val Ala Leu Ala Asp Glu Gly Glu Tyr Thr Cys Ser Ile 100 105 110 Phe Thr Met Pro Val Arg Thr Ala Lys Ser Leu Val Thr Val Leu Gly 115 120 125 Ile Pro Gln Lys Pro Ile Ile Thr Gly Tyr Lys Ser Ser Leu Arg Glu 130 135 140 Lys Asp Thr Ala Thr Leu Asn Cys Gln Ser Ser Gly Ser Lys Pro Ala 145 150 155 160 Ala Arg Leu Thr Trp Arg Lys Gly Asp Gln Glu Leu His Gly Glu Pro 165 170 175 Thr Arg Ile Gln Glu Asp Pro Asn Gly Lys Thr Phe Thr Val Ser Ser 180 185 190 Ser Val Thr Phe Gln Val Thr Arg Glu Asp Asp Gly Ala Ser Ile Val 195 200 205 Cys Ser Val Asn His Glu Ser Leu Lys Gly Ala Asp Arg Ser Thr Ser 210 215 220 Gln Arg Ile Glu Val Leu Tyr Thr Pro Thr Ala Met Ile Arg Pro Asp 225 230 235 240 Pro Pro His Pro Arg Glu Gly Gln Lys Leu Leu Leu His Cys Glu Gly 245 250 255 Arg Gly Asn Pro Val Pro Gln Gln Tyr Leu Trp Glu Lys Glu Gly Ser 260 265 270 Val Pro Pro Leu Lys Met Thr Gln Glu Ser Ala Leu Ile Phe Pro Phe 275 280 285 Leu Asn Lys Ser Asp Ser Gly Thr Tyr Gly Cys Thr Ala Thr Ser Asn 290 295 300 Met Gly Ser Tyr Lys Ala Tyr Tyr Thr Leu Asn Val Asn Asp Pro Ser 305 310 315 320 Pro Val Pro Ser Ser Ser Ser Thr Tyr His Ala Ile Ile Gly Gly Ile 325 330 335 Val Ala Phe Ile Val Phe Leu Leu Leu Ile Met Leu Ile Phe Leu Gly 340 345 350 His Tyr Leu Ile Arg His Lys Gly Thr Tyr Leu Thr His Glu Ala Lys 355 360 365 Gly Ser Asp Asp Ala Pro Asp Ala Asp Thr Ala Ile Ile Asn Ala Glu 370 375 380 Gly Gly Gln Ser Gly Gly Asp Asp Lys Lys Glu Tyr Phe Ile 385 390 395 <210> 2 <211> 3557 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (141)..(1334) <400> 2 ggtccccacc tcggccccgg gctccgaagc ggctcggggg cgccctttcg gtcaacatcg 60 tagtccaccc cctccccatc cccagccccc ggggattcag gctcgccagc gcccagccag 120 ggagccggcc gggaagcgcg atg ggg gcc cca gcc gcc tcg ctc ctg ctc ctg 173 Met Gly Ala Pro Ala Ala Ser Leu Leu Leu Leu 1 5 10 ctc ctg ctg ttc gcc tgc tgc tgg gcg ccc ggc ggg gcc aac ctc tcc 221 Leu Leu Leu Phe Ala Cys Cys Trp Ala Pro Gly Gly Ala Asn Leu Ser 15 20 25 cag gac gac agc cag ccc tgg aca tct gat gaa aca gtg gtg gct ggt 269 Gln Asp Asp Ser Gln Pro Trp Thr Ser Asp Glu Thr Val Val Ala Gly 30 35 40 ggc acc gtg gtg ctc aag tgc caa gtg aaa gat cac gag gac tca tcc 317 Gly Thr Val Val Leu Lys Cys Gln Val Lys Asp His Glu Asp Ser Ser 45 50 55 ctg caa tgg tct aac cct gct cag cag act ctc tac ttt ggg gag aag 365 Leu Gln Trp Ser Asn Pro Ala Gln Gln Thr Leu Tyr Phe Gly Glu Lys 60 65 70 75 aga gcc ctt cga gat aat cga att cag ctg gtt acc tct acg ccc cac 413 Arg Ala Leu Arg Asp Asn Arg Ile Gln Leu Val Thr Ser Thr Pro His 80 85 90 gag ctc agc atc agc atc agc aat gtg gcc ctg gca gac gag ggc gag 461 Glu Leu Ser Ile Ser Ile Ser Asn Val Ala Leu Ala Asp Glu Gly Glu 95 100 105 tac acc tgc tca atc ttc act atg cct gtg cga act gcc aag tcc ctc 509 Tyr Thr Cys Ser Ile Phe Thr Met Pro Val Arg Thr Ala Lys Ser Leu 110 115 120 gtc act gtg cta gga att cca cag aag ccc atc atc act ggt tat aaa 557 Val Thr Val Leu Gly Ile Pro Gln Lys Pro Ile Ile Thr Gly Tyr Lys 125 130 135 tct tca tta cgg gaa aaa gac aca gcc acc cta aac tgt cag tct tct 605 Ser Ser Leu Arg Glu Lys Asp Thr Ala Thr Leu Asn Cys Gln Ser Ser 140 145 150 155 ggg agc aag cct gca gcc cgg ctc acc tgg aga aag ggt gac caa gaa 653 Gly Ser Lys Pro Ala Ala Arg Leu Thr Trp Arg Lys Gly Asp Gln Glu 160 165 170 ctc cac gga gaa cca acc cgc ata cag gaa gat ccc aat ggt aaa acc 701 Leu His Gly Glu Pro Thr Arg Ile Gln Glu Asp Pro Asn Gly Lys Thr 175 180 185 ttc act gtc agc agc tcg gtg aca ttc cag gtt acc cgg gag gat gat 749 Phe Thr Val Ser Ser Ser Val Thr Phe Gln Val Thr Arg Glu Asp Asp 190 195 200 ggg gcg agc atc gtg tgc tct gtg aac cat gaa tct cta aag gga gct 797 Gly Ala Ser Ile Val Cys Ser Val Asn His Glu Ser Leu Lys Gly Ala 205 210 215 gac aga tcc acc tct caa cgc att gaa gtt tta tac aca cca act gcg 845 Asp Arg Ser Thr Ser Gln Arg Ile Glu Val Leu Tyr Thr Pro Thr Ala 220 225 230 235 atg att agg cca gac cct ccc cat cct cgt gag ggc cag aag ctg ttg 893 Met Ile Arg Pro Asp Pro Pro His Pro Arg Glu Gly Gln Lys Leu Leu 240 245 250 cta cac tgt gag ggt cgc ggc aat cca gtc ccc cag cag tac cta tgg 941 Leu His Cys Glu Gly Arg Gly Asn Pro Val Pro Gln Gln Tyr Leu Trp 255 260 265 gag aag gag ggc agt gtg cca ccc ctg aag atg acc cag gag agt gcc 989 Glu Lys Glu Gly Ser Val Pro Pro Leu Lys Met Thr Gln Glu Ser Ala 270 275 280 ctg atc ttc cct ttc ctc aac aag agt gac agt ggc acc tac ggc tgc 1037 Leu Ile Phe Pro Phe Leu Asn Lys Ser Asp Ser Gly Thr Tyr Gly Cys 285 290 295 aca gcc acc agc aac atg ggc agc tac aag gcc tac tac acc ctc aat 1085 Thr Ala Thr Ser Asn Met Gly Ser Tyr Lys Ala Tyr Tyr Thr Leu Asn 300 305 310 315 gtt aat gac ccc agt ccg gtg ccc tcc tcc tcc agc acc tac cac gcc 1133 Val Asn Asp Pro Ser Pro Val Pro Ser Ser Ser Ser Thr Tyr His Ala 320 325 330 atc atc ggt ggg atc gtg gct ttc att gtc ttc ctg ctg ctc atc atg 1181 Ile Ile Gly Gly Ile Val Ala Phe Ile Val Phe Leu Leu Leu Ile Met 335 340 345 ctc atc ttc ctt ggc cac tac ttg atc cgg cac aaa gga acc tac ctg 1229 Leu Ile Phe Leu Gly His Tyr Leu Ile Arg His Lys Gly Thr Tyr Leu 350 355 360 aca cat gag gca aaa ggc tcc gac gat gct cca gac gcg gac acg gcc 1277 Thr His Glu Ala Lys Gly Ser Asp Asp Ala Pro Asp Ala Asp Thr Ala 365 370 375 atc atc aat gca gaa ggc ggg cag tca gga ggg gac gac aag aag gaa 1325 Ile Ile Asn Ala Glu Gly Gly Gln Ser Gly Gly Asp Asp Lys Lys Glu 380 385 390 395 tat ttc atc tagaggcgcc tgcccacttc ctgcgccccc caggggccct 1374 Tyr Phe Ile gtggggactg ctggggccgt caccaacccg gacttgtaca gagcaaccgc agggccgccc 1434 ctcccgcttg ctccccagcc cacccacccc cctgtacaga atgtctgctt tgggtgcggt 1494 tttgtactcg gtttggaatg gggagggagg agggcggggg gaggggaggg ttgccctcag 1554 ccctttccgt ggcttctctg catttgggtt attattattt ttgtaacaat cccaaatcaa 1614 atctgtctcc aggctggaga ggcaggagcc ctggggtgag aaaagcaaaa aacaaacaaa 1674 aaacaaaacc ctggagtgtt aggaggagag tgaaggtaga ggggtgagga agggtaaggg 1734 gcagggctgg tttcagctgg gggctctcac cagccctcct ttcagcctct acaacagagc 1794 agcttcccag acttctccag gaacccagaa acgggatggt tgtcggcaaa ggttgggagt 1854 ggcttttcct ctggtagcca cacacctgag cactacggac agggaggcag gtgccacctt 1914 gacacctctc ttccatagca atgggaaagt gatgagtgcg ggagtcctga ggagatgtgg 1974 cctgcagaca acatgcagcc atgcagggac ccaggactgt aacctgggga ggacgcgggt 2034 ccctgcaagg aagagtagat ttggagagga aggatggagg tggactctca ccccattccc 2094 cccggaaatg aacaaagccg ggccctttcc ataggaactg cccttggaga tagcagagtg 2154 tggctgcccc tccttgctcc agcagcagtg ggagaggcac tgctctgggg cctgaactgc 2214 ctctgcttcc ccccctgagg ggcccctcac tcttacccaa gactctggat tgttgcacgg 2274 caaccactcc tcccatggca ttgctcagca actacttctc ccttcccggc caccctgtgc 2334 ccccttcctg gtcccaacgc cagcccttca tccttcctcc ctcagcagcc aggcagacat 2394 aacaacaaaa ctactaaaag gagcttcact gcagtgagct gtttcctgcc caaactaagg 2454 gaataatgtg aactgtgtgc atgtgtgtgg tgtgtatgca tgtgtgcatg tgtgtgtgtg 2514 tgtgtgcatg tgtgtgagtg agtgagaggc agagcgagga actgaggagg agggctaaga 2574 gccaggggtc ctgggcaagt ggacagggct gtgggacatg ttggggaggc tttgggaatg 2634 gggtattcct agtcagggtt cacacctcac ctgggatgtt gttccatgct ggtatttcct 2694 ctgccacccc caatgcccat cggtcttgga gaaaggagtc cccgggtgtg tgtttgccca 2754 gctgtccatt ctatctctcc cttaaacaca gagcattcag cccttccctg gatttccctc 2814 ctctgagcca tggagtcagt gccacagcct ttgctatgca cctctcaggc ctctccttgg 2874 cgttgaccct ggaaagacct accaccacct attttttccc atagtctgta cccagtgagt 2934 tgaaggctgg gtccccaccc ttccttttga tttcctgtct tccttctcgt ggccccagct 2994 ggttgctgtg gagatgaggt tcctggtcct ccctgtcctg gctggactgc cccgcctcag 3054 atccaggatg cccttggcat cgctcccacc ctcccccagc ttttcctccc tggtctgaca 3114 atgggcatgc aaaaaggggc agctgcaatc tagcaggcct gcccaccccc ttcagttcag 3174 gtaatacagt tgtgaatctt ccagccgctg gttagggcct tgggcaccac aggcagcccc 3234 tcacctaagc cggggcctac tcctcttaca acagcaagag agccctgggg ccccaggcct 3294 gttgagcttc ttgtctccca gcacccgctt ttgggaaaat gacttttcct cttcaagctg 3354 aaccactctg tccatattac acagaagcca tatttgtacg ggggggtggg agggagaggg 3414 gctgttgtgc tgtgtgtgtc tgtccagggg tgggggggtg ggggaaggga gcagggaggg 3474 gaccgtgtat ctttataatc tttctaactc tcctgtgcta atctcagagg ggtcaccctc 3534 aatatatctg gattatccgt gtc 3557 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Gene Amplification Primer <400> 3 cctttcggtc aacatcgtag tccaccccct 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Gene Amplification Primer <400> 4 tacaagtccg ggttggtgac ggccccagca 30 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Gene Amplification Primer <400> 5 acagccagcc ctggacat 18 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Gene Amplification Primer <400> 6 ctagatgaaa tattccttct tgt 23 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Cys Ala Glu Gly Gly Gln Ser Gly Gly Asp Asp Lys Lys Glu Tyr Phe 1 5 10 15 Ile

【図面の簡単な説明】

【図１】ＴＳＬＬ１ｃＤＮＡの塩基配列と、これから推
定されるアミノ酸配列を示した図面である。

【図２】本遺伝子と関連する他の遺伝子とがコードする
アミノ酸配列における構造類似性を示した図面である。

【図３】本遺伝子とヒトＴＳＬＣ１遺伝子を図式化した
図面である。

【図４】本遺伝子の染色体上の座位を示す図面である。

【図５】成人と胎児の組織における、本遺伝子のノーザ
ンブロット解析の結果を示した図面である。

【図６】ヒト神経膠腫細胞の細胞株における、本遺伝子
のノーザンブロット解析の結果を示した図面である。

【図７】抗ＴＳＬＬ１ポリクローナル抗体ＡＣ２によ
る、ＴＳＬＬ１タンパク質の特異的な検出を示した図面
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 1/21 Ａ６１Ｋ 31/7088 5/10 48/00 // Ａ６１Ｋ 31/7088 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 38/00 5/00 Ａ 48/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者野村幸男埼玉県川越市的場1361−１株式会社ビー・エム・エル総合研究所内Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA12 CA04 CA05 HA11 HA17 4B065 AB01 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA07 AA13 BA01 BA08 BA22 CA18 NA14 ZB26 4C086 AA03 EA16 NA14 ZB26 4H045 AA10 AA11 BA09 CA40 DA75 EA28 EA51

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１で表されるアミノ酸配列のタン
パク質。
【請求項２】配列番号１で表されるアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列を含む遺伝子。
【請求項３】配列番号１で表されるアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列からなる遺伝子。
【請求項４】配列番号２で表される塩基配列を含む遺伝
子。
【請求項５】配列番号２で表される塩基配列からなる遺
伝子。
【請求項６】遺伝子が、癌抑制遺伝子である、請求項２
〜５のいずれかの請求項記載の遺伝子。
【請求項７】請求項２〜６のいずれかの請求項記載の遺
伝子が組み込まれている遺伝子発現用ベクター。
【請求項８】請求項７記載の遺伝子発現用ベクターで形
質転換された形質転換体。
【請求項９】請求項１記載のタンパク質の全部又は一部
を免疫原とする、このタンパク質に対して免疫反応性が
認められる抗体。