CN113785048A - 用于扩增和分化在过继转移疗法中的t淋巴细胞和nk细胞的方法 - Google Patents

用于扩增和分化在过继转移疗法中的t淋巴细胞和nk细胞的方法 Download PDF

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Abstract

在本发明中描述了用于获得具有在用于癌症疗法的过继细胞转移中的所希望的表型的T淋巴细胞和NK细胞的方法。尤其地，本发明基于这样的策略，所述策略用于诱导通过具有中等亲和力的IL2受体的优先信号传导，由此实现扩增具有所希望的中枢记忆表型的细胞。本发明的方法在获得在癌症治疗中使用的肿瘤浸润淋巴细胞、TCR或经改造的T细胞嵌合受体之中是有用的。

Description

用于扩增和分化在过继转移疗法中的T淋巴细胞和NK细胞的 方法
技术领域
本发明涉及生物技术和免疫肿瘤学领域，尤其涉及用于扩增和分化具有记忆表型的T淋巴细胞和NK细胞的方法以及其在用于癌症疗法的过继细胞转移中的用途。
现有技术
白介素2(IL2)是第一种在分子上进行了表征的细胞因子，并且最初显示出其刺激T和NK细胞的生长和扩增的能力(Morgan等人,1976,Science,193(4257):1007-1008)。1992年批准了IL2用于癌症的临床使用，但是其受体的生物学的准确描述尚在研究中(Rosenberg,2014,J.Immunol.,192(12):5451-8；Smith,2006,Medical Immunology,1476(9433):5-3)。高剂量的IL2的全身施被用作癌症的免疫疗法，并且已在黑素瘤和肾细胞癌患者中产生了持久的应答，但是仅在一小部分患者中。此外，该治疗诱导显著的毒性，这限制了其临床重要性(Atkins,2006,Clin.Cancer Res.,12:2353-2358)。
在T淋巴细胞和NK细胞中，IL2与三种类型的受体(IL2R)相互作用。低亲和力的受体(Kd～10-8M)，其仅包含CD25，其是α亚基(IL2Rα)。中等亲和力的二聚体IL2受体(IL2Rβγ)(Kd～10-9M)，其由CD122亚基或IL2Rβ链和CD132亚基或IL2Rγ链形成；和高亲和力的受体(IL2Rαβγ)，其包含三个亚基IL2Rα、IL2Rβ和IL2Rγ。仅IL2Rβγ和IL2Rαβγ是有功能的并且能够向细胞转导信号(Stauber等人,2005,PNAS,103(8):2788-2793；Wang,2005,Science,310(18):1159-1163)。
IL2Rβ和IL2Rγ存在于免疫系统的效应细胞中，而在调节T细胞(Treg)中IL2Rα亚基的组成性表达使得其表达IL2Rαβγ并且因此具有在体内IL2的优先使用(Malek,2008,Annu.Rev.Immunol.,26:453-79)。迄今为止，许多工作已证明，用高剂量的全身IL2进行的疗法的低效力正是由于Treg细胞的扩增，其反过来抑制抗肿瘤效应应答(Choo Sim等人,2014,J.Clin.Invest.,124(1):99-110)。
在改善用IL2进行的疗法的效力的努力中，几个突变研究证明，可能使IL2突变，以便要么促进要么减损其与该受体的亚基中的每一个的相互作用，基于在淋巴样细胞中IL2R的不同亚基的差异表达(Skrombolas和Frelinger,2014,Expert.Rev.Clin.Immunol.,10(2):207-217)。最初的研究聚焦于增加IL2对IL2Rα的亲和力(Rao等人,2003,ProteinEngineering,16(12):1081-1087)。虽然在开展该项工作的时刻不是明显的，但是今天知道增加对IL2Rα的亲和力的策略诱导Treg的优先扩增，这是在抗肿瘤疗法中不希望的。最近，Levin等人在1992年获得了具有增加的对IL2Rβ亚基的亲和力的IL2突变体，其优先地激活过表达IL2Rβγ的效应细胞(IL2Rβγ)。特别地，一种称为“superkine H9”的变体的获得比天然IL2更抗肿瘤且毒性更低(Levin等人,2012,Nature,484(7395):529-33)。Carmenate等人报道了在人IL2的序列中引入四个突变，其有效地降低对IL2Rα的亲和力而不减损与IL2Rβγ的相互作用。该突变蛋白当在体内施用时不扩增Treg细胞群体，并且在小鼠模型中比天然IL2更有效且毒性更低(Carmenate等人,2013,J.Immunol.,190(12):6230-8)。IL2的其他两种突变蛋白(称为F42K和R38A)也具有非常低的对IL2Rα的结合亲和力，并且显示出在体外刺激Treg方面不太有效而有效地扩增LAK细胞(Heaton等人,1994,Ann.Surg.Oncol.,1(3):198-203)。
为了改善用高剂量的IL2进行的疗法的效力，其他工作集中于通过PEG化或将其与抗体(Ab)的Fc部分相融合来增加其半寿期(Zhu等人,2015；Cancer Cell,27:498-501；Charych等人,2016,Clin.Cancer Res.,22(3):680-90)。
过继细胞转移(ACT)被定义为这样的治疗方法，其中从捐献者中抽取免疫系统的细胞，在体外进行培养和/或操作，然后施用给患者以治疗疾病。对于癌症的治疗，在ACT疗法中使用的细胞通常为淋巴细胞(Gattinoni等人,2006,Nat.Rev.Immun.,6:383-393)。在该疗法中，目前流行三种主要的治疗方式：a)离体使用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；b)使用经基因修饰以表达具有更高的对源自肿瘤抗原的肽的亲和力或亲和性的嵌合受体TCR的T或NK细胞；和c)使用经改造以表达对于肿瘤抗原来说特异性的嵌合抗原受体(CAR)的T或NK细胞。后面这两种策略经常与被转移的淋巴细胞的基因改造相组合以刺激其体内效应子功能，例如相关细胞因子的分泌的改造(Cassian Y.,2018,Curr.Opin.Immunol.,51:197-203)。
虽然向肿瘤转移反应性效应T细胞可以引起客观真实的应答，但是无论在人中还是在动物中都存在有力的证据证明，具有中枢记忆表型的T细胞是抗肿瘤应答的优异的介导者(Klebanoffy等人,2005,PNAS,102(27):9571-6)。中枢记忆细胞是已经经历了抗原特异性激活(CD44+)并且保留了CD62L(其对于迁移至外周淋巴结来说是必需的)的表达的细胞(Ridell等人,2014,Cancer J.,20(2):141-144)。中枢记忆T细胞持续更长的时间，这可能归因于其更大的在与抗原(TCF1+)再次相遇后进行增殖和分泌细胞因子例如IL2的能力。相反地，效应T细胞是这样的细胞，其已经与抗原相遇并且具有CD62L表达的显著降低、更高的抑制性标志物(PD1、TIM3和LAG3)的表达和更小的分泌细胞因子的能力，具有更大的在体内转变为经耗竭的细胞的倾向(Kishton等人,2017,Cell.Metab.,26(1):94-109；Klebanoff等人,2005,PNAS,102(27):9571-6)。因此，为了实现更好的ACT疗法，需要开发用于培养T细胞的技术方案，其有利于淋巴细胞朝向中枢记忆细胞分化。
IL2促进T淋巴细胞和NK细胞的体外激活和扩增，因此在开发癌症的ACT疗法中具有主要的作用。所描述的最初策略使用IL2来产生LAK细胞，LAK和全身高剂量IL2的共施用提高单一疗法的临床应答。在另一种策略中，使用高浓度的IL2来扩增来自肿瘤提取物的TIL。TIL在与TCR的体外刺激相组合的IL2存在下经历快速扩增。与全身高剂量IL2的用药制度一起，向患者施用经扩增的TIL，所述用药制度对于支持所转移的细胞的体内持久性做出贡献(Rosenberg,2014,J.Immunol.,192(12)5451-8)。一种更近期的用于提高作为ACT疗法的辅药的全身高剂量IL2的效力的策略开发出了基于配体-受体对的正交化的方法，其中使用与其突变型受体特异性结合(但不与其天然对应物特异性结合)的突变型IL2。用这种策略，作者们通过使用正交IL2-IL2R对而将IL2的信号传导重新引向经改造的T细胞，这限制了不希望的毒性，并且在小鼠癌症模型中在通过使用ACT疗法而减小肿瘤体积和提高存活率方面也是有效的(Sockolosky等人,2018,Science,359(6379):1037-1042)。
虽然IL2对于调节ACT与相关联的T细胞应答具有作用，但是其在记忆T细胞的扩增/分化中的效应尚未完全弄清。在IL2存在下体外扩增的细胞具有强的效应子特性，并且还显示出减损其体内持久性和存活率。IL2以独特且有效的方式促进T细胞的激活和增殖，然而也负责促成通过激活诱导的死亡机制(Spolski等人,2018,Nat.Rev.Immunol.,(18)648-659)。几项研究显示，在体外激活期间减少IL2的信号传导可以有利于CD8+记忆T细胞的发展。IL2信号的减少主要通过降低IL2的浓度或减少在体外培养期间的暴露时间来实现。另一些作者用共同γ链家族的其他细胞因子(主要是IL7、IL15和IL21)部分替代了IL2的使用(Hinrichs等人,2008,Blood,111(11)5326-5333；Mueller等人,2008,Eur.J.Immunol.,38(10)2874-85；Zeng等人,2005,J.Exp.Med.,201(1)139-48；Markley和Sadelain,2010,Blood,115(17)3508-3519；Zhang等人,2015,Clin.Cancer Res.,21(10):2278-88)。因此，IL2的使用仍然是在ACT免疫疗法中T细胞的激活和扩增方面的标准策略。
IL2/IL2R相互作用的复杂性及其在T细胞分化中的牵涉仍然未被完全了解。特别地，通过不同的IL2R(IL2Rαβγ或IL2Rβγ)的优先信号传导对于T淋巴细胞的体外扩增/分化的影响还未被认识。还没有检定上面所描述的IL2突变体中的任何一种以在体外扩增/分化T细胞以用于ACT疗法，也没有报道通过中等亲和力的IL2受体(IL2Rβγ)来优先地引导IL2信号的策略。
本发明的作者通过采用不同的在T淋巴细胞的体外激活/扩增期间通过IL2Rβγ优先地引导信号的策略发现了重大优点。所述策略诱导具有明显的中枢记忆表型和更大的抗肿瘤能力的肿瘤特异性T细胞的有效扩增，相比于传统的培养策略而言，后者在某个点使用天然IL2。本发明允许对于目前的在癌症患者中在ACT疗法中使用之前进行体外细胞扩增/分化的实验方案的重大改进。
发明简述
本发明提供了用于富集和扩增具有中枢记忆表型的淋巴细胞的体外或离体方法，其包括扩增在从受试者获得的样品中的淋巴细胞或从所述样品中分离的淋巴细胞，其中所述扩增包括β/γ二聚体IL2受体的激活。
此外，本发明还提供了用于富集和扩增具有中枢记忆表型的淋巴细胞的体外方法，其包括扩增在从受试者获得的样品中的淋巴细胞或从所述样品中分离的淋巴细胞，其中所述扩增包括β/γ二聚体IL2受体的激活。
本发明提供了用于富集和扩增用于在过继细胞转移疗法中使用的具有中枢记忆表型的淋巴细胞的方法，其中所述扩增包括β/γ二聚体IL2受体的激活。
本发明涉及用于分化和/或扩增至在过继细胞转移疗法中使用的T淋巴细胞和NK细胞的记忆表型的方法，其包括三个步骤。所述步骤为：
i)从受试者中抽取T淋巴细胞和NK细胞，
ii)用保证通过具有中等亲和力的IL2受体(IL2Rβγ)的优先信号传导的策略来在体外扩增和分化所述T淋巴细胞和/或NK细胞，任选地可以改造所述T淋巴细胞和NK细胞，和
iii)向受试者转移经激活的细胞。
特别地，该用于激活T淋巴细胞和NK细胞的方法采用通过IL2Rβγ的优先信号传导的策略，其选自包括下列各项的组：
-将所述T淋巴细胞和NK细胞与具有优先地通过IL2Rβγ进行信号传导的特性的可溶性IL2突变蛋白一起进行培养，
-对所述T淋巴细胞和NK细胞进行基因修饰以使其分泌具有优先地通过IL2Rβγ进行信号传导的特性的IL2突变蛋白，
-在天然IL2和阻断IL2-IL2Rα(CD25)相互作用的药理学试剂存在下培养所述T淋巴细胞和NK细胞，
-在天然IL2存在下培养所述T淋巴细胞和NK细胞，并且对所述T淋巴细胞和NK细胞进行基因修饰以使其分泌阻断IL2-IL2Rα(CD25)相互作用的可溶性蛋白质，
-在天然IL2存在下培养所述T淋巴细胞和NK细胞，并且对所述T淋巴细胞和NK细胞进行基因修饰以降低在细胞表面上IL2Rα(CD25)的表达，和
-在天然IL2存在下培养所述T淋巴细胞和NK细胞，并且对所述T淋巴细胞和NK细胞进行基因修饰以增加IL2Rβγ的表达。
更特别地，所述IL2突变蛋白包含在本发明的SEQ ID NO.1至7中所描述的那些。所述阻断IL2与其受体的α链的相互作用的药理学试剂选自：与IL2或IL2受体的α链相结合的抗体或抗体片段；与IL2或IL2受体的α链相结合的肽或在化学上确定的小分子；和IL2受体的α链的可溶形式或其经修饰的变体。
在另一个实施方案中，在所述方法的第二个步骤中，所述通过IL2Rβγ的信号传导可以在细胞培养的不同时刻发生，或者在体外或在体内保持。在第三个步骤中，所述细胞转移可以对捐献所述细胞的该受试者或对不同的受试者进行。
在一些实施方案中，具有中枢记忆表型的淋巴细胞的扩增包括使用额外的激素、细胞因子和为了扩增淋巴细胞而优化的培养条件。优选地，所述细胞因子为IL12、IL17、IL15和IL21。
特别地，本发明的方法允许延长所转移的细胞的持久性，以及更大的离体、体外和体内抗肿瘤效应。
在某些实施方案中，所述样品获得自淋巴结引流。在另一些实施方案中，所述样品为未处理的肿瘤的碎块、经酶促处理的肿瘤的碎块、解离/悬浮的肿瘤细胞、淋巴结样品或体液样品(例如，血液、腹水或淋巴液)。在某些实施方案中，所述受试者为人。
在另一个方面，在本发明中描述了用于在有此需要的受试者中治疗肿瘤的方法，其包括向所述受试者施用有效量的用本文中所描述的方法获得的淋巴细胞。在某些实施方案中，所述肿瘤为实体肿瘤。在某些实施方案中，所述肿瘤为液态肿瘤。
本发明的目标为所描述的方法用于过继细胞转移疗法的用途，特别地在获得TIL淋巴细胞或T细胞嵌合受体中，和更特别地在癌症治疗中。
本发明的目标为按照所描述的方法获得的细胞。
发明详述
本发明提供了用于富集和扩增具有中枢记忆表型的T淋巴细胞和NK细胞的离体方法，其包括扩增在从受试者获得的样品中的所述群体或从所述样品中分离的淋巴细胞和NK细胞，其中所述扩增包括中等亲和力的受体(IL2Rβγ)的激活。
本发明提供了用于富集和扩增具有中枢记忆表型的T淋巴细胞和NK细胞的体内方法，其包括扩增在从受试者获得的样品中的所述群体或从所述样品中分离的淋巴细胞和NK细胞，其中所述扩增包括IL2Rβγ的激活。
本发明提供了用于富集和扩增用于在ACT疗法中使用的具有中枢记忆表型的T淋巴细胞和NK细胞的方法，其中所述扩增包括IL2Rβγ的激活。
本发明基于在体外和离体改变在T淋巴细胞和NK细胞中的通过IL2受体的信号传导，以用于在ACT疗法中使用。本发明首先提出了在其体内转移之前，用诱导通过IL2Rβγ的优先信号传导的策略来替代在T淋巴细胞和NK细胞的体外激活和培养实验方案中所使用的IL2(和其所产生的天然信号)。这样的策略包括但不限于：
-将所述T淋巴细胞和NK细胞与具有优先地通过IL2Rβγ进行信号传导的特性的可溶性IL2突变蛋白一起进行培养，
-对所述T淋巴细胞和NK细胞进行基因修饰以使其分泌具有优先地通过IL2Rβγ进行信号传导的特性的IL2突变蛋白，
-在天然IL2和阻断IL2-IL2Rα(CD25)相互作用的药理学试剂存在下培养所述T淋巴细胞和NK细胞，
-在天然IL2存在下培养所述T淋巴细胞和NK细胞，并且对所述T淋巴细胞和NK细胞进行基因修饰以使其分泌阻断IL2-IL2Rα(CD25)相互作用的可溶性蛋白质，
-在天然IL2存在下培养所述T淋巴细胞和NK细胞，并且对所述T淋巴细胞和NK细胞进行基因修饰以降低在细胞表面上IL2Rα(CD25)的表达，和
-在天然IL2存在下培养所述T淋巴细胞和NK细胞，并且对所述T淋巴细胞和NK细胞进行基因修饰以增加IL2Rβγ的表达。
本文中所描述的方法提供了用于扩增/分化当在体内转移时在肿瘤控制方面高度有效的、具有中枢记忆表型的、经激活的T细胞和NK细胞的策略。本发明代表了目前的ACT疗法中的重大改进。
按照本发明的方法的细胞的培养可以通过使用合适的培养基并且在适合于体外培养免疫系统细胞的环境条件下进行。细胞的扩增可以在其他细胞因子例如IL12、IL17、IL15和IL21存在下进行。细胞的扩增可以通过使用被报道用于ACT的实验方案中的任一种来进行。在这些实验方案中在其中使用IL2的培养阶段之中，用在本申请中所详细描述的策略中的任一种来替代天然IL2的信号。另外，所述细胞可以或可以不进行改造以：表达CAR；表达具有所希望的特异性的TCR；表达在细胞膜中的其他目的受体；分泌不同的细胞因子或目的可溶性蛋白质。
当提及其所应用至的细胞时，在本发明中所描述的方法涉及下列中的任一个：T细胞的混合物、经纯化的T细胞(CD8+和CD4+)、NK细胞、NKT细胞。所述细胞可以获得自外周血单核细胞、肿瘤引流淋巴结或肿瘤浸润物。
术语“IL2突变蛋白”、“非α突变蛋白”、“非αIL2突变蛋白”、“IL2的部分激动剂”或“IL2突变体”在本文中可互换使用并且是指经突变的IL2蛋白质，其中所述突变诱导IL2Rβγ的激活，优先地与IL2的二聚体受体(IL2Rβγ)相互作用，诱导，具有降低的对IL2Rα的亲和力，或者具有更大的对受体IL2Rβγ的亲和力。这些IL2突变蛋白的非限制性例子为SEQID NO.1-7。
术语“淋巴细胞”和“淋巴样细胞”在本文中可互换使用并且是指任何在受试者中介导免疫性的细胞，包括淋巴细胞、淋巴母细胞和浆细胞。在本发明的一些实施方案中，这些术语是指一类携带对于特定抗原具有特异性的表面受体并且负责适应性免疫应答的血液白细胞。所述细胞可以介导体液免疫和细胞免疫。在本发明的另一些实施方案中，这些术语是指一类不携带对于特定抗原具有特异性的表面受体并且参与先天免疫应答的淋巴细胞。
本文中所提出的策略可以以治疗目的用于在受试者(其可以是人或动物)中以ACT疗法治疗癌症。
在另一个方面，在本发明中描述了用于在有此需要的受试者中治疗肿瘤的方法，其包括向所述受试者施用有效量的用本文中所描述的方法获得的淋巴细胞。在某些实施方案中，所述肿瘤为实体肿瘤(例如，卵巢肿瘤、黑素瘤、肺肿瘤、胃肠肿瘤、乳腺肿瘤)。在某些实施方案中，所述肿瘤为液态肿瘤(例如、白血病或淋巴瘤)。在某些实施方案中，所述肿瘤表达由至少一个包含肿瘤抗原的肽组成的突变。在某些实施方案中，所述受试者为人。
使用优先地通过IL2Rβγ进行信号传导的源自IL2的经改造的细胞因子
本发明的一个实施方案特别地涉及在T细胞激活和扩增的实验方案期间使用优先地通过IL2Rβγ进行信号传导的IL2突变型变体。所述IL2突变型变体包括但不限于：具有降低的对IL2Rα的亲和力的变体，例如在US 9,206,243中所描述的变体，其相应于本发明的序列SEQ ID NO.1-6；以及1994年由Heaton等人所描述的突变蛋白F42，其相应于本发明的SEQID NO.7(Heaton等人,Cancer Res.(1994)53:2597-2602)。
在T淋巴细胞的培养中，除了IL2突变型变体外，还采用用包被有抗-CD3/抗-CD28或特异性抗原的磁珠通过TCR进行刺激。这些IL2突变型变体可以在整个培养期间维持，或者可以在培养的特定阶段中(优选地在激活的最初时刻中)使用。所述IL2突变型变体可以在1ng/ml至1mg/ml，优选地1μg至5μg的浓度范围内使用。
细胞的扩增可以遵循在ACT的背景下所报道的实验方案中的任一个。在其中在传统实验方案中使用天然IL2的培养阶段之中，改为添加IL2突变蛋白。例如，可以是基于用抗-CD3/CD28抗体和IL2突变蛋白培养细胞的实验方案，或者可以将IL2突变蛋白和其他细胞因子例如IL7、IL15、IL12和IL21相组合。
改造细胞以分泌优先地通过IL2Rβγ进行信号传导的IL2突变蛋白
按照在本发明中所描述的方法，可以对细胞进行基因修饰以分泌在本发明中所提及的IL2突变蛋白中的任一种。所述对于细胞的修饰可以用与转导或转染相关并且在ACT技术的背景下广泛使用的经充分描述的方法中的任一种来进行。
例如，这可以通过使用基因组编辑技术或者用于将具有突变蛋白基因的构建体引入细胞中的病毒载体来进行。所述构建体可以包含用于容易地追踪转导效率的报道基因或者用于富集经成功转导的细胞群体的抗生素抗性基因。转导/转染效率应当是高的，至少对于保证在体外扩增期间优先地通过IL2Rβγ的IL2自分泌信号来说足够高。该特别的程序给予细胞关于在体内转移后通过中等亲和力的IL2受体的恒定信号的可用性，从而对细胞的持久性及其抗肿瘤能力做出贡献。
经改造的细胞的扩增可以遵循在ACT的背景下的实验方案中的任一个，但不向培养物添加天然IL2。例如，可以用通过TCR的特异性信号传导，用通过单独的CD3/CD28的激活，和/或与存活细胞因子例如IL7、IL15和IL21相组合地来激活细胞。
在淋巴样细胞的培养物中添加影响IL2/IL2Rα相互作用的药理学试剂
使用本发明的方法的另一个策略在于通过使用药理学试剂来在当在为了ACT的细胞扩增中使用天然IL2时阻断IL2/IL2Rα相互作用。此类试剂的添加使天然IL2的信号优先地偏向IL2Rβγ，这通过阻断IL2接近受体IL2Rα(CD25)来进行。激活/扩增的实验方案可以将通过TCR的特异性信号传导、通过CD3/CD28的激活和其他目的细胞因子相组合。所述药理学试剂和IL2应当总是一起使用并且同时添加在培养物中。所得的通过IL2Rβγ的IL2的部分信号可以在整个培养期间或者在特定的时期阶段中或者优选地在最初的激活阶段期间维持。应当过量使用所述药理学试剂以加强其阻断能力，具体的量应当根据情况进行校准，其中在检查阻断IL2与CD25结合的能力。
本发明中用于阻断IL2-IL2Rα相互作用的药理学试剂包括但不限于：与IL2Rα或IL2相结合的抗体或抗体片段；与IL2Rα或IL2相结合的肽或在化学上确定的小分子；或者IL2Rα的可溶形式或其经修饰的变体。
在与IL2相结合的药理学试剂的情况下，应当验证其阻断与IL2Rα的相互作用而不影响通过IL2Rβγ的结合和信号传导的能力。可以将这些试剂与IL2分开地添加在培养物中，但是也可以事先与IL2相混合以促进所希望的复合物的形成。
细胞的扩增可以遵循在ACT的背景下所报道的实验方案中的任一个，但是在其中在原始实验方案中使用IL2的培养阶段之中还添加药理学试剂。例如，可以是仅仅基于将细胞与抗-CD3/CD28抗体和IL2加上阻断试剂一起进行培养的实验方案，或者可以将IL2加上阻断试剂与其他细胞因子例如IL7、IL15、IL12和IL21相组合。
对细胞进行基因改造以分泌阻断IL2/IL2Rα相互作用的可溶性蛋白质
本发明的另一个策略涉及对细胞进行基因修饰以分泌特异性地阻断IL2/IL2Rα相互作用的可溶性蛋白质。细胞的修饰可以用经充分描述的并且在ACT的背景下广泛使用的转导或转染方法中的任一种来进行。例如，这可以通过使用基因组编辑技术或者用于将具有所希望的蛋白质的基因的构建体引入细胞中的病毒载体来进行。转导/转染效率应当是高的，至少对于细胞产生足够的可溶性蛋白质以在体外扩增期间对IL2/IL2Rα相互作用产生显著的阻断并且优先地通过IL2Rβγ引导信号来说足够高。
根据本发明可以用于阻断IL2/IL2Rα相互作用的蛋白质包括但不限于：与IL2Rα或IL2相结合的抗体或其片段；IL2Rα的可溶形式或其某一经修饰的变体。
细胞的扩增可以遵循在ACT的背景下所报道的实验方案中的任一个；没有在该策略中的任何变化，只是对于细胞的改造来说严格必需的那些。例如，将细胞与抗-CD3/CD28抗体和IL2一起进行的培养可以将IL2与其他细胞因子例如IL7、IL15、IL12和IL21相组合。
改造T淋巴细胞以降低在细胞膜上IL2Rα的表达
本发明的另一个策略涉及对细胞进行基因修饰以减少在细胞表面上IL2Rα的表达。为了进行改造，可以使用几种策略，包括但不限于：干扰RNA、基因组编辑技术和用于敲除特定基因的策略。
细胞的修饰可以用与转导或转染相关并且在ACT技术的背景下广泛使用的经充分描述的方法中的任一种来进行。例如，细胞中CD25的表达的减少或完全取消可以通过使用用于将包含对于阻断IL2Rα表达来说特异性的短发夹RNA的遗传构建物引入细胞中的病毒载体来进行。
细胞的扩增可以遵循在ACT的背景下所报道的实验方案中的任一个；没有在该策略中的任何变化，只是对于细胞的改造来说严格必需的那些。例如，将细胞与抗-CD3/CD28抗体和IL2一起进行的培养可以将IL2与其他细胞因子例如IL7、IL15、IL12和IL21相组合。
改造T淋巴细胞以增加在细胞膜上IL2Rβγ的表达
本发明的另一个策略涉及对细胞进行基因修饰以增加在细胞表面上IL2Rβγ的表达。该策略可以通过使用用于将处于组成性表达启动子之下的具有编码CD122(IL2R的β链)的基因的构建体或者具有编码CD132(IL2R的γ链)的基因的构建体引入细胞中的病毒载体来进行。备选地，在该策略中，可以对细胞进行基因修饰以用具有增加的对IL2的亲和力的CD122突变型变体来替代天然CD122的表达，而不是使用天然CD122。这可以通过使用基因组编辑技术或者借助于用于将具有经突变的CD122基因的遗传构建物引入细胞中的病毒载体来实现。
在所描述的策略中，所述遗传构建物除了目的基因外，还可以包含用于容易且快速地评价转导效率的报道基因，以及用于富集经成功转导的细胞群体的赋予对特定抗生素的抗性的基因。
细胞的扩增可以遵循在ACT的背景下所报道的实验方案中的任一个；没有在该策略中的任何变化，只是对于细胞的改造来说严格必需的那些。例如，将细胞与抗-CD3/CD28抗体和IL2一起进行的培养可以将IL2与其他细胞因子例如IL7、IL15、IL12和IL21相组合。
治疗方法
在一个有关方面，在本发明中描述了用于在有此需要的受试者中治疗肿瘤的方法，其包括向所述受试者施用有效量的通过本文中所描述的方法而产生的淋巴细胞群体。在某些实施方案中，所述肿瘤为实体肿瘤。在某些实施方案中，所述肿瘤为液态肿瘤(例如，血液癌症)。
附图简述
图1.当与天然IL2一起或者与优先地通过中等亲和力的受体IL2Rβγ进行信号传导的IL2突变蛋白一起进行培养时所获得的T细胞表型的比较。A)细胞生存力，B)效应细胞和记忆细胞的百分比。
图2.当以宽浓度范围的天然IL2和优先地通过IL2Rβγ进行信号传导的IL2突变蛋白来培养细胞时所获得的T细胞表型的比较，关于下列方面：A)细胞生存力；B)PD1阳性细胞的百分比；和C)具有中枢记忆表型的细胞的百分比。
图3.当将T细胞与天然IL2和优先地通过T细胞上的IL2Rβγ进行信号传导的IL2突变蛋白以及与之相组合的IL-7和IL-15一起进行培养时重新获得的T细胞表型的比较，关于下列方面：A)细胞生存力；B)效应和记忆细胞的百分比。
图4.当与处于宽剂量范围的天然IL2或优先地通过中等亲和力的受体进行信号传导的IL2突变蛋白以及与之相组合的IL7和IL15一起进行培养时在T细胞上重新获得的表型的比较。A)细胞生存力；B)PD1阳性细胞的百分比；和C)具有中枢记忆表型的细胞的百分比。
图5.当仅用IL2或IL2突变蛋白或者用与IL7和IL15相组合的IL2或IL2突变蛋白刺激细胞时获得的细胞表型的比较。
图6A.显示了eGFP阳性细胞的百分比的直方图，其指明了关于IL2或IL2突变蛋白的转导效率。
图6B.关于当转导淋巴细胞以产生天然IL2或IL2突变蛋白时在培养物中重新获得的记忆和效应细胞的百分比的比较。
图7A.显示了通过使用不同的shRNA在淋巴细胞中CD25的表达降低的效率的直方图。
图7B.关于随着实现在淋巴细胞中CD25表达的更大降低而变化的记忆和效应细胞的百分比的比较。
图8.在CD8+ T细胞上通过使用抗-CD25抗体来引导天然IL2的信号传导朝向IL2Rβγ的效应的比较，关于下列方面：A)细胞生存力；和B)效应和记忆细胞的百分比。
图9.用单独的IL2、IL2+IL15+IL7、单独的IL2突变蛋白或者IL2突变蛋白+IL15+IL7的CD8+ T细胞的功能能力。A)通过用肽SIINFEKL再刺激的CD8+OT1 T细胞的粒酶β的产生；B)与IL2、IL2突变蛋白(单独地或者与IL7和IL15相组合地)一起进行培养的OT1细胞针对B16OVA的细胞毒性能力。
图10.在接受了与天然IL2或与IL2突变蛋白一起进行培养的OT1细胞作为治疗的携带MB16OVA肿瘤的动物中肿瘤体积的测量。
图11.被转导以产生天然IL2或优先地通过IL2Rβγ进行信号传导的IL2突变蛋白的OT1 T细胞的体内抗肿瘤效应的比较。A)肿瘤体积；B)随时间的存活率。
图12.在与IL2或与IL2突变蛋白一起进行培养之前和之后CD8+ TIL的表征，关于下列方面：A)扩增水平；B)通过TIL的Ki-67的表达百分比；和C)幼稚T细胞(CD62L+CD44-)、中枢记忆T细胞(CD62L+CD44+)、记忆效应T细胞(CD62L-CD44+)的分布。
图13.在与IL2或与IL2突变蛋白一起进行培养之前和之后CD8+ TIL的表征，关于下列方面：A)抑制性标志物的表达百分比；B)INFγ、TNFα、粒酶β的产生。
图14.在与IL2或与IL2突变蛋白一起进行培养的TIL中NK细胞的扩增。A)NK细胞的百分比；B)NK细胞的数目。
实施例
实施例1.用优先地通过IL2Rβγ进行信号传导的IL2突变蛋白替代天然IL2保存了淋巴细胞和生存力并且赋予中枢记忆表型
从OT1系小鼠的脾脏中分离幼稚CD8+ T细胞。对于TCR的刺激，使用包被有抗-CD3/抗-CD28抗体的磁珠七天，另外将用天然IL2或者在分子免疫学中心(Center of MolecularImmunology)获得(批次号1201602)且在专利US 9,206,243的SEQ ID NO.6中公开的IL2突变蛋白进行的刺激维持十天。每两天扩大培养物以维持1×106的细胞密度并且与新鲜培养基一起添加细胞因子。在所述两种培养条件下都达到大量T细胞的成功扩增并且观察到相似的增殖水平。在图1A中观察到，通过使用IL2突变蛋白来刺激OT1细胞，显著地改善了细胞生存力(其通过流式细胞术来测量)(p<0.0001)，相比于用天然IL2进行刺激的细胞而言。另外，通过流式细胞术测量了记忆细胞的数量以及激活和抑制标志物的表达。相比于用天然IL2进行刺激的细胞而言，用突变蛋白进行刺激的细胞显示出显著地更大百分比的中枢记忆表型(p<0.0001)，其由标志物CD62L+/CD44+来定义(图1B)。标志物PD-1、Klrg1、Lag-3和Tim-3的表型分析显示，用IL2突变蛋白激活的细胞抑制免疫系统检查点的配体(PD-1、Klrg1、Lag-3和Tim-3)的表达(表1)。
表1.针对所使用的两种刺激变体的不同的耗竭标志物的表达(阳性细胞的％)
标志物 天然IL2 IL2突变蛋白
PD1 2.61 0.38
TIM3 17.0 0.42
Lag3 79.9 15.9
Klrg1 12.4 0.06
对于用IL2突变蛋白进行刺激的细胞和对于用天然IL2进行刺激的细胞，在生存力(图2A)、PD1的表达(图2B)和CD62L的表达(图2C)方面都在一定的剂量范围内保持了上面所描述的效应。
这些结果共同表明，用具有通过IL2Rβγ的优先刺激的IL2突变蛋白替代天然IL2促进朝向中枢记忆表型而不是朝向天然IL2所诱导的效应子表型的分化。IL2突变蛋白赋予更大的关于淋巴细胞再循环的潜力(更高的CD62L表达)和更大的对于耗竭的抵抗力(更低的PD1表达)，其是对于T细胞的体内转移来说所更希望的表型。
实施例2.用优先地通过IL2Rβγ进行信号传导的IL2突变蛋白替代天然IL2在与IL7和IL15相组合的培养实验方案中有利于中枢记忆表型
如由其他作者所描述的，IL7和IL15与IL2的组合相比于仅IL2而言改善了T细胞的性能(Redeker和Arens,2016,Front Immunol.6(7):345)。在我们的实验中，在培养中将IL2或IL2突变蛋白与IL7和IL15相组合以激活/扩增OT1细胞。
在该策略中，对于TCR的刺激，使用与实施例1相同的程序。在培养开始之时向添加IL2或IL2突变蛋白直至第五天，然后将细胞与IL-7/IL-15一起维持十天。在该情景下，这两种培养条件都提供了相似的在培养物中的细胞密度、高的生存力(图3A)，并且有利于记忆细胞而不是效应细胞的流行。然而，与突变蛋白一起进行培养的细胞显示出相比于与天然IL2一起进行培养的细胞而言更高的在培养物中的中枢记忆细胞的比例(p<0.0015)，如在图3B中所显示的。
而与突变蛋白一起进行培养的细胞显示出更低的耗竭标志物的表达，如在表2中所观察到的。
表2.当与IL7和IL15相组合地使用天然IL2或IL2突变蛋白来进行体外激活/扩增时不同的耗竭标志物的表达(阳性细胞的％)
标志物 天然IL-2 IL-2突变蛋白
PD1 1.69 0.48
TIM3 10.3 0.18
Lag3 84.3 21.1
Klrg1 6.07 0.05
作为与IL7和IL15相组合的实验方案的一部分，评价了不同浓度的天然IL2和IL2突变蛋白，并且证明所描述的效应在确定的剂量范围内是相似的，关于下列方面：细胞生存力(图4A)、PD1的表达(图4B)和记忆细胞的流行(图4C)。
虽然当与仅天然IL2相比较时天然IL2与IL7和IL15的组合改善了培养条件，但是当在组合实验方案中使用IL2突变蛋白时，未观察到改善，这是由于单独的突变蛋白在保存细胞生存力和诱导中枢记忆表型方面就是高度有效的。另外，单独的IL2突变蛋白在诱导经激活的T细胞中的中枢记忆表型方面与IL2、IL7和IL15的组合一样有效(图5)。
实施例3.为了产生优先地通过IL2Rβγ进行信号传导的突变蛋白而改造的T细胞获得中枢记忆表型
为了在体外和体内都获得细胞因子的连续供应来源，对T细胞进行基因修饰以产生在实施例1中所提及的IL2突变蛋白。使用编码绿色荧光蛋白(eGFP)和天然IL2或IL2突变蛋白的逆转录病毒构建体。转导程序通过用包被有抗-CD3/抗-CD28抗体的磁珠和用天然IL2或用IL2突变蛋白刺激刚刚分离的OT1小鼠的幼稚T细胞来起始。在24和48小时，向在包被有retronectin的平板中的细胞添加浓缩的逆转录病毒载体上清液。在转导之后，用包被有抗-CD3/抗-CD28抗体的磁珠将TCR的刺激维持7天，连同IL-7/IL-15一起10天。通过测量eGFP来确认转导效率，并且证实用天然IL2和用突变蛋白都高于80％(图6A)。在转导之后，在培养物上清液中通过ELISA来定量所分泌的天然IL2或IL2突变蛋白分子。
与当将OT1 T细胞与可溶性IL2突变蛋白一起进行培养时所观察的相似地，用其进行改造的细胞相比于结果多数为效应子类型的用天然IL2进行改造的细胞而言具有中枢记忆表型(p<0.0001)(图6B)，并且显示出更低的耗竭标志物的表达(表3)。
表3.在用天然IL2或IL2突变蛋白进行改造后耗竭标志物的表达(阳性细胞的％)
标志物 天然IL2 IL2突变蛋白
PD1 3.02 0.67
TIM3 17.0 0.35
Lag3 80.1 36.2
所有这些结果显示，促进通过IL2Rβγ的信号传导有利于向中枢记忆细胞的分化，尽管具有连续不断和持续的信号传导。
实施例4.用于降低在淋巴细胞中CD25的表达的基因改造有利于在用天然IL2激活的T细胞中的中枢记忆表型
使用编码eGFP和短发夹RNA(shRNA)的载体，旨在阻断IL2的α链(CD25)的基因的表达。转导程序通过用包被有抗-CD3/抗-CD28抗体的磁珠和用天然IL2刺激刚刚分离的OT1小鼠的幼稚T细胞来起始。使用三种不同的shRNA构建物，并且获得不同的敲低效率，基于在表面上CD25的表达。作为转导的对照，使用编码eGFP和不影响IL2的α链的基因的表达的shRNA的构建物。在两轮转导后，用IL2(50IU/ml)将细胞在培养物中维持五天。通过流式细胞术来测量CD25表达的降低(图7A)。当实现CD25表达的更多减少时，在用IL2进行刺激后中枢记忆细胞的百分比是高的(图7B)。
通过减少CD25表达提供了关于用IL2通过IL2Rβγ进行刺激的情景，并且在这些条件下有利于向中枢记忆的CD8+ T细胞的分化。
实施例5.通过用IL2刺激细胞并且同时经由向培养物添加的药理学试剂阻断与CD25的相互作用来获得中枢记忆表型
在为了引导通过IL2Rβγ的信号传导的另一个试验中，使用针对CD25的抗体连同天然IL2一起用于在体外激活T细胞。将OT1小鼠的T细胞与包被有抗-CD3/抗-CD28抗体的磁珠和与50IU/ml的IL2和10μg/ml的抗-CD25单克隆抗体(BioLegend克隆3C7)一起进行培养。从第0天起添加抗-CD25抗体，并且当每两天添加具有天然IL2的新鲜培养基时进行更新直至完成10天。作为对照，使用与所使用的抗-CD25抗体相同的同种型的具有无关特异性的抗体。在该时间过后，观察到在用天然IL2进行激活期间添加抗-CD25抗体增加了细胞生存力和中枢记忆T细胞群体，相比于同种型对照而言(p<0.0001)(分别地，图8A和8B)。此外，观察到通过向培养物添加抗-CD25抗体，细胞具有更低的耗竭标志物的表达(表4)。
表4.在用抗-CD25抗体连同天然IL2或IL2突变蛋白一起进行阻断后细胞的耗竭标志物的表达
标志物 同种型对照 抗-CD25
PD1 4.12 3.33
TIM3 18.5 0.54
Lag3 80.2 21.3
这些结果暗示，通过经由阻断与CD25的相互作用来引导通过IL2Rβγ的信号，细胞被引向适合于过继细胞转移疗法的中枢记忆表型。
实施例6.接受了通过IL2Rβγ的优先激活的T细胞在体外显示出有效的T细胞的抗原特异性细胞毒性
为了验证通过IL2Rβγ激活的中枢记忆T细胞的功能能力，进行细胞毒性试验。使用用在实施例1和3中所描述的方法激活的OT1小鼠的T细胞。用其特异性抗原(肽SIINFEKL)刺激这些细胞，并且通过流式细胞术来测定产生粒酶β的能力。为了评价细胞毒性能力，将用在实施例1和3中所描述的方法激活的OT1细胞与为了在其表面上表达模式抗原OVA而转导的B16黑素瘤细胞(B16-OVA)一起以1:1的比例进行共培养；作为对照，使用未转导的B16黑素瘤细胞。向培养物添加试剂IncuCyteCytotox，并且每两个小时监测细胞死亡，总共60小时。确认了靶细胞的裂解是抗原特异性的，因为在对照细胞中未获得裂解。
用优先地通过IL2Rβγ进行信号传导的IL2突变蛋白激活的OT1细胞显示出离体的有效的直接裂解活性，这证明当通过IL2Rβγ指导信号传导时，向着强有力的细胞毒性细胞进行分化(图9A和B)。
实施例7.当在过继细胞转移模型中使用时，接受了通过IL2Rβγ的激活的T细胞显示出更好的抗肿瘤活性
OT1小鼠模型连同肿瘤细胞系B16/OVA一起代表了过继细胞疗法的临床前近似。作为接受者，使用接受了1×105个表达肽OVA的黑素瘤细胞的皮下注射的C57BL/6系小鼠，十天过后对其用亚致死剂量(5Gy)进行辐射。将动物分为四个处理组，并且在第11和15天以下列形式接受1×106个经激活的OT1小鼠的T细胞的静脉内转移：
组1：未接受治疗(对照)；
组2：用天然IL2激活的OT1 T细胞(如在实施例1中所描述的那样)；
组3：用IL2突变蛋白激活的OT1 T细胞(如在实施例1中所描述的那样)；
组4：用与IL7+IL15相组合的IL2突变蛋白激活的OT1 T细胞(如在实施例2中所描述的那样)。
如在图10中所观察到的，使用用IL2突变蛋白激活的细胞的ACT疗法相比于用天然IL2激活的细胞而言更好地控制了肿瘤生长。这些结果表明，通过用IL2突变蛋白激活细胞所获得的具有低的耗竭标志物表达的最初所诱导的记忆表型是对于在体内控制肿瘤来说有效的策略。
实施例8.当在过继细胞转移中使用时，为了产生优先地通过IL2Rβγ进行信号传导的IL2突变蛋白而改造的T细胞显示出稳固的抗肿瘤活性
为了改善ACT方法的有效性，对T细胞进行基因改造以产生IL2突变蛋白。基因的插入允许在体外和在体内在T细胞中突变蛋白的连续和持续的信号。作为接受者，使用接受了1×105个表达肽OVA的黑素瘤细胞的皮下注射的C57BL/6系小鼠，十天过后对其用亚致死剂量(5Gy)进行辐射。将动物分为三个处理组，并且在第11和15天以下列形式接受1×106个OT1小鼠的T细胞的静脉内转移：
组1：未接受治疗(对照)；
组2：为了产生天然IL2而改造的OT1 T细胞(转导实验方案与在实施例3中所使用的相同)；
组3：为了产生IL2突变蛋白而改造的OT1 T细胞(转导实验方案与在实施例3中所使用的相同)。
图11显示，接受了为了产生IL2突变蛋白而改造的细胞的动物经历所建立的肿瘤的生长的控制(图11A)和更高的存活率(图11B)。
实施例9.通过使用IL2突变蛋白来产生TIL
由于ACT疗法可以通过使用TIL来进行，因此评价IL2突变蛋白对于这些淋巴细胞的扩增的效应。为了研究在TIL中β/γ二聚体IL2受体的激活的作用，在肿瘤细胞接种后第19-21天之间从C57BL/6小鼠中分离MC38肿瘤。以机械方式解离肿瘤，并且在天然IL2或IL2突变蛋白存在下培养14-16天。发现当在培养条件下使用IL2突变蛋白时，TIL的扩增更大。相一致地，IL2突变蛋白增加TIL的增殖率(图12A和B)。另外，与IL2突变蛋白一起离体培养的TIL显示出中枢记忆T细胞的显著扩增，相比于对照而言(图12C)。总而言之，这些数据显示，用IL2突变蛋白进行扩增的TIL具有更大的维持记忆表型的增殖。
实施例10.用IL2突变蛋白进行扩增的TIL是多功能的并且显示出激活和耗竭标志物的减少
在扩增之前对于用在实施例9中所使用的方法获得的TIL进行表型的及其功能特性的表征，将这些细胞在抗-CD3和抗-CD2抗体存在下刺激4小时。
发现抑制性受体PD-1、Lag-3和Tim-3在用IL2突变蛋白进行扩增的TIL中急剧地减少(图13A)。关于其功能性，发现用IL2突变蛋白进行扩增的细胞显示出INFγ、TNFα和粒酶β的产生(图13B)。总之，这些结果显示了IL2突变蛋白扩增TIL并且使它们朝向中枢记忆表型富集而不危及其功能性的能力。
实施例11.通过使用IL2突变蛋白来在TIL中产生NK细胞
为了研究β/γ二聚体IL2受体的激活在所扩增的全部TIL之中的NK细胞的比例方面的作用，在肿瘤细胞接种后第19-21天之间从C57BL/6小鼠中分离MC38肿瘤。以机械方式解离肿瘤，并且在天然IL2或IL2突变蛋白存在下培养14-16天。与IL2突变蛋白一起离体培养的TIL相比于天然IL2而言显示出NK细胞的显著扩增，在占总体的比例(图14A)和绝对数目(图14B)方面。
序列表
<110> Centro de Inmunologia Molecular
<120> 用于扩增和分化在过继转移疗法中的T淋巴细胞和NK细胞的方法
<130> 602018CU00
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 通过重组DNA技术
<400> 1
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Lys Met Leu Thr Ile Lys Phe Asn Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Leu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Val Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 2
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 通过重组DNA技术
<400> 2
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1 5 10 15
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20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 3
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 通过重组DNA技术
<400> 3
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130
<210> 4
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 通过重组DNA技术
<400> 4
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Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
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<220>
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<400> 5
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<211> 133
<212> PRT
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<220>
<223> 通过重组DNA技术
<400> 6
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<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 通过重组DNA技术
<400> 7
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Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130

Claims (30)

1.用于分化和扩增在过继细胞转移疗法中使用的具有中枢记忆表型的T淋巴细胞和NK细胞的方法，其包括三个步骤：
i)从受试者中抽取T淋巴细胞和/或NK细胞，
ii)用保证通过具有中等亲和力的IL2受体(IL2Rβγ)的优先信号传导的策略来在体外扩增和分化所述T淋巴细胞和/或NK细胞，任选地可以改造所述T淋巴细胞和NK细胞，和
iii)向受试者转移经激活的细胞。
2.根据权利要求1的方法，其中用于诱导通过IL2Rβγ的优先信号传导的策略选自包括下列各项的组：
-将所述T淋巴细胞和NK细胞与具有优先地通过IL2Rβγ进行信号传导的特性的可溶性IL2突变蛋白一起进行培养，
-对所述T淋巴细胞和NK细胞进行基因修饰以使其分泌具有优先地通过IL2Rβγ进行信号传导的特性的IL2突变蛋白，
-在天然IL2和阻断IL2-IL2Rα(CD25)相互作用的药理学试剂存在下培养所述T淋巴细胞和NK细胞，
-在天然IL2存在下培养所述T淋巴细胞和NK细胞，并且对所述T淋巴细胞和NK细胞进行基因修饰以使其分泌阻断IL2-IL2Rα相互作用的可溶性蛋白质，
-在天然IL2存在下培养所述T淋巴细胞和NK细胞，并且对所述T淋巴细胞和NK细胞进行基因修饰以降低在细胞表面上IL2Rα的表达，和
-在天然IL2存在下培养所述T淋巴细胞和NK细胞，并且对所述T淋巴细胞和NK细胞进行基因修饰以增加IL2Rβγ的表达。
3.根据权利要求2的方法，其中所述IL2突变蛋白选自包括下列各项的组：
-SEQ ID NO.1，
-SEQ ID NO.2，
-SEQ ID NO.3，
-SEQ ID NO.4，
-SEQ ID NO.5，
-SEQ ID NO.6，和
-SEQ ID NO.7。
4.根据权利要求2的方法，其中阻断IL2与其受体的α链相互作用的药理学试剂选自包括下列各项的组：
-与IL2或IL2受体的α链相结合的抗体或抗体片段，
-与IL2或IL2受体的α链相结合的肽或在化学上确定的小分子，和
-IL2受体的α链的可溶形式或其经修饰的变体。
5.权利要求1的方法，其中该第三个步骤可以对捐献所述细胞的同一个受试者或对不同的受试者进行。
6.根据权利要求2的方法，其中所述通过IL2Rβγ的信号传导可以在细胞培养的不同时刻发生，或者在体外和在体内保持。
7.根据权利要求1-6的方法，其用于延长所转移的细胞的持久性和更大的体外和体内抗肿瘤效应。
8.根据权利要求1-6的方法，其与从包括下列各项的组中选择的其他细胞因子相组合：
-IL12，
-IL17，
-IL15，和
-IL21。
9.根据权利要求1的方法，其中所述T淋巴细胞和/或NK细胞可以为下列中的任一个：T细胞的混合物、经纯化的CD4或CD8 T细胞、NK细胞或NKT细胞。
10.根据权利要求1的方法，其中在步骤i中的所述T淋巴细胞和/或NK细胞可以获得自外周血单核细胞、淋巴结引流或肿瘤浸润物。
11.根据权利要求1的方法，其中另外可以改造所述T淋巴细胞和/或NK细胞，以表达抗原嵌合受体，具有所希望的特异性的T细胞受体，在细胞膜上的其他令人感兴趣的受体，分泌不同的令人感兴趣的细胞因子或可溶性蛋白质。
12.权利要求1-6中任一项的方法用于过继细胞转移疗法的用途。
13.根据权利要求9的在获得肿瘤浸润淋巴细胞或T细胞嵌合受体中的用途。
14.根据权利要求11-12的在治疗癌症中的用途。
15.按照权利要求1-6的方法获得的细胞。
16.用于离体富集和扩增具有记忆表型的淋巴细胞的方法，其包括：
a)从受试者中获得淋巴细胞群体，
b)扩增所述淋巴细胞，其中于在所述淋巴细胞中激活IL2的二聚体受体的条件下培养所述细胞。
17.权利要求16的方法，其中步骤(b)通过使用至少一种IL2突变蛋白来进行。
18.权利要求16的方法，其中步骤(b)通过调节IL2受体的至少一个亚基的表达来进行。
19.权利要求18的方法，其中所述IL2受体的亚基为α(CD25)、β或γ。
20.权利要求16的方法，其中步骤(b)通过抑制IL2受体与其关联蛋白质的相互作用来进行。
21.权利要求20的方法，其中IL2受体与其关联蛋白质的相互作用的抑制通过IL2受体的α亚基的下调或者通过β和γ亚基的上调而发生。
22.权利要求20的方法，其中IL2受体与其关联蛋白质的相互作用的抑制通过将所述细胞与抗-CD25抗体一起进行温育而发生。
23.权利要求16的方法，其中步骤(b)通过用编码IL2突变蛋白的表达和分泌的核酸转导所述淋巴细胞来进行。
24.通过权利要求16-23中任一项获得的药用组合物。
25.在有此需要的受试者中治疗癌症的方法，其包括施用具有中枢记忆表型的淋巴细胞，所述方法包括下列步骤：
a)从受试者中获得淋巴细胞群体，
b)扩增所述淋巴细胞，其中于在所述淋巴细胞中激活IL2的二聚体受体的条件下培养所述细胞，
c)向所述受试者施用治疗有效剂量的来自步骤(b)的淋巴细胞。
26.权利要求25的方法，其中βγ二聚体IL2受体的激活包括将所述淋巴细胞与IL2突变蛋白一起进行温育。
27.权利要求25的方法，其中βγ二聚体IL2受体的激活包括在所述淋巴细胞中引入编码IL2突变蛋白的核苷酸序列。
28.权利要求25的方法，其中βγ二聚体IL2受体的激活包括引入用于在所述淋巴细胞中上调IL2受体的β和γ亚基的表达的核苷酸序列，并且将所述淋巴细胞与天然IL2一起进行温育。
29.权利要求25的方法，其中βγ二聚体IL2受体的激活包括引入用于在所述淋巴细胞中下调IL2受体的α亚基的核苷酸序列，并且将所述淋巴细胞与天然IL2一起进行温育。
30.权利要求25的方法，其中βγ二聚体IL2受体的激活包括将所述淋巴细胞与天然IL2和抗-CD25抗体一起进行温育。
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