TW202128739A - 含人白細胞介素10和Fc片段的融合蛋白及其醫藥用途 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及一種含人白細胞介素10和Fc片段的融合蛋白及其醫藥用途，所述融合蛋白由人白細胞介素10通過連接肽與免疫球蛋白IgG的Fc片段融合而成；其中，所述Fc片段為人IgG1、人IgG2或人IgG4的Fc片段；所述人白細胞介素10包括SEQ ID No:1所示的氨基酸序列。本發明是由人IL-10與人免疫球蛋白Fc片段通過特定的連接肽融合而成，延長了人IL-10在體內的半衰期，並增加了其在體內的穩定性。此外，本發明提供的融合蛋白可用於免疫疾病和癌症的治療。
Description
本發明涉及生物醫藥技術領域，特別涉及一種含人白細胞介素10和Fc片段的融合蛋白及其醫藥用途。
人白細胞介素10（IL-10）基因位於1q31-32上，全長5.1kb，包含5個外顯子。IL-10基因由178個氨基酸組成，人類和鼠類的IL-10基因有75%的氨基酸序列是一致的，人類IL-10是一個35kD的二聚體，由兩個單體通過非共價鍵形式結合，在單體內有兩個二硫鍵來維持其結構和生物學活性。目前已知所有的淋巴細胞均能合成IL-10，體內最重要的來源主要是單核巨噬細胞和T輔助細胞。此外，樹突狀細胞、B細胞、NK細胞、細胞毒性T細胞、肥大細胞以及中性粒細胞和嗜酸性細胞也能合成IL-10基因。
多年來，人們對IL-10的認識主要集中在免疫抑制方面，認為IL-10可以直接抑制效應T細胞增殖和遷移能力並下調相關細胞因數的產生，在誘導腫瘤的免疫逃逸方面起到重要作用。近年來，不斷有研究表明IL-10具有免疫活化作用，其免疫活化作用對於腫瘤的抑制起到了至關重要的作用。Mumm等研究發現聚乙二醇化IL-10對移植瘤有排斥作用，並可提高顆粒酶 B 和 IFN-γ的表達。IL-10是人體中天然存在的免疫生長因數，能刺激免疫系統中一種被稱為CD8+ T細胞的特殊白細胞的存活、擴增和殺傷潛力，CD8+ T細胞可以識別並殺死癌細胞，IL-10 啟動CD8+T細胞中磷酸化的STAT1和STAT3，從而誘導CD8+T 細胞的增殖和IFN-γ、細胞毒性蛋白穿孔素及顆粒蛋白酶的表達；IFN-γ可以誘導腫瘤細胞和單核巨噬細胞中MHC-Ⅰ類抗原分子的表達，協助CD8+T細胞殺死大部分抗原特異性腫瘤細胞；啟動CD8+T細胞中的 TCR可以有效地誘導抗細胞凋亡信號和細胞增殖信號，CD8+ T細胞的存活和擴增有望改善患者的預後和生存率。
重組人IL-10在體內半衰期只有2個小時，很快會被清除，這嚴重影響了其在疾病治療中的應用。為了克服重組人IL-10半衰期短的問題，目前有些研究機構採用PEG化修飾方法延長其在體內的半衰期，但是PEG化修飾位點較多，所以人IL-10經過PEG化修飾後產物不均一，這給生產工藝和品質控制帶來了很大的難度。因此，急需開發一種既能夠有效延長重組人IL-10半衰期，而且能夠得到穩定的均一產物，便於工藝生產和品質控制的人白細胞介素10-Fc融合蛋白及其醫藥用途。
為了解決現有技術中存在的人IL-10半衰期短，人IL-10經過PEG化修飾後產物不均一等問題，本發明通過基因工程技術提供了一種將人IL-10與免疫球蛋白Fc片段融合在一起，並保留了IL-10生物活性，極大延長了IL-10在生物體內的半衰期的人白細胞介素10-Fc融合蛋白及其醫藥用途。
本發明具體技術方案如下：
本發明提供了一種含人白細胞介素10和Fc片段的融合蛋白，所述融合蛋白由人白細胞介素10通過連接肽與免疫球蛋白IgG的Fc片段融合而成；其中，所述Fc片段為人IgG1、人IgG2或人IgG4的Fc片段；
人IgG4的Fc片段包括SEQ ID No:6所示的氨基酸序列（或者，人IgG4的Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID No:6所示）；
所述人白細胞介素10包括SEQ ID No:1所示的氨基酸序列。
人IgG2的Fc片段包括SEQ ID No:5所示的氨基酸序列（或者人IgG2的Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID No:5所示）。
本發明的融合蛋白中，人白細胞介素10、連接肽和免疫球蛋白IgG的Fc片段以「N端」至「C端」的方式依次連接。
本發明將人白細胞介素10與免疫球蛋白Fc片段融合，不僅保留了人白細胞介素10的生物學活性，而且能夠通過免疫球蛋白Fc片段有效延長了半衰期，克服了人白細胞介素10半衰期短的缺陷，本發明的Fc片段源自人IgG1、IgG2或IgG4，其中IgG2和IgG4使用野生型序列，人IgG的四種亞型中，IgG1和IgG3亞型的抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用（ADCC作用）和補體依賴的細胞毒性作用（CDC作用）較強，而IgG2和IgG4亞型的ADCC作用和CDC作用相對較弱，本發明的融合蛋白並不需要ADCC和CDC作用，相反，ADCC和CDC作用會帶來一些不必要的副作用，因此，根據本發明的較佳實施方式，IgG2和IgG4的Fc片段使用野生型氨基酸序列。此外，本發明通過連接肽與免疫球蛋白IgG的Fc片段連接，不僅保證了大分子融合蛋白的穩定性，而且能夠保證得到均一的融合蛋白產物，便於生產和品質控制。
較佳地，所述Fc片段為人IgG1的Fc部分。人IgG1的Fc部分包括SEQ ID No:2或SEQ ID No:3所示的氨基酸序列，或者，人IgG1的Fc部分的氨基酸序列如SEQ ID No:2或SEQ ID No:3所示。
較佳地，所述Fc片段包括SEQ ID No:2或SEQ ID No:3所示的氨基酸序列。
進一步地，所述連接肽通式為［GlyGlyGlyGlyX］n；
其中，X為Ser或Ala，n為1-6的整數。
較佳地，X為Ser。
較佳地，n為6。
上述通式的連接肽結構能夠進一步保證藥物分子的生物活性。
本發明還提供了一種多核苷酸序列，所述多核苷酸序列編碼所述融合蛋白的氨基酸序列。
本發明進一步提供了一種重組DNA表達載體，所述重組DNA表達載體包含如上所述的多核苷酸序列。
本發明還提供了一種轉染如上所述的重組DNA表達載體的宿主細胞，所述宿主細胞包括原核細胞、酵母細胞和哺乳動物細胞中的至少一種。
本發明還提供了一種藥物或藥物組合物，所述藥物或藥物組合物包含如上所述的融合蛋白。
本發明還提供了如上所述的融合蛋白用於製備預防和/或治療免疫疾病和/或癌症的藥物中的應用。
本發明的有益效果如下：首先，本發明提供的融合蛋白在保留了人白細胞介素10生物活性的同時，通過與免疫球蛋白IgG的Fc片段融合，延長了人白細胞介素10在生物體內的半衰期，增加了人白細胞介素10在體內的穩定性，能夠長時間抑制腫瘤生長，有利於其在疾病治療中的應用，其次，從純化工藝和生產角度而言，本發明採用基因工程技術進行融合蛋白的製備，通過連接肽將人白細胞介素10與免疫球蛋白IgG的Fc片段融合，提高了大分子融合蛋白的結構穩定性，不容易分解，產品均一性較好，便於純化，保證了純化後產品的純度，克服了IL-10 PEG化帶來的生產工藝和品質控制的麻煩。
此外，所述IL-10融合蛋白可用於相關疾病的治療，疾病包括免疫疾病和/或癌症，免疫疾病包括但不限於多發性硬化症、銀屑病、風濕性關節炎、克羅恩病等。所述癌症包括但不限於胰腺癌、非小細胞肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、腎癌、結直腸癌、乳腺癌等腫瘤。
下面結合以下實施例對本發明作進一步詳細說明。
實施例1
本發明實施例1提供了一種融合蛋白，融合蛋白是由人白細胞介素10通過連接肽與免疫球蛋白IgG的Fc片段融合而成；其中，Fc片段為人IgG1的Fc部分；人白細胞介素10的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示；Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示；
連接肽通式為［GlyGlyGlyGlySer］6
，連接肽的氨基酸序列如SEQ ID No:4所示。
其中，SEQ ID No:1（人白細胞介素10的氨基酸序列）；
SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN。
SEQ ID No:2（Fc片段的氨基酸序列）；
DKTHTCPPCPAPELEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKAYACAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
SEQ ID No:4（連接肽的氨基酸序列）；
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS。
融合蛋白的具體構型示意圖如圖1所示。
實施例2
本發明實施例2提供了一種融合蛋白，融合蛋白是由人白細胞介素10通過連接肽與免疫球蛋白IgG的Fc片段融合而成；其中，Fc片段為人IgG1的Fc部分；人白細胞介素10的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示；Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID No:3所示；
連接肽通式為［GlyGlyGlyGlySer］6
，連接肽的氨基酸序列如SEQ ID No:4所示。
其中，SEQ ID No:1和SEQ ID No:4提供的氨基酸序列與實施例1中相同；
SEQ ID No:3（Fc片段的氨基酸序列）；
EPKSCDKTHTCPPCPAPELEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKAYACAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
融合蛋白的具體構型示意圖如圖1所示。
實施例3
本發明實施例3提供了一種融合蛋白，融合蛋白是由人白細胞介素10通過連接肽與免疫球蛋白IgG的Fc片段融合而成；其中，Fc片段為人IgG2的Fc部分，Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID No:5所示；人白細胞介素10的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示；
連接肽通式為［GlyGlyGlyGlySer］6
，連接肽的氨基酸序列如SEQ ID No:4所示。
其中，SEQ ID No:1和SEQ ID No:4提供的氨基酸序列與實施例1中相同；
SEQ ID No:5（Fc片段的氨基酸序列）；
ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
融合蛋白的具體構型示意圖如圖1所示。
實施例4
本發明實施例4提供了一種融合蛋白，融合蛋白是由人白細胞介素10通過連接肽與免疫球蛋白IgG的Fc片段融合而成；其中，Fc片段為人IgG4的Fc部分，Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID No:6所示；人白細胞介素10的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示；
連接肽通式為［GlyGlyGlyGlySer］6
，連接肽的氨基酸序列如SEQ ID No:4所示。
其中，SEQ ID No:1和SEQ ID No:4提供的氨基酸序列與實施例1中相同；
SEQ ID No:6（Fc片段的氨基酸序列）；
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK。
融合蛋白的具體構型示意圖如圖1所示。
實施例5
本發明實施例5提供了一種融合蛋白，融合蛋白是由人白細胞介素10通過連接肽與免疫球蛋白IgG的Fc片段融合而成；其中，Fc片段為人IgG2的Fc部分，Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID No:5所示；人白細胞介素10的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示；
連接肽通式為［GlyGlyGlyGlySer］5
，連接肽的氨基酸序列如SEQ ID No:7所示。
其中，SEQ ID No:1提供的氨基酸序列與實施例1中相同；SEQ ID No:5提供的氨基酸序列與實施例3中相同；
SEQ ID No:7（連接肽的氨基酸序列）；
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS。
融合蛋白的具體構型示意圖如圖1所示。
實施例6
本發明實施例6提供了一種融合蛋白，融合蛋白是由人白細胞介素10通過連接肽與免疫球蛋白IgG的Fc片段融合而成；其中，Fc片段為人IgG4的Fc部分，Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID No:6所示；人白細胞介素10的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示；
連接肽通式為［GlyGlyGlyGlyAla］4
，連接肽的氨基酸序列如SEQ ID No:8所示。
其中，SEQ ID No:1提供的氨基酸序列與實施例1中相同，SEQ ID No:6提供的氨基酸序列與實施例4中相同；
SEQ ID No:8（連接肽的氨基酸序列）；
GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA。
融合蛋白的具體構型示意圖如圖1所示。
實施例7
本發明實施例7提供了一種融合蛋白，融合蛋白是由人白細胞介素10通過連接肽與免疫球蛋白IgG的Fc片段融合而成；其中，Fc片段為人IgG1的Fc部分；人白細胞介素10的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示；Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示；
連接肽通式為［GlyGlyGlyGlySer］3
，連接肽的氨基酸序列如SEQ ID No:9所示。
其中，SEQ ID No:1和 SEQ ID No:2提供的氨基酸序列與實施例1中相同；
SEQ ID No:9（連接肽的氨基酸序列）；
GGGGSGGGGSGGGGS。
融合蛋白的具體構型示意圖如圖1所示。
實施例8
本發明實施例8提供了一種融合蛋白，融合蛋白是由人白細胞介素10通過連接肽與免疫球蛋白IgG的Fc片段融合而成；其中，Fc片段為人IgG2的Fc部分，人白細胞介素10的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示；Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID No:5所示；
連接肽通式為［GlyGlyGlyGlyAla］3
，連接肽的氨基酸序列如SEQ ID No:10所示。
其中，SEQ ID No:1提供的氨基酸序列與實施例1中相同；SEQ ID No:5提供的氨基酸序列與實施例3中相同；
SEQ ID No:10（連接肽的氨基酸序列）；
GGGGAGGGGAGGGGA。
融合蛋白的具體構型示意圖如圖1所示。
實施例9
本發明實施例9提供了一種多核苷酸序列，多核苷酸序列編碼實施例1-8任一項提供的融合蛋白的氨基酸序列。
實施例10
本發明實施10提供了一種重組DNA表達載體，重組DNA表達載體包含實施例9提供的多核苷酸序列。
實施例11
本發明實施11提供了一種轉染實施例10中提供的重組DNA表達載體的宿主細胞，宿主細胞包括原核細胞、酵母細胞和哺乳動物細胞。
實施例12
本發明實施例12提供了一種藥物或藥物組合物，藥物或藥物組合物包含實施例1-8任一項提供的融合蛋白。
實施例13
本發明實施例13提供了一種融合蛋白用於製備治療免疫疾病和癌症藥物中的應用，其中，免疫疾病包括但不限於多發性硬化症、銀屑病、風濕性關節炎、克羅恩病等；癌症包括但不限於胰腺癌、非小細胞肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、腎癌、結直腸癌、乳腺癌等腫瘤。
實驗例1
本實驗例用來說明人白細胞介素10和本發明的融合蛋白表達載體的構建
按照實施例1-8並參考如圖1所示的分子構型示意圖，選擇pTSE（pTSE載體製備過程參見CN103525868A說明書第3頁第[0019]段以及實施例1）作為表達載體，編碼融合蛋白的基因由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，基因合成時，在合成基因兩側分別引入EcoRl、BamHI酶切位點，然後對pTSE表達載體和合成的編碼融合蛋白的基因均進行EcoRl、BamHI雙酶切，並將pTSE表達載體和編碼融合蛋白的基因的酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳和目的片段回收，最後將回收的目的片段分別連接到pTSE表達載體中，轉化到TOP感受態細胞（匯天東方，貨號HT702-03），測序正確後得到基因表達載體（如圖2所示），人白細胞介素10表達質粒命名為r1L-10，實施例1-8的融合蛋白的表達質粒按照表1分別命名為：IL-10-Fc-A、IL-10-Fc-B、IL-10-Fc-C、IL-10-Fc-D、IL-10-Fc-E、IL-10-Fc-F、IL-10-Fc-G、IL-10-Fc-H。
實驗例2
本實驗例用來說明人白細胞介素10和本發明的融合蛋白的表達和純化
I）、人白細胞介素10和融合蛋白表達質粒的獲得。
利用無內毒素大提試劑盒（購買于康為世紀生物科技有限公司，CW2104）進行質粒大提，具體操作步驟如下：
（1）取200µl活化的菌液置於500ml搖瓶（含200ml amp+ 的LB培養基）中，37℃，220rpm搖床過夜培養；
（2）取200 ml過夜培養的菌液，加入離心管中，在7000rpm下離心5分鐘收集細菌，儘量除盡全部上清；
（3）向留有菌體沉澱的離心管中加入12.5ml Buffer P1（已加入RNase A），使用渦旋振盪器充分混勻，懸浮細菌沉澱；
（4）向離心管中加入12.5 ml Buffer P2，溫和地上下顛倒混勻8-10次，使菌體充分裂解，室溫放置3-5分鐘，待溶液應變得清亮粘稠；
（5）向離心管中加入12.5 ml Buffer E3，立即上下顛倒混勻8-10次，此時出現白色絮狀沉澱，室溫放置5分鐘；在7000rpm下離心15分鐘，將上清全部倒入除內毒素篩檢程式（Endo-Remover FQ）中，慢慢推動推柄（Plungers）過濾，濾液收集在乾淨的50 ml離心管（自備）中；
（6）向濾液中加入10ml、0.3倍濾液體積的異丙醇，上下顛倒混勻；
（7）柱平衡：向已裝入收集管中的吸附柱（Spin Columns DQ）中加入2 ml Buffer PS，在7000rpm下離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中；
（8）將步驟6中濾液與異丙醇的混合溶液轉移到平衡好的吸附柱（已裝入收集管）中；
（9）在7000rpm下離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中；
（10）向吸附柱中加入10 ml Buffer PW（已加入無水乙醇），在7000rpm下離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液；
（11）重複步驟（10）一次；
（12）將吸附柱重新放回收集管中，7000rpm離心5分鐘，倒掉廢液，將吸附柱置於室溫數分鐘，以徹底晾乾吸附柱中殘餘的漂洗液；
（13）將吸附柱置於一個新的離心管中，向吸附膜的中間部位加入1ml無內毒素用水，室溫放置2-5分鐘，在7000rpm下離心5分鐘，將質粒溶液收集到離心管中；測定濃度後，於-20℃保存質粒。
II）、人白細胞介素10和融合蛋白表達質粒的暫態轉染。
人胚腎細胞（HEK293懸浮細胞，購自中國醫學科學院基礎醫學研究所，貨號為GNHu43）在FreeStyle 293 Expression Medium（Gibco）中培養，細胞每隔一到兩天傳代一次，傳代後細胞起始密度維持在0.2-0.6×106
個/ml，細胞培養體積為搖瓶容積的15-35%，細胞培養瓶放在搖床（搖床轉速:135rpm，溫度:37℃，CO2
:5%）中培養。轉染前一天，將處於對數生長期，生長狀態良好的HEK293細胞，傳代到細胞密度為0.5×106
個/ml，放置搖床（135rpm，37℃，5% CO2
）培養過夜，待第二天進行轉染。
轉染前將準備好的1×106
個/ml細胞懸液在搖床（135rpm，39℃，5% CO2
）培養2h，轉染時，依次加入上述步驟1）得到的9種質粒（終濃度1 µg/ml）、聚乙烯亞胺PEI（終濃度2µg/ml），混勻，一起共轉染到HEK293懸浮細胞中，之後，置於搖床（135rpm，39℃，5% CO2
）培養40min。轉染後的細胞繼續在135rpm，37℃，5% CO2
搖床中培養，表達人白細胞介素10和融合蛋白。轉染96小時後離心收穫上清液體。
III）、人白細胞介素10和融合蛋白的純化。
人白細胞介素10的純化：上清液體用0.22μM濾膜過濾，利用Ni柱從表達上清中獲得帶有His標籤結構域的人白細胞介素10。平衡緩衝液和洗脫緩衝液分別為50mM Tris-HCl、0.5M NaCl、20mM咪唑、pH7.6和50mM Tris-HCl、0.5M NaCl、0.5M咪唑、pH7.6。設置梯度洗脫條件：100%洗脫液，30min，5ml/min流速梯度洗脫，根據咪唑不同濃度變化，收集UV280檢測到的蛋白峰，標記好收峰位置，用PBS緩衝液進行換液濃縮。
融合蛋白的純化：上清液體用0.22μM濾膜過濾，利用HiTrap rProtein A親和層析柱從表達上清中獲得帶有Fc結構域的融合蛋白。平衡緩衝液和洗脫緩衝液分別為50mM Tris-HCl、0.15M NaCl、pH 7.0和0.1M檸檬酸-檸檬酸鈉、pH 3.0。通過陽離子交換柱HiTrap-SPFF獲得目標融合蛋白，最後用PBS緩衝液進行換液濃縮。得到純化後的人白細胞介素10和融合蛋白，如圖3所示，從左側到右側依次為蛋白質分子量Marker、rIL-10、IL-10-Fc-A、IL-10-Fc-B、IL-10-Fc-C、IL-10-Fc-D、IL-10-Fc-E、IL-10-Fc-F、IL-10-Fc-G、IL-10-Fc-H，每條帶的分子量大小與理論一致。
表1
實驗例3
| 實施例 | 藥物分子 | 人白細胞介素10氨基酸序列 | Fc 亞型 | Fc氨基酸序列 | 連接肽氨基酸序列 |
| 1 | IL-10-Fc-A | SEQ ID No:1 | IgG1 | SEQ ID No:2 | SEQ ID No:4 |
| 2 | IL-10-Fc-B | SEQ ID No:1 | IgG1 | SEQ ID No:3 | SEQ ID No:4 |
| 7 | IL-10-Fc-C | SEQ ID No:1 | IgG1 | SEQ ID No:2 | SEQ ID No:9 |
| 3 | IL-10-Fc-D | SEQ ID No:1 | IgG2 | SEQ ID No:5 | SEQ ID No:4 |
| 5 | IL-10-Fc-E | SEQ ID No:1 | IgG2 | SEQ ID No:5 | SEQ ID No:7 |
| 8 | IL-10-Fc-F | SEQ ID No:1 | IgG2 | SEQ ID No:5 | SEQ ID No:10 |
| 4 | IL-10-Fc-G | SEQ ID No:1 | IgG4 | SEQ ID No:6 | SEQ ID No:4 |
| 6 | IL-10-Fc-H | SEQ ID No:1 | IgG4 | SEQ ID No:6 | SEQ ID No:8 |
本實驗例用來說明本發明的融合蛋白在刺激小鼠肥大細胞MC/9增殖方面的效果
1、實驗細胞
名稱：小鼠肥大細胞MC/9
細胞培養基：RPMI1640（Gibico，A10491-01）+10% FBS（VisTech， SE200-ES）
來源：上海子實生物科技有限公司
細胞特性：該細胞表達內源性鼠白細胞介素10（IL-10）受體（R1和R2），在小鼠白細胞介素4（IL-4）（購自南京金斯瑞生物科技有限公司，貨號為Z02996）存在的情況下，IL-10可刺激MC/9小鼠肥大細胞株增殖。而單一的mIL-4或hIL-10則僅有很低的增殖刺激活性。
2、細胞鋪板及加藥
取對數生長期的MC/9細胞用空白1640培養基洗滌2次，懸於20% FCS-1640培養液，並調製濃度為2×105
個/ml，加入96孔板，1×104
個/孔，設置對照組和實驗組，分別給藥，單獨作用組中融合蛋白的給藥劑量是25ng/孔，聯合作用組中mIL-4和融合蛋白的給藥劑量分別為0.05ng/孔和25ng/孔，具體給藥情況如下表2所示。
表2
| 對照組 | 實驗組 | |
| 單獨作用組 | 聯合作用組 | |
| Medium | IL-10-Fc-A | mIL-4+IL-10-Fc-A |
| IL-10-Fc-B | mIL-4+IL-10-Fc-B | |
| rIL-10 | IL-10-Fc-C | mIL-4+IL-10-Fc-C |
| IL-10-Fc-D | mIL-4+IL-10-Fc-D | |
| mIL-4 | IL-10-Fc-E | mIL-4+IL-10-Fc-E |
| IL-10-Fc-F | mIL-4+IL-10-Fc-F | |
| rIL-10+mIL-4 | IL-10-Fc-G | mIL-4+IL-10-Fc-G |
| IL-10-Fc-H | mIL-4+IL-10-Fc-H |
37℃，5% CO2
培養箱中培養72小時後，加入CCK-8檢測液，37℃孵育2-4小時後在450nm處檢測OD值。
實驗結果如圖4所示，通過細胞增殖情況得知，本發明提供的融合蛋白IL-10-Fc-A、IL-10-Fc-B、IL-10-Fc-C、IL-10-Fc-D、IL-10-Fc-E、IL-10-Fc-F、IL-10-Fc-G、IL-10-Fc-H保留了人白細胞介素10生物活性，不同類型的融合蛋白均能刺激小鼠肥大細胞MC/9的增值，通過小鼠白細胞介素4（IL-4）共刺激，融合蛋白能夠顯著刺激細胞增殖。
實驗例4
本實驗例用來說明本發明的融合蛋白對SK-BR-3腫瘤細胞體外殺傷作用
1、靶細胞
名稱：人乳腺癌細胞SK-BR-3
維持培養基：RPMI1640（Gibico，A10491-01）+10%FBS（VisTech， SE200-ES）
實驗培養基：RPMI1640（Gibico，A10491-01）+10%滅活FBS（VisTech， SE200-ES）
來源：購買自ATCC，編號為 HTB-30；
2、靶細胞鋪板及血清滅活
提前一天將SK-BR-3細胞消化後，維持培養基重懸計數，鋪于平底96孔板中，5×103
個/100µl/孔，過夜培養，待細胞貼壁。
取一管完全融化的FBS，置於60℃水浴鍋中，作用40min，即獲得滅活血清。
3、效應細胞——人單個核細胞（PBMC）分離
在50ml管中加入20ml單個核細胞分離液；用全血稀釋液將採集到的血液按1:1比例進行稀釋處理，混勻後沿康寧管內壁勻速緩慢的鋪至分離液上層，每管內加入稀釋後全血體積為20ml；待各管加液完畢後放入提前預冷至22℃的離心機內，600g水準離心15min（加減速設置為1）；離心完成後取出離心管，用移液器小心吸取置於分離液和血清間呈圓弧狀分佈的細胞層—單個核細胞（PBMC），置於新的50ml管中；按照1:5比例在細胞液中加入細胞洗滌液，充分混勻後離心，棄上清，再重複洗滌一次，收集細胞沉澱，用RPMI-1640培養基重懸；將單個核細胞（PBMC）調整細胞數目為2.5×106
個/ml；
4、藥物稀釋及鋪板加藥
將實驗例2中得到的8種藥物分子（IL-10-Fc-A、IL-10-Fc-B、IL-10-Fc-C、IL-10-Fc-D、IL-10-Fc-E、IL-10-Fc-F、IL-10-Fc-G、IL-10-Fc-H）用實驗培養基稀釋，使其作用終濃度為200µg/ml，設置3個複孔。
將96孔板內的生長培養基棄去，滅菌PBS輕柔洗一次，每孔加入100µl實驗用培養基。將調整數目的PBMC細胞和稀釋後的藥物分子先後加入96孔板內，PBMC與靶細胞的效靶比為50:1。
設置空白靶細胞、空白PBMC對照組，每組分別只含有靶細胞和效應細胞，每組3個複孔；同時設置效應細胞/靶細胞混合作用孔，共計6孔。其中3孔設為最大殺傷組，在檢測前30min加入裂解液，完全裂解殺死細胞；其餘3孔為自然殺傷組（自然殺傷組中分別加入IL-10-Fc-A、IL-10-Fc-B、IL-10-Fc-C、IL-10-Fc-D、IL-10-Fc-E、IL-10-Fc-F、IL-10-Fc-G、IL-10-Fc-H），作為融合蛋白殺傷作用的對照（TARGET+PBMC）。空白靶細胞、空白PBMC及最大殺傷組均用於進行細胞死亡率計算。標示清晰後，置於37℃細胞培養箱孵育。
5、檢測及殺傷率計算
3天后鏡檢可見明顯靶細胞數目減少，取上清液進行LDH檢測，酶標儀讀取OD490後，進行細胞死亡率計算。計算公式為：
| 細胞死亡率（%）= | 實驗孔-空白靶細胞-空白PBMC | × 100% |
| 最大殺傷孔-空白靶細胞-空白PBMC |
實驗結果如圖5所示，與對照組PBMC+TARGET相比，實施例1-8提供的8種融合蛋白均能特異性殺傷SK-BR-3腫瘤細胞，其中IL-10-Fc-A、IL-10-Fc-B、IL-10-Fc-D、IL-10-Fc-G的殺傷能力較強，細胞死亡率均在60%以上，殺傷能力最強的為IL-10-Fc-A融合蛋白。
實驗例5
本實驗例用來說明本發明的融合蛋白在小鼠H1975腫瘤模型中的藥效
1、實驗動物：
種屬品系：Mus Musculus，NCG，小鼠
周齡：6-8 周
實驗動物提供商: 江蘇集萃藥康生物科技有限公司。
2、細胞培養：用含有滅活的10%胎牛血清，100 U/ml 的青黴素和100 µg/ml 的鏈黴素以及2 mM穀氨醯胺的RPMI-1640培養基在37℃、5% CO2
的培養箱中培養腫瘤細胞（購自ATCC，貨號為CRL-5908），每隔3至4天待細胞長滿後分瓶傳代，將處於對數生長期的腫瘤細胞用於體內腫瘤的接種。
3、腫瘤細胞的接種與分組：
將H1975細胞用PBS洗滌細胞兩次，然後重懸腫瘤細胞於PBS，得到NCI-H1975人非小細胞肺癌細胞，並將NCI-H1975人非小細胞肺癌細胞接種於PBMC人源化的NCG小鼠皮下，細胞接種量為5×106
/小鼠；PBMC來源於正常人外周血，於H1975細胞接種前三天接種至荷瘤鼠體內，2×106
/小鼠。在腫瘤接種後待腫瘤生長至約100 mm3
時分組給藥，共6組，每組8只動物，分別為溶媒對照組、rIL-10組、IL-10-Fc-A組、IL-10-Fc-B組、IL-10-Fc-D組、IL-10-Fc-G組（1 mg/kg，s.c.，biw × 4 Weeks）。
4、檢測指標：每週使用遊標卡尺對腫瘤體積進行2次的測量，測量腫瘤的長徑和短徑，其體積計算公式為：體積=0.5×長徑×短徑2
；記錄荷瘤鼠腫瘤體積的變化與給藥時間的關係，實驗結果如圖6所示。
通過圖6中資料顯示，與溶媒對照組相比，給藥組對腫瘤生長具有抑制能力，與給藥組rIL-10相比，隨著時間的延長，給藥組IL-10-Fc-A、給藥組IL-10-Fc-B、給藥組IL-10-Fc-D和給藥組IL-10-Fc-G對腫瘤生長的抑制作用都比較強，對腫瘤生長的抑制效果明顯優於人白細胞介素10，其中融合蛋白IL-10-Fc-A對腫瘤生長的抑制效果最好。
實驗例6
本實驗例用來說明本發明的融合蛋白對人源化異種移植非小細胞肺癌H1975腫瘤模型中的體內藥效實驗
1、實驗動物：
種屬品系：Mus Musculus，NCG，小鼠；
周齡：6-8 周；
體重：18-22 g；
動物數量：32只；
實驗動物提供商: 江蘇集萃藥康生物科技有限公司。
2、細胞培養：用含有滅活的10%胎牛血清，100 U/ml 的青黴素和100 µg/ml 的鏈黴素以及2 mM穀氨醯胺的RPMI-1640培養基在37℃、5% CO2
的培養箱中培養腫瘤細胞（購自ATCC，貨號為CRL-5908），每隔3至4天待細胞長滿後分瓶傳代，將處於對數生長期的腫瘤細胞用於體內腫瘤的接種。
3、腫瘤細胞的接種與分組：
用PBS洗滌H1975細胞兩次，然後重懸腫瘤細胞於PBS，得到NCI-H1975人非小細胞肺癌細胞，並將NCI-H1975人非小細胞肺癌細胞接種於實驗動物的右側脅肋部皮下，100ul/小鼠，細胞接種量為5×106
/小鼠；PBMC來源於正常人外周血，於NCI-H1975細胞接種前三天接種至荷瘤鼠體內，2×106
/小鼠。待腫瘤體積生長至50-80mm3
左右時分組給藥，共4組，每組8只動物，具體給藥方案見下表3所示。
表3
| 組別 | 動物數 | 治療 | 劑量 | 給藥途徑 | 給藥週期 |
| 1 | 8 | 溶媒對照組 | - | 皮下注射 | 每週2次，給藥6次 |
| 2 | 8 | 融合蛋白 IL-10-Fc-A | 1.0 mg/kg | 皮下注射 | 每週2次，給藥6次 |
| 3 | 8 | 融合蛋白 IL-10-Fc-A | 0.1 mg/kg | 皮下注射 | 每週2次，給藥6次 |
| 4 | 8 | 融合蛋白 IL-10-Fc-A | 0.01mg/kg | 皮下注射 | 每週2次，給藥6次 |
4、檢測指標：
a.腫瘤體積：每週使用遊標卡尺對腫瘤體積進行2次的測量，測量腫瘤的長徑和短徑，其體積計算公式為：體積=0.5×長徑×短徑2
。
b.動物給藥後的反應：在進行腫瘤體積測量的同時，稱量小鼠體重。記錄小鼠體重的變化與給藥時間的關係。同時觀察小鼠的存活情況和健康狀況如給藥期間動物活動、進食等一般狀態。
c.腫瘤瘤體拍照：實驗結束時，將小鼠安樂死，剝離腫瘤，並將對照組和受試組剝離的腫瘤擺放整齊進行拍照。
5、藥物評價指標：
a.腫瘤生長抑制率（%）；
腫瘤生長抑制率（%）=（1－T/C）×100%；
T/C =治療組RTV／對照組RTV；
腫瘤生長抑制率≥60%，並經統計學處理p＜0.05為有效。
b.治療組/對照組腫瘤體積比T/C(%)；
治療組/對照組腫瘤體積比T/C (%) =治療組RTV／對照組RTV×100%；
療效評價標準：T/C (%)＞40%為無效，T/C (%) ≤40%且p＜0.05為有效。
6、免疫學評價指標：實驗分組（分組後3天內）和末次給藥24小時（實驗結束）時取血，分離PBMC，檢測人源CD45；實驗結束時收集腫瘤，製備細胞懸液，檢測CD3/CD8/INF-r/CD4/CD25/FOXP3/PD-1/LAG3。
7、統計學分析
應用One-Way ANOVA檢驗對腫瘤體積進行組間統計學分析，P ＜ 0.05認為有顯著性差異，實驗結果如圖7所示。
如圖7所示，與溶媒對照組相比，給藥組對腫瘤的生長具有抑制能力，不同的給藥劑量對腫瘤的抑制能力顯示出明顯的量效關係。融合蛋白IL-10-Fc-A的給藥劑量越高，對腫瘤的抑制能力越強，給藥劑量在0.01mg/kg仍然具有對腫瘤的抑制能力，為此可以證明，本發明提供的融合蛋白IL-10-Fc-A能夠用於治療腫瘤疾病。
本發明不局限於上述具體實施方式，任何人在本發明的啟示下都可得出其他各種形式的產品，但不論在其形狀或結構上作任何變化，凡是具有與本發明相同或相近似的技術方案，均落在本發明的保護範圍之內。
圖1為本發明的融合蛋白分子結構示意圖；
圖2為人白細胞介素10和本發明的融合蛋白表達載體；
圖3為人白細胞介素10和本發明的融合蛋白的變性聚丙烯醯胺凝膠電泳；
圖4為人白細胞介素10和本發明的融合蛋白刺激小鼠肥大細胞MC/9增殖；
圖5為本發明的融合蛋白對SK-BR-3腫瘤細胞的殺傷；
圖6為本發明的融合蛋白在小鼠H1975腫瘤模型中的藥效作用；以及
圖7為本發明的融合蛋白對人源化異種移植非小細胞肺癌H1975腫瘤模型中的體內藥效圖。
Claims (10)
- 一種含人白細胞介素10和Fc片段的融合蛋白，其特徵在於，所述融合蛋白由人白細胞介素10通過連接肽與免疫球蛋白IgG的Fc片段融合而成，其中，所述Fc片段為人IgG1的Fc片段、人IgG2的Fc片段或人IgG4的Fc片段；人IgG4的Fc片段包括SEQ ID No:6所示的氨基酸序列；所述人白細胞介素10包括SEQ ID No:1所示的氨基酸序列。
- 如請求項1之融合蛋白，其中，所述Fc片段為人IgG1的Fc片段。
- 如請求項2之融合蛋白，其中，所述Fc片段包括SEQ ID No:2或SEQ ID No:3所示的氨基酸序列。
- 如請求項1之融合蛋白，其中，所述連接肽的通式為［GlyGlyGlyGlyX］n；其中，X為Ser或Ala，n為1-6的整數；較佳地，X為Ser。
- 如請求項4之融合蛋白，其中，n為6。
- 一種多核苷酸序列，其特徵在於，所述多核苷酸序列編碼請求項1-5中任一項所述的融合蛋白的氨基酸序列。
- 一種重組DNA表達載體，其特徵在於，所述重組DNA表達載體包含請求項6所述的多核苷酸序列。
- 一種轉染有如請求項7的所述重組DNA表達載體的宿主細胞，其特徵在於，所述宿主細胞包括原核細胞、酵母細胞和哺乳動物細胞中的至少一種。
- 一種藥物或藥物組合物，其特徵在於，所述藥物或藥物組合物包含請求項1-5中任一項所述的融合蛋白。
- 一種如請求項1-5中任一項所述的融合蛋白用於製備預防和/或治療免疫疾病和/或癌症的藥物中的應用。
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