CN103387616A

CN103387616A - EPO变体与Fc融合蛋白

Info

Publication number: CN103387616A
Application number: CN2012101434032A
Authority: CN
Inventors: 郑心校; 田燕; 卞春东; 查长春
Original assignee: JIANGSU FUTAI BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: JIANGSU FUTAI BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2012-05-10
Filing date: 2012-05-10
Publication date: 2013-11-13

Abstract

本发明提供了一种EPO变体与Fc融合蛋白，所说的EPO变体为与造血功能相关氨基酸定向突变使得造血活性消失的EPO胞外区全序列，所说的Fc片段包括铰链区、CH2区和CH3区，所说的EPO变体与Fc序列之间为直接融合或通过连接序列融合，所说的EPO胞外区全序列选自人或其他动物的EPO，所说的Fc片段选自人或动物的IgG、IgM、IgD、IgA或者它们的亚型，所说Fc片段选自天然型Fc或与受体和/或补体结合相关的氨基酸改变的突变型Fc。本发明的EPO变体与Fc融合蛋白的用途，包括促进神经干细胞再生，制备预防和治疗神经细胞损伤的药物中的应用。本发明的EPO变体-Fc融合蛋白造血活性基本消失，而具有其组织保护活性，即其神经细胞再生活性，同时拥有类似用抗体的长效体内应用半衰期。

Description

EPO变体与Fc融合蛋白

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白，具体地说，涉及一种EPO变体与Fc融合蛋白，属于基因工程技术领域。

背景技术

促红细胞生成素（EPO)是一种公知的糖蛋白，最初因其对骨髓的激素性影响和参与成熟血红细胞的生长与发育而被鉴定。除这种造血活性之外，最近已发现EPO还在许多组织中作为有效的、局部生成的改善代谢应激的分子而起作用。EPO的组织保护活性通过与促红细胞生成素受体的相互作用而介导。例如，在脑部，EPO和它的受体与局部产生，受到代谢应激物的调控，并提供神经保护和抗炎的功能（Doggrell，SA.(2004)Expert Opin Investig Drugs;13(11):1517-9)。在骨髓中，EPO提供的有益效果包括抑制神经元，少突胶质细胞和内皮细胞的凋亡和坏死，减少空化，降低脂质过氧化，动员内皮祖细胞，促进血管发生和恢复血管的自我调节（Gorio，A.等（2002）Proc Natl Acad Sci USA;99(14):9450-5；Leist M.(2004)Science;305（5681）：239-42）。

然而对于应用EPO提供神经保护和防止组织损伤等功能来说，造血活性通常并不需要，并且如果施用大量的EPO来治疗或缓解神经细胞损伤时，造血活性是有害的。氨甲酰化的促红细胞生成素（CEPO）也显示出表现出组织保护效应，但是没有红细胞生成效应（Leist 等（2004） Science 305：239-242和WO 2005/025606 A1），但CEPO需要需要使用化学方法对EPO进行氨甲酰化，应用和效果都受到一定的限制。EPO变体重组蛋白， 1998年Qiu H, Belanger A, Yoon HW, Bunn HF等人做了报道，然后由于EPO分子量小，EPO变体重组蛋白体内半衰期非常短，仅为4到11小时，对应病人而言，这就需要在短时间内反复多次接受多次注射。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种EPO变体与Fc融合蛋白。

本发明的EPO变体与Fc融合蛋白，所说的EPO变体为与造血功能相关氨基酸定向突变使得造血活性消失的EPO胞外区全序列，所说的Fc片段包括铰链区、CH2区和CH3区，所说的EPO变体与Fc序列之间为直接融合或通过连接序列融合，所说的EPO变体选自人或其他动物的EPO，所说的Fc片段选自人或动物的IgG、IgM、IgD、IgA或者它们的亚型，所说Fc片段选自天然型Fc或与受体和/或补体结合相关的氨基酸改变的突变型Fc。

所说的EPO变体的氨基酸序列如SEQ ID.1 所示，DNA序列如SEQ ID.2 所示。

所说的Fc片段选自人IgG1、小鼠IgG2a或大鼠IgG2a，其中人IgG1的氨基酸序列如SEQ ID.3所示，小鼠IgG2a的氨基酸序列如SEQ ID.4 所示、大鼠IgG2a的氨基酸序列如SEQ ID.5 所示。

所说的突变型Fc片段选自突变型人IgG1或小鼠IgG2a，其中突变型人IgG1的氨基酸序列如SEQ ID.6 所示，突变型小鼠IgG2a的氨基酸序列如SEQ ID.7 所示。

本发明还包括一种EPO变体与Fc融合蛋白编码DNA序列的载体，所说的载体为真核载体。

所说的真核载体为哺乳动物细胞表达载体。由于原核表达体系所表达的产物，缺乏糖基化修饰功能，蛋白功能不能保证，因此在此发明中，优选哺乳动物细胞表达载体，如pRc-CMV( Invitrogen公司)。

本发明还包括一种EPO变体与Fc融合蛋白编码DNA序列的载体的宿主细胞，所说的宿主细胞选自真核细胞或原核细胞。

所说的宿主细胞选自CHO细胞。

本发明的EPO变体与Fc融合蛋白的用途，包括促进神经干细胞再生，制备预防和治疗神经细胞损伤的药物中的应用。

本发明的所用术语“Fc”指免疫球蛋白重链恒定区的羧基端或其中的一部分，例如免疫球蛋白Fc片段可包括重链CH1、CH2、CH3、CH4的两个或更多结构域与免疫球蛋白铰链区的组合。已知免疫球蛋白有很多类别，如IgA、IgD、IgE、IgM及IgG（包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)，从特定免疫球蛋白类别和亚类中选择特定的免疫球蛋白Fc区，是在本领域技术人员所掌握的范围之内。免疫球蛋白是人类血液中最丰富的蛋白质，它们的半衰期可高达21天。已经报道和公布的专利将免疫球蛋白的Fc区域与其他蛋白质（如各种细胞因子和可溶性受体）的区域融合，创制出融合蛋白。这类融合蛋白是通过IgG Fc铰链区中的Cys残基连接的同源二聚体蛋白，结构类似于IgG分子但无CH1区域和轻链。这类融合蛋白维持有原功能蛋白质的生物活性，同时大大延长了体内半衰期(参见,如Nature,337:525-531.1989;如Trends Biotechnol.,14:52-60,1996;如美国专利No.5349053与6224867及中国专利200510084233.5）。在该方面几个优选的实施方案中，免疫球蛋白Fc片段分别选自人IgG1，小鼠IgG2a，大鼠IgG2a，包括其铰链区、CH2、CH3区。实验证明，本发明的EPO变体-Fc融合蛋白具有与重组EPO变体相比，半衰期明显延长。

EPO变体与免疫球蛋白Fc融合，可选择多种连接序列，例如可以选择一系列的甘氨酸和丝氨酸的组合，长度约为20个氨基酸残基（参见美国专利NO 00/13827），也可选择EPO变体与免疫球蛋白Fc的铰链区直接融合。在该方面的另一个优选实施方式中，EPO变体与Fc铰链区通过Gly-Asp连接序列融合。

免疫球蛋白的Fc区域中消灭病原体的免疫防御中起重要作用。IgG的效应功能由Fc介导通过两种主要机制，即（1）与细胞表面Fc受体的结合，吞噬作用或杀伤细胞通过抗体依赖性细胞毒性途径（ADCC)消化病原体；（2）与第一补体成分C1的C1q部分结果，引发依赖于补体的细胞毒性途径（CDC），从而裂解病原体。由于溶细胞性EPO变体-Fc融合蛋白，即EPO变体与天然型免疫球蛋白Fc融合蛋白，由于其天然型Fc功能区的存在，所以其具有ADCC和CDC效应。在某些应用方面，这两种效应是正向的，但在另一些应用领域，这两种效应可能是反向的。因此，本发明还通过对Fc中与受体和（或）补体结合相关的氨基酸改变，提供了EPO变体与Fc融合蛋白的另一种形式，非溶细胞性EPO变体与Fc融合蛋白，即EPO变体与突变型免疫球蛋白Fc融合蛋白。

本发明的EPO变体-Fc融合蛋白造血活性基本消失，而具有其组织保护活性，即其神经细胞再生活性，同时拥有类似用抗体的长效体内应用半衰期。

附图说明

图1 为EPO变体基因扩增电泳图，其中，1：EPO变体基因扩增产物； M：DNA分子量标准（Marker）；

图2-1 为表达纯化还原前的EPO变体与Fc融合蛋白（SDS-PAGE）电泳图；其中，1：人EPO变体与Fc融合蛋白（还原前）；M：蛋白分子量标准（Marker）

图2-2 为表达纯化还原后的EPO变体与Fc融合蛋白（SDS-PAGE）电泳图；其中，1：人EPO变体与Fc融合蛋白（还原后）；M：蛋白分子量标准（Marker）。

具体实施方式

实施例1 EPO变体与Fc融合蛋白表达质粒的构建

从正常人的外周血中分离粘附的单核细胞，加入LPS刺激4小时后，异硫氰酸胍一步法抽提总RNA，MMLV逆转录酶合成cDNA第一条链，再以其为模板扩增促红细胞生成素变体胞外区全部序列（GeneBank：NM_000799.2），并利用中间引物做相应氨基酸突变，产生的两个片段通过Over-Lap PCR的方法进行拼接，模板均为cDNA。用于扩增全长胞外区序列的上、下游引物分别引NotI和BamHI位点。所用引物序列如下：

上游引物: P1:5' ATATGGCGCCGCCCCGGCCAGGCGCGGAG3'

下游引物: P2:5' ATATGGGATCCCTGTCCCCTGTCCTGCA 3'

突变上游引物: P3:5' AGCTGTCCTGGAGGGCCAGGCCCTGTTGGTC 3'

突变下游引物: P4:5' GGGCCTGGCCCCGCAGGACAGCTTCCGACAG 3'

反应体系为50ul，其中浓度为50pM/ul引物各加0.5ul，浓度为2.5mM Each的dNTP加0.8ul，所用DNA聚合酶为江苏省弗泰生物科技有限公司生产的pfu DNA polymerase，2.5U/ul，加0.8ul。

反应条件为94℃ 30秒、54℃ 30秒、72℃ 45秒，25个循环后，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，产物大小与预期大小一致，再将两个片段通过OVER-LAP PCR扩增得到的基因产物（图1），用江苏省弗泰生物科技有限公司生产的DNA凝胶回收试剂盒纯化后，用NotI和BamHI(Fermentas公司)酶切、回收、连接克隆至实验室保存的pRc-CMV-Fc表达载体系统。

pRc-CMV-Fc表达载体系统是经改造的带有优化的多克隆位点、信号肽序列、Fc片段系统（人、小鼠或大鼠天然型Fc，或相应突变型Fc）。

将筛选、抽提得到的克隆质粒测序（Genscript公司），DNASTAR软件比对，与预期序列完全一致，构建即完成。

实施例2 EPO变体与Fc融合蛋白的生产

1、稳定的高表达细胞株的筛选

用冷的1×PBS将对数生长期的CHO细胞稀释至3 x10⁶/ml后，取0.1ml悬

液，加入2mm电击杯(Bio-Rad公司)，再加入3ug线性化表达质粒，混合后冰上静置10-15min。设定电穿孔仪电压300V，电容25uF，点穿后电击杯在冰上静置10min，用移液管转移细胞至含5%1× FBS培养液的10cm 培养皿中培养。两天后待细胞生长状态恢复，用400 ug/ml的G418对阴性细胞进行筛选。观察细胞状态，每4天换液一次，培养两周后，采用极限稀释法，用96孔培养板进行高表达细胞株筛选。最终通过ELISA检测和比较筛选，得到稳定的高表达细胞株。

2、高表达细胞株的培养

根据需要，按每毫升培养液加5mg微载体计算，称取微载体，并在磷酸缓冲液（PBS）的液体模式下高压灭菌。将灭菌好的微载体移入搅瓶，待微载体沉淀后，弃去PBS，加入培养液。

取出细胞培养皿中的处于对数生长期的EPO变体与Fc融合蛋白高表达细胞，去上清液，加适量胰蛋白酶37℃消化2-3min(显微镜下可见细胞漂浮并分散)后，加适量含血清的培养基终止消化并细胞计数。根据细胞计数结果和培养体积，将细胞和培养液混合并使细胞分散均匀，得到细胞悬液，悬液细胞密度为1-5x10⁵/ml。

待搅瓶中的微载体沉淀，弃去培养液，并将细胞悬液加入搅瓶。将搅瓶放入二氧化碳培养箱（5%二氧化碳、37℃），调整搅瓶转速至50-70rpm ，进行连续悬浮培养。

3、EPO变体与Fc融合蛋白的纯化

发酵培养物经高速冷冻离心后收集培养上清，培养上清经离子截留分子量为10KD Pellicon（购自Millipore公司）超浓缩，然后用Protein A亲合层析柱（购自GE公司）分离提纯，提纯的蛋白经1×PBS的透析最终得到EPO变体与Fc融合蛋白。（图2-1、图2-1）

Organization Applicant

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<110> OrganizationName : 江苏省弗泰生物科技有限公司

Application Project

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<120> Title : EPO变体与Fc融合蛋白

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aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacga cgggctgtgc tgaacactgc 180

agcttgaatg agaatatcac tgtcccagac accaaagtta atttctatgc ctggaagagg 240

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gtcctggagg gccaggccct gttggtcaac tcttcccagc cgtgggagcc cctgcagctg 360

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SequenceName : 7

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Claims

1.EPO变体与Fc融合蛋白，其特征在于，所说的EPO变体为与造血功能相关氨基酸定向突变使得造血活性消失的EPO胞外区全序列，所说的Fc片段包括铰链区、CH2区和CH3区，所说的EPO变体与Fc序列之间为直接融合或通过连接序列融合，所说的EPO胞外区全序列选自人或其他动物的EPO，所说的Fc片段选自人或动物的IgG、IgM、IgD、IgA或者它们的亚型，所说Fc片段选自天然型Fc或与受体和/或补体结合相关的氨基酸改变的突变型Fc。

2.根据权利要求1所述的EPO变体与Fc融合蛋白，其特征在于，所说的EPO变体的氨基酸序列如SEQ ID.1 所示，DNA序列如SEQ ID.2 所示。

3.根据权利要求1所述的EPO变体与Fc融合蛋白，其特征在于，所说的Fc片段选自人IgG1、小鼠IgG2a或大鼠IgG2a，其中人IgG1的氨基酸序列如SEQ ID.3 所示，小鼠IgG2a的氨基酸序列如SEQ ID.4所示、大鼠IgG2a的氨基酸序列如SEQ ID.5 所示。

4.根据权利要求1所述的EPO变体与Fc融合蛋白，其特征在于，所说的突变型Fc片段选自突变型人IgG1或小鼠IgG2a，其中突变型人IgG1的氨基酸序列如SEQ ID.6 所示，突变型小鼠IgG2a的氨基酸序列如SEQ ID.7 所示。

5.一种包含权利要求1-4中任意一种EPO变体与Fc融合蛋白编码DNA序列的载体，其特征在于，所说的载体为真核载体。

6.根据权利要求5所述的载体，其特征在于，所说的真核载体为哺乳动物细胞表达载体。

7.一种包含权利要求1-4中任意一种EPO变体与Fc融合蛋白编码DNA序列的载体的宿主细胞，其特征在于，所说的宿主细胞选自真核细胞或原核细胞。

8.根据权利要求7所述的EPO变体与Fc融合蛋白，其特征在于，所说的宿主细胞选自CHO细胞。

9.如权利要求1-4中任意一种所述的EPO变体与Fc融合蛋白的用途，包括促进神经干细胞再生，制备预防和治疗神经细胞损伤的药物中的应用。