CN102675470B

CN102675470B - SCF-Fc融合蛋白

Info

Publication number: CN102675470B
Application number: CN201210094390.4A
Authority: CN
Inventors: 郑心校; 田燕; 卞春东; 查长春
Original assignee: JIANGSU FUTAI BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: JIANGSU FUTAI BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2012-04-01
Filing date: 2012-04-01
Publication date: 2015-06-17
Anticipated expiration: 2032-04-01
Also published as: CN102675470A

Abstract

本发明提供了一种SCF-Fc融合蛋白，其特征在于，所说的SCF包括胞外区全部序列，所说的Fc片段包括铰链区、CH2区和CH3区，所说的SCF与Fc序列之间为直接融合或通过连接序列融合。本发明的SCF-Fc融合蛋白可用于建立溶细胞性SCF-Fc融合蛋白，一过性的清除cKit表面受体阳性的造血干细胞，激活骨髓造血干细胞微环境－Niche,促进造血干细胞归宿至干细胞微环境，诱导和增强混合嵌合体的形成，以诱导移植免疫耐受，还可以应用于对血液系统遗传性细胞异常疾病的干细胞治疗；用于建立非溶性的SCF-Fc融合蛋白可以应用于SCF的替代疗法，以及用于标记和分离骨髓造血干细胞。

Description

SCF-Fc融合蛋白

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白，具体地说，涉及一种SCF-Fc融合蛋白，属于基因工程技术领域。

背景技术

自1990年美国3个研究组几乎同时报道干细胞因子(SCF)以来，世界各地进行了广泛深入的研究。干细胞因子又称肥大细胞生长因子（MGF），c-Kit配体（c-Kit-L）及Steel因子（SLF）。它是由骨髓微环境中的基质细胞产生的一种酸性糖蛋白。其糖基连在肽键的N和O基团上，由非共价结合的两个相同亚基组成。

SCF和其他细胞因子一起诱导干和祖细胞增生、延长其存活期及引起干和祖细胞动员。虽然SCF的受体在祖细胞无显著不同，但SCF诱导红系祖细胞增生比粒-单祖细胞强，可能是其他特异性因素影响祖细胞对SCF的反应性。给小鼠应用SCF和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，外周血干细胞和祖细胞第1天即达高峰，6周后正常。骨髓中干和祖细胞第1天下降，第14天升高达10倍，6周后正常。表明最初外周血干和祖细胞升高是由骨髓中动员到外周血。Mauch等报道SCF和IL-11合用增加长期骨髓增殖细胞（LTMRC）从骨髓动员到未切脾鼠的脾和切脾鼠的血液。Yonemura等认为SCF单独在体外不能维持干细胞量，体内作用是SCF和其他细胞因子相互作用的结果。在体外SCF和IL-7协同促进体B细胞增生。Takeda等认为体内B细胞发育不是受体c-kit和SCF相互作用，而另一受体型酪氨酸激酶（FLK2）对B细胞发育比c-kit更重要。

SCF在肥大细胞发育和存活中起关键作用。小鼠SCF的基因缺失导致结缔组织和粘膜表面肥大细胞缺乏。由于SCF引起肥大细胞脱粒，应用时一般以减少剂量为代价。Nocka等发现与二硫化物相联系的二聚体SCF比普通SCF刺激细胞增生强10～20倍，但对肥大细胞脱粒并不比普通SCF强。

SCF既有化学激动性，也有化学趋化性。膜结合型SCF促进造血祖细胞回到骨髓。静脉输注c-kit+造血祖细胞后其沿着SCF的梯度移动到骨髓，是由ckit粘附到骨髓基质细胞表面的SCF引起的。Kim等认为基质细胞源因子-1（SDF-1）只有化学趋化性，它作为生理抗移动因子抑制造血祖细胞移出骨髓。

应用SCF、促血小板生长因子(TPO)、IL-12、IL-3处理冷冻骨髓细胞移植给鼠，其恢复血小板和中性粒细胞比用未处理的骨髓移植早3～6 d。在鼠模型中，受者在应用5-FU前和后给予SCF注射，可以使干细胞从静止期进入细胞周期。这样干细胞对5-FU敏感，易于杀死，为供者骨髓移入受者提供了稳定的内环境，有利于骨髓移植的成功。

综上所述，SCF有着广泛的应用前景，然而SCF应用于临床至今并没有取得实质性的、突破性的进展，而且很多体外实验的明显结果往往在体内难以得到重复与验证。究其原因，天然或重组SCF自身短暂的血浆循环半衰期是关键性障碍。大多数细胞因子因免疫刺激而分泌并发挥其调节作用。但它们的血浆半衰期都很短暂，从生理角度这是一种机体避免过度的免疫反应的保护机制。其中以SCF为例，其体内循环半衰期仅仅为数分钟。因而使用天然或重组SCF于体内，难以达到稳定的有效的血浆浓度。本发明的干细胞生长因子与Fc融合蛋白（SCF-Fc），不仅具有重组SCF的全部生物学活性，而且明显延长了半衰期。

特别，在器官移植方面，目前异体器官移植已成为挽救晚期器官衰竭患者生命的有效临床手段，然而如何解决居高不下的中长期慢性移植器官排斥发生率，以及大剂量长期非特异免疫抑制药物引发的严重合并症，最终诱导受体对异体移植器官的免疫耐受，仍然是世界范围异体器官移植界所面临的严重挑战。虽然近三十年来对异体移植免疫耐受的机理和实验诱导方案的研究取的了很大进展，然而目前被证实的，能够在多种不同种系动物模型，特别是在人的临床肾移植的受体中，达到免疫耐受的仅有方法，是应用供体骨髓细胞移植，诱导和维持长期的稳定的嵌合体(MC)。

现行的成功的治疗方案需要在移植前对受体使用大剂量放射治疗合并多种细胞毒性药物和免疫抑制药物的诱导，达到对受体进行骨髓肃清（myeloablation）的效果。但是对大剂量放疗和细胞毒性免疫抑制药物安全性的顾虑，严重阻碍了这一方案在器官移植的临床应用。如何深入探索和掌握嵌合体介导的移植免疫耐受的机理，发展一种能够在不对受体进行骨髓肃清（myeloablation）的条件下，成功诱导稳定嵌合体状态，以达到异体移植免疫耐受的目的，将是具有重大科学研究和临床应用意义的重要课题。近期对干细胞的研究提供显著证据表明，骨髓造血干细胞（HSC）的维持和自身更新取决于其存在的微环境，称之为诱导造血微环境或干细胞涅池（niche）。至今，大多数的研究最关注的是骨髓干细胞niche。这种特殊的在骨髓内的niche,代表了一种和谐的微环境，在这个生理的微环境内HSC和骨髓间充质干细胞相互依存，共同维持这种平衡。骨髓HSC微环境对HSC功能的关键作用已得到充分的认识。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种SCF-Fc融合蛋白。

本发明的SCF-Fc融合蛋白，所说的SCF包括胞外区全部序列，所说的Fc片段包括铰链区、CH2区和CH3区，所说的SCF与Fc序列之间为直接融合或通过连接序列融合，所说的SCF选自人、小鼠、大鼠或其他动物的SCF，所说的Fc片段选自人或动物的IgG、IgM、IgD、IgA或者它们的亚型，所说Fc片段选自天然型Fc或与受体和/或补体结合相关的氨基酸改变的突变型Fc。

所说的SCF选自人、小鼠或大鼠SCF，其中人SCF具有如SEQ ID.1 所示的氨基酸序列和如SEQ ID.2所示的核苷酸序列，小鼠SCF具有如SEQ ID.3所示的氨基酸序列和如SEQ ID.4所示的核苷酸序列，大鼠SCF具有如SEQ ID.5所示的氨基酸序列和如SEQ ID.6所示的核苷酸序列。

所说的Fc片段选自人或动物的IgG、IgM、IgD、IgA或者它们的亚型。

所说的Fc片段选自人IgG1、小鼠IgG2a或大鼠IgG2a，其中人IgG1的氨基酸序列如SEQ ID.7 所示，小鼠IgG2a的氨基酸序列如SEQ ID.8 所示、大鼠IgG2a的氨基酸序列如SEQ ID.9 所示。

所说的突变型Fc片段选自突变型人IgG1或小鼠IgG2a，其中突变型人IgG1的氨基酸序列如SEQ ID.10 所示，突变型小鼠IgG2a的氨基酸序列如SEQ ID.11 所示。

本发明还包括一种SCF-Fc融合蛋白编码DNA序列的载体，所说的载体为真核载体。

所说的真核载体为哺乳动物细胞表达载体。由于原核表达体系所表达的产物，缺乏糖基化修饰功能，蛋白功能不能保证，因此在此发明中，优选哺乳动物细胞表达载体，如pRc-CMV( Invitrogen公司)。

本发明还包括一种SCF-Fc融合蛋白编码DNA序列的载体的宿主细胞，所说的宿主细胞选自真核细胞或原核细胞。

所说的宿主细胞选自CHO细胞。

本发明的SCF-Fc融合蛋白的用途，包括用于建立溶细胞性SCF-Fc融合蛋白，一过性的清除cKit表面受体阳性的造血干细胞，激活骨髓造血干细胞微环境－Niche,促进造血干细胞归宿至干细胞微环境，诱导和增强混合嵌合体的形成，以诱导移植免疫耐受，还可以应用于对血液系统遗传性细胞异常疾病的干细胞治疗；用于建立非溶性的SCF-Fc融合蛋白可以应用于SCF的替代疗法，以及用于标记和分离骨髓造血干细胞。

本发明的所用术语“Fc”指免疫球蛋白重链恒定区的羧基端或其中的一部分，例如免疫球蛋白Fc片段可包括重链CH1、CH2、CH3、CH4的两个或更多结构域与免疫球蛋白铰链区的组合。已知免疫球蛋白有很多类别，如IgA、IgD、IgE、IgM及IgG（包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)，从特定免疫球蛋白类别和亚类中选择特定的免疫球蛋白Fc区，是在本领域技术人员所掌握的范围之内。免疫球蛋白是人类血液中最丰富的蛋白质，它们的半衰期可高达21天。已经报道和公布的专利将免疫球蛋白的Fc区域与其他蛋白质（如各种细胞因子和可溶性受体）的区域融合，创制出融合蛋白。这类融合蛋白是通过IgG Fc铰链区中的Cys残基连接的同源二聚体蛋白，结构类似于IgG分子但无CH1区域和轻链。这类融合蛋白维持有原功能蛋白质的生物活性，同时大大延长了体内半衰期(参见,如Nature,337:525-531.1989;如Trends Biotechnol.,14:52-60,1996;如美国专利No.5349053与6224867及中国专利200510084233.5）。在该方面几个优选的实施方案中，免疫球蛋白Fc片段分别选自人IgG1，小鼠IgG2a，大鼠IgG2a，包括其铰链区、CH2、CH3区。实验证明，本发明的SCF-Fc融合蛋白具有与重组SCF相比，半衰期明显延长。

SCF与免疫球蛋白Fc融合，可选择多种连接序列，例如可以选择一系列的甘氨酸和丝氨酸的组合，长度约为20个氨基酸残基（参见美国专利NO 00/13827），也可选择SCF与免疫球蛋白Fc的铰链区直接融合。在该方面的另一个优选实施方式中，SCF与Fc铰链区通过Gly-Asp连接序列融合。

免疫球蛋白的Fc区域中消灭病原体的免疫防御中起重要作用。IgG的效应功能由Fc介导通过两种主要机制，即（1）与细胞表面Fc受体的结合，吞噬作用或杀伤细胞通过抗体依赖性细胞毒性途径（ADCC)消化病原体；（2）与第一补体成分C1的C1q部分结果，引发依赖于补体的细胞毒性途径（CDC），从而裂解病原体。由于溶细胞性SCF-Fc融合蛋白，即SCF与天然型免疫球蛋白Fc融合蛋白，由于其天然型Fc功能区的存在，所以其具有ADCC和CDC效应。在某些应用方面，这两种效应是正向的，但在另一些应用领域，这两种效应可能是反向的。因此，本发明还通过对Fc中与受体和（或）补体结合相关的氨基酸改变，提供了SCF-Fc融合蛋白的另一种形式，非溶细胞性SCF-Fc融合蛋白，即SCF与突变型免疫球蛋白Fc融合蛋白。

附图说明

图1为干细胞生长因子扩增电泳图，其中，1：人干细胞生长因子PCR产物；2：小鼠干细胞生长因子PCR产物；3：大鼠干细胞生长因子PCR产物；M：DNA分子量标准（Marker）；

图2-1为表达纯化的干细胞生长因子与Fc融合蛋白（SDS-PAGE）还原前电泳图，其中，1：人干细胞生长因子与Fc融合蛋白（还原前）（Human SCF/Human IgG1-Fc++）；2：人干细胞生长因子与Fc变体融合蛋白（还原前）（Human SCF/Human IgG1-Fc--）；3：小鼠干细胞生长因子与Fc融合蛋白（还原前）（Mouse SCF/Mouse IgG2a-Fc++）；4：大鼠干细胞生长因子与Fc融合蛋白（还原前）（Rat SCF/Rat IgG2a-Fc++）；5：大鼠干细胞生长因子与小鼠Fc融合蛋白（还原前）（Rat SCF/Mouse IgG2a-Fc）M：蛋白分子量标准（Marker）；

图2-2为表达纯化的干细胞生长因子与Fc融合蛋白（SDS-PAGE）还原后电泳图，其中，1：人干细胞生长因子与Fc融合蛋白（还原后）（Human SCF/Human IgG1-Fc++）；2：人干细胞生长因子与Fc变体融合蛋白（还原后）（Human SCF/Human IgG1-Fc--）；3：小鼠干细胞生长因子与Fc融合蛋白（还原后）（Mouse SCF/Mouse IgG2a-Fc++）；4：大鼠干细胞生长因子与Fc融合蛋白（还原后）（Rat SCF/Rat IgG2a-Fc++）；5：大鼠干细胞生长因子与小鼠Fc融合蛋白（还原后）（Rat SCF/Mouse IgG2a-Fc）M：蛋白分子量标准（Marker）；

图3为重组干细胞生长因子半衰期的测定曲线；

图4-1为应用SCF/Fc红色荧光标记的骨髓造血干细胞；

图4-2为应用SCF/Fc（红色）与抗ckit（白灰色）双荧光标记的骨髓造血干细胞；

图5为 SCF-Fc荧光标记骨髓造血干细胞效果的流式细胞仪检测结果；

图6为应用SCF/Fc分离骨髓造血干细胞的结果图；

图7为应用溶细胞性SCF/Fc增强混合嵌合体的建立以诱导移植免疫耐受结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解，引用实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1 干细胞生长因子与Fc融合蛋白表达质粒的构建

以人-干细胞生长因子与Fc融合蛋白的基因构建为例：

以购自Thermo（Open Biosystems）公司的cDNA克隆（货号：MHS4426-99239430）为模板，扩增人SCF胞外区全序列（GenBank：BC126166.1），上游引物引入NotI位点、Kozak序列：

P1: 5' ATATGGCGGCCGCCGCCACCATGAAGAAGACACAAACTTG 3'下游引物引入BamHI位点

P2: 5'ctctgGGATCCCAGTGTAGGCTGGAGTC 3'

反应体系为50ul，其中浓度为50pM/ul引物各加0.5ul，浓度为2.5mM Each的dNTP加0.8ul，所用DNA聚合酶为江苏省弗泰生物科技有限公司生产的pfu DNA polymerase，2.5U/ul，加0.8ul。

反应条件为94℃ 30秒、54℃ 30秒、72℃ 45秒，25个循环后，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，产物大小与预期大小（591bp）一致（图3）。将得到的基因产物用江苏省弗泰生物科技有限公司生产的DNA凝胶回收试剂盒纯化后，用NotI和BamHI(Fermentas公司)酶切、回收、连接克隆至实验室保存的pRc-CMV-Fc表达载体系统。

pRc-CMV-Fc表达载体系统是经改造的带有优化的多克隆位点、信号肽序列、Fc片段系统（人、小鼠或大鼠天然型Fc，或相应突变型Fc）。

将Human SCF连接至pRc-CMV-（Human IgG1-Fc）即得溶细胞性人SCF-Fc融合蛋白的表达构建。同理，将Human SCF连接至pRc-CMV-（Mouse IgG2a-Fc）,即得溶细胞性人SCF-mFc融合蛋白的表达构建；将Human SCF连接至pRc-CMV-（突变型Human IgG1-Fc)，即得非溶细胞性Human SCF-Fc融合蛋白的表达构建。

将筛选、抽提得到的克隆质粒测序（Genscript公司），DNASTAR软件比对，与预期序列完全一致，构建即完成。

同样的方法，构建小鼠-干细胞生长因子与Fc融合蛋白，大鼠-干细胞生长因子与Fc融合蛋白，所用模板及引物说明如下：

小鼠-干细胞生长因子与Fc融合蛋白的基因构建：

模板购自Thermo（Open Biosystems）公司的cDNA克隆（货号：MMM1013-65096），引物P1：5' atatgGCGGCCGCTGGATCGCAGCGCTG 3'，

引物P2：5' CAGAGGGATCCTGTAGGCCCGAGTCTTCAG 3'

PCR产物大小为：676bp（图1）

大鼠-干细胞生长因子与Fc融合蛋白的基因构建：

使用全基因合成的方法，方法参考文献进行：A modified method for PCR-directed gene synthesis from large number of overlapping oligodeoxyribonucleotides.

Cherry,J；Nieuwenhuijsen,BW；Kaftan,EJ；Kennedy,JD；Chanda,PK

Journal of Biochemical and Biophysical Methods.200870(6)

PCR产物大小为：654bp（图1）

实施例2. 干细胞生长因子与Fc融合蛋白的生产

1、稳定的高表达细胞株的筛选

用冷的1×PBS将对数生长期的CHO细胞稀释至8 x10⁶/ml后，

取0.4ml悬液，加入电击杯，再加入15ug线性化表达质粒，混合后冰上静置10-15min。设定电穿孔仪电压800V，电容25uF，点穿后电击杯在冰上静置10min，用移液管转移细胞至含5%1× FBS培养液的10cm 培养皿中培养。两天后待细胞生长状态恢复，用400 ug/ml的G418对阴性细胞进行筛选。观察细胞状态，每4天换液一次，培养两周后，采用极限稀释法，用96孔培养板进行高表达细胞株筛选。最终通过ELISA检测和比较筛选，得到稳定的高表达细胞株。

2、高表达细胞株的培养

根据需要，按每毫升培养液加5mg微载体计算，称取微载体，并在磷酸缓冲液（PBS）的液体模式下高压灭菌。将灭菌好的微载体移入搅瓶，待微载体沉淀后，弃去PBS，加入培养液。

取出细胞培养皿中的处于对数生长期的SCF-Fc高表达细胞，去上清液，加适量胰蛋白酶37℃消化2-3min(显微镜下可见细胞漂浮并分散)后，加适量含血清的培养基终止消化并细胞计数。根据细胞计数结果和培养体积，将细胞和培养液混合并使细胞分散均匀，得到细胞悬液，悬液细胞密度为1-5x10⁵/ml。

待搅瓶中的微载体沉淀，弃去培养液，并将细胞悬液加入搅瓶。将搅瓶放入二氧化碳培养箱（5%二氧化碳、37℃），调整搅瓶转速至50-70rpm ，进行连续悬浮培养。

3、SCF-Fc融合蛋白的纯化

发酵培养物经高速冷冻离心后收集培养上清，培养上清经离子截留分子量为10KD Pellicon（购自Millipore公司）超浓缩15倍，然后用Protein A亲合层析柱（购自GE公司）分离提纯，提纯的蛋白经1×PBS的透析最终得到SCF-FC融合蛋白。（图2-1，图2-2）

实施例3. 干细胞生长因子与Fc融合蛋白半衰期的测定

检测原理和方法：为检测融合蛋白的血清半衰期特殊设计了一种酶联免疫检测方法（ELISA），使用鼠抗人SCF单克隆抗体作为捕获抗体，生物素标记的鼠抗人IgG1单克隆抗体作为检测抗体，这种ELISA是特异性的针对人SCF-Fc融合蛋白中的SCF和IgG1，不会产生假阳性反应，可以对血清中的SCF-Fc浓度进行定量的分析，从而测出SCF-Fc的循环半衰期。

分别对4只10周大的C57BL/6 小鼠静脉注射0.1mg人SCF-Fc融合蛋白，在注射后的5分钟、1小时、5小时、8小时、24小时、48小时、72小时分别进行100ml眼窝取血，并进行上述ELISA方法检测。SCF-Fc融合蛋白血清半衰期达到32小时。（图3）

实施例4. 应用SCF-Fc荧光标记骨髓造血干细胞

先将Rat-SCF-mFc融合蛋白做生物素标记。用无水DMSO配制10mg/ml生物素N-羟基丁二酰亚胺活化酯溶液（SIGMA Cat# B-2642，生物素终浓度22mM）。用磷酸盐缓冲液（1XPBS）配制浓度为0.5mg/ml的Rat-SCF-mFc融合蛋白溶液。取3ul生物素酯溶液加入300ul Rat-SCF-mFc融合蛋白溶液中，室温放置1h。加入3.3ul 0.5M Tris（pH=8），室温放置1h终止反应。1X PBS过夜透析。

应用生物素标记的Rat-SCF-mFc融合蛋白（Rat-SCF-mFc-Biotin）进行红色荧光标记骨髓造血干细胞。将LEW大鼠的骨髓细胞进行红细胞裂解液溶解（碧云天生物技术公司，货号C3702），将细胞涂片、1%福尔马林固定，然后用Rat-SCF-mFc-Biotin进行4度、30分钟染色，再用Avidin-TRITC（购自博士德生物公司，货号BA1093）染色，应用荧光显微镜进行观察，结果如图4-1。

应用Rat-SCF-mFc-Biotin和抗cKit-FITC双荧光标记骨髓造血干细胞。将LEW大鼠的骨髓细胞进行红细胞裂解液溶解，将细胞涂片、1%福尔马林固定，用Rat-SCF/mFc-Biotin进行4度、30分钟染色，再用Avidin-TRITC染色，然后再用抗cKit-FITC进行染色，应用荧光显微镜进行观察，结果如图4-2。

SCF-Fc荧光标记骨髓造血干细胞效果的测定。将LEW大鼠的骨髓细胞进行红细胞裂解液溶解，用Rat-SCF-mFc-Biotin进行4度、30分钟染色。用Avidin-TRITC染色，然后再用抗cKit-FITC进行4度、30分钟染色。经流式细胞仪检测，结果如图5，93% SCF/Fc标记阳性骨髓细胞是cKit标记阳性。

实施例5. 应用SCF-Fc分离骨髓造血干细胞

将LEW大鼠的骨髓细胞进行红细胞裂解液溶解，应用Rat-SCF-mFc-Biotin与Avidin-磁珠混合，4度、30分钟后，加入骨髓细胞4度、30分钟处理。过磁珠后，洗脱磁珠上的细胞。洗脱的细胞加入抗cKit-FITC，4度30分钟处理后，用流式细胞仪分析。结果如图6，应用SCF-Fc分离的骨髓造血细胞77.4%为cKit阳性的造血干细胞。

实施例6. 应用SCF-Fc增强混合嵌合体的建立以诱导移植免疫耐受

以BN大鼠为供体，进行原肢异体移植，以LEW大鼠为受体接受环孢素(Cyclosporin)和雷帕霉素(Rapamycin) 进行ALS，21天治疗，一组受体（n=2）接受了溶细胞性Rat-SCF-Fc融合蛋白（0.3mg）腹腔注射，术后用抗BN大鼠MHC抗体检测嵌合体的进行，结果显示经SCF-Fc融合蛋白治疗的大鼠嵌合体不断升高。其中一只受体术后11周可达97.5%。另一只可达22.4%，而对照组只维持在2-4%之间。（如图7）

<110> OrganizationName : 江苏省弗泰生物科技有限公司

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<120> Title : SCF-Fc融合蛋白

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aagcccttca tgctgccccc tgtggccgcc agctccctga ggaacgactc cagcagcagc 600

aacaggaagg ccgccaag 618

<212> Type : DNA

<211> Length : 618

SequenceName : 6

SequenceDescription :

Sequence

--------

<213> OrganismName :

<400> PreSequenceString :

KSADKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCMVVDVS HEDPEVKFNW 60

YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS 120

KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV 180

LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK 230

<212> Type : PRT

<211> Length : 230

SequenceName : 7

SequenceDescription :

Sequence

--------

<213> OrganismName :

<400> PreSequenceString :

RGPTIKPCPP CKCPAPNLLG GPSVFIFPPK IKDVLMISLS PIVTCVVVDV SEDDPDVQIS 60

WFVNNVEVHT AQTQTHREDY NSTLRVVSAL PIQHQDWMSG KEFKCKVNNK DLPAPIERTI 120

SKPKGSVRAP QVYVLPPPEE EMTKKQVTLT CMVTDFMPED IYVEWTNNGK TELNYKNTEP 180

VLDSDGSYFM YSKLRVEKKN WVERNSYSCS VVHEGLHNHH TTKSFSRTPG K 231

<212> Type : PRT

<211> Length : 231

SequenceName : 8

SequenceDescription :

Sequence

--------

<213> OrganismName :

<400> PreSequenceString :

KKIVPRECNP CGCTGSEVSS VFIFPPKTKD VLTITLTPKV TCVVVDISQN DPEVRFSWFI 60

DDVEVHTAQT HAPEKQSNST LRSVSELPIV HRDWLNGKTF KCKVNSGAFP APIEKSISKP 120

EGTPRGPQVY TMAPPKEEMT QSQVSITCMV KGFYPPDIYT EWKMNGQPQE NYKNTPPTMD 180

TDGSYFLYSK LNVKKETWQQ GNTFTCSVLH EGLHNHHTEK SLSHSPGK 228

<212> Type : PRT

<211> Length : 228

SequenceName : 9

SequenceDescription :

Sequence

--------

<213> OrganismName :

<400> PreSequenceString :

KSADKTHTCP PCPAPELEGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW 60

YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK AYACAVSNKA LPAPIEKTIS 120

KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV 180

LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK 230

<212> Type : PRT

<211> Length : 230

SequenceName : 10

SequenceDescription :

Sequence

--------

<213> OrganismName :

<400> PreSequenceString :

RGPTIKPCPP CKCPAPNLEG GPSVFIFPPK IKDVLMISLS PIVTCVVVDV SEDDPDVQIS 60

WFVNNVEVHT AQTQTHREDY NSTLRVVSAL PIQHQDWMSG KAFACAVNNK DLPAPIERTI 120

SKPKGSVRAP QVYVLPPPEE EMTKKQVTLT CMVTDFMPED IYVEWTNNGK TELNYKNTEP 180

VLDSDGSYFM YSKLRVEKKN WVERNSYSCS VVHEGLHNHH TTKSFSRTPG K 231

<212> Type : PRT

<211> Length : 231

SequenceName : 11

SequenceDescription :

Claims

1.SCF-Fc融合蛋白的制备方法，所说的SCF包括胞外区全部序列，所说的Fc片段包括铰链区、CH2区和CH3区，所说的SCF与Fc序列之间为直接融合或通过连接序列融合，所说的SCF选自人、小鼠或大鼠的SCF，所说的Fc片段选自人、小鼠或大鼠的IgG、IgM、IgD、IgA或者它们的亚型，所说Fc片段选自天然型Fc或与受体和/或补体结合相关的氨基酸改变的突变型Fc，其中，

人SCF的氨基酸序列如SEQ ID.1 所示，核苷酸序列如SEQ ID.2所示，

小鼠SCF的氨基酸序列如SEQ ID.3所示，核苷酸序列如SEQ ID.4所示，

大鼠SCF的氨基酸序列如SEQ ID.5所示，核苷酸序列如SEQ ID.6所示，

所说的天然型Fc片段选自人IgG1、小鼠IgG2a或大鼠IgG2a，其中人IgG1的氨基酸序列如SEQ ID.7 所示，小鼠IgG2a的氨基酸序列如SEQ ID.8 所示，大鼠IgG2a的氨基酸序列如SEQ ID.9 所示，

所说的突变型Fc片段选自突变型人IgG1或小鼠IgG2a，其中突变型人IgG1的氨基酸序列如SEQ ID.10 所示，突变型小鼠IgG2a的氨基酸序列如SEQ ID.11 所示，

其特征在于，所述的SCF-Fc融合蛋白采用如下方法制备而成：

步骤一：干细胞生长因子与Fc融合蛋白表达质粒的构建

人-干细胞生长因子的基因构建方法如下：以购自Thermo Open Biosystems公司的cDNA克隆为模板，cDNA克隆的货号为MHS4426-99239430，扩增人SCF胞外区全序列，GenBank序列号为BC126166.1，上游引物引入NotI位点、Kozak序列：P1: 5' ATATGGCGGCCGCCGCCACCATGAAGAAGACACAAACTTG 3'，

下游引物引入BamHI位点，P2: 5'ctctgGGATCCCAGTGTAGGCTGGAGTC 3'；

反应体系为50μl，其中浓度为50pM/μl引物各加0.5μl，浓度为2.5mM Each的dNTP加0.8μl，所用DNA聚合酶为江苏省弗泰生物科技有限公司生产的pfu DNA polymerase，2.5U/μl，加0.8μl；反应条件为94℃ 30秒、54℃ 30秒、72℃ 45秒，25个循环后；将得到的基因产物用江苏省弗泰生物科技有限公司生产的DNA凝胶回收试剂盒纯化后，用NotI和BamHI酶切、回收、连接克隆至实验室保存的pRc-CMV-Fc表达载体系统；pRc-CMV-Fc表达载体系统是经改造的带有优化的多克隆位点、信号肽序列、Fc片段系统，Fc片段系统为人、小鼠或大鼠天然型Fc，或相应突变型Fc，将Human SCF连接至pRc-CMV- Fc，Fc选自Human IgG1，即得溶细胞性人SCF-Fc融合蛋白的表达质粒，同理，将Human SCF连接至pRc-CMV-Fc，Fc选自Mouse IgG2a，即得溶细胞性人SCF-mFc融合蛋白的表达质粒；将Human SCF连接至pRc-CMV-Fc，Fc选自突变型Human IgG1，即得非溶细胞性Human SCF-Fc融合蛋白的表达质粒；

所述的小鼠-干细胞生长因子与Fc融合蛋白表达质粒和大鼠-干细胞生长因子与Fc融合蛋白表达质粒，采用同样的方法构建；小鼠-干细胞生长因子的基因构建所用模板及引物说明如下：

模板购自Thermo Open Biosystems 公司的cDNA克隆，cDNA克隆的货号为MMM1013-65096，

引物P1：5' atatgGCGGCCGCTGGATCGCAGCGCTG 3'，

引物P2：5' CAGAGGGATCCTGTAGGCCCGAGTCTTCAG 3'

大鼠-干细胞生长因子与Fc融合蛋白的基因构建：使用全基因合成的方法；

步骤二：干细胞生长因子与Fc融合蛋白的生产

包括如下步骤：

1）稳定的高表达细胞株的筛选

用冷的1×PBS将对数生长期的CHO细胞稀释至8 ×10⁶/ml后，取0.4ml悬液，加入电击杯，再加入15μg线性化表达质粒，混合后冰上静置10-15min，设定电穿孔仪电压800V，电容25μF，点穿后电击杯在冰上静置10min，用移液管转移细胞至含5%1× FBS培养液的10cm 培养皿中培养，两天后待细胞生长状态恢复，用400 μg/ml的G418对阴性细胞进行筛选，观察细胞状态，每4天换液一次，培养两周后，采用极限稀释法，用96孔培养板进行高表达细胞株筛选，最终通过ELISA检测和比较筛选，得到稳定的高表达细胞株；

2）高表达细胞株的培养

根据需要，按每毫升培养液加5mg微载体计算，称取微载体，并在磷酸缓冲液PBS的液体模式下高压灭菌，将灭菌好的微载体移入搅瓶，待微载体沉淀后，弃去PBS，加入培养液，取出细胞培养皿中的处于对数生长期的SCF-Fc高表达细胞，去上清液，加适量胰蛋白酶37℃消化2-3min后，消化程度为显微镜下可见细胞漂浮并分散，加适量含血清的培养基终止消化并细胞计数，根据细胞计数结果和培养体积，将细胞和培养液混合并使细胞分散均匀，得到细胞悬液，悬液细胞密度为1-5×10⁵/ml；待搅瓶中的微载体沉淀，弃去培养液，并将细胞悬液加入搅瓶，将搅瓶放入二氧化碳培养箱，二氧化碳培养箱内有5%二氧化碳，温度为37℃，调整搅瓶转速至50-70rpm ，进行连续悬浮培养；

3）SCF-Fc融合蛋白的纯化

发酵培养物经高速冷冻离心后收集培养上清，培养上清经离子截留分子量为10KD Pellicon，Pellicon购自Millipore公司，超浓缩15倍，然后用购自GE公司的Protein A亲合层析柱分离提纯，提纯的蛋白经1×PBS的透析最终得到SCF-Fc融合蛋白。