JP2022551463A - ヒトインターロイキン１０及びＦｃ断片を含む融合タンパク質及びその医療用途 - Google Patents
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Abstract
融合タンパク質及びその医療用途を提供し、前記融合タンパク質は、接続ペプチドを介してヒトインターロイキン１０(ＩＬ－１０)を免疫グロブリンＩｇＧのＦｃ断片と融合させることによって形成される。ここで、Ｆｃ断片は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２又はヒトＩｇＧ４のＦｃ断片であり、ヒトインターロイキン１０は、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む。前記融合タンパク質は、免疫疾患及び癌の治療に用いることができ、ヒトＩＬ－１０の体内での半減期を延長し、かつその体内での安定性を高める。【選択図】図１
Description
（関連出願の相互参照）
本願は、２０１９年１０月８日に提出された中国特許出願201910947766.3の利益を要求し、該出願の内容は引用により本明細書に組み込まれる。
本願は、２０１９年１０月８日に提出された中国特許出願201910947766.3の利益を要求し、該出願の内容は引用により本明細書に組み込まれる。
本発明は、生物医薬の技術分野に関し、特にヒトインターロイキン１０及びＦｃ断片を含む融合タンパク質及びその医療用途に関する。
ヒトインターロイキン１０(ＩＬ－１０)遺伝子は、１ｑ３１－３２に位置し、全長が５.１kbであり、５つのエクソンを含む。ＩＬ－１０遺伝子は、１７８個のアミノ酸で構成され、ヒト及びマウス類のＩＬ－１０遺伝子は、７５％のアミノ酸配列が一致し、ヒトＩＬ－１０は、３５kDの二量体であり、二つの単量体が非共有結合の形式で結合され、単量体内における二つのジスルフィドによりその構造及び生物学的活性を維持する。
現在、全てのリンパ球は、いずれもＩＬ－１０を合成することができ、体内の最も重要な供給源が主に単核マクロファージ及びＴ補助細胞であり、また、樹状細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、細胞毒性Ｔ細胞、肥大細胞、好中球及び好酸性細胞もＩＬ－１０遺伝子を合成することができると分かっている。
長年にわたって、人々のＩＬ－１０に関する認識は、主に免疫抑制の面に集中し、ＩＬ－１０がエフェクターＴ細胞の増殖及び移動能力を直接抑制しかつ関連するサイトカインの生成を低下させることができ、腫瘍の免疫脱出を誘導する面で重要な役割を働くと考えられる。近年では、ＩＬ－１０は、免疫活性化作用を有し、その免疫活性化作用が腫瘍の抑制に対して非常に重要な役割を果たすことを示す研究が継続している。Ｍｕｍｍ等による研究によると、ポリエチレングリコール化されたＩＬ－１０は、移植腫瘍に対して拒絶作用を有し、かつGranzyme B及びＩＦＮ－γの発現を向上させることができる。
ＩＬ－１０は、人体に天然に存在する免疫成長因子であり、免疫システムにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞と呼ばれる特殊白血球の生存、増幅及び殺傷潜在力を刺激することができ、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、癌細胞を識別して死滅させることができ、ＩＬ－１０は、ＣＤ８＋Ｔ細胞中のリン酸化されたＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３を活性化することにより、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖並びにＩＦＮ－γ、Cytotoxic Proteins Perforin、及び、顆粒プロテアーゼの発現を誘導することができる。
ＩＦＮ－γは、腫瘍細胞及び単核マクロファージにおけるＭＨＣ－Ｉ系抗原分子の発現を誘導することができ、ＣＤ８＋Ｔ細胞がほとんどの抗原特異的腫瘍細胞を死滅させるように補助する。ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＴＣＲを活性化することが抗細胞アポトーシス信号及び細胞増殖シグナルを効果的に誘導することができ、ＣＤ８＋Ｔ細胞の生存及び増幅は、患者の予後及び生存率を改善することが期待できる。
組換えヒトＩＬ－１０の体内での半減期は、２時間だけであり、すぐに除去され、これはその疾患治療における応用に深刻な影響を与える。組換えヒトＩＬ－１０の半減期が短いという問題を解決するために、現在ＰＥＧ化修飾方法を採用してその体内での半減期を延長する研究機構があるが、ＰＥＧ化修飾サイトが多いため、ヒトＩＬ－１０がＰＥＧ化修飾された後に生成物が不均一であり、これは製造プロセス及び品質制御に大きな難度をもたらす。
したがって、組換えヒトＩＬ－１０半減期を効果的に延長することができ、かつ安定した均一な生成物を得ることができ、プロセス生産及び品質制御に役立つヒトインターロイキン１０－Ｆｃ融合タンパク質及びその医療用途を開発する必要がある。
従来の技術に存在するヒトＩＬ－１０の半減期が短く、ヒトＩＬ－１０がＰＥＧ化修飾された後に生成物が不均一である等の問題を解決するために、本発明は、遺伝子工学技術によりヒトＩＬ－１０と免疫グロブリンＦｃ断片を融合し、かつＩＬ－１０の生物学的活性を保持し、ＩＬ－１０の生体内での半減期を大幅に延長するヒトインターロイキン１０－Ｆｃ融合タンパク質及びその医療用途を提供する。
本発明の具体的な技術的解決手段は以下の通りである。
本発明は、ヒトインターロイキン１０及びＦｃ断片を含む融合タンパク質を提供し、前記融合タンパク質は、接続ペプチドを介してヒトインターロイキン１０を免疫グロブリンＩｇＧのＦｃ断片と融合させることによって形成され、前記Ｆｃ断片はヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２又はヒトＩｇＧ４のＦｃ断片であり、
ヒトＩｇＧ４のＦｃ断片は配列番号６に示すアミノ酸配列を含み(又は、ヒトＩｇＧ４のＦｃ断片のアミノ酸配列は配列番号６に示す通りであり)、
前記ヒトインターロイキン１０は配列番号１に示すアミノ酸配列を含む。
ヒトＩｇＧ４のＦｃ断片は配列番号６に示すアミノ酸配列を含み(又は、ヒトＩｇＧ４のＦｃ断片のアミノ酸配列は配列番号６に示す通りであり)、
前記ヒトインターロイキン１０は配列番号１に示すアミノ酸配列を含む。
ヒトＩｇＧ２のＦｃ断片は配列番号５に示すアミノ酸配列を含む(又はヒトＩｇＧ２のＦｃ断片のアミノ酸配列は配列番号５に示す通りである)。
本発明の融合タンパク質において、ヒトインターロイキン１０、接続ペプチド及び免疫グロブリンＩｇＧのＦｃ断片は「Ｎ端」～「Ｃ端」の方式で順に連結される。
本発明は、ヒトインターロイキン１０を免疫グロブリンＦｃ断片と融合させ、ヒトインターロイキン１０の生物学的活性を保持するだけでなく、免疫グロブリンＦｃ断片により半減期を効果的に延長し、ヒトインターロイキン１０の半減期が短いという欠陥を克服し、本発明のＦｃ断片はヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４に由来し、ここでＩｇＧ２及びＩｇＧ４は野生型配列を使用し、ヒトＩｇＧの四種類のサブタイプにおいて、サブタイプＩｇＧ１及びＩｇＧ３の、抗体が依存する細胞媒介の細胞毒性作用(ＡＤＣＣ作用)及び補体が依存する細胞毒性作用(ＣＤＣ作用)が強く、サブタイプＩｇＧ２及びＩｇＧ４のＡＤＣＣ作用及びＣＤＣ作用が相対的に弱い。
本発明の融合タンパク質が、ＡＤＣＣ及びＣＤＣ作用を必要とせず、逆に、ＡＤＣＣ及びＣＤＣ作用は、いくつかの不必要な副作用をもたらす。従って、本発明の好ましい実施形態によれば、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４のＦｃ断片は野生型アミノ酸配列を使用する。
また、本発明は、接続ペプチドを介して免疫グロブリンＩｇＧのＦｃ断片に連結され、大分子融合タンパク質の安定性を保証するだけでなく、均一な融合タンパク質生成物を得ることを保証することができ、製造及び品質制御に役立つ。
好ましくは、前記Ｆｃ断片がヒトＩｇＧ１のＦｃ部分である。ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分は配列番号２又は配列番号３に示すアミノ酸配列を含み、又は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のアミノ酸配列は配列番号２又は配列番号３に示す通りである。
好ましくは、前記Ｆｃ断片は配列番号２又は配列番号３に示すアミノ酸配列を含む。
さらに、前記接続ペプチドの一般式は、[GlyGlyGlyGlyX]nであり、
ここで、Ｘは、Ｓｅｒ又はＡｌａであり、ｎは、１～６の整数であり、
好ましくは、Ｘは、Ｓｅｒである。
ここで、Ｘは、Ｓｅｒ又はＡｌａであり、ｎは、１～６の整数であり、
好ましくは、Ｘは、Ｓｅｒである。
好ましくは、ｎは、６である。
上記一般式の接続ペプチド構造は薬物分子の生物学的活性をさらに保証することができる。
本発明は、ポリヌクレオチド配列をさらに提供し、前記ポリヌクレオチド配列は、前記融合タンパク質のアミノ酸配列をコードする。
本発明は、組換えＤＮＡ発現ベクターをさらに提供し、前記組換えＤＮＡ発現ベクターは、前記のようなポリヌクレオチド配列を含む。
本発明は、前記のような組換えＤＮＡ発現ベクターによって形質転換された宿主細胞をさらに提供し、前記宿主細胞は、原核細胞、酵母細胞及び哺乳動物細胞のうちの少なくとも一種を含む。
本発明は、薬物又は薬物組成物をさらに提供し、前記薬物又は薬物組成物は前記のような融合タンパク質を含む。
本発明は、免疫疾患及び／又は癌を予防及び／又は治療する薬物の製造における上記融合タンパク質の使用をさらに提供する。
本発明の有益な効果は以下の通りである。
まず、本発明の提供する融合タンパク質は、ヒトインターロイキン１０の生物学的活性を保持すると同時に、免疫グロブリンＩｇＧのＦｃ断片と融合することにより、ヒトインターロイキン１０の生体内での半減期を延長し、ヒトインターロイキン１０の生体内での安定性を高め、腫瘍の成長を長時間に抑制することができ、疾患治療における応用に役立ち、次に、精製プロセス及び生産の観点から言えば、本発明は遺伝子工学技術を採用して融合タンパク質の製造を行い、接続ペプチドを介してヒトインターロイキン１０を免疫グロブリンＩｇＧのＦｃ断片と融合させ、大分子融合タンパク質の構造安定性を高め、分解しにくく、製品の均一性が高く、精製しやすく、精製後の製品の純度を保証し、ＩＬ－１０のＰＥＧ化による製造プロセス及び品質制御の面倒を克服した。
また、前記ＩＬ－１０融合タンパク質は、関連疾患の治療に用いることができ、疾患は、免疫疾患及び／又は癌を含み、免疫疾患は、多発性硬化症、乾癬、リウマチ性関節炎、クローン病等を含むがこれらに限定されない。前記癌は、膵臓癌、非小細胞肺癌、黒色腫、前立腺癌、腎臓癌、結腸直腸癌、乳癌等の腫瘍を含むがこれらに限定されない。
以下、以下の実施例を参照して本発明をさらに詳細に説明する。
（実施例１）
本発明の実施例１は、融合タンパク質を提供し、融合タンパク質は、接続ペプチドを介してヒトインターロイキン１０を免疫グロブリンＩｇＧのＦｃ断片と融合させることによって形成され、ここで、Ｆｃ断片はヒトＩｇＧ１のＦｃ部分であり、ヒトインターロイキン１０のアミノ酸配列は配列番号１に示す通りであり、Ｆｃ断片のアミノ酸配列は配列番号２に示す通りであり、
接続ペプチドの一般式は、[GlyGlyGlyGlySer]6であり、接続ペプチドのアミノ酸配列は配列番号４に示す通りである。
本発明の実施例１は、融合タンパク質を提供し、融合タンパク質は、接続ペプチドを介してヒトインターロイキン１０を免疫グロブリンＩｇＧのＦｃ断片と融合させることによって形成され、ここで、Ｆｃ断片はヒトＩｇＧ１のＦｃ部分であり、ヒトインターロイキン１０のアミノ酸配列は配列番号１に示す通りであり、Ｆｃ断片のアミノ酸配列は配列番号２に示す通りであり、
接続ペプチドの一般式は、[GlyGlyGlyGlySer]6であり、接続ペプチドのアミノ酸配列は配列番号４に示す通りである。
ここで、配列番号１(ヒトインターロイキン１０のアミノ酸配列)は、SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNである。
配列番号２(Ｆｃ断片のアミノ酸配列)は、DKTHTCPPCPAPELEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKAYACAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKである。
配列番号４(接続ペプチドのアミノ酸配列)は、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSである。
融合タンパク質の具体的な構造概略図は図１に示す通りである。
（実施例２）
本発明の実施例２は、融合タンパク質を提供し、融合タンパク質は、接続ペプチドを介してヒトインターロイキン１０を免疫グロブリンＩｇＧのＦｃ断片と融合させることによって形成され、ここで、Ｆｃ断片はヒトＩｇＧ１のＦｃ部分であり、ヒトインターロイキン１０のアミノ酸配列は配列番号１に示す通りであり、Ｆｃ断片のアミノ酸配列は配列番号３に示す通りであり、
接続ペプチドの一般式は、[GlyGlyGlyGlySer]6であり、接続ペプチドのアミノ酸配列は配列番号４に示す通りである。
本発明の実施例２は、融合タンパク質を提供し、融合タンパク質は、接続ペプチドを介してヒトインターロイキン１０を免疫グロブリンＩｇＧのＦｃ断片と融合させることによって形成され、ここで、Ｆｃ断片はヒトＩｇＧ１のＦｃ部分であり、ヒトインターロイキン１０のアミノ酸配列は配列番号１に示す通りであり、Ｆｃ断片のアミノ酸配列は配列番号３に示す通りであり、
接続ペプチドの一般式は、[GlyGlyGlyGlySer]6であり、接続ペプチドのアミノ酸配列は配列番号４に示す通りである。
ここで、配列番号１及び配列番号４が提供するアミノ酸配列は実施例１と同じであり、
配列番号３(Ｆｃ断片のアミノ酸配列)は、EPKSCDKTHTCPPCPAPELEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKAYACAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKである。
配列番号３(Ｆｃ断片のアミノ酸配列)は、EPKSCDKTHTCPPCPAPELEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKAYACAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKである。
融合タンパク質の具体的な構造概略図は図１に示す通りである。
（実施例３）
本発明の実施例３は、融合タンパク質を提供し、融合タンパク質は、接続ペプチドを介してヒトインターロイキン１０を免疫グロブリンＩｇＧのＦｃ断片と融合させることによって形成され、ここで、Ｆｃ断片はヒトＩｇＧ２のＦｃ部分であり、Ｆｃ断片のアミノ酸配列は配列番号５に示す通りであり、ヒトインターロイキン１０のアミノ酸配列は配列番号１に示す通りであり、
接続ペプチドの一般式は、[GlyGlyGlyGlySer]6であり、接続ペプチドのアミノ酸配列は配列番号４に示す通りである。
本発明の実施例３は、融合タンパク質を提供し、融合タンパク質は、接続ペプチドを介してヒトインターロイキン１０を免疫グロブリンＩｇＧのＦｃ断片と融合させることによって形成され、ここで、Ｆｃ断片はヒトＩｇＧ２のＦｃ部分であり、Ｆｃ断片のアミノ酸配列は配列番号５に示す通りであり、ヒトインターロイキン１０のアミノ酸配列は配列番号１に示す通りであり、
接続ペプチドの一般式は、[GlyGlyGlyGlySer]6であり、接続ペプチドのアミノ酸配列は配列番号４に示す通りである。
ここで、配列番号１及び配列番号４が提供するアミノ酸配列は実施例１と同じであり、
配列番号５(Ｆｃ断片のアミノ酸配列)は、ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKである。
配列番号５(Ｆｃ断片のアミノ酸配列)は、ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKである。
融合タンパク質の具体的な構造概略図は図１に示す通りである。
（実施例４）
本発明の実施例４は、融合タンパク質を提供し、融合タンパク質は、接続ペプチドを介してヒトインターロイキン１０を免疫グロブリンＩｇＧのＦｃ断片と融合させることによって形成され、ここで、Ｆｃ断片はヒトＩｇＧ４のＦｃ部分であり、Ｆｃ断片のアミノ酸配列は配列番号６に示す通りであり、ヒトインターロイキン１０のアミノ酸配列は配列番号１に示す通りであり、
接続ペプチドの一般式は、[GlyGlyGlyGlySer]6であり、接続ペプチドのアミノ酸配列は配列番号４に示す通りである。
本発明の実施例４は、融合タンパク質を提供し、融合タンパク質は、接続ペプチドを介してヒトインターロイキン１０を免疫グロブリンＩｇＧのＦｃ断片と融合させることによって形成され、ここで、Ｆｃ断片はヒトＩｇＧ４のＦｃ部分であり、Ｆｃ断片のアミノ酸配列は配列番号６に示す通りであり、ヒトインターロイキン１０のアミノ酸配列は配列番号１に示す通りであり、
接続ペプチドの一般式は、[GlyGlyGlyGlySer]6であり、接続ペプチドのアミノ酸配列は配列番号４に示す通りである。
ここで、配列番号１及び配列番号４が提供するアミノ酸配列は実施例１と同じであり、
配列番号６(Ｆｃ断片のアミノ酸配列)は、ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKである。
配列番号６(Ｆｃ断片のアミノ酸配列)は、ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKである。
融合タンパク質の具体的な構造概略図は図１に示す通りである。
（実施例５）
本発明の実施例５は、融合タンパク質を提供し、融合タンパク質は、接続ペプチドを介してヒトインターロイキン１０を免疫グロブリンＩｇＧのＦｃ断片と融合させることによって形成され、ここで、Ｆｃ断片はヒトＩｇＧ２のＦｃ部分であり、Ｆｃ断片のアミノ酸配列は配列番号５に示す通りであり、ヒトインターロイキン１０のアミノ酸配列は配列番号１に示す通りであり、
接続ペプチドの一般式は、[GlyGlyGlyGlySer]5であり、接続ペプチドのアミノ酸配列は配列番号７に示す通りである。
本発明の実施例５は、融合タンパク質を提供し、融合タンパク質は、接続ペプチドを介してヒトインターロイキン１０を免疫グロブリンＩｇＧのＦｃ断片と融合させることによって形成され、ここで、Ｆｃ断片はヒトＩｇＧ２のＦｃ部分であり、Ｆｃ断片のアミノ酸配列は配列番号５に示す通りであり、ヒトインターロイキン１０のアミノ酸配列は配列番号１に示す通りであり、
接続ペプチドの一般式は、[GlyGlyGlyGlySer]5であり、接続ペプチドのアミノ酸配列は配列番号７に示す通りである。
ここで、配列番号１が提供するアミノ酸配列は実施例１と同じであり、配列番号５が提供するアミノ酸配列は実施例３と同じであり、
配列番号７(接続ペプチドのアミノ酸配列)は、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSである。
配列番号７(接続ペプチドのアミノ酸配列)は、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSである。
融合タンパク質の具体的な構造概略図は図１に示す通りである。
（実施例６）
本発明の実施例６は、融合タンパク質を提供し、融合タンパク質は、接続ペプチドを介してヒトインターロイキン１０を免疫グロブリンＩｇＧのＦｃ断片と融合させることによって形成され、ここで、Ｆｃ断片はヒトＩｇＧ４のＦｃ部分であり、Ｆｃ断片のアミノ酸配列は配列番号６に示す通りであり、ヒトインターロイキン１０のアミノ酸配列は配列番号１に示す通りであり、
接続ペプチドの一般式は、[GlyGlyGlyGlyAla]4であり、接続ペプチドのアミノ酸配列は配列番号８に示す通りである。
本発明の実施例６は、融合タンパク質を提供し、融合タンパク質は、接続ペプチドを介してヒトインターロイキン１０を免疫グロブリンＩｇＧのＦｃ断片と融合させることによって形成され、ここで、Ｆｃ断片はヒトＩｇＧ４のＦｃ部分であり、Ｆｃ断片のアミノ酸配列は配列番号６に示す通りであり、ヒトインターロイキン１０のアミノ酸配列は配列番号１に示す通りであり、
接続ペプチドの一般式は、[GlyGlyGlyGlyAla]4であり、接続ペプチドのアミノ酸配列は配列番号８に示す通りである。
ここで、配列番号１が提供するアミノ酸配列は実施例１と同じであり、配列番号６が提供するアミノ酸配列は実施例４と同じであり、
配列番号８(接続ペプチドのアミノ酸配列)は、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAである。
配列番号８(接続ペプチドのアミノ酸配列)は、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAである。
融合タンパク質の具体的な構造概略図は図１に示す通りである。
（実施例７）
本発明の実施例７は、融合タンパク質を提供し、融合タンパク質は、接続ペプチドを介してヒトインターロイキン１０を免疫グロブリンＩｇＧのＦｃ断片と融合させることによって形成され、ここで、Ｆｃ断片はヒトＩｇＧ１のＦｃ部分であり、ヒトインターロイキン１０のアミノ酸配列は配列番号１に示す通りであり、Ｆｃ断片のアミノ酸配列は配列番号２に示す通りであり、
接続ペプチドの一般式は、[GlyGlyGlyGlySer]3であり、接続ペプチドのアミノ酸配列は配列番号９に示す通りである。
本発明の実施例７は、融合タンパク質を提供し、融合タンパク質は、接続ペプチドを介してヒトインターロイキン１０を免疫グロブリンＩｇＧのＦｃ断片と融合させることによって形成され、ここで、Ｆｃ断片はヒトＩｇＧ１のＦｃ部分であり、ヒトインターロイキン１０のアミノ酸配列は配列番号１に示す通りであり、Ｆｃ断片のアミノ酸配列は配列番号２に示す通りであり、
接続ペプチドの一般式は、[GlyGlyGlyGlySer]3であり、接続ペプチドのアミノ酸配列は配列番号９に示す通りである。
ここで、配列番号１及び配列番号２が提供するアミノ酸配列は実施例１と同じであり、
配列番号９(接続ペプチドのアミノ酸配列)は、GGGGSGGGGSGGGGSであり、
融合タンパク質の具体的な構造概略図は図１に示す通りである。
配列番号９(接続ペプチドのアミノ酸配列)は、GGGGSGGGGSGGGGSであり、
融合タンパク質の具体的な構造概略図は図１に示す通りである。
（実施例８）
本発明の実施例８は、融合タンパク質を提供し、融合タンパク質は接続ペプチドを介してヒトインターロイキン１０を免疫グロブリンＩｇＧのＦｃ断片と融合させることによって形成され、Ｆｃ断片はヒトＩｇＧ２のＦｃ部分であり、ヒトインターロイキン１０のアミノ酸配列は配列番号１に示す通りであり、Ｆｃ断片のアミノ酸配列は配列番号５に示す通りであり、
接続ペプチドの一般式は、[GlyGlyGlyGlyAla]3であり、接続ペプチドのアミノ酸配列は配列番号１０に示す通りである。
本発明の実施例８は、融合タンパク質を提供し、融合タンパク質は接続ペプチドを介してヒトインターロイキン１０を免疫グロブリンＩｇＧのＦｃ断片と融合させることによって形成され、Ｆｃ断片はヒトＩｇＧ２のＦｃ部分であり、ヒトインターロイキン１０のアミノ酸配列は配列番号１に示す通りであり、Ｆｃ断片のアミノ酸配列は配列番号５に示す通りであり、
接続ペプチドの一般式は、[GlyGlyGlyGlyAla]3であり、接続ペプチドのアミノ酸配列は配列番号１０に示す通りである。
ここで、配列番号１が提供するアミノ酸配列は実施例１と同じであり、配列番号５が提供するアミノ酸配列は実施例３と同じであり、
配列番号１０(接続ペプチドのアミノ酸配列)は、GGGGAGGGGAGGGGAであり、
融合タンパク質の具体的な構造概略図は図１に示す通りである。
配列番号１０(接続ペプチドのアミノ酸配列)は、GGGGAGGGGAGGGGAであり、
融合タンパク質の具体的な構造概略図は図１に示す通りである。
（実施例９）
本発明の実施例９は、ポリヌクレオチド配列を提供し、ポリヌクレオチド配列は、実施例１～８のいずれか１つが提供する融合タンパク質のアミノ酸配列をコードする。
本発明の実施例９は、ポリヌクレオチド配列を提供し、ポリヌクレオチド配列は、実施例１～８のいずれか１つが提供する融合タンパク質のアミノ酸配列をコードする。
（実施例１０）
本発明の実施例１０は、組換えＤＮＡ発現ベクターを提供し、組換えＤＮＡ発現ベクターは実施例９が提供するポリヌクレオチド配列を含む。
本発明の実施例１０は、組換えＤＮＡ発現ベクターを提供し、組換えＤＮＡ発現ベクターは実施例９が提供するポリヌクレオチド配列を含む。
（実施例１１）
本発明の実施例１１は、実施例１０に提供された組換えＤＮＡ発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を提供し、宿主細胞は、原核細胞、酵母細胞及び哺乳動物細胞を含む。
本発明の実施例１１は、実施例１０に提供された組換えＤＮＡ発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を提供し、宿主細胞は、原核細胞、酵母細胞及び哺乳動物細胞を含む。
（実施例１２）
本発明の実施例１２は、薬物又は薬物組成物を提供し、薬物又は薬物組成物は、実施例１～８のいずれか１つが提供する融合タンパク質を含む。
本発明の実施例１２は、薬物又は薬物組成物を提供し、薬物又は薬物組成物は、実施例１～８のいずれか１つが提供する融合タンパク質を含む。
（実施例１３）
本発明の実施例１３は、免疫疾患及び癌を治療する薬物の製造における融合タンパク質の使用を提供し、ここで、免疫疾患は、多発性硬化症、乾癬、リウマチ性関節炎、クローン病などを含むがこれらに限定されなく、癌は、膵臓癌、非小細胞肺癌、黒色腫、前立腺癌、腎臓癌、結腸直腸癌、乳癌などの腫瘍を含むがこれらに限定されない。
本発明の実施例１３は、免疫疾患及び癌を治療する薬物の製造における融合タンパク質の使用を提供し、ここで、免疫疾患は、多発性硬化症、乾癬、リウマチ性関節炎、クローン病などを含むがこれらに限定されなく、癌は、膵臓癌、非小細胞肺癌、黒色腫、前立腺癌、腎臓癌、結腸直腸癌、乳癌などの腫瘍を含むがこれらに限定されない。
（実験例１）
本実験例は、ヒトインターロイキン１０及び本発明の融合タンパク質発現ベクターの構築を説明するために用いられる。
本実験例は、ヒトインターロイキン１０及び本発明の融合タンパク質発現ベクターの構築を説明するために用いられる。
実施例１～８に応じて図１に示すような分子構造概略図を参照し、ｐＴＳＥ(ｐＴＳＥベクターの製造過程はCN103525868A明細書第３ページ段落［００１９］及び実施例１を参照する)を発現ベクターとして選択し、融合タンパク質をコードする遺伝子は、南京金斯瑞生物科技有限公司により合成され、遺伝子を合成する時に、合成遺伝子の両側にそれぞれＥｃｏＲｌ、ＢａｍＨＩ酵素切断部位を導入し、次にｐＴＳＥ発現ベクター及び合成された融合タンパク質をコードする遺伝子に対していずれもＥｃｏＲｌ、ＢａｍＨＩ二重酵素切断を行い、かつｐＴＳＥ発現ベクター及び融合タンパク質をコードする遺伝子の酵素切断生成物にアガロースゲル電気泳動及び目的断片回収を行い、最後に回収された目的断片をそれぞれｐＴＳＥ発現ベクターに接続し、ＴＯＰコンピテント細胞(匯天東方、品番ＨＴ７０２－０３)にトランスフェクトし、配列決定を行い、正確であると遺伝子発現ベクター(図２に示す)を得る。
ヒトインターロイキン１０の発現プラスミドがr1L-10と命名され、実施例１～８の融合タンパク質の発現プラスミドが、表１に応じてそれぞれIL-10-Fc-A、IL-10-Fc-B、IL-10-Fc-C、IL-10-Fc-D、IL-10-Fc-E、IL-10-Fc-F、IL-10-Fc-G、IL-10-Fc-Hと命名される。
（実験例２）
本実験例は、ヒトインターロイキン１０及び本発明の融合タンパク質の発現及び精製を説明するために用いられる。
本実験例は、ヒトインターロイキン１０及び本発明の融合タンパク質の発現及び精製を説明するために用いられる。
Ｉ)、ヒトインターロイキン１０及び融合タンパク質発現プラスミドの取得
エンドトキシンなしビッグ抽出キット(康為世紀生物科学技術有限公司から購入、ＣＷ２１０４)を利用してプラスミドのビッグ抽出を行い、具体的な操作ステップは、下記の通りである。
エンドトキシンなしビッグ抽出キット(康為世紀生物科学技術有限公司から購入、ＣＷ２１０４)を利用してプラスミドのビッグ抽出を行い、具体的な操作ステップは、下記の通りである。
(１)２００μlの活性化された菌液を取って５００mlの振盪フラスコ(２００mlamp+を含むＬＢ培地)に置き、３７℃で、２２０rpmの振盪器で一晩培養する。
(２)２００mlの一晩培養した菌液を取り、遠心管に添加し、７０００rpmで５分間遠心分離して細菌を収集し、全ての上清をできるだけ除去する。
(３)菌体沈殿が残された遠心管に１２.５mlのBuffer P1(RNaseAが添加しされた)を添加し、ボルテックス発振器を用いて十分に均一に混合し、細菌沈殿を懸濁させる。
(４)遠心管に１２.５mlのBuffer P2を添加し、穏やかに遠心管を８～１０回上下に逆にして均一に混合し、菌体を十分に分解させ、溶液が透明で粘稠になるように室温で３～５分間放置する。
(５)遠心管に１２.５mlのBuffer E3を添加し、直ちに遠心管を８～１０回上下に逆にして均一に混合し、この時に白色綿状沈殿が現れ、室温で５分間放置し、７０００rpmで１５分間遠心分離し、上清を全てエンドトキシン除去フィルタ(Endo-Remover FQ)に注ぎ、押子(Plungers)を徐々に押して濾過し、濾過液を清潔な５０ml遠心管(自己準備)に収集する。
(６)濾過液に１０mlで、０.３倍の濾液体積のイソプロピルアルコールを添加し、上下を逆にして均一に混合する。
(７)カラムの平衡化収集管に入れられた吸着カラム(Spin Columns DQ)に２mlのBuffer PSを添加し、７０００rpmで２分間遠心分離し、収集管における廃液を捨て、吸着カラムを収集管に再び置く。
(８)ステップ６における濾過液とイソプロピルアルコールとの混合溶液を平衡化された吸着カラム(収集管に装入された)に移す。
(９)７０００rpmで２分間遠心分離し、収集管における廃液を捨て、吸着カラムを収集管に再び置く。
(１０)吸着カラムに１０mlのBuffer PW(無水エタノールを添加した)を添加し、７０００rpmで２分間遠心分離し、収集管における廃液を捨てる。
(１１)ステップ(１０)を一回繰り返す。
(１２)吸着カラムを再び収集管に置き、７０００rpmで５分間遠心分離し、廃液を捨て、吸着カラムを室温に数分間置きいて、吸着カラムに残ったすすぎ液を徹底的に乾燥させる。
(１３)吸着カラムを新しい遠心管に置き、吸着膜の中央部位に１mlのエンドトキシンフリー水を添加し、室温で２～５分間放置し、７０００rpmで５分間遠心分離し、プラスミド溶液を遠心管に収集し、濃度を測定した後に、－２０℃でプラスミドを保存する。
II)、ヒトインターロイキン１０及び融合タンパク質発現プラスミドの瞬時形質転換
ヒト胚腎細胞(ＨＥＫ２９３懸濁細胞、中国医学科学院基礎医学研究所から購入、品番ＧＮＨｕ４３)をFreeStyle 293 Expression Medium(Gibco)に培養し、細胞を一日か二日ごとに一回継代し、継代後の細胞の開始密度を０.２～０.６×１０6個/mlに維持し、細胞培養体積が振盪フラスコ容積の１５～３５％であり、細胞培養フラスコを振盪器(振盪器の回転数が１３５rpmであり、温度が３７℃であり、ＣＯ2が５％である)に置いて培養する。形質転換の前日に、対数増殖期にあり成長状態が良好であるＨＥＫ２９３細胞を、細胞密度が０.５×１０6個/mlになるまで継代し、振盪器(１３５rpm、３７℃、５％ＣＯ2)に置いて一晩培養し、二日目に形質転換を行う。
ヒト胚腎細胞(ＨＥＫ２９３懸濁細胞、中国医学科学院基礎医学研究所から購入、品番ＧＮＨｕ４３)をFreeStyle 293 Expression Medium(Gibco)に培養し、細胞を一日か二日ごとに一回継代し、継代後の細胞の開始密度を０.２～０.６×１０6個/mlに維持し、細胞培養体積が振盪フラスコ容積の１５～３５％であり、細胞培養フラスコを振盪器(振盪器の回転数が１３５rpmであり、温度が３７℃であり、ＣＯ2が５％である)に置いて培養する。形質転換の前日に、対数増殖期にあり成長状態が良好であるＨＥＫ２９３細胞を、細胞密度が０.５×１０6個/mlになるまで継代し、振盪器(１３５rpm、３７℃、５％ＣＯ2)に置いて一晩培養し、二日目に形質転換を行う。
形質転換前に準備された１×１０6個/mlの細胞懸濁液を振盪器(１３５rpm、３９℃、５％ＣＯ2)で２ｈ培養し、形質転換時に、上記ステップ１)で得られた９種類のプラスミド(最終濃度１μg/ml)、ポリエチレンイミンＰＥＩ(最終濃度２μg/ml)を順に添加し、均一に混合し、共にＨＥＫ２９３懸濁細胞に形質転換し、その後に、振盪器(１３５rpm、３９℃、５％ＣＯ2)に置いて４０min培養する。形質転換された細胞を１３５rpm、３７℃、５％ＣＯ2の振盪器で培養し続け、ヒトインターロイキン１０及び融合タンパク質を発現する。９６時間形質転換した後に遠心分離して上清液を収集する。
III)、ヒトインターロイキン１０及び融合タンパク質の精製
ヒトインターロイキン１０の精製上清液を０.２２μMの濾過膜で濾過し、Ｎｉカラムを利用して発現上清からＨｉｓタグドメイン付きのヒトインターロイキン１０を得る。
ヒトインターロイキン１０の精製上清液を０.２２μMの濾過膜で濾過し、Ｎｉカラムを利用して発現上清からＨｉｓタグドメイン付きのヒトインターロイキン１０を得る。
平衡緩衝液及び溶出緩衝液は、それぞれ５０mMのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、０.５ＭのＮａＣｌ、２０mMのイミダゾール、ｐＨ７.６、及び、５０mMのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、０.５ＭのＮａＣｌ、０.５Ｍのイミダゾール、ｐＨ７.６である。勾配溶出条件の設定１００％溶出液で、３０min及び５ml/min流速で勾配溶出を行い、イミダゾールの異なる濃度変化に基づいて、ＵＶ２８０で検出されたタンパク質ピークを収集し、ピーク収集位置を標識しておき、ＰＢＳ緩衝液で液体交換濃縮を行う。
融合タンパク質の精製上清液を０.２２μMの濾過膜で濾過し、ＨｉＴｒａｐｒＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーカラムを利用して発現上清からＦｃドメイン付きの融合タンパク質を取得する。平衡緩衝液及び溶出緩衝液は、それぞれ５０mMのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、０.１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７.０、及び、０.１Ｍのクエン酸－クエン酸ナトリウム、ｐＨ３.０である。
陽イオン交換カラムＨｉＴｒａｐ－ＳＰＦＦにより目標融合タンパク質を取得し、最後にＰＢＳ緩衝液で液体交換濃縮を行う。精製されたヒトインターロイキン１０及び融合タンパク質を得て、図３に示すように、左側から右側まで順にタンパク質分子量Marker、rIL-10、IL-10-Fc-A、IL-10-Fc-B、IL-10-Fc-C、IL-10-Fc-D、IL-10-Fc-E、IL-10-Fc-F、IL-10-Fc-G、IL-10-Fc-Hであり、各バンドの分子量の大きさは理論と一致する。
（実験例３）
本実験例は、本発明の融合タンパク質がマウス肥大細胞ＭＣ／９の増殖を刺激することにおける効果を説明するために用いられる。
本実験例は、本発明の融合タンパク質がマウス肥大細胞ＭＣ／９の増殖を刺激することにおける効果を説明するために用いられる。
１、実験細胞
名称マウス肥大細胞ＭＣ／９
細胞培地ＲＰＭＩ１６４０(Gibico,A10491-01)＋１０％ＦＢＳ(VisTech,SE200-ES)
供給源上海子実生物科技有限公司
名称マウス肥大細胞ＭＣ／９
細胞培地ＲＰＭＩ１６４０(Gibico,A10491-01)＋１０％ＦＢＳ(VisTech,SE200-ES)
供給源上海子実生物科技有限公司
細胞特性該細胞は、内因性マウスインターロイキン１０(ＩＬ－１０)受容体(Ｒ１及びＲ２)を発現し、マウスインターロイキン４(ＩＬ－４)(南京金斯瑞生物科技有限公司から購入され、品番Ｚ０２９９６)が存在する場合に、ＩＬ－１０は、ＭＣ／９マウス肥大細胞株の増殖を刺激することができる。単一のｍＩＬ－４又はｈＩＬ－１０は、ただ非常に低い増殖刺激活性を有する。
２、細胞敷設及び薬物の添加
対数増殖期のＭＣ／９細胞をブランク１６４０培地で２回洗浄し、２０％ＦＣＳ－１６４０培養液に懸濁し、かつ濃度が２×１０5個/mlであるように調製し、９６ウェルプレートに添加し、１×１０4個/ウェルであり、対照グループ及び実験グループを設置し、それぞれ投与し、単独作用グループにおける融合タンパク質の投与量は、２５ng/ウェルであり、組み合わせ作用グループにおけるｍＩＬ－４及び融合タンパク質の投与量はそれぞれ０.０５ng/ウェル及び２５ng/ウェルであり、具体的な投与状況は以下の表２に示す通りである。
対数増殖期のＭＣ／９細胞をブランク１６４０培地で２回洗浄し、２０％ＦＣＳ－１６４０培養液に懸濁し、かつ濃度が２×１０5個/mlであるように調製し、９６ウェルプレートに添加し、１×１０4個/ウェルであり、対照グループ及び実験グループを設置し、それぞれ投与し、単独作用グループにおける融合タンパク質の投与量は、２５ng/ウェルであり、組み合わせ作用グループにおけるｍＩＬ－４及び融合タンパク質の投与量はそれぞれ０.０５ng/ウェル及び２５ng/ウェルであり、具体的な投与状況は以下の表２に示す通りである。
３７℃で５％ＣＯ2のインキュベータで７２時間培養した後に、ＣＣＫ－８検出液を添加し、３７℃で２～４時間培養した後に４５０nmでＯＤ値を検出する。
実験結果は、図４に示すように通りであり、細胞増殖状況から分かるように、本発明の提供する融合タンパク質IL-10-Fc-A、IL-10-Fc-B、IL-10-Fc-C、IL-10-Fc-D、IL-10-Fc-E、IL-10-Fc-F、IL-10-Fc-G、IL-10-Fc-Hは、ヒトインターロイキン１０の生物学的活性を保持し、異なるタイプの融合タンパク質はいずれもマウス肥大細胞ＭＣ／９の増殖を刺激することができ、マウスインターロイキン４(ＩＬ－４)とともに刺激することにより、融合タンパク質は細胞増殖を顕著に刺激することができる。
（実験例４）
本実験例は、本発明の融合タンパク質のＳＫ－ＢＲ－３腫瘍細胞に対するインビトロ殺傷作用を説明するために用いられる。
本実験例は、本発明の融合タンパク質のＳＫ－ＢＲ－３腫瘍細胞に対するインビトロ殺傷作用を説明するために用いられる。
１、標的細胞
名称ヒト乳癌細胞ＳＫ－ＢＲ－３
維持培地ＲＰＭＩ１６４０(Gibico,A10491-01)＋１０％ＦＢＳ(VisTech,SE200-ES)
実験培地ＲＰＭＩ１６４０(Gibico,A10491-01)＋１０％不活化ＦＢＳ(VisTech,SE200-ES)
供給源ＡＴＣＣから購入し、番号がＨＴＢ－３０である。
名称ヒト乳癌細胞ＳＫ－ＢＲ－３
維持培地ＲＰＭＩ１６４０(Gibico,A10491-01)＋１０％ＦＢＳ(VisTech,SE200-ES)
実験培地ＲＰＭＩ１６４０(Gibico,A10491-01)＋１０％不活化ＦＢＳ(VisTech,SE200-ES)
供給源ＡＴＣＣから購入し、番号がＨＴＢ－３０である。
２、標的細胞の敷設及び血清の不活化
一日前にＳＫ－ＢＲ－３細胞を消化した後に、維持培地で再懸濁して計数し、平底９６ウェルプレートに敷設し、５×１０3個/１００μl/ウェルで、細胞が壁に貼り付けられるよう一晩培養する。
一日前にＳＫ－ＢＲ－３細胞を消化した後に、維持培地で再懸濁して計数し、平底９６ウェルプレートに敷設し、５×１０3個/１００μl/ウェルで、細胞が壁に貼り付けられるよう一晩培養する。
完全に融解したＦＢＳを一管取り、６０℃のウォーターバスに置き、４０min作用すれば、不活化血清を得る。
３、エフェクター細胞－ヒト単一核細胞(ＰＢＭＣ)分離
３、エフェクター細胞－ヒト単一核細胞(ＰＢＭＣ)分離
５０ml管に２０mlの単一核細胞分離液を添加し、収集された血液を全血希釈液で１:１の割合で希釈処理し、均一に混合した後にコーニング管の内壁に沿って分離液の上層に等速でゆっくりと敷き、各管内に希釈後の全血の体積が２０mlであり、各管に液体を添加した後に２２℃に予め予冷された遠心分離機内に入れ、６００ｇで１５min水平遠心分離し(加減速を１に設定する)、遠心分離が完了した後に遠心管を取り出し、ピペットで分離液と血清との間に円弧状に分布する細胞層－単一核細胞(ＰＢＭＣ)を注意深く吸い取り、新規５０ml管に置き、１:５の割合で細胞液に細胞洗浄液を添加し、十分に均一に混合した後に遠心分離し、上清を捨て、さらに一回繰り返して洗浄し、細胞沈殿を収集し、ＲＰＭＩ－１６４０培地で再懸濁し、単一核細胞(ＰＢＭＣ)を細胞数が２.５×１０6個/mlになるように調整する。
４、薬物の希釈、並びに敷設及び薬物の添加
実験例２で得られた８種類の薬物分子(IL-10-Fc-A、IL-10-Fc-B、IL-10-Fc-C、IL-10-Fc-D、IL-10-Fc-E、IL-10-Fc-F、IL-10-Fc-G、IL-10-Fc-H)を実験培地で希釈することにより、その作用最終濃度を２００μg/mlにし、重複ウェルを３つ設置した。
実験例２で得られた８種類の薬物分子(IL-10-Fc-A、IL-10-Fc-B、IL-10-Fc-C、IL-10-Fc-D、IL-10-Fc-E、IL-10-Fc-F、IL-10-Fc-G、IL-10-Fc-H)を実験培地で希釈することにより、その作用最終濃度を２００μg/mlにし、重複ウェルを３つ設置した。
９６ウェルプレート内の成長培地を捨て、滅菌ＰＢＳで一回軽く洗浄し、各ウェルに１００μlの実験用培地を添加する。調整された数のＰＢＭＣ細胞と希釈された薬物分子を順に９６ウェルプレート内に添加し、ＰＢＭＣと標的細胞との有効標的比は５０:１である。
ブランク標的細胞、ブランクＰＢＭＣ対照グループを設置し、各グループはそれぞれ標的細胞及びエフェクター細胞のみを含み、各グループは３個の重複ウェルを有する。同時に、エフェクター細胞／標的細胞混合作用孔を設置し、合計６ウェルである。この中で、３つのウェルを最大殺傷グループとして設定し、検出前の３０minに溶解液を添加し、細胞を完全に溶解し殺傷し、残りの３つのウェルは自然殺傷グループ(自然殺傷グループにそれぞれIL-10-Fc-A、IL-10-Fc-B、IL-10-Fc-C、IL-10-Fc-D、IL-10-Fc-E、IL-10-Fc-F、IL-10-Fc-G、IL-10-Fc-Hを添加する)であり、融合タンパク質殺傷作用の対照(TARGET+PBMC)とされる。ブランク標的細胞、ブランクＰＢＭＣ及び最大殺傷グループは、いずれも細胞死亡率の計算を行うために用いられる。明らかに標示した後に、３７℃の細胞インキュベータに置いてインキュベートする。
５、検出及び殺傷率の計算
３日後に顕微鏡検査により標的細胞の数が明らかに減少したことが分かり、上清液を取ってＬＤＨ検出を行って、マイクロプレートリーダーによりＯＤ４９０を読み取った後に、細胞死亡率の計算を行った。計算式は以下の通りである。
３日後に顕微鏡検査により標的細胞の数が明らかに減少したことが分かり、上清液を取ってＬＤＨ検出を行って、マイクロプレートリーダーによりＯＤ４９０を読み取った後に、細胞死亡率の計算を行った。計算式は以下の通りである。
実験結果は、図５に示す通りであり、対照グループＰＢＭＣ＋ＴＡＲＧＥＴに比べて、実施例１～８が提供する８種類の融合タンパク質はいずれもＳＫ－ＢＲ－３腫瘍細胞を特異的に殺傷することができ、ここでIL-10-Fc-A、IL-10-Fc-B、IL-10-Fc-D、IL-10-Fc-Gの殺傷能力が強く、細胞死亡率がいずれも６０％以上であり、殺傷能力が最も強いのはIL-10-Fc-A融合タンパク質である。
（実験例５）
本実験例は、本発明の融合タンパク質のマウスＨ１９７５腫瘍モデルにおける薬効を説明するために用いられる。
本実験例は、本発明の融合タンパク質のマウスＨ１９７５腫瘍モデルにおける薬効を説明するために用いられる。
１、実験動物
種属や品種ＭｕｓＭｕｓｃｕｌｕｓ、ＮＣＧ、マウス
週齢６～８週
実験動物プロバイダ江蘇集萃薬康生物科技有限公司。
種属や品種ＭｕｓＭｕｓｃｕｌｕｓ、ＮＣＧ、マウス
週齢６～８週
実験動物プロバイダ江蘇集萃薬康生物科技有限公司。
２、細胞培養不活化された１０％のウシ胎児血清、１００U/mlのペニシリン、１００μg/mlのストレプトマイシン及び２mMのグルタミンを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地で３７℃、５％ＣＯ2のインキュベータで腫瘍細胞(ＡＴＣＣから購入され、品番ＣＲＬ－５９０８)を培養し、３～４日ごとに細胞が満ちた後にフラスコに分けて継代し、対数増殖期にある腫瘍細胞を体内腫瘍の接種に用いる。
３、腫瘍細胞の接種及びグループ化
Ｈ１９７５細胞をＰＢＳで細胞を二回洗浄し、次に腫瘍細胞をＰＢＳに再懸濁し、ＮＣＩ－Ｈ１９７５ヒト非小細胞肺癌細胞を得て、かつＮＣＩ－Ｈ１９７５ヒト非小細胞肺癌細胞をＰＢＭＣヒト化されたＮＣＧマウス皮下に接種し、細胞接種量は、５×１０6/マウスである；ＰＢＭＣは、正常ヒト末梢血に由来し、Ｈ１９７５細胞を接種する前の三日間に担癌マウス体内に接種し、２×１０6/マウスである。腫瘍を接種した後に腫瘍が約１００mm3に成長する時にグループに分けて投与し、合計６グループであり、各グループに８匹の動物があり、それぞれ溶媒対照グループ、rIL-10グループ、IL-10-Fc-Aグループ、IL-10-Fc-Bグループ、IL-10-Fc-Dグループ、IL-10-Fc-Gグループ(１mg/kg、s.c.、biw×４Weeks)である。
Ｈ１９７５細胞をＰＢＳで細胞を二回洗浄し、次に腫瘍細胞をＰＢＳに再懸濁し、ＮＣＩ－Ｈ１９７５ヒト非小細胞肺癌細胞を得て、かつＮＣＩ－Ｈ１９７５ヒト非小細胞肺癌細胞をＰＢＭＣヒト化されたＮＣＧマウス皮下に接種し、細胞接種量は、５×１０6/マウスである；ＰＢＭＣは、正常ヒト末梢血に由来し、Ｈ１９７５細胞を接種する前の三日間に担癌マウス体内に接種し、２×１０6/マウスである。腫瘍を接種した後に腫瘍が約１００mm3に成長する時にグループに分けて投与し、合計６グループであり、各グループに８匹の動物があり、それぞれ溶媒対照グループ、rIL-10グループ、IL-10-Fc-Aグループ、IL-10-Fc-Bグループ、IL-10-Fc-Dグループ、IL-10-Fc-Gグループ(１mg/kg、s.c.、biw×４Weeks)である。
４、検出指標毎週に、ノギスを用いて腫瘍の体積を２回測定し、腫瘍の長径及び短径を測定し、その体積計算式は以下の通りである。体積＝０.５×長径×短径2。担癌マウスの腫瘍の体積の変化と投与時間との関係を記録し、実験結果は図６に示す通りである。
図６におけるデータに示されるように、溶媒対照グループに比べて、投与グループは、腫瘍成長に対して抑制能力を有し、投与グループrIL-10に比べて、時間が経つにつれ、投与グループIL-10-Fc-A、投与グループIL-10-Fc-B、投与グループIL-10-Fc-D及び投与グループIL-10-Fc-Gの腫瘍成長に対する抑制作用がいずれも強く、腫瘍成長に対する抑制効果がヒトインターロイキン１０より明らかに高く、ここで融合タンパク質IL-10-Fc-Aの腫瘍成長に対する抑制効果が最も高い。
（実験例６）
本実験例は、本発明の融合タンパク質のヒト化異種移植非小細胞肺癌Ｈ１９７５腫瘍モデルにおける体内薬効実験を説明するために用いられる。
本実験例は、本発明の融合タンパク質のヒト化異種移植非小細胞肺癌Ｈ１９７５腫瘍モデルにおける体内薬効実験を説明するために用いられる。
１、実験動物
種属や品種ＭｕｓＭｕｓｃｕｌｕｓ、ＮＣＧ、マウス、
週齢６～８週
体重１８～２２ｇ
動物の数３２匹
実験動物プロバイダ江蘇集萃薬康生物科技有限公司。
種属や品種ＭｕｓＭｕｓｃｕｌｕｓ、ＮＣＧ、マウス、
週齢６～８週
体重１８～２２ｇ
動物の数３２匹
実験動物プロバイダ江蘇集萃薬康生物科技有限公司。
２、細胞培養不活化された１０％のウシ胎児血清、１００U/mlのペニシリン、１００μg/mlのストレプトマイシン及び２mMのグルタミンを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地で３７℃、５％ＣＯ2のインキュベータで腫瘍細胞(ＡＴＣＣから購入され、品番ＣＲＬ－５９０８)を培養し、３～４日ごとに細胞が満ちた後にフラスコに分けて継代し、対数増殖期にある腫瘍細胞を体内腫瘍の接種に用いる。
３、腫瘍細胞の接種及びグループ化
ＰＢＳでＨ１９７５細胞を二回洗浄し、次に腫瘍細胞をＰＢＳに再懸濁し、ＮＣＩ－Ｈ１９７５ヒト非小細胞肺癌細胞を得て、かつＮＣＩ－Ｈ１９７５ヒト非小細胞肺癌細胞を実験動物の右側脇肋部皮下に接種し、１００ul/マウスであり、細胞接種量は５×１０6/マウスであり、ＰＢＭＣは、正常なヒト末梢血に由来し、ＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞を接種する前の三日間に担癌マウス体内に接種し、２×１０6/マウスである。腫瘍体積が約５０～８０mm3に成長する時にグループに分けて投与し、合計４グループであり、各グループに８匹の動物があり、具体的な投与スキームは以下の表３に示す通りである。
ＰＢＳでＨ１９７５細胞を二回洗浄し、次に腫瘍細胞をＰＢＳに再懸濁し、ＮＣＩ－Ｈ１９７５ヒト非小細胞肺癌細胞を得て、かつＮＣＩ－Ｈ１９７５ヒト非小細胞肺癌細胞を実験動物の右側脇肋部皮下に接種し、１００ul/マウスであり、細胞接種量は５×１０6/マウスであり、ＰＢＭＣは、正常なヒト末梢血に由来し、ＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞を接種する前の三日間に担癌マウス体内に接種し、２×１０6/マウスである。腫瘍体積が約５０～８０mm3に成長する時にグループに分けて投与し、合計４グループであり、各グループに８匹の動物があり、具体的な投与スキームは以下の表３に示す通りである。
４、検出指標
ａ．腫瘍体積毎週に、ノギスを用いて腫瘍の体積を２回測定し、腫瘍の長径及び短径を測定し、その体積計算式は以下の通りである。体積＝０.５×長径×短径2。
ａ．腫瘍体積毎週に、ノギスを用いて腫瘍の体積を２回測定し、腫瘍の長径及び短径を測定し、その体積計算式は以下の通りである。体積＝０.５×長径×短径2。
ｂ．動物へ投与後の反応腫瘍体積測定を行うと同時に、マウスの体重を秤量する。マウス体重の変化と投与時間との関係を記録する。それと同時に、投与期間の動物活動、摂食等の一般的な状態などのマウスの生存状況及び健康状態を観察する。
ｃ．腫瘍体の撮影実験が終了すると、マウスを安楽死させ、腫瘍を剥離し、かつ対照グループ及び試験グループの剥離された腫瘍を整然と並べて撮影する。
５、薬物評価指標
ａ．腫瘍成長抑制率(％)
腫瘍成長抑制率(％)＝(１－Ｔ／Ｃ)×１００％
Ｔ／Ｃ＝治療グループＲＴＶ／対照グループＲＴＶ
腫瘍成長抑制率≧６０％であり、かつ統計学的処理によりｐ＜０.０５であることは有効である。
ａ．腫瘍成長抑制率(％)
腫瘍成長抑制率(％)＝(１－Ｔ／Ｃ)×１００％
Ｔ／Ｃ＝治療グループＲＴＶ／対照グループＲＴＶ
腫瘍成長抑制率≧６０％であり、かつ統計学的処理によりｐ＜０.０５であることは有効である。
ｂ．治療グループ／対照グループの腫瘍体積比Ｔ／Ｃ(％)
治療グループ／対照グループの腫瘍体積比Ｔ／Ｃ(％)＝治療グループＲＴＶ／対照グループＲＴＶ×１００％
治療効果評価基準Ｔ／Ｃ(％)＞４０％は、無効であり、Ｔ／Ｃ(％)≦４０％かつｐ＜０.０５は、有効である。
治療グループ／対照グループの腫瘍体積比Ｔ／Ｃ(％)＝治療グループＲＴＶ／対照グループＲＴＶ×１００％
治療効果評価基準Ｔ／Ｃ(％)＞４０％は、無効であり、Ｔ／Ｃ(％)≦４０％かつｐ＜０.０５は、有効である。
６、免疫学的評価指標実験グループ分け(グループ分け後の３日以内)の時と最終回投与２４時間(実験終了)の時とに血を取り、ＰＢＭＣを分離し、ヒト由来ＣＤ４５を検出する。実験終了時に腫瘍を収集し、細胞懸濁液を調製し、ＣＤ３／ＣＤ８／ＩＮＦ－ｒ／ＣＤ４／ＣＤ２５／ＦＯＸＰ３／ＰＤ－１／ＬＡＧ３を検出する。
７、統計学的分析
Ｏｎｅ－ＷａｙＡＮＯＶＡ検定を応用して腫瘍体積に群間統計学的分析を行い、Ｐ＜０.０５であると顕著な差異があると考えられ、実験結果は図７に示す通りである。
Ｏｎｅ－ＷａｙＡＮＯＶＡ検定を応用して腫瘍体積に群間統計学的分析を行い、Ｐ＜０.０５であると顕著な差異があると考えられ、実験結果は図７に示す通りである。
図７に示すように、溶媒対照グループに比べて、投与グループは、腫瘍の成長に対して抑制能力を有し、異なる投与量の腫瘍に対する抑制能力は、明らかな投与効果関係を示す。融合タンパク質IL-10-Fc-Aの投与量が高いほど、腫瘍に対する抑制能力が強く、投与量が０.０１mg/kgで依然として腫瘍に対する抑制能力を有する。それにより、本発明が提供する融合タンパク質IL-10-Fc-Aは、腫瘍疾患の治療に用いることができることを証明することができる。
本発明は、上記具体的な実施形態に限定されるものではなく、誰でも本発明の示唆の下で外の様々な形式の製品を獲得できる。しかし、その形状又は構造についてはいかなる変化を行っても、本発明と同じであるか又は類似する技術方案を有すれば、いずれも本発明の保護範囲内に落ちる。
さらに、前記接続ペプチドの一般式は、[GlyGlyGlyGlyX]nであり、
ここで、Ｘは、Ｓｅｒ又はＡｌａであり、ｎは、１～６の整数であり、
詳しくは、アミノ酸配列は、配列番号１１～配列番号１６に示す通りであり、
好ましくは、Ｘは、Ｓｅｒである。
ここで、Ｘは、Ｓｅｒ又はＡｌａであり、ｎは、１～６の整数であり、
詳しくは、アミノ酸配列は、配列番号１１～配列番号１６に示す通りであり、
好ましくは、Ｘは、Ｓｅｒである。
Claims (10)
- ヒトインターロイキン１０及びＦｃ断片を含む融合タンパク質であって、前記融合タンパク質は、接続ペプチドを介してヒトインターロイキン１０を免疫グロブリンＩｇＧのＦｃ断片と融合させることによって形成され、前記Ｆｃ断片はヒトＩｇＧ１のＦｃ断片、ヒトＩｇＧ２のＦｃ断片又はヒトＩｇＧ４のＦｃ断片であり、
ヒトＩｇＧ４のＦｃ断片は配列番号６に示すアミノ酸配列を含み、
前記ヒトインターロイキン１０は配列番号１に示すアミノ酸配列を含む、ことを特徴とする融合タンパク質。 - 前記Ｆｃ断片がヒトＩｇＧ１のＦｃ断片である、ことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
- 前記Ｆｃ断片が配列番号２又は配列番号３に示すアミノ酸配列を含む、ことを特徴とする請求項２に記載の融合タンパク質。
- 前記接続ペプチドの一般式は、[GlyGlyGlyGlyX]nであり、
ここで、Ｘは、Ｓｅｒ又はＡｌａであり、ｎは、１～６の整数であり、
好ましくは、Ｘは、Ｓｅｒである、ことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。 - ｎが６である、ことを特徴とする請求項４に記載の融合タンパク質。
- 請求項１～５のいずれか１項に記載の融合タンパク質のアミノ酸配列をコードする、ことを特徴とするポリヌクレオチド配列。
- 請求項６に記載のポリヌクレオチド配列を含む、ことを特徴とする組換えＤＮＡ発現ベクター。
- 原核細胞、酵母細胞及び哺乳動物細胞のうちの少なくとも一種を含む、ことを特徴とする請求項７に記載の組換えＤＮＡ発現ベクターによって形質転換された宿主細胞。
- 請求項１～５のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む、ことを特徴とする薬物又は薬物組成物。
- 免疫疾患及び／又は癌を予防及び／又は治療する薬物の製造における請求項１～５のいずれか１項に記載の融合タンパク質の使用。
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