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Hintergrund der Erfindung
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Damit
T-Zellen auf fremde Proteine reagieren, müssen von antigenpräsentierenden
Zellen (APCs) zwei Signale an ruhende T-Lymphozyten geliefert werden
(Jenkins, M. und Schwartz, R. (1987) J. Exp. Med. 165:302-319; Mueller,
D. L. et al. (1990) J. Immunol. 144:3701-3709). Das erste Signal,
das der Immunantwort Spezifität
verleiht, wird über
den T-Zell-Rezeptor (TCR) transduziert, nachdem das präsentierte
fremde antigene Peptid in Verbindung mit dem Haupthistokompatibilitätskomplex
(MHC) erkannt worden ist. Das zweite Signal, Costimulation genannt,
induziert die Proliferation von T-Zellen und versetzt sie in einen
funktionsfähigen Zustand
(Lenschow et al. (1996) Annu. Rev. Immunol. 14:233). Die Costimulation
ist weder antigen-spezifisch noch MHC-beschränkt, und man nimmt an, dass
sie durch ein oder mehrere verschiedene Zelloberflächenmoleküle, die
von APCs exprimiert werden, induziert wird (Jenkins, M. K. et al.
(1988) J. Immunol. 140:3324-3330; Linsley, P. S. et al. (1991) J.
Exp. Med. 173:721-730; Gimmi, C. D. et al. (1991) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 88:6575-6579; Young, J. W. et al. (1992) J. Clin. Invest
90:229-237; Koulova, L. et al. (1991) J. Exp. Med. 173:759-762;
Reiser, H. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:271-275;
van-Seventer, G. A. et al. (1990) J. Immunol. 144:4579-4586; LaSalle,
J. M. et al. (1991) J. Immunol. 147:774-80; Dustin, M. I. et al.
(1989) J. Exp. Med. 169:503; Armitage, R. J. et al. (1992) Nature
357:80-82; Liu, Y. et al. (1992) J. Exp. Med 175:437-445).
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Die
auf APCs exprimierten Proteine CD80 (B7-1) und CD86 (B7-2) sind
entscheidende costimulatorische Moleküle (Freeman et al. (1991) J.
Exp. Med. 174:625; Freeman et al. (1989) J. Immunol. 143:2714; Azuma
et al. (1993) Nature 366:76; Freeman et al. (1993) Science 262:909).
B7-2 scheint während primären Immunantworten
eine zentrale Rolle zu spielen, während B7-1, das zu einem späteren Zeitpunkt
im Verlauf einer Immunantwort hochreguliert wird, für die Prolongation
von primären
T-Zell-Antworten oder die Costimulation von sekundären T-Zell-Antworten
wichtig sein kann (Bluestone (1995) Immunity 2:555).
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CD28,
ein Ligand, an den B7-1 und B7-2 binden, wird konstitutiv auf ruhenden
T-Zellen exprimiert, und seine Expression nimmt nach der Aktivierung
zu. Nach der Signaltransduktion durch den T-Zell-Rezeptor induzieren
die Ligation von CD28 und die Transduktion eines costimulatorischen
Signals die Proliferation von T-Zellen und die Sekretion von IL-2
(Linsley, P. S. et al. (1991) J. Exp. Med. 173:721-730; Gimmi, C.
D. et al. (1991) Proc. Natl. Acad Sci. USA 88:6575-6579; June, C.
H. et al. (1990) Immunol. Today 11:211-6; Harding, F. A. et al.
(1992) Nature 356:607-609). Ein zweiter Ligand, CTLA4 (CD152) genannt,
ist homolog zu CD28, aber er ist nicht auf ruhenden T-Zellen exprimiert
und erscheint nach der T-Zell-Aktivierung (Brunet, J. F. et al. (1987)
Nature 328:267-270). CTLA4 scheint für die Negativregulation von
T-Zell-Antworten entscheidend zu sein (Waterhouse et al. (1995)
Science 270:985). Man fand heraus, dass die Blockierung von CTLA4
inhibitorische Signale entfernt, während die Aggregation von CTLA4
inhibitorische Signale liefert, die T-Zell-Antworten herunterregeln
(Allison und Krummel (1995) Science 270:932). Die B7-Moleküle haben
eine höhere
Affinität für CTLA4
als für
CD28 (Linsley, P. S. et al. (1991) J. Exp. Med. 174:561-569), und
B7-1 und B7-2 binden, wie man festgestellt hat, an verschiedene
Regionen des CTLA4-Moleküls
und haben unterschiedliche Kinetiken bezüglich der Bindung an CTLA4
(Linsley et al. (1994) Immunity 1:793).
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In
der Vergangenheit sind Berichte über
die Existenz von zusätzlichen
Mitgliedern der costimulatorischen B7-Familie kontrovers gewesen.
Der Antikörper
BB-1 schien eine Untergruppe von Zellen zu erkennen, die größer als
die B7-1- und B7-2-positiven Zellen waren, was für die Existenz eines anderen
Mitglieds der B7-Familie sprach, nämlich B7-3. Man glaubte, dass
die Identität
von B7-3 teilweise
durch Expressionsklonierung der invarianten Kette des T-Zell-Rezeptors
unter Verwendung des BB-1-Antikörpers
beantwortet sei. Obwohl die invariante Kette nicht mit der B7-Familie
verwandt ist, ermöglichte
dieses Molekül
einen niedrigen Costimulationsgrad bei der Beurteilung in T-Zell-Proliferationsassays.
WO 00/46240 offenbart zwei
Polypeptide eines Costimulationswegs von T-Zellen. Die Polypeptide
stellen ein Ligand-Rezeptor-Paar in einem einzelnen costimulatorischen
Weg dar, der sich von dem Weg bestehend aus CD28, CTLA-4, B7.1 und
B7.2 zu unterscheiden scheint. Nukleinsäure, Polypeptid, Vektor, rekombinante
Zellen, Antikörper,
Verfahren zu deren Herstellung und ihre erfindungsgemäße Verwendung
werden von
WO 00/46240 weder
offenbart noch vorgeschlagen.
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Erst
vor sehr kurzer Zeit wurde ein neuartiger Oberflächenrezeptor namens ICOS beschrieben,
der Sequenzidentität
mit CD28 (24%) und CTLA4 (17%) hatte (Hutloff et al. (1999) Nature
397:263;
WO 98/38216 ). Im
Gegensatz zu CD28 zeigte sich, dass ICOS auf stimulierte T-Zellen
hochreguliert war und die Sekretion einer Gruppe von Zytokinen bewirkte,
die sich von jenen unterschieden, die durch CD28-Costimulation vermittelt
waren (Hutloff et al. (1999) Nature 397:263). EMBL AB014553 offenbart
menschliche mRNA für
das KIAA0653 Protein mit Homologie zu einem CD80-ähnlichen
Proteinvorläufer.
Nukleinsäure,
Polypeptid, Vektor, rekombinante Zellen, Antikörper, Verfahren zu deren Herstellung
und ihre erfindungsgemäße Verwendung werden
von EMBL AB014553 weder offenbart noch vorgeschlagen.
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Die
Bedeutung des costimulatorischen Wegs B7:CD28/CTLA4 wurde in vitro
und in mehreren in vivo Modellsystemen gezeigt. Die Blockierung
dieses costimulatorischen Wegs führt
zu der Entwicklung von antigenspezifischer Toleranz in murinen und
humanen Systemen (Harding, F. A. et al. (1992) Nature 356:607-609; Lenschow,
D. J. et al. (1992) Science 257:789-792; Turka, L. A. et al. (1992)
Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:11102-11105; Gimmi, C. D. et al. (1993)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6586-6590; Boussiotis, V. et al. (1993)
J. Exp. Med. 178:1753-1763). Umgekehrt induziert die Expression
von B7 durch B7-negative murine Tumorzellen T-Zellvermittelte spezifische
Immunität,
begleitet von Tumorabstoßung
und Langzeitschutz gegenüber
Tumor-Challenge (Chen, L. et al. (1992) Cell 71:1093-1102; Townsend,
S. E. und Allison, J. P. (1993) Science 259:368-370; Baskar, S.
et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:5687-5690.). Die Manipulation
der costimulatorischen Wege bietet daher ein großes Potenzial für die Stimulierung
oder Unterdrückung
von Immunantworten im Menschen.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung basiert, zumindest teilweise, auf der Entdeckung
von neuen Nukleinsäuremolekülen und
von Polypeptiden, die von solchen Nukleinsäuremolekülen codiert werden, hierin
als GL50-Moleküle
bezeichnet. Bevorzugte GL50-Moleküle beinhalten Antigene auf
der Oberfläche
von professionellen antigenpräsentierenden
Zellen (z.B. B-Lymphozyten, Monozyten, dendritische Zellen, Langerhans-Zellen)
und andere antigenpräsentierende
Zellen (z.B. Keratinozyten, endotheliale Zellen, Astrozyten, Fibroblasten,
Oligodendrozyten), welche die T-Zell-Proliferation costimulieren,
an costimulatorische Rezeptoren-Liganden auf T-Zellen binden (z.B.
CD28, CTLA4, und/oder ICOS) und/oder durch Antikörper gebunden sind, die Mitglieder der
B7-Familie erkennen, z.B. Antikörper
gegen GL50.
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Die
erfindungsgemäßen GL50-Nukleinsäuremoleküle und GL50-Polypeptidmoleküle sind
zum Beispiel für
die Modulation der Immunantwort nützlich. Dementsprechend bietet
die Erfindung in einem Aspekt isolierte Nukleinsäuremoleküle, die GL50-Polypeptide codieren,
sowie Nukleinsäurefragmente,
die als Primer oder als Hybridisierungssonden für die Detektion von GL50-codierenden
Nukleinsäuren
geeignet sind.
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In
einem Ausführungsbeispiel
ist ein erfindungsgemäßes GL50-Nukleinsäuremolekül mindestens
zu 95%, 98% oder mehr mit einer Nukleotidsequenz identisch (z.B.
zu der gesamten Länge
der Nukleotidsequenz), einschließlich SEQ ID Nr. 5 oder ein
Komplement davon.
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In
einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
enthält
das isolierte Nukleinsäuremolekül die in
SEQ ID Nr. 1, 3 oder 5 gezeigte Nukleotidsequenz oder ein Komplement
davon. In einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel codiert ein
erfindungsgemäßes isoliertes
Nukleinsäuremolekül die Aminosäuresequenz
eines GL50-Polypeptids.
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Ein
anderes Ausführungsbeispiel
der Erfindung zeichnet sich durch Nukleinsäuremoleküle aus, vorzugsweise durch
die GL50-Nukleinsäuremoleküle, die
spezifisch die GL50-Nukleinsäuremoleküle detektieren, im
Vergleich zu Nukleinsäuremolekülen, die
Nicht-GL50-Polypeptide codieren. In einem Ausführungsbeispiel weist ein solches
Nukleinsäuremolekül zum Beispiel
eine Länge
von mindestens 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400,
450, 500, 550, 600, 650, 700, 750 oder 800 Nukleotide auf und hybridisiert
unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül, das die in SEQ ID Nr. 1,
3 oder 5 gezeigte Nukleotidsequenz oder ein Komplement davon umfasst.
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In
anderen bevorzugten Ausführungsbeispielen
codieren erfindungsgemäße Nukleinsäuremoleküle natürlich vorkommende
Allelvarianten eines humanen GL50-Polypeptids, wobei die Nukleinsäuremoleküle unter
stringenten Bedingungen mit dem Komplement eines Nukleinsäuremoleküls hybridisieren,
das die SEQ ID Nr. 3 enthält.
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Ein
anderes Ausführungsbeispiel
der Erfindung bietet ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das antisense zu einem GL50-Nukleinsäuremolekül ist, z.B.
der Masterstrang eines GL50-Nukleinsäuremoleküls.
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Ein
anderer Aspekt der Erfindung bietet einen Vektor, der ein GL50-Nukleinsäuremolekül umfasst.
In bestimmten Ausführungsbeispielen
ist der Vektor ein rekombinanter Expressionsvektor. In einem anderen Ausführungsbeispiel
bietet die Erfindung eine Wirtszelle, die einen erfindungsgemäßen Vektor
enthält.
Die Erfindung bietet ferner ein Verfahren zur Herstellung eines
Polypeptids, vorzugsweise eines GL50-Polypeptids, durch das Kultivieren
in einem geeigneten Medium einer erfindungsgemäßen Wirtszelle, z.B. eine Säugetierwirtszelle,
wie etwa eine nicht-humane Säugetierzelle,
die einen rekombinanten Expressionsvektor enthält, so dass das Polypeptid
hergestellt wird.
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Ein
anderer Aspekt dieser Erfindung zeichnet sich durch isolierte oder
rekombinante GL50-Polypeptide und GL50-Proteine aus.
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In
einem Ausführungsbeispiel
ist das isolierte Polypeptid ein humanes GL50-Polypeptid.
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In
noch einem anderen Ausführungsbeispiel
ist das isolierte GL50-Polypeptid ein lösliches GL50-Polypeptid.
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In
einem weiteren Ausführungsbeispiel
ist das isolierte GL50-Polypeptid auf der Oberfläche einer Zelle exprimiert,
z.B. hat eine Transmembrandomäne.
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In
einem weiteren Ausführungsbeispiel
spielt das isolierte GL50-Polypeptid eine Rolle bei der Costimulation
der Zytokinsekretion und/oder der Proliferation von aktivierten
T-Zellen. In einem anderen Ausführungsbeispiel
ist das isolierte GL50-Polypeptid von einem Nukleinsäuremolekül codiert,
das eine Nukleotidsequenz hat, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen
mit einem Nukleinsäuremolekül hybridisiert,
das die Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1, 3 oder 5 umfasst.
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Ein
anderes Ausführungsbeispiel
der Erfindung zeichnet sich durch ein isoliertes Polypeptid aus,
vorzugsweise ein GL50-Polypeptid, das von einem Nukleinsäuremolekül codiert
ist, das eine Nukleotidsequenz aufweist, die eine Identität von mindestens
etwa 95%, 98% oder mehr mit einer Nukleotidsequenz hat (z.B. zu der
gesamten Länge
der Nukleotidsequenz), die SEQ ID Nr. 5 oder ein Komplement davon
enthält.
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Ein
anderes Ausführungsbeispiel
der Erfindung zeichnet sich durch ein isoliertes Polypeptid aus,
vorzugsweise ein GL50-Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz
mit einer Identität
von mindestens etwa 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%,
95%, 98% oder mehr mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 4 oder
6 umfasst.
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Diese
Erfindung zeichnet sich durch ein isoliertes GL50-Polypeptid aus,
das von einem Nukleinsäuremolekül codiert
ist, das eine Nukleotidsequenz hat, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen
mit einem Nukleinsäuremolekül hybridisiert,
das die Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1, 3 oder 5 oder ein Komplement
davon umfasst.
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Die
erfindungsgemäßen Polypeptide
können
funktionell mit einem Nicht-GL50-Polypeptid verbunden sein (z.B.
heterologe Aminosäuresequenzen),
um Fusionsproteine zu bilden. Die Erfindung zeichnet sich ferner
durch Antikörper
aus, wie zum Beispiel monoklonale oder polyklonale Antikörper, die
spezifisch erfindungsgemäße Polypeptide
binden, vorzugsweise GL50-Polypeptide. Außerdem können die GL50-Polypeptide,
z.B. biologisch aktive Polypeptide, in pharmazeutische Zusammensetzungen
eingebracht werden, die optional pharmazeutisch akzeptable Träger enthalten.
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In
einem anderen Aspekt bietet die vorliegende Erfindung ein Verfahren
zum Detektieren der Anwesenheit eines GL50-Nukleinsäuremoleküls oder
GL50-Polypeptids in einer biologischen Probe durch das Inkontaktbringen
der biologischen Probe mit einem Agens, das dazu fähig ist,
ein GL50-Nukleinsäuremolekül oder GL50-Polypeptid
zu detektieren, so dass die Anwesenheit eines GL50-Nukleinsäuremoleküls oder GL50-Polypeptids
in der biologischen Probe nachgewiesen ist.
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In
einem anderen Aspekt bietet die vorliegende Erfindung ein Verfahren
zum Detektieren des Vorhandenseins von GL50-Aktivität in einer
biologischen Probe durch das Inkontaktbringen der biologischen Probe mit
einem Agens, das dazu fähig
ist, einen Indikator der GL50-Polypeptidaktivität zu detektieren, so dass das Vorhandensein
der GL50-Polypeptidaktivität
in der biologischen Probe nachgewiesen ist.
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In
einem anderen Aspekt bietet die Erfindung ein Verfahren zum Modulieren
der GL50-Polypeptidaktivität,
umfassend das Inkontaktbringen einer Zelle, die dazu fähig ist,
das GL50-Polypeptid mit einem Agens zu exprimieren, das die GL50-Aktivität moduliert,
so dass die GL50-Aktivität
in der Zelle moduliert ist. In einem Ausführungsbeispiel inhibiert das
Agens die GL50-Aktivität.
In einem anderen Ausführungsbeispiel
stimuliert das Agens die GL50-Aktivität. In einem Ausführungsbeispiel
ist das Agens ein Antikörper,
der (vorzugsweise spezifisch) an ein GL50-Polypeptid bindet. In
einem anderen Ausführungsbeispiel
moduliert das Agens die Expression von GL50 durch das Modulieren
der Transkription eines GL50-Gens oder der Translation einer GL50-mRNA.
In noch einem anderen Ausführungsbeispiel
ist das Agens ein Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz,
die antisense zu dem Masterstrang einer GL50-mRNA oder eines GL50-Gens
ist.
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In
einem Ausführungsbeispiel
werden die Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet, um ein
Individuum zu behandeln, das eine Krankheit aufweist (charakterisiert
durch aberrante Expression oder Aktivität eines GL50-Polypeptids oder
einer GL50-Nukleinsäure)
oder sich in einem Zustand befindet, die bzw. der von einer Modulation,
sei es eine Hoch- oder Heruntermodulation, eines GL50-Moleküls profitieren
würde durch das
Verabreichen eines Agens, das ein GL50-Modulator für das Individuum
ist. In einem Ausführungsbeispiel ist
der GL50-Modulator ein GL50-Polypeptid. In einem anderen Ausführungsbeispiel
ist der GL50-Modulator ein GL50-Nukleinsäuremolekül. In einem anderen Ausführungsbeispiel
ein GL50-Modulatormolekül,
das die Interaktion zwischen GL50 und einem Liganden von GL50 moduliert,
oder ein Molekül,
das mit der intrazellulären
Domäne
von GL50 interagiert. In noch einem anderen Ausführungsbeispiel ist der GL50-Modulator
ein Peptid, ein Peptidomimetikum oder ein sonstiges kleines Molekül. In einem
bevorzugten Ausführungsbeispiel ist
die durch aberrante Expression des GL50-Polypeptids oder der GL50-Nukleinsäuren charakterisierte Krankheit
eine Immunsystemkrankheit oder ein Immunsystemzustand, die bzw.
der von einer Modulation einer GL50-Aktivität profitieren würde.
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Die
vorliegende Erfindung bietet ferner einen diagnostischen Assay zur
Identifizierung des Vorhandenseins oder Nicht-Vorhandenseins einer
genetischen Alteration, charakterisiert durch mindestens eines der folgenden
Merkmale: (i) aberrante Modifikation oder Mutation eines Gens, das
ein GL50-Polypeptid codiert; (ii) Fehlregulierung des Gens; und
(iii) aberrante posttranslationale Modifikation eines GL50-Polypeptids,
wobei eine Wildtyp-Form des Gens ein Polypeptid mit einer GL50-Aktivität codiert.
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In
einem anderen Aspekt bietet die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung
einer Verbindung, die an ein GL50-Polypeptid bindet oder dessen
Aktivität
moduliert. Das Verfahren beinhaltet das Bereitstellen einer Indikatorzusammensetzung
umfassend ein GL50-Polypeptid mit GL50-Aktivität, das Inkontaktbringen der Indikatorzusammensetzung
mit einer Testverbindung und das Bestimmen der Wirkung der Testverbindung
auf die GL50-Aktivität
in der Indikatorzusammensetzung, um eine Verbindung zu identifizieren,
welche die Aktivität eines
GL50-Polypeptids moduliert.
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In
einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein nichthumanes transgenes
Tier, das Zellen enthält, die
ein Transgen tragen, das ein Polypeptid der GL50-Familie codiert.
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In
einem Ausführungsbeispiel
bietet die vorliegende Erfindung Verfahren zur Behandlung von Krebs, mit
einschließend
die Verabreichung an ein Individuum, das an einem Tumor leidet,
umfassend die Verabreichung einer stimulatorischen Form eines GL50-Moleküls. In einem
bevorzugten Ausführungsbeispiel
ist die stimulatorische Form eines GL50-Moleküls eine lösliche Form von GL50 und enthält die extrazelluläre Domäne eines
costimulatorischen Moleküls.
In einem Ausführungsbeispiel
ist das costimulatorische Molekül
monospezifisch. In einem Ausführungsbeispiel
ist das costimulatorische Molekül
dimerisch. In einem Ausführungsbeispiel
ist das costimulatorische Molekül
zweiwertig.
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In
einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel
ist das costimulatorische Molekül
an ein zweites Protein oder Polypeptid fusioniert, das einen Teil
eines Immunglobulinmoleküls
enthält
(z.B. ein Teil eines Immunglobulinmoleküls, welches Cysteinreste enthält; ein
Teil eines Immunglobulinmoleküls,
welches die Scharnierregion, CH2- und CH3-Regionen eines humanen
Immunglobulinmoleküls
enthält;
oder ein Teil eines Immunglobulinmoleküls, welches die Scharnierregion,
CH1, CH2 und CH3 Bereich eines humanen Immunglobulinmoleküls enthält). In
noch einem anderen Ausführungsbeispiel
wurde der Teil des Immunglobulinmoleküls modifiziert, um Komplementbindung
und/oder Fc-Rezeptorbindung zu reduzieren.
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In
noch einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum
Reduzieren der Proliferation einer Tumorzelle, umfassend das Inkontaktbringen
einer Immunzelle mit einer aktivierenden Form eines GL50-Moleküls, so dass
eine Immunantwort auf die Tumorzelle verstärkt wird und die Proliferation
der Tumorzelle reduziert wird.
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In
einem Ausführungsbeispiel
ist die aktivierende Form eines GL50-Moleküls ein lösliches Polypeptid, das die
extrazelluläre
Domäne
von GL50 umfasst.
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In
einem anderen Ausführungsbeispiel
ist die aktivierende Form eines GL50-Moleküls eine Zelle, die mit einem
Polypeptid assoziiert ist, das die extrazelluläre Domäne von GL50 umfasst.
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In
noch einem anderen Ausführungsbeispiel
betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Screenen einer Verbindung,
welche die GL50-vermittelte Aktivierung einer Immunzelle moduliert,
umfassend: i) das Inkontaktbringen eines Polypeptids, das mindestens
eine GL50-Polypeptiddomäne
umfasst, mit einer Testverbindung und einem GL50-Bindungspartner
und ii) das Identifizieren von Verbindungen, welche die Interaktion
des Polypeptids mit dem GL50-Bindungspartner modulieren, um dabei
Verbindungen zu identifizieren, die GL50-vermittelte Aktivierung
einer Immunzelle modulieren.
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In
einem Ausführungsbeispiel
umfasst das Polypeptid eine GL50-Domäne, ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus einer Transmembrandomäne,
einer cytoplasmatischen Domäne
und einer extrazellulären Domäne.
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In
einer Ausführungsform
ist die Domäne
eine Spleißvariante
einer cytoplasmatischen GL50-Domäne.
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In
einer Ausführungsform
umfasst die GL50-Polypeptiddomäne
mindestens eine Aminosäuresubstitution.
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In
einem Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Screenen nach
einer Verbindung, welche die Signaltransduktion in einer Immunzelle
moduliert, umfassend das Inkontaktbringen einer Immunzelle, die
ein GL50-Molekül
exprimiert, mit einer Testverbindung, und das Bestimmen der Fähigkeit
der Testverbindung, die Signaltransduktion über GL50 zu modulieren, um
dabei eine Verbindung zu identifizieren, die ein Signal in einer
Immunzelle moduliert.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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1 zeigt
die komplette Nukleotidsequenz von murinem GL50-1 (mGL50-1), basierend
auf einem Klon der Signalsequenz (Position 1-519) und einem isolierten
RecA-Klon (Position 374-2718).
Vorhergesagte Nukleotide, die eine Signalsequenz codieren, sind
eingerahmt, und die hydrophobe Transmembrandomäne ist unterstrichen.
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2 zeigt
die Nukleotidsequenz eines murinen GL50-2 (mGL50-2)-Produkts.
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3 zeigt
eine Sequenzanordnung des mGL50-1- und mGL50-2-Produkts. Eine Sequenzdivergenz tritt
am Nukleotid 1027 für
mGL50-1 und an 960 für
mGL50-2 auf.
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4 zeigt
eine isoformspezifische RT-PCR von mGL50-1 und mGL50-2.
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5 zeigt
eine isoformspezifische Northern Blot-Analyse von mGL50-1 und mGL50-2.
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6 zeigt die Nukleotidsequenz des AB014553
RACE-Produkts. Der eingerahmte Bereich ist ein Divergenzgebiet zwischen
der veröffentlichten
AB014553-cDNA-Sequenz und dem RACE-Produkt. Der letzte verschachtelte
RACE-Primer erstreckt sich von Position 1 bis 22, was den Nukleotiden
655 bis 676 entspricht.
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7 zeigt
eine Anordnung des translatierten RACE-Produkts und der veröffentlichten
AB014553-cDNA. Eine Divergenz tritt an den Resten 299 der veröffentlichten
AB014553-cDNA und an den Resten 123 des RACE-Produkts auf.
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8 zeigt
die Sequenz von humanem GL50 (hGL50).
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9 zeigt
eine Hydropathie-Plot-Analyse von GL50, fusioniertes AB014553 RACE-Produkt
(hGL50) und murines und humanes B7-1 und B7-2. Zwischen GL50 und
AB014553 sind signifikante Hydropathieprofile zu sehen.
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10 zeigt eine RT-PCR Southern-Blot-Analyse der
veröffentlichten
AB014553 cDNA und AB014553 RACE-Produkte.
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11 zeigte eine Northern-Analyse von mehreren RNA-Blots
von Humangewebe. Die codierenden Sequenzen von hGL50/AB014553 wurden
als Sonden verwendet.
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12 zeigt eine PileUp-Analyse von hGL50, mGL50-1,
hB7-1, mB7-2, hB7-2, mB7-2, in der die Signalpeptide, Ig-ähnliche
Domänen,
Transmembrandomänen
und cytoplasmatische Domänen
angezeigt sind. Die vorhergesagten hydrophoben Reste der Transmembran
sind unterstrichen, und Sternchen kennzeichnen Reste, die zur Ig-Struktur
beitragen. Die extrazellulären
Cysteine und Tryptophane, Indikatoren der Ig-Struktur, sind in Fettdruck
dargestellt.
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13 zeigt eine Dendrogramm-Analyse, die genetische
Distanzen zwischen B7-1, B7-2 und GL50-Proteinen darstellt. Y08823
ist das CD80-artige Protein vom Huhn, und MM867065_1 ist das Butyrophilin
von der Maus.
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14 zeigt Ergebnisse einer GL50 COS-Transfektionsstudie.
mGL50-1 wurde in COS-Zellen exprimiert, gefolgt von einer Anfärbung mit
entweder ICOS-Ig, CD28-Ig oder CTLA4-Ig. Man stellte eine Bindung von
ICOS Ig durch Zellen fest, die mGL50-1 exprimieren.
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15 zeigt eine schematische Darstellung von mGL50-1
und mGL50-2. Sequenzdivergenz, gekennzeichnet durch eine vertikale
Linie, tritt am Nukleotid 1027 für
mGL50-1 und an 960 für
mGL50-2 auf. Die repetitive Sequenz (schraffierter Kasten) befindet
sich in der 3'-UTR
von mGL50-2 und umfasst die Nukleotide 1349-1554. Striche und Pfeilspitzen
stellen Oligonukleotide dar, die in der RT-PCR-Analyse verwendet
werden. Horizontale Linien stellen Sonden dar, die in der Northern
Blot-Analyse verwendet werden.
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16 stellt ein Proteinsequenz-Alignment zwischen
mGL50-1, mGL50-2, hGL50 und Y08823 dar. Die Sequenzen wurden mit
dem Programm PileUp ausgerichtet, und gemeinsame Reste dieser Moleküle sind eingerahmt.
Die Buchstaben über
den Sequenzen bezeichnen sekundäre
Peptidstrukturen wie für
Y08823 vorhergesagt, basierend auf der Kristallstruktur von B7-1.
Das Exon, das die Sequenzen der cytoplasmatische hGL50-Domäne 1 codiert,
ist durch einen mit Cy-1 bezeichneten Balken gekennzeichnet.
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17 zeigt die durchflusscytometrische Analyse von
ICOS, der an GL50-verwandte Proteine von der Maus, vom Menschen
und vom Huhn bindet. COS-Zellen, die mit Expressionsplasmiden transfiziert
sind, die mGL50-1, mGL50-2, hGL50 und das B7-artige Protein Y08823
vom Huhn codieren, wurden mit mICOS-mIgG2am, hICOS-mIgG2am oder
mCTLA4-mIgG2am inkubiert, gefolgt von einer Sekundärfärbung mit anti-Maus
IgG2a Biotin und einer Detektion mit Streptavidin-PE.
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18 zeigt einen ICOS, der an WEHI231 bindet. Titermengen
von mICOS-mIgG2am oder mCTLA4-mIgG2am wurden verwendet, um WEHI231-Zellen
in Anwesenheit von blockierenden Antikörpern gegen B7-1 und B7-2 oder
Isotypkontrollen zu färben.
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19 zeigt einen ICOS, der an undifferenzierte ES-Zellen
bindet. Die Auswertung des Zählgeräts für undifferenzierte
ES-Zellen, gefärbt
mit anti-B7-1 und mICOS-mIgG2am Reagenzien, ergab die positive Färbung sowohl
für B7-1
als auch für
den ICOS-Liganden.
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20 zeigt die immunologische Phänotypisierung von Untergruppen
der BALG/c und RAG1 -/- Splenozyten. Zweidimensionale Darstellungen
von 10.000 gefärbten
Zellen sind dargestellt; Proben mit 50.000 Datenpunkten sind durch
Sternchen gekennzeichnet. (A) Angereicherte Splenozyten von BALG/C
oder RAG1 -/- Mäusen
wurden mit mICOS-mIgG2am und FITC-konjugierten Antikörpern gegen CD3, CD24, CD45R/B220, Pan-NK,
MHC Klasse II oder CD40 gefärbt.
Um die CD4+, ICOS-Ligand+ Zellen weiter zu phänotypisieren, wurden RAG1 -/-
Zellen mit PE-markiertem anti-CD4 und FITC-markiertem anti-CD11c
gefärbt.
(B) Angereicherte Splenozyten von RAG 1 -/- und BALG/C Mäusen (unbehandelt,
ConA-aktiviert oder LPS-aktiviert) wurden mit mICOS-mIgG2am und
Antikörpern
gegen CD4, CD8, CD19, CD11b, CD11c und CD69 gefärbt.
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21 zeigt eine phylogenetische Darstellung von
GL50/B7-Liganden und CD28/CTLA4/ICOS-Rezeptoren. Unter Verwendung
von genetischer Distanz, angegeben in Substitutionen pro 100 Aminosäuren, wurden
distanzproportionale Phylogramme erzeugt. (A) Phylogramm von GL50/B7-verwandten
Proteinen. Die Accession Nr. MMU67065_1 stellt Butyrophilin von
der Maus dar. (B) Phylogramm von ICOS/CD28/CTLA4 Proteinen.
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22 zeigt die Proliferation und die Zytokininduktion
durch die GL50-Costimulation von T-Zellen, in der Abwesenheit oder
Anwesenheit von blockierenden Antikörpern gegen CD28. Anmerkung:
hGL50.Fc ist mit hGL50-IgG2am identisch.
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23 zeigt eine T-Zell-Proliferation, induziert
durch GL50-Costimulation in der Anwesenheit von verschiedenen Konzentrationen
von blockierenden Antikörpern
gegen CD28 und anti-CD3-Stimulation.
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24 zeigt Zytokininduktion durch GL50-Costimulation
in T-Zellen in der Abwesenheit oder Anwesenheit von CD28-Stimulation.
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25 zeigt die Fähigkeit
von GL50-IgG2a, das Tumorwachstum in Mäusen zu inhibieren.
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26 zeigt die Sequenz des hICOS-mIgG2am-Fusionsproteins.
(A) Die Nukleotidsequenz, die hICOS-mIgG2am codiert (bezeichnet
als SEQ ID Nr. 23). Die Oncostatin-M Leader-Sequenz ist von den
unterstrichenen Nukleotiden codiert. Die eingerahmten Nukleotide
codieren die murine IgG2am-Domäne
des Fusionsproteins. Die Translationsinitiationsstelle ist durch
ein X gekennzeichnet. Introne und untranslatierte Regionen sind
durch eine gestrichelte Linie gekennzeichnet. Das Stopp-Codon ist
durch eine doppelte Unterstreichung gekennzeichnet. (B) Die vorhergesagte
Aminosäuresequenz
(bezeichnet als SEQ ID Nr. 24) des hICOS-mIgG2am-Fusionsproteins.
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27 zeigt die Sequenz des mICOS-mIgG2am-Fusionsproteins.
(A) Die Nukleotidsequenz, die mICOS-mIgG2am codiert (bezeichnet
als SEQ ID Nr. 25). Die Oncostatin-M Leader-Sequenz ist von den
unterstrichenen Nukleotiden codiert. Die eingerahmten Nukleotide
codieren die murine IgG2am-Domäne
des Fusionsproteins. Die Translationsinitiationsstelle ist durch
ein X gekennzeichnet. Introne und untranslatierte Regionen sind
durch eine gestrichelte Linie gekennzeichnet. Das Stopp-Codon ist
durch eine doppelte Unterstreichung gekennzeichnet. (B) Die vorhergesagte
Aminosäuresequenz
(bezeichnet als SEQ ID Nr. 26) des mICOS-mIgG2am-Fusionsproteins.
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28 zeigt die Sequenz des hGL50-mIgG2am-Fusionsproteins.
(A) Die Nukleotidsequenz, die hGL50-mIgG2am codiert (bezeichnet
als SEQ ID Nr. 27). Die Oncostatin-M Leader-Sequenz ist von den
unterstrichenen Nukleotiden codiert. Die eingerahmten Nukleotide
codieren die murine IgG2am-Domäne
des Fusionsproteins. Die Translationsinitiationsstelle ist durch
ein X gekennzeichnet. Introne und untranslatierte Regionen sind
durch eine gestrichelte Linie gekennzeichnet. Das Stopp-Codon ist
durch eine doppelte Unterstreichung gekennzeichnet. (B) Die vorhergesagte
Aminosäuresequenz
(bezeichnet als SEQ ID Nr. 28) des hGL50-mIgG2am-Fusionsproteins.
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29 zeigt die Sequenz des mGL50-mIgG2am-Fusionsproteins.
(A) Die Nukleotidsequenz, die mGL50-mIgG2am codiert (bezeichnet
als SEQ ID Nr. 29). Die Oncostatin-M Leader-Sequenz ist von den
unterstrichenen Nukleotiden codiert. Die eingerahmten Nukleotide
codieren die murine IgG2am-Domäne
des Fusionsproteins. Die Translationsinitiationsstelle ist durch
ein X gekennzeichnet. Introne und untranslatierte Regionen sind
durch eine gestrichelte Linie gekennzeichnet. Das Stopp-Codon ist
durch eine doppelte Unterstreichung gekennzeichnet. (B) Die vorhergesagte
Aminosäuresequenz
(bezeichnet als SEQ ID Nr. 30) des mGL50-mIgG2am Fusionsproteins.
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30 zeigt eine Färbung mit ICOS-Ig von verschiedenen
Milzzelltypen.
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31 zeigt die Verringerung der Tumorigenizität von Tumorzellen,
die mit GL50 transfiziert sind.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Neben
den vorstehend charakterisierten B-Lymphozyt-Akivierungsantigenen,
z.B. B7-1 und B7-2, gibt es noch andere Antigene auf der Oberfläche von
antigenpräsentierenden
Zellen (z.B. B-Zellen, Monozyten, dendritische Zellen, Langerhan-Zellen,
Keratinozyten, endotheliale Zellen, Astrozyten, Fibroblasten, Oligodendrozyten),
die T-Zellen costimulieren.
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Die
vorliegende Erfindung basiert, zumindest teilweise, auf der Entdeckung
von neuen Molekülen, hierin
als GL50-Polypeptide bezeichnet. Murines GL50-1 (mGL50-1) wurde
von einer IL-12-aktivierten Lymphknotenbibliothek von der Maus isoliert.
Die Nukleotidsequenz von mGL50-1 ist in der SEQ ID Nr. 1 gezeigt.
Die abgeleitete Polypeptidsequenz von murinem mGL50-1 voller Länge ist
in SEQ ID Nr. 2 gezeigt. Die Sequenz hat ungefähr 20% Sequenzidentität mit murinem
B7-1 und B7-2. mGL50-1 codiert ein aus 322 Aminsäuren bestehendes Polypeptid,
das eine Leader-Sequenz, extrazelluläre Ig-ähnliche Domänen, eine hydrophobe Transmembrandomäne und eine
intrazelluläre
Domäne
mit einem Tyrosinrest enthält.
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Eine
3' RACE PCR mit
muriner RNA aus peripheren Blutlymphozyten (PBL) zeigte eine alternativ
gespleißte
Form non murinem GL50 (mGL50-2). Die Nukleotidsequenz von murinem
GL50-2 (mGL50-2)
ist in SEQ ID Nr. 3 gezeigt. Die Nukelotidsequenz codierte ein Polypeptid
mit einer abweichenden 27 Aminosäuren langen
intrazellulären
Domäne,
die zusätzliche
drei Tyrosine, eine 3'-untranslatierte
Region mit Polyadenylierungssignal (Konsensus) und einen Poly(A)-Schwanz
enthielt, die in SEQ ID Nr. 4 gezeigt sind. Transkripte von mGL50-1
sowie von mGL50-2 wurden durch RT-PCR- und Northern-Blot-Analysen
gefunden und wurden hauptsächlich
in lymphoiden Organen mit Panels von mehreren Geweben lokalisiert.
Man stellte fest, dass die identifizierten murinen GL50-Sequenzen
mit einem bereits früher
berichtetem cDNA Klon aus humanem Gehirn, GenBank Accession Nr.
AB014553, verwandt waren.
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Eine
3' RACE von humaner
cDNA aus PBL wurde ausgeführt,
um humane, mit murinem GL50 verwandt Klone zu identifizieren. Es
wurden Klone identifiziert, die alternative 3' Sequenzen codieren. Die Nukleotidsequenz
des resultierenden humanen GL50 (hGL50 [AB014553RACE])-Klons ist
in SEQ ID Nr. 5 gezeigt. Die Nukleotidsequenz codiert ein aus 309
Aminosäuren
bestehendes Protein, das etwa 26% Aminosäuresequenzidentität mit mGL50-1,
28% Identität
mit mGL50-2, und Aminosäuresequenz,
ungefähr
13% Aminosäuresequenzidentität mit humanem
B7-1, und etwa 13% Aminosäuresequenzidentität mit humanem
und murinem B7-2 hat.
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Durchflusszytometrische
Untersuchungen unter Verwendung eines murinen GL50-1-Ig Fusionsproteins
als Reagenz zeigten eine Bindung an COS-Transfektanten, die murinen
ICOS exprimieren, aber keine Bindung an Zellen, die CD28 oder CTLA-4
exprimieren. Diese Ergebnisse bestätigen, dass GL50-Moleküle neue Mitglieder
der B7-Molekülfamilie
sind.
-
GL50-Nukleinsäuremoleküle und GL50-Polypeptidmoleküle
-
In
einem Ausführungsbeispiel
codieren die erfindungsgemäßen isolierten
Nukleinsäuremoleküle eukaryotische
GL50-Polypeptide.
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Die
Moleküle
der GL50-Familie haben eine Reihe von konservierten Regionen gemeinsam,
einschließlich
Signaldomänen,
IgV-Domänen
und der IgC-Domänen.
In dem Fall von mGL50-1 (SEQ ID N. 1) codiert zum Beispiel die aus
2718 Nukleotiden bestehende mGL50-1-Konsensussequenz ein aus 322
Aminosäuren
bestehendes Protein mit einer vorhergesagten Masse von 36 kDa. Eine
Hydropathie-Plot-Analyse des offenen Leserahmens sagte eine Struktur
voraus, die einer Leader-Sequenz entspricht (codiert von etwa den Nukleotiden
67 bis 195), einer extrazelluläre
Domäne
(codiert von etwa den Nukleotiden 196 bis 904), einer hydrophobe
Transmembranregion (codiert von etwa den Nukleotiden 905 bis 961)
und einer potenziellen intrazellulären cytoplasmatischen Domäne (codiert
von etwa den Nukleotiden 962 bis 1032). Eine Signalpeptidspaltung
wurde an Position 46 in der Aminosäuresequenz vorhergesagt. In
einem Ausführungsbeispiel
umfasst die extrazelluläre
Domäne
eines GL50-Polypeptids die IgV- und IgC-Domänen nach der Spaltung der Signalsequenz,
aber nicht die Transmembrandomäne
und die cytoplasmatische Domäne
eines GL50-Polypeptids (z.B. entsprechend der Aminosäuresequenz
von etwa Aminosäure
47-277 von GL50-1 oder der Aminosäuresequenz von etwa Aminosäure 22 bis
etwa Aminosäure
278 von hGL50, wie in 16 dargelegt).
-
Eine
Analyse der mGL50-1-Aminosäuresequenz
ließ auf
eine strukturelle Ähnlichkeit
zu einer Ig-Domäne
in der cytoplasmatischen Domäne
des Proteins schließen.
In Übereinstimmung
mit einer Ig-ähnlichen Struktur
wurden 4 Cysteine in der extrazellulären Domäne gefunden, was die Möglichkeit
einer intramolekularen Bindung und eine eindeutige strukturelle
Konformation entsprechend einer IgV-ähnlichen
Domäne
und einer IgC-ähnlichen
Domäne
gestattete. Diese Regionen sind beide Domänen von Mitgliedern der Ig-Superfamilie,
und sie sind als Stand der Technik anerkannt. Diese Domänen entsprechen
Struktureinheiten, die eindeutige Faltungsmuster haben, bekannt
als Ig-Faltungen. Die Ig-Faltungen bestehen aus einer Sandwichstruktur
mit zwei β-Faltblättern, die
jeweils aus antiparallelen β-Strängen aus
5-10 Aminosäuren
mit einer konservierten Disulfidbindung zwischen den beiden Faltblättern in
den meisten, aber nicht in allen Domänen bestehen. IgC-Domänen von
Ig-, TCR- und MHC-Molekülen
haben die gleichen Arten von Sequenzmuster und werden als C1-Gruppe
innerhalb der Ig-Superfamilie bezeichnet. Andere IgC-Domänen fallen
in andere Gruppen. IgV-Domänen
haben ebenfalls Sequenzmuster gemeinsam und werden V-Domänen genannt.
IgV-Domänen sind
länger
als C-Domänen
und bilden ein zusätzliches
Paar von β-Strängen.
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In 16 ist eine Anordnung der Moleküle mGL50-2,
mGL50-1, hGL50 und Y08823 vom Huhn dargestellt. Jedes der Moleküle umfasst
ein Signalpeptid, eine IgV-ähnliche
Domäne,
eine IgC-ähnliche
Domäne, eine
Transmembrandomäne
und eine cytoplasmatische Domäne.
Die Domänen
von mGL50-2, hGL50 und Y08823, die jenen in mGL50-1 entsprechen,
sind in 16 dargestellt.
-
Unter
Verwendung des Programms Geneworks Protein-Alignment und der Pam
250 Matrix wurde ein Protein-Alignment der GL50-Polypeptide, der
veröffentlichten
AB014553-Sequenz und der humanen und murinen B7-1- und B7-2-Sequenzen
ausgeführt.
Die Parameter waren dabei wie folgt eingestellt : Gap-Öffnungskosten
= 5, Gap-Verlängerungskosten
= 5, minimale diagonale Länge
= 4, maximaler diagonaler Versatz = 130, Konsensus-Cutoff = 50%.
Die Ergebnisse des Alignments sind in der nachstehenden Tabelle
angegeben. TABELLE 1 Protein-Alignment für GL50-verwandte Proteine
| | AB014553 | hGL50 | mGL50-1 | mGL50-2 | hB7-2 | mB7-2 | hB7-1 | mB7-1 |
| ABO14553 | 100 | 59 | 26 | 28 | 13 | 13 | 13 | 7 |
| hGL50 | | 100 | 42 | 41 | 17 | 17 | 17 | 12 |
| GL50-1 | | | 100 | 92 | 19 | 19 | 20 | 14 |
| GL50-2 | | | | 100 | 20 | 21 | 20 | 13 |
| hB7-2 | | | | | 100 | 48 | 19 | 21 |
| mB7-2 | | | | | | 100 | 20 | 24 |
| hB7-1 | | | | | | | 100 | 41 |
| mB7-1 | | | | | | | | 100 |
| Die Alignments
wurden unter Verwendung des Programms Geneworks Protein-Alignment
und der Pam 250 Matrix durchgeführt,
mit: Gap-Öffnungskosten
= 5, Gap-Verlängerungskosten
= 5, min. diagonale Länge
= 4, max. diagonaler Versatz = 130, Konsensus-Cutoff = 50%,. |
-
Tabelle
1 zeigt, dass das hGL50-Polypeptid ca. 59% Aminosäuresequenzidentität mit dem
von AB014553 codierten Polypeptid und ca. 40% Aminosäuresequenzidentität mit mGL50-1
und mGL50-2 hat. mGL50-1 und mGL50-2 haben einen höheren Grad
an Aminosäuresequenzidentität, nämlich ca.
92%. Die GL50-Polypeptide haben ca. 20% Aminosäuresequenzidentität mit Molekülen der
B7 Familie.
-
Ein
weiteres Alignment wurde durchgeführt, um den Verwandtschaftsgrad
zwischen mGL50, hGL50, humanem B7-1, murinem B7-1, murinem B7-2
und humanen B7-2-Proteinsequenzen zu bestimmen. Unter Verwendung
einer PileUp-Analyse (12) richteten sich 18 Aminosäurestellen
zwischen allen sechs Molekülen
innerhalb der extrazellulären
Domäne
identisch aus. Von den 32 Positionen, welche die vorhergesagten IgV-ähnlichen
und IgC-ähnlichen
Faltungen des B7-Moleküls
definieren, sind 13 identisch zwischen allen sechs Molekülen konserviert,
vor allem die 4 Cysteine, die intramolekulare Faltungen von Domänen gestatten. Andere
Bereiche von signifikanter Sequenzkonservierung wurden zudem in
der extrazellulären
Domäne
gesehen, aber interessanterweise richten sich die Identitäten von
GL50-Sequenzen an bestimmten Orten genauer nach B7-1 oder B7-2 aus
(Identitäts-Score
von 8). Ein Valinrest, welcher der Position 86 von murinem mGL50-1
entspricht, findet sich beispielsweise auch in hGL50 und B7-2 Sequenzen,
aber nicht in B7-1.
Ebenso wird Tyrosin an Position 87 von mGL50-1 an entsprechenden
Stellen in hGL50 und B7-1 konserviert, aber nicht in B7-2. Von den
16 Positionen mit dem Identitäts-Score
8 sind 5 Positionen murinem mGL50-1/hGL50 und B7-1 gemeinsam, 4
Positionen sind murinem mGL50-1/hGL50 und B7-2 gemeinsam, und 6 Positionen sind B7-1
und B7-2 gemeinsam. Auf Basis der Peptidstruktur lassen diese Ergebnisse
darauf schließen,
dass die GL50-Sequenzen einen phylogenetischen Raum parallel zu
der B7 Proteinfamilie einnehmen.
-
Molekularphylogenetische
Analysen (GrowTree), welche die genetische Distanz ausgedrückt in Substitutionen
pro 100 Aminosäuren
messen, ergaben ein Dendrogramm (
13)
mit unabhängiger
Anhäufung von
m/hGL50 (85), m/hB7-2(68) und m/hB7-1 (88). Als Fremdgruppe wurde
mmu67065_1 (Butyrophilin von der Maus) verwendet. Auch beim Klon
Y08823 vom Huhn stellte man fest, dass er sich genauer nach den GL50-Sequenzen
ausrichtete (ca. 140) als nach den B7 Sequenzen (215-320), was darauf
hindeutete, dass diese Sequenzen eine verschiedene Proteinsubfamilie
umfassten. Die Distanzen zwischen den GL50-, B7-2- und B7-1-Zweigen
waren hoch (216-284), was darauf schließen ließ, dass seit dem Anfang der
evolutiven Linien des Menschen und des Nagers große Anzahlen
von Substitutionen zwischen diesen Molekülen stattgefunden waren. Die
genetische Distanz unter den GL50-Nukleinsäuremolekülen ist in Tabelle 2 angegeben. TABELLE 2 Genetische Distanzen unter Mitgliedern
der B7 Familie
| | hGL50 | mGL50-1 | YO8823 | hB7-2 | mB7-2 | hB7-1 | mB7-1 | mmu67065_1 |
| hGL50 | 0 | 85 | 142 | 284 | 263 | 226 | 260 | 188 |
| mGL50-1 | | 0 | 139 | 225 | 216 | 229 | 257 | 223 |
| YO8823 | | | 0 | 235 | 322 | 215 | 223 | 223 |
| hB7-2 | | | | 0 | 68 | 222 | 190 | 215 |
| mB7-2 | | | | | 0 | 88 | 211 | 21 |
| hB7-1 | | | | | | 0 | 88 | 211 |
| mB7-1 | | | | | | | 0 | 271 |
| mmu67065_1 | | | | | | | | 0 |
-
In
den folgenden Unterabschnitten sind verschiedene Aspekte der Erfindung
detaillierter beschrieben.
-
I. Definitionen
-
Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung beinhaltet der Begriff "Immunzelle" Zellen, die hämatopoetischer
Abstammung sind, und die eine Rolle in der Immunantwort spielen.
Immunzellen beinhalten Lymphozyten, wie zum Beispiel B-Zellen und
T-Zellen; natürliche
Killerzellen; myeloide Zellen, wie zum Beispiel Monozyten, Makrophagen,
Eosinophile, Mastzellen, Basophile und Granulozyten.
-
Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung beinhaltet der Begriff "T-Zellen" CD4+ T-Zellen und
CD8+ T-Zellen. Ferner beinhaltet der Begriff T-Zellen sowohl T-Helfer-Zellen
des Typs 1 als auch T-Helfer-Zellen des Typs 2. Der Begriff "antigenpräsentierende
Zellen" beinhaltet
professionelle antigenpräsentierende
Zellen (z.B. B-Lymphozyten, Monozyten, dendritische Zellen, Langerhans-Zellen)
sowie andere antigenpräsentierende Zellen
(z.B. Keratinozyten, endotheliale Zellen, Astrozyten, Fibroblasten,
Oligodendrozyten).
-
Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung beinhaltet der Begriff "Immunantwort" T-Zell-vermittelte und/oder
von B-Zell-vermittelte Immunantworten, die durch Modulation von
T-Zell-Costimulation beeinflusst sind. Typische Beispiele für Immunantworten
beinhalten T-Zellantworten, z.B Zytokinproduktion und zelluläre Zytotoxizität. Außerdem beinhaltet
der Begriff Immunantwort Immunantworten, die indirekt durch T-Zellaktivierung
hervorgerufen werden, z.B. Antikörperproduktion
(humorale Antworten) und die Aktivierung von zytokinresponsiven
Zellen, z.B. Makrophagen.
-
Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung beinhaltet der Begriff "costimulatorischer
Rezeptor" Rezeptoren,
die ein costimulatorisches Signal an eine Immunzelle übertragen,
z.B. CD28. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung beinhaltet der Begriff "inhibitorische Rezeptoren" Rezeptoren, die
ein negatives Signal an eine Immunzelle übertragen (z.B. CTLA4). Ein
von einem inhibitorischen Rezeptor transduziertes Signal kann selbst dann
auftreten, wenn kein costimulatorischer Rezeptor (wie zum Beispiel
CD28) auf der Immunzelle vorhanden ist, und ist daher nicht einfach
eine Wettbewerbsfunktion zwischen inhibitorischen Rezeptoren und
costimulatorischen Rezeptoren, um costimulatorische Moleküle zu binden
(Fallarino et al. (1998) J. Exp. Med. 188:205). Die Übertragung
eines inhibitorischen Signals an eine Immunzelle kann zu einer fehlenden
Reaktivität
oder einer Anergie oder einem programmierten Zelltod in der Immunzelle
führen.
Vorzugsweise funktioniert die Übertragung
eines inhibitorischen Signals durch einen Mechanismus, der nicht
mit einer Apoptose einhergeht. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung
beinhaltet der Begriff "Apoptose" den programmierten
Zelltod, der unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten
Techniken charakterisiert werden kann. Apoptotischer Zelltod kann
z.B. durch Zellschrumpfung, Ausstülpungen der Zellmembran (sog. "Membrane Blebbing") und Chromatinverdichtung
bis hin zu Zellfragmentierung charakterisiert werden. Zellen, die
eine Apoptose durchlaufen, zeigen ferner ein charakteristisches
Muster internukleosomaler DNA-Spaltung.
-
Zusätzlich den
Unterschieden bei den Rezeptortypen können unterschiedliche Formen
von costimulatorischen Molekülen
entweder aktivierend oder inhibitorisch sein. In dem Fall eines
aktivierenden Rezeptors kann ein Signal zum Beispiel durch eine
mehrwertige Form eines costimulatorischen Moleküls übertragen werden, was zu einer
Quervernetzung (sog. "Crosslinking") eines aktivierenden
Rezeptors führt,
oder ein Signal kann inhibiert werden, z.B. durch eine Form eines
costimulatorischen Moleküls,
das an einen aktivierenden Rezeptor bindet, aber kein aktivierendes
Signal überträgt, z.B.
durch das Konkurrieren mit aktivierenden Formen von costimulatorischen
Molekülen
um das Binden an den Rezeptor. (Bestimmte lösliche Formen von costimulatorischen
Molekülen
können
inhibitorisch sein, doch es gibt Beispiele, in denen ein lösliches
Molekül
stimulatorisch sein kann). Ähnlich
kann ein Signal, in Abhängigkeit
von der Form des costimulatorischen Moleküls, das an einen inhibitorischen
Rezeptor bindet, entweder übertragen
werden (z.B. durch eine mehrwertige Form eines costimulatorischen
Moleküls,
was zu einer Quervernetzung eines aktivierenden Rezeptors führt), oder ein
Signal kann inhibiert werden (z.B. durch eine Form eines costimulatorischen
Moleküls,
das an einen inhibitorischen Rezeptor bindet, aber kein inhibitorisches
Signal überträgt). Die
Auswirkungen der verschiedenen modulatorischen Agenzien können leicht
unter Verwendung von üblichen,
hierin beschriebenen Screenings gezeigt werden.
-
Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung beinhaltet der Begriff "costimulieren", wenn er im Zusammenhang
mit aktivierten Immunzellen verwendet wird, die Fähigkeit
eines "costimulatorischen
Moleküls", ein zweites, durch
einen nicht-aktivierenden Rezeptor vermitteltes Signal (ein "costimulatorisches
Signal") zu liefern, das
eine Proliferation oder eine Effektorfunktion induziert. Ein costimulatorisches
Signal kann zum Beispiel zu einer Zytokinsekretion führen, z.B.
in einer T-Zelle, die ein durch einen T-Zellrezeptor vermitteltes
Signal empfangen hat. Immunzellen, die ein durch einen Zellrezeptorvermitteltes
Signal empfangen haben, z.B. über
einen aktivierenden Rezeptor, werden hierin als "aktivierte Immunzellen" bezeichnet.
-
Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung beinhaltet der Begriff "aktivierender Rezeptor" Immunzellenrezeptoren,
die Antigene, komplexierte Antigene (z.B. in Verbindung mit MHC-Molekülen) oder
Antikörper
binden. Solche aktivierenden Rezeptoren beinhalten T-Zellrezeptoren
(TCR), B-Zellrezeptoren (BCR), Zytokinrezeptoren, LPS-Rezeptoren,
Komplementrezeptoren und Fc-Rezeptoren.
-
T-Zellrezeptoren
sind zum Beispiel auf T-Zellen vorhanden und sind mit CD3-Molekülen assoziiert. T-Zellrezeptoren
werden durch Antigen in Verbindung mit MHC-Molekülen stimuliert (sowie durch
polyklonale T-Zell-aktivierende Reagenzien). Die T-Zellaktivierung
mittels TCR führt
zu zahlreichen Veränderungen,
z.B. Proteinphosphorylierung, Veränderungen der Membranlipide,
Ionenflüsse,
Veränderungen
der cyclischen Nukleotide, Änderungen
der RNA-Transkription, Änderungen
der Proteinsynthese und Änderungen
des Zellvolumens.
-
Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff "inhibitorisches Signal" ein Signal, das über einen
inhibitorischen Rezeptor (z.B. CTLA4) an eine Immunzelle übertragen
wird. Solch ein Signal antagonisiert ein Signal über einen aktivierenden Rezeptor
(z.B. über
einen TCR, CD3, BCR oder ein Fc-Molekül) und kann z.B. zu einer Inhibition
der sekundären
Botenstoffe; einer Inhibition der Proliferation; einer Inhibition der
Effektorfunktion der Immunzelle, z.B. reduzierte Phagocytose, reduzierte
Antikörperproduktion,
reduzierte zelluläre
Zytotoxizität,
ausbleibende Produktion von Mediatoren (wie zum Beispiel Zytokine
(z.B. IL-2) und/oder Mediatoren für allergische Reaktionen) seitens
der Immunzelle; oder zu der Entstehung einer Anergie führen.
-
Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung beinhaltet der Begriff "Adjuvans" Agenzien, welche
die Immunantwort an ein Antigen verstärken (z.B. ein tumorassoziiertes
Antigen). Adjuvanzien können
zusammen mit costimulatorischen Molekülen verabreicht werden, um
die Immunantwort noch weiter zu verstärken.
-
Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung beinhaltet der Begriff "monospezifisch" Moleküle, die
nur eine Spezifität
haben, d.h. die spezifisch an ihren verwandten Liganden binden,
z.B. CD28, CTLA4 oder ICOS auf T-Zellen. Solche monospezifischen
Agenzien sind nicht so ausgeführt
worden, dass sie zusätzliche
Spezifitäten
enthalten, und binden daher nicht gezielt an andere Zelloberflächenmoleküle. Im Rahmen
der vorliegenden Erfindung beinhaltet der Begriff "oligospezifisch" Moleküle, die
mehr als eine Spezifität
haben, z.B. eine zusätzliche
Spezifität
für ein
Molekül,
die anders ist als die für
ihren verwandten Liganden, z.B. eine Spezifität für ein Zelloberflächenmolekül wie zum
Beispiel ein tumorassoziiertes Antigen oder ein T-Zellrezeptor.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung beinhaltet der Begriff "zweiwertig" oder "bivalent" lösliche costimulatorische
Moleküle,
die zwei Bindungsstellen pro Molekül zur Interaktion mit ihrem
Liganden haben. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung beinhaltet
der Begriff "dimer" Formen, die als
Homodimere vorliegen, d.h. als eine Einheit bestehend aus zwei identischen
Untereinheiten, die miteinander verbunden sind, z.B. durch Disulfidbindungen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung beinhaltet der Begriff "multimer" lösliche Formen,
die mehr als zwei Untereinheiten haben.
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In
einem anderen Ausführungsbeispiel
ist eine aktivierende Form eines GL50-Moleküls ein lösliches GL50-Molekül. Im Rahmen
der vorliegenden Erfindung beinhaltet der Begriff "löslich" Moleküle, z.B. costimulatorische
Moleküle,
die nicht zellassoziiert sind. Lösliche
costimulatorische Moleküle
behalten die Funktion der zellassoziierten Moleküle bei, von denen sie abgeleitet
sind, z.B. sind sie fähig,
an ihre verwandten Liganden auf T-Zellen zu binden und über ein
CD28- und/oder CTLA4-Molekül
auf einer T-Zelle Signaltransduktion zu vermitteln. Sie liegen jedoch
in löslicher
Form vor, d.h. sie sind nicht membrangebunden. Vorzugsweise weisen die
löslichen
Zusammensetzungen eine extrazelluläre Domäne eines costimulatorischen
Moleküls
auf.
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Vorzugsweise
weist eine solche lösliche
Form eines GL50 mindestens einen Teil der extrazellulären Domäne eines
GL50-Moleküls
auf. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung beinhaltet der Begriff "extrazelluläre Domäne eines
GL50-Moleküls" einen Teil eines
GL50-Moleküls,
der in der zellassoziierten Form des GL50-Moleküls extrazellulär ist. Vorzugsweise
ist die extrazelluläre
Domäne
die extrazelluläre
Domäne
eines humanen GL50-Moleküls.
In einem Ausführungsbeispiel
weist ein lösliches
costimulatorishes Molekül
eine extrazelluläre
Domäne
eines GL50 Moleküls
und des Weiteren eine Signalsequenz auf.
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung beinhaltet der Begriff "fehlende Reaktivität" das Nicht-Ansprechen
von Immunzellen bei Stimulation, z.B. Stimulation über einen
aktivierenden Rezeptor oder ein Zytokin. Fehlende Reaktivität kann z.B.
aufgrund von Exposition gegenüber
Immunosuppressiva oder Exposition gegenüber hohen Antigendosen auftreten.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung beinhaltet der Begriff "Anergie" oder "Toleranz" das Nicht-Ansprechen
bei aktivierender rezeptorvermittelter Stimulation. Ein solches Nicht-Ansprechen
ist im Allgemeinen antigenspezifisch und dauert fort, nachdem die
Exposition gegenüber dem
toleranzinduzierenden Antigen aufgehört hat. Eine Anergie in T-Zellen
ist zum Beispiel (im Gegensatz zu fehlender Reaktivität) durch
eine mangelnde Zytokinproduktion charakterisiert, z.B. IL-2. Eine
T-Zellanergie tritt dann auf, wenn T-Zellen gegenüber Antigen
exponiert sind und ein erstes Signal (ein T-Zellrezeptor- oder CD-3-vermitteltes
Signal) in Abwesenheit eines zweiten Signals (ein costimulatorisches
Signal) empfangen. Unter diesen Bedingungen führt die erneute Exposition
der Zellen gegenüber
dem selben Antigen (selbst wenn die erneute Exposition in Anwesenheit
eines costimulatorischen Moleküls
stattfindet) zu einer Störung
der Zytokinproduktion und damit zu einer Störung der Proliferation.
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Anerge
T-Zellen können
jedoch Antworten auf nicht-verwandte Antigene aufbauen, und sie
können proliferieren,
wenn sie mit Zytokinen kultiviert wurden (z.B. IL-2). T-Zell-Anergie
kann zum Beispiel auch bei einem Mangel an IL-2 Produktion durch
T-Lymphozyten beobachtet werden, wie es durch ELISA oder durch einen
Proliferationsassay unter Verwendung einer Indikatorzelllinie gemessen
wurde. Alternativ kann ein Reportergenkonstrukt verwendet werden.
Zum Beispiel initiieren anerge T-Zellen nicht die IL-2 Gentranskription, die
durch einen heterologen Promotor unter der Kontrolle des 5'-IL-2 Gen-Enhancers
oder durch ein Multimer der AP1-Sequenz, die im Enhancer gefunden
werden kann, induziert wird (Kang et al. (1992) Science 257:1134).
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Die
GL50-Polypeptide und GL50-Nukleinsäuremoleküle umfassen eine Familie von
Molekülen
mit bestimmten konservierten strukturellen und funktionellen Eigenschaften.
Wenn der Begriff "Familie" sich auf die erfindungsgemäßen Protein-
und Nukleinsäuremoleküle bezieht,
sind damit zwei oder mehr Proteine oder Nukleinsäuremoleküle gemeint, die eine gemeinsame
strukturelle Domäne
oder ein gemeinsames Motiv haben und eine ausreichende Aminosäuren- oder
Nukleotidsequenzhomologie wie hierin definiert aufweisen. Solche Familienmitglieder
können
natürlich
oder nicht natürlich
vorkommen und können
entweder von derselben Spezies oder von unterschiedlichen Spezies
sein. Eine Familie kann zum Beispiel ein erstes Protein von humaner Herkunft
sowie weitere, andere Proteine von humaner Herkunft enthalten. Alternativ
kann sie Homologa von nicht humaner Herkunft enthalten. Mitglieder
einer Familie können
ferner gemeinsame funktionelle Eigenschaften haben. Die hierin beschriebenen
GL50-Moleküle
sind Mitglieder von einer größeren Familie
von Molekülen,
die B7-Familie von costimulatorischen Molekülen. Im Rahmen der vorliegenden
Erfindung beinhaltet der Begriff "B7-Familie" oder "B7-Moleküle" costimulatorische Moleküle mit Sequenzhomologie
zu B7-Polypeptiden, z.B. B7-1, B7-2, B7-3 (vom Antikörper BB-1
erkannt), und/oder GL50. Wie in der vorstehenden Tabelle 1 gezeigt,
haben zum Beispiel humanes B7-1 und humanes B7-2 ca. 20% Aminosäurensequenzidentität. Außerdem haben
die Moleküle
der B7 Familie eine Funktion gemein, z.B. die Fähigkeit, an einen Liganden
der B7-Familie (z.B. einen oder mehrere von CD28, CTLA4 oder ICOS)
und/oder an ihre Liganden auf Immunzellen zu binden, und sie haben
die Fähigkeit,
die Costimulation von Immunzellen zu inhibieren oder zu induzieren.
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung beinhaltet der Begriff "Aktivität" mit Bezug auf ein
GL50 Polypeptid Aktivitäten,
die der Struktur eines GL50-Polypeptids inhärent sind. Der Begriff "Aktivität" beinhaltet die Fähigkeit,
ein costimulatorisches Signal in aktivierten T-Zellen zu modulieren
und die Proliferation und/oder die Zytokinsekretion zu induzieren.
Außerdem
beinhaltet der Begriff "Aktivität" die Fähigkeit
eines GL50-Polypeptids, an seinen natürlichen Liganden oder Bindungspartner
zu binden. Vorzugsweise ist der Ligand, an den ein GL50-Polypeptid
bindet, ein ICOS-Molekül.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung übertragen "aktivierende Formen" von costimulatorischen Molekülen ein
Signal über
einen costimulatorischen Rezeptor (z.B. ein Signal, das eine Immunzelle
aktiviert, wenn der Rezeptor ein costimulatorischer Rezeptor ist,
der ein costimulatorisches Signal überträgt (z.B. CD28 oder ICOS) oder
ein inhibitorisches Signal, wenn der Rezeptor ein Rezeptor ist,
der ein negatives Signal an eine Immunzelle überträgt (z.B. CTLA4). Inhibitorische
Formen eines costimulatorischen Moleküls unterbinden die Übertragung
eines Signals an eine Immunzelle (z.B. entweder ein costimulatorisches
Signal oder ein negatives Signal).
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung beinhaltet der Begriff "Tumor" sowohl benigne als
auch maligne (karzinomatöse)
Neoplasien (z.B. Karzinome, Sarkome, Leukämien und Lymphome). Der Begriff "Krebs" beinhaltet primäre maligne
Tumore (z.B. jene, deren Zellen vom Sitz des ursprünglichen
Tumors nicht an andere Stellen im Körper des Individuums gewandert
sind) und sekundäre
maligne Tumore (z.B. jene, die durch Metastasen und die Abwanderung
von Tumorzellen an sekundäre
Stellen, die nicht der Sitz des ursprünglichen Tumors sind, entstehen).
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnet ein "natürlich vorkommendes" Nukleinsäuremolekül ein RNA-
oder DNA-Molekül
mit einer Nukleotidsequenz, die in der Natur vorkommt (z.B. ein
natürliches Protein
codiert).
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung umfasst ein "Antisense-"Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz, die
zu einem "Sense-"Nukleinsäuremolekül komplementär ist, das
ein Protein codiert, z.B. komplementär zu dem Masterstrang eines
doppelsträngigen
cDNA-Moleküls,
komplementär
zu einer mRNA-Sequenz oder komplementär zu dem Masterstrang eines
Gens. Folglich kann ein Antisense-Nukleinsäuremolekül über eine Wasserstoffbrücke an ein
Sense-Nukleinsäuremolekül binden.
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff "codierende Region" Regionen einer Nukleotidsequenz,
die Codons umfassen, die in Aminosäurereste translatiert werden,
während
der Begriff "nicht-codierende
Region" Regionen
einer Nukleotidsequenz bezeichnet, die nicht in Aminosäurereste
translatiert werden (z.B. 5'-
und 3'-untranslatierte
Regionen).
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff "Vektor" ein Nukleinsäuremolekül, das eine
andere Nukleinsäure
tragen kann, an die es gebunden ist. Ein Vektortyp ist ein „Plasmid", was eine zirkuläre doppelsträngige DNA-Schleife
bezeichnet, in die zusätzliche
DNA-Segmente ligiert werden können.
Ein weiterer Vektortyp ist ein viraler Vektor, wobei zusätzliche
DNA-Segmente in das virale Genom ligiert werden können. Bestimmte
Vektoren können
in einer Wirtszelle, in die sie eingebracht worden sind, autonom
replizieren (z.B. Bakterienvektoren mit bakteriellem Replikationsursprung
und episomale Säugetiervektoren).
Andere Vektoren (z.B. nicht-episomale
Säugetiervektoren)
werden beim Einbringen in die Wirtszelle in das Genom einer Wirtszelle
integriert und dadurch zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert. Zudem
können
bestimmte Vektoren die Expression von Genen, mit denen sie funktionell
verbunden sind, steuern. Diese Vektoren werden hierin als „rekombinante
Expressionsvektoren" oder
einfach "Expressionsvektoren" bezeichnet. Im Allgemeinen
haben Expressionsvektoren, die für
DNA-Rekombinationstechniken geeignet sind, oft die Form von Plasmiden.
In der vorliegenden Beschreibung können "Plasmid" und "Vektor" austauschbar verwendet werden, da das
Plasmid die am häufigsten
verwendete Vektorform ist. Die Erfindung soll jedoch diese anderen
Formen von Expressionsvektoren, wie zum Beispiel virale Vektoren
(z.B. replikationsdefiziente Retroviren, Adenoviren und adenoassoziierte
Viren), die ähnliche
Funktionen ausüben,
beinhalten.
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff "Wirtszelle" eine Zelle, in die
eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, wie
zum Beispiel ein erfindungsgemäßer rekombinanter
Expressionsvektor, eingebracht worden ist. Die Begriffe "Wirtszellen" und "rekombinante Wirtszelle" werden hierin untereinander
austauschbar verwendet. Selbstverständlich betreffen diese Begriffe
nicht nur die jeweilige Zielzelle, sondern auch die Nachkommen oder
potenziellen Nachkommen dieser Zelle. Da in aufeinanderfolgenden
Generationen aufgrund von Mutation oder Umwelteinflüssen bestimmte
Modifikationen auftreten können,
sind diese Nachkommen nicht unbedingt mit der Parentalzelle identisch,
sind jedoch immer im Umfang des Begriffs, wie hierin verwendet,
enthalten.
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff "transgenes Tier" ein nichthumanes Tier,
vorzugsweise ein Säugetier,
bevorzugter eine Maus, in dem eine oder mehrere der Zellen des Tiers
ein "Transgen" enthalten. Der Begriff "Transgen" bezeichnet exogene
DNA, die in das Genom einer Zelle integriert ist, aus der sich ein
transgenes Tier entwickelt, und die in dem Genom des vollentwickelten
Tiers bleibt, zum Beispiel zur Regulation der Expression eines codierten
Genprodukts in einem oder mehreren Zelltypen oder Geweben des transgenen
Tiers.
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnet ein "homologes rekombinantes
Tier" eine Art von transgenem
nichthumanem Tier, vorzugsweise ein Säugetier, bevorzugter eine Maus,
in dem ein endogenes Gen durch eine homologe Rekombination zwischen
dem endogenen Gen und einem in eine Zelle des Tiers eingebrachten
exogenen DNA-Molekül
verändert
wird, z.B. eine Embryozelle des Tiers, vor der Entwicklung des Tiers.
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnet ein "isoliertes Protein" ein Protein, das
im Wesentlichen frei von anderen Proteinen, zellulärem Material
und Kulturmedium ist, wenn es von Zellen isoliert oder durch DNA-Rekombinationstechniken
produziert wird, oder frei von chemischen Vorstufen oder sonstigen Chemikalien
ist, wenn es chemisch synthetisiert wird.
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Der
Begriff "Antikörper" beinhaltet ferner
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung einen "antigenbindenden Teil" eines Antikörpers (oder
einfach "Antikörperteil"). Der Begriff "antigenbindender
Teil" bezeichnet im
Rahmen der vorliegenden Erfindung ein oder mehrere Fragmente eines
Antikörpers,
welche die Fähigkeit beibehalten,
spezifisch an ein Antigen zu binden (z.B. GL50). Es konnte gezeigt
werden, dass die antigenbindende Funktion eines Antikörpers durch
Fragmente eines Antikörpers
voller Länge
ausgeführt
werden kann. Beispiele für
bindende Fragmente, die von dem Begriff "antigenbindender Teil" eines Antikörpers erfasst
werden, beinhalten (i) ein Fab-Fragment, ein einwertiges Fragment
bestehend aus den VL-, VH-, CL- und CH1-Domänen; (ii) ein F(ab')2-Fragment,
ein zweiwertiges Fragment umfassend zwei Fab-Fragmente, die durch
eine Disulfidbrücke
in der Scharnierregion verbunden sind; (iii) ein Fd-Fragment bestehend
aus den VH- und CH1-Domänen; (iv)
ein Fv-Fragment bestehend aus den VL- und VH-Domänen eines einzigen Arms eines
Antikörpers;
(v) ein dAb-Fragment (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), das
aus einer VH-Domäne
besteht; und (vi) eine isolierte komplementaritätsbestimmende Region (engl.
Abk.: CDR). Des Weiteren können
die zwei Domänen
des Fv-Fragments VL und VH, obwohl sie von separaten Gene codiert
werden, unter Verwendung von rekombinanten Verfahren durch einen
synthetischen Linker verbunden werden, der ihnen ermöglicht, als
eine einzige Proteinkette gemacht zu sein, in der die VL- und VH-Regionen
sich paaren, um einwertige Moleküle
zu bilden (bekannt als Fv-Einzelkette (scFv); siehe z.B. Bird et
al. (1988) Science 242:423-426; und Huston et al. (1988) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 85:5879-5883; und Osbourn et al. 1998, Nature Biotechnology 16:778).
Solche Einzelkettenantikörper
sollen ebenfalls von dem Begriff "antigenbindender Teil" eines Antikörpers erfasst
werden. Jegliche VH- und VL-Sequenzen aus spezifischer Fv-Einzelkette
können
mit einer konstanten Region von Human-Immunglobulin-cDNA oder genomischen
Sequenzen verbunden werden, um Expressionsvektoren zu erzeugen,
die komplette IgG-Moleküle
oder sonstige Isotypen codieren. Ferner können VH und V1 für die Erzeugung
von Feb, Fv oder anderen Fragmenten von Immunglobulinen unter Verwendung von
Proteinchemie oder DNA-Rekombinationstechnologie verwendet werden.
Andere Formen von Einzelkettenantikörpern, wie zum Beispiel Diabodies,
sind ebenfalls erfasst. Diabodies sind zweiwertige, bispezifische Antikörper, in
denen VH- und VL-Domänen
auf einer einzigen Polypeptidkette exprimiert sind, die jedoch einen Linker
verwenden, der zu kurz ist, um eine Paarung zwischen den beiden
Domänen
auf derselben Kette zu erlauben, und dadurch die Domänen zwingt,
sich mit komplementären
Domänen
einer anderen Kette zu paaren und zwei antigenbindende Stellen herzustellen
(siehe z.B. Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
90:6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123).
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Des
Weiteren kann ein Antikörper
oder ein antigenbindender Teil davon Bestandteil eines größeren Immun-Adhäsionsmoleküls sein,
das durch kovalente oder nichtkovalente Assoziation des Antikörpers oder des
Antikörperteils
mit einem oder mehreren anderen Proteinen oder Peptiden gebildet
wird. Beispiele für
solche Immun-Adhäsionsmoleküle beinhalten
die Verwendung der Kernregion von Streptavidin, um ein tetrameres
scFv-Molekül
herzustellen (Kipriyanov, S.M., et al. (1995) Human Antibodies and
Hybridomas 6:93-101), und die Verwendung eines Cysteinrests, eines
Markerpeptids und einer C-terminalen Polyhistidinmarkierung, um
zweiwertige und biotinylierte scFv-Moleküle herzustellen (Kipriyanov,
S.M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). Antikörperteile,
wie zum Beispiel Fab- und F(ab')2-Fragmente, können aus ganzen Antikörpern hergestellt
werden, indem man herkömmliche
Techniken anwendet, wie zum Beispiel Papain- bzw. Pepsindigestion
von ganzen Antikörpern.
Des Weiteren kann man Antikörper,
Antikörperteile
und Immun-Adhäsionsmoleküle unter
Verwendung von gewöhnlichen,
hierin beschriebenen DNA-Rekombinationstechniken
erhalten.
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Antikörper können polyklonal
oder monoklonal; xenogen, allogen oder syngen; oder modifizierte
Formen davon sein, z.B. humanisiert, chimär, etc. Vorzugsweise binden
erfindungsgemäße Antikörper spezifisch oder
im Wesentlichen spezifisch an GL50-Moleküle. Die Begriffe "monoklonale Antikörper " und "monoklonale Antikörperzusammensetzung" bezeichnen in der
vorliegenden Patentschrift eine Population von Antikörpermolekülen, die
nur eine Spezies einer antigenbindenden Stelle enthält, die
zu einer Immunreaktion mit einem bestimmten Epitop eines Antigens
fähig ist,
während
der Begriff "polyklonale
Antikörper" und "polyklonale Antikörperzusammensetzung" eine Population
von Antikörpermolekülen bezeichnet,
die mehrere Spezies von antigenbindenden Stellen enthält, die
dazu fähig
sind, mit einem bestimmten Antigen zu interagieren. Eine monoklonale
Antikörperzusammensetzung
zeigt typischerweise eine einzige Bindungsaffinität für ein bestimmtes Antigen,
mit dem zusammen es zu einer Immunreaktion fähig ist.
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Der
Begriff "humanisierter
Antikörper" soll in der vorliegenden
Patentschrift Antikörper
beinhalten, welche aus einer nichthumanen Zelle hergestellt sind,
die variable und konstante Regionen hat, die verändert worden sind, um Antikörpern ähnlicher
zu sein, die aus einer humanen Zelle hergestellt sind. Zum Beispiel
durch das Verändern
der Aminosäuresequenz
eines nichthumanen Antikörpers
und das Einbringen von Aminosäuren,
die in humanen Keimbahn-Immunglobulinsequenzen
zu finden sind. Die erfindungsgemäßen humanisierten Antikörper können Aminosäurereste
enthalten, die nicht von humanen Keimbahn-Immunglobulinsequenzen
codiert sind (z.B. Mutationen, die mittels zufallsbedingter oder
ortsspezifischer Mutagenese in vitro oder durch somatische Mutation
in vivo eingebracht wurden), zum Beispiel in die komplementaritätsbestimmenden Regionen.
Der Begriff "humanisierte
Antikörper" beinhaltet im Rahmen
der vorliegenden Erfindung auch Antikörper, in denen CDR-Sequenzen,
die von der Keimbahn einer anderen Säugetierspezies, wie zum Beispiel eine
Maus, abgeleitet sind, auf humane Rahmensequenzen verpflanzt worden
sind.
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Ein "isolierter Antikörper" soll im Rahmen der
vorliegenden Erfindung einen Antikörper bezeichnen, der im Wesentlichen
frei von anderen Antikörpern
ist, die andersartige antigene Spezifitäten haben (z.B. ist ein isolierter
Antikörper,
der spezifisch GL50 bindet, im Wesentlichen frei von Antikörpern, die
spezifisch andere Antigene als GL50 binden). Außerdem kann ein isolierter
Antikörper
im Wesentlichen frei von anderem zellulärem Material und/oder Chemikalien
sein.
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung ist ein "Bindungspartner" ein Zielmolekül oder ein Molekül, mit dem
ein GL50-Polypeptid in der Natur bindet oder interagiert (z.B. ein
Ligand oder ein intrazelluläres
Interaktionsmolekül
(wie zum Beispiel ein Molekül,
das entweder stromaufwärts
oder stromabwärts
von GL50 in einem Signaltransduktionsweg agiert)), so dass man eine
GL50-Aktivität
erhält.
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Der
Begriff "Signaltransduktion" soll die Verarbeitung
von physikalischen oder chemischen Signalen von der extrazellulären Umgebung
durch die Zellmembran und in die Zelle beinhalten und kann durch
einen oder mehrere verschiedene Mechanismen auftreten, wie zum Beispiel
Aktivierung/Inaktivierung von Enzymen (wie zum Beispiel Proteasen
oder sonstige Enzyme, welche die Phosphorylierungsmuster verändern können, oder
sonstige posttranslationale Modifikationen), Aktivierung von Ionenkanälen oder
intrazellulären
Ionenspeichern, Aktivierung von Effektorenzymen durch guaninnukleotidbindende
Protein-Zwischenprodukte, Bildung von Inositolphosphat, Aktivierung
oder Inaktivierung von Adenylylcyclase, direkte Aktivierung (oder
Inhibition) eines Transkriptionsfaktors und/oder Aktivierung. Ein "Signalweg" bezeichnet die Komponenten,
die in die "Signaltransduktion" eines bestimmten
Signals in eine Zelle involviert sind.
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Zwischen
den Aminosäuresequenzen
eines bestimmten Proteins und den Nukleotidsequenzen, die für dieses
Protein codieren können,
wie es durch den genetischen Code (siehe unten) definiert ist, besteht
eine bekannte und eindeutige Übereinstimmung.
Ebenso besteht eine bekannte und eindeutige Übereinstimmung zwischen den
Nukleotidsequenzen eines bestimmten Nukleinsäuremoleküls und der Aminosäuresequenz,
die von diesem Nukleinsäuremolekül codiert
wird, wie es durch den genetischen Code definiert ist.
| GENETISCHER
CODE | |
| Alanin
(Ala, A) | GCA,
GCC, GCG, GCT |
| Arginin
(Arg, R) | AGA,
ACG, CGA, CGC, CGG, CGT |
| Asparagin
(Asn, N) | AAC,
AAT |
| Asparaginsäure (Asp,
D) | GAC,
GAT |
| Cystein
(Cys, C) | TGC,
TGT |
| Glutaminsäure (Glu,
E) | GAA,
GAG |
| Glutamin
(Gln, Q) | CAA,
CAG |
| Glycin
(Gly, G) | GGA,
GGC, GGG, GGT |
| Histidin
(His, H) | CAC,
CAT |
| Isoleucin
(Ile, I) | ATA,
ATC, ATT |
| Leucin
(Leu, L) | CTA,
CTC, CTG, CTT, TTA, TTG |
| Lysin
(Lys, K) | AAA,
AAG |
| Methionin
(Met, M) | ATG |
| Phenylalanin
(Phe, F) | TTC,
TTT |
| Prolin
(Pro, P) | CCA,
CCC, CCG, CCT |
| Serin
(Ser, S) | AGC,
AGT, TCA, TCC, TCG, TCT |
| Threonin
(Thr, T) | ACA,
ACC, ACG, ACT |
| Tryptophan
(Trp, W) | TGG |
| Tyrosin
(Tyr, Y) | TAC,
TAT |
| Valin
(Val, V) | GTA,
GTC, GTG, GTT |
| Endsignal
(Stopp-Codon) | TAA,
TAG, TGA |
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Eine
wichtige und wohl bekannte Eigenschaft des genetischen Codes ist
seine Redundanz, wodurch für
die meisten der Aminosäuren,
die gewöhnlich
Proteine herstellen, mehr als ein codierendes Nukleotidtriplett
verwendet werden kann (siebe obige Darstellung). Daher kann eine
Reihe verschiedener Nukleotidsequenzen für eine bestimmte Aminosäuresequenz
codieren. Solche Nukleotidsequenzen werden als funktionell äquivalent
betrachtet, da sie zur Produktion derselben Aminosäuresequenz
in allen Organismen führen
(obwohl bestimmte Organismen manche Sequenzen möglicherweise effizienter translatieren
als andere). Des Weiteren kann gelegentlich eine methylierte Variante
eines Purins oder Pyrimidins in einer bestimmten Nukleotidsequenz
gefunden werden. Solche Methylierungen beeinträchtigen die Codierungsbeziehung
zwischen dem Trinukleotid-Codon und der entsprechenden Aminosäure nicht.
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In
Anbetracht der vorangehenden Ausführungen kann die Nukleotidsequenz
eines DNA- oder RNA-Moleküls,
die ein erfindungsgemäßes GL50-Polypeptid
(oder einen beliebigen Teil davon) codiert, verwendet werden, um
die GL50-Aminosäuresequenz
abzuleiten, wobei der genetische Code verwendet wird, um das DNA-
oder RNA-Molekül
in eine Aminosäuresequenz
zu translatieren. Ebenso können
im Fall einer beliebigen GL50-Aminosäuresequenz entsprechende Nukleotidsequenzen,
die ein GL50-Polypeptid codieren können, von dem genetischen Code
abgeleitet werden (der aufgrund seiner Redundanz mehrere Nukleinsäuresequenzen
für eine
bestimmte Aminosäuresequenz
herstellen wird). Die hierin enthaltene Beschreibung und/oder Offenbarung
einer GL50-Nukleotidsequenz ist also so zu interpretieren, dass
sie gleichfalls die Beschreibung und/oder Offenbarung der von der
Nukleotidsequenz codierten Aminosäuresequenz enthält. Ebenso
ist die hierin enthaltene Beschreibung und/oder Offenbarung einer
GL50-Aminosäuresequenz
so zu interpretieren, dass sie gleichfalls die Beschreibung und/oder
Offenbarung von allen möglichen
Nukleotidsequenzen enthält,
welche die Aminosäuresequenz
codieren können.
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II. Isolierte Nukleinsäuremoleküle
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Ein
Aspekt der Erfindung betrifft isolierte Nukleinsäuremoleküle, die GL50-Polypeptide oder
biologisch aktive Teile davon codieren, sowie Nukleinsäurefragmente,
die für
die Verwendung als Hybridisierungssonden zum Identifizieren von
GL50-codierenden Nukleinsäuremolekülen ausreichen
(z.B. GL50-mRNA), und Fragmente zur Verwendung als PCR-Primer für die Amplifikation
oder Mutation von GL50-Nukleinsäuremolekülen. Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung soll der Begriff "Nukleinsäuremolekül" DNA-Moleküle (z.B.
cDNA oder genomische DNA) und RNA-Moleküle (z.B. mRNA) und Analoga
der unter Verwendung von Nukleotidanaloga erzeugten DNA oder RNA
beinhalten. Das Nukleinsäuremolekül kann einsträngig oder
doppelsträngig
sein, doch vorzugsweise ist es eine doppelsträngige DNA.
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Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül ist von
anderen Nukleinsäuremolekülen, die
in der natürlichen Quelle
der Nukleinsäure
zugegen sind, getrennt. In Bezug auf genomische DNA beinhaltet der
Begriff "isoliert" zum Beispiel Nukleinsäuremoleküle, die
von dem Chromosom getrennt sind, mit dem die genomische DNA natürlich assoziiert
ist. Vorzugsweise ist ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül frei von
Sequenzen, welche die Nukleinsäure
in der genomischen DNA des Organismus, von dem die Nukleinsäuremoleküle abgeleitet
sind, natürlich
flankieren (d.h. Sequenzen, die sich an den 5'- und 3'-Enden der Nukleinsäure befinden). Zum Beispiel
kann das isolierte GL50-Nukleinsäuremolekül in verschiedenen
Ausführungsformen
weniger als etwa 5kb, 4kb, 3kb, 2kb, 1kb, 0,5kb oder 0,1kb Nukleotidsequenzen
enthalten, die das Nukleinsäuremolekül in genomischer
DNA der Zelle, von der die Nukleinsäure abgeleitet ist, natürlich flankieren.
Des Weiteren kann ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül, wie zum
Beispiel ein cDNA-Molekül,
im Wesentlichen frei von sonstigem zellulärem Material oder Kulturmedium
sein, wenn es durch Rekombinationstechniken hergestellt worden ist,
oder im Wesentlichen frei von chemischen Vorstufen oder sonstigen
Chemikalien sein, wenn es chemisch synthetisiert worden ist. Ein "isoliertes" GL50-Nukleinsäuremolekül kann jedoch
mit anderen Nukleotidsequenzen verbunden sein, welche die GL50 Sequenzen
in genomischer DNA normalerweise nicht flankieren (z.B. können die
GL50-Nukleotidsequenzen mit Vektorsequenzen verbunden sein). In
bestimmten bevorzugten Ausführungsbeispielen
kann ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül, wie zum
Beispiel ein cDNA-Molekül,
auch frei von sonstigem zellulärem
Material sein. Für
das GL50-Nukleinsäuremolekül ist es
jedoch erforderlich, dass es frei von sonstigem zellulärem Material
ist, um als "isoliert" betrachtet zu werden
(z.B. würde
ein GL50-DNA-Molekül,
das von anderer Säugetier-DNA
getrennt und in eine Bakterienzelle eingebracht wird, immer noch
als "isoliert" betrachtet werden).
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Ein
erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül, z.B.
ein Nukleinsäuremolekül mit der
Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1, 3 oder 5 oder einem Teil davon,
kann unter Verwendung von gewöhnlichen
molekularbiologischen Verfahren und den hierin dargelegten Sequenzinformationen
isoliert werden. Zum Beispiel können GL50-Nukleinsäuremoleküle unter
Verwendung der gesamten Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1, 3 oder
5 bzw. einem Teil davon als Hybridisierungssonde mittels gewöhnlicher
Hybridisierungs- und Klonierungstechniken isoliert werden (z.B.
wie in Sambrook, J. et al. Molecular Cloning: A Laborstory Manual.
2. Auflage, Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor Laborstory
Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben).
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Des
Weiteren kann ein Nukleinsäuremolekül, das die
gesamte SEQ ID Nr. 1, 3 oder 5 bzw. einen Teil davon umfasst, durch
die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von synthetischen
Oligonukleotidprimern isoliert werden, die auf der Basis der Sequenz
von SEQ ID Nr. 1, 3 bzw. 5 entwickelt wurden.
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Eine
erfindungsgemäße Nukleinsäure kann
unter Verwendung von cDNA, mRNA oder alternativ genomischer DNA
als Matrize und geeigneten Oligonukleotidprimern gemäß gewöhnlichen
PCR-Amplifikationsverfahren amplifiziert werden. Die auf diese Weise
amplifizierte Nukleinsäure
kann in einen geeigneten Vektor kloniert und durch DNA-Sequenzanalysen
charakterisiert werden. Des Weiteren können mittels gewöhnlicher Syntheseverfahren,
z.B. unter Verwendung eines DNA-Syntheseautomaten,
Oligonukleotide hergestellt werden, die GL50-Nukleotidsequenzen
entsprechen.
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In
einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
umfasst ein erfindungsgemäßes isoliertes
Nukleinsäuremolekül die in
SEQ ID Nr. 1, 3 oder 5 gezeigte Nukleotidsequenz.
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In
einem Ausführungsbeispiel
umfasst ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül ein Nukleinsäuremolekül, das ein
Komplement der in SEQ ID Nr. 1, 3 oder 5 gezeigten Nukleotidsequenz
oder ein Teil von einer dieser Nukleotidsequenzen ist. Ein zu der
in SEQ ID Nr. 1, 3 oder 5 gezeigten Nukleotidsequenz komplementäres Nukleinsäuremolekül ist eines,
das ausreichend komplementär
zu der in SEQ ID Nr. 1, 3 bzw. 5 gezeigten Nukleotidsequenz ist,
so dass es mit der in SEQ ID Nr. 1, 3 bzw. 5 gezeigten Nukleotidsequenz
hybridisieren kann und dabei ein stabiles Duplex bildet.
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In
noch einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel umfasst ein
erfindungsgemäßes isoliertes Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz,
die mindestens zu ca. 95%, 98% oder mehr zu der in SEQ ID Nr. 5
gezeigten Nukleotidsequenz (z.B. zu der gesamten Länge der
Nukleotidsequenz) oder einem Teil von einer dieser Nukleotidsequenzen
homolog ist.
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Des
Weiteren kann ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül nur einen
Teil der Nukleinsäuresequenz
von SEQ ID Nr. 1, 3 oder 5 aufweisen, zum Beispiel ein Fragment,
das als Sonde oder Primer verwendet werden kann, oder ein Fragment,
das einen biologisch aktiven Teil eines GL50-Polypeptids codiert.
Die durch die Klonierung der GL50-Gene ermittelte Nukleotidsequenz ermöglicht die
Herstellung von Sonden und Primern, die für die Verwendung zur Identifizierung
und/oder zur Klovierung anderer GL50-Familienmitglieder sowie Homologa
der GL50-Famile von anderen Species ausgeführt sind. Die Sonde bzw. der
Primer umfasst typischerweise ein im Wesentlichen gereinigtes Oligonukleotid.
In einem Ausführungsbeispiel
umfasst das Oligonukleotid eine Region der Nukleotidsequenz, die
unter stringenten Bedingungen mit mindestens etwa 12 oder 15, vorzugsweise
etwa 20 oder 25, bevorzugter etwa 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65,
75 oder 100 aufeinanderfolgenden Nukleotiden einer Sense-Sequenz
von SEQ ID Nr. 1, 3 oder 5 oder von einer natürlich vorkommenden Allelvariante
oder einem Mutanten von SEQ ID Nr. 1, 3 oder 5 hybridisiert. In
einem anderen Ausführungsbeispiel
umfasst ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz
mit einer Länge
von mindestens etwa 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800,
900, 1000 oder 1100 Nukleotiden und hybridisiert unter stringenten
Hybridisierungsbedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül von SEQ ID Nr. 1, 3 oder
5.
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In
einem anderen Ausführungsbeispiel
umfasst ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül mindestens
etwa 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 oder 1100
benachbarte Nukleotide von SEQ ID Nr. 1, 3 oder 5.
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In
einem Ausführungsbeispiel
enthält
ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül, z.B.
zur Verwendung als Sonde, nicht den Teil von SEQ ID Nr. 1 von etwa
den Nukleotiden 1-370 von SEQ ID Nr. 5.
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Vorzugsweise
umfasst ein erfindungsgemäßes isoliertes
Nukleinsäuremolekül mindestens
einen Teil der codierenden Region von SEQ ID Nr. 1 (Nukleotide 67-1032)
oder SEQ ID Nr. 3 (Nukleotide 1-1041) oder SEQ ID Nr. 5 (Nukleotide
24-950). In einem anderen Ausführungsbeispiel
umfasst ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül die gesamte
codierende Region von SEQ ID Nr. 1, 3 oder 5.
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In
anderen Ausführungsbeispielen
hat ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül mindestens
70% Identität,
bevorzugter 80% Identität,
und noch bevorzugter 90% Identität
mit einem Nukleinsäuremolekül umfassend:
mindestens etwa 300, 400, 500, 600, 700, 800 oder etwa 900 Nukleotide
von SEQ ID Nr. 1, 3 oder 5, oder mindestens etwa 1000 oder 1100
benachbarte Nukleotide von SEQ ID Nr. 1 oder 3.
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Sonden,
die auf den GL50-Nukleotidsequenzen basieren, können verwendet werden, um Transkripte oder
genomische Sequenzen zu detektieren, welche dieselben oder homologe
Proteine codieren. In bevorzugten Ausführungsbeispielen umfasst die
Sonde ferner eine ihr zugeordnete Markierungsgruppe, z.B. kann die Markierungsgruppe
ein Radioisotop, eine fluoreszierende Verbindung, ein Enzym oder
ein Enzym-Kofaktor sein. Solche Sonden können als Teil eines diagnostischen
Testkits zur Identifizierung von Zellen oder Geweben verwendet werden,
die ein GL50-Polypeptid missexprimieren, wie zum Beispiel durch
Messen einer Menge einer GL50-codierenden Nukleinsäure in einer
Zellenprobe von einem Individuum, z.B. Ermitteln der GL50-mRNA-Spiegel oder
durch Bestimmen, ob ein genomisches GL50-Gen mutiert oder deletiert
ist.
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Ein
Nukleinsäurefragment,
das einen "biologisch
aktiven Teil eines GL50-Polypeptids" codiert, kann hergestellt werden, indem
man einen Teil der Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1, 3 oder 5,
die ein Polypeptid mit einer biologischen GL50-Aktivität codiert
(die biologischen Aktivitäten
der GL50-Polypeptide sind hierin beschrieben), isoliert, den codierten
Teil des GL50-Polypeptids exprimiert (z.B. durch eine rekombinante
Expression in vitro) und die Aktivität des codierten Teils des GL50-Polypeptids
feststellt.
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Nukleinsäuremoleküle, die
sich aufgrund von Degeneration des genetischen Codes von SEQ ID
Nr. 1, 3 oder 5 unterscheiden und dadurch dasselbe GL50-Mitgliedsprotein
codieren wie jenes, das von SEQ ID Nr. 1, 3 oder 5 codiert wird,
sind von der Erfindung erfasst. Folglich hat in einem anderen Ausführungsbeispiel
ein erfindungsgemäßes isoliertes
Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz,
die ein Protein mit einer in SEQ ID Nr. 4 oder 6 gezeigten Aminosäuresequenz
codiert. In einem anderen Ausführungsbeispiel
hat ein erfindungsgemäßes isoliertes
Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz,
die ein GL50-Polypeptid isoliert.
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Neben
den in SEQ ID Nr. 1, 3 oder 5 gezeigten GL50-Nukleotidsequenzen
wird der Fachmann erkennen, dass innerhalb einer Population (z.B.
innerhalb der humanen Population) DNA-Sequenzpolymorphismus existiert,
der zu Veränderungen
in den Aminosäuresequenzen
der GL50-Polypeptide führt.
Ein derartiger genetischer Polymorphismus in den GL50-Genen kann
aufgrund einer natürlichen
Allelvariation unter Individuen innerhalb einer Population auftreten.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnen die Begriffe "Gen" und "rekombinantes Gen" Nukleinsäuremoleküle, die
einen offenen Leserahmen enthalten, der ein GL50-Polypeptid codiert,
vorzugsweise ein GL50-Polypeptid vom Säuger, und kann ferner nicht-codierende
regulatorische Sequenzen und Introne enthalten. Solche natürlichen
Allelvariationen umfassen sowohl funktionelle als auch nicht-funktionelle
GL50-Polypeptide und können
typischerweise zu einer Divergenz von 1-5% in der Nukleotidsequenz
eines GL50-Gens führen.
Alle derartigen Nukleotidvariationen und resultierenden Aminosäurepolymorphismen
in GL50-Genen, die das Ergebnis von natürlicher Allelvariation sind
und die funktionelle Aktivität
eines GL50-Polypeptids nicht verändern,
sollen in den Schutzumfang der Erfindung fallen.
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Außerdem sollen
Nukleinsäuremoleküle, die
andere Mitglieder der GL50-Familie codieren, und die daher eine
Nukleotidsequenz haben, die sich von den Sequenzen der GL50-Familie
von SEQ ID Nr. 1, 3 oder 5 unterscheidet, in den Schutzumfang der
Erfindung fallen. Zum Beispiel kann ein anderes mGL50-1 auf der
Basis der Nukleotidsequenz von hGL50 identifiziert werden. Außerdem sollen
Nukleinsäuremoleküle, die GL50-Polypeptide
von anderen Spezies codieren, und die daher eine Nukleotidsequenz
haben, die sich von den GL50-Sequenzen von SEQ ID Nr. 1, 3 oder
5 unterscheidet, in den Schutzumfang der Erfindung fallen. Zum Beispiel
kann ein mGL50-1-Ortholog auf der Basis der murinen Nukleotidsequenz
identifiziert werden.
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Nukleinsäuremoleküle, die
natürlichen
Allelvarianten und Homologa der erfindungsgemäßen GL50-Moleküle entsprechen,
können
isoliert werden, z.B. basierend auf ihrer Homologie zu den hierin
offenbarten GL50-Nukleinsäuren
unter Verwendung der hierin offenbarten cDNAs oder Teilen davon
als Hybridisierungssonden gemäß gewöhnlichen
Hybridisierungsverfahren. Zum Beispiel kann eine GL50-DNA von einer humanen
genomischen DNA-Bibliothek unter Verwendung der gesamten SEQ ID
Nr. 1, 3 oder 5 oder einem Teil davon als Hybridisierungssonde und
gemäß gewöhnlichen Hybridisierungsverfahren
isoliert werden (z.B. wie in Sambrook, J., et al. Molecular Cloning:
A Laborstory Manual. 2. Auflage Cold Spring Harbor Laborstory, Cold
Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben). Außerdem kann ein Nukleinsäuremolekül, das ein
gesamtes GL50-Gen oder einen Teil davon umfasst, durch die Polymerase-Kettenreaktion
isoliert werden, wobei man Oligonukleotidprimer verwendet, die so
ausgeführt
sind, dass sie auf der Sequenz SEQ ID Nr. 1, 3 oder 5 basieren.
Zum Beispiel kann mRNA aus Zellen isoliert werden (z.B. durch das
Guanidiniumthiocyanat-Extraktionsverfahren
von Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18: 5294-5299), und cDNA
kann durch reverse Transkriptase (z.B. Moloney-MLV-Reverse-Transkriptase,
erhältlich
bei Gibco/BRL, Bethesda, MD; oder durch die AMV-Reverse-Transkriptase
hergestellt werden, erhältlich
bei Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL). Synthetische Oligonukleotidprimer
für die
PCR-Amplifikation können
so ausgeführt
sein, dass sie auf der in SEQ ID Nr. 1, 3 oder 5 gezeigten Nukleotidsequenz
basieren. Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül kann unter
Verwendung von cDNA oder alternativ genomischer DNA als Matrize
und von geeigneten Oligonukleotidprimern gemäß gewöhnlichen PCR-Amplifikationsverfahren
amplifiziert werden. Die auf diese Weise amplifizierten Nukleinsäuren können in
einen geeigneten Vektor kloniert und durch DNA-Sequenzanalysen charakterisiert
werden. Des Weiteren können
mittels gewöhnlicher
Syntheseverfahren, z.B. unter Verwendung eines DNA-Syntheseautomaten,
Oligonukleotide hergestellt werden, die einer GL50-Nukleotidsequenz
entsprechen.
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In
einem anderen Ausführungsbeispiel
kann ein erfindungsgemäßes isoliertes
Nukleinsäuremolekül auf Basis
von Nukleotidsequenzidentität
unter Verwendung eines mathematischen Algorithmus identifiziert werden.
Solche Algorithmen werden nachstehend detaillierter beschrieben
(siehe z.B. Abschnitt III).
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In
einem anderen Ausführungsbeispiel
hat ein erfindungsgemäßes isoliertes
Nukleinsäuremolekül eine Länge von
mindestens 15, 20, 25, 30 oder mehr Nukleotiden und hybridisiert
unter stringenten Bedingungen mit dem Nukleinsäuremolekül, das die Nukleotidsequenz
SEQ ID Nr. 1, 3 oder 5 umfasst. In einem anderen Ausführungsbeispiel
hat das Nukleinsäuremolekül eine Länge von
mindestens 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500,
550 oder 600 Nukleotiden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung soll
der Begriff "hybridisiert
unter stringenten Bedingungen" Bedingungen
bezüglich
der Hybridisierung und Waschung beschreiben, unter denen Nukleotidsequenzen,
die mindestens zu 30%, 40%, 50% oder 60% homolog zueinander sind,
typischerweise miteinander hybridisiert bleiben. Vorzugsweise sind
die Bedingungen so, dass Sequenzen, die mindestens zu etwa 70%,
bevorzugter mindestens zu etwa 80%, und noch mehr bevorzugt mindestens
zu etwa 85% oder 90% homolog zueinander sind, typischerweise miteinander
hybridisiert bleiben. Derartige stringente Bedingungen sind dem
Fachmann bekannt und können
in den "Current
Protocols in Molecular Biology",
John Wiley und Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6 gefunden werden. Ein
bevorzugtes, nicht beschränkendes
Beispiel für
stringente Hybridisierungsbedingungen ist die Hybridisierung in
6X Natriumchlorid/Natriumcitrat (SSC) bei etwa 45°C, gefolgt
von einer oder mehreren Waschungen in 0,2 X SSC, 0,1% S.D.S. bei
50-65°C.
Vorzugsweise entspricht ein erfindungsgemäßes isoliertes Nukleinsäuremolekül, das unter
stringenten Bedingungen mit der Sequenz SEQ ID Nr. 1, 3 oder 5 hybridisiert,
einem natürlich
vorkommenden Nukleinsäuremolekül.
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnet ein "natürlich vorkommendes" Nukleinsäuremolekül ein RNA-
oder DNA-Molekül
mit einer Nukleotidsequenz, die in der Natur vorkommt (z.B. ein
natürliches Protein
codiert). Neben den in SEQ ID Nr. 1, 3 oder 5 gezeigten GL50-Nukleotidsequenzen
wird der Fachmann erkennen, dass innerhalb einer Population DNA-Sequenzpolymorphismen
auftreten können,
die zu geringfügigen Änderungen
in den Nukleotid- oder
Aminosäuresequenzen
eines GL50 führen.
Ein derartiger genetischer Polymorphismus in einem GL50-Gen kann
aufgrund einer natürlichen
Allelvariation unter Individuen innerhalb einer Population auftreten.
Derartige natürliche
Allelvariationen können
typischerweise zu einer Divergenz von 1-2% in der Nukleotidsequenz
des Gens führen.
Derartige Nukleotidvariationen und resultierenden Aminosäurepolymorphismen
in einem GL50-Gen, die das Ergebnis von natürlicher Allelvariation sind
und die funktionelle Aktivität
eines GL50-Polypeptids nicht verändern,
fallen in den Schutzumfang der Erfindung.
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Neben
den natürlich
vorkommenden Allelvarianten von GL50-Sequenzen, die in der Population
existieren können,
wird der Fachmann ferner erkennen, dass durch Mutation geringfügige Änderungen
in Nukleotidsequenzen, z.B. von SEQ ID Nr. 1, 3 oder 5, eingebracht
werden können,
die wiederum zu Änderungen
in der Aminosäuresequenz
des codierten Proteins führen,
ohne die funktionelle Aktivität
eines GL50-Polypeptids zu verändern.
Zum Beispiel können
in der Sequenz von SEQ ID Nr. 1, 3 oder 5 Nukleotidsubstitutionen
gemacht werden, die zu Aminosäuresubstitutionen
an "nicht-essentiellen" Aminosäureresten
führen.
Ein "nicht-essentieller" Aminosäurerest
ist ein Rest, der von der Wildtypsequenz eines GL50-Nukleinsäuremoleküls verändert werden
kann (z.B. die Sequenz SEQ ID Nr. 1, 3 oder 5), ohne die funktionelle
Aktivität
eines GL50-Moleküls
zu verändern.
Typische Beispiele für
Reste, die nicht-essentiell sind und daher substituiert werden können, können vom
Durchschnittsfachmann mittels der Durchführung eines Aminosäure-Alignments
von Mitgliedern der B7-Familie (oder von Mitgliedern der GL50-Familie)
und der Bestimmung von nicht konservierten Resten identifiziert
werden. Bei solchen Resten ist es wahrscheinlicher, dass sie substituiert
werden können,
da sie nicht konserviert worden sind.
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Dementsprechend
betrifft ein anderer Aspekt der Erfindung Nukleinsäuremoleküle, welche
GL50-Polypeptide codieren, die Änderungen
in Aminosäureresten
enthalten, welche für
eine GL50-Aktivität
nicht essentiell sind. Solche GL50-Polypeptide unterscheiden sich
in der Aminosäuresequenz
von SEQ ID Nr. 2, 4 oder 6 und behalten sogar eine inhärente GL50-Aktivität bei. Durch
das Einbringen von einer oder mehreren Nukleotidsubstitutionen,
Additionen oder Deletionen in die Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr.
1, 3 oder 5, so dass eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, Additionen
oder Deletionen in das codierte Protein eingebracht werden, kann
ein isoliertes Nukleinsäuremolekül hergestellt
werden, das eine nicht-natürliche
Variante eines GL50-Polypeptids codiert. Durch gewöhnliche
Verfahren, wie zum Beispiel gezielte Mutagenese und PCR-vermittelte
Mutagenese, können
Mutationen in SEQ ID N. 1, 3 oder 5 eingebracht werden. Vorzugsweise
werden konservative Aminosäuresubstitutionen
an einem oder mehreren nicht- essentiellen
Aminosäureresten
gemacht. Bei einer "konservativen
Aminosäuresubstitution" wird der Aminosäurerest
durch einen Aminosäurerest
mit einer ähnlichen
Seitenkette ersetzt. Familien von Aminosäureresten mit ähnlichen
Seitenketten sind im Stand der Technik definiert worden, einschließlich basischer
Seitenketten (z.B. Lysin, Arginin, Histidin), saurer Seitenketten
(z.B. Asparaginsäure,
Glutaminsäure),
ungeladener polarer Seitenketten (z.B. Glycin, Asparagin, Glutamin,
Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein), unpolarer Seitenketten (z.B.
Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin,
Tryptophan), β-verzweigter
Seitenketten (z.B. Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatischer
Seitenketten (z.B. Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin).
Ein nicht-essentieller Aminosäurerest
in einem GL50 wird also vorzugsweise durch einen anderen Aminosäurerest
von der gleichen Seitenketten-Familie ersetzt.
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Alternativ
können
in einem anderen Ausführungsbeispiel
Mutationen zufallsbedingt entlang einer ganzen GL50-codierenden
Sequenz oder einem Teil davon eingebracht werden, zum Beispiel durch
Sättigungsmutagenese
oder rationale Kassettenmutagenese, und die resultierenden Mutanten
können
auf ihre Fähigkeit gescreent
werden, an einen Liganden zu binden oder an intrazelluläre Interaktionsmoleküle zu binden,
um Mutanten zu identifizieren, die funktionelle Aktivität beibehalten.
Nach der Mutagenese kann das codierte GL50-Mutantenprotein rekombinant
in einer Wirtszelle exprimiert werden, und die funktionelle Aktivität des Mutantenproteins
kann unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Assays
bestimmt werden, um eine GL50-Aktivität zu bewerten.
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Dementsprechend
betrifft ein anderer Aspekt der Erfindung Nukleinsäuremoleküle, welche
GL50-Polypeptide codieren, die Änderungen
in Aminosäureresten
enthalten, welche für
eine Aktivität
nicht essentiell sind. Homologie-Alignments, wie zum Beispiel die
hierin gezeigte PileUp-Analyse, können verwendet werden, um Aminosäuren auszuwählen, die
verändert
werden können.
Die 18 Aminosäurepositionen,
zum Beispiel, die zwischen allen sechs Molekülen in der extrazellulären Domäne identisch
ausgerichtet sind, sind gut konserviert, und es ist daher unwahrscheinlich,
dass sie verändert
werden können. Ähnlich sind
von den 32 Positionen, welche die vorhergesagten IgV-ähnlichen und IgC-ähnlichen
Faltungen der Moleküle
der B7-Familie definieren, 13 identisch zwischen allen sechs Molekülen konserviert,
vor allem die 4 Cysteine, die intramolekulare Faltungen von Domänen gestatten.
Daher ist es unwahrscheinlich, dass diese Aminosäuren verändert werden können. Andere
Bereiche von signifikanter Sequenzkonservierung wurden auch in der
extrazellulären
Domäne gesehen.
Zum Beispiel findet sich ein Valinrest, der Position 86 von mGL50-1
entspricht, auch in hGL50, und die B7-2 Sequenzen können nicht
verändert
werden. Ebenso das Tyrosin an Position 87 von murinem mGL50-1, das
an entsprechenden Stellen in hGL50 und B7-1 konserviert ist. Die
16 Positionen mit einem Identitäts-Score
von 8 (5 Positionen haben murines mGL50-1/hGL50 und B7-1 gemeinsam,
4 Positionen haben murines mGL50-1/hGL50 und B7-2 gemeinsam, und
6 Positionen haben B7-1 und B7-2 gemeinsam) können nicht verändert werden.
Außerdem
die unter den Mitgliedern der GL50-Familie konservierten Positionen
in der Transmembrandomäne
und/oder in der cytoplasmatischen Domäne (insbesondere Tyrosinreste
in der Transmembrandomäne
oder in der cytoplasmatischen Domäne eines GL50-Moleküls). Auch
in diesem Fall ist es unwahrscheinlich, dass diese Positionen verändert werden
können,
wenn die GL50-Aktivität
beibehalten werden soll.
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Noch
ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft nicht-natürlich vorkommende
GL50-Nukleinsäuremoleküle, die
insofern chimär
sind, als dass sie eine Nukleinsäuresequenz
umfassen, welche die Transmembrandomäne oder die cytoplasmatische
Domäne
von GL50 codiert, die sie naturgemäß nicht umfassen. In einem Ausführungsbeispiel
können
zum Beispiel die Transmembrandomäne
und/oder die cytoplasmatische Domäne eines GL50-Moleküls unter
Verwendung von gewöhnlichen
molekularbiologischen Verfahren ausgetauscht oder umgeordnet werden,
um GL50-Moleküle
herzustellen, die andere Signaltransduktionseigenschaften haben
als natürlich
vorkommenden GL50-Moleküle.
Solche Nukleinsäure-
und Polypeptidmoleküle
sind ebenfalls von der Erfindung erfasst.
-
In
noch einem anderen Aspekt können
GL50-Nukleinsäuremoleküle so ausgeführt sein,
dass sie Nukleinsäuresequenzen
umfassen, die mindestens einen Teil eines anderen Mitglieds der
B7-Familie codieren, z.B. B7-1 oder B7-2. Zum Beispiel können unter
Verwendung von gewöhnlichen
Verfahren Nukleinsäuremoleküle hergestellt
werden, die hybride GL50/B7-Moleküle mit Ligand-bindenden und/oder
Signaltransduktionseigenschaften codieren, die sich von jenen, die
in natürlich
vorkommenden Molekülen
zu finden sind, unterscheiden. In einem Ausführungsbeispiel kann zum Beispiel
die Sequenz von GL50 (Y08823) vom Huhn verwendet werden, um Moleküle mit veränderten
Signaltransduktions- oder Bindungseigenschaften zu entwickeln. Zu
diesem Zweck kann sich die Sequenzähnlichkeit zwischen GL50 vom
Vogel und Säugetierformen
des Moleküls und
ihre Unterschiede in der Ligandenpräferenz zunutze machen. Zum
Beispiel kann die progressive Substitution von Resten, die zwischen
GL50-ähnlichem
Protein vom Vogel (Y08823) und GL50 konserviert sind, mit jenen,
die in GL50 zu finden sind (um das Molekül GL50-ähnlicher zu machen) zu einem
funktionellem Molekül führen, das
an ICOS und CD28 und CTLA4 bindet. Ig-Fusion oder andere Konstrukte,
die hybride GL50/B7 Proteine umfassen, können verwendet werden, um eine
differentielle Aktivierung oder Inhibition von Zielzellpopulationen
und von T-Zellphänotypen
zu erreichen. Solche Nukleinsäure-
und Polypeptidmoleküle
sind ebenfalls von der Erfindung erfasst.
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Noch
ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft isolierte Nukleinsäuremoleküle, die
GL50-Fusionsproteine codieren. Solche Nukleinsäuremoleküle, welche mindestens eine
erste Nukleotidsequenz umfassen, die ein GL50-Polypeptid, -Polypeptid
oder -Peptid codiert, das operativ mit einer zweiten Nukelotidsequenz
verbunden ist, die ein nicht-GL50 Polypeptid, -Polypeptid oder -Peptid
codiert, können
mittels gewöhnlicher DNA-Rekombinationstechniken
hergestellt werden.
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In
einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
kann eine GL50-Polypeptidmutante auf folgende Fähigkeiten hin untersucht werden.
1) die Proliferation und/oder die Effektorfunktion (z.B. die Zytokinsekretion
(wie zum Beispiel IL-2 oder IL-10) von aktivierten Zellen costimulieren
(oder deren Costimulation inhibieren, z.B. in löslicher Form); 2) an einen
Antikörper
gegen B7 binden; und/oder 3) an einen GL50-Ligaeden binden (z.B.
an CD28, CTLA4 und/oder ICOS).
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Neben
den vorstehend beschriebenen Nukleinsäuremolekülen, die GL50-Polypeptide codieren,
betrifft ein anderer Aspekt der Erfindung isolierte Nukleinsäuremoleküle, die
dazu antisense sind. Ein "Antisense-"Nukleinsäuremolekül umfasst
eine Nukleotidsequenz, die zu einem "Sense-"Nukleinsäuremolekül komplementär ist, das
ein Protein codiert, z.B. komplementär zu dem Masterstrang eines
doppelsträngigen
cDNA-Moleküls
oder komplementär
zu einer mRNA-Sequenz. Folglich kann ein Antisense-Nukleinsäuremolekül über eine
Wasserstoffbrücke
an ein Sense-Nukleinsäuremolekül binden.
Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann komplementär zu dem
gesamten GL50-Masterstrang oder nur zu einem Teil davon sein. In
einem Ausführungsbeispiel
ist ein Antisense-Nukleinsäuremolekül antisense
zu einer "codierenden
Region" des Masterstrangs
einer Nukleotidsequenz, die GL50 codiert. Der Begriff "codierende Region" bezeichnet die Region der
Nukleotidsequenz, die Codons umfasst, die in Aminosäurereste
translatiert sind. In einem Ausführungsbeispiel
ist ein Antisense-Nukleinsäuremolekül antisense
zu einer "nicht-codierenden
Region" des Masterstrangs einer
Nukleotidsequenz, die GL50 codiert. Der Begriff "nicht-codierende Region" bezeichnet 5'- und 3'-Sequenzen, welche
die codierende Region flankieren und nicht in Aminosäuren translatiert
sind (d.h. auch als 5'-
und 3'-untranslatierte
Regionen bezeichnet).
-
In
Anbetracht der hierin offenbarten GL50-codierenden Masterstrang-Sequenzen
können,
gemäß den Prinzip
der Basenpaarung von Watson und Crick, erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäuremoleküle entwickelt
werden. Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann komplementär zu der
gesamten codierenden Region der GL50-mRNA sein, doch bevorzugter
ist es ein Oligonukleotid, das nur zu einem Teil der codierenden
oder nicht-codierenden Region der GL50-mRNA antisense ist. Das Antisense-Oligonukleotid
kann zum Beispiel komplementär
zu der Region sein, welche die Translationsstartstelle der GL50-mRNA
umgibt. Ein Antisense-Oligonukleotid kann zum Beispiel eine Länge von
etwa 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Nukleotide haben.
Ein erfindungsgemäßes Antisense-Nukleinsäuremolekül kann unter
Verwendung von chemischen Synthesen und enzymatischen Ligationsreaktionen
nach im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden.
Eine Antisense-Nukleinsäure
(z.B. ein Antisense-Oligonukleotid) kann zum Beispiel unter Verwendung
von natürlich
vorkommenden Nukleotiden oder auf verschiedene Weise modifizierten
Nukleotiden chemisch synthetisiert werden, wobei diese Nukleotide
so beschaffen sind, dass sie die biologische Stabilität der Moleküle erhöhen oder
die physikalische Stabilität
des Duplex erhöhen,
das zwischen den Antisense- und Sense-Nukleinsäuren ausgebildet ist. Beispielsweise
können
Phosphorthioat-Derivate und acridinsubstituierte Nukleotide verwendet
werden. Beispiele modifizierter Nukleotide, die zur Herstellung
der Antisense-Nukleinsäure
verwendet werden können,
sind u. a. 5-Fluoruracil,
5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Ioduracil, Hypoxanthin, Xanthin,
4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxymethyl)-uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridin, 5-Carboxymethylaminomethyluracil,
Dihydrouracil, β-D-Galactosylqueosin,
Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin,
2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin,
N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, β-D-Mannosylqueosin,
5'-Methoxycarboxymethyluracil,
5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure (v),
Wybutoxosin, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil,
4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure (v), 5-Methyl-2-thiouracil,
3-(3-Amino-3-N-2carboxypropyl)-uracil, (acp3)w und 2,6-Diaminopurin.
Alternativ kann die Antisense-Nukleinsäure biologisch hergestellt
werden, indem man einen Expressionsvektor verwendet, in den eine
Nukleinsäure
in Antisense-Richtung subkloniert worden ist (d.h. die von der eingebrachten
Nukleinsäure
transkribierte RNA wird in Bezug auf die jeweilige Ziel-Nukleinsäure eine
Antisense-Richtung haben, was in dem folgenden Unterabschnitt genauer
erklärt
wird).
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Die
erfindungsgemässen
Antisense-Nukleinsäuremoleküle werden üblicherweise
an ein Individuum verabreicht oder in situ erzeugt, so dass sie
mit der zellulären
mRNA und/oder der genomischen, ein GL50-Polypeptid codierenden DNA
hybridisieren oder daran binden, so dass die Expression des Proteins
inhibiert wird, z.B. durch Inhibition der Transkription und/oder
der Translation. Die Hybridisierung kann durch herkömmliche Nukleotidkomplementarität unter
Bildung eines stabilen Duplex oder zum Beispiel im Fall eines Antisense-Nukleinsäuremoleküls, das
an DNA-Duplices
bindet, durch spezifische Interaktionen in der großen Furche
der Doppelhelix erfolgen. Ein Beispiel für eine Verabreichungsform von
erfindungsgemäßen Antisense-Nukleinsäuremolekülen umfasst
die direkte Injektion an einer Gewebestelle. Alternativ können Antisense-Nukleinsäuremoleküle zu ausgewählten Zielzellen
modifiziert werden und anschließend
systemisch verabreicht werden. Für
die systemische Verabreichung können
Antisense-Moleküle
zum Beispiel so modifiziert werden, dass sie spezifisch an Rezeptoren
oder Antigene binden, die auf einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiert
sind, z.B. durch Verbinden der Antisense-Nukleinsäuremoleküle mit den Peptiden oder Antikörpern, die
an Zelloberflächenrezeptoren
oder Antigene binden. Die Antisense-Nukleinsäuremoleküle können auch unter Verwendung
der hierin beschriebenen Vektoren an Zellen geliefert werden. Um
ausreichende intrazelluläre
Konzentrationen der Antisense-Moleküle zu erhalten, sind Vektorkonstrukte
bevorzugt, in denen das Antisense-Nukleinsäuremolekül einem starken Pol II oder
Pol III Promotors unterstellt wird.
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In
noch einem anderen Ausführungsbeispiel
ist das erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäuremolekül ein α-anomeres
Nukleinsäuremolekül. Ein α-anomeres
Nukleinsäuremolekül bildet
spezifische doppelsträngige
Hybride mit komplementärer
RNA, wobei die Stränge
im Gegensatz zu gewöhnlichen β-Einheiten parallel
zueinander verlaufen (Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids. Res.
15:6625-6641). Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann zudem ein 2'-O-Methylribonukleotid
(Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:6131-6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analogon
(Inoue et al. (1987) FERS Lett. 215:327-330) umfassen.
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In
noch einem anderen Ausführungsbeispiel
ist ein erfindungsgemäßes Antisense-Nukleinsäuremolekül ein Ribozym.
Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribonukleaseaktivität, die eine
einzelsträngige Nukleinsäure, wie
zum Beispiel eine RNA, zu der sie eine komplementäre Region
haben, spalten können.
Somit können
Ribozyme (z.B. Hammerhead-Ribozyme
(beschrieben in Haselhoff und Gerlach (1988) Nature 334:585-591))
zur katalytischen Spaltung von GL50-mRNA-Transkripten verwendet
werden, um dadurch die Translation der GL50-mRNA zu inhibieren.
Ein Ribozym mit Spezifität
für eine
GL50-codierende Nukleinsäure kann
auf der Basis einer hierin offenbarten Nukleotidsequenz eines GL50
gebildet werden (z.B. SEQ ID Nr. 1, 3 oder 5). Beispielsweise kann
ein Derivat einer Tetrahymena-L-19-IVS-RNA konstruiert werden, wobei
die Nukleotidsequenz der aktiven Stelle komplementär zu der
Nukleotidsequenz ist, die in einer GL50-codierenden mRNA gespalten
werden soll. Siehe z.B. Cech et al.
US-amerikanisches
Patent Nr. 4,987,071 ; und Cech et al.
US-amerikanisches Patent Nr. 5,116,742 .
Alternativ kann GL50-mRNA zur Selektion einer katalytischen RNA mit
spezifischer Ribonukleaseaktivität
aus einem Pool von RNA-Molekülen
verwendet werden. Siehe z.B. Bartel, D. und Szostak, J. W. (1993)
Science 261:1411-1418).
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Alternativ
kann die GL50-Genexpression inhibiert werden, indem Nukleotidsequenzen,
die komplementär
zu der regulatorischen Region des GL50 sind (z.B. der GL50-Promotor
und/oder Enhancer) so dirigiert werden, dass Triele-Helixstrukturen
gebildet werden, welche die Transkription des GL50-Gens in Ziel-Zellen verhindern.
Siehe allgemein Helene, C. (1991) Anticancer Drug Des. 6(6):569-84;
Helene, C. et al. (1992) Ann. N. Y. Acad. Sci. 660:27-36; und Maher,
L. J. (1992) Bioessays 14(12):807-15.
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In
noch einem anderen Ausführungsbeispiel
können
die erfindungsgemäßen GL50-Nukleinsäuremoleküle am Basenanteil,
Zuckeranteil oder Phosphatrückgrat
modifiziert werden, um beispielsweise die Stabilität, die Hybridisierung
oder die Löslichkeit
des Moleküls
zu verbessern. Das Deoxyribose-Phosphatrückgrat der Nukleinsäuremoleküle kann
zum Beispiel so modifiziert werden, dass Peptidnukleinsäuren entstehen
(siehe Hyrup B. und Nielsen, P. E. (1996) Bioorg. Med. Chem. 4(1):5-23).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnen die Begriffe "Peptidnukleinsäuren " oder "PNAs" Nukleinsäure-Imitatoren,
z.B. DNA-Imitatoren, in denen das Deoxyribose-Phosphatrückgrat durch
ein Pseudopeptid-Rückgrat
ersetzt wurde und nur die vier natürlichen Nukleinbasen erhalten
geblieben sind. Es zeigte sich, dass das neutrale Rückgrat von
PNAs eine spezifische Hybridisierung mit DNA und RNA unter Bedingungen
von geringer ionischer Stärke
ermöglicht.
Die Synthese von PNA-Oligomeren kann unter Verwendung von gewöhnlichen
Festphasenpeptidsynthesen ausgeführt
werden, wie sie in Hyrup und Nielsen (1996) supra; Perry-O'Keefe et al. (1996) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 93:14670-675 beschrieben sind.
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PNAs
von GL50-Nukleinsäuremolekülen können in
therapeutischen und diagnostischen Einsatzbereichen verwendet werden.
PNAs können
zum Beispiel als Antisense-Agenzien oder antigene Agenzien für sequenzspezifische
Modulation von Genexpression, zum Beispiel durch die Induktion des
Transkriptions- oder Translationsarrests oder die Inhibition der
Replikation, verwendet werden. PNAs von GL50 Nukleinsäuremolekülen finden
zudem Verwendung in den Analysen von einzelnen Basenpaarmutationen
in einem Gen (z.B. durch PNA-induziertes PCR-Clamping); als 'artifizielle Restriktionsenzyme', wenn sie zusammen
mit anderen Enzymen verwendet werden, (z.B. S1-Nukleasen (Hyrup
und Nielsen (1996) supra)); oder als Sonden oder Primer für DNA-Sequenzierung
oder Hybridisierung (Hyrup und Nielsen (1996) supra; Perry-O'Keefe (1996) supra).
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In
einem anderen Ausführungsbeispiel
können
PNAs von GL50 modifiziert werden, (z.B. um ihre Stabilität oder zelluläre Aufnahme
zu verbessern), indem man den PNAs Lipophile oder sonstige Helfergruppen zuordnet,
PNA-DNA-Chimäre
bildet oder Liposome oder sonstige im Stand der Technik bekannte
Verfahren zur Medikamentenverabreichung verwendet. Zum Beispiel
können
PNA-DNA-Chimäre von GL50-Nukleinsäuremolekülen erzeugt
werden, welche die vorteilhaften Eigenschaften von PNA und DNA vereinen.
Solche Chimäre
ermöglichen
den DNA-Erkennungsenzymen (z.B. RNAse H und DNA-Polymerasen), mit
dem DNA-Teil zu interagieren, während
der PNA-Teil eine hohe Bindungsaffinität und Spezifität bietet.
PNA-DNA-Chimäre können unter
Verwendung von Linkern von geeigneter Länge verbunden werden. Diese
Linker werden nach den Kriterien Basenstapelung, Anzahl der Bindungen
zwischen den Nukleinbasen und der Ausrichtung ausgewählt (Hyrup
und Nielsen (1996) supra). Die Synthese von PNA-DNA-Chimären kann
wie in Hyrup und Nielsen (1996) supra und Finn P. J. et al. (1996)
Nucleic Acids Res. 24(17):3357-63 beschrieben ausgeführt werden. Zum
Beispiel kann eine DNA-Kette auf einem festen Support unter Verwendung
von gewöhnlicher
Phosphoramiditkopplungschemie und modifizierten Nukleotidanaloga
synthetisiert werden, z.B. kann 5'-(4-Methoxytrityl)amino-5'-deoxythymidin-phosphoramidit
zwischen der PNA und dem 5'-Ende
der DNA verwendet werden (Mag, M. et al. (1989) Nucleic Acids Res.
17:5973-88). Anschließend
werden PNA-Monomere schrittweise verkoppelt, um ein chimäres Molekül mit einem
5'-PNA-Segment und
einem 3'-DNA-Segment
herzustellen (Finn et al. (1996) supra). Alternativ können chimäre Moleküle mit einem
5'-DNA-Segment und
einem 3'-PNA-Segment
synthetisiert werden (Peterser, K. H. et al. (1975) Bioorganic Med.
Chem. Lett. 5:1119-11124).
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In
anderen Ausführungsbeispielen
kann das Oligonukleotid andere angehängte Gruppen umfassen, wie
zum Beispiel Peptide (z.B. um Hostzellen-Rezeptoren in vivo vorzusehen)
oder Agenzien, die den Transport durch die Zellmembran erleichtern
(siehe z.B. Letsinger et al. (1989) Proc. Natl. Acad Sci. USA 86:6553-6556;
Lemaitre et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652; PCT-Publikation
Nr.
WO88/09810 ) oder
die Blut-Hirn-Schranke (siehe z.B. PCT-Publikation Nr.
WO89/10134 ). Außerdem können Oligonukleotide mit hybridisierungaktivierten
Spaltungsagenzien (siehe z.B. Krol et al. (1988) Biotechniques 6:958-976)
oder Interkalanzien modifiziert werden. (Siehe z.B. Zon (1988) Pharm.
Res. 5:539-549). Zu diesem Zweck kann das Oligonukleotid mit einem
anderen Molekül
gepaart werden (z.B. ein Peptid, ein hybridisierungaktiviertes Vernetzungsagens,
ein Transportagens oder ein hybridisierungaktiviertes Spaltungsagens).
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III. Isolierte GL50-Polypeptide und Antikörper gegen
GL50
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Ein
Aspekt der Erfindung betrifft isolierte GL50-Polypeptide und biologisch
aktive Teile davon sowie Polypeptidefragmente, die sich für die Verwendung
als Immunogene zur Entwicklung von Antikörpern gegen GL50 eignen. In
einem Ausführungsbeispiel
können
native GL50-Polypeptide durch ein geeignetes Reinigungsschema unter
Verwendung von gewöhnlichen
Reinigungsverfahren von Zell- oder Gewebequellen isoliert werden.
In einem anderen Ausführungsbeispiel
werden GL50-Polypeptide durch DNA-Rekombinationstechniken hergestellt.
Alternativ zu rekombinanter Expression kann ein GL50-Polypeptid
oder ein GL50-Polypeptid unter Verwendung von gewöhnlichen
Peptidsyntheseverfahren chemisch synthetisiert werden.
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Ein "isoliertes" oder "gereinigtes" Protein bzw. ein
biologisch aktiver Teil davon ist im Wesentlichen frei von zellulärem Material
oder sonstigen kontaminierenden Proteinen aus den Zell- oder Gewebequellen,
von denen die GL50-Polypeptide abstammen, oder im Wesentlichen frei
von chemischen Vorstufen oder sonstigen Chemikalien, wenn es bzw.
er chemisch synthetisiert worden ist. Die Formulierung "im Wesentlichen frei
von zellulärem
Material" umfasst
Präparate
von GL50-Polypeptid, in denen das Protein von zellulären Komponenten
der Zellen, von denen es isoliert oder rekombinant hergestellt worden
ist, getrennt ist. In einem Ausführungsbeispiel
umfasst die Formulierung "im
Wesentlichen frei von zellulärem
Material" Präparate von GL50-Polypeptid
mit weniger als etwa 30% (Trockengewicht) Nicht-GL50-Polypeptid
(hierin auch als "kontaminierendes
Protein" bezeichnet),
bevorzugter weniger als etwa 20% Nicht-GL50-Polypeptid, noch bevorzugter
weniger als etwa 10% Nicht-GL50-Polypeptid, und am meisten bevorzugter
weniger als etwa 5% Nicht-GL50-Polypeptid. Wenn das GL50 Polypeptid
bzw. der biologisch aktive Teil davon rekombinant hergestellt worden
ist, ist es zudem vorzugsweise im Wesentlichen frei von Kulturmedium,
d.h. das Kulturmedium macht weniger als etwa 20%, bevorzugter weniger
als etwa 10%, und am meisten bevorzugt weniger als etwa 5% des Volumens
des Proteinpräparats
aus.
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Die
Beschreibung "im
Wesentlichen frei von chemischen Vorstufen oder sonstigen Chemikalien" beinhaltet Präparate von
GL50-Polypeptid, in denen das Protein von chemischen Vorstufen oder
sonstigen Chemikalien, die an der Synthese des Proteins beteiligt
sind, getrennt ist. In einem Ausführungsbeispiel beinhaltet die
Beschreibung "im
Wesentlichen frei von chemischen Vorstufen oder sonstigen Chemikalien" Präparate von GL50-Polypeptid
mit weniger als etwa 30% (Trockengewicht) chemische Vorstufen oder
Nicht-GL50-Chemikalien, bevorzugter weniger als etwa 20% chemische
Vorstufen oder Nicht-GL50-Chemikalien, noch bevorzugter weniger
als etwa 10% chemische Vorstufen oder Nicht-GL50-Chemikalien, und
am meisten bevorzugt weniger als etwa 5% chemische Vorstufen oder
Nicht-GL50-Chemikalien.
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Ein
anderer Aspekt der Erfindung betrifft isolierte GL50-Polypeptide.
Vorzugsweise umfassen die GL50-Polypeptide die von SEQ ID Nr. 1,
3 oder 5 codierte Aminosäuresequenz.
In einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel umfasst das
Protein die von SEQ ID Nr. 4 oder 6 codierte Aminosäuresequenz.
In anderen Ausführungsbeispielen
hat das Protein mindestens 50%, vorzugsweise 60% Aminosäureidentität, bevorzugter
70% Aminosäureidentität, bevorzugter
80%, und noch bevorzugter 90% oder 95% Aminosäureidentität zu der in SEQ ID Nr. 4 oder
6 gezeigten Aminosäuresequenz.
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In
anderen Ausführungsbeispielen
bietet die Erfindung isolierte Teile eines GL50-Polypeptids. GL50-Polypeptide
mit einer GL50-Polypeptid-Domäne.
Typische Beispiele für
Domänen
des GL50-Polypeptids sind in 12 gezeigt
und beinhalten IgV-ähnliche,
IgC-ähnliche,
Transmembrandomänen
und cytoplasmatische Domänen.
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Die
Erfindung betrifft ferner lösliche
Formen von GL50-Polypeptiden. Solche Formen können natürlich vorkommen oder können geschaffen
sein und können
z.B. eine extrazelluläre
Domäne
eines GL50-Polypeptids umfassen. In einem Ausführungsbeispiel umfasst die
extrazelluläre
Domäne
eines GL50-Polypeptids die IgV- und IgC-Domänen nach der Spaltung der Signalsequenz,
aber nicht die Transmembrandomäne
und die cytoplasmatische Domäne
eines GL50-Polypeptids (z.B. entsprechend der Aminosäuresequenz
von etwa Aminosäure
22-258 der SEQ ID Nr. 6).
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Biologisch
aktive Teile eines GL50-Polypeptids beinhalten Peptide mit Aminosäuresequenzen,
die ausreichend homolog zu der Aminosäuresequenz des GL50-Polypeptids
oder von dieser abgeleitet sind, und die weniger Aminosäuren enthalten
als die GL50-Polypeptide voller Länge und mindestens eine Aktivität eines GL50-Polypeptids
aufweisen. Typischerweise umfassen biologisch aktive Teile eine
Domäne
oder ein Motiv mit mindestens einer Aktivität des GL50-Polypeptids. Ein
biologisch aktiver Teil eines GL50-Polypeptids kann ein Polypeptid
sein, das zum Beispiel eine Länge
von mindestens 10, 25, 50, 100, 150, 200 oder mehr Aminosäuren hat.
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Zur
Bestimmung der prozentualen Identität von zwei Aminosäuresequenzen
oder von zwei Nukleinsäuresequenzen
werden die Sequenzen so ausgerichtet, dass sie optimal verglichen
werden können
(z.B. können
in eine oder in beide von einer ersten und einer zweiten Aminosäure- oder
Nukleinsäuresequenz
Lücken,
sog. "Gags", eingebracht werden,
um eine optimale Ausrichtung zu erreichen). In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
beträgt
die Länge
einer zu Vergleichszwecken ausgerichteten Referenzsequenz mindestens
30%, vorzugsweise mindestens 40%, noch bevorzugter mindestens 50%,
noch mehr bevorzugt mindestens 60%, und noch mehr bevorzugt mindestens
70%, 80% oder 90% der Länge
der Referenzsequenz.
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Anschließend werden
die Reste an entsprechenden Positionen verglichen, und wenn eine
Position in einer Sequenz von dem selben Rest besetzt ist wie die
entsprechende Position in der anderen Sequenz, dann sind die Moleküle an dieser
Position identisch. Die prozentuale Identität zwischen zwei Sequenzen ist
daher eine Funktion der Anzahl von identischen Positionen, die zwei
Sequenzen gemeinsam haben (d.h. Identität in % = Anzahl an identischen
Positionen/Gesamtanzahl von Positionen × 100). Die prozentuale Identität zwischen
den zwei Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl von identischen
Positionen, welche die Sequenzen gemeinsam haben, wobei die Anzahl
an Gaps und die Länge
aller Gaps, die für
eine optimale Ausrichtung der zwei Sequenzen eingefügt worden
sind, berücksichtigt
werden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist Aminosäure- bzw.
Nukleinsäure-"Identität" äquivalent zu Aminosäure- bzw.
Nukleinsäure-"Homologie".
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Der
Vergleich von Sequenzen und die Bestimmung der prozentualen Identität zwischen
zwei Sequenzen kann unter Verwendung eines mathematischen Algorithmus
erfolgen. Ein nicht-limitierendes
Beispiel für einen
mathematischen Algorithmus, der für den Vergleich von Sequenzen
verwendet wird, ist der Algorithmus von Karlin und Altschul (1990)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264, modifiziert wie in Karlin und
Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873. Solch ein Algorithmus
ist in die Programmen NBLAST und XBLAST (Version 2.0) von Altschul,
et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403 integriert. Nukleotidsuchen
mit BLAST können
mit dem Programm NBLAST, Score = 100, Wortlänge = 12 ausgeführt werden,
um Nukleotidsequenzen zu erhalten, die homolog zu den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen sind.
Proteinsuchen mit BLAST können
mit dem Programm XBLAST, Score = 50, Wortlänge = 3 ausgeführt werden,
um Aminosäuresequenzen
zu erhalten, die homolog zu den erfindungsgemäßen Proteinmolekülen sind.
Um mit Gaps verlängerte
Alignments für
Vergleichszwecke zu erhalten, kann das Programm Gapped BLAST verwendet
werden, wie in Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Research 25(17):3389
beschrieben. Bei Verwendung der Programme BLAST und Gapped BLAST
können
die Standardparameter der zugehörigen
Programme (z.B. XBLAST und NBLAST) verwendet werden. Siehe http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Ein weiteres bevorzugtes, nicht beschränkendes Beispiel für einen
Algorithmus, der für
den Vergleich von Sequenzen verwendet wird, ist der Algorithmus
von Myers und Miller, CABIOS (1989). Solch ein Algorithmus ist in
das Programm ALIGN (Version 2.0 oder 2.OU) integriert, das Teil
des Softwarepakets GCG Sequence Alignment ist. Bei Verwendung des
Programms ALIGN zum Vergleichen von Aminosäuresequenzen können eine
PAM120 Weight Residue Table, eine "gap length penalty" ("Strafpunkte" für die Länge der
Lücke)
von 12 und eine „gap
length penalty" von
4 verwendet werden.
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Als
weiteres Beispiel kann das Alignment-Programm im Programm Geneworks
(von Oxford Molecular; z.B. Version 2.5.1) mit einem konstanten
PAM-Faktor und den wie folgt eingestellten Parametern verwendet werden: "gap creation" (Herstellen einer
Lücke)
= 16, "extension
penalty" ("Strafpunkte" für das Erweitern
einer Lücke)
= 4, Scoring Matrix = fastadna.cmp.
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Ein
anderes nicht-limitierendes Beispiel für einen mathematischen Algorithmus,
der für
das Alignment von Proteinsequenzen verwendet wird, ist der Lipman-Pearson
Algorithmus (Lipman und Pearson (1985) Science 227:1435). Bei Verwendung
des Lipman-Pearson Algorithmus können
eine PAM250 Weight Residue Table, eine "gap length penalty" von 12, eine "gap length penalty" von 4 und ein k-Tupel von 2 verwendet
werden. Ein bevorzugtes nicht-limitierendes Beispiel für einen
mathematischen Algorithmus, der für das Alignment von Nukleinsäuresequenzen
verwendet wird, ist der Wilbur-Lipman-Algorithmus (Wilbur und Lipman
(1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726). Bei der Verwendung des
Wilbur-Lipman-Algorithmus können
ein Fenster von 20, eine "gap
length penalty" von
3 und ein kTuple von 3 verwendet werden. Sowohl der Lipman-Pearson
Algorithmus als auch der Wilbur-Lipman Algorithmus sind zum Beispiel
in das Programm MegAlign integriert (z.B. Version 3.1.7), das Teil
des Softwarepakets für
Sequenzanalysen DNASTAR ist.
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Weitere
Algorithmen zur Sequenzanalyse sind in dem Stand der Technik bekannt,
wie unter anderem ADVANCE und ADAM, beschrieben in Torelli und Robotti
(1994) Comput. Appl. Biosci. 10:3, und FASIA, beschrieben in Pearson
und Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444.
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In
einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
wird die prozentuale Identität
zwischen zwei Aminosäuresequenzen
unter Verwendung des Programms GAP aus dem Softwarepaket GCG bestimmt,
wobei man entweder eine Blosum 62-Matrix oder eine PAM250-Matrix
und als Parameter ein "gap
weight" (Lückengewichtung)
von 16, 14, 12, 10, 8, 6, oder 4 und ein "length weight" (Längengewichtung)
von 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 verwendet. In noch einem anderen bevorzugten
Ausführungsbeispiel
wird die prozentuale Identität
zwischen zwei Nukleotidsequenzen unter Verwendung des Programms
GAP aus dem Softwarepaket GCG bestimmt, wobei die Matrix NWSgapdna.cmp
und ein "gap weight" von 40, 50, 60,
70 oder 80 und ein "length
weight" von 1, 2, 3,
4, 5 oder 6 verwendet werden.
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Protein-Alignments
können
auch unter Verwendung des Programms Geneworks für ein globales Protein-Alignment
gemacht werden (z.B. Version 2.5.1), wobei die PAM250-Matrix verwendet
wird und die Parameter wie folgt gesetzt sind: "cost to open gap" ("Kosten" zum Öffnen einer
Lücke)
= 5, "cost to lengthen
gap" (Kosten zum
Verlängern
einer Lücke)
= 5, "minimum diagonal
length" (min. diagonale
Länge)
= 4, "maximum diagonal
Offset" (max. diagonaler
Versatz) = 130, "consensus
cutoff" (Parameter
zur Berechnung der Übereinstimmung)
= 50%.
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Die
erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und
Proteinsequenzen können
zudem als Abfragesequenz verwendet werden, um eine Suche über öffentliche
Datenbanken auszuführen,
um zum Beispiel andere Familienmitglieder oder verwandte Sequenzen
zu finden. Solche Suchen können
unter Verwendung der Programme NBLAST und XBLAST (Version 2.0) von
Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10 ausgeführt werden. Nukleotidsuchen
mit BLAST können
mit dem Programm NBLAST, Score = 100, Wortlänge = 12 ausgeführt werden,
um Nukleotidsequenzen zu erhalten, die homolog zu den erfindungsgemäßen GL50-Nukleinsäuremolekülen sind.
Proteinsuchen mit BLAST können
mit dem Programm XBLAST, Score = 50, Wortlänge = 3 ausgeführt werden,
um Aminosäuresequenzen
zu erhalten, die homolog zu den erfindungsgemäßen GL50-Polypeptidmolekülen sind. Um für Vergleichszwecke
mit Gaps verlängerte
Alignments zu erhalten, kann Gapped BLAST verwendet werden, wie
in Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402 beschrieben.
Bei Verwendung der Programme BLAST und Gapped BLAST können die
Standardparameter der zugehörigen Programme
(z.B. XBLAST und NBLAST) verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen können zum
Beispiel unter Verwendung der vorgegebenen BLASTN-Matrix 1-3 analysiert
werden, wobei der Parameter "gap
penalties" wie folgt
eingestellt ist: "existence" (Vorhandensein)
11 und extension (Erweiterung) 1. Die erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen
können
unter Verwendung der folgenden Standardeinstellungen analysiert
werden: die Blosum62-Matrix mit "gap
penalties" eingestellt
auf "existence" 11 und "extension" 1. Siehe http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
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Die
durch Sequenz-Alignments verdeutlichte Anwesenheit von unterschiedlichen
Carboxyl-Regionen auf
RACE-Klonen lässt
darauf schließen,
dass durch die zusätzlichen
Tyrosine in der intrazellulären
Domäne dieser
Moleküle
alternative Signalübertragungsfunktionen
von diesen unterschiedlichen Molekülen ausgeführt werden. Bisher sind nur
vereinzelt Studien ausgeführt
worden, um zu bestimmen, ob entweder für B7-1 oder für B7-2 eine
intrazelluläre
Signalübertragung
existiert. Auf der Basis der Anwesenheit von Tyrosinen in der cytoplasmatischen
Domäne
auf GL50-Sequenzen
kann man vorhersagen, dass derartige Signalereignisse existieren.
Die Untersuchung der cytoplasmatischen Domänen von murinem und humanem
B7-1 und B7-2 zeigte eine geringfügige Ähnlichkeit, und die berichtete
Fähigkeit
von B7-Molekülen,
in GPI-verankerten Konstrukten zu wirken, die keinerlei cytoplasmatische
Sequenzen aufweisen, ließ zudem
darauf schließen,
dass die cytoplasmatische Domäne
von B7 möglicherweise
vollständig überflüssig ist.
Dementsprechend können
in einem Ausführungsbeispiel
Tyrosin-Reste in der intrazellulären
Domäne
eines GL50-Tyrosinmoleküls so geändert werden,
dass die intrazelluläre
Signalübertragung über ein
GL50-Peptid moduliert wird.
-
Ferner
bietet die Erfindung chimäre
GL50-Proteine oder GL50-Fusionsproteine. Im Rahmen der vorliegenden
Erfindung umfasst ein "chimäres GL50-Protein" oder "GL50-Fusionsprotein" ein GL50-Polypeptid, das
funktionell mit einem Nicht-GL50-Polypeptid verbunden ist. Ein "GL50-Polypeptid" bezeichnet ein Polypeptid
mit einer Aminosäuresequenz,
die dem GL50-Polypeptid entspricht, während ein "Nicht-GL50-Polypeptid" ein Polypeptid mit
einer Aminosäuresequenz
bezeichnet, die einem Protein entspricht, das im Wesentlichen nicht
homolog zu dem GL50-Polypeptid
ist, z.B. ein Protein, das sich von dem GL50-Polypeptid unterscheidet,
und das von dem selben oder von einem anderen Organismus stammt.
In einem GL50-Fusionsprotein kann das GL50-Polypeptid einem GL50-Polypeptid ganz
oder teilweise entsprechen. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
umfasst ein GL50-Fusionsprotein mindestens einen biologisch aktiven
Teil eines GL50-Polypeptids, z.B. eine extrazelluläre Domäne eines
GL50-Polypeptids. In dem Fusionsprotein soll der Begriff "funktionell verbunden" besagen, dass das
GL50-Polypeptid und das Nicht-GL50-Polypeptid im Leserahmen ("inframe") miteinander fusioniert
sind. Das Nicht-GL50-Polypeptid kann mit dem N-terminalen Bereich oder
mit dem C-terminalen Bereich des GL50-Polypeptids fusioniert sein.
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In
einem Ausführungsbeispiel
ist das Fusionsprotein zum Beispiel ein Fusionsprotein aus GST und
einem GL50-Mitglied, in dem die Sequenzen des GL50-Mitglieds mit
dem C-terminalen Bereich der GST-Sequenzen fusioniert worden sind.
In einem anderen Ausführungsbeispiel
ist das Fusionsprotein ein Fusionsprotein aus einem GL50-Mitglied
und HA, in dem die Nukleotidsequenz des GL50-Mitglieds in einen
Vektor eingebracht worden ist, wie zum Beispiel der Vektor pCEP4HA
(Herrscher, R. F. et al. (1995) Genes Dev. 9:3067-3082), so dass
die Sequenzen des GL50-Mitglieds im Leserahmen mit einem HA-Epitop-Tag
fusioniert sind. Solche Fusionsproteine können die Reinigung eines rekombinanten
GL50-Mitglieds erleichtern oder können verwendet werden, wenn
ein Molekül
gewünscht
ist, das nicht an einen Fc-Rezeptor bindet.
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Ein
GL50-Fusionsprotein kann mittels rekombinanter Expression einer
Nukleotidsequenz hergestellt werden, die ein erstes Peptid mit GL50-Aktivität codiert,
und einer Nukleotidsequenz, die ein zweites Peptid codiert, das
einem Teil entspricht, der die Löslichkeit,
die Affinität,
die Stabilität
oder die Wertigkeit des ersten Peptids ändert, zum Beispiel eine konstante
Immunglobulinregion. Vorzugsweise besteht das erste Peptid aus einem
Teil eines GL50-Polypeptids (z.B. ein Teil aus Aminosäureresten
von der in SEQ ID Nr. 4 oder 6 gezeigten Sequenz, der ausreicht,
um aktivierte T-Zellen zu costimulieren. Das zweite Peptid kann
eine konstante Immunglobulinregion beinhalten, zum Beispiel eine
humane Cγ1-Domäne oder
Cγ4-Domäne (z.B.
die Scharnierregion, CH2- und CH3-Regionen von humanem IgCγ1 oder humanem
IgCγ4, siehe
z.B. Capon et al.
US-amerikanische
Patente 5,116,964 ,
5,580,756 ,
5,844,095 und dergleichen,
die durch diese Bezugnahme als Bestandteil der vorliegenden Patentschrift
gelten).
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Besonders
bevorzugte Fusionsproteine aus GL50 und Ig enthalten den Teil der
extrazellulären
Domäne
oder der variablen regionartigen Domäne eines hGL50, der an eine
konstante Immunglobulinregion gekoppelt ist. Die konstante Immunglobulinregion
kann genetische Modifikationen enthalten, welche die Effektoraktivität, die der
Immunglobulinstruktur inhärent
ist, reduzieren oder unterbinden. Zum Beispiel kann die DNA, die den
extrazellulären
Teil eines GL50-Polypeptids
codiert, mit einer DNA verbunden sein, welche die Scharnierregion,
CH2- und CH3-Regionen
von humanem, durch gezielte Mutagenese modifiziertem IgCγ1 und/oder IgCγ4 codiert,
z.B. gemäß den Lehren
in
WO 97/28267 .
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Die
Nukleotid- und Aminosäuresequenzen
von typischen Beispielen für
lösliche
GL50- und ICOS-Konstrukte sind in den 26-29 dargestellt. 26 stellt ein typisches Beispiel einer Nukleinsäure- und
Aminosäuresequenz
eines humanen ICOS-Fusionsproteins dar, 27 stellt
ein typisches Beispiel einer Nukleinsäure- und Aminosäuresequenz
eines murinen ICOS-Fusionsproteins dar, 28 stellt
ein typisches Beispiel einer Nukleinsäure- und Aminosäuresequenz
eines humanen GL50-Fusionsproteins dar, und 29 stellt
ein typisches Beispiel einer Nukleinsäure- und Aminosäuresequenz
eines murinen GL50-Fusionsproteins dar.
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Ein
resultierendes Fusionsprotein aus GL50 und Ig kann eine geänderte Löslichkeit,
Bindungsaffinität, Stabilität und/oder
Wertigkeit haben (d.h. die Anzahl von Bindungsstellen, die pro Molekül zur Verfügung stehen),
und kann die Effizienz der Proteinreinigung erhöhen. Fusionsproteine und Peptide,
die mittels rekombinanter Techniken hergestellt sind, können von
einem Gemisch von Zellen und Medium, welches das Protein oder Peptid
enthält,
sekretiert und isoliert werden. Alternativ kann das Protein oder
Peptid cytoplasmatisch gespeichert werden, die Zellen können geerntet
und lysiert werden, und das Protein kann isoliert werden. Eine Zellkultur
enthält
typischerweise Wirtszellen, Medien und sonstige Nebenprodukte. Geeignete
Medien für
Zellkulturen sind im Stand der Technik wohl bekannt. Proteine und
Peptide können
von dem Zellkulturmedium, den Wirtszellen oder beiden unter Verwendung
von im Stand der Technik bekannten Verfahren zur Reinigung von Proteinen
und Peptiden isoliert werden. Verfahren zum Transfizieren von Wirtszellen
und zum Reinigen von Poteinen und Peptiden sind im Stand der Technik
bekannt.
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Vorzugsweise
wird ein erfindungsgemäßes GL50-Fusionsprotein
mittels gewöhnlicher
DNA-Rekombinationstechniken hergestellt. Zum Beispiel werden DNA-Fragmente,
die für
die verschiedenen Polypeptidsequenzen codieren, gemäß herkömmlicher
Verfahren im Leserahmen miteinander ligiert, zum Beispiel unter Verwendung
von stumpfen ("blunt") oder überhängenden
("staggered") Enden zur Ligation,
Digestion mit Restriktionsenzymen, um geeignete Enden zu erhalten,
Einfüllen
von kohäsiven
Enden, soweit erforderlich, Behandlung mit alkalischen Phosphatasen,
um ungewollte Bindungen zu verhindern, und enzymatischer Ligation.
In einem anderen Ausführungsbeispiel
kann das Fusionsgen mittels herkömmlicher
Verfahren, einschließlich
DNA-Syntheseautomaten, synthetisiert werden. Alternativ kann die
PCR-Amplifikation von Genfragmenten unter Verwendung von Ankerprimern
ausgeführt
werden, die komplementäre Überhänge zwischen
zwei aufeinanderfolgenden Genfragmenten entstehen lassen, die anschließend abgekühlt and
reamplifiziert werden können,
so dass eine chimäre
Gensequenz entsteht (siehe zum Beispiel Current Protocols in Molecular Biology,
Ausubel et al. Eds. John Wiley und Sons: 1992). Überdies sind viele Expressionsvektoren
im Handel erhältlich,
die bereits eine Fusionseinheit (z.B. ein GST-Polypeptid oder ein
HA-Epitoptag) codieren. Eine GL50-codierende Nukleinsäure kann
in einen solchen Expressionsvektor kloniert werden, so dass die
Fusionseinheit im Leserahmen mit dem GL50-Polypeptid verbunden ist.
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In
einem anderen Ausführungsbeispiel
ist das Fusionsprotein ein GL50-Polypeptid, das an seinem N-terminalen
Ende eine heterologe Signalsequenz enthält. In bestimmten Wirtszellen
(z.B. Wirtszellen von Säugetieren)
kann die Expression und/oder die Sekretion von GL50 durch die Verwendung
einer heterologen Signalsequenz erhöht werden.
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Die
erfindungsgemäßen GL50-Fusionsproteine
können
in pharmazeutische Zusammensetzungen integriert und einem Individuum
in vivo verabreicht werden. Die Verwendung von GL50-Fusionsproteinen
kann bei der Behandlung von immunologischen Krankheiten, z.B. Autoimmunkrankheiten,
oder im Fall von Transplantationen therapeutisch dienlich sein. Überdies
können
die erfindungsgemäßen GL50-Fusionsproteine
als Immunogene verwendet werden, um Antikörper gegen GL50 in einem Individuum
herzustellen, um GL50-Liganden zu reinigen, sowie in Screeningassays,
um Moleküle
zu identifizieren, welche die Interaktion von GL50 mit einem GL50-Liganden
inhibieren.
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Ferner
betrifft die vorliegende Erfindung Varianten der GL50-Polypeptide,
die entweder als GL50-Agonisten (Mimetika) oder als GL50-Antagonisten
wirken. Varianten der GL50-Polypeptide können durch Mutagenese hergestellt
werden, z.B. Einzelpunktmutation oder Verkürzung eines GL50-Polypeptids. Ein
Agonist der GL50-Polypeptide kann im Wesentlichen die gleichen oder
eine Untergruppe der biologischen Aktivitäten der natürlich vorkommenden Form eines
GL50-Polypeptids beibehalten. Ein Antagonist eines GL50-Polypeptids kann
eine oder mehrere der Aktivitäten
der natürlich
vorkommenden Form des GL50-Polypeptids inhibieren, zum Beispiel
durch kompetetive Modulation einer zellulären Aktivität eines GL50-Polypeptids. Mit
einer Variante von eingeschränkter
Funktion können
somit spezifische biologische Effekte ausgelöst werden. In einem Ausführungsbeispiel
hat die Behandlung eines Individuums mit einer Variante, die eine
Untergruppe der biologischen Aktivitäten der natürlich vorkommenden Form des
Proteins hat, weniger Nebenwirkungen in einem Individuum als bei
einer Behandlung mit der natürlich
vorkommenden Form des GL50-Polypeptids.
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In
einem Ausführungsbeispiel
können
Varianten eines GL50-Polypeptids, das entweder als GL50-Agonist
(Mimetikum) oder als GL50-Antagonist wirkt, durch Durchmusterung
von kombinatorischen Bibliotheken von Mutanten, z.B. Verkürzungsmutanten,
eines GL50-Polypeptids für
Agonist- oder Antagonistaktivität
von GL50-Polypeptiden identifiziert werden. In einem Ausführungsbeispiel
wird eine variegierte Bibliothek von GL50-Varianten durch kombinatorische
Mutagenese auf Nukleinsäureebene
erzeugt und wird von einer variegierten Genbibliothek codiert. Eine
variegierte Bibliothek von GL50-Varianten kann zum Beispiel durch
enzymatische Ligation eines Gemisches von synthetischen Oligonukleotiden
in Gensequenzen hergestellt werden, so dass sich ein degenerierter
Satz potentieller GL50-Sequenzen als individuelle Polypeptide oder
alternativ als Satz größerer Fusionsproteine
(z.B. für
die Phage-Display-Technik), die diesen Satz von GL50-Sequenzen enthalten,
exprimieren lässt.
Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, die zur Herstellung von Bibliotheken
potenzieller GL50-Varianten aus einer degenerierten Oligonukleotidsequenz
verwendet werden können.
Chemische Synthesen einer degenerierten Gensequenz können in
einem DNA-Syntheseautomaten durchgeführt werden,
und das synthetische Gen kann dann in einen geeigneten Expressionsvektor
ligiert werden. Die Verwendung eines degenerierten Satzes von Genen
ermöglicht
die Bereitstellung sämtlicher
Sequenzen, die den gewünschten
Satz an potentiellen GL50-Sequenzen codieren, in einem Gemisch.
Verfahren zur Synthese degenerierter Oligonukleotide sind im Stand
der Technik bekannt (siehe z.B. Narang, S. A. (1983) Tetrahedron
39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura
et al. (1984) Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids
Res. 11:477.
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Außerdem können Bibliotheken
von Fragmenten einer Sequenz, die GL50-Polypeptid codiert, zur Herstellung
einer variegierten Population eines GL50-Fragments für das Screening
und die anschließende
Selektion von Varianten eines GL50-Polypeptids verwendet werden.
In einem Ausführungsbeispiel
kann eine Bibliothek von Fragmenten der codierenden Sequenz durch
Behandlung eines doppelsträngigen
PCR-Fragments einer GL50-codierenden Sequenz mit einer Nuklease
unter Bedingungen, unter denen "Nicking" (Einzelstrangschnitt)
nur etwa einmal pro Molekül
erfolgen, Denaturieren der doppelsträngigen DNA, Renaturieren der
DNA unter Bildung doppelsträngiger
DNA, die Sense/Antisense-Paare von verschiedenen Produkten mit Einzelstrangbrüchen umfassen
kann, Entfernen einzelsträngiger
Abschnitte aus neu gebildeten Duplices durch Behandlung mit S1-Nuklease
und Ligieren der resultierenden Fragmentbibliothek in einen Expressionsvektor
erzeugt werden. Mit diesem Verfahren kann eine Expressionsbibliothek
hergeleitet werden, die N-terminale, C-terminale und interne Fragmente
des GL50-Polypeptids verschiedener Größen codiert.
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Im
Stand der Technik sind mehrere Verfahren für das Screening in kombinatorischen
Bibliotheken von Genprodukten, die durch Punktmutationen oder Verkürzung hergestellt
worden sind, und für
das Screening von cDNA-Bibliotheken nach Genprodukten mit einer
ausgewählten
Eigenschaft bekannt. Solche Verfahren lassen sich an das schnelle
Screening der Genbibliotheken anpassen, die durch kombinatorische
Mutagenese von GL50-Polypeptiden erzeugt worden sind. Die am häufigsten
verwendeten Verfahren zum Screening großer Genbibliotheken, die für eine Analyse
mit hohem Durchsatz geeignet sind, beinhalten typischerweise das Klonieren
der Genbibliothek in replizierbare Expressionsvektoren, Transformieren
von geeigneten Zellen mit der resultierenden Vektorenbibliothek
und Exprimieren der kombinatorischen Gene unter Bedingungen, unter denen
der Nachweis einer gewünschten
Aktivität
die Isolation des Vektors erleichtert, der das Gen kodiert, dessen
Produkt nachgewiesen wurde. Die "Recursive-Ensemble-Mutagenese" (REM), ein neues
Verfahren, das die Häufigkeit
funktioneller Mutanten in den Bibliotheken erhöht, kann in Kombination mit
den Screeningassays zur Identifizierung von GL50-Varianten verwendet
werden (Arkin and Youvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815;
Delagrave et al. (1993) Protein Eng. 6(3):327-331).
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In
einem Ausführungsbeispiel
können
zellbasierte Assays zur Analyse einer variegierten GL50-Bibliothek genutzt
werden. Zum Beispiel kann eine Bibliothek von Expressionsvektoren
in eine Zell-Linie
transfiziert werden, die gewöhnlich
GL50 synthetisiert und ausscheidet. Die transfizierten Zellen werden
dann gezüchtet, so
dass GL50 und ein bestimmter GL50-Mutant sekretiert werden und der
Effekt der Expression des Mutanten auf die GL50-Aktivität in Zellüberständen nachgewiesen
werden kann, z.B. durch eine beliebige Anzahl von enzymatischen
Assays. Anschließend
kann Plasmid-DNA von den Zellen, in denen Inhibition oder alternativ Verstärkung der
GL50-Aktivität
nachgewiesen wurde, und von den weiter charakterisierten individuellen
Klonen zurückgewonnen
werden.
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Neben
den GL50-Polypeptiden, die nur aus natürlich vorkommenden Aminosäuren bestehen,
sind auch GL50-Peptidomimetika vorgesehen. Peptidanaloga werden
in der pharmazeutischen Industrie häufig als Nicht-Peptid-Pharmazeutika
verwendet, deren Eigenschaften jenen des Templatpeptids ähnlich sind
Diese Typen von Nicht-Peptidverbindungen werden als "Peptidmimetika" oder "Peptidomimetika" bezeichnet (Fauchere,
J. (1986) Adv. Drug Res. 15:29; Veber und Freidinger (1985) TINS
S.392; und Evans et al. (1987) J. Med Chem. 30:1229, die durch diese
Bezugnahme als Bestandteil der vorliegenden Patenschrift gelten)
und werden gewöhnlich
mit Hilfe von computerunterstützter
Molekularmodellierung entwickelt. Peptidmimetika, die in ihrer Struktur
den therapeutisch nützlichen
Peptiden ähneln,
können
verwendet werden, um eine äquivalente therapeutische
oder prophylaktische Wirkung zu erzeugen. Im Allgemeinen sind Peptidmimetika
strukturell ähnlich
wie ein paradigmatisches Polypeptid (d.h. ein Polypeptid, das eine
biologische oder pharmakologische Aktivität hat), wie zum Beispiel humanes
GL50, aber eine oder mehrere ihrer Peptidverbindungen sind optional ersetzt
durch eine Verbindung ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH-
(cis und trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2-, und -CH2SO-, durch Verfahren,
die im Stand der Technik bekannt und in den folgenden Referenzen
näher beschrieben
sind: Spatola, A. F. in "Chemistry
and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins" Weinstein, B., Hg.,
Marcel Dekker, New York, S. 267 (1983); Spatola, A. F., Vega Data
(March 1983), Vol. 1, Ausgabe 3, "Peiltide Backbone Modifications" (allgemeiner Bericht);
Morley, J. S. (1980) Trends Pharm. Sci. S. 463-468 (allgemeiner
Bericht); Hudson, D. et al. (1979) Int. J. Peilt. Prot. Res. 14:177-185
(-CH2NH-, CH2CH2-); Spatola, A. F. et al. (1986) Life Sci. 38:1243-1249 (-CH2-S);
Hann, M. M. (1982) J. Chem. Soc. Perkin Trans. I. 307-314 (-CH-CH-,
cis and trans); Almquist, R. G. et al. (190) J. Med. Chem. 23:1392-1398
(-COCH2-); Jennings-White, C. et al. (1982) Tetrahedron Lett. 23:2533
(-COCH2-); Szelke, M. et al.
Europäische Patentanmeldung
EP 45665 (1982) CA: 97:39405 (1982)(-CH(OH)CH2-); Holladay,
M. W. et al. (1983) Tetrahedron Lett. (1983) 24:4401-4404 (-C(OH)CH2-); und
Hruby, V. J. (1982) Life Sci. (1982) 31:189-199 (-CH2-S-); die alle
durch diese Bezugnahme als Bestandteil der vorliegenden Patentschrift
gelten. Eine besonders bevorzugte Nicht-Peptid-Verbindung ist -CH2NH-.
Solche Peptidmimetika können
signifikante Vorteile gegenüber
Polypeptidausführungen
haben, u.a. zum Beispiel wirtschaftlichere Herstellung, größere chemische
Stabilität,
verbesserte pharmakologischen Eigenschaften (Halbwertszeit, Absorption,
Wirkstärke,
Wirksamkeit, etc.), geänderte
Spezifität
(z.B. ein breites Spektrum an biologischen Aktivitäten), verminderte
Antigenität,
und dergleichen. Das Markieren von Peptidmimetika umfasst gewöhnlich die
kovalente Anbindung von einem oder mehreren Markern, direkt oder
durch einen Abstandhalter, einen sog. "Spacer" (z.B. eine Amidgruppe), an nicht-störenden Positionen
auf dem Peptidmimetikum, die durch Daten, die auf einer Quantitativen
Struktur-Wirkungs-Beziehung (engl. Abk.: QSAR) basieren, und/oder
Molekulardesign vorhergesagt sind. Solche nicht-störenden Positionen
sind im Allgemeinen Positionen, die keine direkten Kontaktstellen
mit dem Makromolekül
bzw. den Makromolekülen
bilden, an dem bzw. an denen das Peptidmimetikum bindet, um die
therapeutische Wirkung zu erzeugen. Die Derivatisierung (z.B. Markieren)
von Peptidmimetika sollte die gewünschte biologische oder pharmakologische
Aktivität
des Peptidmimetikums nicht wesentlich beeinträchtigen.
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Systematische
Substitutionen von einer oder mehreren Aminosäuren einer GL50-Aminosäuresequenz
mit einer D-Aminosäure
des gleichen Typs (z.B. D-Lysin anstelle von L-Lysin) können verwendet
werden, um stabilere Peptide herzustellen. Außerdem können durch im Stand der Technik
bekannte Verfahren eingeschränkte
Peptide hergestellt werden, die eine GL50-Aminosäuresequenz oder eine im Wesentlichen
identische Sequenzvariation umfassen (Rizo und Gierasch (1992) Annu.
Rev. Biochem. 61:387, durch diese Bezugnahme Bestandteil der vorliegenden
Patentschrift); zum Beispiel durch das Hinzufügen von internen Cysteinresten,
die intramolekulare Disulfidbrücken
bilden können,
die das Peptid zyklisieren.
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Die
Aminosäuresequenzen
der hierin bezeichneten GL50-Polypeptide werden es dem Fachmann
ermöglichen,
Polypeptide herzustellen, die GL50 Peptidsequenzen und Sequenzvarianten
davon entsprechen. Solche Polypeptide können in prokaryotischen oder
eukaryotischen Wirtszellen durch die Expression von Polynukleotiden,
die eine GL50 Peptidsequenz codieren, oft als Teil eines größeren Polypeptids,
hergestellt werden. Alternativ können
solche Peptide durch chemische Verfahren synthetisiert werden. Verfahren
zur Expression von heterologen Proteinen in rekombinanten Wirten,
chemischen Synthese von Polypeptiden und in vitro Translation sind
im Stand der Technik wohl bekannt und in den folgenden Schriftstücken näher beschrieben: Maniatis
et al. Molecular Cloning: A Laborstory Manual (1989), 2. Auflage,
Cold Spring Harbor, N.Y.; Berger und Kimmel, Methods in Enzymology,
Vol. 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press,
Inc., San Diego, Calif.; Merrifield, J. (1969) J. Am. Chem. Soc.
91:501; Chaiken I. M. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem. 11: 255; Kaiser
et al. (1989) Science 243:187; Merrifield, B. (1986) Science 232:
342; Kent, S. B. H. (1988) Annu. Rev. Biochem. 57:957; und Offord,
R. E. (1980) Semisynthetic Proteins, Wiley Publishing, die durch
diese Bezugnahme als Bestandteil der vorliegenden Patentschrift
gelten).
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Peptide
können
z.B. als Agonisten oder Antagonisten einer Interaktion zwischen
GL50 und GL50-Ligand hergestellt, typischerweise durch direkte chemische
Synthese, und verwendet werden. Peptide können als modifizierte Peptide
hergestellt werden, wobei Nicht-Peptidteile durch kovalente Anbindung
an das N-terminale und/oder C-terminale Ende angekoppelt sind. In
bestimmten bevorzugten Ausführungsbeispielen
sind entweder das Carboxyl-Ende oder das Amino-Ende oder beide chemisch
modifiziert. Die häufigsten
Modifikationen der terminalen Amino- und Carboxylgruppen sind Acetylierung
bzw. Amidierung. Aminoterminale Modifikationen wie zum Beispiel
Acylierung (z.B. Acetylierung) oder Alkylierung (z.B. Methylierung)
und carboxyterminale Modifikationen wie zum Beispiel Amidierung
sowie andere terminale Modifikationen, einschließlich Cyclisierung, können in
viele Ausführungsbeispiele
der Erfindung integriert werden. Bestimmte aminoterminale und/oder
carboxyterminale Modifikationen und/oder Peptidextensionen der Kernsequenz
können
vorteilhafte physikalische, chemische, biochemische und pharmakologische
Eigenschaften liefern, wie zum Beispiel verbesserte Stabilität, höhere Wirkstärke und/oder
Wirksamkeit, Resistenz gegenüber
Serumproteasen, wünschenswerte
pharmakokinetische Eigenschaften, etc. Peptide können therapeutisch verwendet
werden, um Krankheiten zu behandeln, z.B. durch Verändern der
Costimulation in einem Patienten.
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Ein
isoliertes GL50-Polypeptid oder ein Teil oder ein Fragment davon
kann als Immunogen verwendet werden, um unter Verwendung von gewöhnlichen
Verfahren zur Herstellung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern Antikörper zu
erzeugen, die GL50 binden. Man kann ein GL50-Polypeptid in voller
Länge verwenden,
und alternativ bietet die Erfindung antigene Peptidfragmente von
GL50 zur Verwendung als Immunogene. Das antigene Peptid von GL50
umfasst mindestens 8 Aminosäurereste
und umfasst ein Epitop von GL50, so dass ein Antikörper gegen
das Peptid einen spezifischen Immunkomplex mit GL50 bildet. Vorzugsweise
umfasst das antigene Peptid mindestens 10 Aminosäurereste, bevorzugter mindestens
15 Aminosäurereste,
noch bevorzugter mindestens 20 Aminosäurereste, und am meisten bevorzugt
mindestens 30 Aminosäurereste.
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Alternativ
kann ein Fragment eines antigenen Peptids eines GL50-Polypeptids
als Immunogen verwendet werden. Ein Fragment eines antigenen Peptides
eines GL50-Polypeptids umfasst typischerweise mindestens 8 Aminosäurereste
der in SEQ ID Nr. 4 oder 6 gezeigten Aminosäuresequenz und umfasst ein
Epitop eines GL50-Polypeptids, so dass ein Antikörper gegen das Peptid einen
Immunkomplex mit einem GL50-Molekül bildet. Bevorzugte, von dem
antigenen Peptid umfasste Epitope sind Regionen von GL50, die sich
an der Oberfläche
des Proteins befinden, z.B. hydrophile Regionen. In einem Ausführungsbeispiel
bindet ein Antikörper
im Wesentlichen spezifisch an ein GL50-Molekül. In einem anderen Ausführungsbeispiel
bindet ein Antikörper
spezifisch an ein GL50-Polypeptid.
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Vorzugsweise
umfasst das antigene Peptid mindestens etwa 10 Aminosäurereste,
bevorzugter mindestens etwa 15 Aminosäurereste, noch bevorzugter
mindestens etwa 20 Aminosäurereste,
und am meisten bevorzugt mindestens etwa 30 Aminosäurereste.
Bevorzugte, von dem antigenen Peptid umfasste Epitope, sind Regionen
eines GL50-Polypeptids, die sich an der Oberfläche des Proteins befinden,
z.B. hydrophile Regionen, und die spezifisch für ein GL50-Polypeptid sind.
In einem Ausführungsbeispiel
können
solche Epitope spezifisch für
ein GL50-Polypeptid von einer Spezies sein, wie zum Beispiel von
der Maus oder vom Menschen (d.h. ein antigenes Peptid, das eine
Region eines GL50-Polypeptids umfasst, die nicht über verschiedene
Arten hinweg konserviert ist, wird als Immunogen verwendet; solche
nicht konservierten Reste können
mittels eines Alignments wie hierin vorgesehen bestimmt werden).
Eine gewöhnliche
Hydrophobizitätsanalyse
des GL50-Polypeptids kann ausgeführt
werden, um hydrophile Regionen zu identifizieren.
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Ein
GL50-Immunogen wird typischerweise verwendet, um durch das Immunisieren
eines geeigneten Individuums (z.B. Kaninchen, Ziege, Maus oder ein
anderes Säugetier)
mit dem Immunogen Antikörper
herzustellen. Ein geeignetes immunogenes Präparat kann zum Beispiel ein
rekombinant exprimiertes GL50-Polypeptid oder ein chemisch synthetisiertes
GL50-Petid enthalten. Das Präparat
kann zudem ein Adjuvans enthalten, wie zum Beispiel das komplette
oder inkomplette Freund'sche
Adjuvans oder ein ähnliches
immunstimulatorisches Agens. Die Immunisierung eines geeigneten
Individuums mit einem immunogenen GL50-Präparat induziert eine polyklonale
Antikörperantwort
gegen GL50.
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Dementsprechend
betrifft ein anderer Aspekt der Erfindung Antikörper gegen GL50. Polyklonale
Antikörper
gegen GL50-können
wie vorstehend beschrieben durch das Immunisieren eines geeigneten
Individuums mit einem GL50-Immunogen hergestellt werden. Der anti-GL50-Antikörper-Titer
in dem immunisierten Individuum kann im Zeitablauf durch gewöhnliche
Verfahren kontrolliert werden, wie zum Beispiel durch das immunologische
Nachweisverfahren "ELISA" (Enzyme Linked Immunosorbent
Assay), bei dem ein immobilisiertes GL50-Polypeptid verwendet wird.
Falls gewünscht,
kann das gegen ein GL50-Polypeptid gerichtete Antikörpermolekül von dem
Säugetier
isoliert (z.B. von dem Blut) und weiter gereinigt werden, wobei
wohl bekannte Verfahren verwendet werden, wie zum Bespiel eine Protein-A-Chromatographie,
um die IgG-Fraktion zu erhalten. An einem geeigneten Zeitpunkt nach
der Immunisierung, z.B. wenn die anti-GL50-Antikörper-Titer am höchsten sind,
können
dem Individuum Antikörper-produzierende
Zellen entnommen werden, die zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern verwendet
werden, wobei gewöhnliche
Verfahren zum Einsatz kommen, wie zum Beispiel die Hybridomtechnik,
ursprünglich
beschrieben von Kohler und Milstein (1975) Nature 256:495-497 (siehe
auch Brown et al. (1981) J. Immunol 127:539-46; Brown et al. (1980)
J. Biol. Chem. 255:4980-83; Yeh et al. (1976) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 76:2927-31; und Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29:269-75),
die etwas jüngere
Human-Hybridomtechnik mit humanen B-Zellen (Kozbor et al. (1983)
Immunol. Today 4:72), die EBV-Hybridomtechnik
(Cole et al. (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.
Liss, Inc., S. 77-96) oder die Trioma-Technologie. Die Technologie
zur Herstellung von monoklonalen Antikörper-Hybridomen ist wohl bekannt (siehe allgemein
Kenneth, R. H. in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological
Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); Lerner,
E. A. (1981) Yale J. Biol. Med. 54:387-402; Gefter, M. L. et al.
(1977) Somatic Cell Genet., 3:231-36). Kurz gesagt, eine immortale Zelllinie
(typischerweise ein Myelom) wird mit Lymphozyten (typischerweise
Splenozyten) von einem Säugetier fusioniert,
das mit einem GL50-Immunogen der vorstehend beschriebenen Art immunisiert
worden ist, und die Kulturüberstände der
resultierenden Hybridomzellen werden gescreent, um ein Hybridom
zu identifizieren, das einen monoklonalen Antikörper herstellt, der spezifisch
an ein GL50-Polypeptid bindet.
-
Man
kann ein beliebiges der vielen wohl bekannten Protokolle, die für die Fusionierung
von Lymphozyten mit immortalisierten Zelllinien verwendet werden,
zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers gegen GL50 einsetzen
(siehe z.B. Galfre, G. et al. (1977) Nature 266:55052; Gefter et
al. (1977) supra; Lerner (1981) supra; Kenneth, Monoclonal Antibodies,
supra). Außerdem
wird dem Durchschnittsfachmann klar sein, dass es viele Variationen
dieser Verfahren gibt, die ebenfalls dienlich wären. Typischerweise stammt
die immortale Zelllinie (z.B. eine Myelomzelllinie) von derselben
Säugetierspezies
ab wie die Lymphozyten. Zum Beispiel können murine Hybridome hergestellt
werden, indem man mit einem erfindungsgemäßen immunogenen Präparat immunisierte
Lymphozyten von einer Maus mit einer immortalisierten Zelllinie
fusioniert. Bevorzugte immortale Zelllinien sind Myelomzelllinien
von der Maus, die sensitiv gegenüber
Kulturmedien sind, die Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthalten
("HAT-Medium"). Als Fusionspartner
gemäß den gewöhnlichen
Verfahren kann man eine beliebige der vielen Myelomzelllinien verwenden,
z.B. die Myelomlinien P3-NS1/1Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 oder Sp2/O-Ag14.
Diese Myelomlinien sind von der "American
Type Culture Collection" (ATCC),
Rockville, Md. erhältlich
Typischerweise werden HAT-sensitive
Myelomzellen von der Maus unter Verwendung von Polyethylenglykol
(PEG) mit Splenozyten von der Maus fusioniert. Hybridomzellen, die
aus der Fusion resultieren, werden dann unter Verwendung des HAT-Mediums
ausgewählt,
das nicht-fusionierte und leistungsunfähig fusionierte Myelomzellen
tötet (nicht-fusionierte
Splenozyten sterben nach einigen Tagen, da sie nicht transformiert
worden sind). Hybridomzellen, die einen erfindungsgemäßen monoklonalen
Antikörper herstellen,
werden durch Screenen der Hybridomkulturüberstände auf GL50-Molekül-bindende
Antikörper
detektiert, z.B. unter Verwendung eines gewöhnlichen ELISA-Assays.
-
Als
Alternative zur Herstellung von Hybridomen, die monoklonale Antikörper ausscheiden,
kann ein monoklonaler Antikörper
gegen GL50-identifiziert und isoliert werden, indem man eine rekombinante
kombinatorische Immunglobulinbibliothek (z.B. eine Antikörper-Phage-Display-Bibliothek) mit einem
GL50 screent, um dadurch Mitglieder der Immunglobulinbibliothek,
die ein GL50-Polypeptid
binden, zu isolieren. Kits zum Herstellen und Screenen von Phage-Display-Bibliotheken
sind im Handel erhältlich
(z.B. das Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Katalog Nr.
27-9400-01; und
das Stratagene SurfZAP
TM Phage Display Kit,
Katalog Nr. 240612). Außerdem
findet man Beispiele für
Verfahren und Reagenzien, die besonders geeignet für die Verwendung
zur Herstellung und zum Screenen einer Antikörper-Display-Bibliothek sind,
zum Beispiel in Ladner et al.
US-amerikanisches
Patent Nr. 5,223,409; Kang et al. Internationale Veröffentlichung
Nr.
WO 92/18619 ; Dower
et al. Internationale Veröffentlichung
Nr.
WO 91/17271 ; Winter
et al. Internationale Veröffentlichung
Nr.
WO 92/20791 ; Markland
et al. Internationale Veröffentlichung
Nr.
WO 92/15679 ; Breitling
et al. Internationale Veröffentlichung
Nr.
WO 93/01288 ; McCafferty
et al. Internationale Veröffentlichung
Nr.
WO 92/01047 ; Garrard
et al. Internationale Veröffentlichung
Nr.
WO 92/09690 ; Ladner
et al. Internationale Veröffentlichung
Nr.
WO 90/02809 ; Fuchs
et al. (1991) Biotechnology (NY) 9:1369-1372; Hay et al. (1992)
Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281;
Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992)
J. Mol. Biol. 226:889-896;
Clarkson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) Proc.
Natl. Acad Sci. USA 89:3576-3580; Garrard et al. (1991) Biotechnology
(NY) 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4133-4137;
Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982; und
McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554.
-
Außerdem fallen
auch rekombinante Antikörper
gegen GL50, wie zum Beispiel chimäre und humanisierte monoklonale
Antikörper,
umfassend sowohl humane als auch nicht-humane Anteile, die unter
Verwendung von gewöhnlichen
DNA-Rekombinationstechniken gemacht werden können, unter den Schutzumfang der
Erfindung. Solche chimären
und humanisierten monoklonalen Antikörper können mittels der im Stand der Technik
bekannten DNA-Rekombinationstechniken hergestellt werden, zum Beispiel
unter Verwendung der in den folgenden Schriftstücken beschriebenen Verfahren:
Robinson et al. Internationale Patentveröffentlichung
PCT/US86/02269 ; Akira et al.
Europäische Patentanmeldung 184,187 ;
Taniguchi, M.
Europäische Patentanmeldung
171,496 ; Morrison et al.
Europäische Patentanmeldung
173,494 ; Neuberger et al. PCT-Anmeldung
WO86/01533 ; Cabilly et al.
US-amerikanisches Patent Nr. 4,816,567 ;
Cabilly et al.
Europäische Patentanmeldung
125,023 ; Retter et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu
et al. (1987) Proc. Natl. Acad Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al.
(1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl.
Acad. Sci. 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Cancer Res. 47:999-1005;
Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; and Shaw et al. (1988) J.
Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison, S. L. (1985) Science
229:1202-1207; Oi et al. (1986) Biotechniques 4:214; Winter
US-amerikanisches Patent 5,225,539 ;
Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988)
Science 239:1534; und Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060.
-
Außerdem können humanisierte
Antikörper
nach Standardprotokollen hergestellt werden, wie zum Beispiel jene,
die in dem
US-amerikanischen
Patent 5,565,332 offenbart sind. In einem anderen Ausführungsbeispiel
können
Antikörperketten
oder spezifische Bindungspaarmitglieder hergestellt werden, indem
man Vektoren, die Nukleinsäuremoleküle umfassen,
welche eine Fusion einer Polypeptidkette eines spezifischen Bindungspaarmitglieds
und einer Komponente eines replizierbaren genetischen Displaypakets
codieren, mit Vektoren rekombiniert, die Nukleinsäuremoleküle enthalten,
welche eine zweite Polypeptidkette eines einzelnen Bindungspaarmitglieds
codieren, wobei im Stand der Technik bekannte Verfahren verwendet
werden, z.B. wie jene, die in den
US-amerikanischen
Patenten 5,565,332 ,
5,871,907 oder
5,733,743 beschrieben sind.
Die Verwendung von intrazellulären
Antikörpern,
um die Proteinfunktion in einer Zelle zu inhibieren, ist ebenfalls im
Stand der Technik bekannt (siehe z.B. Carlson, J. R. (1988) Mol.
Cell. Biol. 8:2638-2646; Biocca, S. et al.(1990) EMBO J. 9:101-108;
Werge, T. M. et al. (1990) FERS Lett. 274:193-198; Carlson, J. R.
(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7427-7428; Marasco, W. A. et
al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7889-7893; Biocca, S. et
al. (1994) Biotechnology (NY) 12:396-399; Chen, S-Y. et al. (1994)
Hum. Gene Ther. 5:595-601; Duan, L et al. (1994) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 91:5075-5079; Chen, S-Y. et al. (1994) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 91:5932-5936; Beerli, R. R. et al. (1994) J. Biol. Chem.
269:23931-23936; Beerli, R. R. et al. (1994) Biochem. Biophys. Res.
Commun. 204:666-672; Mhashilkar, A. M. et al. (1995) EMBO J. 14:1542-1551;
Richardson, J. H. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:3137-3141; PCT-Veröffentlichung
Nr.
WO 94/02610 von Marasco
et al.; und PCT-Veröffentlichung
Nr.
WO 95/03832 von
Duan et al.).
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In
einem Ausführungsbeispiel
ist ein Antikörper
zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ein bispezifischer
Antikörper.
Ein bispezifischer Antikörper
hat Bindungsstellen für
zwei unterschiedliche Antigene in einem einzigen Antikörpermolekül. Eine
Antigenbindung kann gleichzeitig oder sequenziell erfolgen. Triome und
Hybridhybridome sind zwei Beispiele für Zelllinien, die bispezifische
Antikörper
sekretieren können.
Beispiele für
bispezifische Antikörper,
die durch Hybridhybride oder Triome hergestellt werden, sind in
dem
US-amerikanischen Patent
4,474,893 offenbart. Bispezifische Antikörper wurden
durch chemische Mittel (Staerz et al. (1985) Nature 314:628, und
Perez et al. (1985) Nature 316:354) und durch Hybridomtechnologie
hergestellt (Staerz und Bevan (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
83:1453, und Staerz und Bevan (1986) Immunol. Today 7:241). Bispezifische
Antikörper
sind auch in dem
US-amerikanischen
Patent 5,959,084 beschrieben. Fragmente von bispezifischen
Antikörpern
sind in dem
US-amerikanischen
Patent 5,798,229 beschrieben.
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Eine
weitere Möglichkeit
zur Produktion von bispezifischen Agenzien ist die Herstellung von
Heterohybridomen mittels Fusion von Hybridomen oder anderen Zellen,
die andersartige Antikörper
herstellen, gefolgt von einer Identifizierung von Klonen, die beide
Antikörper
herstellen und co-assemblieren können.
Ebenso können
sie durch chemische oder genetische Konjugation von kompletten Immunglobulinketten
oder Teilen davon, wie zum Beispiel Fab- und Fv-Sequenzen, hergestellt
werden. Zum Beispiel können
bispezifische Agenzien entwickelt werden, die an den T-Zellrezeptorkomplex,
den B-Zellrezeptorkomplex, CD40, CD40-Liganden, CD2, oder CD45 binden
(neben GL50 oder ICOS).
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Ein
Antikörper
gegen GL50 (z.B. ein monoklonaler Antikörper) kann verwendet werden,
um mittels gewöhnlicher
Verfahren, wie zum Beispiel Affinitätschromatographie oder Immunpräzipitation,
ein GL50-Polypeptid zu isolieren. Antikörper gegen GL50 können die
Reinigung von natürlichen
GL50-Polypeptiden von Zellen und von rekombinant hergestellten,
in Wirtszellen exprimierten GL50-Polypeptiden erleichtern. Außerdem kann
ein Antikörper
gegen GL50 verwendet werden, um ein GL50-Polypeptid zu detektieren
(z.B. in einem zellulärem
Lysat oder Zellrückstand).
Außerdem
können
Antikörper
gegen GL50 verwendet werden, um die Interaktion zwischen GL50 und
einem Liganden oder Bindungspartner zu hemmen. Die Detektion kann
durch das Koppeln (d.h. durch eine physikalische Verbindung) des
Antikörpers
mit einer detektierbaren Substanz erleichtert werden. Dementsprechend
ist in einem Ausführungsbeispiel
ein erfindungsgemäßer Antikörper gegen GL50
mit einer detektierbaren Substanz markiert. Beispiele für detektierbare
Substanzen beinhalten verschiedene Enzyme, prosthetische Gruppen,
fluoreszierende Stoffe, lumineszierende Stoffe und radioaktive Stoffe. Beispiele
für geeignete
Enzyme beinhalten Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, β-Galactosidase oder
Acetylcholinesterase; Beispiele für geeignete prosthetische Gruppenkomplexe
beinhalten Streptavidin-Biotin und Avidin-Biotin; Beispiele für geeignete
fluoreszierende Stoffe beinhalten Umbelliferon, Fluorescein, Fluoresceinisothiocyanat,
Rhodamin, Dichlorotriazinylaminofluorescein, Dansylchlorid oder
Phycoerythrin; ein Beispiel für
einen lumineszierenden Stoff beinhaltet Luminol; und Beispiele für geeignete
radioaktive Stoffe beinhalten 125I, 131I, 35S und 3H.
-
Noch
ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft Antikörper gegen GL50, die durch
einen Prozess erhältlich
sind, umfassend:
- (a) Immunisieren eines Tiers
mit einem immunogenen GL50-Polypeptid oder einem immunogenen Teil
davon, der spezifisch für
ein GL50-Polypeptid ist; und
- (b) Isolieren von Antikörpern,
die spezifisch an ein GL50-Polypeptid binden, von dem Tier.
-
IV. Rekombinante Expressionsvektoren und
Wirtszellen
-
Ein
anderer Aspekt der Erfindung betrifft Vektoren, vorzugsweise Expressionsvektoren,
die eine Nukleinsäure
enthalten, die ein Protein der GL50-Familie (oder einen Teil davon)
codiert. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff "Vektor" ein Nukleinsäuremolekül, das fähig ist,
eine andere Nukleinsäure
zu tragen, mit der es verknüpft
wurde. Ein Vektortyp ist ein „Plasmid", was eine zirkuläre doppelsträngige DNA-Schleife
bezeichnet, in die zusätzliche
DNA-Segmente ligiert
werden können.
Ein weiterer Vektortyp ist ein viraler Vektor, wobei zusätzliche
DNA-Segmente in
das virale Genom ligiert werden können. Bestimmte Vektoren können in
einer Wirtszelle, in die sie eingebracht worden sind, autonom replizieren
(z.B. Bakterienvektoren mit bakteriellem Replikationsursprung und
episomale Säugervektoren).
Andere Vektoren (z.B. nicht-episomale Säugervektoren) werden beim Einbringen
in die Wirtszelle in das Genom einer Wirtszelle integriert und dadurch
zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert. Zudem können bestimmte Vektoren die
Expression von Genen, mit denen sie funktionell verbunden sind,
steuern. Solche Vektoren werden als "Expressionsvektoren" bezeichnet. Im Allgemeinen haben Expressionsvektoren,
die für
DNA-Rekombinationstechniken
geeignet sind, oft die Form von Plasmiden. In der vorliegenden Beschreibung
können "Plasmid" und "Vektor" austauschbar verwendet
werden, da das Plasmid die am häufigsten
verwendete Vektorform ist. Die Erfindung soll jedoch diese anderen
Formen von Expressionsvektoren, wie zum Beispiel virale Vektoren
(z.B. replikationsdefiziente Retroviren, Adenoviren und adenoverwandte
Viren), die ähnliche
Funktionen ausüben,
beinhalten.
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Die
erfindungsgemäßen rekombinanten
Expressionsvektoren umfassen eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in einer Form, die für die Expression
der Nukleinsäure
in einer Wirtszelle geeignet ist, was bedeutet, dass die rekombinanten
Expressionsvektoren eine oder mehrere regulatorische Sequenzen beinhalten,
die auf der Grundlage der für
die Expression zu verwendenden Wirtszellen ausgewählt werden,
und die mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz funktionell verbunden
sind. In einem rekombinanten Expressionsvektor soll der Begriff "funktionell verbunden" bedeuten, dass die
Nukleotidsequenz von Interesse mit regulatorischen Sequenzen in
einer Weise verbunden ist, welche die Expression der Nukleotidsequenz
gestattet (z.B. in einem in vitro Transkriptions-/Translationssystem
oder in einer Wirtszelle, wenn der Vektor in die Wirtszelle eingebracht
wird). Der Begriff "regulatorische
Sequenz" soll Promotoren,
Enhancer und sonstige Expressionssteuerungselemente (z.B. Polyadenylierungssignale)
beinhalten. Solche regulatorischen Sequenzen sind zum Beispiel in
Goeddel (1990) Methods Enzymol. 185:3-7 beschrieben. Regulatorische
Sequenzen beinhalten jene, welche die konstitutive Expression einer
Nukleotidsequenz in vielen Arten von Wirtszellen steuern, und jene, welche
die Expression der Nukleotidsequenz nur in bestimmten Wirtszellen
steuern (z.B. in gewebespezifischen regulatorischen Sequenzen).
Dem Fachmann auf diesem Gebiet wird klar sein, dass die Gestaltung
eines Expressionsvektors von solchen Faktoren abhängen kann
wie zum Beispiel wie zum Beispiel die Wahl der zu transformierenden
Wirtszelle, der gewünschte
Expressionsgrad von Proteinen, etc. Die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren
können
in Wirtszellen eingebracht werden, um dadurch Proteine oder Peptide
herzustellen, einschließlich
Fusionsproteine oder Fusionspeptide, die von Nukleinsäuren gemäß der hierin
enthaltenen Beschreibung codiert sind (z.B. Proteine der GL50-Familie,
Mutantenformen von GL50-Polypeptiden oder Teile davon, Fusionsproteine,
etc.).
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In
einem Ausführungsbeispiel
der Erfindung können
Vektoren konstruiert werden, die nur eine Transmembrandomäne oder
intrazelluläre
Domäne
eines GL50-Moleküls
umfassen. Solche Konstrukte können
verwendet werden, um z.B. intrazelluläre Signalübertragung über GL50-Moleküle zu modulieren
und als dominant-negative Mutanten zu wirken.
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Die
erfindungsgemäßen rekombinanten
Expressionsvektoren können
für die
Expression von GL50-Polypeptiden in prokaryotischen oder eukaryotischen
Zellen ausgelegt sein. Zum Beispiel können GL50-Polypeptide in bakteriellen
Zellen exprimiert werden, wie zum Beispiel E. coli, Insektenzellen
(unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren), Hefezellen
oder Säugerzellen.
Geeignete Zellen sind in Goeddel (1990) supra näher erörtert. Alternativ kann der
rekombinante Expressionsvektor in vitro transkribiert und translatiert
werden, zum Beispiel unter Verwendung von regulatorischen T7-Promotorsequenzen
und T7-Polymerase.
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Die
Expression von Proteinen in Prokaryoten wird am häufigsten
in E. coli ausgeführt,
und zwar mit Vektoren, die konstitutive oder induzierbare Promotoren
enthalten, welche die Expression von Fusionsproteinen oder von Nicht-Fusionsproteinen
leiten. Fusionsvektoren fügen
eine Anzahl von Aminosäuren
einem darin codierten Protein bei, gewöhnlich zu dem Amino-Ende des
rekombinanten Proteins. Solche Fusionsvektoren haben typischerweise
drei Aufgaben: 1) die Verstärkung
der Expression von rekombinantem Protein; 2) die Erhöhung der
Löslichkeit
des rekombinanten Proteins; und 3) die Unterstützung der Reinigung des rekombinanten
Proteins durch Wirkung als Ligand bei der Affinitätsreinigung.
Bei Fusions-Expressionsvektoren wird oft eine proteolytische Spaltstelle
an der Verbindungsstelle der Fusionseinheit und des rekombinanten
Proteins eingebracht, so dass die Trennung des rekombinanten Proteins
von der Fusionseinheit nach der Reinigung des Fusionsproteins möglich ist.
Solche Enzyme und ihre entsprechenden Erkennungssequenzen beinhalten Faktor
Xa, Thrombin und Enterokinase. Übliche
Fusionsexpressionsvektoren umfassen pGEX (Pharmacia Biotech Inc;
Smith, D. B. und Johnson, K. S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New
England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT 5 (Pharmacia, Piscataway,
NJ), bei denen Glutathion-S-Transferase
(GST), Maltose E-bindendes Protein bzw. Protein A an das rekombinante
Zielprotein fusioniert wird.
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Gereinigte
Fusionsproteine können
zum Beispiel therapeutisch verwendet werden, in GL50-Aktivitätsassays
(z.B. direkte Assays oder kompetitive Assays, die nachstehend detailliert
beschrieben sind), oder zur Erzeugung von Antikörpern, die spezifisch für GL50-Polypeptide
sind.
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Beispiele
für geeignete
induzierbare Nicht-Fusions-Expressionsvektoren aus E. coli umfassen
pTrc (Amann et al. (1988) Gene 69:301-315) und pET 11d (Studier
et al. (1990) Methods Enzymol. 185:60-89). Die Zielgenexpression
vom pTrc- Vektor beruht auf der Transkription durch Wirts-RNA-Polymerase von einem
Hybrid-trp-lac-Fusionspromotor. Die Zielgenexpression vom pET11d-Vektor
beruht auf der Transkription von einem T7-gn10-lac-Fusions-Promotor,
die von einer coexprimierten viralen RNA-Polymerase (T7gn1) vermittelt wird.
Diese virale Polymerase wird von den Wirtsstämmen BL21 (DE3) oder HMS174
(DE3) von einem residenten Prophagen induziert, der ein T7 gn1-Gen
unter der Transkriptionssteuerung des lacUV 5-Promotors trägt.
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Eine
Strategie zur Maximierung der Expression des rekombinanten Polypeptids
in E. coli besteht darin, das Polypeptid in ein Wirtsbakterium zu
exprimieren, das eine beeinträchtigte
Kapazität
zur proteolytischen Spaltung des rekombinanten Polypeptids aufweist
(Gottesman, S. (1990) Methods EnzymoL 185:119-128). Eine weitere
Strategie besteht darin, die Nukleinsäuresequenz der in einen Expressionsvektor
zu inserierenden Nukleinsäure
zu verändern,
so dass die einzelnen Codons für
jede Aminosäure
jene sind, die vorzugsweise in E. coli verwendet werden (Wada et
al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). Diese Veränderung
der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen
erfolgt durch gewöhnliche
DNA-Synthesetechniken.
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In
einem anderen Ausführungsbeispiel
ist der GL50-Expressionsvektor ein Hefeexpressionsvektor. Beispiele
für Vektoren
zur Expression in der Hefe S. cerevisiae beinhalten pYepSec1 (Baldari
et al. (1987) EMBO J. 6:229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz (1982)
Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54:113-123),
pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA), und picZ (Invitrogen
Corp, San Diego, CA).
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Alternativ
kann ein GL50-Polypeptid in Insektenzellen unter Verwendung von
Baculovirus-Expressionsvektoren
exprimiert werden. Baculovirus-Vektoren, die zur Expression von
Polypeptiden in gezüchteten
Insektenzellen (z.B. Sf9-Zellen) verfügbar sind, beinhalten die pAc-Reihen
(Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) und die pVL-Reihen
(Lucklow, V. A., und Summers, M. D. (1989) Virology 170:31-39).
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In
noch einem anderen Ausführungsbeispiel
wird das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül in Säugetierzellen
mit einem Säugetier-Expressionsvektor
exprimiert. Beispiele für
Säugetier-Expressionsvektoren beinhalten
pMex-NeoI, pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329:840) und pMT2PC (Kaufman
et al. (1987) EMBO J. 6:187-195). Bei der Verwendung in Säugetierzellen
werden die Steuerfunktionen des Expressionsvektors oft durch virale
regulatorische Elemente gewährleistet.
Gemeinhin verwendete Promotoren stammen zum Beispiel aus Polyoma,
Adenovirus2, Cytomegalievirus und Simian Virus 40. Für weitere
geeignete Expressionssysteme für
prokaryotische und eukaryotische Zellen siehe die Kapitel 16 und
17 aus Sambrook, J. et al. Molecular Cloning: A Laborstory Manual.
2. Auflage, Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor Laborstory
Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
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In
einem anderen Ausführungsbeispiel
kann der rekombinante Säugetier-Expressionsvektor
die Expression der Nukleinsäure
vorzugsweise in einem bestimmten Zelltyp steuern (z.B. werden gewebespezifische regulatorische
Elemente zur Expression der Nukleinsäure verwendet). Gewebespezifische
regulatorische Elemente sind im Stand der Technik bekannt. Nicht
einschränkende
Beispiele für
geeignete gewebespezifische Promotoren beinhalten den Albuminpromotor
(leberspezifisch; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1:268-277), lymphoid-spezifische
Promotoren (Calame and Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275), insbesondere
Promotoren von T-Zellrezeptoren
(Winoto und Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733) und Immunglobulinen
(Banerji et al. (1983) Cell 33:729-740; Queen und Baltimore (1983)
Cell 33:741-748), neuronspezifische Promotoren (z.B. der Neurofilament-Promotor;
Byrne und Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477), pankreasspezifische
Promotoren (Edlund et al. (1985) Science 230:912-916), und milchdrüsenspezifische Promotoren
(z.B. Milchserum-Promotor;
US-amerikanisches
Patent Nr. 4,873,316 und
europäische Patentanmeldungsveröffentlichung
Nr. 264,166 ). Entwicklungsregulierte Promotoren sind ebenfalls
umfasst, zum Beispiel die Maus-hox-Promotoren (Kessel und Gruss
(1990) Science 249:374-379) und der α-Fetoprotein-Promotor (Campes
und Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546).
-
Außerdem sind
induzierbare regulatorische Systeme zur Verwendung in Säugetierzellen
im Stand der Technik bekannt, zum Beispiel Systeme, in denen die
Genexpression durch Schwermetallione (siehe z.B. Mayo et al. (1982)
Cell 29:99-108; Brinster et al. (1982) Nature 296:39-42; Searle et al.
(1985) Mol. Cell. Biol. 5:1480-1489), Hitzeschock (siehe z.B. Nouer
et al. (1991) in Heat Shock Response, Nouer, L., ed. CRC, Boca Raton,
FL, S. 167-220), Hormone (siehe z.B. Lee et al. (1981) Nature 294:228-232;
Hynes et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2038-2042; und
McCafferty et al. (1987) Nature 329:734-736; Israel und Kaufman (1989)
Nucleic Acids Res. 17:2589-2604;
und PCT-Veröffentlichung
Nr.
WO 93/23431 ), FK506-verwandte
Moleküle
(siehe z.B. PCT-Veröffentlichung
Nr.
WO 94/18317 ) oder
Tetrazycline gesteuert wird (Gossen, M. und Bujard, H. (1992) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551; Gossen, M. et al. (1995) Science
268:1766-1769; PCT-Veröffentlichung
Nr.
WO 94/29442 ; und
PCT-Veröffentlichung
Nr.
WO 96/01313 ). Dementsprechend
sieht die Erfindung in einem anderen Ausführungsbeispiel einen rekombinanten
Expressionsvektor vor, in dem eine GL50-DNA funktionell mit einem
induzierbaren eukaryotischen Promotor verbunden ist, was eine induzierbare Expression
eines GL50-Polypeptids in eukaryotischen Zellen ermöglicht.
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Ferner
stellt die Erfindung einen rekombinanten Expressionsvektor bereit,
der ein erfindungsgemäßes DNA-Molekül umfasst,
das in Antisense-Richtung in den Expressionsvektor kloniert ist.
Das heißt,
das DNA-Molekül
ist funktionell derart mit einer regulatorischen Sequenz verbunden,
dass die Expression (durch Transkription des DNA-Moleküls) eines
RNA-Moleküls
möglich
ist, das antisense zu der GL50-mRNA ist. Man kann regulatorische
Sequenzen auswählen,
die funktionell mit einem Nukleinsäuremolekül verbunden sind, das in Antisense-Richtung
kloniert ist, welche die kontinuierliche Expression des Antisense-RNA-Moleküls in einer
Vielfalt von Zelltypen leiten, zum Beispiel virale Promotoren und/oder
Enhancer, oder man kann regulatorische Sequenzen auswählen, welche
die konstitutive, gewebespezifische oder zelltypspezifische Expression
einer Antisense- RNA leiten. Der Antisense-Expressionvektor kann
in Form eines rekombinanten Plasmids, Phagemids oder attenuierten
Virus vorliegen, in dem Antisense-Nukleinsäuren unter der Kontrolle einer
hochwirksamen regulatorischen Region produziert werden, deren Aktivität durch
den Zelltyp bestimmt werden kann, in den der Vektor eingebracht
worden ist. Für
eine Erläuterung
der Regulation der Genexpression mittels Antisense-Genen wird auf
Weintraub, H., et al., Antisense-RNA as a molecular tool for genetic
analysis, Reviews- Trends in Genetics, Bd. 1(1) 1986 hingewiesen.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Wirtszellen, in die ein erfindungsgemäßer rekombinanter
Expressionsvektor eingebracht worden ist. Die Begriffe 'Wirtszellen" und „rekombinante
Wirtszelle" werden
hierin untereinander austauschbar verwendet. Selbstverständlich betreffen
diese Begriffe nicht nur die jeweilige Zielzelle, sondern auch die
Nachkommen oder potenziellen Nachkommen dieser Zelle. Da in aufeinanderfolgenden
Generationen aufgrund von Mutation oder Umwelteinflüssen bestimmte
Modifikationen auftreten können, sind
diese Nachkommen nicht unbedingt mit der Parentalzelle identisch,
sind jedoch immer im Umfang des Begriffs, wie hierin verwendet,
enthalten.
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Eine
Wirtszelle kann eine prokaryotische oder eukaryotische Zelle sein.
Zum Beispiel kann eine GL5-Polypeptid in Bakterienzellen, wie zum
Beispiel E. coli, Insektenzellen, Hefezellen oder Säugetierzellen (wie
zum Beispiel Chinesische Hamster-Quarzellen (CHO) oder COS-Zellen)
exprimiert werden. Andere geeignete Wirtszellen sind dem Fachmann
auf diesem Gebiet bekannt.
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Vektor-DNA
lässt sich
in prokaryotische oder eukaryotische Zellen über herkömmliche Transformations- oder
Transfektionstechniken einbringen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung
sollen die Begriffe "Transformation" und "Transfektion" eine Vielzahl von
im Stand der Technik bekannten Verfahren zum Einbringen von fremder
Nukleinsäure
(z.B. DNA) in eine Wirtszelle beinhalten, einschließlich Calciumphosphat-
oder Calciumchlorid-Copräzipitation,
DEAE-Dextran-vermittelte
Transfektion, Lipofektion oder Elektroporation. Geeignete Verfahren
zur Transformation oder Transfektion von Wirtszellen finden sich
in Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laborstory Manual. 2.
Auflage., Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor Laborstory Press,
Cold Spring Harbor, NY, 1989), und anderen Labor-Handbüchern.
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Von
der stabilen Transfektion von Säugetierzellen
ist bekannt, dass je nach verwendetem Expressionsvektor und verwendeter
Transfektionstechnik möglicherweise
nur ein kleiner Teil der Zellen die fremde DNA in ihr Genom integriert.
Zur Identifizierung und Selektion dieser Integranten wird gewöhnlich ein
Gen, das einen selektierbaren Marker (z.B. Resistenz gegen Antibiotika)
codiert, zusammen mit dem Gen von Interesse in die Wirtszellen eingebracht
Bevorzugte selektierbare Marker umfassen solche, die Resistenz gegen
Medikamente, wie G418, Hygromycin und Methotrexat, verleihen. Eine
Nukleinsäure,
die einen selektierbaren Marker kodiert, kann in eine Wirtszelle
auf dem gleichen Vektor eingebracht werden, wie jene, die ein GL50-Polypeptid kodiert,
oder kann auf einem gesonderten Vektor eingebracht werden. Zellen,
die mit der eingebrachten Nukleinsäure stabil transfiziert worden
sind, können
durch Medikamentenselektion identifiziert werden (z.B. überleben
Zellen, die den selektierbaren Marker integriert haben, wohingegen
die anderen Zellen absterben).
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Eine
erfindungsgemäße Wirtszelle,
wie zum Beispiel eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle
in Kultur, kann zur Herstellung (d.h. zur Expression) eines GL50-Polypeptids
verwendet werden. Dementsprechend stellt die Erfindung ferner Verfahren
zur Produktion eines GL50-Polypeptids unter Verwendung der erfindungsgemäßen Wirtszellen
bereit. In einem Ausführungsbeispiel
umfasst das Verfahren die Anzucht der erfindungsgemäßen Wirtszelle
(in die ein rekombinanter Expressionsvektor, der ein GL50-Polypeptid
codiert, eingebracht worden ist) in einem geeigneten Medium, bis
das GL50-Polypeptid hergestellt worden ist. In einem anderen Ausführungsbeispiel
umfasst das Verfahren das Isolieren eines GL50-Polypeptids von dem
Medium oder der Wirtszelle.
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Bestimmte
erfindungsgemäße Wirtszellen
können
auch zur Herstellung von nicht-humanen transgenen Tieren verwendet
werden. In einem Ausführungsbeispiel
ist eine erfindungsgemäße Wirtszelle
eine befruchtete Eizelle oder eine embryonale Stammzelle, in die
GL50-codierende Sequenzen eingebracht worden sind. Diese Wirtszellen
können
dann verwendet werden, um nicht-humane
transgene Tiere herzustellen, in denen exogene GL50-Sequenzen in
ihr Genom eingebracht worden sind, oder um homologe rekombinante
Tiere herzustellen, in denen endogene GL50-Sequenzen verändert worden
sind. Solche Tiere sind nützlich,
um die Funktion und/oder die Aktivität eines GL50-Polypeptids zu
untersuchen, und um Modulatoren der GL50-Aktivität zu identifizieren und/oder
zu bewerten. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist ein "transgenes Tier" ein nichthumanes
Tier, vorzugsweise ein Säugetier,
bevorzugter ein Nagetier wie zum Beispiel eine Ratte oder eine Maus,
in dem eine oder mehrere der Zellen des Tiers ein Transgen enthalten.
Andere Beispiele für
transgene Tiere beinhalten nicht-humane Primaten, Schafe, Hunde,
Kühe, Ziegen,
Hühner,
Amphibien, etc. Ein Transgen ist eine exogene DNA, die in das Genom
einer Zelle integriert ist, aus der sich ein transgenes Tier entwickelt,
und die in dem Genom des vollentwickelten Tiers bleibt, wo es die
Expression eines codierten Genprodukts in einem oder mehreren Zelltypen
oder Geweben des transgenen Tiers steuert. Im Rahmen der vorliegenden
Erfindung ist ein "homologes
rekombinantes Tier" ein
nicht-humanes Tier, vorzugsweise ein Säugetier, bevorzugter eine Maus,
in dem ein endogenes GL50-Gen durch eine homologe Rekombination
zwischen dem endogenen Gen und einem in eine Zelle des Tiers eingebrachten
exogenen DNA-Molekül
verändert
worden ist, z.B. eine Embryozelle des Tiers, vor der Entwicklung
des Tiers.
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Ein
erfindungsgemäßes transgenes
Tier kann geschaffen werden, indem man eine GL50-codierende Nukleinsäure in den
männlichen
Pronukleus einer befruchteten Eizelle einbringt, z.B. durch Mikroinjektion,
retrovirale Infektion, und die Eizelle in einem pseudoschwangeren
weiblichen Pflegetier sich entwickeln lässt. Die mGL50-1-Sequenz von
SEQ ID Nr. 1, 3 oder 5 kann als Transgen in das Genom eines nicht-humanen
Tiers eingebracht werden. Alternativ kann ein nicht-humanes Homologon
eines hGL50-Gens, zum Beispiel GL50-Gen von einer Maus oder Ratte,
als Transgen verwendet werden. Alternativ kann ein Homologon eines GL50-Gens,
wie zum Beispiel ein anderes Mitglied der GL50-Familie, mittels
Hybridisierung mit DNA-Sequenzen von SEQ ID Nr. 1, 3 oder 5 der
GL50-Familie (in vorstehendem Kapitel I näher beschrieben) isoliert und als
Transgen verwendet werden. Intronische Sequenzen und Polyadenylierungssignale
können
ebenfalls in dem Transgen enthalten sein, um die Effizienz der Expression
des Transgens zu erhöhen.
Eine oder mehrere gewebespezifische regulatorische Sequenzen können funktionell
mit einem GLÖL50-Transgen
verbunden sein, um die Expression eines GL50-Polypeptids an bestimmten
Zellen zu leiten. Verfahren zum Herstellen von transgenen Tieren
mittels Embryomanipulation und Mikroinjektion, insbesondere Tiere
wie Mäuse,
sind im Stand der Technik üblich
geworden und sind zum Beispiel in den
US-amerikanischen
Patenten Nr. 4,736,866 und
4,870,009 ,
beide von Leder et al., in dem
US-amerikanischen
Patent Nr. 4,873,191 von Wagner et al., und in Hogan, B., Manipulating
the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring
Harbor, N.Y., 1986) beschrieben. Ähnliche Verfahren werden für die Herstellung
von anderen transgenen Tieren verwendet. Ein transgenes Foundertier
kann auf Basis der Anwesenheit eines GL50-Transgens in seinem Genom und/oder
der Expression von GL50mRNA in Geweben oder Zellen des Tiers identifiziert
werden. Ein transgenes Foundertier kann dann verwendet werden, um
weitere Tiere, die das Transgen tragen, zu züchten. Außerdem können transgene Tiere, die ein
Transgen tragen, das ein GL50-Polypeptid codiert, zu weiteren transgenen
Tieren, die andere Transgene tragen, herangezüchtet werden.
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Zur
Erzeugung eines homolog rekombinierten Tiers wird ein Vektor hergestellt,
der zumindest einen Abschnitt eines GL50-Gens enthält, in den
eine Deletion, Addition oder Substitution eingebracht worden ist, um
das GL50-Gen zu verändern,
z.B. funktionell zu disrumpieren. Das GL50-Gen kann ein humanes
Gen sein (z.B. die SEQ ID Nr. 1, 3 oder 5), aber vorzugsweise ist
es ein nicht-humanes Homologon eines hGL50-Gens (z.B. eine cDNA,
die durch stringente Hybridisierung mit der Nukleotidsequenz von
SEQ ID Nr. 1, 3 oder 5 isoliert worden ist). Ein GL50-Gen von der
Maus kann zum Beispiel verwendet werden, um einen homologen rekombinanten
Vektor zu erstellen, der geeignet ist, ein endogenes GL50-Gen in
dem Genom der Maus zu verändern.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
ist der Vektor derart ausgestaltet, dass das endogene GL50-Gen bei
homologer Rekombination funktionell disrumpiert ist (d.h. nicht
länger
ein funktionelles Protein codiert, auch als "Knockout"-Vektor bezeichnet). Der Vektor kann
alternativ derart ausgestaltet sein, dass das endogene GL50-Gen
bei homologer Rekombination mutiert oder anderweitig verändert ist,
jedoch weiterhin das funktionelle Protein codiert (z.B. kann der
regulatorische Upstream-Bereich derart verändert sein, dass dadurch die
Expression des endogenen GL50-Polypeptids verändert wird). Der veränderte Abschnitt
des GL50-Gens ist im homologen Rekombinationsvektor an seinem 5'- und 3'-Ende von zusätzlicher Nukleinsäure des
GL50-Gens flankiert, die eine homologe Rekombination zwischen dem
exogenen GL50-Gen, das von dem Vektor getragen wird, und einem endogenen
GL50-Gen in einer
embryonalen Stammzelle ermöglicht.
Die zusätzliche
flankierende GL50-Nukleinsäure
ist für
eine erfolgreiche homologe Rekombination mit dem endogenen Gen hinreichend
lang. Typischerweise enthält
der Vektor mehrere Kilobasen flankierende DNA (sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende) (siehe z.B.
Thomas, K. R. und Capecchi, M. R. (1987) Cell 51:503 für eine Beschreibung
von homologen Rekombinationsvektoren). Der Vektor wird in eine embryonale
Stammzellenlinie eingebracht (z.B. durch Elektroporation), und Zellen,
in denen das eingebrachte GL50-Gen mit dem endogenen GL50-Gen homolog
rekombiniert worden ist, werden selektiert (siehe z.B. Li, E. et
al. (1992) Cell 69:915). Die selektierten Zellen werden dann in
eine Blastozyste eines Tiers (z.B. eine Maus) injiziert, um Aggregationschimäre zu bilden
(siehe z.B. Bradley, A. in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:
A Practical Approach, E.J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987) S.
113-152). Ein chimärer
Embryo kann dann in ein geeignetes pseudoschwangeres weibliches
Pflegetier implantiert und ausgetragen werden. Das Beherbergen der
Nachkommenschaft der homolog rekombinierten DNA in ihren Keimzellen
kann verwendet werden, um Tiere zu züchten, in denen alle Zellen
des Tiers durch Keimbahntransmission des Transgens die homolog rekombinierte
DNA enthalten. Verfahren zum Erzeugen von homologen Rekombinationsvektoren
und homologen rekombinanten Tieren sind in Bradley, A. (1991) Current
Opinion in Biotechnology 2:823-829 und in den Internationalen PCT-Veröffentlichungen
Nr.
WO 90/11354 von
Le Mouellec et al.;
WO 91/01140 von
Smithies et al.;
WO 92/0968 von
Zijlstra et al.; und
WO 93/04169 von
Berns et al. näher
beschrieben.
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Zusätzlich zu
den vorstehenden Erläuterungen
wird es dem Fachmann auf diesem Gebiet klar sein, dass andere im
Stand der Technik bekannte Ansätze
für die
homologe Rekombination für
die vorliegende Erfindung Anwendung finden können. Enzymgestützte ortsspezifische
Integrationssysteme sind im Stand der Technik bekannt und können eingesetzt
werden, um ein DNA-Molekül an einer
vorherbestimmten Stelle in ein zweites DNA-Zielmolekül zu integrieren.
Beispiel für
solche enzymgestützte
Integrationssysteme beinhalten das Zielsystem Cre Rekombinase/lox
(z.B. wie in Baubonis, W. und Sauer, B. (1993) Nucl. Acids Res. 21:2025-2029;
und Fukushige, S. und Sauer, B. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:7905-7909 beschrieben) und das Zielsystem Flp-Rekombinase (FRT-Sequenz) (z.B. wie
in Dang, D. T. und Perrimon, N. (1992) Dev. Genet. 13:367-375; und Fiering,
S. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8469-8473 beschrieben).
Tetrazyklinregulierte induzierbare homologe Rekombinationssysteme,
wie sie zum Beispiel in der PCT-Veröffentlichung
Nr.
WO 94/29442 und
der PCT-Veröffentlichung
Nr.
WO 96/01313 beschrieben
sind, können
ebenfalls verwendet werden.
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In
einem anderen Ausführungsbeispiel
können
zum Beispiel transgene nicht-humane Tiere hergestellt werden, die
selektierte System enthalten, die eine regulierte Expression des
Transgens ermöglichen.
Ein Beispiel für
ein solches System ist das aus dem Bakteriophagen P1 stammende crelloxP
Rekombinasesystem. Für
eine Beschreibung des crelloxP Rekombinasesystems siehe z.B. Lakso
et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232-6236. Ein weiteres
Beispiel für
ein Rekombinasesystem ist das aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae
stammende FLP-Rekombinasesystem (O'Gorman et al. (1991) Science 251:1351-1355.
Wenn ein crelloxP Rekombinasesystem verwendet wird, um die Expression
des Transgens zu regulieren, werden Tiere benötigt, die Transgene enthalten,
welche sowohl das Enzym Cre Rekombinase als auch ein selektiertes
Protein codieren. Solche Tiere können
mittels der Entwicklung von "doppelt" transgenen Tieren
bereitgestellt werden, z.B. Paarung von zwei transgenen Tieren:
eines, das ein Transgen enthält,
das ein selektiertes Protein codiert, und ein anderes, das ein Transgen
enthält,
das eine Rekombinase codiert.
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Klone
von hierin beschriebenen nicht-humanen transgenen Tieren können auch
gemäß den in
Wilmut, I. et al. (1997) Nature 385:810-813 und den Internationalen
PCT-Veröffentlichung
Nr.
WO 97/07668 und
WO 97/07669 beschriebenen
Verfahren hergestellt werden. Kurz gesagt, eine Zelle, z.B. eine
somatische Zelle, von dem transgenen Tier kann isoliert und dazu
gebracht werden, den Wachstumszyklus zu beenden und in die G
o-Phase einzutreten. Die im Ruhezustand befindliche
Zelle kann dann, z.B. mittels elektrischer Impulse, mit einer entkernten
Eizelle eines Tiers derselben Spezies, aus dem die im Ruhezustand
befindliche Zelle isoliert ist, fusioniert werden. Die wiederhergestellte
Eizelle wird dann kultiviert, so dass sie sich zu einer Morula oder
Blastozyste entwickelt, und dann einem pseudoschwangeren weiblichen
Pflegetier übertragen.
Das Junge von diesem weiblichen Pflegetier wird ein Klon des Tiers
sein, von dem eine Zelle, z.B. die somatische Zelle, isoliert ist.
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V. Pharmazeutische Zusammensetzungen
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Erfindungsgemäße GL50-Modulatoren
("aktive Verbindungen") (z.B. inhibitorische
oder stimulierende GL50-Agenzien, einschließlich GL50-Nukleinsäuremoleküle, Polypeptide,
Antikörper
oder Verbindungen, die als Modulatoren einer GL50-Aktivität identifiziert
sind) können
in pharmazeutische Zusammensetzungen, die sich für die Verabreichung eignen,
integriert werden. Solche Zusammensetzungen umfassen typischerweise das
Nukleinsäuremolekül, das Polypeptid
oder den Antikörper
und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Im Rahmen der vorliegenden
Erfindung soll die Bezeichnung "pharmazeutisch
akzeptable Träger" sämtliche Lösungsmittel,
Dispersionsmittel, Beschichtungen, antibakteriellen und antifungalen
Agenzien, isotonischen und absorptionsverzögernden Agenzien, und dergleichen
beinhalten, die mit der Verabreichung von Pharmazeutika verträglich sind.
Die Verwendung von solchen Mitteln und Agenzien für pharmazeutisch
aktive Substanzen ist im Stand der Technik wohl bekannt. Sofern
die herkömmlichen
Mittel oder Agenzien nicht mit der aktiven Verbindung unverträglich sind,
wird deren Verwendung in den Zusammensetzungen in Betracht gezogen.
Ergänzende
aktive Verbindungen können
ebenfalls in die Zusammensetzungen eingearbeitet werden.
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Eine
erfindungsgemäße pharmazeutische
Zusammensetzung ist so formuliert, dass sie mit der beabsichtigen
Verabreichungsform verträglich
ist. Beispiele für
Verabreichungsformen beinhalten parenterale, z.B. intravenöse, intradermale,
subkutane, orale (z.B. Inhalation), transdermale (topische), transmukosale
und rektale Verabreichung. Lösungen
oder Suspensionen, die für
parenterale, intradermale oder subkutane Anwendung verwendet werden,
können
die folgenden Komponenten enthalten: ein steriles Verdünnungsmittel,
wie zum Beispiel Wasser zur Injektion, Kochsalzlösung, nichtflüchtige Öle, Polyethylenglykole,
Glyzerin, Propylenglykol oder sonstige synthetische Lösungen;
antibakterielle Agenzien, wie zum Beispiel Benzylalkohol oder Methylparabene;
Antioxidationsmittel, wie zum Beispiel Askorbinsäure oder Natriumbisulfit; Chelatbildner,
wie zum Beispiel Ethylendiamintetraessigsäure; Puffer, wie zum Beispiel
Azetate, Zitrate oder Phosphate und Agenzien für die Anpassung der Tonizität, wie zum
Beispiel Natriumchlorid oder Dextrose. Der pH-Wert kann mit Säuren oder
Basen angepasst werden, zum Beispiel mit Chlorwasserstoffsäsure oder
Natriumhydroxid. Das parenterale Präparat kann in Ampullen, Einwegspritzen
oder Fläschchen
für Mehrfachdosierung
aus Glas oder Kunststoff verschlossen werden.
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Pharmazeutische
Zusammensetzungen, die sich für
die Injektion eignen, beinhalten sterile wässrige Lösungen (sofern wasserlöslich) oder
Dispersionen und sterile Pulver für die extemporane Zubereitung
von sterilen injizierbaren Lösungen
oder Dispersionen. Für
die intravenöse
Verabreichung beinhalten geeignete Träger physiologische Kochsalzlösung, bakteriostatisches
Wasser, Cremophor EL® (BASF, Parsippany, NJ) oder
phosphatgepufferte Kochsalzlösungen
(PBS). In allen Fällen
muss die Zusammensetzung steril sein und sollte in dem Maße flüssig sein,
dass sie leicht per Spritze verabreicht werden kann. Sie muss in
Hinblick auf Herstellungs- und Lagerbedingungen stabil sein und
muss gegen verunreinigende Wirkung von Mikroorganismen, wie zum
Beispiel Bakterien und Pilze, geschützt sein. Der Träger kann
ein Lösungsmittel
oder Dispersionsmittel sein, das zum Beispiel Wasser, Ethanol, Polyol
(zum Beispiel Glyzerol, Propylenglykol, flüssiger Polyethylenglykol, u.ä.), und
geeignete Gemische davon enthält.
Das geeignete Fließvermögen kann
Beispiel durch die Verwendung eines Überzugs, wie etwa Lezithin,
bei der Dispersion durch die Beibehaltung der erforderlichen Partikelgröße und durch
die Verwendung von Tensiden unterstützt werden. Das Einwirken von
Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle und antifungale
Agenzien erreicht werden, zum Beispiel Parabene, Chlorobutanol,
Phenol, Askorbinsäure,
Thimerosal, u.ä.
In vielen Fällen
werden vorzugsweise isotonische Mittel, zum Beispiel Zucker, Polyalkohole
wie Manitol, Sorbitol, Natriumchlorid in die Zusammensetzung aufgenommen.
Eine verlängerte
Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann erreicht werden,
indem man ein Mittel in die Zusammensetzung aufnimmt, das die Absorption
verzögert,
zum Beispiel Aluminiummonostearat und Gelatine.
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Sterile
injizierbare Lösungen
können
durch Integrieren der aktiven Verbindung (z.B. ein GL50-Polypeptid,
ein Nukleinsäuremolekül oder ein
Antikörper
gegen GL50) in der erforderlichen Menge in einem geeigneten Lösungsmittel
mit einem der vorstehend aufgeführten
Bestandteile, oder, nach Bedarf, mit einer Kombination aus den vorstehend
aufgeführten
Bestandteilen, und einer anschließenden Sterilfiltration hergestellt werden.
Dispersionen werden im Allgemeinen zubereitet, indem man die aktive
Verbindung in ein steriles Vehikel einbringt, das ein basisches
Dispersionsmittel und die erforderlichen sonstigen Bestandteile
aus der vorstehenden Aufzählung
enthält.
Bei sterilen Pulvern für
die Herstellung von sterilen injizierbaren Lösungen sind die bevorzugten
Zubereitungsverfahren die Vakuumtrocknung und die Gefriertrocknung,
wodurch man ein Pulver des aktiven Bestandteils plus einen beliebigen
zusätzlichen
gewünschten
Bestandteil aus einer zuvor sterilfiltrierten Lösung davon erhält.
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Oral
zu verabreichende Zusammensetzungen beinhalten im Allgemeinen ein
inertes Verdünnungsmittel
oder einen essbaren Träger.
Sie können
in Gelatinekapseln gefüllt
oder zu Tabletten komprimiert sein. Zum Zwecke einer oralen therapeutischen
Verabreichung kann die aktive Verbindung mit Arzneistoffträgern eingebracht
sein und in Form von Tabletten, Pastillen, oder Kapseln verwendet
werden. Orale Zusammensetzungen können auch mittels eines flüssigen Trägers zur
Verwendung als Mundwasser hergestellt werden, wobei die Verbindung
in dem flüssigen
Träger
oral verwendet und ausgespuckt oder heruntergeschluckt wird. Pharmazeutisch
verträgliche
Bindemittel und/oder Hilfsmittel können als Teil der Zusammensetzung
enthalten sein. Die Tabletten Pillen, Kapseln, Pastillen, u.ä. können einen
der folgenden Bestandteile oder Verbindungen ähnlicher Natur enthalten: einen
Binder, wie zum Beispiel mikrokristalline Zellulose, Tragantgummi
oder Gelatine; einen Arzneistoffträger, wie zum Beispiel Stärke oder
Laktose, Sprengmittel, wie zum Beispiel Alginsäure, Primogel oder Maisstärke; ein
Gleitmittel, wie zum Beispiel Magnesiumstearat oder Sterotes; ein
Fließregulierungsmittel,
wie zum Beispiel kolloidales Siliziumdioxid; ein Süßungsmittel, wie
zum Beispiel Saccharose oder Saccharin; oder ein Aromastoff, wie
zum Beispiel Pfefferminze, Methylsalicylat oder Orangenaroma.
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Für die Verabreichung
durch Inhalation werden die Verbindungen in Form eines Aerosols
aus einem unter Druck stehenden Behälter oder Spender geliefert,
der einen geeigneten Treibstoff enthält, z.B. ein Gas wie etwa Kohlenstoffdioxid
oder einen Vernebler.
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Die
systemische Verabreichung kann auch durch transmukosale oder transdermale
Mittel erfolgen. Für
eine transmukosale oder transdermale Verabreichung werden Eindringmittel,
die dazu geeignet sind, die Barriere zu durchdringen, in der Formulierung
verwendet. Solche Eindringmittel sind gewöhnlich im Stand der Technik
bekannt und beinhalten zum Beispiel, für die transmukosale Verabreichung,
Detergenzien, Gallensalze und Fusidinsäurederivative. Die transmukosale
Verabreichung kann mittels Nasensprays oder Zäpfchen erfolgen. Für die transdermale
Verabreichung sind die aktiven Verbindungen als Salben, Wundsalben,
Gele oder Cremes formuliert, wie dies im Stand der Technik gewöhnlich bekannt
ist.
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Die
Verbindungen können
auch in Form von Zäpfchen
(z.B. mit herkömmlichen
Zäpfchengrundlagen wie
etwa Kakaobutter und andere Glyzeride) oder Verweilklistieren für die rektale
Verabreichung zubereitet werden.
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In
einem Ausführungsbeispiel
werden die aktiven Verbindungen mit Trägern zubereitet, welche die Verbindung
gegen ein schnelles Ausscheiden aus dem Körper schützen, wie zum Beispiel Formulierungen
mit kontrollierter Wirkstofffreisetzung, einschließlich Implantate
und mikroverkapselte Freigabesysteme. Biologisch abbaubare, biokompatible
Polymere können
verwendet werden, wie zum Beispiel, Ethylenvinylacetat, Polyanhydride,
Polyglykolsäure,
Kollagen, Polyorthoester und Polymilchsäure. Verfahren zur Zubereitung
von solchen Formulierungen werden für den Fachmann auf diesem Gebiet
ersichtlich sein. Die Stoffe sind auch von Alza Corporation und
Nova Pharmaceuticals, Inc. kommerziell erhältlich. Liposomale Suspensionen
(einschließlich
gegen infizierte Zellen gerichteter Liposomen mit monoklonalen Antikörpern gegen
virale Antigene) können
ebenfalls als pharmazeutisch akzeptable Träger verwendet werden. Diese
können
gemäß Verfahren zubereitet
werden, die dem Fachmann auf diesem Gebiet geläufig sind, zum Beispiel gemäß dem in
dem
US-amerikanischen Patent
Nr. 4,522,811 beschriebenen Verfahren.
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Es
ist besonders vorteilhaft, orale oder pareneterale Zusammensetzungen
in Einnahmeeinheiten zu formulieren, um die Verabreichung zu erleichtern
und eine einheitliche Dosierung sicherzustellen. Im Rahmen der vorliegenden
Erfindung bezeichnet Einnahmeeinheiten physikalisch getrennt Einheiten,
die als einheitliche Dosierung für
das zu behandelnde Individuum geeignet sind, wobei jede Einheit
eine vorhergestimmte Menge der aktiven Verbindung enthält, die
so berechnet ist, dass sie zusammen mit dem erforderlichen pharmazeutischen
Träger
die gewünschte
therapeutische Wirkung erzeugt. Die Spezifikation für die erfindungsgemäßen Einnahmeeinheiten
wird bestimmt und hängt
ab von den individuellen Eigenschaften der aktiven Verbindung, der
jeweiligen angestrebten therapeutischen Wirkung und den Beschränkungen,
die der Herstellungstechnik einer solchen aktiven Verbindung für die Behandlung
von Individuen inhärent
ist.
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Die
Toxizität
und die therapeutische Effizienz von solchen Verbindungen lassen
sich durch gewöhnliche
pharmazeutische Verfahren in Zellkulturen oder Versuchstieren bestimmen,
z.B. durch die Bestimmung des LD50-Werts (die letale Dosis bei 50%
der Population) und des ED50-Werts (die therapeutisch wirksame Dosis
in 50% der Population). Das Dosisverhältnis zwischen toxischen und
therapeutischen Wirkungen ist der therapeutische Index, der als
das Verhältnis
LD50/ED50 ausgedrückt
werden kann. Verbindungen, die hohe therapeutische Indizes aufweisen,
sind bevorzugt. Verbindungen, die toxische Nebenwirkungen zeigen,
können
zwar verwendet werden, doch sollte man Vorsicht walten lassen, wenn
man ein Freigabesystem entwickeln möchte, das solche Verbindungen
an Stellen mit befallenem Gewebe schickt, um potenzielle Beschädigung von
nicht infizierten Zellen gering zu halten und dabei die Nebenwirkungen
zu reduzieren.
-
Die
von diesen Zellkulturuntersuchungen und Tierstudien erhaltenen Daten
können
verwendet werden, um einen Dosierungsbereich für die Anwendung beim Menschen
zu formulieren. Die Dosierung von solchen Verbindungen liegt vorzugsweise
in einem Bereich von zirkulierenden Konzentrationen, die den ED50-Wert
mit geringer oder keiner Toxizität
enthalten. Die Dosierung kann innerhalb diese Bereichs in Abhängigkeit
von der verwendeten Dosierungsform und der eingesetzten Verabreichungsform
variieren. Für
jede in dem erfindungsgemäßen Verfahren
verwendete Verbindung kann die therapeutisch wirksame Dosis durch Zellkulturuntersuchungen
im Voraus berechnet werden. Eine Dosis kann in Tiermodellen formuliert
werden, um eine zirkulierende Plasmakonzentration zu erhalten, die
den IC50-Wert enthält
(d.h. die Konzentration der Testverbindung, welche die Hälfte der
maximalen Inhibition der Symptome erreicht), der in einer Zellkultur
bestimmt wurde. Solche Information können verwendet werden, um für den Menschen
nützliche
Dosen genauer bestimmen zu können.
Die Plasmaspiegel können
zum Beispiel durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gemessen
werden.
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Die
erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können in
Vektoren eingebracht und als Gentherapievektoren verwendet werden.
Gentherapievektoren können
einem Individuum zum Beispiel durch intravenöse Injektion, lokale Verabreichung
(siehe
US-amerikanisches Patent
5,328,470 ) oder durch stereotaktische Injektion (siehe
z.B. Chef et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057) verabreicht
werden. Das pharmazeutische Präparat
des Gentherapievektors kann den Gentherapievektor in einem akzeptablen
Verdünnungsmittel
beinhalten oder kann eine Matrix zur langsamen Freigabe umfassen,
in die der Gentherapievektor eingebettet ist. Alternativ kann das
pharmazeutische Präparat,
wenn der komplette Gentransfervektor ganz aus rekombinanten Zellen
hergestellt ist, z.B. retrovirale Vektoren, eine oder mehrere Zellen
enthalten, welche die Genfähre
produzieren.
-
Die
pharmazeutischen Zusammensetzungen können zusammen mit dem Beipackzettel
in einem Behälter,
in einer Packung oder in einem Spender enthalten sein.
-
VI. Erfindungsgemäße Verwendungen und Verfahren
-
Die
hierin beschriebenen Nukleinsäuremoleküle, Polypeptide,
Proteinhomologa und Antikörper
können
in einem oder mehreren der folgenden Verfahren verwendet werden:
a) Behandlungsmethoden, z.B. Herauf- oder Herunterregulation der
Immunantwort; b) Screeningassays; c) prädiktive Medizin (z.B. diagnostische Untersuchungen,
prognostische Untersuchungen, Überwachung
von klinischen Studien und pharmakologische Genetik). Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können zum
Beispiel verwendet werden, um GL50-Polypeptide zu exprimieren (z.B. über einen
rekombinanten Expressionsvektor in einer Wirtszelle in Gentherapieanwendungen),
um GL50-mRNA (z.B. in einer biologischen Probe) oder eine genetische
Veränderung
in einem GL50-Gen zu detektieren und die GL50-Aktiviät zu modulieren,
was im Folgenden näher
beschrieben wird. Die GL50-Polypeptide können verwendet werden, um Krankheiten
zu behandeln, die durch ungenügende
oder exzessive Produktion von GL50-Inhibitoren gekennzeichnet sind.
Außerdem
können
die GL50-Polypeptide verwendet werden, um auf natürlich vorkommende
GL50-Liganden zu untersuchen, auf Arzneimittel oder Verbindungen,
welche die GL50-Aktivität
modulieren, zu untersuchen, sowie Krankheiten zu behandeln, die
durch ungenügende
oder exzessive Produktion von GL50-Polypeptiden oder durch die Produktion
von GL50-Polypeptidformen, die im Vergleich zu GL50-Wildtyp-Polypeptiden
eine verminderte oder anomale Aktivität haben, gekennzeichnet sind.
Außerdem
können
die erfindungsgemäßen Antikörper gegen
GL50 verwendet werden, um GL50-Polypeptide zu detektieren und isolieren,
die Bioverfügbarkeit
von GL50-Polypeptiden zu regulieren und die GL50-Aktivität zu modulieren,
z.B. Immunantworten modulieren.
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A. Behandlungsmethoden
-
Die
vorliegende Erfindung bietet sowohl prophylaktische als auch therapeutische
Methoden zur Behandlung eines Individuums, das als gefährdet gilt,
eine Krankheit zu bekommen, oder das anfällig für eine Krankheit ist, die mit
aberranter GL50-Expression oder -Aktivität assoziiert ist, oder auf
die sich die Modulation einer GL50-Aktivität positiv auswirken würde.
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1. Prophylaktische Methoden
-
In
einem Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, die in einem
Individuum einer Krankheit oder einem Zustand vorbeugt, die bzw.
der mit einer aberranten GL50-Expression oder -Aktivität assoziiert
ist, indem man dem Individuum ein GL50-Polypeptid oder ein Agens
verabreicht, das die Expression des GL50-Polypetids oder zumindest
eine GL50-Aktivität
moduliert. Individuen, die als gefährdet gelten, eine Krankheit
zu bekommen, die durch eine aberrante GL50-Expression oder -Aktivität verursacht
ist oder zu der eine anormale GL50-Expression oder -Aktivität beigetragen
hat, können
zum Beispiel durch irgendeine hierin beschriebene diagnostische
oder prognostische Untersuchung oder eine Kombination davon identifiziert
werden. Die Verabreichung eines prophylaktischen Agens kann vor
der Manifestation von Symptomen, die für eine GL50-Aberration charakteristisch
sind, erfolgen, so dass eine Krankheit oder Störung verhindert oder alternativ
in ihrem Fortschritt verzögert
wird. In Abhängigkeit
von der Art der GL50-Aberration oder des Zustands kann zum Beispiel
ein GL50-Polypeptid, ein GL50-Agonist oder ein GL50-Antagonist für die Behandlung
des Individuums verwendet werden. Das geeignete Agens kann auf Basis
von hierin beschriebenen Screeningassays bestimmt werden.
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2. Therapeutische Methoden
-
Ein
anderer Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren zur Modulation der
GL50-Expression oder -Aktivität für therapeutische
Zwecke. Dementsprechend umfasst in einem typischen Ausführungsbeispiel
das erfindungsgemäße modulatorische
Verfahren das Inkontaktbringen einer Zelle mit einem GL50-Polypeptid
oder Agens, das eine oder mehrere der Aktivitäten des GL50-Polypeptids moduliert,
die mit der Zelle assoziiert sind. Ein Agens, das die Aktivität eines
GL50-Polypeptids moduliert, kann ein Agens des hierin beschriebenen
Typs sein, wie zum Beispiel eine Nukleinsäure oder ein Polypeptid, ein
natürlich
vorkommendes Zielmolekül
von einem GL50-Polypeptid (z.B. ein GL5-Ligand), ein GL50-Antikörper, ein
GL50-Agonist oder GL50-Antagonist, ein Peptidomimetikum von einem
GL50-Agonisten oder GL50-Antagonisten oder ein anderes kleines Molekül. In einem
Ausführungsbeispiel
stimuliert das Agens eine oder mehrere GL50-Aktivitäten. Beispiele
für solche stimulierenden
Agenzien beinhalten Agenzien, welche die Interaktion zwischen GL50
und einem stimulierenden Rezeptor stimulieren oder die Interaktion
zwischen GL50 und einem inhibitorischen Rezeptor inhibieren, z.B.
aktive GL50-Polypeptide, bestimmte lösliche Formen von GL50-Molekülen und
ein Nukleinsäuremolekül, das ein
in die Zelle eingebrachtes GL50-Polypeptid codiert. In einem Ausführungsbeispiel
inhibiert das Agens eine oder mehrere GL50-Aktivitäten. Beispiele
für solche
inhibitorischen Agenzien beinhalten Agenzien, welche die Interaktion
zwischen GL50 und einem costimulatorischen Rezeptor verringern oder
die Interaktion zwischen GL50 und einem inhibitorischen Rezeptor
fördern,
z.B. GL50-Antisense-Nukleinsäuremoleküle, Antiköper gegen
GL50 und GL50-Inhibitoren. Diese modulatorischen Verfahren können in
vitro ausgeführt
werden (z.B. durch Kultivieren der Zellen mit dem Agens) oder alternativ
in vivo (z.B. durch Verabreichen des Agens an ein Individuum). Daher
stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Behandlung eines
Individuums bereit, das von einer Krankheit oder Störung betroffen
ist, auf die sich eine Modulation eines GL50-Polypeptids positiv auswirken
würde,
z.B. eine Krankheit, auf die sich eine Herauf- oder Heruntermodulation
der Immunantwort positiv auswirken würde, oder die durch eine aberrante
Expression oder Aktivität
eines GL50-Polypetids oder GL50-Nukleinsäuremoleküls gekennzeichnet ist. In einem
Ausführungsbeispiel
umfasst das Verfahren das Verabreichen eines Agens (z.B. ein in
einem hierin beschriebenen Screeningassay identifiziertes Agens)
oder Kombinationen von Agenzien, welche die Expression oder Aktivität von GL50
modulieren (z.B. heraufmodulieren oder heruntermodulieren). In einem
anderen Ausführungsbeispiel
umfasst das Verfahren das Verabreichen eines GL50-Polypeptids oder
eines GL50-Nukleinsäuremoleküls als Therapie,
um eine reduzierte oder aberrante Expression oder Aktivität von GL50
zu kompensieren.
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Die
Stimulation der GL50-Aktivität
ist dann wünschenswert,
wenn GL50 ungewöhnlich
weit heruntergeregelt ist und/oder wenn eine höhere GL50-Aktivität wahrscheinlich
eine günstige
Auswirkung hätte.
Ebenso ist die Inhibition der GL50-Aktivität dann wünschenswert, wenn GL50 ungewöhnlich weit
heraufgeregelt ist und/oder wenn eine niedrigere GL50-Aktivität wahrscheinlich
eine günstige
Auswirkung hätte.
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3. Die Herunterregulation
der Immunantwort
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Die
Herunterregulation der Funktion eines GL50-Polypeptids und damit
die Herunterregulation der Immunantworten ist auf vielerlei Weisen
möglich.
Man kann sie herunterregeln, indem man eine bereits im Aufbau befindliche
Immunantwort inhibiert oder blockt, oder man kann die Induzierung
einer Immunantwort von vornherein verhindern. Die Funktionen von
aktivierten T-Zellen können
zum Beispiel inhibiert werden, indem man die T-Zellantworten unterdrückt, oder
indem man spezifische Toleranz in T-Zellen induziert, oder indem man
die Produktion von Zytokinen herbeiführt, welche die Immunantwort
dämpfen.
Die Immunsuppression von T-Zellantworten ist allgemein ein aktiver,
nicht-antigenspezifischer
Prozess, der zu einer verminderten T-Zellempfindlichkeit führt und
erforderlich machen kann, dass die T-Zellen permanent dem suppressiven
Agens ausgesetzt sind. Die Toleranz, bei der ein Ausbleiben der
Immunantwort oder eine Anergie in T-Zellen induziert wird, ist von
der Immunsuppression dadurch zu unterscheiden, dass sie im Allgemeinen
antigenspezifisch ist und auch dann noch andauert, nachdem die Einwirkung
des die Toleranz bewirkenden Agens beendet ist. In der Praxis kann
das Vorhandensein von Toleranz dadurch demonstriert werden, dass
in Abwesenheit des die Toleranz bewirkenden Agens bei erneuter Einwirkung
eines spezifischen Antigens die Antwort der T-Zelle ausbleibt.
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GL50-Polypeptide
(einschließlich
nicht-aktiver Formen eines GL50-Polypeptids) oder Antikörper gegen
GL50, die dazu führen,
dass kein costimulierendes Signal an die T-Zellen geliefert wird,
die ein primäres Aktivierungssignal
erhalten haben, können
zum Beispiel verwendet werden, um die Interaktion zwischen GL50 und
seinem Ligand/seinen Liganden zu hemmen und dadurch ein spezifisches
Mittel zu liefern, mit dem die Immunsuppression verursacht und/oder
Toleranz in einem Individuum induziert werden kann. Solche blockierenden
oder inhibitorischen Formen von GL50-Polypeptiden und GL50-Fusionsproteinen
und blockierende Antikörper
können
mittels ihrer Fähigkeit,
die T-Zellproliferation und/oder die Zytokinproduktion zu inhibieren, wenn
sie einem hierin beschriebenen und im Stand der Technik bekannten
in vitro Costimulationsassay hinzugefügt werden, identifiziert werden.
Im Gegensatz zu den inhibitorischen Formen eines GL50-Polypeptids übertragen
aktivierende Formen (wie zum Beispiel ein GL50-Polypeptid mit einer
intakten Zelloberfläche
und bestimmte lösliche
Formen von GL50) vorzugsweise ein costimulatorisches Signal an die
T-Zellen, was im Vergleich zu aktivierten T-Zellen, die kein costimulatorisches
Signal empfangen haben, zu einer verstärkten Zytokinsekretion führt (z.B.
IL-10).
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In
einem Ausführungsbeispiel
können
Fusionsproteine, die ein erstes GL50-Peptid umfassen, das an ein
zweites Peptid mit einer Aktivität
eines anderen B-Lymphozytenantigens (z.B. B7-1 oder B7-2) fusioniert ist,
verwendet werden, um T-Zellvermittelte Immunantworten zu modifizieren.
Alternativ können
zwei getrennte Peptide mit einer Aktivität eines B-Lymphozytenantigens
(zum Beispiel ein GL50-Polypeptid plus ein B7-2- und/oder B7-1-Polypeptid)
oder eine Kombination aus blockierenden Antikörpern (z.B. Antikörper gegen
ein GL50-Polypeptid mit monoklonalen Antikörpern gegen B7-2 und/oder B7-1)
zu einer einzigen Zusammensetzung kombiniert werden oder getrennt
verabreicht werden (gleichzeitig oder der Reihe nach), um T-Zellvermittelte
Immunantworten in einem Individuum heraufzuregeln oder herunterzuregeln.
Des Weiteren kann eine therapeutisch aktive Menge von einem oder
mehreren Peptiden mit einer GL50-Pypeptidaktivität, mit B7-1- und/oder B7-2-Aktivität, zusammen
mit anderen immunregulierenden Reagenzien verwendet werden, um die Immunantworten
zu beeinflussen. Beispiele für
andere immunregulierende Reagenzien beinhalten blockierende Antikörper, (z.B.
gegen CD28, CTLA4 und/oder ICOS oder gegen andere T-Zellmarker oder
gegen Zytokine), Fusionsproteine (z.B. CTLA4Ig) oder immunsuppressive
Arzneimittel (z.B. Rapamycin, Zyklosporin A oder FK506).
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Die
aus den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen produzierten
Peptide können
auch bei der Herstellung von therapeutischen Agenzien nützlich sein,
welche die T-Zellfunktion durch Zerstörung der T-Zellen blockieren.
Wie beschrieben können
zum Beispiel lösliche,
sekretierte Formen eines GL50-Polypeptids oder Antikörper, die
an einen Liganden auf einer T-Zelle binden, verwendet werden. Solche
sekretierte Formen können
durch gewöhnliche
gentechnische Verfahren hergestellt werden. Durch das Verbinden
einer löslichen Form
eines GL50-Polypeptids oder Antikörpers an Toxin, wie zum Beispiel
Rizin, kann ein Agens hergestellt werden, das die T-Zellaktivierung
unterbinden kann. Die Infusion eines Immuntoxins oder einer Kombination von
Immuntoxinen (z.B. GL50-Rizin mit B7-2-Rizin und/oder B7-1-Rizin)
in einen Patienten kann zum Tod von T-Zellen führen, insbesondere von aktivierten
T-Zellen, die größere Mengen
von CD28, CTLA4 und/oder ICOS oder GL50 exprimieren.
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Ein
weiteres Verfahren zur Unterbindung der Funktion eines GL50-Polypeptids
besteht in der Verwendung eines Antisense- oder Triplex-Oligonukleotids.
Zum Beispiel kann ein Oligonukleotid verwendet werden, das komplementär zu dem
Bereich um eine Translationsinitiierungsstelle eines GL50-Polypeptids
ist. Ein oder mehrere Antisense-Oligonukleotide können Zellmedien
hinzugefügt
werden, typischerweise in einem Verhältnis von 200 μg/ml, oder
einem Patienten verabreicht werden, um die Synthese eines GL50-Polypeptids
zu unterbinden. Das Antisense-Oligonukleotid wird von den Zellen
aufgenommen und mit einer GL50-mRNA hybridisiert, um die Translation
zu unterbinden. Alternativ kann ein Oligonukleotid verwendet werden,
das doppelsträngige
DNA bindet, um ein Triplex-Konstrukt zu bilden und dadurch das Abwickeln
und die Transkription der DNA zu unterbinden. Das Ergebnis von beiden
Möglichkeiten
ist die Blockierung der Synthese eines GL50-Polypeptids.
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Die
Herunterregulation oder Ausschalten von einer oder mehreren Funktionen
eines GL50-Polypeptids, z.B. das Verhindern der Synthese von großen Mengen
an Lymphokinen durch aktivierte T-Zellen, ist dann nützlich,
wenn es um Gewebe-, Haut- und Organtransplantation und die Transplantat-gegen-Empfänger-Krankheit
(engt. Abk. GvHD) geht. Die Blockierung der T-Zellenfunktion sollte
zum Beispiel dazu führen, dass
bei einer Gewebetransplantation weniger Gewebe zerstört wird.
Typischerweise wird bei Gewebetransplantationen die Abstoßung des
Transplantats dadurch initiiert, dass die T-Zellen es als fremd
erkennen, worauf eine Immunreaktion folgt, die das Transplantat
zerstört.
Die Verabreichung eines Moleküls
vor der Transplantation, das die Interaktion eines B7-Lymphozytantigens
mit seinem bzw. seinen natürlichen
Liganden auf Immunzellen (wie zum Beispiel eine lösliche,
monomere Form eines GL50-Polypeptids, allein oder in Verbindung
mit einer monomeren Form eines anderen B7-Peptids (z.B. B7-1, B7-2)
oder ein blockierender Antikörper)
inhibiert oder blockiert, kann dazu führen, dass das Moleküls an den
bzw. die natürlichen
Liganden auf den Immunzellen bindet, ohne das entsprechende costimulatorische
Signal zu übertragen.
Die so bewirkte Blockierung der B-Lymphozyten-Antigenfunktion verhindert
die Synthese von Zytokinen durch Immunzellen, wie zum Beispiel T-Zellen,
und unterdrückt
somit die Immunantwort. Außerdem
kann die ausbleibende Costimulation dazu ausreichen, die T-Zellen
zu anergisieren und wodurch in einem Individuum Toleranz induziert wird.
Durch die Induktion einer Langzeittoleranz durch B-Lymphozytenantigene
blockierende Reagenzien kann die Notwendigkeit einer wiederholten
Verabreichung dieser blockierenden Reagenzien wegfallen. Es kann
auch erforderlich sein, die Funktion einer Kombination von B-Lymphozytenantigenen
zu blockieren, um eine ausreichende Immunsuppression oder Toleranz
in einem Individuum zu erhalten. Es kann zum Beispiel wünschenswert
sein, die Funktion von B7-1 und GL50, B7-2 und GL50, oder B7-1 und
B7-2 und einem GL50-Polypetid zu blockieren, indem man vor der Transplantation
eine lösliche
Form von einer Kombination von Peptiden mit einer Aktivität von jedem
dieser Antigene oder blockierenden Antikörpern (getrennt oder zusammen
in einer einzigen Zusammensetzung) verabreicht. Alternativ können inhibitorische
Formen von GL50-Polypeptiden mit anderen suppressiven Agenzien,
wie zum Beispiel blockierende Antikörper gegen andere T-Zellmarker
oder gegen Zytokine, andere Fusionsproteine, z.B. CTLA4Ig oder immunsuppressive
Arzneimittel, verwendet werden.
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Die
Wirksamkeit von bestimmten blockierenden Reagenzien für die Verhinderung
der Abstoßung
eines transplantierten Organs oder von GvHD kann unter Verwendung
von Tiermodellen beurteilt werden, mit denen die Wirksamkeit beim
Menschen vorhergesagt werden kann. Da B7-Polypeptide eine Aminosäurekonservierung über Spezies
hinweg zeigen, ist es wahrscheinlich, dass andere GL50-Antigene über Spezies
hinweg funktionieren, was die Verwendung von Reagenzien erlaubt,
die aus humanen Proteinen in Tiersystemen bestehen. Beispiele für geeignete
Systeme, die verwendet werden können,
beinhalten allogene Herztransplantate in Ratten und xenogene Transplantate
von Pankreasinselzellen in Mäusen.
Beide Modelle sind verwendet worden, um die immunsuppressiven Wirkungen
von CTLA4Ig-Fusionsproteinen in vivo zu untersuchen, gemäß der Beschreibung
in Lenschow et al., Science, 257:789-792 (1992) und Turka et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:11102-11105 (1992). Außerdem können Maus-Modelle
von GvHD (siehe Paul ed., Fundamental Immunology, Raven Press, New
York, 1989, S. 846-847) verwendet werden, um die Wirkung der Blockierung
der Funktion eines GL50-Polypeptids auf die Entwicklung dieser Krankheit
in vivo zu bestimmen.
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Die
Blockierung einer Funktion des GL50-Polypeptids, z.B. durch die
Verwendung eines Peptids, das eine GL50-Polypeptidaktivität hat, allein
oder in Kombination mit einem Peptid, das eine B7-1-Aktivität hat und/oder
einem Peptid, das eine B7-2-Aktivität hat, kann auch für die Behandlung
von Autoimmunkrankheiten therapeutisch nützlich sein. Viele Autoimmunkrankheiten
sind das Ergebnis einer unangebrachten Aktivierung von T-Zellen,
die gegen körpereigenes
Gewebe reaktiv sind und die Produktion von Zytokinen und Autoantikörpern fördern, die
in die Pathologie dieser Krankheiten involviert sind. Die Symptome
dieser Krankheiten können
gemildert oder beseitigt werden, wenn man die Aktivierung von autoreaktiven
T-Zellen verhindert. Reagenzien, welche die Costimulation von T-Zellen
durch die Unterbrechung der Interaktionen zwischen Rezeptor und
Ligand von B-Lymphozytenantigenen blockieren, können verabreicht werden, um
die Aktivierung von T-Zellen zu inhibieren und die Produktion von
Autoantikörpern
oder von T-Zell-abgeleiteten Zytokinen zu verhindern, die in den
Krankheitsprozess involviert sein können. Außerdem können blockierende Reagenzien eine
antigenspezifische Toleranz von autoreaktiven T-Zellen induzieren,
was zu einer langzeitigen Befreiung von dieser Krankheit führen könnte. Die
Wirksamkeit von blockierenden Reagenzien hinsichtlich des Verhinderns
oder Linderns von Autoimmunerkrankungen kann durch Verwendung einer
Reihe von gut charakterisierten Tiermodellen von humanen Autoimmunkrankheiten
bestimmt werden. Beispiele beinhalten experimentelle Autoimmunencephalitis
in Mäusen,
systemischer Lupus erythematodesin MRL/lprl lpr Mäusen oder
NZB-Hybridmäusen,
Kollagen-induzierte
Autoimmunarthritis in Mäusen,
Diabetes mellitus in NOD-Mäusen
und BB-Ratten und experimentelle Myasthenia gravis in Mäusen (siehe
Paul ed., Fundamental Immunology, Raven Press, New York, 1989, S.
840-856).
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Die
IgE-Antikörperantwort
bei atopischer Allergie ist in hohem Maße von T-Zellen abhängig, und
daher kann die Inhibition von B-Lymphozytenantigen-induzierter T-Zellaktivierung
bei der Behandlung von Allergien und allergischen Reaktionen therapeutisch
nützlich
sein. Eine inhibitorische Form eines GL50-Polypeptids, wie zum Beispiel
ein Peptid, das eine GL50-Polypeptidaktivität hat, allein oder in Kombination
mit einem anderen B-Lymphozytenantigen, wie zum Beispiel B7-1 oder
B7-2, kann einem
allergischen Individuum verabreicht werden, um T-Zellvermittelte
allergische Reaktionen in dem Individuum zu inhibieren. Die Inhibition
der GL50-Costimulation von T-Zellen kann von der Exposition gegenüber einem
Allergen zusammen mit geeigneten MHC-Molekülen begleitet sein. Allergische
Reaktionen können
systemischer oder lokaler Natur sein, in Abhängigkeit von dem Eintrittsweg
des Allergens und dem Depositionsmuster von IgE auf Mastzellen oder
Basophilen. Daher kann es erforderlich sein, T-Zellvermittelte allergische
Reaktionen lokal oder systemisch durch die passende Verabreichung
einer inhibitorischen Form eines GL50-Polypeptids zu inhibieren.
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Die
Inhibition von T-Zellaktivierung durch die Blockierung einer GL50-Antigenfunktion
kann auch bei viralen Infektionen von T-Zellen therapeutisch wichtig
sein. Bei der erworbenen Immunschwäche-Krankheit AIDS wird die
virale Replikation durch T-Zellaktivierung stimuliert. Die Blockierung
einer GL50-Funktion könnte zu
einem geringeren Ausmaß an
viraler Replikation führen
und dadurch den Verlauf von AIDS verbessern. Außerdem kann es zudem wünschenswert
sein, die Funktion einer Kombination von B-Lymphozytenantigenen, d.h.
GL50 mit B7-2 und/oder B7-1, zu blockieren.
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In
einem Ausführungsbeispiel
der Erfindung induziert ein Mitglied der GL50-Familie vorzugsweise
die IL-10-Sekretion durch eine T-Zelle (Hutloff et al. (1999) Nature
397:263). IL-10 fördert
einerseits die Entwicklung von Antworten des Typs Th2, führt aber
andererseits auch zu einer Herunterregulation der Produktion von bestimmten
Zytokinen und zu einer Hochregulation von zellvermittelter Immunität, z.B.
durch Verringerung der Makrophagenaktivierung (Bai et al. (1997)
Clin. Immunol. Immunopathol. 83:117; Koch et al. (1996) J. Exp. Med.
184:741; de Vries (1995) Ann. Med 27:537). Dementsprechend kann
in einem Ausführungsbeispiel
der Erfindung eine Erhöhung
der Aktivität
eines Mitglieds der GL50-Familie zu einer Heruntermodulation einer
zellvermittelten Immunantwort führen.
Daher werden in einem Ausführungsbeispiel
der Erfindung die zellvermittelten Immunantworten durch das Erhöhen der
GL50-Aktivität
verringert.
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4. Die Hochregulation von
Immunantworten
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Die
Hochregulation einer Immunantwort, z.B. durch das Fördern einer
stimulierenden Aktivität
von GL50, kann ebenfalls in der Therapie nützlich sein. Die Hochregulation
von Immunantworten kann in der Form geschehen, dass eine bestehende
Immunantwort verstärkt
oder eine anfängliche
Immunantwort hervorgerufen wird. Beispielsweise kann die Verstärkung einer
Immunantwort durch die Stimulierung der GL50-Aktivität im Falle
von Virusinfektionen nützlich
sein. Virusinfektionen werden zunächst von zytolytischen T-Zellen
gereinigt. In Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung nimmt man an, dass die Interaktion
des GL50-Polypeptids mit seinem bzw. seinen natürlichen Liganden auf T-Zellen
dazu führen
kann, dass die zytolytische Aktivität von zumindest einigen T-Zellen
ansteigt. Die Hinzufügung
einer aktivierenden Form von GL50, allein oder in Kombination mit
einer aktivierenden Form eines andersartigen Polypeptids der B7-Familie,
um die T-Zellaktivierung durch die Costimulationswege zu stimulieren,
wäre also
in Situationen therapeutisch nützlich, in
denen eine schnellere oder sorgfältigere
Beseitigung des Virus vorteilhaft wäre. Diese würden virale Hautkrankheiten
beinhalten, wie zum Beispiel Herpes oder Gürtelrose, bei denen das einwertige
oder mehrwertige lösliche
GL50-Polypeptid oder eine Kombination eines solchen Peptids mit
einem Peptid mit einer B7-1-Aktivität und/oder einem Peptid mit
einer B7-2-Aktivität
topisch an die Haut geliefert wird. Außerdem könnten systemische Viruserkrankungen,
wie zum Beispiel Influenza, gewöhnliche
Erkältungen
und Gehirnentzündung durch
die Verabreichung von stimulierenden Formen von GL50 systemisch
gemildert werden.
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Alternativ
können
antivirale Immunantworten in einem infizierten Patient verstärkt werden,
indem man dem Patienten T-Zellen entnimmt, die T-Zellen in vitro
mit viralen Antigen-gepulsten APCs, die entweder ein GL50-Peptid
exprimieren (allein oder in Kombination mit einem Peptid, das eine
B7-1-Aktivität hat, und/oder mit
einem Peptid, das eine B7-2-Aktivität hat) oder zusammen mit einer stimulatorischen
Form eines löslichen GL50-Peptids
costimuliert (allein oder in Kombination mit einem Peptid, das eine
B7-1-Aktivität
hat, und/oder mit einem Peptid, das eine B7-2-Aktivität hat) und
die in vitro aktivierten T-Zellen wieder in den Patienten einbringt.
Ein anderes Verfahren zur Verstärkung
von antiviralen Immunantworten bestände darin, infizierte Zellen von
einem Patienten zu isolieren, sie mit einem Nukleinsäuremolekül zu transfizieren,
das ein Peptid mit der Aktivität
eines B-Lymphozytenantigens codiert, wie hierin beschrieben, so
dass die Zellen das GL50-Antigen ganz oder zum Teil auf ihrer Oberfläche exprimieren,
und die transfizierten Zellen wieder in den Patienten einzubringen.
Die infizierten Zellen wären
nun in der Lage, ein costimulatorisches Signal an die T-Zellen zu
liefern und sie dadurch in vivo zu aktivieren.
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Stimulatorische
Formen von GL50-Molekülen
können
ebenfalls prophylaktisch in Impfstoffen gegen verschiedene Pathogene
verwendet werden. Immunität
gegen ein Pathogen, z.B. ein Virus, könnte durch Impfung mit einem
viralen Protein zusammen mit einer stimulatorischen Form eines GL50-Polypeptids
in einem geeigneten Adjuvans induziert werden. Alternativ kann ein
Expressionsvektor für
die Impfung verwendet werden, der sowohl Gene für ein pathogenes Antigen als
auch für
ein Peptid mit einer Aktivität
eines GL50-Antigens codiert, z.B. ein Expressionsvektor für einen
Vacciniavirus, der so gestaltet ist, dass er ein Nukleinsäuremolekül, das ein
virales Protein codiert, und ein Nukleinsäuremolekül, das ein hierin beschriebenes
GL50-Polypeptid codiert, exprimiert. DNA-Impfstoffe können durch
eine Vielzahl von Mitteln verabreicht werden, zum Beispiel durch
Injektion (z.B. intramuskulär,
intradermal oder durch die biolistische Injektion von DNA-beschichteten Goldpartikeln
in die Epidermis mit einer Genpistole, die einen Partikelbeschleuniger
oder ein Druckgas verwendet, um die Partikel in die Haut zu injizieren
(Haynes et al. (1996) J. Biotechnol. 44:37)). Alternativ können DNA-Impfstoffe
durch nicht-invasive Mittel verabreicht werden. Zum Beispiel kann
reine oder lipidformulierte DNA einem Atmungssystem oder einem anderen
Ziel zugeführt
werden, z.B. Peyer'sche Plaques
durch orale Lieferung der DNA (Schubbert (1997) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 94:961). Verdünnte
Mikroorganismen können
für die
Zuführung
an mukosale Flächen
verwendet werden. (Sizemore et al. 1995. Science. 270:29). In einem
Ausführungsbeispiel
wird das Antigen gleichzeitig mit einer stimulatorischen Form eines
GL50-Moleküls
verabreicht.
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In
einer anderen Anwendung kann die Hochregulation oder die Verstärkung der
GL50-Funktion für
die Induktion von Tumorimmunität
nützlich
sein. In einem Ausführungsbeispiel
ist das GL50-Molekül
zellassoziiert. Tumorzellen (z.B. Sarkom, Melanom, Lymphom, Leukämie, Neuroblastom,
Karzinom), die mit einer Nukleinsäure transfiziert sind, die
mindestens ein GL50-Antigen codiert, können einem Individuum verabreicht
werden, um die tumorspezifische Toleranz dieses Individuum zu überwinden.
Die Tumorzelle kann so transfiziert werden, dass sie eine Kombination
aus B7-Polypeptiden exprimiert, wenn dies gewünscht wird (z.B. B7-1, B7-2,
GL50). Beispielsweise können
Tumorzellen, die man einem Patienten entnommen hat, ex vivo mit
einem Expressionsvektor transfiziert werden, der die Expression
eines GL50-Polypeptids allein oder zusammen mit einem Peptid, das
eine B7-1-Aktivität
und/oder B7-2-Aktivität
hat, bewirkt. Die transfizierten Tumorzellen werden wieder in den
Patienten eingebracht, um die Expression der Peptide auf der Oberfläche der
transfizierten Zelle zu bewirken. Alternativ können Techniken der Gentherapie
verwendet werden, um eine Tumorzelle für eine Transfektion in vivo
zu ermitteln.
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Die
Anwesenheit des Peptids mit der Aktivität eines GL50-Moleküls auf der
Oberfläche
der Tumorzelle liefert das notwendige costimuliatorische Signal
an T-Zellen, um eine T-Zellvermittelte Immunantwort gegen die transfizierten
Tumorzellen zu induzieren. Außerdem
können
Tumorzellen, die keine MHC-Klasse-I- oder MHC-Klasse-II-Moleküle haben,
oder die keine ausreichenden Mengen an MHC-Klasse-I- oder MHC-Klasse-II-Molekülen exprimieren,
mit einer Nukleinsäure
transfiziert werden, die ein gesamtes MHC-Klasse-I-α-Ketten-Protein
und β2-Mikroglobulin-Protein oder ein MHC-Klasse-II-α-Ketten-Protein
und ein MHC-Klasse-II-β-Ketten-Protein
oder einen Teil davon (z.B. ein verkürztes Stück einer cytoplasmatischen
Domäne)
codiert, um dadurch MHC-Klasse-I- oder MHC-Klasse-II-Proteine auf
der Zelloberfläche
zu exprimieren. Die Expression des geeigneten MHC der Klasse I oder
Klasse II zusammen mit einem Peptid, das die Aktivität eines
B-Lymphozytenantigens hat (z.B. B7-1, B7-2, GL50), induziert eine
T-Zellvermittelte Immunantwort gegen die transfizierte Tumorzelle.
Wahlweise kann ein Gen, das ein Antisense-Konstrukt codiert, welches
die Expression eines MHC-Klasse-II-assoziierten Proteins hemmt,
wie zum Beispiel die invariante Kette, ebenfalls mit einer DNA co-transfiziert
werden, die ein GL50-Polypeptid codiert, um die Präsentation
von tumorassoziierten Antigenen zu fördern und eine tumorspezifische
Immunität
zu induzieren. Es hat sich gezeigt, dass die Expression von B7-1
durch B7-negative Mäusetumorzellen
T-Zellvermittelte spezifische Immunität induziert, begleitet von
einer Abstoßung
des Tumors und einem Langzeitschutz gegenüber Tumor-Challenge in Mäusen (Chen,
L. et al. (1992) Cell 71:1093-1102;
Townsend, S. E. und Allison, J. P. (1993) Science 259:368-370; Baskar,
S. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5687-5690). Die Induktion
einer T-Zellvermittelten Immunantwort in einem Menschen kann also
dazu ausreichen, dass dieser die tumorspezifische Toleranz überwindet.
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In
einem anderen Ausführungsbeispiel
kann eine aktivierende Form von einem oder mehreren GL50-Peptiden
(z.B. zum Beispiel auf einer Zelloberfläche exprimiert) einem tumorkranken
Patienten verabreicht werden, um ein costimulatorisches Signal an
die T-Zellen zu liefern und unter Verwendung von im Stand der Technik
bekannten Verfahren eine Immunität
gegen den Tumor zu induzieren.
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In
einem besonderen Ausführungsbeispiel
werden einem Individuum Zellen entnommen, die dann ex vivo kultiviert
werden, um die Population von T-Zellen zu vergrößern. In einem weiteren Ausführungsbeispiel werden
dann die T-Zellen einem Individuum zugeführt. T-Zellen können so
stimuliert werden, dass sie in vitro profilieren, indem man zum
Beispiel ein primäres
Aktivierungssignal und ein costimulatorisches Signal an die T-Zellen
schickt, wie dies im Stand der Technik bekannt ist. Verschiedene
Formen von GL50-Polypeptiden können
ebenfalls verwendet werden, um die Proliferation von T-Zellen zu
costimulieren. In einem Ausführungsbeispiel
werden T-Zellen nach dem Verfahren, das in der PCT-Anmeldung Nr.
WO 94/29436 beschrieben
ist, ex vivo kultiviert. Das costimulatorische Molekül kann löslich, an
einer Zellmembran befestigt oder an einer soliden Fläche, wie
zum Beispiel ein Kügelchen,
befestigt sein.
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B. Identifizierung von Zytokinen, die
durch GL50-vermittelte Costimulation induziert sind
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Die
hierin beschriebenen GL50-Moleküle
können
verwendet werden, um Zytokine zu identifizieren, die als Reaktion
auf eine Stimulierung durch ein GL50-Polypeptid von T-Zellen produziert
worden sind. T-Zellen können
suboptimal in vitro mit einem primären Aktivierungssignal stimuliert
werden, wie zum Beispiel Phorbolester, Antikörper gegen CD3 oder vorzugsweise
Antigen zusammen mit einem MHC-Klasse-II-Molekül, und von einer stimulatorischen
Form von GL50-Antigen, zum Beispiel von einer Zelle, die mit einer
Nukleinsäure transfiziert
ist, welche ein GL50-Polypeptid codiert und das Peptid auf ihrer
Oberfläche
exprimiert, oder von einer löslichen,
stimulatorischen Form des Peptids, ein costimulatorisches Signal
erhalten. Bekannte Zytokine, die in das Medium gegeben werden, können durch
ELISA oder durch einen Antikörper,
der das Zytokin hemmt und die Fähigkeit
hat, die T-Zellproliferation oder die Proliferation von anderen
Zelltypen, die durch Zytokin induziert ist, zu inhibieren, identifiziert
werden. Ein IL-4 ELISA-Kit ist von Genzyme (Cambridge MA) erhältlich, genauso
wie ein IL-7-blockierender Antikörper.
Blockierende Antikörper
gegen IL-9 und IL-12 sind vom Genetics Institute (Cambridge, MA)
erhältlich.
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Ein
in vitro Costimulationsassay von T-Zellen, wie er vorstehend beschrieben
ist, kann ebenfalls in einem Verfahren verwendet werden, das darauf
abzielt, neuartige Zytokine zu identifizieren, die durch Costimulation
induziert werden können.
Wo zum Beispiel die Stimulation der CD28/CTLA4-Wege die IL-2-Sekretion
zu verstärken
scheint, scheint die Stimulation der ICOS-Wege die IL-10-Sekretion
zu verstärken
(Hutloff et al. 199. Nature 397:263). Wenn eine bestimmte Aktivität, die durch
Costimulation induziert worden ist, z.B. T-Zellproliferation, nicht
inhibiert werden kann, indem man bekannten Zytokinen blockierende
Antikörper
hinzufügt, resultiert
die Aktivität
möglicherweise
von der Wirkung eines unbekannten Zytokins. Nach der Costimulation könnte man
dieses Zytokin durch herkömmliche
Verfahren von dem Medium reinigen und seine Aktivität messen,
indem man sich seine Fähigkeit
zunutze macht, die T-Zellproliferation zu induzieren.
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Zur
Identifizierung von Zytokinen, welche die Induktion von Toleranz
verhindern können,
kann ein in vitro Costimulationsassay von T-Zellen verwendet werden,
wie er vorstehend beschrieben ist. In diesem Fall würde man
ein primäres
Aktivierungssignal an die T-Zellen schicken und sie mit einem ausgewählten Zytokin in
Kontakt bringen, ohne ein costimulatorisches Signal an die T-Zellen
zu schicken. Nach dem Waschen und Verweilen der T-Zellen würde man
die Zellen erneut sowohl mit dem primären Aktivierungssignal als
auch mit einem costimulatorischen Signal stimulieren. Wenn die T-Zellen
nicht antworten (z.B. Zytokine proliferieren oder produzieren),
ist in ihnen Toleranz ausgelöst
worden, und das Zytokin hat die Induktion der Toleranz nicht verhindert.
Wenn die T-Zellen jedoch antworten, hat das Zytokin die Induktion
der Toleranz verhindert. Zytokine mit der Fähigkeit, die Induktion von
Toleranz zu verhindern, können
für die
Blockierung in vivo in Verbindung mit Reagenzien, welche die B-Lymphozytenantigene
blockieren, vorgesehen werden, was ein wirksameres Mittel ist, um
in Empfängern
von Transplantaten oder in Individuen mit einer Autoimmunkrankheit
Toleranz zu induzieren. Zum Beispiel könnte man einem Individuum ein
GL50-blockierendes Reagenz zusammen mit einem Zytokin-blockierendem
Antikörper
zuführen.
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C. Die Identifizierung von Molekülen mit
Einfluss auf die Costimulation
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Eine
andere Anwendung des Peptid mit der Aktivität eines erfindungsgemäßen neuen
B-Lymphozytantigens ist die Verwendung von einem oder mehreren dieser
Peptide in Screeningassays, um bis jetzt noch nicht bestimmte Moleküle zu entdecken,
die Modulatoren von costimulatorischer Ligandenbindung und/oder von
intrazellulärer
Signalübertragung
durch T-Zellen nach der Costimulation sind. Zum Beispiel könnte ein
Bindungstest an fester Phase unter Verwendung eines Peptids mit
der Aktivität
eines GL50-Moleküls
ausgeführt werden,
um Moleküle
zu identifizieren, an denen GL50 bindet und/oder welche die Bindung
des Antigens mit einem geeigneten T-Zellliganden (z.B. CD28, CTLA4
oder ICOS) inhibieren. Außerdem
könnte
ein in vitro Costimulationsassay von T-Zellen gemäß der vorstehenden
Beschreibung ausgeführt
werden, um Moleküle
zu identifizieren, welche die intrazelluläre Signalübertragung durch die T-Zellen
nach der Costimulation beeinträchtigen,
was anhand der Fähigkeit
dieser Moleküle
bestimmt wird, die T-Zellproliferation und/oder die Zytokinproduktion
zu inhibieren (die jedoch nicht die Bindung eines GL50-Moleküls an seinen
Liganden verhindern). Die Verbindung Zyklosporin A und Rapamycin
inhibieren zum Beispiel die T-Zellaktivierung durch Stimulierung über den
T-Zellrezeptorweg, jedoch nicht über
den CD28/CTLA4-Weg. Ein anderer intrazellulärer Signalweg ist also in die
Costimulation involviert. Moleküle,
welche die intrazelluläre
Signalübertragung über den
CD28/CTLA4- und/oder den ICOS-Weg beeinträchtigen, können als immunsuppressive Agenzien
in vivo mit oder ohne die Verwendung eines zusätzlichen Immunsuppressors,
wie zum Beispiel Zyklosporin A oder Rapamycin, wirksam sein.
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D. Identifizierung von Molekülen, welche
die Expression eines GL50-Polypeptids modulieren
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Die
Antikörper,
die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Proteine und Peptide hergestellt
worden sind, können
in einem Screeningassay zur Identifizierung von Molekülen, welche
die Expression eines GL50-Polypeptids auf Zellen modulieren, verwendet
werden. Moleküle,
welche die intrazelluläre
Signalübertragung
beeinträchtigen,
was zur Induktion der Expression von GL50-Polypeptiden führt, z.B.
als Reaktion auf Aktivierungssignale, können zum Beispiel identifiziert
werden, indem man die Expression von einem oder mehreren GL50-Polypeptiden
auf der Zelloberfläche
untersucht. Eine reduzierte Immunfluoreszenzfärbung durch einen Antikörper gegen
GL50 in Anwesenheit des Moleküls
würde darauf
hinweisen, dass das Molekül
intrazelluläre
Signale inhibiert. Moleküle,
welche die Expression eines GL50-Polypeptids hochregeln, führen eine verstärkte Immunfluoreszenzfärbung herbei.
Alternativ kann die Wirkung eines Moleküls auf die Expression eines
GL50-Polypeptids bestimmt werden, indem man unter Verwendung einer
erfindungsgemäßen Sonde
zelluläre
mRNA-Spiegel von GL50 detektiert. Zum Beispiel kann eine Zelle,
die ein GL50-Polypeptid exprimiert, mit einem Molekül in Kontakt
gebracht werden, das getestet werden soll, und ein Anstieg oder
Abfall der mRNA-Spiegel von GL50 in der Zelle kann durch gewöhnliche Verfahren
detektiert werden, wie zum Beispiel die Northern-Hybridisierungsanalyse
oder die herkömmliche
Dot-Blot-Methode von mRNA oder Gesamt-poly(A+)RNAs
unter Verwendung einer mGL50-1-Sonde, die mit einem detektierbaren
Marker gekennzeichnet ist. Moleküle,
welche die Expression eines GL50-Polypeptids modulieren, können für die Hochregulation
oder Herunterregulation von Immunantworten, allein oder in Verbindung
mit löslichen
blockierenden oder stimulierenden Reagenzien, therapeutisch nützlich sein.
Zum Beispiel könnte
ein Molekül,
das die Expression von GL50 inhibiert, für immunsuppressive Zwecke zusammen
mit einem GL50-blockierendem Reagenz verabreicht werden. Moleküle, die
in den vorstehend beschriebenen Untersuchungen getestet werden können, beinhalten
Zytokine, wie zum Beispiel IL-4, gINF, IL-10, IL-12, GM-CSF und Prostaglandine.
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E. Screeningassays
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Die
Erfindung stellt ein Verfahren (hierin auch als "Screeningassay" bezeichnet) zur Identifizierung von Modulatoren
bereit, d.h. Kandidaten oder Testverbindungen oder Agenzien (z.B.
Peptide, Peptidomimetika, kleine Moleküle oder andere Medikamente),
die an GL50-Polypeptide oder Teile davon binden und eine stimulatorische
oder inhibitorische Wirkung haben, zum Beispiel auf die GL50-Expression
oder auf die GL50-Aktivität.
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In
einem Ausführungsbeispiel
stellt die Erfindung Untersuchungen zum Screenen von Kandidaten oder
Testverbindungen bereit, die an ein GL50-Polypeptid oder ein Polypeptid
oder einen biologischen Teil davon binden oder dessen Aktivität modulieren,
z.B. die Modulation der Fähigkeit
eines GL50-Polypeptids, mit einem Bindungspartner zu interagieren
(z.B. ein verwandter Ligand oder intrazellulärer Interakteur). In einem Ausführungsbeispiel
können
zum Beispiel Teile der extrazellulären Domäne von GL50 verwendet werden.
In einem anderen Ausführungsbeispiel
können
Teile der cytoplasmatischen Domäne
eines GL50-Moleküls
verwendet werden. In einem anderen Ausführungsbeispiel können Teile
der Transmembrandomäne
eines GL50-Moleküls
verwendet werden.
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In
einem Ausführungsbeispiel
können
Variantenformen eines Polypeptids, das eine GL50-Domäne umfasst,
in einem Screeningassay verwendet werden. Zum Beispiel können GL50-Domänen, die
eine Aminosäureänderung
aufweisen (z.B. die durch Verwendung einer Zufallsmutagenese oder
Kassettenmutagenese mutagenisiert worden sind), in den vorliegenden
Screeningassays verwendet werden. Alternativ können Spleißvarianten von intrazellulären GL50-Domänen (z.B.
intrazelluläre
GL50-1-Domäne,
cytoplasmatische GL50-2-Domäne
oder zusätzliche
Exone, die bei der Sequenzierung von Chromosom 21 oder durch RACE PCR
identifiziert worden sind) verwendet werden, um die Verbindungen
zu screenen. Solche GL50-Varianten können verwendet werden, um Verbindungen
mit einer Aktivität
gegen einen Bereich von GL50-Molekülen zu identifizieren, und
können
Aminosäurereste
identifizieren, die für
die GL50-Aktivität
wesentlich sind.
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Die
Testverbindungen der vorliegenden Erfindung kann man erhalten, indem
man einen der zahlreichen Ansätze
von im Stand der Technik bekannten Verfahren für kombinatorische Bibliotheken verwendet,
einschließlich
biologischer Bibliotheken; räumlich
adressierbarer Bibliotheken, parallel für Festphasen oder Lösungsphasen;
Verfahren für
synthetische Bibliotheken, die eine Dekonvolution erfahren; Bibliotheken,
in der jedes Harzkügelchen
nur eine Verbindung trägt
("one-bead one-compound"-Technik); und synthetischer
Bibliotheken, die zur Selektion die Affinitätschromatographie verwenden.
Der Ansatz der biologischen Bibliothek ist auf Peptidbibliotheken
beschränkt,
während
die anderen vier Ansätze
auf Peptide, Nicht-Peptid-Oligomere oder Verbindungsbibliotheken
für kleine
Moleküle
anwendbar sind (Lam, K. S. (1997) Anticancer Drug Des. 12:145).
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Beispiele
für Verfahren
für die
Synthese von molekularen Bibliotheken können im Stand der Technik gefunden
werden, zum Beispiel in DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 90:6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422;
Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al. (1993)
Science 261:1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Aufl.
Engl. 33:2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl.
33:2061; und in Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37:1233.
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Bibliotheken
für Verbindungen
können
in Lösung
(z.B. Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421) oder auf Harzkügelchen (Lam (1991) Nature
354:82-84), Spänen
(Fodor (1993) Nature 364:555-556),
Bakterien (Ladner USP 5,223,409), Sporen (Ladner USP '409), Plasmiden (Cull
et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869) oder auf
Phagen sein (Scott and Smith (1990) Science 249:386-390); (Devlin
(1990) Science 249:404-406); (Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad.
Sci. 87:6378-6382); (Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310); (Ladner
supra.).
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In
einem anderen Ausführungsbeispiel
ist ein Assay ein zellbasierter Assay, umfassend das Inkontaktbringen
einer Zelle, die ein GL50-Zielmolekül exprimiert (z.B. ein GL50-Ligand,
wie zum Beispiel ICOS oder intrazelluläre Interaktionsmoleküle), mit
einer Testverbindung und die Bestimmung der Fähigkeit der Testverbindung,
die Aktivität
des GL50-Zielmoleküls
zu modulieren (z.B. zu stimulieren oder zu inhibieren). In einem Ausführungsbeispiel
wird ein GL50-Zielmolekül
z.B. in einem Zwei-Hybrid-Assay oder Drei-Hybrid-Assay identifiziert.
In einem anderen Ausführungsbeispiel
wird ein GL50-Interaktionsmolekül
unter Verwendung von gewöhnlichen
Verfahren zur Vernetzung von GL50 mit benachbarten Molekülen, gefolgt
von einer Immunpräzipitation
mittels Antikörper
gegen GL50 identifiziert.
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In
einem Ausführungsbeispiel
können
Teile der Transmembranregionen und/oder der intrazellulären Regionen
wie definiert durch Hydropathie-Plots, oder Domänen wie definiert durch die
Exonstruktur, als "Bait" (Köderprotein)
in Zwei-Hybrid-Assays fungieren, um Bindungspartner für diese
Domänen
zu bestimmen. Interagierende Proteine können in Assays zur Messung
des Bindungsgrads von GL50 an Interaktionspartner zwecks eventueller
Produktion oder in Assays zur Qualitätskontrolle verwendet werden.
In einem anderen Ausführungsbeispiel
können
Spleißvarianten
der cytoplasmatischen Domäne
in anderen 2-Hybrid-Assays verwendet werden, um den gesamten Bereich
von interagierenden Proteinen, die an eine beliebige Spleißvariante von
GL50 binden, zu erfassen.
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Die
Fähigkeit
der Testverbindung, die Aktivität
eines GL50-Zielmoleküls
zu modulieren, kann man zum Beispiel dadurch bestimmen, dass man
die Fähigkeit
des GL50-Polypeptids bestimmt, an das GL50-Zielmolekül oder seinen
Liganden zu binden oder mit diesen zu interagieren. Die Bestimmung
der Fähigkeit
des GL50-Polypeptids, an einen Liganden eines GL50-Moleküls zu binden
oder mit diesem zu interagieren, erfolgt z.B. durch direkte Bindung.
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In
einem Assay für
direkte Bindung könnte
das GL50-Polypeptid mit einem Radioisotop oder einem enzymatischen
Marker gekoppelt werden, so dass die Bindung des GL50-Polypeptids
an ein GL50-Zielmolekül durch
die Detektion des markierten GL50-Polypeptids in einem Komplex bestimmt
werden kann. Zum Beispiel können
GL50-Moleküle,
z.B. GL50-Polypeptide, entweder direkt oder indirekt mit 125I, 35S, 14C oder 3H markiert werden,
und das Radioisotop kann durch direkte Zählung von Radioemission oder
durch Szintillationszählung nachgewiesen
werden. Alternativ können
GL50-Moleküle
enzymatisch markiert werden, zum Beispiel mit Meerrettichperoxidase,
alkalische Phosphatase oder Luziferase, und die enzymatische Markierung
kann durch die Bestimmung der Umwandlung eines geeigneten Substrats
in ein Produkt detektiert werden.
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Unter
den Schutzbereich dieser Erfindung fällt auch die Bestimmung der
Fähigkeit
einer Verbindung, die Interaktion zwischen GL50 und seinem Zielmolekül zu modulieren,
ohne dass irgendeiner der Interaktionspartner markiert ist. Zum
Beispiel kann ein Mikrophysiometer verwendet werden, um die Interaktion
zwischen GL50 und seinem Zielmolekül zu detektieren, ohne dass
GL50 oder das Zielmolekül
markiert ist. McConnell, H. M. et al. (1992) Science 257:1906-1912.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist ein "Mikrophysiometer" (z.B. Cytosensor) ein analytisches
Instrument, das unter Verwendung eines lichtadressierbaren potentiometrischen
Sensors (LAPS) die Geschwindigkeit misst, mit der eine Zelle ihre
Umgebung ansäuert. Änderungen dieser
Ansäuerungsgeschwindigkeit
können
als Indikator für
die Interaktion zwischen Verbindung und Rezeptor verwendet werden.
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In
einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
kann man die Fähigkeit
des GL50-Polypeptids, an einen GL50-Bindingspartner zu binden oder
mit diesem zu interagieren, dadurch bestimmen, dass man die Aktivität des Bindungspartners
bestimmt. Die Aktivität
des Zielmoleküls
kann zum Beispiel durch Detektion der Induktion eines zellulären Second
Messengers des Ziels (z.B. GL150 oder ein anderes Substrat an Tyrosinresten zu
phosphorylieren), durch Detektion der katalytischen oder enzymatischen
Aktivität
eines geeigneten Substrats, durch Detektion der Induktion eines
Reportergens (umfassend ein zielgesteuertes regulatorisches Element,
das mit einer Nukleinsäure
funktionell verbunden, die einen detektierbaren Marker codiert,
z.B. Chloramphenicolacetyltransferase), oder durch Detektion einer
zielregulierten zellulären
Antwort bestimmt werden. Die Fähigkeit
des GL50-Polypeptids, an ein GL50-Zielmolekül zu binden oder mit diesem
zu interagieren, kann zum Beispiel dadurch bestimmt werden, dass
man die Fähigkeit
einer Verbindung misst, die T-Zellcostimulation in einem Proliferationsassay
herunterzumodulieren, oder indem man die Fähigkeit eines GL50-Polypeptids beeinträchtigt,
an Antikörper
zu binden, die einen Teil des GL50-Polypeptids erkennen.
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In
noch einem anderen Ausführungsbeispiel
ist ein erfindungsgemäßer Assay
ein zellfreier Assay, in dem ein GL50-Polypeptid oder ein biologisch
aktiver Teil davon mit einer Testverbindung in Kontakt gebracht wird,
und die Fähigkeit
der Testverbindung bestimmt wird, an das GL50-Polypeptid oder seinen
biologisch aktiven Teil zu binden. Das Binden der Testverbindung
an das GL50-Polypeptid kann entweder direkt oder indirekt, wie vorstehend
beschrieben, bestimmt werden. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
beinhaltet der Assay das Inkontaktbringen des GL50-Polypeptids oder
des biologisch aktiven Teils davon mit einer bekannten Verbindung,
die an GL50 bindet, so dass ein Untersuchungsgemisch entsteht, das
Inkontaktbringen des Untersuchungsgemisches mit einer Testverbindung,
und das Bestimmen der Fähigkeit
der Testverbindung, mit einem GL50-Polypeptid zu interagieren, wobei
das Bestimmen der Fähigkeit
der Testverbindung, mit einem GL50-Polypeptid zu interagieren, das
Bestimmen der Fähigkeit
der Testverbindung umfasst, bevorzugter an ein GL50-Polypeptid oder
an dessen biologisch aktiven Teil zu binden als die bekannte Verbindung.
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In
einem anderen Ausführungsbeispiel
ist der Assay ein zellfreier Assay, in dem ein GL50-Polypeptid oder
ein biologisch aktiver Teil davon mit einer Testverbindung in Kontakt
gebracht wird, und die Fähigkeit
der Testverbindung bestimmt wird, die Aktivität des GL50-Polypeptids oder
von dessen biologisch aktiven Teil zu modulieren (z.B. zu stimulieren
oder zu inhibieren). Die Fähigkeit
der Testverbindung, die Aktivität
eines GL50-Polypeptids zu modulieren, kann man zum Beispiel dadurch
bestimmen, dass man mittels eines der vorstehenden Verfahren zur
Bestimmung von direkten Bindungen die Fähigkeit des GL50-Polypeptids
bestimmt, an ein GL50-Zielmolekül
oder an seinen Liganden zu binden. Zur Bestimmung der Fähigkeit
des GL50-Polypeptids, an ein GL50-Zielmolekül zu binden, kann man auch
eine Technologie wie zum Beispiel die biomolekulare Interaktionsanalyse
(BIA) in Echtzeit verwenden. Sjolander, S. und Urbaniczky, C. (1991)
Anal. Chem. 63:2338-2345 und Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct.
Biol. 5:699-705. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist "BIA" eine Technologie
zum Untersuchen von biospezifischen Interaktionen in Echtzeit, ohne
einen der Interaktionspartner zu markieren (z.B. BIAcore). Veränderungen
in dem optischen Phänomen
der Oberflächenplasmonresonanz
(SPR) können
als Indikator für
Echtzeitreaktionen zwischen biologischen Molekülen verwendet werden.
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In
einem alternativen Ausführungsbeispiel
kann man die Fähigkeit
der Testverbindung, die Aktivität
eines GL50-Polypeptids zu modulieren, dadurch bestimmen, dass man
die Fähigkeit
des GL50-Polypeptids bestimmt, die Aktivität eines GL50-Zielmoleküls weiter
zu modulieren (z.B. eine Komponente des GL50-vermittelten Signaltransduktionswegs).
Zum Beispiel kann man die Aktivität des Effektormoleküls auf einem
geeignetem Ziel oder das Binden des Effektors an ein geeignetes
Ziel bestimmen, wie es vorstehend beschrieben ist.
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In
noch einem anderen Ausführungsbeispiel
beinhaltet der zellfreie Assay das Inkontaktbringen eines GL50-Polypeptids
oder eines biologisch aktiven Teils davon mit einer bekannten Verbindung,
die an das GL50-Polypeptid bindet, so dass ein Untersuchungsgemisch
entsteht, das Inkontaktbringen des Untersuchungsgemisches mit einer
Testverbindung, und das Bestimmen der Fähigkeit der Testverbindung,
mit dem GL50-Polypeptid zu interagieren, wobei das Bestimmen der
Fähigkeit
der Testverbindung, mit dem GL50-Polypeptid zu interagieren, das
Bestimmen der Fähigkeit
des GL50-Polypeptids umfasst, vorzugsweise an ein GL50-Zielmolekül zu binden
oder dessen Aktivität
zu modulieren.
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Die
erfindungsgemäßen zellfreien
Assays eignen sich sowohl für
die Verwendung von löslichen
als auch von membrangebunden Formen von Proteinen (z.B. GL50-Polypeptide
oder biologisch aktive Teile davon, oder Rezeptoren, an die GL50
bindet). In dem Fall von zellfreien Assays, in denen eine membrangebundene
Form eines Proteins verwendet wird (z.B. ein GL50-Zelloberflächen-Rezeptor),
kann es wünschenswert sein,
einen Lösungsvermittler
zu verwenden, so dass die membrangebundene Form des Proteins in
Lösung gehalten
wird. Beispiele für
solche Lösungsvermittler
beinhalten nicht-ionische Detergenzien, wie zum Beispiel n-Oktylglukosid,
n-Dodecylglukosid, n-Dodecylmaltosid, Octanoyl-N-methylglucamid,
Decanoyl-N-methylglucamid,
Triton® X-100,
Triton® X-114,
Thesit®,
Isotridecypoly(ethylenglykolether)n, 3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylamminio]-1-propansulfonat
(CHAPS), 3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylamminio]-2-hydroxy-1-propansulfonat
(CHAPSO) oder N-dodecyl-N, N-Dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat.
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In
einem Ausführungsbeispiel
der vorstehenden erfindungsgemäßen Assayverfahren
kann es wünschenswert
sein, entweder GL50 oder sein Zielmolekül zu immobilisieren, um die
Trennung komplexierter Formen von unkomplexierten Formen von einem
oder beiden der Proteine zu erleichtern sowie der Automatisierung
des Assays Rechnung zu tragen. Das Binden einer Testverbindung an
ein GL50-Polypeptid oder die Interaktion zwischen einem GL50-Polypeptid
und einem Zielmolekül
in Anwesenheit und Abwesenheit einer Kandidatenverbindung kann in
einem Gefäß erfolgen,
das für
die Aufnahme der Reaktionspartner geeignet ist. Beispiele für solche
Gefäße beinhalten
Mikrotiterplatten, Teströhrchen
und Mikrozentrifugenröhrchen.
In einem Ausführungsbeispiel
kann ein Fusionsprotein bereitgestellt werden, das eine Domäne hinzufügt, die
einem oder beiden Proteinen die Bindung an eine Matrix erlaubt.
Zum Beispiel können
Glutathion-S-Transferase/GL50-Fusionsproteine
oder Glutathion-S-Transferase/Ziel-Fusionsproteine auf Glutathionsepharose-Beads
(Sigma Chemical, St. Louis, MO) oder Glutathion-derivatisierte Mikrotiterplatten
absorbiert werden, die dann mit der Testverbindung oder mit der
Testverbindung und entweder dem nicht-absorbiertem Zielprotein oder
einem GL50-Polypeptid kombiniert werden, woraufhin dieses Gemisch
unter Bedingungen, die für
eine Komplexbildung förderlich
sind (z.B. unter physiologischen Bedingungen für Salz und pH), inkubiert wird.
Nach der Inkubation werden die Beads bzw. die Mikroplattenvertiefungen
gewaschen, um sämtliche
ungebundenen Komponenten zu entfernen, im Fall von Beads wird die
Matrix immobilisiert, und der Komplex wird entweder direkt oder
indirekt bestimmt, zum Beispiel wie vorstehend beschrieben. Alternativ
kann man die Komplexe von der Matrix dissoziieren und unter Verwendung
von gewöhnlichen
Verfahren den Bindungsgrad oder die Aktivität von GL50 bestimmen.
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Andere
Techniken zur Immobilisierung von Proteinen auf Matrizen können ebenfalls
in den erfindungsgemäßen Screeningassays
verwendet werden. Zum Beispiel kann entweder ein GL50-Polypeptid
oder ein GL50-Zielmolekül
durch Verwendung einer Konjugation von Biotin und Streptavidin immobilisiert
werden. Biotinylierte GL50-Polypeptide oder GL50-Zielmoleküle können unter
Verwendung von im Stand der Technik wohl bekannten Verfahren (z.B.
Biotinylation Kit, Pierce Chemicals, Rockford, IL) aus Botin-NHS
(N-Hydroxysuccinimid) zubereitet werden und in den Vertiefungen
von mit Streptavidin beschichteten 96-Well-Platten (Pierce Chemical)
immobilisiert werden. Alternativ können Antikörper, die gegenüber GL50-Polypeptiden
oder GL50-Zielmolekülen
reaktiv sind, aber das Binden des GL50-Polypeptids an sein Zielmolekül nicht
beeinträchtigen,
in den Vertiefungen der Platte derivatisiert werden, und ungebundene
Zielpolypeptide oder GL50-Polypeptide können in den Vertiefungen durch
Antikörperkonjugation
eingefangen werden. Verfahren zum Detektieren solcher Komplexe,
neben jenen, die vorstehend in Bezug auf GST-immobiliiserte Komplexe
beschrieben sind, beinhalten die Immundetektion von Komplexen unter
Verwendung von Antikörpern,
die gegenüber
dem GL50-Polypeptid oder dem GL50-Zielmolekül reaktiv sind, sowie enzymgekoppelte
Assays, die auf der Detektion einer enzymatischen, mit dem GL50-Polypetid
oder GL50-Zielmolekül
assoziierten Aktivität
beruhen.
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In
einem anderen Ausführungsbeispiel
werden Modulatoren der GL50-Expression durch ein Verfahren identifiziert,
in dem eine Zelle mit einer Kandidatenverbindung in Kontakt gebracht
wird und die Expression von GL50-mRNA oder GL50-Protein in der Zelle
bestimmt wird. Der Expressionsgrad von GL50-mRNA oder GL50-Protein
in Anwesenheit der Kandidatenverbindung wird mit dem Expressionsgrad
von GL50-mRNA oder GL50-Protein in Abwesenheit der Kandidatenverbindung
verglichen. Auf der Basis dieses Vergleichs kann dann die Kandidatenverbindung
als Modulator der GL50-Expression identifiziert werden. Wenn zum
Beispiel die Expression von GL50-mRNA oder GL50-Protein in der Anwesenheit
der Kandidatenverbindung größer ist (z.B.
statistisch signifikant größer) als
in der Abwesenheit, ist die Kandidatenverbindung als Stimulator
der Expression von GL50-mRNA oder GL50-Protein identifiziert. Alternativ,
wenn die Expression von GL50-mRNA oder GL50-Protein in der Anwesenheit
der Kandidatenverbindung geringer ist (z.B. statistisch signifikant
kleiner) als in der Abwesenheit, ist die Kandidatenverbindung als
Inhibitor der Expression von GL50-mRNA oder GL50-Protein identifiziert.
Der Expressionsgrad von GL50-mRNA oder GL50-Protein in den Zellen
kann unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren für die Detektion
von GL50-mRNA oder GL50-Protein bestimmt werden.
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In
noch einem anderen Aspekt der Erfindung können die GL50-Polypeptide,
z.B. lösliche
oder membrangebundene Moleküle
oder Teile davon (z.B. Transmembranteile oder cytoplasmatische Teile),
als "Köderproteine" in einem Zwei-Hybrid-Assay
oder Drei-Hybrid-Assay verwendet werden (siehe z.B. das
US-amerikanische Patent Nr. 5,283,317 ;
Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J. Biol.
Chem. 268:12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924;
Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696; und Brent
WO94/10300 ), um andere Proteine zu
identifizieren, die an GL50 binden oder mit ihm interagieren ("GL50-bindende Proteine" oder "GL50-bP") und in die GL50-Aktivität involviert
sind. Es ist wahrscheinlich, dass solche GL50-bindenden Proteine
in die Übertragung
von Signalen von den GL50-Polypeptiden oder GL50-Zielen involviert
sind, zum Beispiel als vorgelagerte Elemente eines GL50-vermittelten
Signalwegs. Alternativ können
solche GL50-bindenden Proteine GL50-Inhibitoren sein.
-
Das
Zwei-Hybrid-System basiert auf der modularen Natur der meisten Transkriptionsfaktoren,
die aus trennbaren DNA-Bindungs- und DNA-Aktivierungsdomänen besteht.
Kurz gesagt, der Assay verwendet zwei unterschiedliche DNA-Konstrukte.
In einem Konstrukt ist das Gen, das für ein GL50-Polypeptid codiert,
an ein Gen fusioniert, das die DNA-Bindungsdomäne eines bekannten Transkriptionsfaktors
codiert (z.B. GAL-4). In dem anderen Konstrukt ist eine DNA-Sequenz
aus einer Bibliothek von DNA-Sequenzen, die ein nicht identifiziertes
Protein codiert, das "Prey" ("Beute") oder "Probe" genannt wird, an
ein Gen fusioniert, das für
die Aktivierungsdomäne
des bekannten Transkriptionsfaktors codiert. Wenn die "Bait"- und "Prey"-Proteine (Köder- und
Beute-Proteine) in der Lage sind, in vivo zu interagieren und dabei
einen GL50-abhängigen
Komplex bilden, nähern
sich die DNA-Bindungs- und DNA-Aktivierungsdomänen des Transkriptionsfaktors
einander stark an. Diese Nähe
erlaubt die Transkription eines Reportergens (z.B. LacZ), das mit
einer transkriptionellen regulatorischen Stelle, die auf den Transkriptionsfaktor
anspricht, funktionell verbunden ist. Man kann die Expression des
Reportergens detektieren und die Zellkolonien, die den funktionellen
Transkriptionsfaktor enthalten, isolieren und dazu verwenden, das
klonierte Gen zu erhalten, welches das Protein codiert, das mit
dem GL50-Polypeptid interagiert.
-
Diese
Erfindung betrifft ferner ein neue Agenzien, die mittels der vorstehend
beschriebenen Screeningassays identifiziert werden. Dementsprechend
fällt es
unter den Schutzumfang dieser Erfindung, in einem geeigneten Tiermodell
ein Agens zu verwenden, das wie hierin beschrieben identifiziert
wird. Ein Agens, das wie hierin beschrieben identifiziert wird (z.B.
ein GL50-modulierendes Agens, ein GL50-Antisense-Nukleinsäuremolekül, ein GL50-spezifischer
Antikörper
oder ein GL50-Bindungspartner), kann zum Beispiel in einem Tiermodell
verwendet werden, um die Wirksamkeit, die Toxizität oder die
Nebenwirkungen einer Behandlung mit einem solchen Agens zu bestimmen.
Alternativ kann ein Agens, das wie hierin beschrieben identifiziert
wird, in einem Tiermodell verwendet werden, um den Mechanismus der
Wirkung eines solchen Agens zu bestimmen. Des Weiteren betrifft
die Erfindung neuartige Agenzien, die mittels der vorstehend beschriebenen
Screeningassays identifiziert werden, und die für Behandlungen verwendet werden,
wie sie hierin beschrieben sind.
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F. Detektionsassays
-
Teile
oder Fragmente der hierin identifizierten cDNA-Sequenzen (und die
entsprechenden vollständigen
Gensequenzen) können
auf die verschiedenste Weise als Polynukleotidreagenzien verwendet
werden. Zum Beispiel können
diese Sequenzen verwendet werden, um (i) ihre jeweiligen Gene auf
einem Chromosom zu kartieren und somit Genregionen zu lokalisieren,
die mit genetischen Krankheiten assoziiert sind; (ii) ein Individuum
anhand einer winzigen biologischen Probe (Gewebetypisierung) zu
identifizieren; and (iii) bei der forensischen Identifizierung einer
biologischen Probe zu helfen. Diese Anwendungen sind in den folgenden
Unterabschnitten beschrieben.
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1. Chromosomenkartierung
-
GL50
ist auf dem humanem Chromosom 21q22 kartiert worden. Dementsprechend
können
hierin beschriebene Teile oder Fragmente von GL50-Nukleotidsequenzen
(sowohl codierende als auch nicht-codierende) verwendet werden,
um diese Sequenzen mit Genen in Beziehung zu setzen, die mit Krankheiten
assoziiert sind.
-
Die
physikalische Position einer Sequenz auf dem Chromosom kann mit
genetischen Kartierungsdaten in Beziehung gesetzt werden. (Solche
Daten findet man zum Beispiel in V. McKusick, Mendelian Inheritance
in Man, online erhältlich
bei der Welch Medical Library der Johns Hopkins Universität). Der
Zusammenhang zwischen einem Gen und einer Krankheit, die in dem
selben chromosomalen Bereich lokalisiert sind, kann durch eine Kopplungsanalyse
ermittelt werden (gemeinsames Erbgut von physikalisch benachbarten
Genen), zum Beispiel beschrieben in Egeland, J. et al. (1987) Nature,
325:783-787.
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Zudem
können
Unterschiede in den DNA-Sequenzen zwischen Individuen bestimmt werden,
die an einer mit dem GL50-Gen assoziierten Krankheit erkrankt sind
und jenen, die nicht daran erkrankt sind. Wenn in einigen oder allen
erkranken Individuen, jedoch in keinem der nicht erkrankten Individuen
eine Mutation beobachtet wird, dann ist wohl die Mutation der Verursacher
dieser speziellen Krankheit. Der Vergleich zwischen den erkrankten
und den nicht erkrankten Individuen involviert im Allgemeinen eine
erste Suche nach strukturellen Veränderungen in den Chromosomen,
wie zum Beispiel Deletionen oder Translokationen, die durch Spreitung
der Chromosomen ersichtlich werden oder mittels einer PCR auf Basis
dieser DNA-Sequenz detektierbar sind. Schließlich kann eine komplette Sequenzierung
von Genen aus verschiedenen Individuen ausgeführt werden, um das Vorhandensein
einer Mutation zu bestätigen
und Mutationen von Polymorphismen abzugrenzen.
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2. Gewebetypisierung
-
Die
erfindungsgemäßen GL50-Sequenen
können
auch dazu verwendet werden, Individuen anhand von winzigen biologischen
Proben zu identifizieren. Die Streitkräfte der Vereinigten Staaten
ziehen zum Beispiel in Erwägung,
die RFLP-Methode (Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus) zur Identifizierung
ihrer Mitglieder zu verwenden. Bei dieser Technik wird genomische
DNA eines Individuums mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen
verdaut und auf einem Southern-Blot sondiert, um einzelne Streifen
für die
Identifizierung zu erhalten. Dieses Verfahren weist nicht die derzeitigen
Einschränkungen
der sog. "Dog Tags", der militärischen
Erkennungsmarken auf, die verloren gehen, vertauscht oder gestohlen
werden können,
was eine positive Identifizierung erschwert. Die erfindungsgemäßen Sequenzen
sind zudem als zusätzliche
DNA-Marker für
die RFLP-Methode nützlich
(beschrieben in dem
US-amerikanischen
Patent 5,272,057 ).
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Des
Weiteren kann die erfindungsgemäße Sequenz
dazu verwendet werden, eine alternative Technik bereitzustellen,
welche die tatsächliche
Basensequenz der DNA von ausgewählten
Teilen des Genoms eines Individuums bestimmt. Die hierin beschriebene
GL50-Nukleotidsequenz kann also verwendet werden, um zwei PCR-Primer
aus den 5'- und
3'-Enden der Sequenzen
herzustellen. Diese Primer können
dann dazu verwendet werden, die DNA eines Individuums zu amplifizieren
und anschließend
zu sequenzieren.
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Gruppen
von entsprechenden DNA-Sequenzen von Individuen, die auf diese Weise
hergestellt worden sind, können
eindeutige individuelle Identifizierungen liefern, da jedes Individuum
aufgrund der Alleldifferenzen ein eindeutiges Set von solchen DNA-Sequenzen
haben wird. Die erfindungsgemäße Sequenz
kann verwendet werden, um solche Identifizierungssequenzen von Individuen
und von Gewebe zu erhalten. Die erfindungsgemäßen GL50-Nukleotidsequenzen
stellen nur beim Menschen vorkommende Teile des Genoms dar. Allelvarianten
treten bis zu einem gewissen Maß in
dem codierenden Regionen dieser Sequenzen auf, und in verstärktem Maße in den
nicht-codierenden
Regionen. Man schätzt,
dass Allelvarianten zwischen Menschen mit einer Häufigkeit
von etwa einem Mal pro 500 Basen auftreten. Jede der hierin beschriebenen
Sequenzen kann bis zu einem gewissen Grad als Norm verwendet werden,
mit der die DNA von einem Individuum zu Identifizierungszwecken
verglichen werden kann. Aufgrund der Tatsache, dass in den nicht-codierenden Regionen
häufiger
Polymorphismen auftreten, sind weniger Sequenzen erforderlich, um
Individuen voneinander zu unterscheiden. Die nicht-codierenden Sequenzen
von SEQ ID Nr. 1, 3 oder 5 können
mit einer Gruppe von Primern, die jeweils eine nicht-codierende
amplifizierte Sequenz aus 100 Basen ergeben, leicht eine eindeutige
Identifizierung von Individuen liefern. Wenn vorhergesagte codierende
Sequenzen verwendet werden, wäre
eine geeignetere Anzahl von Primern für eine positive Identifizierung
eines Individuums 500 bis 2000.
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Wenn
eine Gruppe von Reagenzien aus hierin beschriebenen GL50-Nukleotidsequenzen
verwendet wird, um eine Datenbank für eine eindeutige Identifizierung
eines Individuums zu erstellen, können später genau diese Reagenzien
auch dazu verwendet werden, Gewebe von diesem Individuum zu identifizieren.
Wenn die Datenbank für
eine eindeutige Identifizierung verwendet wird, kann eine positive
Identifizierung des Individuums, egal ob lebend oder tot, anhand
von extrem kleinen Gewebeproben gemacht werden.
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3. Die Verwendung von partiellen GL50-Sequenzen
in der forensischen Biologie
-
DNA-basierte
Identifizierungstechniken können
auch in der forensischen Biologie verwendet werden. Die forensische
Biologie ist ein wissenschaftliches Gebiet, das die genetische Typisierung
von biologischen Beweismitteln, die an Tatorten gefunden werden,
als Mittel einsetzt, um zum Beispiel Täter positiv zu identifizieren.
Zur Durchführung
einer solchen Identifizierung kann die PCR-Technologie verwendet
werden, um DNA-Sequenzen, die man sehr kleinen biologischen Proben
entnommen hat, wie etwa Gewebe, z.B. Haare oder Haut oder Körperflüssigkeiten,
z.B. Blut, Speichel oder Sperma, die am Tatort gefunden worden waren, zu
amplifizieren. Die amplifizierte Sequenz kann dann mit einer Vorgabe
verglichen werden, wodurch die Herkunft der biologischen Probe ermittelt
werden kann.
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Die
erfindungsgemäßen Sequenzen
können
verwendet werden, um Polynukleotid-Reagenzien bereitzustellen, z.B.
PCR-Primer, die für
spezielle Orte in dem humanen Genom geplant sind und die Zuverlässigkeit von
DNA-basierten forensischen Identifizierungen verbessern können, zum
Beispiel indem sie einen anderen "Identifikationsmarker" bereitstellen (d.h.
eine andere DNA-Sequenz, die eindeutig auf ein bestimmtes Individuum
hinweist). Wie oben erwähnt,
können
für die
Identifizierung Informationen über
die eigentliche Basensequenz verwendet werden, was eine präzise Alternative
zu Mustern darstellt, die von Fragmenten gebildet sind, die ein
Restriktionsenzym erzeugt hat. Sequenzen, die sich in nicht-codierenden
Regionen befinden, sind für diese
Verwendung besonders geeignet, da in nicht-codierenden Regionen
häufiger
Polymorphismen auftreten, was die Unterscheidung von Individuen
durch diese Technik erleichtert. Beispiele für Nukleotidreagenzien beinhalten
die GL50-Nukleotidsequenzen oder Teile davon, die eine Länge von
mindestens 20 Basen, vorzugsweise 30 Basen haben.
-
Die
hierin beschriebenen GL50-Nukleotidsequenzen können ferner dazu verwendet
werden, Polynukleotid-Reagenzien bereitzustellen, z.B. markierte
oder markierbare Sonden, die zum Beispiel in einem in situ Hybridisierungsverfahren
zur Identifizierung von spezifischen Geweben, z.B. Hirngewebe, verwendet
werden können.
Dies kann in Fällen
sehr hilfreich sein, in denen ein Pathologe ein Gewebe von unbekannter
Herkunft präsentiert
bekommt. Gruppen von Solchen GL50-Sonden können dazu verwendet werden,
Gewebe nach Spezies und/oder nach Organtyp zu bestimmen.
-
In
einer ähnlichen
Weise können
diese Reagenzien, z.B. GL50-Primer oder Sonden, dazu verwendet werden,
Gewebekulturen auf Kontamination zu untersuchen (d.h. auf das Vorhandensein
von einem Gemisch aus unterschiedlichen Arten von Zellen in einer
Kultur zu untersuchen).
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G. Die prädiktive Medizin
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft ferner das Gebiet der prädiktiven
Medizin, in der diagnostische Assays, prognostische Assays und die Überwachung
von klinischen Studien für
prognostische (prädiktive)
Zwecke verwendet werden, um dadurch ein Individuum prophylaktisch
behandeln zu können.
Folglich betrifft ein Aspekt der vorliegenden Erfindung diagnostische
Assays zur Bestimmung der Expression von GL50-Polypeptiden und/oder
GL50-Nukleinsäure
sowie der GL50-Aktivität
im Rahmen einer biologischen Probe (z.B. Blut, Serum, Zellen, Gewebe),
um dadurch zu bestimmen, ob ein Individuum von einer Krankheit oder
Störung
befallen ist oder ob das Individuum als gefährdet gilt, eine solche Krankheit
oder Störung
zu bekommen, die mit einer aberranten GL50-Expression oder GL50-Aktivität assoziiert
ist. Die Erfindung stellt zudem prognostische (oder prädiktive)
Assays bereit, mit denen ermittelt werden kann, ob die Gefahr für ein Individuum
besteht, eine Störung
zu bekommen, die mit der Expression von GL50-Polypeptiden bzw. GL50-Nukleinsäure oder
mit der Aktivität
von GL50-Polypeptiden bzw. GL50-Nukleinsäure assoziiert ist. Zum Beispiel
können
Mutationen in einem GL50-Gen in einer biologischen Probe untersucht
werden. Solche Assays können
für prognostische
oder prädiktive
Zwecke verwendet werden, um auf diese Weise ein Individuum prophylaktisch
behandeln zu können,
bevor die Störung
ausbricht, die durch die Expression von GL50-Polypeptiden bzw. GL50-Nukleinsäure oder
durch die Aktivität
von GL50-Polypeptiden bzw. GL50-Nukleinsäure charakterisiert ist oder
mit ihnen assoziiert ist.
-
Ein
anderer Aspekt der Erfindung betrifft die Überwachung des Einflusses von
Agenzien (z.B. Arzneimittel, Verbindungen) auf die Expression oder
die Aktivität
von GL50 in klinischen Studien.
-
Diese
und andere Agenzien werden in den folgenden Abschnitten detaillierter
beschrieben.
-
1. Diagnostische Assays
-
Ein
typisches Beispiel eines Verfahrens zum Nachweisen der Anwesenheit
oder Abwesenheit eines GL50-Polypeptids oder von Nukleinsäure in einer
biologischen Probe involviert das Beschaffen einer biologischen
Probe von einem Testindividuum und das Inkontaktbringen der biologischen
Probe mit einer Verbindung oder einem Agens, die bzw. das dazu fähig ist,
ein GL50-Polypeptid oder eine GL50-Nukleinsäure (z.B. mRNA, genomische
DNA), die ein GL50-Polypeptid codiert, zu detektieren, so dass die
Anwesenheit eines GL50-Polypeptid oder einer GL50-Nukleinsäure in der
biologischen Probe nachgewiesen ist. hin bevorzugtes Agens zum Nachweisen
von GL50-mRNA oder genomischer DNA ist eine markierte Nukleinsäurensonde,
die dazu fähig
ist, mit GL50-mRNA oder genomischer DNA zu hybridisieren. Die Nukleinsäurensonde
kann zum Beispiel eine hGL50-Nukleinsäure sein, wie zum Beispiel
die Nukleinsäure
von SEQ ID Nr. 1, 3 oder 5 oder ein Teil davon, wie zum Beispiel
ein Oligonukleotid mit einer Länge
von mindestens 15, 30, 50, 100, 250 oder 500 Nukleotiden und ausreichend,
um unter stringenten Bedingungen spezifisch mit GL50 mRNA oder genomischer
DNA zu hybridisieren. Andere Sonden, die für die Verwendung in erfindungsgemäßen diagnostischen Assays
geeignet sind, sind hierin beschrieben.
-
Ein
bevorzugtes Agens zum Nachweis eines GL50-Polypeptids ist ein Antikörper, der
an ein GL50-Polypeptid binden kann, vorzugsweise ein Antikörper mit
einer detektierbaren Markierung. Antikörper können polyklonal oder bevorzugter
monoklonal sein. Man kann einen intakten Antikörper oder ein Fragment davon
(z.B. Fab oder F(ab')2) verwenden. Der Begriff "markiert" soll, wenn er sich
auf eine Sonde oder auf einen Antikörper bezieht, die direkte Markierung
der Sonde bzw. des Antikörpers
durch das Koppeln (d.h. physikalisches Verbinden) einer detektierbaren
Substanz mit der Sonde bzw. mit dem Antikörper sowie die indirekte Markierung der
Sonde bzw. des Antikörpers
durch Reaktivität
mit einem anderen Reagenz, das direkt markiert ist, umfassen. Beispiele
für eine
indirekte Markierung beinhalten die Detektion eines primären Antikörpers unter
Verwendung eines fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörpers und Endmarkierung einer
DNA-Sonde mit Biotin, so dass sie mit fluoreszenzmarkiertem Streptavidin
detektiert werden kann. Der Begriff "biologische Probe" soll Gewebe, Zellen und biologische
Flüssigkeiten
beinhalten, die von einem Individuum isoliert worden sind, sowie Gewebe,
Zellen und Flüssigkeiten,
die sich in einem Individuum befinden. Das heißt, das erfindungsgemäße Detektionsverfahren
kann verwendet werden, um GL50-mRNA, GL50-Protein oder genomische
GL50-DNA in einer biologischen Probe in vitro sowie in vivo zu detektieren.
In vitro-Verfahren für
die Detektion von GL50-mRNA beinhalten Northern-Hybridisierungen
und in situ Hybridisierungen. In vitro-Verfahren für die Detektion
eines GL50-Polypeptids beinhalten enzymgebundene Immunosorbent-Assays
(ELISAs), Western Blots, Immunpräzipitationen
und Immunfluoreszenz. In vitro-Verfahren für die Detektion von genomischer GL50-DNA
beinhalten Southern-Hybridisierungen. In vivo-Verfahren für die Detektion
eines GL50-Polypeptids schließlich
beinhalten das Einbringen eines markierten Antikörpers gegen GL50 in ein Individuum.
Der Antikörper
kann zum Beispiel mit einem radioaktiven Marker markiert sein, dessen
Anwesenheit und Position in einem Individuum durch gewöhnliche
Bilddarstellungsverfahren detektiert werden können.
-
In
einem Ausführungsbeispiel
enthält
eine biologische Probe Proteinmoleküle von dem Testindividuum.
Alternativ kann die biologische Probe mRNA-Moleküle von dem Testindividuum oder
genomische DNA-Moleküle
von dem Testindividuum enthalten. Eine bevorzugte biologische Probe
ist eine Serumprobe, die mittels herkömmlicher Mittel von dem Testindividuum
isoliert wird.
-
In
einem anderen Ausführungsbeispiel
umfasst das Verfahren ferner das Beschaffen einer biologischen Probe
von einem Kontrollindividuum, das Inkontaktbringen der biologischen
Probe mit einer Verbindung oder mit einem Agens, die bzw. das dazu
fähig ist,
ein GL50-Polypeptid, GL50-mRNA oder genomische GL50-DNA zu detektieren,
so dass die Anwesenheit eines GL50-Polypeptids, von GL50-mRNA oder
von genomischer GL50-DNA in der biologischen Probe nachgewiesen
ist, und das Vergleichen der Anwesenheit des GL50 Polypeptids, der
GL50-mRNA oder der genomischen GL50-DNA in der Kontrollprobe mit
der Anwesenheit des GL50-Polypeptids, der GL50-mRNA oder der genomischen
GL50-DNA in der Testprobe.
-
Die
Erfindung umfasst ferner Kits zum Nachweisen der Anwesenheit von
GL50 in einer biologischen Probe. Das Kit kann zum Beispiel eine
markierte Verbindung oder ein markiertes Agens, die bzw. das ein GL50-Polypeptid
oder GL50-mRNA in einer biologischen Probe detektieren kann; Mittel
zum Bestimmen der Menge an GL50 in einer Probe; und Mittel zum Vergleichen
der Menge an GL50 in der Probe mit einer Vorgabe umfassen. Die Verbindung
bzw. das Agens kann in einem geeigneten Behälter verpackt sein. Das Kit
kann ferner eine Bedienungsanleitung des Kits zum Detektieren eines
GL50-Polypeptids oder einer Nukleinsäure umfassen.
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2. Prognostische Assays
-
Die
hierin beschriebenen diagnostischen Verfahren können zudem verwendet werden,
um Individuen zu identifizieren, die eine Krankheit oder Störung haben
oder die als gefährdet
gelten, eine solche Krankheit oder Störung zu bekommen, die mit einer
aberranten GL50-Expression oder GL50-Aktivität assoziiert ist. Die hierin
beschriebenen Assays, wie zum Beispiel die vorstehenden diagnostischen
Assays oder die folgenden Assays, können beispielsweise verwendet
werden, um ein Individuum zu identifizieren, das eine Krankheit
hat oder als gefährdet
gilt, diese Krankheit zu bekommen, die mit der Expression eines
GL50-Polypeptid bzw. einer GL50-Nukleinsäure oder mit der Aktivität eines
GL50-Polypeptid bzw. einer GL50-Nukleinsäure assoziiert ist. Die vorliegende
Erfindung bietet also ein Verfahren zur Identifizierung einer Krankheit
oder einer Störung,
die mit aberranter GL50-Expression oder GL50-Aktivität assoziiert
ist, in dem einem Individuum eine Testprobe entnommen wird und ein
GL50-Polypeptid oder eine GL50-Nukleinsäure (z.B. mRNA, genomische
DNA) detektiert wird, wobei die Anwesenheit eines GL50-Polypeptids
oder einer GL50-Nukleinsäure
diagnostisch für ein
Individuum ist, das eine Krankheit oder eine Störung hat bzw. das als gefährdet gilt,
eine Krankheit oder eine Störung,
die mit aberranter GL50-Expression oder GL50-Aktivität assoziiert
ist. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnet "Testprobe" eine biologische
Probe, die man einem betreffenden Individuum entnommen hat. Eine
Testprobe kann zum Beispiel eine biologische Flüssigkeit (z.B. Serum), eine
Zellprobe oder Gewebe sein.
-
Des
Weiteren können
die hierin beschriebenen prognostischen Assays verwendet werden,
um zu bestimmen, ob ein Agens (z.B. ein Agonist, Antagonist, Peptidomimetikum,
Protein, Peptid, Nukleinsäure,
kleines Molekül
oder ein sonstiger Arzneimittelkandidat) einem Individuum verabreicht
werden kann, um eine Krankheit oder eine Störung, die mit einer aberranten
GL50-Expression oder GL50-Aktivität assoziiert ist, zu behandeln.
Die vorliegende Erfindung bietet also ein Verfahren zur Bestimmung,
ob ein Individuum wirksam mit einem Agens für eine Störung behandelt werden kann,
die mit aberranter GL50-Expression oder GL50-Aktivität assoziiert
ist, in dem eine Testprobe beschafft wird und eine Expression oder
eine Aktivität
eines GL50-Polypeptids bzw. einer GL50-Nukleinsäure detektiert wird (z.B. wobei
die Häufigkeit
der Expression oder Aktivität eines
GL50-Polypeptids oder einer GL50-Nukleinsäure für ein Individuum diagnostisch
ist, dem das Agens verabfolgt werden kann, um eine Störung zu
behandeln, die mit aberranter GL50-Expression bzw. GL50-Aktivität assoziiert
ist).
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Die
erfindungsgemäßen Verfahren
können
zudem dazu verwendet werden, genetische Veränderungen in einem GL50-Gen
zu detektieren und dabei zu bestimmen, ob ein Individuum mit dem
veränderten
Gen als gefährdet
gilt, eine Störung
zu bekommen, die mit dem GL50-Gen assoziiert ist. In bevorzugten
Ausführungsbeispielen
beinhalten die Verfahren die Detektion in einer Zellprobe der Anwesenheit
oder Abwesenheit einer genetischen Veränderung, die dadurch gekennzeichnet
ist, dass mindestens eine der Veränderungen sich auf die Unversehrtheit
eines Gens, das ein GL50-Protein codiert, oder die Missexpression
des GL50-Gens auswirkt. Solche genetischen Veränderungen können zum Beispiel dadurch detektiert
werden, dass man die Existenz von mindestens einer der folgenden
Möglichkeiten
einwandfrei feststellt: 1) eine Deletion von einem oder mehreren
Nukleotiden von einem GL50-Gen; 2) eine Zugabe von einem oder mehreren
Nukleotiden zu einem GL50-Gen; 3) eine Substitution von einem oder
mehreren Nukleotiden eines GL50-Gens, 4) eine Neuanordnung der Chromosomen
eines GL50-Gens; 5) eine Veränderung
in der Stufe eines Transkripts der Boten-RNA eines GL50-Gens, 6)
eine aberrante Modifikation eines GL50-Gens, wie zum Beispiel des
Methylierungsmusters der genomischen DNA, 7) die Anwesenheit eines
Nicht-Wildtyp-Spleißmusters
eines Transkripts der Boten-RNA eines GL50-Gens, 8) eine Nicht-Wildtyp-Stufe eines GL50-Polypeptids,
9) der Allelverlust eines GL50-Gens, und 10) die unangebrachte posttranslationale
Modifikation eines GL50-Polypeptids. Wie hierin beschrieben, ist
die Anzahl der Assayverfahren groß, die im Stand der Technik
bekannt sind und verwendet werden können, um Alterationen in einem
Gen zu detektieren. Eine bevorzugte biologische Probe ist ein Gewebe
oder ein Serum, das mittels herkömmlicher
Mittel von einem Individuum isoliert worden ist, z.B. eine kardiale
Gewebeprobe.
-
In
bestimmten Ausführungsbeispielen
involviert die Detektion der Alteration die Verwendung einer Sonde
bzw. eines Primers in einer Polymerasekettenreaktion (PCR) (siehe
z.B. die
US-amerikanischen Patente
Nr. 4,683,195 und
4,683,202 ),
wie zum Beispiel eine Anker-PCR oder RACE-PCR, oder alternativ in
einer Ligase-Kettenreaktion (LCR) (siehe z.B. Landegran et al. (1988)
Science 241:1077-1080; und Nakazawa et al. (1994) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 91:360-364), wobei die Ligase-Kettenreaktion insbesondere
für die
Detektion von Punktmutationen in dem GL50-Gen nützlich ist (siehe Abravaya
et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23:675-682). Das Verfahren kann
die Schritte des Entnehmens einer Zellprobe von einem Patienten,
das Isolieren von Nukleinsäure
(z.B. genomisch, mRNA oder beide) aus den Zellen der Probe, das
Inkontaktbringen der Nukleinsäureprobe
mit einem oder mehreren Primern, die unter stringenten Bedingungen
spezifisch mit einem GL50-Gen hybridisieren, so dass eine Hybridisierung
und eine Amplifikation des GL50-Gens (falls vorhanden) erfolgen,
und die Detektion der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Amplifikationsprodukts
oder die Ermittlung der Größe des Amplifikationsprodukts
und das Vergleichen der Länge
mit einer Kontollprobe. Voraussichtlich wird es wohl erwünscht sein,
eine PCR und/oder LCR als einleitenden Schritt zusammen mit irgendeiner
der hierin beschriebenen Verfahren zur Detektion von Mutationen
zu verwenden.
-
Alternative
Amplifikationsverfahren beinhalten die selbstunterhaltende Sequenzreplikation
(Guatelli, J.C. et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878),
das transkriptionsbasierte Amplifikationssystem (Kwoh, D.Y. et al.,
(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), die Q-Beta-Replikase (Lizardi,
P.M. et al. (1988) Bio-Technology 6:1197), oder jegliches andere
Nukleinsäureamplifikationsverfahren
mit einer anschließenden
Detektion der amplifizierten Moleküle unter Verwendung Verfahren,
die dem Fachmann auf diesem Gebiet wohl bekannt sind. Diese Detektionsschemata
sind insbesondere dann für
die Detektion von Nukleinsäuremolekülen nützlich,
wenn diese Moleküle
in sehr geringer Anzahl vorhanden sind.
-
In
einem alternativen Ausführungsbeispiel
können
Mutationen in einem GL50-Gen anhand von Alterationen in Restriktionsenzymspaltungsmustern
identifiziert werden. Zum Beispiel wird Probe-DNA und Kontroll-DNA
isoliert, amplifiziert (optional), mit einer oder mehreren Restriktionsendonukleasen
verdaut, und mittels Gelelektrophorese werden die Längengrößen der
Fragmente bestimmt und verglichen. Differenzen in der Längengröße der Fragmente
zwischen der Probe-DNA und der Kontroll-DNA lassen auf Mutationen
in der Probe-DNA schließen. Überdies
können
sequenzspezifische Ribozymen (siehe zum Beispiel das
US-amerikanische Patent Nr. 5,498,531 )
dazu genutzt werden, auf das Vorhandensein von spezifischen Mutationen
durch die Entwicklung einer neuen Riboyzmspaltstelle oder durch
den Wegfall einer solchen zu testen.
-
In
anderen Ausführungsbeispielen
können
genetische Mutationen in GL50 identifiziert werden, indem man eine
Probe und Kontroll-Nukleinsäuren,
z.B. DNA oder RNA, mit High-Density-Arrays hybridisiert, die Hunderte
oder Tausende von Oligonukleotidsonden enthalten (Cronin, M.T. et
al. (1996) Human Mutation 7:244-255; Kozal, M.J. et al. (1996) Nature
Medicine 2:753-759). Genetische Mutationen in GL50 können zum Beispiel
in zweidimensionalen Arrays identifiziert werden, die lichterzeugte
DNA-Sonden enthalten, wie in Cronin, M.T. et al. supra beschrieben.
Kurz gesagt, ein erstes Hybridisierungsarray von Sonden kann verwendet werden,
um durch lange DNA-Stücke
in einer Probe zu scannen und sie zu kontrollieren, um Basenwechsel zwischen
den Sequenzen zu identifizieren, indem man lineare Arrays von sequenziellen überlappenden
Sonden macht. Dieser Schritt erlaubt die Identifizierung von Punktmutationen.
Diesem Schritt folgt ein zweites Hybridisierungsarray, das die Charakterisierung
von spezifischen Mutationen erlaubt, da es kleinere, spezialisierte
Sondenarrays verwendet, die komplementär zu allen detektierten Varianten
oder Mutationen sind. Jedes Mutationsarray besteht aus einem Set
paralleler Sonden, von denen die eine komplementär zu dem Wildtyp-Gen ist, und
die andere komplementär
zu dem Mutantengen ist.
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In
noch einem anderen Ausführungsbeispiel
kann eine beliebige aus einer Vielzahl von im Stand der Technik
bekannten Sequenzierungsreaktionen verwendet werden, um das GL50-Gen
direkt zu sequenzieren und Mutationen zu detektieren, indem man
die Sequenz der GL50-Probe mit der entsprechenden Wildtyp-Sequenz
(Kontrollsequenz) vergleicht. Beispiele für Sequenzierungsreaktionen
beinhalten jene, die auf den von Maxam und Gilbert ((1977) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 74:560) oder Sanger ((1977) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 74:5463) entwickelten Techniken basieren. Ebenso wird in
Betracht gezogen, dass für
die Ausführung
von diagnostischen Assays irgendeines aus einer Vielzahl von automatisierten
Sequenzierungsverfahren verwendet werden kann ((1995) Biotechniques
19:448), einschließlich
Sequenzierung durch Massenspektrometrie (siehe z.B. die Internationale
PCT-Veröffentlichung
Nr.
WO 94/16101 ; Cohen
et al. (1996) Adv. Chromatogr. 36:127-162; und Griffin et al. (1993)
Appl. Biochem. Biotechnol. 38:147-159).
-
Andere
Verfahren zum Detektieren von Mutationen in dem GL50-Gen beinhalten
Verfahren, in denen Schutz gegen Spaltungsagenzien verwendet wird,
um nicht übereinstimmende
Basen in RNA/RNA- oder RNA/DNA-Heteroduplices zu detektieren (Myers
et al. (1985) Science 230: 1242). Im Allgemeinen beginnt das herkömmliche
Verfahren der "Mismatch
Cleavage" (Spaltung
von Fehlpaarungen) mit dem Bereitstellen von Heteroduplices, die
durch Hybridisierung von (markierter) RNA oder DNA, welche die Wildtyp-GL50-Sequenz enthält, entstanden
sind, wobei man möglicherweise
mutierende RNA oder DNA aus einer Gewebeprobe erhält. Die
doppelsträngigen
Duplices werden mit einem Agens behandelt, welches das Duplex in
einzelsträngige
Bereiche spaltet, so wie jene, die auf Basenfehlpaarungen zwischen
den Kontroll- und Proben-Strängen zurückzuführen sind.
RNA/DNA-Duplice können
zum Beispiel mit RNase und DNA/DNA-Hybriden behandelt werden, die
mit S1-Nuklease behandelt wurden, um die Fehlpaarungsbereiche enzymatisch
zu verdauen. In anderen Ausführungsbeispielen
können
entweder DNA/DNA- oder RNA/DNA-Duplice mit Hydroxylamin oder Osmiumtetroxid
und mit Piperidin behandelt werden, um Fehlpaarungsbereiche zu verdauen.
Nach der Digestion der Fehlpaarungsbereiche wird dann das resultierende
Material auf denaturierenden Polyacrylamidgelen nach Größe isoliert,
um die Mutationsstelle zu bestimmen. Siehe zum Beispiel Cotton et
al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4397; Saleeba et al. (1992)
Methods Enzymol. 217:286-295. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
kann die Kontroll-DNA bzw. Kontroll-RNA zur Detektion markiert werden.
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In
noch einem anderen Ausführungsbeispiel
werden für
die Spaltungsreaktion von Fehlpaarungen in einem definierten System
zur Detektion und Kartierung von Punktmutationen in GL50s, die man
aus Zellproben gewonnen hat, ein oder mehrere Proteine verwendet,
die fehlgepaarte Basenpaare in einer doppelsträngigen DNA erkennen (sogenannte "DNA-Reparaturenzyme
für Fehlpaarungen"). Zum Beispiel spaltet
das Enzym mutY aus E. coli A bei G/A Fehlpaarungen und die Thymidin-DNA-Glycosylase
von HeLa-Zellen spaltet T bei G/T Fehlpaarungen (Hsu et al. (1994)
Carcinogenesis 15:1657-1662). Gemäß einem exemplarischen Ausführungsbeispiel
wird eine Sonde, die auf einer GL50-Sequenz basiert, z.B. eine GL50-Wildtyp-Sequenz, mit
einer cDNA oder einem anderen DNA-Produkt aus einer oder mehreren
Testzellen hybridisiert. Das Duplex wird mit einem DNA-Reparaturenzym
für Fehlpaarungen
behandelt, und die Spaltungsprodukte, falls vorhanden, können anhand
von Elektrophoreseprotokollen oder ähnlichem detektiert werden.
Siehe zum Beispiel das
US-amerikanische
Patent Nr. 5,459,039 .
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In
anderen Ausführungsbeispielen
werden Alterationen in der elektrophoretischen Mobilität verwendet,
um Mutationen in GL50-Genen zu identifizieren. Zum Beispiel kann
eine Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus-Analyse
(engl. Abk.: SSCP) verwendet werden, um Differenzen in der elektrophoretischen
Mobilität
zwischen mutierenden und Wildtyp-Nukleinsäuren zu detektieren (Orita
et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 86:2766, siehe auch Cotton
(1993) Mutat. Res. 285:125-144; und Hayashi (1992) Genet. Anal.
Tech. Appl. 9:73-79). Einzelsträngige
DNA-Fragmente von GL50-Probennukleinsäuren und
GL50-Kontrollnukleinsäuren
werden denaturiert; dann lässt
man sie renaturieren. Die sekundäre
Struktur von einsträngigen
Nukleinsäuren
variiert entsprechend der Sequenz, und die resultierende Alteration
in der elektrophoretischen Mobilität ermöglicht sogar die Detektion
eines Einzelbasenaustausches. Die DNA-Fragmente können zur
Detektion markiert werden oder mittels markierter Sonden detektiert
werden. Die Empfindlichkeit des Assays kann verbessert werden, indem
man RNA verwendet (bevorzugter als DNA), in der die sekundäre Struktur
empfindlicher gegenüber
einem Sequenzaustausch ist. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
verwendet das betreffende Verfahren die Heteroduplex-Analyse, um
auf der Basis von Änderungen
in der elektrophoretischen Mobilität doppelsträngige Heteroduplexmoleküle zu isolieren
(Keen et al. (1991) Trends Genet 7:5).
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In
noch einem anderen Ausführungsbeispiel
wird die Bewegung der Mutanten- oder Wildtyp-Fragmente in Polyacrylamidgelen, die
einen denaturierenden Gradienten enthalten, unter Verwendung einer
denaturierenden Gradienten-Gelelektrophorese (DGGE) untersucht (Myers
et al. (1985) Nature 313:495). Wird als Analyseverfahren eine DGGE
verwendet, so wird die DNA modifiziert, um sicherzustellen, dass
sie nicht vollständig
denaturiert wird, zum Beispiel durch Anhängen über die PCR einer GC-Klammer,
die eine Länge
von ca. 40 bp hat und aus hochschmelzender GC-reicher DNA besteht.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel
wird anstatt eines denaturierenden Gradienten ein Temperaturgradient
verwendet, um Differenzen in der Mobilität von Kontroll- und Probe-DNA
zu identifizieren (Rosenbaum und Reissner (1987) Biophys. Chem.
265:12753).
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Beispiele
für andere
Verfahren zur Detektion von Punktmutationen beinhalten, sind aber
nicht darauf beschränkt,
selektive Oligonukleotidhybridisierung, selektive Amplifikation
oder selektive Primerextension. Zum Beispiel können Oligonukleotidprimer hergestellt
werden, in denen die bekannte Mutation zentral platziert und dann
mit einer Ziel-DNA unter Bedingungen, die nur bei perfekter Basenpaarung
eine Hybridisierung erlauben, hybridisiert wird (Saiki et al. (1986)
Nature 324:163); Saiki et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6230).
Solche allelspezifischen Oligonukleotide werden mit PCR-amplifizierter
Ziel-DNA oder einer Reihe von unterschiedlichen Mutationen hybridisiert,
wenn die Oligonukleotide an der hybridisierenden Membran befestigt
sind, und mit markierter Ziel-DNA hybridisiert.
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Alternativ
kann man eine allelspezifische Amplifikationstechnik, die auf einer
selektiven PCR-Amplifikation beruht, in Verbindung mit der vorliegenden
Erfindung verwenden. Oligonukleotide, die als Primer für eine spezifische
Amplifikation verwendet werden, können die Mutation von Interesse
in die Mitte des Moleküls (so
dass die Amplifikation auf einer differentiellen Hybridisierung
beruht) (Gibbs et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:2437-2448) oder
an das äußerste 3'-Ende von einem Primer
bringen, wo die Fehlpaarung unter geeigneten Bedingungen die Polymeraseverlängerung
verhindern oder reduzieren kann (Prossner et al. (1993) Tibtech
11:238). Außerdem
kann es wünschenswert
sein, eine neue Restriktionsstelle in den Bereich der Mutation einzubringen,
um eine spaltungsbasierte Detektion zu erschaffen (Gasparini et
al. (1992) Mol. Cell Probes 6:1). Man erwartet, dass die Amplifikation
in bestimmten Ausführungsformen
unter Verwendung von Taq-Ligase für die Amplifikation ausgeführt werden
kann (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:189). In solchen
Fällen
wird nur dann eine Ligation erfolgen, wenn an dem 3'-Ende der 5'-Sequenz eine perfekte
Basenpaarung vorliegt, so dass es möglich ist, das Vorhandensein
einer bekannten Mutation an einer spezifischen Stelle zu detektieren,
indem man das Vorhandensein oder Nicht-Vorhandensein einer Amplifikation überprüft.
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Die
hierin beschriebenen Verfahren können
zum Beispiel ausgeführt
werden, indem man Fertigpackungen mit diagnostischen Kits verwendet,
die mindestens eine Sonden-Nukleinsäure oder ein Antikörper-Reagenz
wie hierin beschrieben umfassen und sich problemlos verwenden lassen,
z.B. im klinischen Milieu, um Patienten, die Symptome für ein Leiden
oder für
eine Krankheit zeigen, die mit einem GL50-Gen verknüpft ist,
oder Patienten, in deren Familienanamnese eine derartige Krankheit
oder ein derartiges Leiden auftaucht, eine Diagnose zu stellen.
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Des
Weiteren kann jeglicher Zelltyp und jegliches Gewebe, in dem GL50
exprimiert wird, in den hierin beschriebenen prognostischen Assays
verwendet werden.
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VII. Die Verabreichung von GL50-modulierenden
Agenzien
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Erfindungsgemäße GL50-modulierende
Agenzien werden einem Individuum in einer biologisch verträglichen
und für
eine pharmazeutische in vivo-Verabreichung geeigneten Form verabreicht,
entweder um die T-Zellvermittelte Immunantwort zu verstärken oder
um diese zu unterdrücken.
Mit einer "biologisch
verträglichen
und für
eine in vivo-Verabreichung geeigneten Form" ist eine Form des zu verabreichenden
Proteins gemeint, in der jegliche toxischen Wirkungen durch die
therapeutischen Wirkungen des Proteins ausgeglichen werden. Der
Begriff soll lebende Organismen beinhalten, in denen eine Immunantwort
ausgelöst
werden kann, z.B. Säugetiere.
Beispiele für
Individuen beinhalten Mensche, Tiere, Katzen, Mäuse, Ratten und transgene Spezies
davon. Die Verabreichung eines Agens wie hierin beschrieben kann
in einer beliebigen pharmakologischen Form erfolgen, einschließlich einer
therapeutisch aktiven Menge eines Agens, entweder allein oder in Kombination
mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
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Die
Verabreichung einer therapeutisch aktiven Menge der erfindungsgemäßen therapeutischen
Zusammensetzungen ist definiert als eine Menge, ausreichend wirksam,
in ausreichenden Dosen und über
einen ausreichenden Zeitraum hinweg, um das gewünschte Ergebnis zu erhalten.
Eine therapeutisch aktive Menge von einem GL50-modulierenden Agens
kann zum Beispiel entsprechend Faktoren wie zum Beispiel der Krankheitszustand,
das Alter, das Geschlecht und das Gewicht des Individuums sowie
der Fähigkeit
des Peptids, eine gewünschte
Reaktion in dem Individuum auszulösen, variieren. Die Dosierungsregimen
können
so angepasst werden, dass sie die optimale therapeutische Reaktion
gewährleisten.
Zum Beispiel kann die Dosis über den
Tag verteilt verabreicht werden, oder die Dosis kann anteilmäßig, wie
von den Erfordernissen der therapeutischen Situation indiziert,
reduziert werden.
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Das
GL50-modulierende Agens (z.B. ein Peptid, ein Nukleinsäuremolekül oder ein
Antikörper)
kann auf bequeme Weise verabreicht werden, wie zum Beispiel durch
Injektion (subkutan, intravenös,
etc.), orale Verabreichung, Inhalation, transdermale Anwendung oder
rektale Verabreichung. In Abhängigkeit
von der Verabreichungsform kann die aktive Verbindung mit einem
Material beschichtet sein, das die Verbindung vor der Wirkung von
Enzymen, Säuren
und sonstigen natürlichen
Gegebenheiten schützt,
welche die Wirkung der Verbindung blockieren könnten. Wenn man zum Beispiel
das GL50-modulierende Agens auf andere Weise als parenteral verabreicht,
kann es erforderlich sein, das Peptid mit einem Material zu beschichten
oder das Peptid zusammen mit einem Material zu verabreichen, das
dessen Außerkraftsetzung
verhindert.
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Ein
GL50-modulierendes Agens kann dem Individuum in einem geeignetem
Träger,
Verdünnungsmittel
oder Adjuvans, zusammen mit Enzyminhibitoren oder in einem geeignetem
Träger
wie zum Beispiel Liposomen verabreicht werden. Pharmazeutisch akzeptable
Verdünnungsmittel
beinhalten salzhaltige und wässrige
Pufferlösungen.
Der Begriff "Adjuvans" wird im weitesten
Sinne verwendet und beinhaltet sämtliche
stimulierenden Verbindungen, wie zum Beispiel Interferon. Adjuvanzien,
die hierin betrachtet werden, beinhalten Resorcine, nicht-ionische
Tenside, wie zum Beispiel Polyoxyethylenoleylether und n-Hexadecylpolyethylenether.
Enzyminhibitoren beinhalten pankreatische Trypsininhibitoren, Diisopropylfluorphosphat
(DFP) und Trasylol. Liposomen beinhalten Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsionen
sowie herkömmliche
Liposomen (Sterns et al., (1984) J. Neuroimmunol 7:27).
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Die
aktive Verbindung kann auch parenteral oder intraperitoneal verabreicht
werden. Dispersionen können
auch in Glycerol, flüssigen
Polyethylenglycolen und Gemischen davon und in 01 zubereitet werden. Unter
gewöhnlichen
Lager- und Nutzungsbedingungen können
diese Präparate
ein Konservierungsmittel enthalten, um die Entwicklung von Mikroorganismen
zu verhindern.
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Pharmazeutische
Zusammensetzungen, die sich für
injizierbare Anwendungen eignen, beinhalten sterile wässrige Lösungen (sofern
wasserlöslich)
oder Dispersionen und sterile Pulver für die magistrale Zubereitung
von sterilen injizierbaren Lösungen
oder Dispersionen. In allen Fällen muss
die Zusammensetzung steril sein und sollte in dem Maße flüssig sein,
dass sie leicht per Spritze verabreicht werden kann. Sie muss in
Hinblick auf Herstellungs- und Lagerbedingungen stabil sein und
muss gegen Verschmutzungen durch Mikroorganismen, wie zum Beispiel
Bakterien und Pilze, geschützt
sein. Der Träger
kann ein Lösungsmittel
oder Dispersionsmittel sein, das zum Beispiel Wasser, Ethanol, Polyol
(zum Beispiel Glyzerol, Propylenglykol, flüssiger Polyethylenglykol, u.ä.), und
geeignete Gemische davon enthält.
Das geeignete Fließvermögen kann
Beispiel durch die Verwendung einer Beschichtung, wie etwa Lezithin,
durch die Beibehaltung der erforderlichen Partikelgröße, wenn
es sich um eine Dispersion handelt, und durch die Verwendung von
Tensiden unterstützt
werden. Die Unterbindung von Einflüssen von Mikroorganismen kann
durch verschiedene antibakterielle und antifungale Agenzien erreicht
werden, zum Beispiel Parabene, Chlorobutanol, Phenol, Askorbinsäure, Thimerosal,
und dergleichen. In vielen Fällen
ist es erwünscht,
isotonische Agenzien in die Zusammensetzung aufzunehmen, zum Beispiel
Zucker, Polyalkohole wie Manitol, Sorbitol, Natriumchlorid. Verlängerte Absorption
der injizierbaren Zusammensetzungen kann erreicht werden, indem
man ein Agens in die Zusammensetzung aufnimmt, das die Absorption
verzögert,
zum Beispiel Aluminiummonostearat und Gelatine.
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Sterile
injizierbare Lösungen
können
durch Integrieren der aktiven Verbindung (z.B. ein GL50-Polypeptid
oder ein Antikörper
gegen GL50) in der erforderlichen Menge in einem geeigneten Lösungsmittel
mit einem der vorstehend aufgeführten
Bestandteile, oder, nach Bedarf, mit einer Kombination aus den vorstehend aufgeführten Bestandteilen,
und einer anschließenden
Sterilfiltration hergestellt werden. Dispersionen werden im Allgemeinen
zubereitet, indem man die aktive Verbindung in ein steriles Vehikel
einbringt, das ein basisches Dispersionsmittel und die erforderlichen
sonstigen Bestandteile aus der vorstehenden Aufzählung enthält. Bei sterilen Pulvern für die Herstellung
von sterilen injizierbaren Lösungen
sind die bevorzugten Zubereitungsverfahren die Vakuumtrocknung und
die Gefriertrocknung, wodurch man ein Pulver des aktiven Bestandteils
plus einen beliebigen zusätzlichen
gewünschten
Bestandteil aus einer zuvor sterilfiltrierten Lösung davon erhält.
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Wenn
die aktive Verbindung in der vorstehend beschriebenen Weise geeignet
geschützt
ist, kann das Protein oral verabreicht werden, zum Beispiel mit
einem inerten Verdünnungsmittel
oder einem vergleichbaren essbaren Träger. Im Rahmen der vorliegenden
Erfindung beinhaltet "pharmazeutisch
akzeptabler Träger" sämtliche
Lösungsmittel,
Dispersionsmittel, Beschichtungen, antibakteriellen und antifungalen
Agenzien, isotonischen und absorptionsverzögernden Agenzien, und dergleichen.
Die Verwendung von solchen Mitteln und Agenzien für pharmazeutisch
aktive Substanzen ist im Stand der Technik wohl bekannt. Sofern
die herkömmlichen
Mittel oder Agenzien nicht mit der aktiven Verbindung unverträglich sind,
wird deren Verwendung in den therapeutischen Zusammensetzungen in
Betracht gezogen. Ergänzende
aktive Verbindungen können
ebenfalls in die Zusammensetzungen eingearbeitet werden.
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Es
ist besonders vorteilhaft, parenteral Zusammensetzungen in Einnahmeeinheiten
zu formulieren, um die Verabreichung zu erleichtern und eine einheitliche
Dosierung sicherzustellen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung
bezeichnet Einnahmeeinheiten physikalisch getrennt Einheiten, die
als einheitliche Dosierung für
die zu behandelnden Säugetiere
geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorhergestimmte Menge der aktiven
Verbindung enthält,
die so berechnet ist, dass sie zusammen mit dem erforderlichen pharmazeutischen Träger die
gewünschte
therapeutische Wirkung erzeugt. Die Spezifikation der erfindungsgemäßen Einnahmeeinheiten
ist bedingt durch und direkt abhängig
von a) den individuellen Eigenschaften der wirksamen Verbindung
und der jeweiligen angestrebten therapeutischen Wirkung und b) den
Beschränkungen,
die der Herstellungstechnik einer solchen wirksamen Verbindung für die Behandlung
der Sensitivität
von Individuen inhärent sind.
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In
einem Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung wird einem Individuum eine therapeutisch wirksame
Menge eines Antikörpers
gegen ein GL50-Polypeptid verabreicht. Eine therapeutisch wirksame Menge
von Antikörpern
(d.h. eine wirksame Dosis) ist hierin definiert als eine Menge im
Bereich von etwa 0,001 bis 30 mg/kg Körpergewicht, vorzugsweise etwa
0,01 bis 25 mg/kg Körpergewicht,
bevorzugter etwa 0,1 bis 20 mg/kg Körpergewicht, und noch bevorzugter
etwa 1 to 10 mg/kg, 2 to 9 mg/kg, 3 to 8 mg/kg, 4 to 7 mg/kg oder
5 bis 6 mg/kg Körpergewicht.
Für den
Fachmann dieses Gebiets wird es ersichtlich sein, dass bestimmte Faktoren
die Dosis, die für
die effiziente Behandlung eines Individuums erforderlich sind, beeinflussen
können, unter
anderem die Schwere des Leidens oder der Krankheit, vorherige Behandlungen,
der allgemeine Gesundheitszustand und/oder das Alter des Individuums,
und sonstige aktuelle Krankheiten des Individuums. Des Weiteren
kann die Behandlung eines Individuums mit einer therapeutisch wirksamen
Menge an Antikörpern
eine Einzelbehandlung oder vorzugsweise eine Reihe von Behandlungen
beinhalten. In einem bevorzugten Beispiel wird ein Individuum ein
Mal pro Woche etwa 1 bis 10 Wochen, vorzugsweise 2 bis 8 Wochen,
bevorzugter etwa 3 bis 7 Wochen, und noch bevorzugter etwa 4, 5
oder 6 Wochen lang mit Antikörpern
im Bereich von zwischen etwa 0,1 und 20 mg/kg Körpergewicht behandelt. Ferner
wird man erkennen, dass die wirksame Dosis von Antikörpern, die
für die
Behandlung verwendet wird, sich im Laufe einer jeweiligen Behandlung
vergrößern oder
verringern kann. Änderungen
in der Dosierung können
aus den Ergebnissen der hierin beschriebenen diagnostischen Assays
resultieren.
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Die Überwachung
der Einwirkung von Agenzien (z.B. Arzneimittel oder Verbindungen)
auf die Expression bzw. Aktivität
eines GL50-Polypeptids kann nicht nur in allgemeinen Drogen- und
Medikamentenscreenings, sondern auch in klinischen Studien angewendet
werden. Zum Beispiel kann die durch einen hierin beschriebenen Screeningassay
bestimmte Wirksamkeit eines Agens hinsichtlich der Verstärkung der
GL50-Genexpression, der Erhöhung
des Proteinspiegels oder die Hochregulation der GL50-Aktivität in klinischen
Studien von Individuen, die eine verminderte GL50-Genexpression,
einen niedrigen Proteinspiegel und eine heruntergeregelte GL50-Aktivität aufweisen, überwacht
werden. Alternativ kann die durch einen hierin beschriebenen Screeningassay
bestimmte Wirksamkeit eines Agens hinsichtlich der Verringerung
der GL50-Genexpression, des Senkens des Proteinspiegels oder der
Herunterregulation der GL50-Aktivität in klinischen Studien von
Individuen, die eine verstärkte
GL50-Genexpression, einen erhöhten
Proteinspiegel und eine heraufgeregelte GL50-Aktivität aufweisen, überwacht
werden. In solchen klinischen Studien kann die Expression oder Aktivität eines
GL50-Gens und vorzugsweise anderen Genen, die in eine Krankheit verwickelt
gewesen sind, als "Readout" (Auslesesystem)
oder Marker des Phänotyps
einer bestimmten Zelle verwendet werden.
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Zum
Beispiel, aber nicht darauf beschränkt, können Gene, einschließlich GL50,
die in Zellen durch die Behandlung mit einem Agens moduliert werden
(z.B. eine Verbindung, ein Arzneimittel oder ein kleines Molekül), das
die GL50-Aktivität
moduliert (z.B. in einem Screeningassay wie hierin beschrieben identifiziert),
identifiziert werden. Um also die Wirkungen von Agenzien auf eine
GL50-assoziierte Krankheit zu untersuchen, zum Beispiel in einer
klinischen Studie, kann man Zellen isolieren, RNA generieren und
sie auf den Expressionsgrad von GL50 bzw. von anderen Genen, die
in die GL50-assoziierte Krankheit involviert sind, untersuchen.
Der Expressionsgrad von Genen (d.h. ein Genexpressionsmuster) kann
quantifiziert werden, indem man eine Northern-Blot-Analyse oder
RT-PCR ausführt, wie
hierin beschrieben, oder alternativ, indem man die Menge an produziertem
Protein mittels eines der hierin beschriebenen Verfahren misst,
oder indem man den Aktivitätsgrad
von GL50 oder anderen Genen misst. Auf diese Weise kann das Genexpressionsmuster
als Marker dienen, der die physiologische Antwort der Zellen an
das Agens indiziert. Folglich kann der Status der Antwort vor und
an verschiedenen Punkten während
der Behandlung des Individuums mit dem Agens bestimmt werden.
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In
einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
bietet die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Überwachung
der Wirksamkeit der Behandlung eines Individuums mit einem Agens
(d.h. ein Agonist, ein Antagonist, ein Peptidomimetikum, ein Protein,
ein Peptid, eine Nukleinsäure,
ein kleines Moleküle
oder andere Arzneimittelkandidaten, die sich durch die hierin beschriebenen
Screeningassays identifizieren lassen), umfassend die Schritte der
(i) Entnahme einer Probe von einem Individuum vor der Verabreichung
des Agens; (ii) Ermitteln des Expressionsgrad eines GL50-Polypeptids,
einer GL50-mRNA oder einer genomische GL50-DNA in der vor der Verabreichung
entnommenen Probe; (iii) Entnahme von einer oder mehreren Proben
von einem Individuum nach der Verabreichung; (iv) Ermitteln des
Expressions- oder Aktivitätsgrads
des GL50-Polypeptids, der GL50-mRNA oder der genomischen GL50-DNA
in den nach der Verabreichung entnommenen Proben; (v) Vergleichen
des Expressions- oder Aktivitätsgrads
des GL50-Polypeptids, der GL50-mRNA oder der genomischen GL50-DNA
in der vor der Verabreichung entnommenen Probe mit dem GL50-Polypeptid,
der GL50-mRNA oder der genomischen GL50-DNA in der bzw. den nach
der Verabreichung entnommen Probe(n); und (vi) das dementsprechende Ändern der
Verabreichung des Agens an das Individuum. Eine Erhöhung der Verabreichung
des Agens kann zum Beispiel erwünscht
sein, um die Expression oder die Aktivität von GL50 auf einen höheren Grad
zu bringen als der detektierte Grad, d.h. um die Wirksamkeit des
Agens zu erhöhen. Alternativ
kann eine Reduzierung der Verabreichung des Agens wünschenswert
sein, um die Expression oder die Aktivität von GL50 auf einen niedrigeren
Grad zu bringen als der detektierte Grad, d.h. um die Wirksamkeit des
Agens zu verringern. Gemäß einem
solchen Ausführungsbeispiel
kann die Expression oder Aktivität
von GL50 als Indikator für
die Wirksamkeit eines Agens verwendet werden, selbst in Abwesenheit
einer erkennbaren phänotypischen
Reaktion.
-
Diese
Erfindung wird ferner durch die folgenden Beispiele veranschaulicht,
die nicht als beschränkend anzusehen
sind. Die Inhalte aller Referenzen, Patente und veröffentlichten
Patentanmeldungen, die in dieser Anmeldung zitiert sind, sowie die
Figuren und die Sequenzlisten gelten durch den Verweis auf sie als
Bestandteil der vorliegenden Erfindung.
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BEISPIELE
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Die
folgenden Materialien und Verfahren werden in den Beispielen verwendet.
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Mausstamm
und RNA-Isolierung: Mäuse
(C57B1/6), denen 10E5 MB49 Blasenkarzinome injiziert worden waren,
wurden an den Tagen 7-11 und 14-18 mit 1 μg/Maus rekombinantem 1112 behandelt.
Aus den Lymphknoten wurde an den Tagen 9 (75%), 12 (20%) und 19
(5%) RNA isoliert und anschließend
gemischt. RNA wurde unter Verwendung von RNAStat 60 (TelTest B),
gefolgt von einer Anreicherung mit poly A+ RNA unter Verwendung
des magnetischen Isolierungssystems Poly-Attract (Promega) extrahiert. cDNAs
wurden mit SuperScript RT (Gibco BRL) synthetisiert. Zusätzliche
cDNA-Quellen beinhalten eine Bibliothek von fötalem Thymus von der Maus (C3H/Hej)
und periphere Blutlymphozyten von der Maus, gewonnen durch Herzpunktion
von C57B1/6. "Signal
Trap"-Strategie:
Signal-Trap-Protokolle wurde befolgt, wie von Jacobs et al. (1997.
Gene. 198: 289). beschrieben. Kurz gesagt, größenfraktionierte cDNAs wurden
unidirektional in das Invertase-Expressionsplasmid pSUC2T7M130RI
kloniert. Eine Expressionsbibliothek von Plasmidklonen wurde in
E. coli generiert und anschließend
in den invertasedefizienten Hefestamm suc2 eingebracht. Durch die
Signal-Trap-Strategie
erhaltene und in der Hefebibliothek vertretene Klone wurden durch
eine zweitägige
Kultur in YPR Agarplatten selektiert. 333 Klone wurden willkürlich entfernt,
der Mini-Prep-Methode unterzogen und sequenziert.
-
Sequenzanalyse:
TBlastX, FastX, pFam, Pileup, GrowTree und Sigcleave aus dem Wisconsin
Package (GCG) und GeneWorks 2.5.1 wurden für die Manipulation der DNA-Sequenz,
die Datenbanksuche und die Sequenzanalyse verwendet. In 12 wurden Identitätsnachweise für die PileUp-Analyse
gemäß den folgenden
Werten bestimmt: 1 × Paar
= 1; 2 × Paar
= 2; 3 × Paar
= 3; 3 von einem Typ = 4; 3 von einem Typplus 1 × Paar = 5; 2 × 3 von
einem Typ = 6; 4 von einem Typ = 7; 4 von einem Typ plus 1 × Paar =
8; 5 von einem Typ = 9. Das GeneQuest-Modul von DNASTAR Lasergene
wurde verwendet, um Intron-Exon-Grenzen von hGL50 von GenBank Accession
Nr. HS21C098 abzugrenzen. Weitere Analysen wurden mit dem SeqWeb
Wisconsin GCG Paket unter Verwendung von TFASTA, TBLASTN und ProfileScan
ausgeführt.
Distanzproportionale Phylogramme wurden mittels GrowTree auf der
Basis der genetischen Distanz unter Verwendung des Korrekturalgorithmus
nach Kimura generiert. Im Anschluss daran wurden grafische Ausgaben
neu formatiert, um Familien-Cluster
wiederzugeben.
-
Schnelle
3'-Amplifikation
von cDNA-Enden: Unter Verwendung der folgenden Primer wurde eine
3' RACE ausgeführt: (GL50)
VL118 (CCCGCAGTCTGCGCTCGCACC; SEQ ID Nr. 7), VL116 (GTCGACCCACCATGCAGCTAAAGTGTCCCTG;
SEQ ID Nr. 8), (AB014553) VL141 (CGTGTACTGGATCAATAAGACGG; SEQ ID
Nr. 9), VL142 (ACAACAGCCTGCTGGACCAGGC; SEQ ID Nr. 10), (Poly(A)-Oligo)
VL054 (CCAGTGAGCAGAGTGACG; SEQ ID Nr. 11), VL055 (GAGGACTCGAGCTCAAGC;
SEQ ID Nr. 12). Periphere Blutlymphozyten von der Maus (PBLs) wurden
durch Dichtezentrifugation unter Verwendung von Lympholyt nach Herstellerprotokoll
mit Lymphozyten angereichert. Humane PBLs wurden mittels Ficoll-Paque
Dichtezentrifugation von humanen Leukopac-Proben isoliert. Die gesamte
RNA wurde wie nachstehend beschrieben von Lymphozyten extrahiert.
Unter Verwendung der folgenden Primer wurde eine reverse Transkriptase
ausgeführt:
VL053 (CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGCTTTTTTTTTTTT; SEQ ID Nr.
18), 5 μg der
gesamten RNA und SuperScript RT (Gibco-BRL) nach Herstellerprotokoll
in 20 μl
Reaktionen. Pro RACE-Verfahren wurden 0,5-1,0 μl von RT-synthetisierten cDNAs
verwendet. Die 3' RACE
wurde nach dem Verfahren von Frohman, M. A. (1993) Methods Emzymol.
218:340-356 ausgeführt.
-
Isolation
und Analyse von RNA: Die gesamte RNA wurde aus CCE-ES-Zellen, Swiss
Webster-Embryos
bzw. -Dottersäcken
und C57B1/6 peripheren Blutlymphozyten gewonnen und wurde unter
Verwendung von RNAStat 60 (Tel-Test B, Friendswood TX) zusammen
mit einer Phase Lock Gel-Barriere
(Eppendorf) extrahiert. Die RNA wurde unter Verwendung eines Northern
Max-Systems (Ambion) fraktioniert und nach Herstellerprotokoll auf
ZetaProbe GT (BioRad) geblottet. RNA-Panels von verschiedenen Geweben
wurde gekauft ("Multiple
Tissue RNA Panels",
Clontech) and nach Herstellerprotokoll verwendet. Blots wurden mit
radiomarkierten DNA-Fragmenten hybridisiert, welche die Nukleotide
984-1340 des mGL50-2-Klons (357 bp; SEQ ID Nr. 3) umfassen, die
der 3' untranslatierten
Region entsprechen, während
Fragmente, die der codierenden Sequenz von mGL50 entsprechen verwendet
wurden, um sowohl mGL50-1- als auch mGL50-2-Transkripte zu detektieren.
Die Hybridisierungen wurden bei 65°C mit Express Hyb (Clontech) über Nacht
ausgeführt
und im Anschluss daran mit 0,1X SSC und 1% SDS bei Hybridisierungstemperaturen
gewaschen, bis ein geeignetes Signal-Rausch-Verhältnis erreicht war. Die Blots
wurden auf Phosphoimage-Platten exponiert und für eine Aufnahme mit einem autoradiographischen
Film bedeckt.
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Analyse
der Genexpression: Für
die RT-PCR-Analyse wurde eine Erststrang-cDNA-Synthese wie vorstehend
für RACE-Verfahren
beschrieben ausgeführt,
gefolgt von zwei Amplifikationsreaktionen (25 μl) unter Verwendung von Advantage
Taq (Clontech) mit den Primern RLEE 001 und RLEE005 für mGL50-1
und den Primern RLEE 001 und RLEE003 für mGL50-2. Die Primer GAPDHF
und GAPDH-R wurden als positive Amplifikationskontrollen verwendet.
Die Oligonukleotide GAPDH-F (TGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGC; SEQ ID
Nr. 19); GAPDH-R (CATGTAGGCCATGAGGTCCACCAC (SEQ ID Nr. 20); RLEE001
(CATCACTAGCATTAGCCAGGC; SEQ ID Nr. 13); RLEE003 (TGATGTTGTGAAGCTGAGTGC;
SEQ ID NO: 14); RLEE005 (TCATGAGCATCGAGCATCG; SEQ ID Nr. 15); VL142
(ACAACAGCCTGCTGGACCAGGC; SEQ ID Nr. 10); VL162B (TCACGAGAGCAGAAGGAGCAGGTTCC;
SEQ ID NOr. 16); und VL163B (GGGCCCCCCAGAACCTGCTGCTTCC; SEQ ID Nr.
17) waren für
die PCR-Amplifikation der Regionen der extrazellulären Domäne von mGL50-1-,
GL50-RACE-, AB014553 cDNA- und AB014553-RACE-Klonen vorgesehen.
Murine und humane cDNA-Gruppen, die aus Poly-A+-RNA gewonnen waren,
welche lymphoides und nicht-lymphoides Gewebe (Clontech) umfassten,
wurden als Quelle für
die PCR-Analyse verwendet. Die Zyklusbedingungen waren 5 min bei
95°C Denaturierung,
gefolgt von 35 Zyklen 1 min bei 95°C, 1 min bei 60°C, und 1
min bei 72°C. Die
Reaktion war nach einer Verlängerung
von 10 min bei 72°C
beendet. Die Zyklusbedingungen für
die mGL50- und die mGL50-2-PCR waren 95°C für 1 min, 60°C für 1 min, und 72°C für 2 min
für 33
Zyklen, während
die GAPDH-PCR in 30 Zyklen ausgeführt wurde.
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Für die Northern-Blot-Analyse
wurden vorgefertigte RNA-Blots (Clontech) mit radiomarkierten DNA-Fragmenten
hybridisiert, welche die Nukleotide 1065-1588 von mGL50-1 (494 bp;
SEQ ID Nr. 1) oder die Nukleotide 984-1340 des mGL50-2-Klons (357
bp; SEQ ID Nr. 3) umfassten.
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Durchflusscytometrie:
COS-Zellen wurden mit mGL50-1 oder DAP-12 cDNA in pcDNA3.1-CTGFP Expressionsvektoren
transfiziert. Die Transfektion erfolgte unter Verwendung des Transfektions-Reagenz
Lipofectamine (Life Technologies) nach Herstellerprotokoll. Die
Zellen wurden 3 Tage nach der Transfektion geerntet. 10% Kaninchenserum
wurden verwendet, um nicht-spezifische
Bindungen an Zellen zu hemmen. Die Zellen wurden bei Zimmertemperatur
20 Minuten lang mit 200 ng Fusionsproteinen in 100 μl PBS, 2%
FCS gefärbt.
Die Zellen wurden gewaschen und einer Sekundärfärbung mit PE-gekoppeltem Ziege-anti-Maus-IgG
unterzogen. Die Zellen wurden unmittelbar vor der Durchflusscytometrie
mit Propidiumiodid gefärbt.
Nach einer positiven COS-Transfektionskontrolle mit hCTLA4-cDNA
folgte die Identifikation von positiv gefärbten Zellen mit PE-gekoppeltem
anti-CTLA4.
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Zellsuspensionen
für die
cytometrische Analyse wurden von BALG/c Splenozyten (ca. 3 Monate
alt) isoliert und einmal mit DMEM, 10% (vol/vol) hitzeinaktiviertem
fötalem
Kalbserum (JR BioScience), 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin,
100 μg/ml
Streptomycin (Irvine Scientific, Santa Ana, CA), 20 μM 2-β-Mercaptoethanol
(Sigma Co., St. Louis, MO), MEM Natriumpyruvat und MEM nicht-essentiellen
Aminosäuren
(Life Technologies, Rockville, MD) gewaschen. Rote Blutzellen wurden
mit ACT Lysispuffer lysiert und einmal gewaschen. Splenozyten (ca.
1 × 107 Zellen/ml/Vertiefung) von BALG/c Mäusen wurden
mit 25 μg/ml
LPS (Sigma) oder 10 ng/ml PMA, 1 μg/ml
Ionomycin kultiviert. Die Zellen wurden mit FITC-markierten Antikörpern (BD-PharMingen)
und mICOS-mIgG2am-Reagenz gefärbt,
gefolgt von einer cytometrischen Analyse unter Verwendung des Software-Pakets
FACalibur und CellQuest (BD). Die Zellseparation wurde durch eine
magnetische Selektion mit anti-FITC-Microbeads (Miltenyi Biotec)
ausgeführt.
Ihr folgte eine durchflusscytometrische Bestimmung der T-Zellanreicherung.
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Ig-Fusionsproteine:
Fusionsproteine von IgG2a mit mICOS, hICOS, mGL50-1 und hGL50 wurden
für den
Einsatz in den folgenden Beispielen generiert: Die Bezeichnung IgG2am
gibt an, dass die IgG2a-Domäne so
mutiert wurde, dass die Effektorfunktion reduziert worden ist (siehe
Steurer, W. et al. (1995) J. Immunol. 155:1165-74). Die Nukleotidsequenzen
und Aminosäuresequenzen
von hICOSmIgG2am sind in 26 dargestellt
und als SEQ ID Nr. 23 bzw. 24 präsentiert.
Die Nukleotidsequenzen und Aminosäuresequenzen von mICOS-mIgG2am
sind in 27 dargestellt und als SEQ
ID Nr. 25 bzw. 26 präsentiert.
Die Nukleotidsequenzen und Aminosäuresequenzen von hGL50-mIgG2am
sind in 28 dargestellt und als SEQ
ID Nr. 27 beziehungsweise 28 präsentiert.
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Die
Nukleotidsequenzen und Aminosäuresequenzen
von mGL150-mIgG2am sind in 29 dargestellt
und als SEQ ID Nr. 29 bzw. 30 präsentiert.
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Beispiel 1: Die Isolation von mGL50-1-Molekülen
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cDNAs-codierende
sekretierte Proteine aus RNA von IL-12-behandelten Lymphknoten von
der Maus erfuhren eine genetische Selektion für Signalsequenzen unter Verwendung
der Saccharomyces cerevisiae "Signal-Sequenz-Trag-Methode" (Jacobs et al).
Von einer Gesamtanzahl von 333 isolierten und sequenzierten Klonen
einer cDNA-Invertase-Fusion wurde ein partieller cDNA-Klon mit begrenzter
Sequenzidentität
zu B7-1 identifiziert und mGL50-1 genannt (1, SEQ
ID Nr. 1). Die durch recA-vermittelte Rekombination wieder in ihrer
ganzen Länge
hergestellte cDNA wurde von einer cDNA-Bibliothek von fötalem murinen
Thymus isoliert, was zu der Erzeugung von vier zusätzlichen
cDNA-Klonen, die 3'-untranslatierte
Regionen enthielten, sowie zu einer Überlappung des partiellen,
durch die "Signal-Sequenz-Trag-Methode" erhaltenen Sequenzklons führte.
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Die
aus 2718 Nukleotiden bestehende mGL50-1 Konsensussequenz codierte
ein aus 322 Aminosäuren
bestehendes Protein mit einer vorhergesagten Masse von 36 kDa. Ein
Hydropathieplot des offenen Leserahmens sagte eine Struktur voraus,
die einer Leit-Sequenz (von etwa Aminosäure 1-46 von SEQ ID Nr. 2; codiert
von etwa Nukleotid 67 bis 195 von SEQ ID Nr. 1), einer extrazellulären Domäne (von
etwa Aminosäure 47-279
von SEQ ID Nr. 2; codiert von etwa Nukleotid 196 bis 904 von SEQ
ID Nr. 1), einer hydrophoben Transmembranregion (von etwa Aminosäure 280-298
von SEQ ID Nr. 2; codiert von etwa Nukleotid 905 bis 961 von SEQ
ID Nr. 1) und einer potenziellen intrazellulären cytoplasmatischen Domäne (von
etwa Aminosäure 299-322
von SEQ ID Nr. 2; codiert von etwa Nukleotid 962 bis 1032 von SEQ
ID Nr. 1) entsprach. Eine Signalpeptidspaltung wurde an Position
46 in der Aminosäuresequenz
vorhergesagt. Die Analyse von mGL50-1 durch das Programm PFAM zur
Vorhersage des Proteinmotivs deutete auf eine strukturelle Ähnlichkeit
mit der Ig-Domäne
der cytoplasmatischen Domäne
des Poteins hin. In Übereinstimmung
mit einer Ig-ähnlichen
Struktur wurden 4 Cysteine in der extrazellulären Domäne gefunden, was auf der Basis
der Domänendarstellung die
Möglichkeit
einer intramolekularen Bindung und einer andersartigen strukturellen
Konformation gestattete, die einer IgV-ähnlichen Domäne und einer
IgC-ähnlichen
Domäne
entsprach. Ein Sequenzvergleich mit FastX, in dem translatierte
Proteine durch die GenBank Datenbank gesucht wurden, ergab eine
Reihe von identifizierten cDNA-Klonen mit Sequenzähnlichkeiten,
einschließlich
AB014553, B7-1, B7-2 und Y08823. Zugehörige Domänen in Polypeptiden der B7-Familie
sind in 12 dargestellt.
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Beispiel 2: Die Isolation einer alternativ
gespleißten
Form von GL50
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Um
zu bestimmen, inwieweit eine Transkriptionsheterogenität bestand,
wurde eine 3' RACE
ausgeführt,
in der Spleißvarianten
von murinem GL50-1 isoliert wurden. Unter Verwendung von spezifischen,
verschachtelten 5' Oligonukleotidprimern,
die vorgelagerten Sequenzen entsprachen und die Initiationsstartstelle von
mGL50-1 enthielten, wurden aus cDNAs aus PBL von der Maus amplifizierte
PCR-Produkte generiert. Bei der Hybridisierung mit radiomarkierten
Oligonukleotiden im Inneren der mGL50-1 codierenden Region wurden deutliche
Hybridisierungssignale detektiert. Eine anschließende Klonierung von positiv
hybridisierenden PCR-Produkten gefolgt von einer Sequenzanalyse
ergab RACE-Sequenzen, von denen keine mit der mGL50-1-Konsensussequenz
identisch war, die von der Bibliothek von fötalem Thymus von der Maus stammte.
Man hat festgestellt, dass zwei Gruppen von PCR-Produkten, die durch
mehrere Klone mit extensiver Polyadenylierung von unterschiedlichen
Längen
vertreten waren, eine alternativ gespleißte Form von GL50 codieren.
Ein repräsentatives
Produkt, ein Produkt mit einer Länge
von 1759 bp, mGL50-2 genannt, codierte ein Polypeptid mit einer
Länge von
347 Aminosäureresten
mit einer vorhergesagten molekularen Masse von 39 kDa (2, 15).
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Eine
Anordnung von mGL50-1 und mGL50-2 ist in 3 dargestellt.
Die Anordnung der mGL50-1- und mGL50-2-Sequenzen zeigte eine vollständige Identität zwischen
Nukleotid 67 (Initiierung Methionin/mGL50-2 RACE Priming-Site) und
Nukleotid 1027 von der cDNA, mit Ausnahme der beiden Nukleotide, die
in mehreren mGL50-2-Produkten zu finden waren (Nukleotide 531 und
710, was zu einem Austausch von Arginin gegen den Histidinrest an
237 der vorhergesagten Aminosäuresequenz
führte
(3)). Die Abweichungen dieser beiden Nukleotide
ist höchstwahrscheinlich
auf Unterschiede in der Färbung
der Mäuse
zurückzuführen, die
für das
RNA-Startmaterial benutzt wurden, da mehrere separate PCR-Produkte
identische Fehlpaarungen codierten. Sequenzen stromabwärts von
Position 1027 von mGL50-1 und Position 961 von mGL50-2 waren zwischen
den beiden Molekülen
abweichend (3). Sowohl mGL50-1- als auch mGL50-2-Sequenzen enthielten
stromaufwärts
von dem Poly(A)-Schwanz eine Polyadenylierungssequenz vom Konsensus
AATAAA (13 bp für
mGL50-2, 16 bp für
mGL50-1). Als Ergebnis der alternativen 3'-Sequenzen,
die das Carboxy-Ende codieren, fehlten mGL50-2 die letzten zwei
Aminosäuren
von mGL50-1, enthielt nun aber zusätzliche 27 neue Aminosäuren in
der cytoplasmatischen Domäne.
Die vorhergesagte Aminosäuresequenz
von mGL50-2 deutete auf das Vorhandensein von drei einzelnen Tyrosinresten,
Y325, Y328 und Y333, im Carboxy-Ende hin, zusätzlich zu den Tyrosinresten
Y299 und Y307, die den mGL50-1- und mGL50-2-Molekülen gemeinsam
waren. Eine Datenbanksuche mit GenBank lieferte keine cDNA-Sequenzen mit Ähnlichkeit
zu der abweichenden codierenden 3'-Domäne
des mGL50-2-Produkts, mit Ausnahme von einer komplexen repetitiven
Sequenz (Basen 1349-1554), die zudem in zahlreichen genomischen
Sequenzen gefunden wurde (z.B. Accession Nr. AC005818, AC006508
und AF115517), sowie in bekannten mRNAs (Desmin von der Maus: 218892;
und Survivin von der Maus: AF115517). In mGL50-1 wurden keine solchen
untranslatierten repetitiven Sequenzen gefunden.
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Beispiel 3: Die Identifizierung eines
humanen Orthologs von GL50
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Nach
der Identifizierung der murinen GL50-Klone ließen eine Datenbanksuche und
anschließende Vergleiche
darauf schließen,
dass murine mGL50-1- und mGL50-2-Klone zu einer cDNA homolog sein
könnten,
die aus humanem Hirn isoliert worden war, KIAA-Klon 0653 (Accession
Nr. AB014553; Ishikawa et al. (1998) DNA Res. 5:169). AB014553 ist
als eine 4,3 kb lange cDNA auf Chromosom 21 beschrieben worden, die
eine vermeintliches, aus 558 Aminosäuren bestehendes Protein mit
einer molekularen Masse von 60 kDa codiert. Da sowohl die Länge der
AB014553 cDNA als auch jene des codierten Proteins fast 2 Faltungen
größer war
als mGL50-1, war es unwahrscheinlich, dass AB014553 ein humanes
Ortholog der murinen GL50-Sequenzen war. Die Analyse der ersten
303 Reste der abgeleiteten AB014553 Proteinsequenz deutet jedoch
auf eine Ähnlichkeit
mit mGL50-1 hin, wenn man von der Region des Signalpeptids der cDNA
absah.
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Da
AB014553 das Ergebnis einer Größenfraktionierung
von großen
cDNAs war, glaubte man, dass AB014553 eine Transkriptvariante darstellte,
die auch als kleineres Genprodukt existierte. Um herauszufinden, ob
ein solches kleineres Produkt existierte, führte man 3' RACE-Analysen von humanen PBLs durch,
wobei man Oligonukleotidprimer (VL142 (ACAACAGCCTGCTGGACCAGGC; SEQ
ID Nr. 10) und VL141 (CGTGTACTGGATCAATAAGACGG; SEQ ID Nr. 9)) verwendete,
die extrazellulären
Domänen
von AB014553 mit Sequenzhomologie zu GL50 entsprachen. Vier RACE-Produkte
wurden isoliert, die einen offenen Leserahmen codierten, der mit
AB014553 von Aminosäurerest
24 (Startpunkt des RACE-Primers) bis 123 (6)
identisch war. Ab dem Rest 123 divergierte das AB014553 RACE-Produkt
von der cDNA-Sequenz, was zu einem alternativen Stopp-Codon bestehend
aus 88 Nukleotiden mit einer 9 Aminosäuren codierenden Region am
3'-Ende und einer
kurzen, untranslatierten Domäne
führte.
Diese alternative 3'-Region
führte
zu einem verfrühten Stopp-Codon
in dem AB014553 RACE-Klon im Vergleich zur AB014553 cDNA (7).
Die vorhergesagte Gesamtlänge
des abgeleiteten, von diesem alternativ transkribierten Produkt
codierte Polypeptids betrug nach der Fusionierung mit gemeinsamen
5'-Sequenzen von
AB014553-cDNA 309 Aminosäuren, übereinstimmend mit
einem humanen Protein, das ortholog zu GL50-Proteinsequenzen von
der Maus ist und als hGL50 bezeichnet wird (8).
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Beispiel 4: Alignment mit B7-1 vom Huhn
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Bei
dem Alignment mit einem zuvor charakterisierten B7-1 vom Huhn (Accession
Nr. Y08823) entwickelte sich zwischen diesen Molekülen ein
Muster von konservierten Sequenzen der cytoplasmatischen Domäne. Innerhalb
der intrazellulären
Region zeigten hGL50-Proteinsequenzen 34% Identität (9/26
Reste ausgerichtet) zu mGL50-1, während Y08823 vom Huhn 57% Identität (8/14
Reste ausgerichtet) entweder zu humanem oder murinem GL50 oder zu
GL50-2 zeigte, was zu einem Konsensusmotiv von (R)(R)(R)[XX](Q) (H)(X/-)SY(T)(G)(P)
(SEQ ID Nr. 21) führte,
wobei die Aminosäuren
in eckigen Klammern zwischen den drei Genen unterschiedlich sind,
die Aminosäuren
in runden Klammern zwei oder drei Genen gemein sind, und die Aminosäuren ohne
eckige oder runde Klammern allen drei Genen gemein sind. Eine Datenbanksuche
mit FastA nach Proteinen, die zu diesem Motiv homolog sind, ergaben
zwei murine Einträge,
Veli-2 (Accession Nr. AF087694) und MALS-2, ein C. elegans LIN-7
Homologon (Accession Nr. AF 173082), die Sequenzen codieren, die
mit dem Motiv RRRQQHHSYT (SEQ ID Nr. 22) identisch sind. Diese außergewöhnliche
Domäne befindet
sich am Carboxy-Ende von Veli-2, ist aber in den Isoformen Veli-1
oder Veli-3 nicht vorhanden und geht über den Bereich der Homologie
mit C. elegans LIN-7 hinaus.
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Beispiel 5: Die Expression von GL50-Molekülen
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mGL50-1-
und mGL50-2-spezifische RT-PCR-Reaktionen auf handelsüblichen
cDNA-Panels führten zu
abundanten PCR-Produkten in Herz, Milz, Lunge, Leber, Skelettmuskel,
Niere, Hoden, in einem 7-15 Tage alten Embryo und in PBL. Vernachlässigbare
Produkte wurden für
beide Transkripte bei Hirnproben detektiert, während geringe Produktspiegel
in Hodenproben für
mGL50-2 detektiert wurden (4). Eine
Northern-Blot-Analyse von handelsüblichen RNA-Blots unter Verwendung
von Sonden, die entweder für
die gemeinsame extrazelluläre
Domäne
von mGL50-1 und mGL50-2 oder für
die untranslatierten 3'-Regionen
von mGL50-2 oder mGL50-1 spezifisch waren, ergab eine unterschiedliche
Hybridisierung zwischen den beiden Molekülen. Während sowohl die Sonde der
extrazellulären
Domäne
als auch die mGL50-1-spezifische Sonde mit einem ca. 2,7 kb großen Transkript
hybridisierten, das in Herz-, Hirn-, Milz-, Lunge-, Leber-, Skelettmuskel-, Nieren-
und Hodenproben leicht zu detektieren war (identisch mit dem zuvor
in Blots gesehenen, für
mGL50-1 spezifischen Muster) (Ling et al. (2000) J. Immunol. 164:1653-7),
hybridisierte die mGL50-2-spezifische
Sonde mit einem 1,7 kb großen
Transkript, das nur in Herz-, Milz- und Nierenproben detektiert
wurde, was darauf schließen
ließ,
dass mGL50-2-Transkripte gleichzeitig als begrenzte Untergruppe
von mGL50-1-Geweben mit der höchsten
Expression transkribiert wurden (5). In
Poly-A+-RNA-Blots wurde bei Verwendung der 3'-UTR-spezifischen mGL50-2-Sonde eine
eindeutige Hybridisierung in den Proben detektiert, die undifferenzierte
ES-Zellen, 10 Tage alte embryoide Körper, 12,5 Tage alte embryonale
Dottersäcke
und 15 Tage alte fötale
Leber repräsentierten.
Eine Hybridisierung unter Verwendung der mGL50-1-Sonde der cDNA-codierenden Sequenz
zeigte eindeutig in allen untersuchten Proben ein Transkript.
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Um
die Gewebeverteilung von AB014553 cDNA und AB014553 RACE-Klonen
zu bewerten, wurden RT-PCR-/Southern-Blot-Analysen ausgeführt, die
unter ähnlichen
Bedingungen stattfanden wie die vorstehend beschriebenen für die GL50-Sequenzen.
Man verwendete Oligonukleotidprimer, die spezifisch für die Amplifikation
der bekannt gemachten AB014553 cDNA sind (VL142 (ACAACAGCCTGCTGGACCAGGC; SEQ
ID Nr. 10) und VL163B (GGGCCCCCCAGAACCTGCTGCTTCC; SEQ ID Nr. 17)),
und eine PCR zeigte die komplette Abwesenheit von jeglichem detektierbaren
AB014553 cDNA-Signal für
alle getesteten Proben (10).
Mögliche
Erklärungen
für die
Abwesenheit von RT-PCR-Produkten, welche die bekannt gemachten AB014553
cDNA-Sequenzen repräsentieren,
könnten
die Verwendung von nicht optimierten Oligonukleotiden, eine extrem
geringe Häufigkeit
des Zieltranskripts oder die tatsächliche Abwesenheit von dieser
Form des Produkts sein. RT-PCR-Bedingungen, die spezifisch für AB014553
RACE sind, führten
bei Verwendung von Oligonukleotidprimern VL 142 und VL 1626 zu der
Detektion eines Amplifikationsprodukts von 350 bp in Niere, Lunge,
Eierstock, fötaler
Leber und Leukozyte, wobei der höchste
Spiegel an amplifiziertem Produkt in fötaler Leber festgestellt wurde. Überraschenderweise
wurde in Milz, Lunge, Thymus und Lymphknoten nahezu kein Signal
detektiert. Diese Ergebnisse stimmen mit dem veröffentlichten Bericht über die
AB014553-Transkriptverteilung (Ishikawa et al. (1998) DNA Res. 5:169)
in einer kleineren Untersuchung eines cDNA-Gewebepanels überein,
ergänzt
jedoch nicht die Gewebeverteilungsmuster, die bei GL50-Molekülen beobachtet
wurden.
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Im
Gegensatz zu mGL50-1- und mGL50-2-Klonen mit ihren übermäßig langen
und divergenten untranslatierten 3'-Regionen enthielten AB014553 RACE-Produkte
nur eine Sequenz von 88 bp, die von jener von AB014553 cDNA abwich.
Aus diesem Grund ist es unmöglich,
Nukleotidsonden mit ausreichender spezifischer Wirksamkeit für die Detektion
des RACE-Produkts zu entwickeln. Unter Verwendung einer codierenden Region
als Sonde für
hGL50 wurden Northern-Hybridisierungen auf handelsüblichen
humanen Multiple Tissue RNA Blots ausgeführt, um die Transkriptverteilung
festzustellen (11). Die Ergebnisse deuteten
auf das Vorhandensein einer Reihe von Transkripten hin, die man
in allen Geweben mit einer molekularen Größe von ca. 2,4 kb, 3,0 kb,
7,0 kb gefunden hatte, wobei die stärksten Signale in Hirn-, Herz-,
Nieren- und Leberproben auftraten. Schwache Hybridisierungssignale
wurden in Kolon und Thymus gefunden. Ein zusätzliches Transkript von 8,5
kb wurde in einer Untergruppe des Panels gefunden, die Thymus, Milz,
Niere, Leber, Lunge und PBL enthielt, während ein Transkript von 3,8
kb in Lungen- und PBL-Proben gefunden wurden. Ein einzelnes Transkript
von 1,1 kb wurde nur in PBL-Proben gefunden und entsprach der vorhergesagten
Größe von hGL50,
wenn untranslatierte 5'-
und 3'-Sequenzen
enthalten waren. Die Bestimmung von anderen kleineren Transkripten
gestaltete sich schwierig, da der Empfindlichkeitsbereich des Blots
an seine Grenzen stieß.
Keines der ersichtlichen Transkripte korreliert mit der bekannt
gemachten, 4,3 kb langen AB014553 cDNA, was darauf schließen lässt, dass
diese Sequenz in der Natur nicht vorkommt, oder dass sie auf niedrigeren
Ebenen exprimiert wird als detektierbare Grenzen. Der Vergleich
zwischen hGL50-Blots und hGL50 RT-PCR Untersuchungen zeigt eine
gemeinsame Eigentümlichkeit.
In beiden wurde nämlich
das stärkste
Signal in Nierengeweben und das schwächste Signal in lymphatischen
Geweben, wie zum Beispiel Thymus, Milz und PBL, gefunden.
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Beispiel 6: Die Beziehung der GL50-Polypeptide
zu anderen Polypeptiden
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Proteinsequenz-Alignments
dienten dazu, den Verwandtschaftsgrad zwischen mGL50-1, hGL50, und humanem
und murinem B7-1 und B7-2 zu bestimmen. Unter Verwendung einer PileUp-Analyse
(12) richteten sich 18 Aminosäurestellen zwischen allen sechs
Molekülen
innerhalb der extrazellulären
Domäne
identisch aus. Von den 32 Positionen, welche die vorhergesagten
IgV-ähnlichen
und IgC-ähnlichen
Faltungen des B7 Moleküls
definieren, sind 13 identisch zwischen allen sechs Molekülen konserviert,
vor allem die 4 Cysteine, die intramolekulare Faltungen von Domänen gestatten.
Andere Bereiche von signifikanter Sequenzkonservierung wurden ebenfalls
in der extrazellulären
Domäne
gesehen, aber interessanterweise richten sich die Identitäten von
hGL50/GL50 Sequenzen an bestimmten Orten genauer nach B7-1 oder
B7-2 aus (Identitäts- Score von 8). Der
Valinrest, welcher der Position 77 von mGL50-1 entspricht, findet
sich zum Beispiel auch in hGL50 und in murinen und humanen B7-2-Sequenzen,
aber nicht in B7-1. Ebenso ist Tyrosin an Position 78 von mGL50-1
auch an entsprechenden Stellen in hGL50 und murinem und humanem
B7-1 konserviert, aber nicht in B7-2. Von den 16 Positionen mit
Identitäts-Score
8 sind 5 Positionen mGL50-1/hGL50 und B7-1 gemeinsam, 4 Positionen
sind mGL50-1, hGL50 und B7-2 gemeinsam, und 6 Positionen sind B7-1
und B7-2 gemeinsam.
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Auf
Basis der Peptidstruktur lassen diese Ergebnisse darauf schließen, dass
die mGL50/hGL50-Sequenzen einen Platz im phylogenetischen System
einnehmen, der parallel zu der B7-Familie der Proteine ist. Molekularphylogenetische
Analysen (GrowTree), welche die genetische Distanz im Sinne von
Substitutionen pro 100 Aminosäuren
maßen,
führten
zu einem Dendrogramm (13) mit unabhängiger Anhäufung von m/hGL50
(85), m/hB7-2(68) und m/hB7-1 (88). Als Fremdgruppe wurde mmu67065_1
(Butyrophilin der Maus) verwendet. Auch beim Klon Y08823 vom Huhn
stellte man fest, dass er sich genauer nach den GL50/AB014553-Sequenzen
ausrichtete (~140) als nach den B7 Sequenzen (215-320), was darauf
hindeutete, dass diese Sequenzen eine andere Proteinunterfamilie
umfassten. Distanzen zwischen den GL50/AB014553-, B7-2- und B7-1-Zweigen
waren hoch (216-284), was darauf schließen ließ, dass seit dem Anfang der
Abstimmungslinien des Menschen und des Nagers große Anzahlen
von Substitutionen zwischen diesen Molekülen aufgetreten waren.
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Auch
murines und humanes CTLA4 (siehe z.B. Dariavach, P. et al. (1988)
Eur. J Immunol. 18:1901; GenBank Accession Nr. L15006;
US-amerikanisches Patent 5,434,131 )
und ICOS (Hutloff et al. (1999) Nature 397:263;
WO 98/38216 ) wurden unter Verwendung
derselben Parameter auf phylogenetische Beziehungen untersucht.
Genetische Distanzen zeigten ein Muster, das sich von dem für die B7-ähnlichen
Proteine gesehenen Muster unterschied. Wie in den vorherigen Berichten
bemerkt, war die genetische Distanz zwischen murinem und humanem
ICOS und CD28 (176-2570) geringer als die von CTLA4 (261-405). Ein
Vergleich ergab, dass die genetische Distanz zwischen CD28 und CTLA4
viel kleiner war (143-1670), was darauf hinwies, dass die strukturellen
Beziehungen zwischen den Mitgliedern der Rezeptorfamilie nicht parallel
zu jenen der Ligandenfamilie waren.
-
Beispiel 7: Darstellung der Bindung von
GL50 an ICOS
-
Um
zu bestimmen, ob GL50 ein Ligand für murines CTLA4, CD28 oder
ICOS war, wurde unter Verwendung von mGL50-1-Expressionsvektoren
die Transfektion bzw. die Bindung untersucht (14). mGL50-1 bzw. humane DAP-12-negative Kontroll-cDNA
wurde in COS-Zellen transfiziert, gefolgt von einer Färbung mit
einem von ICOS-Ig-, CD28-Ig- und CTLA-4-Ig-Fusionsproteinen oder
mit normalem murinem Ig. Die COS-Zellen wurden zwei Tage nach der
Transfektion mit 5 μg/ml
Fusionsprotein gefärbt,
gefolgt von Ziege-anti-Maus-PE-markiertem Antikörper. Mittels einer Durchflusscytometrie
wurde nur bei dem ICOS-Ig-Reagenz (15%) eine Bindung von GL50-transfizierten
COS-Zellen detektiert, während
eine geringfügige
Bindung für
CD28-Ig, CTLA4-Ig oder normales murines Ig detektiert wurde, die
als negatives Nachweisereagenz verwendet worden waren. Für die DAP12-cDNA-Transfektanten
wurde keinerlei Bindung eines Fusionsproteins detektiert. Diese
Ergebnisse lassen darauf schließen,
dass GL50 ein Ligand für
ICOS-Ig ist.
-
Auch
wenn es unter den hierin angewendeten spezifischen Bedingungen nicht
festgestellt wurde, so wäre
es doch möglich,
dass GL50 auch zu einer Signaltransduktion durch CD28 oder durch
CTLA-4 fähig
ist, da veröffentlichte
Daten eine schwächere
Bindungsaktivität
der B7-Moleküle
zu CD28 als CTLA-4 in zellbasierten Assays zeigen (Greenfield, E.
A. et al. (1998) Crit. Rev. Immunol. 18:389).
-
Beispiel 8: mGL50-2-Transkripte codieren
funktionelle Zelloberflächenproteine
-
Zum
Nachweis, dass mGL50-2-Transkripte funktionelle Zelloberflächenproteine
codieren, verwendete man Vektoren, die unter der transkriptionellen
Kontrolle des EF1-alpha-Promoters die mGL50-codierenden Regionen
exprimierten, um COS-Zellen zu transfizieren. Mittels Durchflusscytometrie
stellte man fest, dass sowohl mICOS-mIgG2am als auch hICOS-mIgG2am
an mGL50-1- und mGL50-2-transfizierte Zellen binden (9-14%), während bei
mCTLA4-mIgG2am eine geringfügige
Bindung beobachtet wurde (<1%),
was darauf hindeutet, dass die Domänen, die von den zusätzlichen,
in mGL50-2 gefundenen Resten in dem alternativen Carboxy-Ende codiert
sind, die Oberflächenaktivierung
dieses Proteins nicht beeinträchtigen
(17). Ebenso ist es bemerkenswert, dass hICOS-mIgG2am
an beide Moleküle
bindet, was darauf schließen
lässt,
dass die ICOS-Rezeptoren, wie CTLA4- und CD28-Rezeptoren, ihre Ligandenbindungsfähigkeit
behalten, wenn sie auf Ziele über
die Grenzen der Primaten- bzw. Nagerarten hinaus untersucht werden.
Andere Mäusezelllinien
wurden auf die Anwesenheit eines ICOS-Oberflächenliganden untersucht. Es
zeigte sich schon früher,
dass WEHI231-Zellen eine Oberflächenexpression
sowohl von B7-1 als auch von B7-2 haben, ES-Zellen hingegen nur
von B7-1. Eine Färbung
von WEHI231-Zellen mit mCTLA4-mIgG2am
war deutlich detektierbar unter Verwendung von 8 ng/ml Reagenz,
während
eine Färbung
mit mICOSmIgG2am bei Mengen, die bei 1 μg/ml begannen, nur schwach detektierbar
war. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die Bindungsaffinität des Reagenz
mCTLA4-mIgG2am an die B7-Moleküle
mindestens 100 Faltungen größer ist
die Bindung der Reagenz mICOS-mIgG2am an GL50 auf WEHI-Zellen, ähnlich wie
die geringe Bindungsaffinität,
die zwischen CD28-Ig- und B7-Proteinen gemessen wurde. In Anwesenheit
von blockierenden Antikörpern
wurde die Bindung von mCTLA4-mIgG2am an WEHI231 vollständig aufgehoben,
während
bei mICOSmIgG2am keine Beeinträchtigung
der Bindung an Zellen zu beobachten war, was bestätigte, dass
weder WEHI231 B7-1
noch B7-2 die spezifische Bindung an mICOS-mIgG2am verstärkt (18). Um die Indizien einer RNA-Blot-Analyse zu
untermauern, die das Vorhandensein von GL50 in Zellen nachwies,
die Vertreter der sehr frühen
embryonalen Umgebung waren (siehe oben), wurden undifferenzierte
CCE-ES-Zellen durch direkte Färbung
mit Antikörpern
gegen B7-1 und indirekte Färbung
mit dem Fusionsprotein mICOS-mIgG2am analysiert. Undifferenzierte
ES-Zellen, die mit anti-B7-1 gefärbt
worden waren (19), zeigten eine Veränderung
der Hintergrundfluoreszenz um 90% (1 log), was mit früheren Beobachtungen übereinstimmte
(Ling, V. et al. (1998) Exp. Cell. Res. 241:55-65), und eine Veränderung
der Hintergrundfluoreszenz um 66,6% (0,5 log) bei einer Färbung mit mICOS-mIgG2am,
was die gleichzeitige Oberflächenpräsentation
sowohl von B7-Molekülen
als auch von Molekülen
des GL50-Typs in einem System nachwies, das die undifferenzierten
inneren Zellmassen von frühen Präimplantationsembryos
widerspiegelte.
-
Beispiel 9: Die Expression von GL50 auf
Splenozytensubpopulationen
-
Eine
phänotypische
Analyse der Haupttypen von Milzzellen mit GL50-Oberflächenproteinen
zeigte, dass die mICOS-mIg-Bindung am leichtesten auf phänotypischen
CD19+-Zellen detektierbar ist, obwohl es ersichtlich war, dass andere
Typen von Milzzellen eine ICOS-Ig-Färbung aufwiesen (siehe
30). Zur weiteren Identifizierung von frisch isolierten
Zellen, die GL50 zeigen, wurden Wildtyp-BALG/C Splenozyten mit RAG1 -/-
Splenozyten ohne reife B- und T-Zellen verglichen. Die Ergebnisse
sind in
20 und Tabelle 3 dargestellt.
| Tabelle
3 Antikörperfärbung | n= | BALG/c
% der Gesamtanzahl an Splenozyten | % ICOS-Ig positiv | n= | RAG1
-/- % der Gesamt-anzahl an
Splenozyten | % ICOS-Ig positiv |
| anti-CD3 | 10.000 | 30% | 10% | 50.000 | <1% | - |
| anti-CD4 | 10.000 | 25% | 8% | 10.000 | 11% | 45% |
| anti-CD8a | 10.000 | 9% | 10% | 50.000 | <1% | - |
| anti-CD19 | 10.000 | 65% | 97% | 50.000 | <1% | - |
| anti-CD24 | 10.000 | 64% | 94% | 10.000 | 67% | 28% |
| anti-CD45R/B220 | 10.000 | 61% | 97% | 50.000 | 6% | 5% |
| anti-CD11
B | 50.000 | 8% | 26% | 10.000 | 37% | 31% |
| anti-CD11C | 50.000 | 2% | 43% | 10.000. | 20% | 55% |
| anti-pan
NK | 50.000 | 3% | 20% | 10.000 | 9% | 3% |
| anti-Klasse II | 10.000 | 65% | 95% | 10.000 | 27% | 3% |
| anti
CD40 | 10.000 | 61% | 97% | 10.000 | <1% | - |
| anti
CD69 | 10.000 | 2% | 25% | 50.000 | 3% | 5% |
-
Wie
erwartet, zeigten BALG/c-Splenozyten eine starke Bindung von mICOS-mIgG2am
(20A und B) an phänotypische B-Zellen (CD19,
B220, CD40 >94%),
während
schwächere
Bindungen bei phänotypischen
T-Zellen und T-Zelluntergruppen (CD3+, CD4+, and CD8+; <10%) Makrophagen
(CD11b, 26%), dendritischen Zellen (CD11c, 43%) und NK-Zellen (pan-NK,
20%) gefunden wurden. Die Bindung von mICOS-mIgG2am wurde zudem
an den allgemeineren lymphoiden Markern CD24 und Klasse II-Zellen
(94%) detektiert. Eine Northern-Blot-Analyse (unter Verwendung einer
mGL50-1-spezifischen
Sonde) zeigte, dass GL50-Transkripte in den Splenozyten von RAG1
-/- Mäusen exprimiert
sind. Dies ließ darauf
schließen,
dass bei Abwesenheit von reifen T- oder B-Zellen, GL50 immer noch
auf anderen Splenozytensubpopulationen exprimiert war. In Übereinstimmung
mit diesen Beobachtungen zeigte eine Analyse von RAG 1 -/- Splenozyten (20B), dass es sich um die Subpopulationen
CD3, CD8, CD19 und CD40 handelte, und dass die verbleibenden CD11b+
(35%) und CD11c+ (55%) Zellen leicht mit mICOS-mIgG2am gegengefärbt sind.
Niedrige (<5%)
ICOS-Ig Anfärbungsgrade
waren auch in 6220+, panNK+ und CD69+ Zellen zu erkennen. Es ist
derzeit noch nicht bekannt, warum es in den mICOS-mIg Anfärbungsgraden
ein Missverhältnis
zwischen diesen drei Markern auf RAG1 -/- Splenozyten im Vergleich
zu den höheren
Anfärbungsgraden
in BALG/c-Splenozyten gibt. Eine Färbung mit mICOS-mIgG von CD4+
(45%) und CD24+ (28%) Zellen war auch in RAG1 -/- Splenozyten ersichtlich,
obwohl keine Färbung
für andere
T-Zellmarker vorhanden war. Eine Färbung mit CD4+ wurde bereits
auf dendritischen Zellen berichtet (Aicher, A. et al. (2000) J.
Immunol. 164:4689-96), und dies wurde durch das Vorhandensein von
einer CD4+, CD11c+ doppelpositiven Zellpopulation in diesen Mäuse unterstützt (20C). Das Vorhandensein von GL50-Transkripten
in Verbindung mit mICOS-mIgG-Bindung von phänotypischen Untergruppen von
Makrophagen und dendritischen Zellen in RAG1 -/- Splenozyten bestätigt das Vorhandensein
eines ICOS-Liganden auf professionellen antigenpräsentierenden
Zellen, welche die Signaltransduktion durch ICOS in vivo verstärken können.
-
Beispiel 10: Die Expression von Spleißvarianten
von GL50-mRNAs in Splenozytensubpopulationen und embryonalen Zellen
-
Da
der ICOS-Ligand als mindestens zwei Spleißvarianten zu existieren schien,
wurden Experimente ausgeführt,
um das Vorhandensein von GL50-1- und GL50-2-Transkripten in Splenozytenzellpopulationen
semiquantitativ zu bestimmen. Man stellte fest, dass BALG/c-Splenozyten,
die in Anwesenheit von LPS oder ConA kultiviert worden waren, den
ICOS-Liganden in
allen untersuchten Splenozyten hochregelten (
20). Um
zu bestimmen, ob die präferenzielle
Stimulierung von diesen Zellen die unterschiedliche Hochregelung
des GL50-1- oder GL50-2-Transkripts bewirkte, wurden mittels einer
RT-PCR und unter Verwendung von transkriptspezifischen Oligonukleotidprimern
und Hybridisierungssonden-Sets GL50-1- und GL50-2-Transkripts detektiert.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt.
-
Die
Amplifikationen wurden doppelt ausgeführt. Ihnen folgten ein Autoradiographieverfahren
zur Detektion von geblotteten GL50-Proben.
- - bedeutet kein
Signal in den doppelten Proben.
- +/- bedeutet ein Signal in einer der doppelten Proben.
- + bedeutet ein Signal in beiden der doppelten Proben.
- ++ bedeutet autoradiographische Signalsättigung in den doppelten Proben.
- (+) bedeutet optische Detektion von amplifizierten GAPDH-Produkten
durch Ethidiumbromidfärbung
-
Die
Zelluntergruppen BALG/C CD4+, CD8+ und CD19+ und die Zelluntergruppen
RAG 1 -/- CD11b+ und CD11c+ wurden mittels Bead-Separation auf >90% Reinheit angereichert.
Duplikatanalysen mittels RT-PCR von mengennormierten RNA-Proben
zeigten, dass GL50-1- und GL50-2-Transkripte in nicht-behandelten
CD4+ T-Zellen und CD19+ B-Zellen zu finden waren, was mit den Ergebnissen
von durchflusscytometrischen Analysen übereinstimmte. Trotz einer
Oberflächenproteindetektion
mittels FACS und Anreicherung von ICOS-Ligand positiven Zellen,
wurden jedoch weder GL50-1- noch GL50-2-Transkripte in CD8+ T-Zellen amplifiziert
Es ist möglich,
dass die CD8 GL50-Expression unter dem Schwellenwert der Detektierfähigkeit durch
RT-PCR liegt, oder dass der CD8+ ICOS-Ligand noch eine andere Variante
von GL50 ist, die für
die Detektion durch diesen Assay nicht vorgesehen ist. Außerdem darf
man die Möglichkeit
nicht ausschließen,
dass die Form des ICOS-Liganden, der auf CD8+ Zellen auftritt, möglicherweise
nicht, wie hierin beschrieben, GL50-1 oder GL50-2 ist, sondern dass
der CD8+ ICOS-Ligand möglicherweise
einen anderen Ursprung als ein lösliches
Protein hat und auf diesen Zelltyp übergeht. Die LPS-Aktivierung
führte
zu einem Profil ähnlich jenem
für Kontrollzellen,
mit Ausnahme davon, dass in CD8+ Proben niedrige GL50-1-Spiegel
detektiert wurden, was darauf schließen lässt, dass die LPS-Stimulierung
von B-Zellen möglicherweise
indirekt die Expression von dieser Form von ICOS-Ligand auf T-Zellen
hochregelt. Eine ConA-Stimulierung von Splenozyten führte zu
der Amplifikation von GL50-1-Transkripten
quer durch alle Proben mit einem Produktrückgang in CD19+ Zellen. GL50-2-Transkripte wurden
in CD8+ Proben induziert und wurden in CD19+ Proben nicht detektiert. der
Rückgang
an amplifiziertem Produkt sowohl von GL50-1 als auch von GL50-2
in CD19+ Zellen lässt
auf eine Regulierung der B-Zelltranskription bei Exponierung gegenüber ConA
schließen.
In RAG -/- Splenozyten wurden GL50-1 und GL50-2 in CD11b+ und CD11c+
positiven Zellen detektiert, während
kultivierte dendritische F5M- und WEHI231-Zellen GL50-1-Transkripte
zeigten. Niedrige GL50-2-Spiegel wurden in WEHI231 und LPS aktivierten
F5M-Zellen detektiert, während
in nicht-induzierten
F5M-Zellen kein amplifiziertes Produkt detektiert wurde. In Proben,
die embryonale Gewebe repräsentierten,
wurden in allen Proben GL50-1 und GL50-2 detektiert, wobei hohe
Spiegel von beiden Spleißvarianten
auf D0 ES-Zellen gefunden wurden. Hohe Spiegel von GL50-1 wurden
auch in 12,5 Tage alten Embryo- und in 11,5 Tage alten Dottersackproben
detektiert. Diese Ergebnisse korrelieren mit dem Grad der Transkript-Hybridisierung,
der in einer RNA-Blot-Analyse festgestellt wurde (siehe oben).
-
Beispiel 11: Das GL50-ähnliche Molekül Y08823
vom Huhn bindet nicht an ICOS
-
Erst
vor sehr kurzer Zeit wurde die Kristallstruktur von B7-1 bei drei
Angström
aufgelöst,
was eine Struktur enthüllte,
die aus parallelen, zweifach drehbar symmetrischen Homodimeren mit
geladenen Resten in der Domäne
des Amino-Endes von B7-1 besteht, die für direkte Interaktionen mit
CD28/CTLA4 zuständig
sind. Humane und murine GL50-, B7-1- und B7-2-Proteinsequenzen zeigen 19-27%
Sequenzidentität
(Tabelle 5), was darauf schließen
lässt,
dass sie möglicherweise
auch strukturelle Ähnlichkeiten
gemeinsam haben.
| Tabelle
5: Alignment-Scores zwischen GL50-, B7-1- und B7-2-verwandten Proteinen |
| | Sequenzidentität in % |
| hGL50 | Y08823 | mGL50 | mGL50 -B | hB7-2 | mB7-2 | hB7-1 | mB7. |
| | hGL50 | - | 36 | 44 | 44 | 19 | 24 | 25 | 22 |
| | Y08823 | 138 | - | 37 | 37 | 28 | 23 | 26 | 30 |
| Genet. | MGL50 | 85 | 131 | - | 99 | 24 | 25 | 24 | 27 |
| Distanz | | | | | | | | | |
| | MGL50 | 85 | 131 | 0,4 | - | 26 | 23 | 26 | 26 |
| | -B | 270 | 230 | 221 | 221 | - | 51 | 26 | 30 |
| | hB7-2 | 251 | 310 | 200 | 200 | 68 | - | 24 | 28 |
| | mB7-2 | 243 | 224 | 247 | 247 | 222 | 243 | - | 45 |
| | hB7-1 | 261 | 223 | 282 | 282 | 190 | 182 | 88 | - |
| | mB7-1 | 188 | 219 | 214 | 214 | 207 | 248 | 220 | 269 |
| | 065 | | | | | | | | |
-
Eine
frühere
Analyse von Y08823 ließ darauf
schließen,
dass beta-Stränge
das DEB bilden, und nicht-verdrillte AGFCC'C'' beta-Faltblätter innerhalb
der Domäne
des Amino-Endes sollten zwischen Y08823 und B7-1 konserviert sein
(Ikemizu, S. et al. (2000) Immunity 12:51-60). Interessanterweise
war der höchste Grad
an vorhergesagter sekundärer
Strukturkonservierung zwischen den GL50-Sequenzen und Y08823 auch in den Regionen,
welche die DEB-beta-Faltblätter
der entsprechenden Domäne
des Amino-Endes umfassen. Vorhersagen auf Basis der strukturellen
Homologien lassen darauf schließen,
dass Sequenzidentitäten
in dieser Region für
entscheidende elektrostatische Kontakte zwischen den Domänen sorgen
und die Hydropathie an der Kontaktstelle zwischen den Domänen bewahren
könnten,
was zu einem ähnlichen
molekularen Gerüst führt wie
jenes, das die GL50- und B7-Moleküle gemeinsam haben (16). Auf Basis dieser Beobachtungen wurde Y08823
vom Huhn auf seine Bindungsfähigkeit
an ICOS-Rezeptoren beurteilt. Mittels einer RT-PCR erhielt man Sequenzen,
die das reife Y08823-Peptid repräsentieren.
Diese Sequenzen wurden in einen Expressionsvektor subkloniert, was
bei der Transfektion von COS-Zellen ein funktionelles Oberflächenprotein
ergab. Man stellte fest, dass Y08823-transfizierte Zellen an CTLA4-Ig
binden, aber weder an hICOS-mIgG2am noch an mICOS-mIgG2am (17). Obwohl es auf Basis der hierin verwendeten
Assay-Bedingungen nicht ausgeschlossen werden kann, dass die Bindung
von Y08823 an ICOS auf nicht detektierbaren Ebenen erfolgt, ist
es unwahrscheinlich, dass das GL50-ähnliche Protein Y08823 übergreifend
als Ligand für
humane oder murine ICOS-Rezeptoren funktioniert.
-
Strukturelle
und genetische Ähnlichkeiten
lassen darauf schließen,
dass Proteine des Typs B7/GL50 über
extreme phylogenetische Grenzen konserviert sind, und in dieser
Interpretation ist impliziert, dass auch mechanistische Wege von
diesen Proteinen gemeinsam benutzt werden. Der Beweis, dass diese
Proteine ähnliche
Funktionen in Bezug auf die Signaltransduktion der T-Zellen haben,
wirft die Frage nach der absoluten Anzahl und des Ursprungs von
costimulatorischen Liganden, ihren verwandten Rezeptoren und existierenden abgeleiteten
Spteißvarianten
auf. Andere Proteine, die in die Struktur der B7 Ig-Superfamilie
passen, beinhalten MOG und Butyrophilin, aber es ist nicht ermittelt
worden, ob diese Proteine als Liganden in irgendeinen costimulatorischen
Weg involviert sind (Henry, J. et al. (1999) Immunol. Today 20:285-8).
Mit der Sequenzverfügbarkeit
von Chromosom 21 (Hattori, M. et al. (2000) Nature 405:311-9) wurde
die genomische Organisation des humanen ICOS-Liganden bestimmt,
was auf das Vorhandensein von mindestens zwei Spleißvarianten
in der Form von hGL50 (Ling, V. et al. (2000) J. Immunol. 164:1653-7)
und KIAA Klon 0653 hinwies (Genbank Accession Nr. AB014453). Zu
den Mitgliedern der B7-ähnlichen
Gene sind die genomische Struktur von B7-1, B7-2, Butyrophilin und
hGL50 gezählt
worden. Obwohl die absolute Anzahl von Exonen, die diese Gene umfassen,
von 5 bis 12 variiert, haben diese Gene die gleiche Struktur, in
der verschiedene Exone die zwei Ig-ähnlichen extrazellulären Domänen codieren:
ein Exon codiert die Transmembrandomäne, und mehrere Exonde codieren
die cytoplasmatische Domäne
(z.B. zwei Exone für
hGL50, zwei Exone für
B7-2 (Jellis, C. E. et al. (1995) Immunogenetics 42:85-9; Borriello,
F. et al. (1995) J. Immunol. 155:5490-7), ein bis zwei Exone für B7-1 (Borriello,
F. et al. (1994) J. Immunol. 153:5038-48), und drei Exone für Butyrophilin
(Ogg, S. L. et al. (1996) Mamm. Genome 7:900-5)). Für KIAA0653
wird die Spleißstelle
zwischen Exonen, welche die cytoplasmatischen Domänen 1 und
2 codieren, nicht verwendet, was zu einem Read-through von 2,9 kb
in das putative Intron 6 führt.
Bei dem Alignment von KIAA0653 mit Chromosom 21 stellte man fest,
dass der BAC-Klon HS21 C098, die alternative cytoplasmatische 3'-Domäne von KIAA0653,
nicht übereinstimmte:
acht Sequenzabweichungen wurden festgestellt, darunter sieben Fehlpaarungen
und eine 17 bp Deletion. Das Exonsequenz-Alignment von humanem GL50
an HS21 C098 zeigte hingegen keine Sequenzabweichungen bis zu und
einschließlich
der Polyadenylierungsstelle. Die oben dargelegten Beispiele zeigen,
dass humanes GL50, mGL50-1 und variantes mGL50-2 eine geringe Aminosäuresequenzidentität in der
Nähe der
Spleißstelle
für die
cytoplasmatische Domänen
1 und 2 aufweist (mGL50-1 Reste 316-318: E-L-T; 16). Der gemeinsame Punkt der Spleißvariation
zwischen hGL50/AB014553 und zwischen mGL50-1/mGL50-2 lässt auf
ein Potenzial eines konservierten Mechanismus schließen, der
alternatives Spleißen
der cytoplasmatischen Domäne
2 gestattet oder fördert,
möglicherweise
um durch die kombinatorische Zugabe von alternativen funktionellen Domänen eine
alternative Signaltransduktion zu bieten. Die Beobachtung, dass
mGL50-2 und das ursprüngliche
mGL50-1 mit unterschiedlichen Gewebespezifitäten transkribiert werden, unterstützt den
Gedanken, dass die Regulierung dieser Moleküle in der Zellsignaltransduktion
vom physiologischen Ort und dem Aktivierungszustand abhängig ist.
-
Die
Existenz eines konservierten intrazellulären Motivs zwischen GL50 vom
Säugetier
und Y08823 vom Vogel, zusammen mit dem Vorhandensein von mehreren
Formen von GL50 mit abweichenden Carboxyl-Regionen, lässt ferner
darauf schließen,
dass Unterschiede in der intrazellulären Domäne von diesen Molekülen möglicherweise
zu verschiedenen Signaltranduktionsfunktionen führen. Dies wird zudem durch
das Vorhandensein von drei zusätzlichen
Tyrosinresten unterstützt,
die sich in der intrazellulären
Domäne
von mGL50-2 befinden, neben den zwei Tyrosinresten, die mGL50-2
mit mGL50-1 gemein hat. Diese Gegensätze in der Struktur von B7-1 und B7-2, wo die
intrazellulären
Regionen keinerlei offensichtliche konservierte Sequenzen haben
und ohne Beeinträchtigung
der costimulatorischen Aktivität
entfernt worden sind, lässt
darauf schließen,
dass die intrazelluläre
Signaltransduktion kein Hauptmerkmal dieser B7-Proteine ist (Brunschwig, E.
B. et al. (1995) J. Immunol. 155:5498-505). Man hat festgestellt,
dass das konservierte Motiv von hGL50 trotz der Vorhersage durch
eine Hydrophobieanalyse, dass es sich in dem intrazellulären Teil
des Moleküls
befände,
von Exon 5 (Transmembrandomäne)
codiert ist, und nicht von Exon 6 (cytoplasmatische Domäne 1). In dem
Y08823 cDNA-Klon vom Huhn endet die Sequenzhomologie mit drei Aminosäureresten
nach dem entsprechenden Exon 6 (cytoplasmatische Domäne 1). Wenn
die genomische Organisation von hGL50 in Y08823 beibehalten wird,
in der das konservierte Motiv von dem intrazellulären Teil
von Exon 5 (Transmembrandomäne)
codiert ist, dann ist es möglich,
dass DNA-Segmente, die ortholog zu Exon 6 und Exon 7 sind, welche
die cytoplasmischen Domänen
1 und 2 in hGL50 codieren, im Huhn komplett fehlen. In den Strukturuntersuchungen
der cytoplasmatischen Domäne
von B7 wird die Auffassung vertreten, dass diese Sequenzen völlig entbehrlich
sind (Brunschwig, E. B. et al. (1995) J. Immunol. 155:5498-505).
Die Tatsache, dass alternative cytoplasmatische Exone in B7-1 und
GL50 verwendet werden, lässt
jedoch darauf schließen,
dass die alternativen Exondomänen
zu der Zeit hinzukommen sind, als die neuen B7-ähnlichen Proteine generiert
wurden. Die B7-ähnlichen
Butyrophilinproteine werden von einer Reihe von Spleißvarianten
codiert, deren vorherrschende Form eine cytoplasmatische Domäne 3 enthält, die
ein intrazelluläres
Ringfingermotiv codiert, das möglicherweise
bei der Signaltransduktion von diesem Molekül verwendet wird (Ogg, S. L.
et al. (1996) Mamm. Genome 7:900-5). Diese Beobachtungen unterstützen die
Idee, dass andere Moleküle
vom Typ Ligand, wie zum Beispiel GL50 und Y08823, mit dem konservierten
intrazellulären
Motiv von Exon 5 und anderen cytoplasmatischen Domänen, andere
Rollen als die Signalübertragung
und die eines Signalempfängermoleküls haben könnten, je
nach Umgebungsmilieu, in dem die Zelle sich befindet.
-
Zur
eindeutigen Definition der Zelluntergruppen, die eine Oberflächenexpression
von GL50 zeigen, wurden eine vergleichende Phänotypisierung von RAG1 -/-
und BALG/C-Splenozytenuntergruppen ausgeführt. Die vorstehend dargelegten
Beispiele zeigen, dass frisch isolierte CD4+ und CD8+ Zellen sowie
RAG 1 -/- CD11c+ Zellen Subpopulationen von ICOS-Ligand-exprimierenden Zellen enthielten.
Diese Ergebnisse unterscheiden sich von früheren Untersuchungen, laut
denen in T-Zelllinien (Aicher, A. et al. (2000) J. Immunol. 164(9):4689-96)
und in einigen dendritischen Zelllinien angeblich kein ICOS-Ligand
zu finden war (Yoshinaga, S. K. et al. (1999) Nature 402:827-32).
Eine RT-PCR-Analyse von gereinigten Zelluntergruppen bestätigte, dass
sowohl GL50-1 als auch GL50-2 in den selben Zellen exprimiert waren,
was darauf schließen
ließ,
dass beide Transkripte zu der Oberflächenpräsentation der ICOS-Bindung
beitragen. Zusätzlich
zu antigenpräsentierenden
Zellen wurde mit dem Vorhandensein von B7-1- und GL50-1-Transkripten
in undifferenzierten Zellen und in embryoiden Körpern, die man 10 Tage lang
in vitro kultivierte, nachgewiesen, dass die erste Expression von
costimulatorischen Liganden frühzeitig
in dem ES-Zellmodell der embryonalen Entwicklung erfolgt Ling, V. et
al. (1998) Exp. Cell Res. 241:55-65). In dieser Untersuchung wurde
ferner durch eine RNA-Analyse nachgewiesen, dass sich auch GL50-2-Transkripte in
diesen Geweben befinden. Nach neuntägiger Differenzierung des embryoiden
Körpers ähneln die
sich entwickelnden hämatopoetischen
Zellen phänotypisch
hämatopoetischen
Vorstufen im Dottersack in vivo, was durch das Potenzial von c-kit+/PECAM1+
Zellen zur Erzeugung von gemischten hämatopoetischen Vorstufen und
das Potenzial von CD45+ Zellen zur Erzeugung von Makrophagenvorstufen
in Koloniebildungsassays bestätigt
ist (Ling, V. and Neben, S. (1997) J. Cell Physiol. 171:104-15;
Ling, V. et al. (1997) Eur. J Immunol. 27:509-14). Man stellte fest,
dass diese CD45+ Zellen auch B7-1+ und B7-2+ sind, was stark darauf
hindeutet, dass die costimulatorische Ligandenexpression sehr frühzeitig
in der Lymphopoese erfolgt. Dementsprechend wurden an Stellen der
embryonalen Hämatopoese,
wie zum Beispiel embryonaler Dottersack und fötale Leber, hohe Expressionsgrade
von GL50-1 und GL50-2 gefunden. Es ist nennenswert, dass der ICOS-Ligand
in embryonischen Fibroblastenkulturen induzierbar ist, ein Zelltyp,
der aus einer Zeit vor der definitiven Lymphopoese stammt, was darauf
schließen
lässt,
dass der Mechanismus für
die costimulatorische Signaltransduktionskaskade unabhängig von
der anfänglichen
Formation der adaptiven Immunantwortbereit sein kann. Es ist postuliert
worden, dass Gewebetiere entwicklungsfähige Bahnen gemeinsam haben,
die in dem phylotypischen Stadium der Embryogenese erscheinen, und
dass bestimmte physiologische Kernprozesse mit besonderen Eigenschaften,
die für
die komplexe Entwicklung relevant sind, während dieser embryonalen Entwicklungsperiode
und später
in der Physiologie der Erwachsenen widergespiegelt werden (Kirschner,
M. and Gerhart, J. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:8420-7).
Es bleibt zu ermitteln, ob costimulatorische Liganden Teil von einigen
Kernprozessen sind, die sowohl für
embryonale als auch für
adulte Systeme verwendet werden.
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Trotz
der großen
genetischen Distanz zwischen den Mitgliedern der B7-Familie lässt die
Tatsache, dass B7-1 und B7-2 vom Primaten und vom Nager Querbindung
an CTLA4 und CD28 über
phylogenetische Linien bewahren, auf Toleranz in Bezug auf Nukleotidaustausch
in diesen Transduktionsmolekülen
im Laufe der Naturgeschichte schließen. Zum Vergleich des phylogenetischen
Divergenzmusters zwischen costimulatorischen Liganden und ihren
Rezeptoren wurden Proteinsequenzen von CTLA4- (Genbank Accession
Nr. NM_009843 and NM_005214), CD28- (Accession Nr. NM_007642, NM_006139
und X67915) und ICOS- (Genbank Accession Nr. AJ250559 und Genseq
Accession Nr. V53199) Rezeptoren von der Maus, vom Menschen und
vom Huhn untersucht. Bei Darstellung in einem graphischen Format
(Tabelle 6) zeigten die genetischen Distanzwerte dieser Rezeptoren
ein Muster (
21), in dem Distanzen zwischen
ICOS- und CD28-Proteinen kleiner waren als Distanzen zwischen ICOS
und CTLA4.
| Tabelle
6: Alignment-Scores zwischen ICOS, CTLA4 und CD28 |
| | | Sequenzidentität in % |
| mICOS | hICOS | hCTLA4 | mCTLA
4 | hCD28 | mCD28 | chCD28 |
| | hICOS | - | 69 | 21 | 20 | 28 | 24 | 21 |
| | mICOS | 41 | - | 17 | 16 | 25 | 21 | 20 |
| Genet. | hCTLA4 | 250 | 368 | - | 74 | 30 | 29 | 32 |
| Distanz | | | | | | | | |
| | mCTLA | 272 | 466 | 33 | - | 31 | 32 | 31 |
| | 4 | | | | | | | |
| | hCD28 | 175 | 205 | 165 | 154 | - | 67 | 50 |
| | mCD28 | 217 | 257 | 167 | 149 | 44 | - | 48 |
| | chCD28 | 246 | 278 | 152 | 156 | 79 | 85 | - |
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Beim
Vergleichen der Beziehungen der Rezeptorsequenzen zwischen Spezies,
stellte man fest, dass die Distanzwerte für humanes CD28/ICOS (176) kleiner
waren als jene für
murines CD28/ICOS (257). Ebenso stellte man fest, dass die Distanzwerte
für humanes
CTLA4/ICOS (261) kleiner waren als die Distanzwerte für murines
CTLA4/ICOS (405). Diese Daten lassen darauf schließen, dass
die Struktur des ICOS-Moleküls
wohl eher von der Form von CD28 stammt als von CTLA4. Hingegen zeigte
eine phylogenetische Analyse des costimulatorischen Liganden, dass
die Distanzwerte zwischen GL50 und B7-1 (243-282) beinahe gleich
den Distanzwerten zwischen GL50 und B7-2 (200-270) waren. Man stellte
fest, dass Y08823 eine größere Sequenzidentität und eine
geringere genetische Distanz (36-37%; 131-138) zu murinen und humanen
GL50-Proteinen zeigte als zu B7-Proteinen (23-30%, 230-310). Die
beinahe gleichen genetischen Distanzen zwischen den Mitgliedern
der GL50-Familie und den Mitgliedern der B7-1/B7-2-Familie und die
nicht gleichen genetischen Distanzen zwischen den Mitgliedern der
ICOS-Familie und den Mitgliedern der CD28/CTLA4-Familie impliziert, dass
die evolutionären
bzw. funktionellen Einschränkungen,
welche die Familie der Rezeptoren lenken, sich von jenen, welche
die Familie der Liganden lenken, unterscheiden.
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Phylogenetische
Sequenzbeziehungen können
die genomische Platzierung dieser Moleküle widerspiegeln: B7-1 und
B7-2 kolokalisiert mit dem murinem Chromosom 16 und dem humanem
Chromosom 3, während
CTLA4, CD28 und ICOS mit dem murinem Chromosom 1 und mit dem humanem
Chromosom 2q33 kolokalisieren. Demgegenüber sind die genetischen Loci
von GL50 nicht mit den Loci von B7 verbunden; humanes GL50 befindet
sich an Chromosom 21 q22 (Hattori, M. et al. (2000) Nature 405:311-9),
während
murines GL50 sich auf Chromosom 10 befindet. Bei einer Analyse mit
TfastX wurden keine zusätzlichen
GL50-ähnlichen
Homologa in Chromosom 21 identifiziert, was darauf schließen lässt, dass
GL50 wohl nicht als Familie von Genen existiert, die wie B7-1 und
B7-2 zusammengeballt sind. Im Fall von Y08823 ist es nicht klar,
ob diese Molekül
ein tatsächliches Ortholog
von B7-1 ist, oder ob Y08823 ein neues B7-ähnliches Molekül darstellt, dessen
Ortholog noch nicht in Säugetiersystemen
definiert worden ist. Es war allerdings überraschend, dass von den 23-30%
Sequenzidentität
zwischen B7s und Y08823, einschließlich mehrerer Aminosäureaustausche an
Stellen mit geladenen Resten, diese Proteine eine funktionelle Querbindung
an CTLA4 bewahren (O'Regan,
M. N. et al. (1999) Immunogenetics 49:68-71). Das unerwartete Ergebnis,
dass Y08823 eine größere strukturelle Ähnlichkeit
zu GL50 aufweist, und dennoch Bindungseigenschaften bewahrt, die
für B7-1
und B7-2 typisch sind, lässt
darauf schließen,
dass strukturelle und funktionelle Einschränkungen auf die Divergenz von diesen
costimulatorischen Liganden gering sind.
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Zahlreiche
Szenarien können
die unterschiedlichen genetischen Distanzen bedingen, die zwischen Rezeptorfamilien
und Ligandenfamilien gemessen wurden. Es ist möglich, dass die Gene, welche
die GL50/B7-Proteinfamilie codieren, früher entstanden als die Gene,
welche die CD28/CTLA4-Rezeptoren codieren. Die Entstehung der Gene,
die den ICOS-Rezeptor codieren, können zu einem späteren Zeitpunkt
in der Phylogenese entstanden sein und können auf der Struktur von CD28
basieren, was zu einer größeren Ähnlichkeit
zu CD28-Molekülen
als zu CTLA4-Molekülen
führt.
Diese Hypothese kann die zahlreichen B7-ähnlichen Proteine erklären, die
es gibt, während
relativ wenige CD28-ähnliche
Rezeptoren beschrieben worden sind. es ist beachtenswert, dass bestimmte
Exone von CTLA4 beachtliche Sequenzbedingungen beibehalten, selbst
auf der Stufe von synonymen DNA-Mutationen, was darauf schließen lässt, dass
es einen noch zu bestimmenden Mechanismus gibt, der diesen Locus
vor wahllosen Mutationen schützt
(Ling, V. et al. (1999) Genomics 60:341-355). Möglicherweise regelt ein Mechanismus,
der die Mutation beschränkt,
die Region des costimulatorischen Rezeptors über die Länge der CTLA4/CD28/ICOS Loci,
oder der verstärkte
Selektionsdruck auf die intrazelluläre Signaltransduktionsdomäne von diesen
Rezeptoren reicht aus, um eine geringere Abweichungsrate zu bewahren.
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Costimulatorische
Liganden und Rezeptoren gehören
zu de rIg-Superfamilie von Proteinen, die als jene Proteine definiert
worden sind, die im Bereich von 10-20% zu Immunglobulinen homolog
sind und charakteristische Disulfidbindungen zwischen den Ketten
aufweisen. Proteine der Ig-Superfamilie sind unter Proteinen von
unterschiedlichen Funktionen und zwischen Phylogenien der Wirbeltiere
weit verbreitet. Das Erscheinen von Arthropoden und Chordaten liegt
600 Mio Jahre zurück,
und es ist behauptet worden, dass Moleküle, welche die putativen Vorläufer der
Ig-Superfamile repräsentieren,
noch älter
sind und vermutlich in den Acoelomaten vorhanden sind, wie zum Beispiel
Flachwürmer
und Nematoden. Die Meinung, dass die Ig-Superfamilie von Proteinen
mindestens genauso alt ist, wird durch die Feststellung untermauert,
dass einige Ig-ähnliche
Proteine, wie zum Beispiel N-CAM sowohl in Säugetieren als auch in Insekten
zu finden sind. Der immunologische "Urknall" (engl.: "big bang") (Marchalonis, J. J. et al. (1998)
Immunol. Rev. 166:103-22 und darin enthaltene Referenzen), durch
den das Ig-basierte, kombinatorische adaptive Immunsystem entstand, erschien
theoretisch während
der Entstehung von Kieferfischen vor 450 Mio Jahren über eine
geologisch kurze Zeitspanne von 10-20 Mio Jahre hinweg. Zur Zeit
gibt es keinen klar definierten Mechanismus, durch den das Immunglobulinsystem
von der Ig-Superfamilie von Molekülen sich hätte entwickeln können. Es
gibt jedoch Theorien, die behaupten, dass Gene, die Ig-Domänen und
Rekombinase-Enzyme codieren, die für das kombinatorische Immunsystem
notwendig sind, horizontal auf eine ausreichend große Skala überführt wurden,
um einen selektiven Vorteil zu bieten (Bernstein, R. M. et al. (1996)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9454-9). Es fehlt namentlich eine
Basis für
ein umfassendes biochemisches System, das die hervorspringenden
Signaltransduktionsmerkmale der Ig-Superfamilie der costimulatorischen
Moleküle
enthält,
die dazu dienen, die Zellaktivierung auszulösen, die Reifung des Immunglobulinmoleküls zu fördern und
das Verändern
der Klasse ("class switching") zu beeinflussen.
Auch wenn es derzeit nicht bekannt ist, ob noch vorhandene Mitglieder
der alten Klasse der Chondrichthyes, wie zum Beispiel Haie, costimulatorische
Moleküle
haben, so lässt
doch die Tatsache, dass costimulierungsabhängige Proteine, wie zum Beispiel
CD28 and Y08823 in Hühnern
zu finden sind, darauf schließen,
dass es eine Art von costimulatorischem Signalweg in den Mitgliedern
der Linie der Vögel
gab, der vor mindestens 300 Mio Jahren entstand (Gurt, D. W. et
al. (1999) Nature 402:411-3), was die Möglichkeit eröffnet, dass
das Y08823-Molekül
einen zeitgenössischen
Vetter sowohl zu GL50-Molekülen
als auch zu B7-Molekülen
darstellt, der wohl eher eine stärkere Ähnlichkeit
zu einem Prototyp eines costimulatorischen Liganden aufweist, als
dass er ein tatsächliches
Ortholog von GL50 oder B7 ist. Im Gegensatz zu der Vogellinie wird
postuliert, dass die evolutiven Linien der Maus und des Menschen
sich vor ca. 100 Mio Jahren trennten, wobei das Genom der Maus im
Vergleich zum Huhn und zum Menschen erhebliche chromosomale Neuordnungen
erfuhr (Gurt, D. W. et al. (1999) Nature 402:411-3). Es ist nicht
bekannt, ob diese Neuordnungen zu der chromosomalen Trennung zwischen
den Mitgliedern der B7-Familie und den Genen, die GL50-Moleküle codieren,
geführt
hat. Ebenfalls unbekannt ist, ob aviäres ICOS oder Varianten davon
existieren.
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Beispiel 12: Lösliches GL50 kann humane T-Zellen costimulieren
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Die
Fähigkeit
von löslichem
hGL50-mIgG2am, humane T-Zellen zu costimulieren, wurde unter Verwendung
eines Assays für
die Costimulation von T-Zellen ermittelt. Natürliche CD4+ T-Zellen wurden
gereinigt und mit 10% Zellen pro Vertiefung ausplattiert. Die Zellen
wurden mit anti-CD3 auf Beads stimuliert, wobei man ein Bead pro
Zelle und 1 oder 2 μg
anti-CD3 pro 107 Beads verwendete. Die Zellen
wurden mit hGL50-mIgG2am auf Beads behandelt, wobei man ein Bead
pro Zelle und 3 μg
hGL50-mIgG2am pro 107 Beads verwendete.
Eine Signaltransduktion wurde über
CD28 induziert (unter Verwendung von anti-CD28 (Pharmingen)) oder
stimuliert, um zu ermitteln, ob die Modulation der CD28-vermittelten
Costimulation eine Auswirkung auf die hGL50mIgG2am-vermittelte Costimulation
hatte.
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Die
IL-2-Produktion, die IL-10-Produktion und die Proliferation (3H-Einbau) wurden als Indikatoren der Costimulation
untersucht. Nach 72 Std. Stimulation wurden Zytokine und Proliferation
gemessen.
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Wie
in 22 gezeigt, kann hGL50-mIgG2am (auch hGL50.Fc
genannt) T-Zellen costimulieren, was aus dem Anstieg der Proliferation
sowie aus der Induktion der IL-2- und IL-10-Produktion ersichtlich
war. In der Anwesenheit von Antikörpern gegen CD28, was eine CD28-vermittelte
Costimulation induziert, wird auch die IL-2-Produktion induziert. 23 zeigt die Wirkungen der verschiedenen Konzentrationen
von anti-CD3 und anti-CD28 auf die Proliferation und die Zytokinproduktion.
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24 zeigt, dass die Zugabe von anti-CD28 zu den
T-Zellen, die mit anti-CD3 oder anti-CD3 und löslichem hGL50mIgG2am stimuliert
waren (um die CD28-vermittelte Costimulation zu stimulieren) die
IL-2-Produktion induziert, aber nicht die hGL50-vermittelte IL-10-Produktion
beeinflusst.
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Beispiel 13: Behandlung von Tumoren in
Mäusen
durch Stimulierung des ICOS/GL50-Signalwegs
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Bisher
liegen keine Berichte über
die Rolle der ICOS/GL50-Costimulation in der Herstellung von Antitumorantworten
vor. In dieser Studie wurde in verschiedenen murinen Tumormodellen
die relative Wirksamkeit der ICOS/GL50-Costimulation mit der CD28/B7-Costimulation
verglichen. Zur systematischen Behandlung von tumortragenden Tieren
wurden murine B7.2-IgG2a- und GL50-IgG2a-Fusionsproteine hergestellt, die
aus der extrazellulären
Domäne
von B7.2 bzw. GL50 und dem Fc-Teil von murinem IgG2a bestehen. Der
murine Isotyp IgG2a wurde zur Kontrolle verwendet. Mäuse, die
MethA oder B6F1 Melanomtumore tragen, wurden zweimal die Woche drei
Wochen lang subkutan mit 50 μg/Injektion
GL50-IgG2a- oder B7.2-IgG2a-Fusionsprotein behandelt. In dem MethA-Modell
führte
die Behandlung mit B7.2-IgG2a zu einem Tumorrückgang von bis zu 100% (25A) und Heilung der Mäuse (25E),
und die Behandlung mit GL50-IgG2a führte zu einer Heilung der Mäuse von
bis zu 60-90% (25E) und zu einer signifikanten
Verzögerung
des Tumorwachstums von 40% (25D).
In dem B16F1-Melanom führte
eine systemische Behandlung mit jedem Protein zu einer vergleichbaren
Verzögerung
des Tumorwachstums. In beiden Tumormodellen zeigte die Kontrollbehandlung
mit IgG2a keine Wirkung (25A, C und
E). In Studien zu Tumorimpfstoffen wurde das B16F1-Melanom- und
das M649-Balsenkarzinommodell verwendet. Die Tumorzellen wurden
mit einem Vektor transduziert, der den EF-1-alpha-Promotor enthielt,
der entweder murines B7.1 oder GL50 exprimierte, und G418 (Neomycin)-selektierte
Tumorzellen wurden für
vivo Tumorigenizitätsexperimente
subkutan injiziert. Die Expression von GL50 und B7-1 auf Tumorzellen
wurde mittels einer FACS-Analyse bestimmt, bei der ein monoklonaler Antikörper gegen
mB7-1 (Pharmingen, Klon 16-10A1) oder ein ICOS-IgG2a-Fusionsprotein
verwendet wurde. Die Ergebnisse zeigen: (i) in dem B16F1-Modell
stoßen
40% der Mäuse,
denen GL50-exprimierene Tumorzellen injiziert worden waren, und
20% der Mäuse,
denen B7.1-exprimierende Tumorzellen injiziert worden waren, ihre
Tumore ab (31A); (ii) in dem MB49-Modell
stoßen
30% der Mäuse,
denen GL50-exprimierene Tumorzellen injiziert worden waren, und
10% der Mäuse,
denen B7.1-exprimierende Tumorzellen injiziert worden waren, ihre
Tumore ab (31B). Diese Ergebnisse besagen,
dass verstärkte
in vivo Interaktionen zwischen ICOS und GL50, die entweder durch
lösliche
GL50-IgG- oder GL50-Expression auf Tumorzellen bedingt ist, eine
signifikante Antitumorwirkung hat, die mit der gut beschriebenen
Antitumorwirksamkeit des CD28/B7-Signalwegs in murinen Tumormodellen
vergleichbar ist.
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