KR20240046248A - 이중특이성 항체 및 이의 응용 - Google Patents

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치강 티안
양양 리
시치 씨에
민후아 첸
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상하이 엔케이 쎌 테크 씨오., 엘티디.
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Abstract

이중특이성 항체 및 이의 응용으로서, 상기 이중특이성 항체는 IL-21 분자; 및 CD16a 항체를 포함하고, 상기 CD16a 항체는 CD16a 단일 사슬 항체 및 FC를 포함하며, 상기 FC의 N-말단은 상기 단일 사슬 항체의 C-말단에 연결되고, 상기 CD16a 단일 사슬 항체는 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역을 포함하며; 상기 FC의 C-말단은 상기 IL21 분자의 N-말단에 연결된다. 제조된 이중특이성 항체는 CD16 및 IL-21 수용체를 동시에 표적으로 할 수 있고, NK 세포를 활성화하며, 반감기가 길고, 단일 표적 항체에 비해 더 강력한 항종양, 항바이러스 능력을 나타내며, 아울러NK 세포 증식을 촉진하여 시험관 내에서 NK 세포를 배양하고 증폭하는 데 사용될 수 있는 응용 잠재력을 갖고, 증폭된 NK 세포는 우수한 세포 독성을 갖는다.

Description

이중특이성 항체 및 이의 응용
[우선권 정보]
본원 발명은 2021년 12월 20일 중국국가지식재산권국에 제출된 특허 번호가 202111564703.3인 특허 출원의 우선권 및 권리를 주장하는 바, 그 전문은 여기에 참조로서 인용된다.
[기술분야]
본 발명은 생물의학 분야에 속하는 것으로, 구체적으로는 이중특이성 항체 및 이의 응용에 관한 것이고, 보다 구체적으로는 약물의 제조에 있어서 재조합 항체, 면역 세포, 핵산, 발현 벡터, 재조합 세포, 조성물, 상기 물질의 용도 및 키트에 관한 것이다.
이중특이성 항체는 2개의 항원 부위에 동시에 특이적으로 결합할 수 있는 항체이다. NK 세포는 선천 면역 체계의 주요 이펙터 세포로, T 세포에 비해 사전 자극 없이 퍼포린, 그랜자임 및 관련 메커니즘을 사용하여 MHC 제한 없이 종양 세포와 바이러스 감염 세포를 사멸할 수 있다. NK 세포는 수많은 활성화 수용체를 발현하고, 인식 종양 세포 또는 감염 세포에 의해 생성된 스트레스 리간드를 효과적으로 인식하여 종양 세포를 효과적으로 사멸할 수 있지만, 동시에 종양 세포는 또한 많은 면역 억제 분자를 분비 및 생성하여 면역 억제 종양 미세환경을 형성하고, 이러한 환경에 처한 NK 세포의 활성 및 항종양 능력의 발휘를 억제하며; NK 세포를 고갈 상태로 만든다. 현재에는 면역 체크포인트 차단, 항체 활성화, 사이토카인 활성화 등과 같이 종양 미세환경에서 NK 세포 고갈을 복원하기 위한 많은 전략도 있는데, 이러한 방법은 NK 세포에 활성화 신호를 제공하거나 종양 미세환경에서 억제 신호를 차단하여 NK 세포가 정상적인 활성화 상태로 복원되어 항종양 또는 항바이러스 기능을 발휘하도록 할 수 있다.
CD16a는 NK 세포에서 발현되는 중요한 활성화 수용체로, CD16a가 리간드 또는 항체와 결합되어 활성화된 후, 다양한 캐스케이드 활성화 반응을 유도하고, 그랜자임, 퍼포린, 염증성 사이토카인 및 케모카인을 방출함으로써, NK 세포에 강력한 활성화 효과와 향상된 항종양 능력을 가져다 준다. IL-21R(IL-21 수용체)는 NK 세포에서 구성적으로 발현되는 사이토카인 수용체로, 대응되는 리간드 IL-21 분자에 의해 인식되고 결합되어 활성화된 후, 마우스 NK 세포의 경우에는 이러한 과정이 이들 NK 세포의 입자를 더 많이 촉진하고 퍼포린의 발현을 상향 조절하며 IFN-γ의 분비를 증가시키고 효능 활성을 촉진하며; 인간 NK 세포의 경우에는 이러한 과정이 IFN-γ 분비를 증가시키고 증식 및 NK 세포 독성 활성을 증가시키는 동시에 NK 세포 성숙 및 NK 세포 수용체 발현을 가속화할 수 있다. 따라서, 표적성이 강한 이중특이성 항체의 개발은 종양의 예방 및 치료에 큰 가치가 있다.
본 발명은 다음과 같은 사실 및 문제에 대한 발명자의 발견과 이해를 기반으로 하여 제안된 것이다.
본 발명에서, 발명자는 CD16a 항체 및 IL-21 분자를 조합하여 재조합 이중특이성 항체를 설계하였는데, 상기 재조합 이중특이성 재조합 항체는 CD16a 및 IL-21 수용체(IL-21R)에 특이적으로 결합할 수 있어 IL-21 분자와 CD16a 항체를 표적화된 방식으로 NK 세포 근처로 이동시켜 NK 세포 상의 CD16a 및/또는 IL-21R와 결합시킴으로써, 다양한 캐스케이드 활성화 반응을 유도하여 NK 세포를 활성화시키고, 종양 미세환경에서 NK 세포의 고갈을 회복시키는 동시에 IFN-γ 분비를 증가시키고, 증식 및 NK 세포 독성 활성을 향상시키며, 아울러 NK 세포 성숙 및 NK 세포 수용체의 발현을 가속화하여 종양 세포 또는 바이러스 감염 세포를 사멸하고, 상기 재조합 이중특이성 항체는 높은 CD16a 및 IL-21R 결합 활성을 가지며, 높은 항종양, 항바이러스 능력을 갖는다.
따라서, 본 발명의 제1 양태에서, 본 발명은 재조합 항체를 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, IL-21 분자; 및 CD16a 항체를 포함하고, 상기 CD16a 항체는 CD16a 단일 사슬 항체 및 Fc 영역을 포함하며, 상기 Fc 영역의 N-말단은 상기 단일 사슬 항체의 C-말단에 연결되고, 상기 CD16a 단일 사슬 항체는 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역을 포함하며; 상기 FC의 C-말단은 상기 IL21 분자의 N-말단에 연결된다. 본 발명의 실시예에 따른 재조합 항체는 CD16a, IL-21R에 효과적으로 결합할 수 있고, 생체 내 및 시험관 내에서 강력한 결합 활성을 가지며, NK 세포를 효과적으로 활성화할 수 있고, 생체 내 반감기가 길며, 현저한 항종양, 항바이러스 효과가 있다.
본 발명의 제2 양태에서, 본 발명은 핵산을 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 핵산은 제1 양태에 따른 재조합 항체를 코딩한다. 본 발명의 실시예에 따른 핵산에 의해 코딩된 재조합 항체는 CD16a, IL-21R에 효과적으로 결합할 수 있고, 생체 내 및 시험관 내에서 강력한 결합 활성을 가지며, NK 세포를 효과적으로 활성화할 수 있고, 생체 내 반감기가 길며, 현저한 항종양, 항바이러스 효과가 있다.
본 발명의 제3 양태에서, 본 발명은 발현 벡터를 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 발현 벡터는 제2 양태에 따른 핵산을 보유한다. 상기 발현 벡터는 선택적 제어 서열을 포함할 수 있고, 상기 제어 서열은 상기 핵산 분자에 작동 가능하게 연결된다. 여기서, 상기 제어 서열은 숙주에서 상기 핵산 분자의 발현을 지시할 수 있는 하나 이상의 제어 서열이다. 본 발명의 실시예에서 제안하는 발현 벡터는 적합한 숙주 세포에서 상기 재조합 항체를 고효율적으로 발현시킬 수 있어, NK 세포를 효과적으로 활성화시켜 종양 또는 바이러스 감염으로 인한 질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
본 발명의 제4 양태에서, 본 발명은 재조합 세포를 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 재조합 세포는 제2 양태에 따른 핵산 분자, 제3 양태에 따른 발현 벡터 또는 제1 양태에 따른 재조합 항체를 보유한다. 상기 재조합 세포는 상기 발현 벡터를 형질감염 또는 형질전환시켜 획득된다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 재조합 세포는 적합한 조건에서 상기 재조합 항체를 고효율적으로 발현시킬 수 있고, 상기 재조합 세포는 종양 또는 바이러스 감염으로 인한 질환의 치료 또는 예방에 효과적으로 사용되어 NK 세포를 효과적으로 활성화할 수 있다.
본 발명의 제5 양태에서, 본 발명은 조성물을 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 제1 양태에 따른 재조합 항체, 제2 양태에 따른 핵산 분자, 제3 양태에 따른 발현 벡터 또는 제4 양태에 따른 재조합 세포를 포함한다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 실시예의 재조합 항체는 CD16a 및 IL-21R 단백질 분자에 효과적으로 결합할 수 있어, 상기 IL-21R 및/또는 CD16a를 고발현하는 NK 세포를 특이적으로 인식하여 NK 세포를 효과적으로 활성화시킬수 있으며, 상기 재조합 항체를 포함하는 조성물도 마찬가지로 종양 또는 바이러스 감염으로 인한 질환을 치료 또는 예방하는 현저한 작용이 있고, 항종양 및 항바이러스 능력이 상당하다.
본 발명의 제6 양태에서, 본 발명은 약물의 제조에 있어서 제1 양태에 따른 재조합 항체, 제2 양태에 따른 핵산 분자, 제3 양태에 따른 발현 벡터, 제4 양태에 따른 재조합 세포 또는 제5 양태에 따른 조성물의 용도를 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 약물은 종양 또는 바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 데 사용된다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 실시예의 재조합 항체는 CD16a 및 IL-21R 단백질에 효과적으로 결합할 수 있어, 상기 IL-21R 및/또는 CD16a를 고발현하는 NK 세포를 특이적으로 인식할 수 있으며, 상기 재조합 항체 및 그에 상응하는 일련의 물질을 이용하여 제조된 약물도 마찬가지로 종양 또는 바이러스 감염으로 인한 질환을 치료 또는 예방하는 현저한 작용이 있고, 항종양 및 항바이러스 능력이 상당하다.
본 발명의 제7 양태에서, 본 발명은 NK 세포의 배양 및 증폭에 있어서 제1 양태에 따른 재조합 항체, 제2 양태에 따른 핵산 분자, 제3 양태에 따른 발현 벡터 및 제4 양태에 따른 재조합 세포의 용도를 제안한다. 본 발명의 실시예에 따른 재조합 항체, 핵산 분자, 발현 벡터 및 상기 재조합 세포는 시험관 내에서 상기 NK 세포의 증식, 증폭을 촉진하는 데 사용될 수 있으며, 증폭된 NK 세포는 우수한 세포 독성을 갖는다.
본 발명의 제8 양태에서, 본 발명은 약물을 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 제1 양태에 따른 재조합 항체, 제2 양태에 따른 핵산 분자, 제3 양태에 따른 발현 벡터, 제4 양태에 따른 재조합 세포 또는 제5 양태에 따른 조성물을 포함하고, 상기 약물은 종양 또는 바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 데 사용된다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따른 재조합 항체는 CD16a 및 IL-21R 단백질에 효과적으로 결합할 수 있어, 상기 IL-21R 및/또는 CD16a를 고발현하는 NK 세포를 특이적으로 인식할 수 있으며, 상기 재조합 항체 및 그에 상응하는 일련의 물질을 이용하여 제조된 약물도 마찬가지로 종양 또는 바이러스 감염으로 인한 질환을 치료 또는 예방하는 현저한 작용이 있고, 항종양 및 항바이러스 능력이 상당하다.
본 발명의 제9 양태에서, 본 발명은 키트를 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 제1 양태에 따른 재조합 항체를 포함한다. 본 발명의 실시예에 따른 재조합 항체는 CD16a 및 IL-21R 단백질 분자에 효과적으로 결합할 수 있어, 상기 IL-21R 또는 CD16a를 특이적으로 고발현하는 NK 세포를 특이적으로 인식할 수 있다. 따라서, 상기 재조합 항체는 CD16a 및/또는 IL-21R을 검출하는 키트의 제조에 사용될 수 있다, 상기 키트는 생물학적 샘플에서 CD16a 및/또는 IL-21R 단백질 분자의 정성적 또는 정량적 검출과 같은 과학적 연구에 사용되어 요구 사항을 충족하는 생물학적 샘플을 얻을 수 있다.
본 발명의 제10 양태에서, 본 발명은 종양 또는 바이러스 감염의 치료 또는 예방에 있어서 전술한 재조합 항체, 핵산 분자, 발현 벡터, 재조합 세포, 조성물 또는 약물의 용도를 제안한다. 전술한 바와 같이, 상기 재조합 항체는 상기 CD16a 및 IL-21R 단백질을 특이적으로 인식할 수 있어, 상기 IL-21R 또는 CD16a를 특이적으로 고발현하는 NK 세포를 특이적으로 인식하여 NK 세포를 효과적으로 활성화시키고, IFN-γ 분비를 강화하며, 증식 및 NK 세포 독성 활성을 향상시키고, 종양 세포를 효과적으로 사멸시키는 동시에 NK 세포 성숙 및 NK 세포 수용체의 발현을 가속화함으로써 종양 미세환경에서 NK 세포의 고갈을 효과적으로 회복시킬 수 있으므로, 본 발명의 실시예에 따른 재조합 항체, 상기 재조합 항체를 포함하는 조성물, 약물 또는 적합한 조건에서 발현되어 상기 재조합 항체를 얻을 수 있는 상기 핵산 분자, 발현 벡터, 재조합 세포 등과 같은 일련의 물질들은 모두 NK 세포를 효과적으로 활성화시켜 종양 또는 바이러스 감염을 치료 또는 예방할 수 있다.
본 발명의 제11 양태에서, 본 발명은 종양 또는 바이러스 감염의 치료 또는 예방 방법을 제안한다. 본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 대상체에게 1) 전술한 재조합 항체; 2) 전술한 핵산 분자; 3) 전술한 발현 벡터; 4) 전술한 재조합 세포; 5) 전술한 조성물; 또는 6) 전술한 약물 중 적어도 하나를 투여하는 것을 포함한다. 전술한 바와 같이, 상기 재조합 항체는 상기 CD16a 및 IL-21R 단백질을 특이적으로 인식할 수 있어, 상기 IL-21R 또는 CD16a를 특이적으로 고발현하는 NK 세포를 특이적으로 인식하여 NK 세포를 효과적으로 활성화시키고, IFN-γ 분비를 강화하며, 증식 및 NK 세포 독성 활성을 향상시키고, 종양 세포를 효과적으로 사멸시키는 동시에 NK 세포 성숙 및 NK 세포 수용체의 발현을 가속화함으로써 종양 미세환경에서 NK 세포의 고갈을 효과적으로 회복시킬 수 있으므로, 본 발명의 실시예에 따른 재조합 항체, 상기 재조합 항체를 포함하는 조성물, 약물 또는 적합한 조건에서 발현되어 상기 재조합 항체를 얻을 수 있는 상기 핵산 분자, 발현 벡터, 재조합 세포 등과 같은 일련의 물질들은 모두 NK 세포를 효과적으로 활성화시켜 종양 또는 바이러스 감염을 치료 또는 예방할 수 있다.
본 발명의 부가적 양태 및 이점은 부분적으로는 아래 설명에서 제시될 것이며, 부분적으로는 아래 설명으로부터 명백해지거나 본 발명의 실천을 통해 이해될 수 있다.
본 발명의 상기 및/또는 부가적 양태 및 이점은 아래 도면과 함께 제시된 실시예의 설명으로부터 명백해지고 쉽게 이해될 것이다. 여기서,
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 이중특이성 항체 발현 벡터의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 재조합 이중특이성 항체의 구조 모식도로서, Linker1은 연결 펩티드 1을 나타내고, Linker2는 연결 펩티드 2를 나타내며, Anti-CD16A는 CD16A 단일 사슬 항체를 나타내고, Hinge는 힌지 영역을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 재조합 이중특이성 항체 anti-CD16A-FCγ4-IL21 발현 클론을 스크리닝한 분석 결과도로서, 여기서,
도 A(3-A)는 DB, Dot blot, 도트 혼성화 검출 결과도이고,
도 B(3-B)는 WB: Western blot, 면역 블로팅(항-Human FCγ4 항체) 검출 결과도이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 재조합 이중특이성 항체 anti-CD16A-FCγ4-IL21 발효 발현의 분석 결과도로서, 여기서,
도 A(4-A)는 발효 과정의 각 파라미터를 모니터링한 결과도이고,
도 B(4-B)는 목적 단백질 누적 시점의 검출 결과도이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 재조합 이중특이성 항체 anti-CD16A-FCγ4-IL21의 정제 및 물리화학적 동정 결과도로서, 여기서,
도 A(5-A)는 anti-CD16A-FCγ4-IL21 단백질 순도에 대한 SDS-PAGE 검출 결과도이고,
도 B(5-B)는 anti-CD16A-FCγ4-IL21의 동적 광산란 검출 결과도이며, 그 중 3개의 실선은 동일한 처리의 3회 반복을 나타내고,
도 C(5-C)는 anti-CD16A-FCγ4-IL21의 HPLC 검출 결과도이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 재조합 이중특이성 항체 anti-CD16A-FCγ4-IL21에 의해 시험관 내에서 활성화된 NK 세포의 활성 검출 결과도로서, 그 중 횡좌표는 anti-CD16A-FCγ4-IL21 활성화 후 PBMC에서 NK 세포의 표면 발현이 변화하는 분자를 나타내고, 종좌표 Positive rate of NK surface molecules(%)는 NK 세포 표면 분자의 양성률(발현 상황)을 나타낸다.
도 7은 본 발명의 실시예에 따른 이중특이성 항체 분자 anti-CD16a-FCγ4-IL21에 의해 시험관 내에서 유도된 NK 세포 증폭 및 증폭 효과의 검출 결과도로서, 여기서,
도 A(7-A)는 이중특이성 항체 분자 anti-CD16a-FCγ4-IL21에 의해 시험관 내에서 유도된 NK 세포 증폭을 도시하는 것으로, 횡좌표 Day는 일수를 나타내고, 종좌표 NK Percentage(%)는 NK 세포의 점유율을 나타내며,
도 B(7-B)는 이중특이성 항체 분자 anti-CD16a-FCγ4-IL21에 의해 시험관 내에서 유도된 NK 세포 증폭 결과도로서, 횡좌표 Day는 일수를 나타내고, 종좌표 Fold increase of NK cell number은 증폭 시스템에서 NK 세포의 증폭 배수를 나타내며,
도 C(7-C)는 이중특이성 항체 분자 anti-CD16a-FCγ4-IL21에 의해 시험관 내에서 유도된 NK 세포 증폭 결과도로서, 횡좌표 Day는 일수를 나타내고, 종좌표 Fold increase of cell number은 증폭 시스템에서 전체 세포의 증폭 배수를 나타내며,
도 D(7-D)는 이중특이성 항체 분자 anti-CD16a-FCγ4-IL21이 시험관 내에서 증PBMC 유래 NK 세포를 증폭시킨 후 얻은 세포 하위 유형 분석 결과도로서, 횡좌표는 세포 하위집단 분류를 나타내고, 종좌표 Percentage(%)는 평균 세포 비율을 나타내며,
도 E(7-E)는 이중특이성 항체 분자 anti-CD16a-FCγ4-IL21에 의해 증폭되어 얻어진 NK 세포의 세포 독성 검출 결과도로서, 횡좌표는 CD56양성 세포와 K562 세포의 비율을 나타내고, 종좌표 Specific killing(%)는 사멸된 특정 세포의 비율을 나타낸다.
이하, 본 발명의 실시예를 상세히 설명한다. 이하에서 설명되는 실시예는 예시적인 것이며, 본 발명을 해석하기 위한 것일 뿐 본 발명을 한정하는 것으로 이해해서는 안된다.
이 밖에, 용어 “제1”, “제2”는 설명의 목적으로만 사용될 뿐 상대적인 중요성을 지시하거나 암시하거나 지시된 기술적 특징의 수를 암시적으로 나타내는 것으로 이해해서는 안된다. 이에 따라, “제1”, “제2”로 한정된 특징은 이러한 특징 중 적어도 하나를 명시적 또는 암시적으로 포함할 수 있다. 본 발명의 설명에 있어서, “복수”는 달리 명확하고 구체적으로 한정하지 않는 한, 2개, 3개 등 적어도 2개를 의미한다.
재조합 항체
본 발명의 일 양태에서, 본 발명은 재조합 항체를 제안하며, 이는 IL-21 분자; 및 CD16a 항체를 포함하고, 상기 CD16a 항체는 CD16a 단일 사슬 항체 및 Fc 영역을 포함하며, 상기 Fc 영역의 N-말단은 상기 단일 사슬 항체의 C-말단에 연결되고, 상기 CD16a 단일 사슬 항체는 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역을 포함하며; 상기 FC의 C-말단은 상기 IL21 분자의 N-말단에 연결된다. 본 발명의 실시예에 따른 재조합 항체는 CD16a, IL-21R에 효과적으로 결합할 수 있고, 생체 내 및 시험관 내에서 강력한 결합 활성을 가지며, NK 세포를 효과적으로 활성화할 수 있고, 생체 내 반감기가 길며, 현저한 항종양, 항바이러스 효과가 있다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 재조합 항체는 다음과 같은 부가적 기술 특징 중 적어도 하나를 더 포함할 수도 있다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 연결 펩티드 1을 더 포함하고, 상기 연결 펩티드 1의 N-말단은 상기 CD16a 단일 사슬 항체의 중쇄 가변 영역의 C-말단에 연결되며, 상기 연결 펩티드 1의 C-말단은 상기 CD16a 단일 사슬 항체의 경쇄 가변 영역의 N-말단에 연결된다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 연결 펩티드 1은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 1).
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 연결 펩티드 2를 더 포함하고, 상기 연결 펩티드 2의 N-말단은 상기 IL-21 분자의 C-말단에 연결되며, 상기 연결 펩티드 2의 C-말단은 상기 Fc 영역의 N-말단에 연결된다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 연결 펩티드 2는 SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 2).
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 Fc 영역의 적어도 일부는 쥐 항체, 인간 항체, 영장류 항체 또는 이들의 돌연변이체 중 적어도 하나로부터 유래된다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 Fc 영역의 적어도 일부는 인간 IgG 또는 그의 돌연변이체로부터 유래된다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 Fc 영역의 적어도 일부는 Fcγ4 또는 그의 돌연변이체로부터 유래된다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 Fc 영역의 적어도 일부는 인간 Fcγ4 또는 그의 돌연변이체로부터 유래된다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 Fc 영역은 SEQ ID NO: 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
APEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO: 3).
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 재조합 항체는 SEQ ID NO: 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
QVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGGTKLTVLESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGGGGSGGGGSGGGGSQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS(SEQ ID NO: 4).
예방 또는 치료용 조성물
본 발명의 일 양태에서, 본 발명은 핵산을 제안하며, 상기 핵산은 전술한 재조합 항체를 코딩한다. 본 발명의 실시예에 따른 핵산에 의해 코딩된 재조합 항체는 CD16a, IL-21R에 효과적으로 결합할 수 있고, 생체 내 및 시험관 내에서 강력한 결합 활성을 가지며, NK 세포를 효과적으로 활성화할 수 있고, 생체 내 반감기가 길며, 현저한 항종양, 항바이러스 효과가 있다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 핵산은 SEQ ID NO: 5로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
CAAGTTCAATTGGTTCAATCTGGTGCTGAGGTTAAGAAACCAGGTGAGTCTTTGAAGGTTTCTTGTAAGGCTTCTGGTTATACTTTCACTTCTTACTATATGCATTGGGTTAGACAAGCTCCAGGTCAAGGTTTGGAGTGGATGGGTATTATTAATCCATCTGGTGGTTCTACTTCTTATGCTCAAAAGTTCCAAGGTAGAGTTACTATGACTAGAGATACTTCTACTTCTACTGTTTATATGGAGTTGTCTTCTTTGAGATCTGAAGATACTGCTGTTTATTATTGTGCTAGAGGTTCTGCTTATTATTATGATTTCGCTGATTATTGGGGTCAAGGTACTTTGGTTACTGTCTCTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCCTCTTACGTCTTGACTCAACCATCTTCTGTCTCTGTTGCTCCAGGTCAAACTGCTACTATTTCTTGTGGTGGTCATAATATTGGTTCTAAGAATGTTCATTGGTATCAACAAAGACCAGGTCAATCTCCAGTCTTGGTCATCTATCAAGATAACAAGAGACCATCTGGTATTCCAGAGAGATTCTCTGGTTCTAATTCTGGTAATACTGCTACTTTGACTATTTCTGGTACTCAAGCTATGGATGAAGCTGATTACTATTGTCAAGTTTGGGATAATTATTCTGTCTTGTTCGGTGGTGGTACTAAGTTGACTGTTTTGGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCGAAGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTTCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCCAAAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGacCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGACTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAAGGTGGTGGTGGTTCTggaGGTggcGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTCAAGATCGCCACATGATTAGAATGCGTCAACTTATAGATATTGTTGATCAGCTGAAAAATTATGTGAATGACTTGGTCCCTGAATTTCTGCCAGCTCCAGAAGATGTAGAGACAAACTGTGAGTGGTCAGCTTTTTCCTGTTTTCAGAAGGCCCAACTAAAGTCAGCAAATACAGGAAACAATGAAAGGATAATCAATGTATCAATTAAAAAGCTGAAGAGGAAACCACCTTCCACAAATGCAGGGAGAAGACAGAAACACAGACTAACATGCCCTTCATGTGATTCTTATGAGAAAAAACCACCCAAAGAATTCCTAGAAAGATTCAAATCACTTCTCCAAAAGATGATTCATCAGCATCTGTCCTCTAGAACACACGGAAGTGAAGATTCC(SEQ ID NO: 5).
설명해야 할 것은, 당업자는 본 발명의 명세서 및 청구범위에 언급된 핵산이 실제로 상보적 이중 가닥 중 임의의 하나 또는 둘 다를 포함한다는 것을 이해해야 한다. 편의상, 본 명세서 및 청구범위에서는 대부분의 경우 하나의 가닥만이 제시되어 있지만 실제로는 이에 상보적인 다른 가닥도 개시되어 있다. 또한, 본 발명의 핵산 서열은 DNA 형태 또는 RNA 형태를 포함하며, 이들 중 하나를 개시한다는 것은 다른 하나도 개시됨을 의미한다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 발현 벡터를 제안하며, 상기 발현 벡터는 전술한 핵산 분자를 보유한다. 상기 발현 벡터는 선택적 제어 서열을 포함할 수 있고, 상기 제어 서열은 상기 핵산 분자에 작동 가능하게 연결된다. 여기서, 상기 제어 서열은 숙주에서 상기 핵산 분자의 발현을 지시할 수 있는 하나 이상의 제어 서열이다. 본 발명의 실시예에서 제안하는 발현 벡터는 적합한 숙주 세포에서 상기 재조합 항체를 고효율적으로 발현시킬 수 있어, NK 세포를 효과적으로 활성화시켜 종양 또는 바이러스 감염으로 인한 질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 재조합 세포를 제안하며, 상기 재조합 세포는 전술한 핵산 분자, 발현 벡터 또는 재조합 항체를 보유한다. 상기 재조합 세포는 상기 발현 벡터를 형질감염 또는 형질전환시켜 획득된다. 본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 재조합 세포는 적합한 조건에서 상기 재조합 항체를 고효율적으로 발현시킬 수 있고, 상기 재조합 세포는 종양 또는 바이러스 감염으로 인한 질환의 치료 또는 예방에 효과적으로 사용될 수 있다.
설명해야 할 것은, 본 명세서에 언급된 "적합한 조건"은 본 발명에 따른 재조합 항체의 발현에 적합한 조건을 의미한다. 당업자라면 재조합 항체의 발현에 적합한 조건이 적합한 형질전환 또는 형질감염 방식, 적합한 형질전환 또는 형질감염 조건, 건강한 숙주 세포 상태, 적합한 숙주 세포 밀도, 적절한 세포 배양 환경, 적절한 세포 배양 시간을 포함하지만 이에 한정되지 않는다는 것을 쉽게 이해할 수 있다. "적합한 조건"은 특별히 한정되지 않으며, 당업자는 실험실의 구체적인 환경에 따라 재조합 항체의 발현에 가장 적합한 조건을 최적화할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 조성물을 제안하며, 이는 전술한 재조합 항체, 핵산 분자, 발현 벡터 또는 재조합 세포를 포함한다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 실시예의 재조합 항체는 CD16a 또는 IL-21R 단백질 분자에 효과적으로 결합할 수 있어, 상기 IL-21R 및/또는 CD16a를 고발현하는 NK 세포를 특이적으로 인식하여 NK 세포를 효과적으로 활성화시킬수 있으며, 상기 재조합 항체를 포함하는 조성물도 마찬가지로 종양 또는 바이러스 감염으로 인한 질환을 치료 또는 예방하는 현저한 작용이 있고, 항종양 및 항바이러스 능력이 상당하다. 상기 조성물은 특별히 한정되지 않는 바, 상기 임의의 물질이 다른 임의의 물질과 조합하여 사용되는 것이라면 식품 조성물 또는 약학적 조성물 등 본 발명에 따른 조성물의 범위 내에 속한다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명은 약물을 제안하며, 이는 전술한 재조합 항체, 핵산 분자, 발현 벡터, 재조합 세포 또는 조성물을 포함하고, 상기 약물은 종양 또는 바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 데 사용된다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따른 재조합 항체는 CD16a 및 IL-21R 단백질에 효과적으로 결합할 수 있어, 상기 IL-21R 및/또는 CD16a를 고발현하는 NK 세포를 특이적으로 인식할 수 있으며, 상기 재조합 항체 및 그에 상응하는 일련의 물질을 이용하여 제조된 약물도 마찬가지로 종양 또는 바이러스 감염으로 인한 질환을 치료 또는 예방하는 현저한 작용이 있고, 항종양 및 항바이러스 능력이 상당하다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 종양은 직장암, 폐암, 유방암, 간암, 위암, 피부암, 신장암췌장암 및 난소암 중 적어도 하나를 포함한다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 바이러스 감염은 HPV, HBV, 인풀루엔자 바이러스 및 코로나 바이러스 중 적어도 하나를 포함한다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 의해 제공되는 약물은 약학적으로 허용 가능한 담체 및 유효량의 상기 재조합 항체 활성 성분을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유효량" 또는 "유효 사용량"은 인간 및/또는 동물에서 기능 또는 활성을 생성하고 인간 및/또는 동물에게 허용되는 양을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용 가능한" 성분은 과도한 부작용(예: 독성, 자극 및 알레르기 반응) 없이 인간 및/또는 포유동물에게 적용되는 물질, 즉 합리적인 이익/위험 비율을 갖는 물질을 의미한다. 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 다양한 부형제 및 희석제를 포함하여 치료제의 투여에 사용되는 담체를 의미한다.
본 발명의 약물은 안전하고 유효한 양의 본 발명의 활성 성분 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유한다. 이러한 담체에는 식염수, 완충액, 포도당, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 조합이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다. 일반적으로 약물 제제는 투여 방식에 맞춰야 하며, 본 발명의 약물 제형은 주사제, 경구 제제(정제, 캡슐제, 경구용 액제), 경피제, 서방제이다. 예를 들어, 생리식염수나 포도당 및 기타 보조제를 함유한 수용액을 사용하여 통상적인 방법으로 제조된다. 상기 약물은 바람직하게는 멸균 조건에서 제조된다.
본 발명에 따른 활성 성분의 유효량은 투여 모드 및 치료할 질환의 중증도에 따라 달라질 수 있다. 바람직한 유효량의 선택은 다양한 요인(예를 들어, 임상 시험을 통해) 당업자에 의해 결정될 수 있다. 상기 요인은 생체 이용률, 대사, 반감기 등과 같은 상기 활성 성분의 약동학적 파라미터; 환자가 치료할 질환의 중증도, 환자의 체중, 환자의 면역 상황, 약물 투여 경로 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 치료 상황의 긴급 요구 사항에 따라 여러 번 분할된 용량을 매일 투여할 수 있거나 용량을 비례적으로 줄일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적으로 허용 가능한 담체에는 물, 식염수, 리포솜, 지질, 단백질, 단백질-항체 접합체, 펩티드계 물질, 셀룰로오스, 나노겔 또는 이들의 조합이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다. 담체의 선택은 당업자에게 잘 알려진 투여 방식에 맞춰야 한다.
용도
본 발명의 일 양태에서, 본 발명은 NK 세포의 배양 및 증폭에 있어서 전술한 재조합 항체, 핵산 분자, 발현 벡터 및 재조합 세포의 용도를 제안한다. 본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따른 재조합 항체, 핵산 분자, 발현 벡터 및 상기 재조합 세포는 시험관 내에서 상기 NK 세포의 증식, 증폭을 촉진하는 데 사용될 수 있으며, 증폭된 NK 세포는 우수한 세포 독성을 갖는다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 NK 세포는 말초혈액 또는 유도줄기세포에서 유래된다. NK 세포는 주로 말초혈액에 분포되고, 또한, 줄기세포를 유도하여 NK 세포를 얻을 수도 있다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 NK 세포는 인간 말초혈액 단핵세포 유래 NK 세포, 인간 제대혈 줄기세포 유도 NK 세포, 인간 배아줄기세포 유도 NK 세포 및 인간 iPSC 유도 NK 세포 중 적어도 하나를 포함한다. NK 세포 말초혈액 단핵세포는 림프구 및 단핵구를 포함하고, 본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 전술한 재조합 항체, 핵산 분자, 발현 벡터 및 상기 재조합 세포는 시험관 내에서 상기로부터 유래된 NK 세포의 증식, 증폭을 촉진하는 데 좋은 효과가 있으며, 증폭된 NK 세포는 우수한 세포 독성을 갖는다.
본 발명의 제7 양태에서, 본 발명은 종양 또는 바이러스 감염을 치료 또는 예방하기 위한 약물의 제조에 있어서 전술한 재조합 항체, 핵산 분자, 발현 벡터, 재조합 세포 또는 조성물의 용도를 제안한다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 실시예의 재조합 항체는 CD16a 및 IL-21R 단백질에 효과적으로 결합할 수 있어, 상기 IL-21R 및/또는 CD16a를 고발현하는 NK 세포를 특이적으로 인식할 수 있으며, 상기 재조합 항체 및 그에 상응하는 일련의 물질을 이용하여 제조된 약물도 마찬가지로 종양 또는 바이러스 감염으로 인한 질환을 치료 또는 예방하는 현저한 작용이 있고, 항종양 및 항바이러스 능력이 상당하다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 용도는 다음과 같은 부가적 기술 특징 중 적어도 하나를 더 포함할 수도 있다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 종양은 직장암, 폐암, 유방암, 간암, 위암, 피부암, 신장암, 췌장암 및 난소암 중 적어도 하나를 포함한다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 바이러스 감염은 HPV, HBV, 인풀루엔자 바이러스 및 코로나 바이러스 중 적어도 하나를 포함한다.
키트
본 발명의 마지막 양태에서, 본 발명은 키트를 제안하며, 이는 전술한 재조합 항체를 포함한다. 본 발명의 실시예에 따른 재조합 항체는 CD16a 및 IL-21R 단백질 분자에 효과적으로 결합할 수 있어, 상기 IL-21R 또는 CD16a를 특이적으로 고발현하는 NK 세포를 특이적으로 인식할 수 있다. 따라서, 상기 재조합 항체는 CD16a 또는 IL-21R을 검출하는 키트의 제조에 사용될 수 있고, 상기 키트는 생물학적 샘플에서 CD16a 및/또는 IL-21R 단백질 분자의 정성적 또는 정량적 검출과 같은 과학적 연구에 사용될 수 있다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 키트는 CD16a 및/또는 IL-21R을 검출하는 데 사용된다.
질환 치료 용도 및 방법
본 발명의 일 양태에서, 본 발명은 종양 또는 바이러스 감염의 치료 또는 예방에 있어서 전술한 재조합 항체, 핵산 분자, 발현 벡터, 재조합 세포, 조성물 또는 약물의 용도를 제안한다. 전술한 바와 같이, 상기 재조합 항체는 상기 CD16a 및 IL-21R 단백질을 특이적으로 인식할 수 있어, 상기 IL-21R 또는 CD16a를 특이적으로 고발현하는 NK 세포를 특이적으로 인식하여 NK 세포를 효과적으로 활성화시키고, IFN-γ 분비를 강화하며, 증식 및 NK 세포 독성 활성을 향상시키고, 종양 세포를 효과적으로 사멸시키는 동시에 NK 세포 성숙 및 NK 세포 수용체의 발현을 가속화함으로써 종양 미세환경에서 NK 세포의 고갈을 효과적으로 회복시킬 수 있으므로, 본 발명의 실시예에 따른 재조합 항체, 상기 재조합 항체를 포함하는 조성물, 약물 또는 적합한 조건에서 발현되어 상기 재조합 항체를 얻을 수 있는 상기 핵산 분자, 발현 벡터, 재조합 세포 등과 같은 일련의 물질들은 모두 NK 세포를 효과적으로 활성화시켜 종양 또는 바이러스 감염을 치료 또는 예방할 수 있다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 종양은 직장암, 폐암, 유방암, 간암, 위암, 피부암, 신장암, 췌장암 및 난소암 중 적어도 하나를 포함하고, 상기 바이러스 감염은 HPV, HBV, 인풀루엔자 바이러스 및 코로나 바이러스 중 적어도 하나를 포함한다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 종양 또는 바이러스 감염의 치료 또는 예방 방법을 제안한다. 본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 대상체에게 1) 전술한 재조합 항체; 2) 전술한 핵산 분자; 3) 전술한 발현 벡터; 4) 전술한 재조합 세포; 5) 전술한 조성물; 또는 6) 전술한 약물 중 적어도 하나를 투여하는 것을 포함한다. 전술한 바와 같이, 상기 재조합 항체는 상기 CD16a 및 IL-21R 단백질을 특이적으로 인식할 수 있어, 상기 IL-21R 또는 CD16a를 특이적으로 고발현하는 NK 세포를 특이적으로 인식하여 NK 세포를 효과적으로 활성화시키고, IFN-γ 분비를 강화하며, 증식 및 NK 세포 독성 활성을 향상시키고, 종양 세포를 효과적으로 사멸시키는 동시에 NK 세포 성숙 및 NK 세포 수용체의 발현을 가속화함으로써 종양 미세환경에서 NK 세포의 고갈을 효과적으로 회복시킬 수 있으므로, 본 발명의 실시예에 따른 재조합 항체, 상기 재조합 항체를 포함하는 조성물, 약물 또는 적합한 조건에서 발현되어 상기 재조합 항체를 얻을 수 있는 상기 핵산 분자, 발현 벡터, 재조합 세포 등과 같은 일련의 물질들은 모두 NK 세포를 효과적으로 활성화시켜 종양 또는 바이러스 감염을 치료 또는 예방할 수 있다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 종양은 직장암, 폐암, 유방암, 간암, 위암, 피부암, 신장암, 췌장암 및 난소암 중 적어도 하나를 포함하고, 상기 바이러스 감염은 HPV, HBV, 인풀루엔자 바이러스 및 코로나 바이러스 중 적어도 하나를 포함한다.
이하, 실시예를 구체적으로 소개한다. 실시예에서 구체적인 기술이나 조건이 명시되지 않은 경우, 당업계의 문헌에 기재된 기술이나 조건 또는 제품 설명서에 따른다. 사용되는 시약 또는 기기는 제조업체가 명시되지 않은 경우, 모두 시중에서 구입할 수 있는 통상적인 제품이다.
실시예 1. 이중특이성 항체 분자 anti-CD16a-FCγ4-IL21의 설계 및 구축
본 실시예의 구체적인 실험 조작은 다음과 같다.
1.1 anti-CD16a-FCγ4-IL21 융합 유전자의 획득
(1) Anti-CD16a-FCγ4 융합 유전자의 획득
Pgapza-CD16-FC4γ4 플라스미드를 주형으로 하고, 프라이머 1 및 프라이머 2를 사용하여 PCR을 수행하여 SEQ ID NO:6으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 anti-CD16a-FCγ4 융합 유전자를 얻되, PCR 프로그램은 변성: 98℃ 20s; 사이클: 98℃ 10s→ 54℃ 15s→ 72℃ 40s(30 사이클) 연장: 72℃ 2min이다.
CAAGTTCAATTGGTTCAATCTGGTGCTGAGGTTAAGAAACCAGGTGAGTCTTTGAAGGTTTCTTGTAAGGCTTCTGGTTATACTTTCACTTCTTACTATATGCATTGGGTTAGACAAGCTCCAGGTCAAGGTTTGGAGTGGATGGGTATTATTAATCCATCTGGTGGTTCTACTTCTTATGCTCAAAAGTTCCAAGGTAGAGTTACTATGACTAGAGATACTTCTACTTCTACTGTTTATATGGAGTTGTCTTCTTTGAGATCTGAAGATACTGCTGTTTATTATTGTGCTAGAGGTTCTGCTTATTATTATGATTTCGCTGATTATTGGGGTCAAGGTACTTTGGTTACTGTCTCTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCCTCTTACGTCTTGACTCAACCATCTTCTGTCTCTGTTGCTCCAGGTCAAACTGCTACTATTTCTTGTGGTGGTCATAATATTGGTTCTAAGAATGTTCATTGGTATCAACAAAGACCAGGTCAATCTCCAGTCTTGGTCATCTATCAAGATAACAAGAGACCATCTGGTATTCCAGAGAGATTCTCTGGTTCTAATTCTGGTAATACTGCTACTTTGACTATTTCTGGTACTCAAGCTATGGATGAAGCTGATTACTATTGTCAAGTTTGGGATAATTATTCTGTCTTGTTCGGTGGTGGTACTAAGTTGACTGTTTTGGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCGAAGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTTCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCCAAAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGacCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGACTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA(SEQ ID NO:6).
(2) GS-IL21 융합 유전자의 획득
Ppicza-rdna-FC-Y407T-IL21플라스미드를 주형으로 하고, 프라이머 3 및 프라이머 4를 사용하여 PCR을 수행하여 SEQ ID NO:7로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 GS-IL21 융합 유전자를 얻되, PCR 프로그램은 변성: 98 20s; 사이클: 98℃ 10s→ 54℃ 15s→ 72℃ 30s(30사이클) 연장: 72℃ 5min이다.
GGTGGTGGTGGTTCTggaGGTggcGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTCAAGATCGCCACATGATTAGAATGCGTCAACTTATAGATATTGTTGATCAGCTGAAAAATTATGTGAATGACTTGGTCCCTGAATTTCTGCCAGCTCCAGAAGATGTAGAGACAAACTGTGAGTGGTCAGCTTTTTCCTGTTTTCAGAAGGCCCAACTAAAGTCAGCAAATACAGGAAACAATGAAAGGATAATCAATGTATCAATTAAAAAGCTGAAGAGGAAACCACCTTCCACAAATGCAGGGAGAAGACAGAAACACAGACTAACATGCCCTTCATGTGATTCTTATGAGAAAAAACCACCCAAAGAATTCCTAGAAAGATTCAAATCACTTCTCCAAAAGATGATTCATCAGCATCTGTCCTCTAGAACACACGGAAGTGAAGATTCCTAG(SEQ ID NO:7).
상기 프라이머 1~4의 서열은 표 1에 나타내었다.
번호 명칭 서열
프라이머 1 Fw-CD16-XhoI CTCTCGAGAAAAGACAAGTTCAATTGGTTC(SEQ ID NO:8)
프라이머 2 RV-T407Y CGGTTAGTCTGCTGTAGAGGAAGAAG(SEQ ID NO:9)
프라이머 3 FW-T407Y CTTCTTCCTCTACAGCAGACTAACCG(SEQ ID NO:10)
프라이머 4 RV-NOTI TTCGCGGCCGCCTAGGAATCTTCACTTCCG(SEQ ID NO:11)
상기 두 단계의 증폭 산물에 대해 아가로스겔 전기 영동을 수행하고, DNA 겔 회수 키트의 조작 절차에 따라 2개의 목적 유전자에 대응되는 밴드를 절단 및 회수하여 Anti-CD16a-FCγ4 및 GS-IL21 융합 유전자를 얻었는 바, 즉 첫번째 목적 유전자 단편과 두번째 목적 유전자 단편을 얻었다.
(3) Anti-CD16a-FCγ4-IL21 융합 유전자의 획득
상기 단계에서 얻은 Anti-CD16a-FCγ4 및 GS-IL21 융합 유전자를 주형으로 하고, 프라이머 1 및 프라이머 4를 사용하여 PCR을 수행하여 Anti-CD16a-FCγ4-IL21 융합 유전자를 얻되, PCR 프로그램은 변성: 98 20s; 3 사이클: 98 10s→ 54 20s→ 72 40s(3사이클); 연장: 72 2min; 그 후 프라이머: 변성: 98 20s; 3 사이클: 98 10s→ 54 20s→ 72 40s(30사이클); 연장: 72 10min이며; 증폭 산물에 대해 아가로스겔 전기 영동을 수행한 후, DNA 겔 회수 키트로 회수하여 하나의 유전자를 얻었으며, 해당 유전자는 양단에 XhoⅠ 및 NotⅠ 효소 절단 부위를 갖고, Anti-CD16a-FCγ4-IL21로 명명되며;
상기 Pgapza-CD16-FC4γ4 및 Ppicza-rdna-FC-Y407T-IL21 플라스미드는 모두 발명자가 통상적인 발현 벡터 구축 방법에 따라 자체로 구축하였다.
1.2 anti-CD16a-FCγ4-IL21 융합 단백질의 피키아 파스토리스 발현 벡터의 구축
단계1.1에서 얻은 anti-CD16a-FCγ4-IL21 융합 단백질을 코딩하는 유전자 서열(SEQ ID NO:5)과 실험실에 보관된 피키아 파스토리스 발현 플라스미드 PGAPzα-rDNA-NTS에 대해 모두 제한 엔도뉴클레아제 XhoⅠ 및 NotⅠ를 사용하여 이중 효소 절단을 수행하였다. 효소 절단된 anti-CD16a-FCγ4-IL21 융합 단백질 유전자 서열 산물 유전자는 PCR 산물 회수 키트(Axygen사)로 회수하고, 효소 절단 플라스미드는 DNA 겔 회수 키트(Axygen사)로 회수하였으며, 조작 절차는 키트 설명서를 참조한다. 회수하여 얻은 효소 절단된 융합 단백질 유전자와 효소 절단된 벡터를 T4 DNA 연결 효소로 연결하고, 구축된 플라스미드 구조는 도 1에 도시된 바와 같다. 효소 연결 산물을 대장균TOP10 컴피턴트 세포로 형질전환시켰다. 형질전환 조작 절차는 다음과 같다. 10μL효소 연결 산물을 취하여 100μL대장균 컴피턴트에 첨가하고 균일하게 혼합하였으며, 얼음 위에 15~30분간 방치하고, 5분 간격으로 균일하게 저어준 후; 42℃에서 90초 동안 열충격을 가하고, 얼음 위에 3~5분간 방치한 후, 400ul의 항내성 LB 액체 배지를 첨가하고, 37℃의 진탕기에서 45분간 소생 및 배양시킨 후, Zeocin 내성 플레이트를 코팅하였다. 클론 콜로니가 플레이트에서 성장한 후, 단일 콜로니를 선택하여 LZ 액체 배지(Zeocin 내성 LB 배지)가 포함된 쉐이커 튜브에 클로닝하고, 37℃에서 6~8h 동안 배양한 후, 균액을 주형으로 하여 PCR 동정을 수행하고, 얻은 양성 클론을 PGAP-zα-anti-CD16a-FCγ4-IL21로 명명하였으며, 양성 클론에 대응되는 균액을 플라스미드 미니 추출 키트로 추출하고, General Biotech 및 Genewise에 보내 시퀀싱을 수행하였다. 시퀀싱 후, 시퀀싱 결과는 이론적 기대 결과와 일치했으며, 클론이 정확하게 구축되었다.
실시예 2. 이중특이성 항체 분자 anti-CD16a-FCγ4-IL21의 발현 및 정제
2.1 anti-CD16a-FCγ4-IL21이중특이성 항체 분자의 발현
실시예 1에서 구축된 양성 클론을 LZ 액체 배지 50mL를 사용하여 확장 배양하고, 키트(Axygen사)를 사용하여 플라스미드 PGAP-zα-anti-CD16a-FCγ4-IL21을 중간량으로 추출하였다. 이전 단계에서 제조된 발현 플라스미드 PGAP-zα-anti-CD16a-FCγ4-IL21을 엔도뉴클레아제 SpeⅠ를 사용하여 선형화하고, 에탄올 침전을 통해 회수하였다. 에탄올 침전 단계: 1) 효소 절단 반응계에 2배 부피의 무수에탄올과 0.1배 부피의 3M 아세트산나트륨을 첨가하고, -20℃에서 2시간 이상 침전시킨다. 2) 12000g에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 버린다. 3) 300μL의 70% 에탄올에 침전물을 재현탁하고, 12000g에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 버린다. 4) 37℃에서 건조시키고, 탈이온수로 재현탁하여 농도를 측정하며, 농도를 0.5~1.0 μg/μL 사이에서 조정한다.
효모 컴피턴트의 제조: 제조 단계: 1) 잘 냉동된 피키아 파스토리스 X33 균주를 선별하여 YPD 플레이트에 도말하고, 30℃ 항온 효모 인큐베이터에서 배양한다. 2) 클론이 약 1mm의 직경을 성장하면, 클론을 골라 액체 4mL YPD 배지에 넣고, 30℃ 항온 효모 진탕기에서 배양한다. 3) 24~48시간 동안 배양한다. 상기 균액 1mL를 50mL의 신선한 YPD 배지에 접종한다. 4) OD600값이 1~1.5에 도달하면, 균액을 50mL 원심분리 튜브에 옮기고, 4℃, 1500g에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 버린다. 5) 50mL의 얼음물에 재현탁하고, 4℃, 1500g에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 버리고 1회 반복한다. 6) 차가운 1M 소르비톨 50mL에 재현탁하고, 4℃, 1500g에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 버리고 1회 반복한다. 7) 차가운 1M 소르비톨 500μL에 재현탁한다.
전기 천공 단계: 상기 컴피턴트 세포 100μL를 취하여 사전 냉각된 멸균 전기 천공 컵에 넣고, 여기에 선형화된 플라스미드(5~10μg) 10μL를 추가하고 균일하게 혼합한다. 전기 천공기의 파라미터를 2000V, 200Ω, 25μF로 설정한다. 전기 천공하고, 전기 천공 직후 전기 천공 컵에 차가운 1M 소르비톨 1mL를 첨가하고 얼음 위에 5~10min 방치한 후, 모든 균액을 1ml YPD가 담긴 50ml 원심분리 튜브에 옮기고, 30℃, 225rpm에서 2h 동안 소생시킨다. 소생 완료 후, 100~1000μL의 상기 균액을 취하여 YPDZ(Zeocin 내성 플레이트 포함) 플레이트에 코팅하고, 플레이트를 30℃ 항온 효모 인큐베이터에 넣어 배양한다.
양성 발현 클론 스크리닝: 상기 YPDZ 플레이트에서 효모 클론이 성장한 후, 몇몇 클론을 골라 2mL BMGY 배지에 넣고, 효모 진탕기에서 균액이 유백색이 될 때까지 28℃ 항온에서 배양하였다. 그 중 1mL의 균액을 동결시켜 종자 보존하고, 나머지 1mL의 균액을 12000g에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 취하여 항-Human FCγ4 항체를 이용한 Dot blot동정 초기 스크리닝에 사용하며, 발현량이 상대적으로 높은 효모 균주를 골라낸 후, 발현량이 상대적으로 높은 효모 균주를 zeocin이 포함된 YPD플레이트에 코팅하고, 클론이 성장한 후, 다시 그 중에서 여러 클론을 선별하며, 상기 방식에 따라 균을 흔들어 균액의 상층액을 얻고, Anti-human FCγ 항체를 사용하여 Western Blot동정 분석을 수행하여 고발현 균주(34-3)를 스크리닝하며, 대응되는 균주의 나머지 1mL의 균액을 동결시켜 종자 보존하되; 이러한 고발현 균주는 anti-CD16a-FCγ4-IL21 복합 단백질을 발현할 수 있는 피키아 파스토리스 균주이다.
도 3에 도시된 바와 같이, 구체적인 실험 결과, YPDZ 내성 배양 플레이트 스크리닝 후, 융합 단백질의 효모 발현 균주를 얻었다. Dot blot를 사용하여 1차 스크리닝을 수행하여 발현량이 상대적으로 높은 일부 클론(예: 도 3B의 66번; 91번; 98번; 34번)을 초보적으로 얻을 수 있고, 그 후 Western Blot를 통해 추가 확인 및 비교를 수행함으로써 발현량이 높은 효모 발현 클론을 스크리닝하여 후속 단백질 발현 및 정제에 사용할 수 있다.
2.2 anti-CD16a-FCγ4-IL21이중특이성 항체 분자의 발효, 정제 및 동정
(1) 발효
발현 균주 배양: 재조합 균주의 발효는 Invitrogen사의 발효 가이드 매뉴얼에 따라 수행하였다. 스크리닝된 고발현 균주를 4mL의 YPD 배지가 포함된 쉐이커 튜브에 접종하고, OD600이 2~6이 될 때까지 30℃의 진탕기에서 24~48시간 동안 배양시켰는 바, 즉 1급 종자액을 발효시켰다. 1mL의 상기 종자액을 200mL의 BMGY 배지가 포함된 삼각 플라스크에 옮기고, 30℃의 진탕기에서 12~24시간 동안 배양시켰는 바, 즉 2급 종자액을 발효시켰다. 200mL의 2급 종자액을 모두 6L BMGY 배지가 포함된 발효 탱크에 접종하였다. 파라미터 설정: 배양 온도 30℃, pH 6.0, 용존 산소, 회전 속도 등을 모니터링하고, 발효 배양을 시작하였다. 균체 성장 단계에서 BMGY 배지를 사용하고, 용존 산소가 급격하게 상승하면 배지 내 기본 글리세롤이 고갈되었음을 의미하므로 글리세롤 유가를 시작하되, 글리세롤 유가 속도는 90ml/h이고, 발효 온도를 25℃로 조정하고, 발효가 완료될 때까지 지속시켰다.
배양액 정화: 발효 완료 후, 10000g에서 30분간 원심분리한 후 상층액을 수집하고, 0.22μm 및 500kDa 미세다공성 필터막으로 여과하고 정화한 후 PH를 7.4로 조정하였다.
도 4는 발효 과정 중 각 파라미터의 모니터링을 도시하며, 전체 발효 과정은 50 시간 동안 지속되고, 발효 과정은 안정적이며 반복이 용이하다. 도 4B로부터, 기본 글리세롤 배양 단계 종료 후로부터 시작하여 글리세롤 유가 제한 배양을 수행하여 단백질 발현을 유도(20h)하고, 전체 과정 동안 단백질이 지속적으로 누적되었으며, 43~50h에 단백질 누적량 차이가 거의 없어 발효 종료점을 판정하였음을 알 수 있다.
(2) 정제
단백질 포획: 친화성 크로마토그래피 니켈 컬럼을 사용하여 재조합 융합 단백질을 포획하였다. 구체적인 단계는 다음과 같다. 1) 탈이온수로5개 컬럼 부피의 크로마토그래피 컬럼을 헹군다. 2) PBS로 3개 컬럼 부피의 크로마토그래피 컬럼을 헹군다. 3) 샘플을 로딩한다. 4) 샘플 로딩이 완료된 후, PBS로 3개 컬럼 부피의 크로마토그래피 컬럼을 헹군다. 5) 불순물 세척: PH5.5 구연산 완충액을 사용하여 5개 컬럼 부피를 헹군다. 6) 목적 단백질을 용출하되, 용출액은 PH3.0 구연산 완충액이고, 수집된 용출액은 농축한 후 후속 정제에 사용한다.
정밀 정제: AKTA PURE 25를 사용하고, PBS 완충액으로 Superdex200 분자체를 균형화하며, 균형화 후, 중성 용출액 샘플을 로딩하고, PBS 완충액으로 헹군 후 용출 샘플을 수집하여 anti-CD16a-FCγ4-IL21 재조합 단백질을 얻었다.
원심분리, 여과 및 2단계 정제를 통해, SDS-PAGE, HPLC 동정을 거쳐 단백질 순도가 95% 이상(도 5A, C)에 도달할 수 있다.
(3) 동정
재조합 단백질 동정: 정제하여 얻은 단백질에 대해 SDS-PAGE, HPLC, 동적 광산란 동정을 수행하였다. 구체적인 실험 결과, 도 4B에 도시된 바와 같이, 여기서, anti-CD16a-FCγ4-IL21 단백질 분자량은 약 135kDa로 예상과 일치하였고; 동적 광산란 동정을 거쳐 anti-CD16a-FCγ4-IL21의 분자 직경은 약 10nm이며, 분자 간 균일 성이 우수하였다.
실시예 3. 시험관 내에서 NK 세포 활성화를 유도하는 이중특이성 항체 anti-CD16a-FCγ4-IL21의 기능 검증
Ficoll 밀도 구배 원심분리법을 사용하여 인간 PBMC를 분리하였다. 분리된 PBMC를 10% FBS가 포함된 RPMI 1640으로 1.0×106개/mL로 희석하였다. T25 배양 플라스크에 희석된 세포 10mL를 첨가하였다. 12시간 동안 배양한 후, 20nM의 최종 농도로 배양 플라스크에 anti-CD16a-FCγ4-IL21 융합 단백질을 첨가하였다. 24시간 동안 배양한 후, 유세포 분석기로 NK 세포 표현형 변화를 검출하였는데, 주로 NK 세포 표면의 주요 활성화 분자 CD69, NKp44 및 킬러 분자 4-1BB, TRAIL, Granzyme B의 발현 상황을 검출하였다.
도 6에 도시된 바와 같이, 구체적인 실험 결과, 대조군 PBS(Control군)와 비교하여, anti-CD16a-FCγ4-IL21 융합 단백질을 첨가한 실험군에서는 NK 세포 표면의 주요 활성화 분자 CD69, NKp44 및 킬러 분자 4-1BB, TRAIL, Granzyme B의 발현 수준이 현저히 상향 조절되었으며, 이에 따라 NK 세포가 anti-CD16a-FCγ4-IL21 융합 단백질에 의해 효과적으로 활성화된 것으로 판단하였다.
실시예 4. 시험관 내에서 NK 세포 증폭을 유도하는 이중특이성 항체 분자 anti-CD16a-FCγ4-IL21의 증폭 및 증폭 효과 평가
4.1 anti-CD16a-FCγ4-IL21에 의해 증폭된 NK 세포의 순도 및 수 검출
24h 전에 융합 단백질을 사용하여 T75 배양 플라스크에 코팅하고, 각 플라스크에서 7.5ml의 코팅액을 취하여 플라스크 바닥을 덮었다. 4℃ 냉장고에서 밤새 코팅하였다.
혈액 샘플에서 PBMC 세포를 분리한 후, 계수하고(Mindray 카운터), PBMC 세포 내 각 세포 하위집단의 백분율을 기록하였다. 1.5*10^6/ml 밀도(20ml의 배양 부피)로 접종하였다. 총 세포 수는 30*10^6이다. 이는 0일째이다. 아울러, anti-CD16a-FCγ4-IL21이 없는 KBM581 배지에 1%의 IL2(1000IU/ml) 및 5%에 대응되는 PBMC 자가 혈장을 첨가하였다.
3일째에, 상응한 배양 부피 1%의 IL2 인자를 보충하였다.
5일째에, 배지 색상 및 T75 플라스크 바닥의 세포 부착 상태를 관찰하고, 필요에 따라 anti-CD16a-FCγ4-IL21이 포함된 KBM581 배지 5~10ml를 보충하였으며, 보충액 부피 1%의 IL2(1000IU/ml) 인자를 첨가하였다.
6일째에, 샘플을 채취하여 계수하고, 세포 계대 배양 및 확장 배양을 수행하였다(1.3*10^6/ml). 이를 염색하고 표지화(CD16a/CD45/CD56) 하였으며, 유세포 분석기로 NK 세포 하위집단의 백분율, CD56+세포 하위집단의 백분율을 검출하고, 총 세포 수를 계산하였으며, 유세포 분석 순도 검출 결과에 따라 NK 세포 수를 계산하였다. 5일째부터 세포를 계대 배양 및 확장 배양하고, anti-CD16a-FCγ4-IL21이 포함된 기본 배지를 사용하였으며, 1%의 IL2 및 2%의 자가 혈장을 첨가하였다.
7일째에, 배지 색상 및 플라스크의 세포 부착 성장 상황을 관찰하고, 필요에 따라 배지를 보충하였다(보충액 부피 1%의IL2 인자를 첨가함).
8일째에, 샘플을 채취하여 계수하였다. 필요에 따라 세포 계대 확장을 수행하고(T75 또는 T175 플라스크, 1.4*10^6/mL), 배양 배지의 1% IL2 인자, 2%의 자가 혈장을 첨가하였다.
9일째에, 배지 색상 및 플라스크의 세포 부착 성장 상황을 관찰하고, 필요에 따라 배지를 보충하였다(보충액 부피 1%의IL2 인자를 첨가함).
10일째에, 샘플을 채취하여 계수하고, 세포 계대 배양 및 확장 배양을 수행하였다(1.5*10^6/mL). 이를 염색하고 표지화(CD16a/CD45/CD56)하였으며, 유세포 분석기로 NK 세포 하위집단의 백분율, CD56+세포 하위집단의 백분율을 검출하고, 총 세포 수를 계산하였다.
12일째에, 배지 색상 및 플라스크의 세포 부착 성장 상황을 관찰하고, 필요에 따라 배지를 보충하였다(보충액 부피 1%의IL2 인자를 첨가함).
13일째에, 샘플을 채취하여 계수하고, 세포 계대 배양 및 확장 배양을 수행하였다(1.5*10^6/mL). 이를 염색하고 표지화(CD16a/CD45/CD56)하였으며, 유세포 분석기로 NK 세포 하위집단의 백분율, CD56+세포 하위집단의 백분율을 검출하고, 총 세포 수를 계산하였으며, 유세포 분석 순도 검출 결과에 따라 NK 세포 수를 계산하였다.
15일째에, 샘플을 채취하여 계수하였다. 필요에 따라 세포 계대 확장을 수행하고(T175 플라스크 또는 배양 백, 1.5*10^6/mL), 배지의 1% IL2 인자를 첨가하였다.
17일째에, 샘플을 채취하여 계수하고, 이를 염색하고 표지화(CD16a/CD45/CD56)하였으며, 유세포 분석기로 NK 세포 하위집단의 백분율, CD56+세포 하위집단의 백분율을 검출하고, 총 세포 수를 계산하였으며, 유세포 분석 순도 검출 결과에 따라 NK 세포 수를 계산하였다. 0, 6, 10, 13, 17일째의 NK 순도 및 세포 수에 따라 시간 경과에 따른 NK 세포 비율과 수 변화 그래프를 작성하였다.
도 7의 A~C부분에 도시된 바와 같이, 구체적인 실험 결과, anti-CD16a-FCγ4-IL21을 사용하여 PBMC 유래 NK 세포를 증폭시키면, NK 세포를 효과적으로 증폭시키고, NK 세포 순도 및 증폭 배수를 향상시키며, 전체 배양 과정에서 NK 세포 비율이 가장 높게는 약 65%에 도달할 수 있다.
4.2 이중특이성 항체 분자에 의해 증폭된 PBMC 유래 NK 세포의 하위집단 분석
(1) 세포내 분자 표지 세포의 모넨신 유도: 배양된 세포 4×106개(2ml)를 취하여 6웰 플레이트에 넣고, 모넨신(0.5 μg/μl) 10 μl를 첨가하여 37℃, 5% CO2 항온 배양 인큐베이터 내에서 4시간 동안 유도하였다.
(2) 단세포 현탁액 제조: 표면 분자 표지 세포에서 배양된 세포 9.0×106개를 취하여 15ml 원심분리 튜브에 넣고, 400g에서 8분간 원심분리하여 세포를 수집하였으며, 10ml의 1×PBS로 2회 세척하고, 마지막으로 0.81ml의 1×PBS를 사용하여 단세포 현탁액으로 재현탁시켰다. 모넨신으로 세포내 분자 표지 세포를 유도 후, 5ml의 1×PBS를 첨가하여 2회 세척하고, 마지막으로 180 μl 1×PBS를 사용하여 단세포 현탁액으로 재현탁시켰다.
(3) 블로킹: 표면 분자 표지 세포에 90μl의 마우스 혈청을 첨가하여 균일하게 혼합하고, 세포내 분자 표지 세포에 20μl의 마우스 혈청을 첨가하여 균일하게 혼합한 후 실온에서 15~30분간 방치하였다.
(4) 표지 항체: 블로킹된 표면 분자 표지 세포를 0.09ml/튜브로 9개의 유동 튜브에 분주하고, 여러 배치의 세포를 동시에 검출하는 경우, 1~8튜브의 세포를 여러 배치의 세포와 동일한 양으로 혼합한 후 표지화하되, 튜브당 세포의 사용량은 0.8~1×106개이고, 샘플 튜브 1은 표면 분자 표지이며, 세포 사용량은 0.8~1×106개이다. 샘플 튜브 2는 세포내 분자 표지이고, 세포 사용량은 3~4×106개이며, 상응한 형광 표지 항체를 첨가하여 균일하게 혼합한 후 4℃의 암실에 30분간(중간에 15분마다 균일하게 혼합함) 방치하였다. 구체적인 실험군을 표 2에 나타내었다.
세포 표면 분자 검출 샘플 튜브 및 실험 조작표
번호 그룹별 형광 표지 항체 사용량
1 블랭크 대조 튜브 / /
2 mouse IgG1- Alexa Flour 647 0.5μL
mouseIgG1-percp cy5.5 0.5μL
mouse IgG1-BV785 0.5μL
3 단일 표준 대조 튜브 CD16a- Percpcy5.5 0.5μL
4 CD56- BV785 0.5μL
5 DAPI 5μL
6 BV510-CD19 1μL
8 BV650-CD14 1μL
샘플 튜브
 CD16a-Percp cy5.5
CD56- BV785
CD14-BV650
CD19-BV510		 0.5μL
0.5μL
1μL
1μL
(5) 세척: 표면 분자 표지 세포의 각 튜브에 1ml의 1×PBS를 첨가하고, 4℃, 400g에서 8분간 원심분리하여 세포를 수집하였다. 1ml의 1×PBS로 2회 세척을 반복하였다. 마지막으로 각 튜브에 200ul PBS를 첨가하여 표지된 세포를 재현탁시키고, 실험군에 DAPI(50μg/ml, 40×) 5 μl를 첨가한 후 튜브를 기계로 옮겨 검출하였다.
(6) 검출: 유세포 분석기를 기기 설명서에 따라 교정 및 조정하였다. 블랭크 대조 튜브 샘플로 전방 산란 및 측면 산란의 전압을 조정하였다. 단일 표준 대조 샘플로 각 채널의 형광 보상을 조정하였다. 검출 시 세포 게이트를 묘사한 후, 각 샘플 게이트 내에서 1×104개 세포를 수집하였다.
구체적인 실험 결과, 도 7-D에 도시된 바와 같이, 증폭된 세포에 대한 하위집단 분석을 통해, anti-CD16a-FCγ4-IL21에 의해 배양 및 증폭된 PBMC 세포에서 NK 세포의 비율은 61%에 달하고, NKT 비율은 약 10%이며, 전체 CD56 양성 세포는 약 71%이고, 나머지 세포 하위집단은 증폭된 PBMC 세포에서 낮은 비율을 차지함을 알 수 있다.
4.3 이중특이성 항체 분자에 의해 증폭된 NK 세포의 사멸 활성 검출
(1) 표적 세포 K562 현탁액 제조
세포 계수: 배양된 K562 세포를 0.5% FBS가 포함된 1640 배지(표적 세포에 사용되는 배지)로 재현탁하고, 계수하였으며, 세포 밀도를 1×106/mL로 조정하였다.
CFSE 염색: 세포 현탁액에 CFSE(작업 농도 5μM)를 첨가하고, 즉시 1mL 피펫으로 피펫팅하여 균일하게 혼합하였으며, 볼텍싱하여 충분하고 균일하게 혼합하고, 37℃배양 인큐베이터의 암실에서 15min 동안 배양하였으며, 5min마다 꺼내 볼텍싱하여 균일하게 혼합하였다.
염색 종료: 4℃로 사전 냉각된 완전 배지(표적 세포에 사용되는 배지) 5배 부피를 첨가하여 염색을 종료하고, 5분간 얼음욕을 수행하였다. 140g, 4℃, 5min 동안 원심 분리하였다.
세포 세척: 4℃로 사전 냉각된 완전 배지(표적 세포에 사용되는 배지)를 사용하여 재현탁하고, 140g, 4℃, 5min 동안 세포를 원심 분리하였으며; 세척을 2회 반복하였다.
계수: 세포를 재현탁하고, 계수하였으며, 세포 밀도를 2×105/mL로 조정하였다.
플레이팅: 96웰 둥근바닥 플레이트 내의 각 윌에 100μl의 K562 현탁액을 첨가하여 웰당 최종 세포 수가 20000개/웰이 되도록 하였다.
(2) NK 세포의 준비 및 첨가
적합한 NK 세포 밀도로 조제하였다.
E-Plate 16을 꺼내 깨끗한 벤치에 놓았다.
100μl의 NK 세포 현탁액을 다양한 CD56+: K562 효능 표적 비율(1:1, 2:1, 4:1, 8:1)로 배양 플레이트 내에 첨가하고, 이 밖에, CFSE 염색만 있는 표적 세포(표적 세포의 자연 사멸률 검출) 대조군; 이펙터 세포(이펙터 세포에 CFSE 비특이적 염색이 포함되지 않음을 증명)만 있는 대조군; 표적 세포+Tween-20(표적 세포 사멸 양성 대조군임) 대조군;을 더 설정하였다.
공동 배양: 미리 설계된 순서에 따라 각 웰에 NK 세포를 첨가하였다. 120g, 실온에서 2min 동안 원심분리하여 효능 표적 세포를 충분히 접촉시켰다. 다시 37℃배양 인큐베이터에 넣고 4시간 동안 배양하였다.
배양 완료 후, 5μl의 PI를 첨가하여 균일하게 혼합하고, 암실에서 5min 동안 배양한 후 기계에서 검출하였다.
결과 분석: 사멸율=[(실험군 표적 세포 사망율(%)-표적 세포의 사망율(%))/(100%-표적 세포 자연사율(%))]×100%).
구체적인 실험 결과, 도 7의 E부분(7-E)에 도시된 바와 같이, 증폭된 세포의 세포 독성을 평가한 결과, 증폭된 세포는 K562 세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있다.
종합하면, 본 실시예의 실험 결과는 anti-CD16a-FCγ4-IL21이 시험관 내에서 NK 세포를 활성화하고 증폭시키는 활성을 가지며, 증폭된 NK 세포는 우수한 세포 독성을 가짐을 증명한다.
본 명세서를 설명함에 있어서, 참조 용어 "일 실시예", "일부 실시예", "예시", "구체적인 예시", 또는 "일부 예시" 등에 대한 설명은 해당 실시예 또는 예시를 결합하여 설명된 구체적인 특징, 구조, 재료 또는 특성이 본 발명의 적어도 일 실시예 또는 예시에 포함된다는 것을 의미한다. 본 명세서에서, 상기 용어에 대한 예시적인 표현은 반드시 동일한 실시예 또는 예시를 가리키는 것은 아니다. 또한, 설명된 구체적인 특징, 구조, 재료 또는 특성은 어느 하나 이상의 실시예 또는 예시에서 적합한 방식으로 결합될 수 있다. 이 밖에, 서로 모순되지 않는 한, 당업자는 본 명세서에 설명된 다양한 실시예 또는 예시 및 다양한 실시예 또는 예시의 특징을 결합 및 조합할 수 있다.
이상, 본 발명의 실시예를 도시하고 설명하였지만, 상기 실시예는 예시적인 것이며 본 발명을 제한하는 것으로 이해해서는 안된다는 점을 이해할 수 있을 것이다. 당업자는 본 발명의 범위 내에서 상기 실시에에 대한 변경, 수정, 대체 및 변형을 수행할 수 있다.

Claims (26)

  1. 재조합 항체로서,
    IL-21 분자; 및
    CD16a 항체를 포함하고, 상기 CD16a 항체는 CD16a 단일 사슬 항체 및 Fc 영역을 포함하며, 상기 Fc 영역의 N-말단은 상기 단일 사슬 항체의 C-말단에 연결되고, 상기 CD16a 단일 사슬 항체는 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역을 포함하며;
    상기 FC의 C-말단은 상기 IL21 분자의 N-말단에 연결되는 것을 특징으로 하는 재조합 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    연결 펩티드 1을 더 포함하고, 상기 연결 펩티드 1의 N-말단은 상기 CD16a 단일 사슬 항체의 중쇄 가변 영역의 C-말단에 연결되며, 상기 연결 펩티드 1의 C-말단은 상기 CD16a 단일 사슬 항체의 경쇄 가변 영역의 N-말단에 연결되고;
    선택적으로, 상기 연결 펩티드 1은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 항체.
  3. 제1항에 있어서,
    연결 펩티드 2를 더 포함하고, 상기 연결 펩티드 2의 N-말단은 상기 IL-21 분자의 C-말단에 연결되며, 상기 연결 펩티드 2의 C-말단은 상기 Fc 영역의 N-말단에 연결되고;
    선택적으로, 상기 연결 펩티드 2는 SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 항체.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 Fc 영역의 적어도 일부는 쥐 항체, 인간 항체, 영장류 항체 또는 이들의 돌연변이체 중 적어도 하나로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 재조합 항체.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 Fc 영역의 적어도 일부는 인간 IgG 또는 그의 돌연변이체로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 재조합 항체.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Fc 영역의 적어도 일부는 인간 Fcγ4 또는 그의 돌연변이체로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 재조합 항체.
  7. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Fc 영역은 SEQ ID NO: 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 재조합 항체로서,
    SEQ ID NO: 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 항체.
  9. 핵산으로서,
    상기 핵산은 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 재조합 항체를 코딩하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  10. 제9항에 있어서,
    SEQ ID NO: 5로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 핵산.
  11. 발현 벡터로서,
    상기 발현 벡터는 제9항 또는 제10항에 따른 핵산 분자를 보유하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  12. 재조합 세포로서,
    상기 재조합 세포는 제9항 또는 제10항에 따른 핵산 분자, 제11항에 따른 발현 벡터 또는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 재조합 항체를 보유하는 것을 특징으로 하는 재조합 세포.
  13. 조성물로서,
    제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 재조합 항체, 제9항 또는 제10항에 따른 핵산 분자, 제11항에 따른 발현 벡터 또는 제12항에 따른 재조합 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 종양 또는 바이러스 감염을 치료 또는 예방하기 위한 약물의 제조에 있어서 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 재조합 항체, 제9항 또는 제10항에 따른 핵산 분자, 제11항에 따른 발현 벡터, 제12항에 따른 재조합 세포 또는 제13항에 따른 조성물의 용도.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 종양은 직장암, 폐암, 유방암, 간암, 위암, 피부암, 신장암, 췌장암 및 난소암 중 적어도 하나를 포함하고, 상기 바이러스 감염은 HPV, HBV, 인풀루엔자 바이러스 및 코로나 바이러스 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  16. NK 세포의 배양 및 증폭에 있어서 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 재조합 항체, 제9항 또는 제10항에 따른 핵산 분자, 제11항에 따른 발현 벡터 및 제12항에 따른 재조합 세포의 용도.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 NK 세포는 말초혈액 또는 유도줄기세포에서 유래된 것을 특징으로 하는 용도.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 NK 세포는 인간 말초혈액 단핵세포 유래 NK 세포, 인간 제대혈 줄기세포 유도 NK 세포, 인간 배아줄기세포 유도 NK 세포 및 인간 iPSC 유도 NK 세포 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  19. 약물로서,
    제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 재조합 항체, 제9항 또는 제10항에 따른 핵산 분자, 제11항에 따른 발현 벡터, 제12항에 따른 재조합 세포 또는 제13항에 따른 조성물을 포함하고, 상기 약물은 종양 또는 바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 데 사용되는 것을 특징으로 하는 약물.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 종양은 직장암, 폐암, 유방암, 간암, 위암, 피부암, 신장암, 췌장암 및 난소암 중 적어도 하나를 포함하고, 상기 바이러스 감염은 HPV, HBV, 인풀루엔자 바이러스 및 코로나 바이러스 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 약물.
  21. 키트로서,
    제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 재조합 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 키트는 CD16a 및/또는 IL-21R을 검출하는 데 사용되는 것을 특징으로 하는 키트.
  23. 종양 또는 바이러스 감염의 치료 또는 예방에 있어서 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 재조합 항체, 제9항 또는 제10항에 따른 핵산 분자, 제11항에 따른 발현 벡터, 제12항에 따른 재조합 세포, 제13항에 따른 조성물 또는 제19항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 약물의 용도.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 종양은 직장암, 폐암, 유방암, 간암, 위암, 피부암, 신장암, 췌장암 및 난소암 중 적어도 하나를 포함하고, 상기 바이러스 감염은 HPV, HBV, 인풀루엔자 바이러스 및 코로나 바이러스 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  25. 종양 또는 바이러스 감염의 치료 또는 예방 방법으로서,
    대상체에게 1) 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 재조합 항체; 2) 제9항 또는 제10항에 따른 핵산 분자; 3) 제11항에 따른 발현 벡터; 4) 제12항에 따른 재조합 세포; 5) 제13항에 따른 조성물; 또는 6) 제19항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 약물 중 적어도 하나를 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 종양은 직장암, 폐암, 유방암, 간암, 위암, 피부암, 신장암, 췌장암 및 난소암 중 적어도 하나를 포함하고, 상기 바이러스 감염은 HPV, HBV, 인풀루엔자 바이러스 및 코로나 바이러스 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0510790D0 (en) * 2005-05-26 2005-06-29 Syngenta Crop Protection Ag Anti-CD16 binding molecules
CN105367660B (zh) * 2015-12-22 2018-12-21 深圳市北科生物科技有限公司 一种抗cd16a抗原和抗muc1抗原的双特异性抗体
AU2018228719B2 (en) * 2017-02-28 2023-03-30 Affimed Gmbh Tandem diabody for CD16A-directed NK-cell engagement
CN110461357A (zh) * 2017-02-28 2019-11-15 阿菲姆德股份有限公司 抗cd16a抗体与细胞因子的组合
FR3064007A1 (fr) * 2017-03-20 2018-09-21 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Anticorps pour le traitement de cancers
JP2021530243A (ja) * 2018-07-25 2021-11-11 アスクジーン・ファーマ・インコーポレイテッドAskGene Pharma, Inc. 新規ｉｌ−２１プロドラッグおよびそれを使用する方法
CN112679609B (zh) * 2019-10-19 2023-01-13 非同（成都）生物科技有限公司 抗CD16a抗原VHH及相关双特性纳米抗体
CN111826400A (zh) * 2020-07-21 2020-10-27 中科宝承生物医学科技有限公司 一种双特异性抗体nk细胞制备方法及其细胞和应用
CN114262382B (zh) * 2021-12-20 2023-09-19 上海恩凯细胞技术有限公司 双特异性抗体及其应用

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