TW202305120A - 新穎方法 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及一種擴增γδ T細胞的方法，包括製備一富含γδ T細胞的組成物和在飼養細胞存在下培養該組成物。還提供了一種工程化γδ T細胞的方法，包括製備一富含γδ T細胞的組成物，轉導該組成物以表現一腫瘤相關抗原具有特異性的一嵌合抗原受體（CAR）和培養轉導的組成物以擴增工程化的γδ T細胞。還提供了根據所述方法產生的擴增的和工程化的γδ T細胞，其在過繼性T細胞療法、嵌合受體療法等中具有實用性。
Description
本發明涉及擴增γδ T細胞的方法，所述方法包括製備一富含γδ T細胞的組成物和在飼養細胞存在下培養所述組成物的步驟。還提供了一種工程化γδ T細胞的方法，所述方法包括以下步驟：製備一富含γδ T細胞的組成物，轉導該組成物以表現對腫瘤相關抗原具有特異性的嵌合抗原受體（CAR），並培養轉導的組成物以擴增工程化的γδ T細胞。這類γδ T 細胞包括非-Vδ2 細胞，例如Vδ1、Vδ3和Vδ5細胞。根據本文所述方法所產生的擴增的和工程化的γδ T細胞被發現可用於過繼性T細胞療法、嵌合受體療法等。本發明還涉及透過本文所述方法產生的單一細胞和細胞群。
對於癌症T細胞免疫療法日益增長的興趣集中在CD8
+和CD4
+αβ T細胞亞群識別癌細胞、以及介導宿主保護功能潛力的明顯能力上，特別是透過藉由PD-1、CTLA-4 和其他受體作用的抑制路徑的臨床介導拮抗的去壓抑。然而，αβ T細胞是MHC限制的（MHC-restricted），這可導致同種異體環境中的移植物對抗宿主疾病（graft versus host disease）。
採用過繼性細胞療法（adoptive cell therapy）治療癌症大部分僅限於基於循環的、患者來源的、工程化的自體αβ T細胞的平台。儘管在某些血液科惡性疾病中取得了成功，但這種方法帶來了挑戰，包括相關的毒性、高生產成本以及在同種異體環境中使用時需要基因編輯細胞以避免移植物對抗宿主疾病。雖然工程化的αβ T細胞（engineered αβ T cells）在血液科惡性疾病中顯示出治療活性，但在實體瘤中的臨床活性一直受到挑戰。
伽馬德爾塔T細胞（gamma delta T細胞，γδ T細胞）是代表T細胞的一個子集，它們在其表面表現獨特的、定義的γδ T細胞受體（T-cell receptor，TCR）。此TCR由一個伽馬（γ） 和一個德爾塔（δ）鏈所組成。人γδ TCR鏈選自三個主要的δ鏈（Vδ1、Vδ2和 Vδ3）以及六個γ鏈。人γδ T細胞可根據它們的TCR鏈進行廣泛分類，因為某些γ和δ類型在一或多種細胞類型上更常發現（雖然並非僅限於此）。例如，大部分血液駐留γδ T細胞（blood-resident γδ T cell）表現Vδ2 TCR（例如Vγ9Vδ2），而這在組織駐留γδ T細胞（tissue-resident γδ T cell）中不太常見，其更頻繁地在皮膚中使用Vδ1，在腸道中使用Vγ4。
因此，與αβ T細胞相比，Vδ1 γδ T細胞是由與Vδ1鏈配對的γ鏈組成的T細胞受體的表現所定義的先天T細胞子集。在小鼠中，Vδ1 γδ T細胞主要存在於組織中，透過模式和天然細胞毒性受體識別的介導性抗腫瘤反應，它們對廣泛的癌症具有高度保護作用。類似地，在人類中，Vδ1 γδ T細胞主要存在於上皮組織內，介導非MHC限制的且非同種異體HLA反應的靶細胞識別。因此，γδ T細胞過繼性細胞療法不需要患者的HLA匹配。先天的Vδ1 γδ T細胞生物學能夠識別抗原非依賴性腫瘤、不需要HLA匹配、以及內在遺傳的遷移且駐留在人體組織中，使Vδ1 γδ T細胞成為吸引人的細胞治療平台。
因此，需要有效擴增γδ T細胞的方法，以使其適合作為治療（例如作為過繼性T細胞療法），以及有可能提供同種異體「現成」嵌合抗原受體表現的γδ T細胞療法的方法，例如治療實體瘤。
WO2017072367和WO2018202808涉及藉由將獲自非造血組織的淋巴細胞培養在至少有介白素-2（IL-2）和/或介白素-5（IL-5）的存在下進行體外擴增非造血組織駐留γδ T細胞的方法。WO2015189356描述了一種組成物，該組成物用於擴增藉由血球分離術獲得的樣品的淋巴細胞，包括至少兩種選自IL-2、IL-15和IL-21的細胞因子。
因此，儘管這些公開內容在某種程度上解決了上述問題，但仍需要擴增和工程化γδ T細胞（例如來自皮膚）的方法，以提供在治療中使用這類γδ T細胞的能力。
根據本發明的第一態樣，提供了一種擴增γδ T細胞的方法，其中該方法包括步驟：
（i）製備一富含γδ T細胞的組成物；和
（ii）在飼養細胞存在下培養該組成物，其中該飼養細胞以至少4：1（飼養細胞：γδ T細胞）的比例存在。
根據本發明的另一態樣，提供了一種擴增γδ T細胞的方法，其中該方法包括步驟：
（i）製備一富含γδ T細胞的組成物；和
（ii）在飼養細胞和包含IL 15和IL-21的培養基存在下培養該組成物，其中該飼養細胞以至少3：2（飼養細胞：γδT細胞）的比例存在。
根據本發明的另一態樣，提供了一種擴增γδ T細胞的方法，其中該方法包括步驟：
（i）透過αβ T細胞的耗盡製備一富含γδ T細胞的組成物；和
（ii）在飼養細胞存在下培養該組成物，其中該飼養細胞以至少3：2（飼養細胞：γδ T細胞）的比例存在。
根據本發明的又一態樣，提供了一種工程化γδ T細胞的方法，該方法包括步驟：
（i）製備一富含γδ T細胞的組成物；
（ii）在沒有TCR刺激的情況下轉導該組成物以表現識別一腫瘤抗原的一嵌合抗原受體（CAR）；和
（iii）培養轉導的組成物以擴增工程化的γδ T細胞，
其中步驟（ii）和（iii）可以按順序或同時進行。
根據本發明的一態樣，提供一種擴增的γδ T細胞群，其是可獲得的，例如透過本文所述的方法獲得。根據另一態樣，提供一種工程化的γδ T細胞群，其是可獲得的，例如透過本文所述的方法獲得。
根據本發明另一態樣，提供了一種醫藥組成物，該醫藥組成物包括如本文所述之擴增的γδ T細胞群或工程化的γδ T細胞群。
根據本發明的又一態樣，提供了如本文所述之擴增的γδ T細胞群、工程化的γδ T細胞群或醫藥組成物，用作為一藥物。在另一態樣，提供如本文所述的擴增的γδ T細胞群、工程化的γδ T細胞群或醫藥組成物，用於治療癌症，例如用於治療實體瘤。
亦提供一種擴增γδ T細胞的方法，其中該方法包括步驟：
（i）製備一富含γδ T細胞的組成物；和
（ii）在飼養細胞存在下培養該組成物，其中該飼養細胞以至少1：2（飼養細胞：γδ T細胞）的比例存在，尤其是至少1：1（飼養細胞：γδ T細胞），特別是至少2：1（飼養細胞：γδ T細胞），例如至少3：1（飼養細胞：γδ T細胞）。
亦提供一種擴增γδ T細胞的方法，其中該方法包括步驟：
（i）製備一富含γδ T細胞的組成物；和
（ii）在飼養細胞和包含IL 15和IL-21的培養基存在下培養該組成物，其中該飼養細胞以至少1：2（飼養細胞：γδ T細胞）的比例存在，例如至少1：1（飼養細胞：γδ T細胞）。
亦提供了一種擴增γδ T細胞的方法，其中該方法包括步驟：
（i）透過αβ T細胞的耗盡製備一富含γδ T細胞的組成物；和
（ii）在飼養細胞存在下培養該組成物，其中該飼養細胞以至少1：2（飼養細胞：γδ T細胞）的比例存在，例如至少 1：1（飼養細胞： γδ T細胞）。
先前已報導，γδ T細胞群可使用輻照人工抗原呈現細胞（aAPC）作為飼養細胞來擴大到臨床規模（Deniger
et al., Clin. Cancer Res., 2014; 20（22）： 5708–5719）。這類 aAPC是源自K562腫瘤細胞並表現CD137L（在IL-2和IL-21存在的情況下），導致多克隆γδ T細胞群的活化和增殖。然而，這類方法需要對K562腫瘤細胞進行基因修飾，以使其發揮aAPC的功能並支持γδ T細胞擴增和活化，並且透過照射來阻止這些腫瘤衍生的aAPC的生長。
因此，根據本發明的第一態樣，提供了一種擴增γδ T細胞的方法，其中該方法包括步驟：
（i）製備一富含γδ T細胞的組成物；和
（ii）在飼養細胞存在下培養該組成物，其中該飼養細胞以至少4：1的比例存在（飼養細胞：γδ T細胞）。
本文所述的方法在人體或動物體外進行，即它們在體外和/或離體進行。因此，在一實施例中，本文所述的方法是體外方法。在另一實施例中，本文所述的方法是離體方法。
如本文所用，提及「擴增的」、「擴增的群體」或「擴增的γδ T細胞」包括比未擴增的群體更大或包含更多細胞數量的細胞群。這樣的群體可為數量多、數量少或混和的群體，在群體中一部份或是特定細胞類型的擴增。應當理解的是，術語「擴增步驟」是指涉導致擴增或擴增群體的過程。因此，與未進行擴增步驟或在任何擴增步驟之前的群體相比，擴增或擴增的群體在數量上可能更多或包含更多數量的細胞。還應理解的是，本文中所指擴增（例如倍數增加或倍數擴增）的任何數字是說明細胞群的數量或大小的增加或是細胞數的增加，且為擴增數量的指標。
應當理解的是，對γδ T細胞組成物的培養是持續一段時間以有效生產擴增的γδ T細胞群。在一實施例中，有效生產擴增的γδ T細胞群的持續時間為至少7天。因此，在一實施例中，將γδ T細胞的組成物培養至少7天。在另一實施例中，將組成物培養7至21天，例如9至15天。於再一實施例中，將組成物培養約10、11、12、13或14天。
於另一實施例中，將組成物培養至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天或至少21天，例如約14天或約21天以產生擴增的γδ T細胞群。於一實施例中，將組成物培養約10、11、12、13或14天以產生擴增的γδ T細胞群。
合適地擴增γδ T細胞群提供至少5倍、尤其是至少10倍、尤其是至少20倍，例如至少50倍，例如至少100倍數量的γδ T細胞。
在一實施例中，該方法包括冷凍擴增的γδ T細胞。這類冷凍擴增的γδ T細胞接著可解凍以用於下游加工或用途，例如治療用途。冷凍使擴增的γδ T細胞易於運輸和長期儲存，並且在本領域中是眾所周知的。因此，提供一種使細胞在冷凍和解凍後顯示出良好存活率和活性的方法是有利的，並且並非所有擴增方法都產生這樣的細胞（數據未顯示）。
至少4：1的飼養細胞：γδ T細胞比例等於培養物中至少80%的飼養細胞與20%或更少的γδ T細胞比例。與在沒有飼養細胞的情況下培養的γδ T細胞群相比，這種飼養細胞：γδ T細胞的比例大幅增加了培養物中的γδ T細胞群的擴增（圖2至3）。此外，即使在最高程度的飼養細胞添加下，這些培養物中的CD45
+群中γδ T細胞的純度也會增加（數據未顯示）。在培養的所有時間點都可以看到這些有利的效果，特別是在培養的第14天和第21天。
因此，在一實施例中，培養物包含至少80%的飼養細胞。在一些實施例中，飼養細胞以約10：1至約99：1（飼養細胞：γδ T細胞）的比例存在。在一實施例中，飼養細胞以至少10：1（飼養細胞：γδ T細胞）的比例存在。因此，在另一實施例中，培養物包含至少90%的飼養細胞。在另一實施例中，飼養細胞以至少20：1（飼養細胞：γδ T細胞）的比例存在。因此，根據一個實施例，培養物包含至少95%的飼養細胞。在另一實施例中，飼養細胞以至少50：1（飼養細胞：γδT細胞）的比例存在。因此，在一實施例中，培養物包含至少98%的飼養細胞。在又一實施例中，飼養細胞以至少99：1（飼養細胞：γδT細胞）的比例存在。因此，在另一實施例中，培養物包含至少99%的飼養細胞。與在沒有飼養細胞的情況下培養的γδ T細胞群相比，本文所測試的所有比例都大幅增強了培養中的γδ T細胞群的擴增（圖 1），當飼養細胞以約10：1的比例存在時（即，培養物中包括大約90%的飼養細胞），γδ T細胞的產量和純度特別優良。
根據本發明的飼養細胞可以是未修飾的自體或同種異體非γδT細胞，即它們是源自與富含γδT細胞的組成物相同或不同的供體的細胞。此類飼養細胞包括αβ T細胞和任選的自然殺手細胞（NK細胞），其衍生自與富含γδ T細胞的組成物相同的組織或相同的組織類型（獨立於衍自相同/單一或不同供體）。例如，其中，從非造血組織（例如皮膚）分離γδ T細胞，飼養細胞亦可從所述非造血組織（例如皮膚）分離的非γδ T細胞。此類飼養細胞，包含αβ T細胞亦可最初從造血組織中分離出來，但隨後透過細胞培養或基因操作進行修飾，以類似於通常不會大量存在於造血組織中的組織駐留或記憶αβ T的表型和生物學。因此，在一實施例中，飼養細胞和富含γδ T細胞的組成物源自單一供體。在另一實施例中，飼養細胞和富含γδ T細胞的組成物來自不同的供體。
在一實施例中，γδ T細胞的組成物源自一單一供體。在一替代性實施例中，該組成物是源自多個供體，即該組成物是「匯集的（pooled）」組成物。在另一實施例中，飼養細胞源自一單一供體。在另一實施例中，飼養細胞源自多個供體，即飼養細胞是「匯集的（pooled）」。因此，在一實施例中，飼養細胞是獲自多個供體，以及富含γδ T細胞的組成物是獲自一單一供體。在另一實施例中，飼養細胞是獲自一單一供體，以及富含γδ T細胞的組成物是獲自多個供體。
在一實施例中，單一或多個供體可包括要用本發明的細胞群或組成物治療的主體。或者，單一或多個供體不包括要用本發明的細胞群或組成物治療的主體。
在一些實施例中，飼養細胞包括αβ-富含的T細胞群（population of αβ-rich T cell）。在另一實施例中，飼養細胞包括αβ T細胞。在一實施例中，αβ T細胞包括CD4 T細胞和/或CD8 T細胞。應當理解的是，提及「CD4 T細胞」或「CD4
+T細胞」是指一種表現CD4表面蛋白的T細胞。同樣地，提及「CD8 T細胞」或「CD8
+T細胞」是指一種表現CD8表面蛋白的T細胞。在一具體實施例中，飼養細胞包括CD4 T細胞。在另一實施例中，飼養細胞由CD4 T細胞組成。
於再一實施例中，飼養細胞包括αβ T細胞和自然殺手（NK）細胞的混合群。因此，在一實施例中，飼養細胞另外包括自然殺手（NK）細胞。
應當理解的是，本文所述的飼養細胞提供天然抗原呈現和共刺激（co-stimulatory）能力，未經遺傳修飾以起到抗原呈現細胞的作用，因此不是aAPC。此外，不需透過輻照或絲裂黴素-C（mitomycin-C）處理來阻止飼養細胞的生長，因為它們並非源自腫瘤細胞。然而，在另一實施例中，飼養細胞是生長停滯的。生長停滯的方法是本領域已知的並且包括但不限於輻照（例如γ-輻照）和絲裂黴素-C處理，產生不能複製但保持代謝活性的飼養細胞，從而為γδ T細胞提供足夠的生長支持。阻止飼養細胞的生長能使γδ T細胞長期培養，而不會在相對於γδ T細胞以大量/高比例存在的情況下使這些細胞過度生長。因此，在另一實施例中，飼養細胞被輻照。在一替代性實施例中，飼養細胞經絲裂黴素C處理。
在一實施例中，飼養細胞獲自非造血組織。在另一實施例中，飼養細胞是獲自皮膚。這類非造血組織及其製備方法的實例可在WO2020095058和WO2020095059中找到，其公開內容的全部內容併入本文。
在其他實施例中，富含γδ T細胞的組成物包含NK細胞。因此，在一實施例中，步驟（i）包括αβ T細胞的耗盡，即通過αβ T細胞的耗盡來製備富含γδ T細胞的組成物。在另一實施例中，根據步驟（i）製備富含γδ T細胞的組成物，包括獲自起始樣品（例如上文所述的非血液組織）的混合細胞群中αβ T細胞的耗盡。組成物中NK細胞的存在是有利的，因為這些細胞也是有效的細胞毒性細胞。因此，與單獨的γδ T細胞組成物相比，額外包括NK細胞的γδ T細胞組成物可能具有增強的細胞毒性特性。
NK細胞（亦稱為大顆粒淋巴球（large granular lymphocytes , LGL））是先天免疫系統的細胞毒性淋巴細胞。它們提供快速反應，例如對於病毒感染的細胞和腫瘤細胞獨立於靶細胞表面的MHC表現。因此，與γδ T細胞類似，NK細胞對靶細胞的識別不受MHC限制，也沒有同種異體HLA反應性，這意味著基於NK細胞的治療不需要患者的HLA匹配。
因此，根據本發明另一態樣，提供了一種擴增γδ T細胞的方法，其中所述方法包括步驟：
（i）透過αβ T細胞的耗盡製備富含γδ T細胞的組成物；和
（ii）在飼養細胞存在下培養組成物，其中飼養細胞以至少3：2（飼養細胞γδ T細胞）的比例存在。
因此，在某些實施例中，培養物包括至少60%的飼養細胞。在其他實施例中，培養物包含至少66%的飼養細胞，例如至少70%的飼養細胞。
在另一實施例中，步驟（i）包括從獲自起始樣品的混和細胞群中陽性選擇γδ T細胞。
在某些實施例中，起始樣品是人類組織。在另一實施例中，起始樣品是非造血組織，例如上文所述。在一具體實施例中，起始樣品是皮膚。
在某些實施例中，該方法包括透過αβ T細胞的耗盡從擴增的γδ T細胞中去除飼養細胞。這種透過αβ T細胞的耗盡的去除導致了擴增的γδT細胞群，該擴增的γδT細胞群是透過本文所述的方法所產生的並且更包括NK細胞。如前文所述，NK細胞是良好的效應細胞，其與γδ T細胞相似，既不是MHC限制性的，也不是同種異體-HLA（allo-HLA）反應性的。因此，在一具體實施例中，擴增的γδ T細胞群包含NK細胞。在一替代性實施例中，該方法包括透過γδ T細胞的陽性選擇從擴增的γδ T細胞中去除飼養細胞。這種γδ T細胞的陽性選擇會導致高度純化的γδ T細胞群，與包含其他/額外細胞類型的群體相比，其可能更適合下游加工或用於治療。
在一實施例中，組成物在包含IL-15的培養基中培養。在另一實施例中，組成物在包含IL-21的培養基中培養。因此，在一些實施例中，培養基包含IL-15和IL-21。在又一實施例中，培養基另外包含IL-2。在又一實施例中，培養基另外包含IL 4。因此，在一些實施例中，培養基另外包含IL-2和IL 4。在另一實施例中，培養基包含IL-15、IL-21、IL-2和IL-4.
在一具體實施例中，在步驟（ii）中將富含γδ T細胞的組成物培養在含有IL-15和IL-21的培養基中。在另一實施例中，步驟（ii）包括在WO2017072367和WO2018202808中公開的用於擴增γδ T細胞的條件和/或方法，其內容以全文併入本文。
因此，根據本發明另一態樣，提供了一種擴增γδT細胞的方法，其中所述方法包括步驟：
（i）製備富含γδ T細胞的組成物；和
（ii）在飼養細胞的存在下將該組成物培養在含有IL 15和IL-21的培養基中，其中飼養細胞以至少3：2（飼養細胞：γδT細胞）的比例存在。
如本文所用，「IL-15」是指天然或重組的IL-15或其變體，其作為一或多IL-15受體（IL-15R）次單位（例如突變體、突變蛋白、類似物、次單位、受體複合物、片段、同功異形體及其擬肽物）。和IL-2一樣，IL-15是一種已知的T細胞生長因子，可支持IL-2依賴性細胞株CTLL-2的增殖。IL-15作為114個胺基酸的成熟蛋白最早是由Grabstein,
et al.報導（Grabstein,
et al. Science1994. 264.5161： 965-969）。本文所用術語「IL-15」是指天然或重組的IL-15及其突變蛋白、類似物、次單元或其複合物（例如受體複合物，例如壽司肽（sushi peptide），如WO 2007/046006中所述），並且其中每個可刺激CTLL-2細胞的增殖。在CTLL-2增殖試驗中，用重組表現的前驅物和IL-15成熟形式的同義融合物（in-frame fusions）轉染的細胞的上清液可誘導CTLL-2細胞增殖。
人IL-15可以根據Grabstein,
et al.描述的過程獲得，或是透過常規過程，例如聚合酶鏈式反應（PCR）。於1993年2月19日將人IL-15 Cdna保存在ATCC
®，登錄號為69245。
人IL-15（Gene ID 3600）的胺基酸序列可在Genbank中的登錄定位庫NP000576.1 GI： 10835153（同功異形體1）和NP_751915.1 GI： 26787986（同功異形體2）發現。鼠（
Mus musculus）IL-15胺基酸序列（Gene ID 16168）可在Genbank中的登錄號NP_001241676.1 GI： 363000984發現。
IL-15還可以指涉源自多種哺乳動物物種的IL-15，包括例如人、猿猴、牛、豬、馬和鼠。如本文所指，IL-15「突變蛋白」或「變體」是與天然哺乳動物IL-15的序列基本上同源的多肽，但是因為胺基酸缺失、插入或取代具有與天然哺乳動物IL-15多肽不同的胺基酸序列。變體可以包含保守取代的序列，這意味著給定的胺基酸殘基被具有相似物理化學特徵的殘基取代。保守取代的例子包括一個脂肪族殘基取代另一個，例如Ile、Val、Leu或Ala，或一個極性殘基取代另一個，例如Lys和Arg之間；Glu和Asp；或Gln和Asn。其他這類的保守取代，例如具有相似疏水性特徵的整個區域的取代，是眾所周知的。本發明還包括天然存在的IL-15變體。這種變體的例子是由交替的mRNA剪接事件或由IL-15蛋白的蛋白水解切割產生的蛋白質，其中保留了IL-15結合特性。mRNA的交替剪接可產生截短但具有生物活性的IL-15蛋白。可歸因於蛋白水解的變化包括，例如，在不同類型的宿主細胞中表現時N端或C端的差異，這是由於從IL-15蛋白中蛋白水解去除一或多個末端胺基酸（通常是從1-10胺基酸）。在一些實施例中，可以修飾蛋白質的末端以改變其物理性質，例如用化學基團如聚乙二醇（Yang,
et al. Cancer1995. 76：687-694）。在一些實施例中，蛋白質的末端或內部可以用額外的胺基酸修飾（Clark-Lewis,
et al. PNAS1993. 90：3574-3577）。
在一些實施例中，本文定義的方法包括IL-15，其濃度通常為至少0.1 ng/mL，例如至少10 ng/mL（例如，從0.1 ng/mL至10,000 ng/mL、從1.0 ng/mL至1,000 ng/mL、從5 ng/mL至800 ng/mL、從10 ng/mL至750 ng/mL、從20 ng/mL至500 ng/mL、從50 ng/mL至400 ng/mL、或從100 ng/mL至250 ng/mL、例如，從0.1 ng/mL至1.0 ng/mL、從1.0 ng/mL至5.0 ng/mL、從5.0 ng/mL至10 ng/mL、從10 ng/mL至20 ng/mL、從20 ng/mL至100 ng/mL、從20 ng/mL至50 ng/mL、從40 ng/mL至70 ng/mL、從50 ng/mL至100 ng/mL、從50 ng/mL至60 ng/mL、從100 ng/mL至200 ng/mL、從200 ng/mL至500 ng/mL、或從500 ng/mL至1,000 ng/mL）。在另一實施例中，本文定義的方法包含濃度通常低於500 ng/mL（例如低於100 ng/mL）的IL-15。在一些實施例中，IL-15的濃度約為50 ng/mL。在另一實施例中，IL-15的濃度約為55 ng/mL。
如本文所用，「IL-21」是指天然或重組IL-21或其變體，其作為一或多IL-21受體（IL-21R）次單位（例如突變體、突變蛋白、類似物、次單位、受體複合物、片段、同功異形體及其擬肽物）。這類試劑可支持自然殺手（NK）和細胞毒性（CD8
+）T細胞的增殖。成熟的人IL-21以133個胺基酸序列的形式出現（減去訊號胜肽，由另外的22個N端胺基酸組成）。IL-21突變蛋白是一種多肽，其中對介白素-21蛋白進行了特異性取代，同時保留了結合IL-21Rα的能力，例如美國專利號9,388,241中所描述的那些。IL-21突變蛋白的特徵在於在天然IL-21多肽鏈中或其他殘基處的一或多個位點處的胺基酸插入、缺失、取代和修飾。根據本揭露，任何此類插入、缺失、取代和修飾都會產生保留IL-21R結合活性的IL-21突變蛋白。示例性突變蛋白可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個胺基酸的取代。
編碼人IL-21的核酸可以透過常規方法例如聚合酶鏈式反應（PCR）獲得。人IL-21的胺基酸序列（基因ID 59067）可在Genbank中的登錄號NC_000004.12發現。鼠（
Mus musculus）IL 21胺基酸序列（基因ID 60505）可在Genbank中以登錄號NC_000069.6發現。
IL-21亦可指涉源自多種哺乳動物物種的IL-21，包括例如人、猿猴、牛、豬、馬和鼠。變體可以包含保守取代的序列（conservatively substituted sequence），這意味著給定的胺基酸殘基被具有相似物理化學特徵的殘基取代。保守取代的例子包括一個脂肪族殘基取代另一個，例如Ile、Val、Leu或Ala，或一個極性殘基取代另一個，例如Lys和Arg之間；Glu和Asp；或 Gln和Asn。其他這類的保守取代，例如具有相似疏水性特徵的整個區域的取代，是眾所周知的。本發明還包括天然存在的IL-21變體。這種變體的例子是由交替的mRNA剪接事件或由IL-21蛋白的蛋白水解切割產生的蛋白質，其中保留了IL-21結合特性。mRNA的交替剪接可產生截短但具有生物活性的IL-21蛋白。可歸因於蛋白水解的變化包括，例如，在不同類型的宿主細胞中表現時N端或C端的差異，這是由於從IL-21蛋白中蛋白水解去除一或多個末端胺基酸（通常是從1-10胺基酸）。在一些實施例中，可以修飾蛋白質的末端以改變其物理性質，例如用化學基團如聚乙二醇（Yang,
et al. Cancer1995. 76：687-69）。在一些實施例中，蛋白質的末端或內部可以用額外的胺基酸修飾（Clark-Lewis,
et al. PNAS1993. 90：3574-3577）。
在另一實施例中，本文定義的方法包括IL-21，其濃度通常為至少0.1 ng/mL，例如至少1.0 ng/mL（例如，從0.1 ng/mL至1,000 ng/mL、從1.0 ng/mL至100 ng/mL、從1.0 ng/mL至50 ng/mL、從2 ng/mL至50 ng/mL、從3 ng/mL至10 ng/mL、從4 ng/mL至8 ng/mL、從5 ng/mL至10 ng/mL、從6 ng/mL至8 ng/mL、例如，從0.1 ng/mL至10 ng/mL、從1.0 ng/mL至5 ng/mL、從1.0 ng/mL至10 ng/mL、從1.0 ng/mL至20 ng/mL）。在另一實施例中，本文定義的方法包括濃度通常低於100 ng/mL，例如低於50 ng/mL的IL 21。在一些實施例中，IL-21的濃度約為6 ng/mL，例如約6.25 ng/mL。
如本文所用，「IL-2」是指天然或重組IL-2或其變體，其作為一或多IL-2受體（IL-2R）次單位（例如突變體、突變蛋白、類似物、次單位、受體複合物、片段、同功異形體及其擬肽物）。此類試劑可以支持IL-2依賴性細胞株CTLL-2（33；美國典型培養物保藏中心（ATCC®）TIB 214）的增殖。如Fujita,
et al. Cell1986所述，成熟的人IL-2以133個胺基酸序列的形式出現（減去訊號肽，由另外20個N端胺基酸組成）。IL-2突變蛋白是一種多肽，其中對介白素-2蛋白進行了特異性取代，同時保留了結合IL-2Rβ的能力，例如US 2014/0046026所述的那些。IL-2突變蛋白的特徵在於在天然IL-2多肽鏈中或其他殘基處的一或多個位點處的胺基酸插入、缺失、取代和修飾。根據本揭露，任何此類插入、缺失、取代和修飾都會產生保留IL-2Rβ結合活性的IL-2突變蛋白。示例性突變蛋白可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個胺基酸的取代。
編碼人IL-2的核酸可以透過常規方法例如聚合酶鏈式反應（PCR）獲得。人IL-2的胺基酸序列（基因ID 3558）可在Genbank的登錄號NP_000577.2 GI：28178861發現。鼠（
Mus musculus）IL-2 胺基酸序列（基因 ID 16183）可在Genbank登錄號NP_032392.1 GI：7110653發現。
IL-2還可指涉源自多種哺乳動物物種的IL-2，包括例如人、猿、牛、豬、馬和鼠。變體可以包含保守取代的序列，這意味著給定的胺基酸殘基被具有相似物理化學特徵的殘基取代。保守取代的例子包括一個脂肪族殘基取代另一個，例如Ile、Val、Leu或Ala，或一個極性殘基取代另一個，例如Lys和Arg之間；Glu和Asp；或Gln和Asn。其他這類的保守取代，例如具有相似疏水性特徵的整個區域的取代，是眾所周知的。本發明還包括天然存在的IL-2變體。這種變體的例子是由交替的mRNA剪接事件或由IL-2蛋白的蛋白水解切割產生的蛋白質，其中保留了IL-2結合特性。mRNA 的交替剪接可產生截短但具有生物活性的IL-2蛋白。可歸因於蛋白水解的變化包括，例如，在不同類型的宿主細胞中表現時N端或C端的差異，這是由於從IL-2蛋白中蛋白水解去除一或多個末端胺基酸（通常是從1-10胺基酸）。在一些實施例中，可以修飾蛋白質的末端或內部以改變其物理性質，例如，用化學基團如聚乙二醇（Yang,
et al. Cancer1995. 76：687-694）。在一些實施例中，蛋白質的末端或內部可以用額外的胺基酸修飾（Clark-Lewis,
et al. PNAS1993. 90：3574-3577）。
在某些實施例中，本文定義的方法包含IL-2，其濃度通常為至少10 IU/mL，例如至少100 IU/mL（例如，從10 IU/mL至1,000 IU/mL、從20 IU/mL至800 IU/mL、從25 IU/mL至750 IU/mL、從30 IU/mL至700 IU/mL、從40 IU/mL至600 IU/mL、從50 IU/mL至500 IU/mL、從75 IU/mL至250 IU/mL、或從100 IU/mL至200 IU/mL、例如，從10 IU/mL至20 IU/mL、從20 IU/mL至30 IU/mL、從30 IU/mL至40 IU/mL、從40 IU/mL至50 IU/mL、從50 IU/mL至75 IU/mL、從75 IU/mL至100 IU/mL、從100 IU/mL至150 IU/mL、從150 IU/mL至200 IU/mL、從200 IU/mL至500 IU/mL、或從500 IU/mL至1,000 IU/mL）。在一些實施例中，本文定義的方法包括濃度通常低於1,000 IU/mL（例如低於500 IU/mL）的IL-2。在一些實施例中，IL-2的濃度約為100 IU/mL。
如本文所用，「IL-4」是指天然或重組IL-4或其變體，其作為一或多IL-4受體（IL-4R）次單位（例如突變體、突變蛋白、類似物、次單位、受體複合物、片段、同功異形體及其擬肽物）。此類試劑可以支持初始（naïve）輔助T細胞（Th0細胞）向Th2細胞的分化。成熟的人IL-4以129個胺基酸序列的形式出現（減去訊號肽，由另外的24個N端胺基酸組成）。IL-4突變蛋白是一種多肽，其中已經對介白素4蛋白進行了特異性取代，同時保留了結合IL-4Rα的能力，例如美國專利號6,313,272中描述的那些。IL-4突變蛋白的特徵在於在天然IL-4多肽鏈中或其他殘基處的一或多個位點處的胺基酸插入、缺失、取代和修飾。根據本揭露，任何此類插入、缺失、取代和修飾都會產生保留IL-2Rα結合活性的IL-4突變蛋白。示例性突變蛋白可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個胺基酸的取代。
編碼人IL-4的核酸可以透過常規方法例如聚合酶鍊式反應（PCR）獲得。人IL-4的胺基酸序列（基因ID 3565）可在Genbank的登錄號NG_023252發現。鼠（
Mus musculus）IL-4胺基酸序列（Gene ID 16189）可在Genbank的登錄號NC_000077.6發現。
IL-4還可指涉源自多種哺乳動物物種的IL-4，包括例如人、猿、牛、豬、馬和鼠。變體可以包含保守取代的序列，這意味著給定的胺基酸殘基被具有相似物理化學特徵的殘基取代。保守取代的例子包括一個脂肪族殘基取代另一個，例如Ile、Val、Leu或Ala，或一個極性殘基取代另一個，例如Lys和Arg之間；Glu和Asp；或Gln和Asn。其他這類的保守取代，例如具有相似疏水性特徵的整個區域的取代，是眾所周知的。本發明還包括天然存在的IL 4變體。這種變體的例子是由交替的mRNA剪接事件或由IL-4蛋白的蛋白水解切割產生的蛋白質，其中保留了IL-4結合特性。mRNA的交替剪接可產生截短但具有生物活性的IL-4蛋白。可歸因於蛋白水解的變化包括，例如，在不同類型的宿主細胞中表現時N端或C端的差異，這是由於從IL-4蛋白中蛋白水解去除一或多個末端胺基酸（通常是從1-10胺基酸）。在一些實施例中，可以修飾蛋白質的末端以改變其物理性質，例如用化學基團如聚乙二醇（（Yang,
et al. Cancer1995. 76：687-694）。在一些實施例中，蛋白質的末端或內部可以用額外的胺基酸修飾（Clark-Lewis,
et al. PNAS1993. 90：3574-3577）。
在另一實施例中，本文定義的方法包括濃度通常為至少0.1 ng/mL，例如至少10 ng/mL（例如，從0.1 ng/mL至1,000 ng/mL、從1.0 ng/mL至100 ng/mL、從1.0 ng/mL至50 ng/mL、從2 ng/mL至50 ng/mL、從3 ng/mL至40 ng/mL、從4 ng/mL至30 ng/mL、從5 ng/mL至20 ng/mL、從10 ng/mL至20 ng/mL、例如從0.1 ng/mL至50 ng/mL、從1.0 ng/mL至25 ng/mL、從5 ng/mL至25 ng/mL）。在另一實施例中，本文定義的方法包括濃度通常低於100 ng/mL（例如低於50 ng/mL，特別是低於20 ng/mL）的IL-4。在一些實施例中，IL-4的濃度約為15ng/mL。
本文所述的γδ T細胞也可以進行基因工程以增強治療特性，例如用於CAR-T治療。這涉及工程化（engineered）細胞受體的產生，例如嵌合抗原受體（CAR）或工程化T細胞受體（TCR），以重編輯（re-program）具有新特異性的T細胞，例如單株抗體的特異性。工程化CAR或TCR可以使T細胞對惡性細胞具有特異性，因此可用於癌症免疫治療。例如，T細胞可以識別表現腫瘤抗原的癌細胞，例如來自主體組織中的正常體細胞不表現的腫瘤特異性抗原、與健康體細胞相比優先在癌細胞上過度表現的腫瘤相關的抗原、或在有壓力事件（例如氧化壓力、DNA損傷、紫外線輻射、EGF受體刺激）的環境中所表現的抗原；或用於識別癌細胞與非癌細胞的其他方法。因此，CAR-修飾的T細胞可用於例如癌症患者的過繼性T細胞療法。
因此，在一實施例中，本文所述的方法包括轉導γδ T細胞的組成物以表現感興趣的表面受體，例如識別腫瘤抗原的嵌合抗原受體（CAR）。任何這類的CAR均可用於本發明，包括靶向CD19或其他已知腫瘤相關抗原的CAR。
已經描述了使用血液駐留γδ T細胞進行CAR-T治療。然而，透過本發明的方法獲得的非造血γδT細胞可能是CAR-T方法的特別好的載體，因為它們可以用嵌合抗原特異性受體轉導，同時保留其識別轉化細胞的先天樣能力並且可能比血液駐留的γδ T細胞或傳統的全身性αβ T細胞具有更好的腫瘤穿透和滯留能力。此外，它們的MHC依賴性抗原呈現的缺乏降低了移植物對抗宿主疾病（graft-versus-host disease）的可能性，並允許它們鎖定表現低量MHC的腫瘤。同樣地，它們不依賴於傳統的共刺激，例如透過CD28的參與增強了對表現低量共刺激受體的配體之腫瘤的靶向性。
根據本發明的另一態樣，提供了一種工程化γδ T細胞的方法，所述方法包括步驟：
（i）製備一富含γδ T細胞的組成物；
（ii）轉導該組成物以表現識別腫瘤抗原的嵌合抗原受體（CAR）；和
（iii）培養轉導的組成物以擴增工程化的γδ T細胞，
其中步驟（ii）和（iii）可以按順序或同時進行。
在一實施例中，步驟（ii）在步驟（iii）之前進行。因此，根據此實施例，組成物的轉導是在不存在任何可能存在於培養物中的飼養細胞的情況下進行的。因此，由於僅轉導了γδ T細胞，用於轉導的材料量可能會減少。在一替代性實施例中，步驟（ii）與步驟（iii）同時進行。根據此實施例，組成物的轉導在培養物中存在任何飼養細胞的情況下進行。因此，雖然與在步驟（iii）之前執行步驟（ii）相比，可能需要增加轉導材料的量，但可以理解的是，可以減少操作，從而導致更簡單的總體方法和減少損失，這可能是與所述的操作有關。
因此，在一些實施例中，步驟（iii）包括在飼養細胞存在下培養轉導的組成物。在另一實施例中，根據此態樣的方法包括前文所述的任何步驟。
令人驚訝地發現，不像先前已知的T細胞轉導方法（該已知方法包含需要TCR刺激的γδ T細胞轉導，其係透過例如抗-CD3抗體（例如OKT-3）或抗-γδ TCR抗體（例如抗-Vδ1抗體）），富含γδ T細胞（特別是源自非造血組織的γδ T細胞）的組成物並不需要TCR（T細胞受體，T cell receptor）刺激。因此，本文所述的方法包括在不存在TCR刺激的情況下轉導γδ T細胞的組成物。
在某些實施例中，使用病毒載體轉導組成物。這類病毒載體在本領域中是已知的，並且技術人員將能夠根據要轉導的細胞辨別要使用的合適病毒載體。在一實施例中，病毒載體是慢病毒載體或逆轉錄病毒載體，例如γ逆轉錄病毒載體。在另一實施例中，病毒載體是γ逆轉錄病毒載體，例如鼠幹細胞病毒（MSCV）或莫洛尼鼠白血病病毒（MLV）。在又一實施例中，病毒載體被假型化（pseudotyped）為除了水泡性口炎病毒-G（vesicular stomatitis virus-G，VSV-G）之外的包膜，例如β-逆轉錄病毒包膜，例如狒狒內源性病毒（BaEV）或RD114。
在一些實施例中，步驟（ii）使用1 x10
6到1 x10
8TU/ml間的病毒載體，例如約1×10
6、約5×10
6、約1×10
7、約5×10
7或約1×10
8TU/ml的病毒載體進行。在一具體實施例中，步驟（ii）使用1 x10
7TU/ml的病毒載體進行。在其他實施例中，步驟（ii）是使用MOI在0.5和50之間的病毒載體所進行的，例如MOI為約0.5、約1、約1.5、約2.5、約5、約10、約25、約40或約50。在一實施例中，步驟（ii）是使用MOI為2.5的病毒載體所進行的。在另一實施例中，步驟（ii）是使用MOI為5的病毒載體所進行的。在另一實施例中，步驟（ii）是使用MOI為10的病毒載體所進行的。
在一實施例中，腫瘤相關抗原是與實體瘤相關的抗原。因此，在一些實施例中，腫瘤和/或癌症是實體瘤。腫瘤壞死家族成員CD70的組成性表現已在血癌和實體癌中得到描述，其中它透過其受體CD27發出訊號，從而增加腫瘤微環境中腫瘤細胞和調節T細胞的存活率。因此，在另一實施例中，實體瘤是CD70
+腫瘤。應當理解的是，CD70可用於將工程化γδ T細胞靶向所述腫瘤。因此，在又一實施例中，腫瘤相關抗原是CD70。
在另一實施例中，腫瘤相關抗原是間皮素。間皮素是一種40 kDa的蛋白質，在間皮細胞中表現，並在幾種腫瘤中過度表現，包括間皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、肺腺癌和膽管癌。因此，它被提議作為一種腫瘤標記物或腫瘤相關抗原，可在免疫治療中被鎖定（Hassan
et al. Clin. Cancer Res.,2004, 10（12）：3937-3942）。這些腫瘤中間皮素的表現可能透過細胞黏附促進腫瘤的植入和腹膜擴散（Rump
et al., Biological Chemistry, 2004, 279（10）：9190-9198）。
根據本發明之一態樣，提供了透過本文所述的方法獲得的擴增的γδ T細胞群。根據另一態樣，提供了透過本文描述的方法獲得的工程化γδ T細胞群。
在一些實施例中，擴增的/工程化的γδ T細胞群包含大於50%的γδ T細胞，例如大於75%的γδ T細胞，特別是大於85%的γδ T細胞。在一實施例中，擴增的/工程化的群體包含Vδ1細胞，其中少於50%（例如少於25%）的Vδ1細胞表現TIGIT。在一實施例中，擴增的/工程化的群體包含Vδ1細胞，其中超過50%（例如超過60%）的Vδ1細胞表現CD27。
透過本文所述的方法獲得的擴增的/工程化的γδ T細胞群可用作藥物，例如用於過繼性T細胞療法。這涉及將獲自這些方法的擴展的/工程化群體轉移到患者體內。治療可以是自體的，即γδ T細胞可以被轉移回取得它們的同一個患者體內；或治療可為同種異體的，即來自一個人的γδ T細胞可轉移到不同的患者體內。在涉及同種異體轉移的情況下，擴增/工程化的群體可能基本上不含αβ T細胞。例如，αβ T細胞可能會從擴增/工程化的群體中耗盡，例如在工程化之後，使用本領域已知的任何合適的方法（例如透過陰性選擇，例如使用磁珠）。一種治療方法可以包括：提供從供體個體獲得的非造血組織樣品；擴增和/或工程化如本文所述的γδ T細胞以產生擴增的/工程化的群體；並將擴增的/工程化的γδT細胞群施用於受體個體。
待治療的患者或主體較佳是人類癌症患者（例如，正在治療實體瘤的人類癌症患者）或病毒感染患者（例如CMV感染或HIV感染患者）。在某些情況下，患者患有和/或正在接受實體瘤治療。因為它們通常駐留在非造血組織中，組織駐留Vδ1 T細胞也比其全身血液駐留對應物更可能歸巢並保留在腫瘤塊內，並且這些細胞的過繼轉移在針對實體瘤和潛在的其他非造血組織相關免疫病理學更有效。
由於γδ T細胞是非MHC限制的，其不能將被轉移到的宿主識別為外來的，這意味著它們不太可能引起移植物對抗宿主疾病。這意味著它們可以「現成」使用並轉移到任何受體，例如用於同種異體過繼性T細胞治療。
透過本文所述方法獲得的γδ T細胞表現NKG2D，並對與惡性腫瘤密切相關的NKG2D配體（例如MICA）作出反應。它們還在沒有任何活化的情況下表現細胞毒性特徵，因此可能有效殺死腫瘤細胞。例如，如本文所述獲得的擴增的/工程化的γδ T細胞在沒有任何活化的情況下表現IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、CCL4、IL-13、粒溶素（Granulysin）、粒酶A和B（Granzyme A and B）以及穿孔素中的一或多種，較佳為全部。IL-17A可能不表現。
因此，本文報導的發現提供了令人信服的證據，證明了將透過本文所述的方法獲得的擴增/工程化γδ T細胞作為「現成的」免疫治療試劑的臨床應用的實用性和適用性。與其他T細胞相比，這些細胞具有先天樣殺傷能力，沒有MHC限制，並且顯示出更好的歸巢和/或保留在腫瘤內。
在一些實施例中，治療在非造血組織中具有實體瘤的個體的方法可包括：擴增/工程化來自如本文所述的個體樣品中的γδ T細胞以產生擴增的/工程化的群體；並向個體施用擴增的/工程化的γδT細胞群。在替代性實施例中，治療方法包括擴增/工程化來自如本文所述的不同個體的樣品中的γδ T細胞以產生擴增的/工程化的群體；並將擴增的/工程化的γδ T細胞群施用於患有實體瘤的個體。在一實施例中，給予個體的擴增的/工程化γδ T細胞的量是治療有效量。
在另一實施例中，治療方法和/或治療有效量包括了WO2020095058所揭露的內容，其全部內容併入本文。
醫藥組成物可包括如本文所述的擴增的和/或工程化的γδ T細胞以及一或多醫藥學或生理學可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。這類組成物可包括緩衝劑，例如中性緩衝鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚醣、甘露醇；蛋白質；多肽或胺基酸，例如甘胺酸；抗氧化劑；螯合劑，例如EDTA或穀胱甘胺酸；佐劑（例如氫氧化鋁）；和防腐劑。可用於本發明醫藥組成物的冷凍保存溶液包括例如DMSO。可以配製組成物，例如用於靜脈給藥。
因此，根據本發明另一態樣，提供了包含如本文所述的擴增的γδ T細胞群或工程化的γδ T細胞群的醫藥組成物。
在一實施例中，醫藥組成物基本上不含（例如沒有）可檢測量的污染物，例如內毒素或黴漿菌。
根據本發明的又一態樣，提供了用作為藥物的如本文所述的擴增的γδ T細胞群、工程化的γδ T細胞群或醫藥組成物。在另一態樣，提供了用於治療癌症的如本文所述的擴增的γδ T細胞群、工程化的γδ T細胞群或醫藥組成物。
應當理解的是，這裡描述的所有實施例都可以應用於本發明的所有態樣。
如本文所用，術語「約」包括比指定的值高至且包含10%以及低至且包含10%，適當地比指定的值高至且包含5%以及低至且包含5%。術語「之間」包括所指定邊界的數值。
現在將透過以下實施例並參考前述附圖來說明本發明的某些態樣和實施例。
實施例
實施例1：使用飼養細胞擴增皮膚來源的γδ細胞
如先前在WO2020095058和WO2020095059中所述分離皮膚駐留細胞。皮膚駐留淋巴細胞被解凍並立即處理以去除αβ T細胞飼養細胞，從而產生富含γδ T細胞的培養物。然後在輻照飼養細胞群的存在下擴增αβ耗盡的培養物。在這個實驗中試驗了來自不同背景的輻照飼養細胞；同種異體周邊血淋巴細胞（PBL）、同種異體周邊血單核細胞（PBMC）、抗-CD3 CD28活化的同種異體PBMC（Act PBMC）或同種異體皮膚分離培養物。然後將共培養物培養7天再收集，並且進行流式分析譜系標記和Ki67核表現。測量γδ T細胞的核內Ki67的表現量以及每孔Vδ1 γδ T細胞的總數。在用輻照皮膚分離細胞作為飼養細胞刺激的培養物中，γδ T胞內Ki67表現和Vδ1 γδ T的細胞總數皆為最高，表示γδ T細胞增殖。這些結果顯示，皮膚駐留淋巴細胞作為飼養細胞成分在驅動皮膚來源的γδ T細胞增殖方面優於基於血液的白血球。（圖 1A-B）。
在單獨的實驗中，皮膚駐留的淋巴細胞被解凍並立刻透過2種不同的選擇策略進行處理，以產生富含γδ T細胞、αβ T細胞耗盡的培養物。透過γδ T細胞的陽性選擇（圖2A-B）或透過藉由陽性選擇αβ T細胞部分的γδ T細胞陰性選擇富集來進行γδ T細胞富集（圖3A-B）。然後在不存在αβ T細胞作為飼養細胞，或者作為一組起始群體，以非αβ T細胞群體相對於自體αβ T細胞飼養細胞的百分比表示（在D0時1%、5%、10%、20%或40%非αβ細胞含量，剩餘的培養物由自體飼養細胞組成）。對於陽性選擇的γδ T細胞，主要含有皮膚αβ T細胞的陰性部分用作飼養細胞層。在這些實驗中，飼養細胞層沒有受到輻照。對於陰性選擇的γδ T細胞，陽性選擇的αβ T細胞作為飼養細胞層。隨後在生長細胞因子IL-15和IL-21的存在下將培養物擴增14天。在D14收集後，記錄了CD45淋巴細胞部分的γδ T細胞百分比，以及從D0到D14的γδ T細胞生長的總增加倍數。結果清楚顯示，當培養物中存在飼養細胞時，γδ T細胞生長倍數在擴增期間增加。在所有情況下，就整體γδ T細胞生長倍數而言，21天的擴增優於14天的擴增。在D0的陰性和陽性γδ T細胞富集策略均使飼養細胞和無飼養細胞培養物成功擴增。
實施例2：使用CD19 CAR轉導皮膚來源的γδ細胞
在存在IL-15和IL-21的情況下，將皮膚駐留淋巴細胞解凍並培養7天。在第7天，收集所有細胞並用載體轉導，該載體是編碼CD19特異性CAR構建體。然後在收集和冷凍保存之前，在有IL-15和IL-21的情況下將細胞再擴增7天。轉導干預（transduction intervention）不影響皮膚駐留γδ T細胞的擴增（數據未顯示）。對於功能測定，將冷凍保存的細胞解凍並透過陽性選擇MACS處理分選αβ T細胞，產生陽性選擇的皮膚駐留αβ T細胞和陰性選擇的皮膚駐留γδ T細胞。將γδ T細胞或αβ T細胞群與血液腫瘤細胞株NALM6以各種效應因子-靶標比例一起共培養。然後將共培養物培養18小時，並透過流式細胞術藉由SYTOX™（Thermofisher）染色來檢測靶細胞裂解。CAR轉導的皮膚駐留γδ T細胞表現出對NALM6細胞株的高功能。這種功能水準與供體匹配的CAR轉導皮膚αβ T細胞的功能水準相當。（圖4）。
在單獨的實驗中，解凍皮膚駐留淋巴細胞並立刻處理，透過MACS對αβ T細胞的陽性選擇來消耗αβ T細胞。在基因工程進行之前，在IL-15和IL-21存在的情況下，將這些αβ T細胞耗盡、γδ T細胞富集的群體培養2天。2天後，收集培養物並用載體轉導，該載體是編碼CD19-特異性CAR構建體的。對於4個供體中的2個，建立了模擬（mock）轉導培養物，其中細胞經歷了相同的轉導過程，但沒有載體的存在。在轉導後，接著將細胞再擴增12天，然後收集它們，透過流式細胞術對譜系和CD19-特異性CAR表現進行表型分析，然後冷凍保存。結果指出，轉導的γδ T細胞表現對CD19特異的CAR構建體，而空白對照轉導的控制組（在適用的情況下）則不表現（圖 5A）。此外，一旦將冷凍保存的細胞解凍並在IL-15和IL-21中再培養7天，CAR
+γδ T細胞的百分比是穩定的（圖 5B）。冷凍保存的細胞也用於功能測定。將細胞解凍並與血液腫瘤細胞株NALM6 一起在不同效應因子下培養：18小時的靶標比例。結果指出，在測試的2個供體中，與匹配的未轉導對照組相比，CAR轉導的γδ T細胞對NAML6的細胞毒性性能有所提高（圖6）。
實施例3：使用間皮素-CAR對皮膚來源的γδ細胞進行轉導和擴增
將皮膚駐留淋巴細胞解凍並立刻處理以透過使用MACS的αβ T細胞的陽性選擇來消耗αβ T細胞。在基因工程之前，在IL-15和IL-21存在的情況下，將這些αβ T細胞耗盡、γδ T細胞富集的群體培養2天。在第2天，從培養物中收集細胞並使用編碼間皮素特異性-CAR構建體的RD-114假型化γ-逆轉錄病毒載體轉導。作為對照，建立了模擬轉導培養物，其中細胞經歷了相同的轉導過程，但沒有載體的存在。隨後將細胞再擴增12天，然後收集它們，透過流式細胞儀對譜系和CAR表現進行表型分析，然後冷凍保存。轉導的細胞表現CAR構建體，而模擬轉導對照組則不表現（圖 7）。解凍後，模擬組和CAR轉導的細胞組均表現出高存活率（透過NC250活細胞計數測量）（圖8A）。
然後將轉導的和模擬轉導的細胞解凍並且立刻測試對於間皮素表現（mesothelin-expressing）的實體瘤（腺癌細胞）細胞株（Hela和SCOV-3）的細胞毒性。除了轉導的γδ T細胞，還測試了用相同接合子（binder）轉導並在IL-2中擴增的非供體匹配的PBMC衍生的αβ T細胞對相同實體瘤靶細胞株的細胞毒性。以5：1、2.5：1、1.25：1、0.625：1、0.312：1和0.156：1的效應因子：目標物比例培養細胞。在終點分析之前將細胞毒性共培養物培養18小時。使用CellTitre GLO®（Promega）測定系統藉由存活目標的計數來確定實體瘤靶細胞的毒性。與模擬轉導的對照組相比，CAR轉導的γδ T細胞展現出提高對HeLa和SCOV-3細胞株的殺傷能力（圖8B-C）。由於未轉導的γδ T細胞對腫瘤細胞株具有一定的活性，因此它們對腫瘤細胞株的細胞毒性與CAR轉導的αβ T細胞相似。然而，與未轉導的γδ T細胞和CAR轉導的αβ T細胞相比，CAR轉導的γδ T細胞顯示出增加的細胞毒性。
實施例4：如實施例1所述將皮膚駐留細胞分離和冷凍。解凍後，藉由磁性細胞分選技術（magnetic activated cell sorting，MACS）透過陰性選擇來富集γδ T細胞，隨後與多種不同的自體陽性選擇的αβ T細胞群共培養，且在培養的第14和21天測量與αβ T細胞的共培養對於γδ T細胞擴增率的影響。首先，藉由MACS透過αβ T細胞的耗盡來富集冷凍分離的細胞中的γδ T細胞。這產生了未接觸的（即未用任何磁性標記的抗體標記）γδ和TCR陰性細胞的群體。然後將這些富含γδ T細胞的群體與自體CD4 αβ T細胞（「CD4飼養細胞」）、CD8 αβ T 細胞（「CD8飼養細胞」）或皆有CD4和CD8 αβ T細胞（「αβ飼養細胞」）共培養。透過陽性標記MACS選擇從皮膚駐留細胞中純化所有飼養細胞層。在所有共培養物中，細胞是以比例為10% γδ T細胞富集的群體設置以及其餘90%的培養物是由自體飼養細胞層組成，培養物在加有5%異體血漿和80ng/ml IL-15以及11.25ng/ml IL-21的TexMACS培養基中運行。然後將培養物擴增14或21天，並在每個時間點記錄每個培養物設置中γδ T細胞的擴增。對培養物進行48小時的供料方案為去除50%的培養基並補充加有足以使培養物恢復到初始細胞因子濃度的細胞因子的50%培養基。在D0設置後，並沒有再將飼養細胞添加到培養物中。建立了在未添加任何αβ飼養細胞的情況下擴增γδ T細胞富集的培養物的對照群體（「只有γδ」）。
當與任何測試的αβ T細胞飼養細胞培養物共培養時，γδ T細胞擴增倍數得到增強。在培養14天和21天時，利用富集的CD4 αβ T細胞引起最大增加程度的γδ擴增倍數。結果指出，αβ T細胞是作為促進γδ T細胞擴增的有效飼養細胞層，CD4 αβ T細胞在驅動擴增方面優於CD8 αβ T細胞（圖 9）。
無
圖 1：用於γδ T細胞擴增的各種飼養細胞來源的比較。從皮膚中分離出γδ T細胞，耗盡 αβ T細胞，並與以下輻照細胞共培養7天：同種異體周邊血淋巴細胞（allogeneic peripheral blood lymphocytes, PBLs）、同種異體周邊血單核細胞 （allogeneic peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）、抗-CD3 CD28活化的同種異體PBMCs（Act PBMCs）、或同種異體皮膚分離培養物(allogeneic skin isolation cultures)（皮膚αβ/皮膚異細胞），與對照組（4CK）相比。A） 使用Ki67標記顯示增殖，總Vδ1細胞數顯示在 B 中。
圖 2：當γδ T細胞從初始群中被陽性選擇出來並以不同比例添加回剩餘的飼養細胞群時的γδ細胞擴增。A） 在對γδ T細胞進行陽性選擇後，在飼養細胞（在D0時，1%、5%、10%、20%或40% γδ T細胞富集的、非αβ細胞含量，剩餘的培養物是由自體飼養細胞組成的）存在的培養物中培養指定天數後測定γδ T細胞的增殖倍數。B） 是A在沒有飼養細胞的情況下。
圖 3：當αβ細胞從初始群中耗盡並以不同比例作為飼養細胞添加回來時的γδ細胞擴增。A） 在飼養細胞（在D0時，1%、5%、10%、20%或40% γδ T細胞富集的、非αβ細胞含量，剩餘的培養物是由自體飼養細胞組成的）存在的培養物中培養指定天數後測定γδ T細胞的擴增倍數。B） 是A在沒有飼養細胞的情況下。
圖 4：CD19 CAR
+γδ T細胞對NALM6靶細胞表現出細胞毒性活性。用CD19 CAR轉導包含αβ飼養細胞的γδ T細胞組成物，然後透過耗盡αβ T細胞從擴增的γδ T細胞中去除飼養細胞。然後將轉導的γδ T細胞與以指定比例與表現CD19的NALM6靶細胞一起培養，並測量殺死的量。
圖 5：冷凍保存的轉導γδ T細胞是存活的，CAR表現穩定，解凍後仍保留細胞毒活性。A）在冷凍前，第14天擴增的CAR表現含量。B）至於A，在解凍後第7天測量CD19 CAR
+細胞的比例，即使在冷凍和恢復後也顯示出良好的表現量。
圖 6：解凍後CD19 CAR轉導的γδ T細胞，其中飼養細胞透過消耗αβ T細胞被去除，以指定比例與表現CD19的NALM6靶細胞一起培養，並測量殺死的量。
圖 7：Meso-CAR轉導的γδ T細胞，其中起始γδ T群被αβ耗盡，然後按照所述轉導和培養，產生超過40%間皮素CAR
+的γδ T細胞群。
圖 8：用meso-CAR轉導的γδ T細胞對間皮素陽性癌細胞株表現出細胞毒性。A） 解凍後模擬組（mock）和轉導細胞組的存活度。B） 細胞毒性 vs Hela細胞。C） 細胞毒性 vs SCOV-3細胞。
圖 9：將陰性選擇的γδ T細胞與皮膚駐留的CD4 αβ T細胞（「CD4飼養細胞」）、皮膚駐留的CD8 αβ T細胞（「CD8飼養細胞」）、或CD4和CD8 αβ T細胞皆有（「αβ飼養細胞」）一起培養，或者在不添加額外飼養細胞的情況下進行培養（「只有γδ」）。然後擴增培養物14天（左圖）或21天（右圖），然後收集培養物並且計算γδ擴增率。
無
Claims (54)
- 一種擴增γδ T細胞的方法，其中該方法包括步驟： （i）製備一富含γδ T細胞的組成物；和 （ii）在飼養細胞存在下培養該組成物，其中該飼養細胞以至少4：1（飼養細胞：γδ T細胞）的比例存在。
- 一種擴增γδ T細胞的方法，其中該方法包括步驟： （i）製備一富含γδ T細胞的組成物；和 （ii）在飼養細胞和包含IL 15和IL-21的培養基存在下培養該組成物，其中該飼養細胞以至少3：2（飼養細胞：γδT細胞）的比例存在。
- 一種擴增γδ T細胞的方法，其中該方法包括步驟： （i）透過αβ T細胞的耗盡製備一富含γδ T細胞的組成物；和 （ii）在飼養細胞存在下培養該組成物，其中該飼養細胞以至少3：2（飼養細胞：γδ T細胞）的比例存在。
- 如請求項1至3中任一項所述之方法，其中該飼養細胞以至少4：1（飼養細胞：γδ T細胞）的比例存在。
- 如請求項1至4中任一項所述之方法，其中該飼養細胞以至少10：1（飼養細胞：γδ T細胞）的比例存在。
- 如請求項1至5中任一項所述之方法，其中該飼養細胞以約10：1至約99：1（飼養細：γδ T細胞）的比例存在。
- 如請求項1至6中任一項所述之方法，其中該飼養細胞包括αβ T細胞。
- 如請求項7所述之方法，其中該αβ T細胞包括CD4 T細胞。
- 如請求項7或8所述之方法，其中該飼養細胞還包括自然殺傷（NK）細胞。
- 如請求項1至9中任一項所述之方法，其中該飼養細胞被照射。
- 如請求項1至10中任一項所述之方法，其中該飼養細胞是源自非造血組織。
- 如請求項11所述之方法，其中該飼養細胞是源自皮膚。
- 如請求項1至12中任一項所述之方法，其中該飼養細胞是源自單一供體。
- 如請求項1至12中任一項所述之方法，其中該飼養細胞是源自多個供體。
- 如請求項1至14中任一項所述之方法，其中該γδ T細胞是源自單一供體。
- 如請求項1至14中任一項所述之方法，其中該γδ T細胞是源自多個供體。
- 如請求項1至16中任一項所述之方法，其中該飼養細胞和該γδ T細胞是源自相同的供體。
- 如請求項1至16中任一項所述之方法，其中該飼養細胞和該γδ T細胞是源自不同的供體。
- 如請求項1至18中任一項所述之方法，其中該方法包括透過αβ T細胞的耗盡從擴增的γδ T細胞中去除該飼養細胞。
- 如請求項1至18中任一項所述之方法，其中該方法包括透過陽性選擇γδ T細胞從擴增的γδ T細胞中去除該飼養細胞。
- 一種工程化γδ T細胞的方法，該方法包括步驟： （i）製備一富含γδ T細胞的組成物； （ii）在沒有TCR刺激的情況下轉導該組成物以表現識別一腫瘤抗原的一嵌合抗原受體（CAR）；和 （iii）培養轉導的組成物以擴增工程化的γδ T細胞， 其中步驟（ii）和（iii）可以按順序或同時進行。
- 如請求項21所述之方法，其中步驟（ii）在步驟（iii）之前進行。
- 如請求項21所述之方法，其中步驟（ii）與步驟（iii）同時進行。
- 如請求項21至23中任一項所述之方法，其中該組成物是使用一病毒載體轉導，例如反轉錄病毒載體，例如γ反轉錄病毒載體或慢病毒載體。
- 如請求項24所述之方法，其中該病毒載體是γ反轉錄病毒載體，例如鼠幹細胞病毒（MSCV）或莫洛尼鼠白血病病毒（MLV）。
- 根據請求項24或25所述的方法，其中所述病毒載體被假型化為具有除水泡性口炎病毒-G（VSV-G）之外的包膜，例如諸如狒狒內源病毒（BaEV）或RD114的β-逆轉錄病毒包膜。
- 如請求項24至26中任一項所述之方法，其中步驟（ii）使用1 x10 7TU/ml的病毒載體進行。
- 如請求項21至27中任一項所述之方法，其中，該腫瘤抗原是來自主體組織中非由正常體細胞表現的腫瘤特異性抗原。
- 如請求項21至27中任一項所述之方法，其中該腫瘤抗原與健康體細胞相比是在癌細胞上優先過度表現的腫瘤相關抗原。
- 如請求項21至27中任一項所述之方法，其中該腫瘤抗原是在如氧化壓力、DNA損傷、UV輻射、EGF受體刺激的壓力事件的情況下表現的抗原。
- 如請求項21至30中任一項所述之方法，其中該腫瘤抗原是與一實體瘤相關的抗原。
- 如請求項31所述之方法，其中該實體瘤是間皮素 +腫瘤。
- 如請求項21至32中任一項所述之方法，其中該腫瘤相關抗原是間皮素。
- 如請求項21至33中任一項所述之方法，其中步驟（iii）包括在不存在飼養細胞的情況下培養該轉導的組成物。
- 如請求項21至33中任一項所述之方法，其中步驟（iii）包括在存在飼養細胞的情況下培養該轉導的組成物。
- 如請求項32所述之方法，包括如請求項1至20中任一項所述之方法的步驟。
- 如請求項1至36中任一項所述之方法，其中步驟（i）包括從獲自一起始樣品之一混合細胞群中的αβ T細胞的耗盡。
- 如請求項1至36中任一項所述之方法，其中步驟（i）包括從獲自一起始樣品之一混合細胞群中的γδ T細胞的陽性選擇。
- 如請求項37或38所述之方法，其中該起始樣品是人體組織。
- 如請求項37至39中任一項所述之方法，其中該起始樣品是非造血組織。
- 如請求項40所述之方法，其中該起始樣品是皮膚。
- 如請求項1或3至41中任一項所述之方法，其中該組成物是培養在包括IL-15或IL-21的培養基中。
- 如請求項42所述之方法，其中該培養基包括IL-15和IL-21。
- 如請求項42或43中任一項所述之方法，其中該培養基另外包括IL-2和/或IL-4。
- 如請求項1至44中任一項所述之方法，其中該方法包括培養該組成物7至21天。
- 如請求項1至45中任一項所述之方法，其中該方法包括培養該組成物約10、11、12、13或14天。
- 如請求項1至42中任一項所述之方法，其中擴增該γδ T細胞群提供至少5倍，特別是至少10倍，特別是至少20倍，例如至少50倍，例如至少100倍數量的γδ T細胞。
- 如請求項1至47中任一項所述之方法，其中該方法包括冷凍該擴增的γδ T細胞。
- 一種擴增的γδ T細胞群，其是可獲得的，例如透過請求項1至20或36至48中任一項所述之方法獲得的。
- 一種工程化的γδ T細胞群，其是可獲得的，例如透過請求項21至48中任一項所述之方法獲得的。
- 一種醫藥組成物，包括如請求項48所述之擴增的γδ T細胞群或如請求項50所述之工程化的γδ T細胞群。
- 如請求項49所述之擴增的γδ T細胞群、如請求項50所述之工程化的γδ T細胞群或如請求項51所述之醫藥組成物，用作為一藥物。
- 如請求項49所述之擴增的γδ T細胞群、如請求項50所述之工程化的γδ T細胞群或如請求項51所述之醫藥組成物，用於治療癌症。
- 如請求項53所述之供使用的擴增的γδ T細胞群、工程化的γδ T細胞群或醫藥組成物，其中該癌症是實體瘤。
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