MXPA04009287A

MXPA04009287A - Proceso para producir linfocito citotoxico.

Info

Publication number: MXPA04009287A
Application number: MXPA04009287A
Authority: MX
Inventors: Ikunoshin Kato
Original assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 2002-03-25
Filing date: 2003-03-25
Publication date: 2005-01-25
Also published as: EA200401242A1; US8728811B2; CA2479288A1; DE60335253D1; TWI334442B; US20080227204A1; US20140212972A1; JPWO2003080817A1; ES2396447T3; CN102321579A; WO2003080817A1; CN101735981B; CA2479288C; EP2305793A1; EP1496109A4; EP1496109A1; KR100895231B1; HK1144105A1; US8975070B2; CN101735981A

Abstract

Un proceso para producir linfocitos citotoxicos caracterizado porque comprende realizar cuando menos una etapa de induccion, mantenimiento y expansion mediante el cultivo de linfocitos citotoxicos en la presencia de fibronectina, fragmentos de la misma o una mezcla de los mismos.

Description

PROCESO PARA PRODUCIR LINFOCITO CITOTOXICO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método para preparar un linfocíto citotóxico, el cual es útil en el campo médico.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Un cuerpo vivo es protegido de substancias extrañas principalmente por una respuesta inmune, y un sistema inmune ha sido establecido por varias células y los factores solubles producidos por las mismas. Entre las mismas, los leucocitos, especialmente los linfocitos, juegan un papel clave. Los linfocitos se clasifican en dos tipos principales, el linfocito B (al que se puede hacer referencia posteriormente en la presente como célula B) y el linfocito T (al que se puede hacer referencia posteriormente en la presente como célula T) , ambos de los cuales reconocen específicamente un antígeno y actúan en el antígeno para proteger el cuerpo vivo. La célula T se subclasifica en célula T auxiliar que tiene el marcador CD (Denominación de Cúmulo) 4 (al que se hace referencia posteriormente en la presente como ??) / involucrado principalmente en la ayuda a la producción de anticuerpos y en la inducción de varias respuestas inmunes, y la célula T citotóxica que tiene el marcador CD8 (Tc: linfocito T citotóxico, al que se hace referencia también como célula T supresora, a la cual se puede hacer referencia posteriormente en la presente como CTL) , que exhibe principalmente una actividad citotóxica. El CTL, que juega el papel más importante en el reconocimiento, destrucción y eliminación de la célula tumoral, de la célula infectada por virus o similares, no produce un anticuerpo que reaccione específicamente con un antígeno como en la célula B, pero reconoce y actúa directamente en los antigenos (péptido antigénico) de una célula objetivo que esté asociada con las moléculas Clase I del principal complejo de histocompatibilidad [MHC, al cual se puede hacer referencia también como antígeno de leucocito humano (HLA) en humano] , que existen sobre la superficie de la membrana de la célula objetivo.- En este momento, el receptor de la célula T (al que se hace referencia posteriormente en la presente como TCR) que existe sobre la superficie de la membrana del CTL, reconoce específicamente los péptidos antigénicos mencionados anteriormente y las moléculas clase I del MHC, y determina si el péptido antigénico se deriva de sí mismo o no . Si se determina que la célula objetivo no se deriva de sí misma, ésta es destruida y eliminada específicamente por el CTL. En años recientes, una terapia que causaría una carga física más pesada en un paciente, tales como la farmacoterapia y la radioterapia, ha sido reconsiderada, y se ha incrementado el interés en una inmunoterapia con una carga física más ligera en un paciente. Especialmente se ha resaltado la efectividad de la inmunoterapia adoptiva en la que el CTL capaz de reaccionar específicamente con un antígeno de interés, es inducido in vitro a partir de un linfocito derivado de un humano que tenga una función inmune normal, o el linfocito es expandido sin inducción, y luego transferido a un paciente. Por ejemplo, se ha sugerido que en una inmunoterapia adoptiva en un modelo , animal, es una terapia efectiva para la infección por virus y tumor [autoría de Greenberg, P. D., Advances Immunology, published in 1992; Reusser P., et al., Blood, 78(5), 1373-1380 (1991)]. En esta terapia es importante mantener o incrementar el número de células en un estado en el que se mantenga o aumente la actividad citotóxica, específica para el antígeno, del CTL. En la inmunoterapia adoptiva descrita anteriormente es necesario administrar linfocitos citotóxicos en un número determinado de células, o mayor, a fin de obtener un efecto terapéutico. En otras palabras se puede decir que uno de los problemas principales es obtener el número anterior de células in vitro, en un corto período .

A fin de mantener y aumentar una actividad citotóxica, específica para el antígeno, del CTL, se ha empleado generalmente un método de estimulación de repetición, con un antígeno de interés, cuando se induzca una respuesta específica en un antígeno para el CTL. Sin embargo, en este método, el número de CTL finalmente obtenido puede ser usualmente reducido, de manera tal que no puede obtenerse un número suficiente de células. Como un método para la preparación de células T que sean efectivas para el tratamiento de una enfermedad, se ha conocido, por ejemplo, la inmunoterapia adoptiva que usa el linfocito de infiltración de tumores (TIL) inducido con IL-2 en una alta concentración [N. Engl . J. Med. , 316, 1310-1321 (1986) ; Rosenberg S. A. et al., N. Engl. J. Med., 319(25), 1676-1680 (1988) ; Ho M. et al., Blood, 81(8), 2093-2101 (1993) ] . Posteriormente, con referencia a la preparación del CTL específico para el antígeno, se ha reportado un método para aislar y expandir un clon de CTL específico para el CMV, usando fibroblasto autoinfectado por CMV e IL-2 [Riddell S. A. et al., J. Immunol . , 146(8), 2795-2804 (1991)] o usando anticuerpo monoclonal anti-CD3 (anti-CD3 mAb) y IL-2 [Riddell S. A. et al., J. I munol . Methods, 128(2), 189-201 (1990)] . Además, la WO 96/06929 describe un método REM (método de expansión rápida) . Este método RE es un método para expandir una población de células T primarias que contienen un CTL específico para el antígeno y TH en un período corto. En otras palabras este método está caracterizado porque se puede proporcionar una gran cantidad de células T haciendo proliferar clones de células T individuales, y porque el número de CTL específicos para el antígeno, se incrementa usando un anticuerpo anti-CD3, IL-2, y PBMC (célula raononuclear de la sangre periférica) deficientes en su capacidad para proliferarse , mediante irradiación, y células infectadas por el virus de Epstein-Barr (al que se puede hacer referencia simplemente, posteriormente en la presente, como EBV) . Además, la WO 97/32970 describe un método REM modificado, en donde el método es un método que usa como una célula alimentadora una cepa de células de mamífero, no diferenciadas, que expresen un componente estimulador de las células T, que se distinga de las PBMC por reducir una cantidad de PBMC usada. La célula supresora activada por linfocina (célula LAK) es una población de células funcionales que tienen una actividad citotóxica, que se obtiene adicionando IL-2 a la sangre periférica (leucocito de la sangre periférica), sangre de cordón umbilical, fluido de tejidos o similares, que contengan linfocitos, y cultivando las células in vi tro por varios días. Durante el cultivo, la proliferación de la célula LAK es acelerada adicionalmente por la adición de un anticuerpo anti-CD3 al mismo y cultivando la célula. La célula LAK así obtenida tiene una actividad citotóxica no específica para varias células cancerosas y otras células objetivo. La célula LAK es usada también en la inmunoterapia adoptiva, en la misma manera que el CTL mencionado anteriormente. Como se describió anteriormente, la utilización de IL-2 es esencial en el paso de obtención de un linfocito citotóxico, por ejemplo, CTL, célula LAK, TIL o similar. La célula es activada además enlazando IL-2 al receptor interleucina-2 (IL-2R) sobre una superficie de la célula. Además, el IL-2R ha sido conocido como un marcador de activación para un linfocito. Desde estos puntos de vista es importante mejorar la expresión del IL-2R sobre la superficie de la célula. Además, en la inducción del CTL es importante mejorar la eficiencia para inducir una célula precursora del CTL sujeto a la estimulación por un antígeno como el CTL, es decir, para mejorar una proporción (tasa) de la célula CD8 -positiva en un grupo de células después de la inducción. La fibronectina es una glicoproteína gigantesca que tiene un peso molecular de 250 mil, que existe en la sangre de un animal, sobre la superficie de una célula cultivada o en una matriz extracelular de un tejido, y se ha sabido que tiene varias funciones. Una estructura del dominio de la misma se encuentra dividida en siete porciones (de aquí en adelante hágase referencia a la figura 1) , en donde tres tipos de secuencias similares se encuentran contenidos en una secuencia de aminoácidos de la misma, y las repeticiones de cada una de estas secuencias constituyen la secuencia completa. A tres tipos de secuencias similares se hace referencia como tipo I, tipo II y tipo III. Entre los mismos, el tipo III está constituido por una cantidad de 71 a 96 residuos de aminoácidos, en donde una tasa de coincidencia de estos residuos de aminoácidos es de 17 a 40%. En la fibronectina existen catorce secuencias del tipo III, entre las cuales la 8o, 9° 6 10° secuencia (a cada una de las cuales se hace referencia posteriormente en la presente como III-8, III-9 ó III -10) se encuentra contenida en un dominio de enlazamiento celular, y la 12°, 13° ó 14° secuencia (a cada una de las cuales se hace referencia posteriormente en la presente como 111-12, 111-13 ó 111-14) se encuentra contenida en un dominio de enlazamiento a la heparina . Además, una región de enlazamiento VAL (antígeno de activación muy tardía) -5 se encuentra contenida en 111-10, y su secuencia central es la RGDS . Además, una región a la cual se hace referencia como IIICS existe en un lado del C-terminal del dominio de enlazamiento a la heparina. Una región a la que se hace referencia como CS-1, que consiste de 25 aminoácidos y que tiene una actividad de enlazamiento al VLA-4, existe en IIICS (Deane F. Momer, FIBRONECTIN, ACADEMIC PRESS INC., 1-8(1988); Kimizuka F. et al., J. Biochem. 110, 284-291 (1991); Hanenberg H. et al., Human Gene Therapy 8, 2193-2206 (1997)).

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un objeto de la presente invención consiste en un método para preparar un linfocito citotóxico que tiene una actividad citotoxica en un alto nivel, el cual se usa convenientemente en el campo médico. Concretamente, la presente invención se refiere a: [1] un método para preparar un linfocito citotóxico caracterizado porque el método comprende el paso de llevar a cabo la inducción, mantenimiento y expansión, al menos una de ellas, de un linfocito citotóxico, en la presencia de fibronectina, un fragmento de la misma o una mezcla de los mismos; [2] el método de acuerdo con el inciso [1] anterior, en donde el linfocito citotóxico expresa en gran medida un receptor interleucina-2 , en comparación con un linfocito citotóxico obtenido llevando a cabo la inducción, mantenimiento y expansión, al menos una de ellas, en la ausencia de fibronectina, un fragmento de ra misma o una mezcla de los mismos; [3] el método de acuerdo con el inciso [1] anterior, en donde el linfocito citotóxico contiene la célula CD8-positiva en una mayor proporción en comparación con un linfocito citotóxico obtenido llevando a cabo la inducción, mantenimiento y expansión, al menos una de ellas, en la ausencia de fibronectina, un fragmento de, -la "> misma o una mezcla de los mismos; [4] el método de acuerdo con cualesquiera de los incisos [1] a [3] anteriores, en donde el linfocito citotóxico mantiene en gran medida la actividad citotóxica, en comparación con un linfocito citotóxico obtenido llevando a cabo la inducción, mantenimiento y expansión, al menos una de ellas, en la ausencia de fibronectina, un fragmento dé la misma o una mezcla de los mismos ; [5] el método de acuerdo con cualesquiera de los incisos [1] a [4] anteriores, en donde la fibronectina, un fragmento de la misma o una mezcla de los mismos, es inmovilizada en una fase sólida; [6] el método de acuerdo con el inciso [5] anterior, en donde la fase sólida es un equipo para cultivo de células o un portador de cultivo de células; [7] el método de acuerdo con el inciso [6] anterior, en donde el equipo para cultivo de células es una caja de Petri, un matraz o una bolsa, y el portador de cultivo de. células consiste en cuentas, una membrana o un portaobjetos de vidrio; [8] el método de acuerdo con cualesquiera de los incisos del [1] al [4] anteriores, en. donde la inducción, mantenimiento y expansión, al menos una de ellas, de un linfocito citotóxico, se lleva a cabo en un medio que contiene fibronectina, un fragmento de la misma o una mezcla de los mismos; [9] el método de acuerdo con cualesquiera de los incisos del [1] al [8] anteriores, en donde el fragmento de fibronectina es un polipeptido que comprende al menos una de las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOs : 1 a 7 del Listado de Secuencias, ? un polipéptido que tiene una substitución, supresión, inserción o adición de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos del polipéptido anterior, en donde el polipéptido tiene funciones equivalentes a las del polipéptido anterior; [10] el método de acuerdo con el inciso [9] anterior, en donde el fragmento de fibronectina tiene una actividad de adhesión celular y/o una actividad de enlazamiento a la heparina; [11] el método de acuerdo con el inciso [9] anterior, en donde el fragmento de fibronectina es un polipéptido seleccionado de los polipeptidos que comprenden cualesquiera de las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NOs : 8 a 19 del Listado de Secuencias; [12] el método de acuerdo con el inciso [1] anterior, que comprende llevar a cabo la inducción, mantenimiento y expansión, al menos una de ellas, de un linfocito citotóxico en la presencia de' fibronectina, un fragmento de la misma o una mezcla de los mismos, en un equipo para cultivo de células que contenga un medio, en donde el método satisface cualesquiera de las condiciones de: (a) una proporción del número de células al inicio del cultivo, en un área de cultivo en el equipo para cultivo de células, es de 1 a 5 x 105 células/cm2; y (b) una concentración de células en un medio, al inicio del cultivo, es de 1 a 5 x 105 células/ml; [13] el método de acuerdo con el inciso [12] ¦anterior, en donde el método excluye un paso de dilución o un paso de intercambio de un equipo para cultivo de células ; [14] un linfocito citotóxico obtenido mediante el método de cualesquiera de los incisos del [1] al [13] anteriores; [15] un medicamento que comprende, como un ingrediente eficaz, un linfocito citotóxico obtenido mediante el método de cualesquiera de los ¦ incisos del [1] al [13] anteriores; [16] un agente para aumentar la expresión del receptor interleucina-2 , de una célula, caracterizado porque el agente comprende como un ingrediente eficaz fibronectina , un fragmento de la misma o una mezcla de los mismos; [17] el agente de acuerdo con el inciso [16] anterior, en donde el fragmento de fibronectina es un polipéptido que comprende al menos una de las secuencias de aminoácidos representadas por' las SEQ ID NOs : 1 a 7 del Listado de Secuencias, o un polipéptido que tenga una substitución, supresión, inserción o adición de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos del polipéptido anterior, en donde el polipéptido tiene funciones equivalentes a las del polipéptido anterior; [18] el agente de acuerdo con el inciso [17] anterior, en donde el fragmento de fibronectina tiene actividad de adhesión celular y/o actividad de enlazamiento a la heparina; [19] el agente de acuerdo con el inciso [17] anterior, en donde el fragmento de fibronectina es un polipéptido seleccionado de polipéptidos que comprenden cualesquiera de las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NOs : 8 a 19 del Listado de Secuencias;

[20] un agente para mejorar una proporción de célula CD8-positiva en un linfocito, caracterizado porque el agente comprende como un ingrediente eficaz fibronectina, un fragmento de la misma o una mezcla de los mismos; [21] el agente de acuerdo con el inciso [20] anterior, en donde el fragmento de fibronectina es un polipéptido que comprende al menos una de las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOs : 1 a 7 del Listado de Secuencias, o un polipéptido que tenga una substitución, supresión, inserción o adición de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos del polipéptido anterior, en donde el polipéptido tiene funciones equivalentes a las del polipéptido anterior; [22] el agente de acuerdo con el inciso [21] anterior, en donde el fragmento de fibronectina tiene una actividad de adhesión celular y/o una actividad de enlazamiento a la heparina; [23] el agente de acuerdo con el inciso [21] anterior, en donde el fragmento de fibronectina es un polipéptido seleccionado de polipéptidos que comprenden cualesquiera de las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NOs: 8 a 19 del Listado de Secuencias; [24] un agente para mejorar o mantener la actividad citotóxica en un linfocito citotóxico, caracterizado porque el agente comprende como un ingrediente eficaz fibronectina, un fragmento de la misma o una mezcla de los mismos; [25] el agente de acuerdo con el inciso [24] anterior, en donde el fragmento de fibronectina es un polipéptido que comprende al menos una de las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOs : 1 a 7 del Listado de Secuencias, o un polipéptido que tiene una substitución, supresión, inserción o adición de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos del polipéptido anterior, en donde el polipéptido tiene funciones equivalentes a las del polipéptido anterior,- [26] el agente de acuerdo con el inciso [25] anterior, en donde el fragmento de fibronectina tiene actividad de adhesión celular y/o actividad de enlazamiento a la heparina; [27] el agente de acuerdo con el inciso [25] anterior, en donde el fragmento de fibronectina es un polipéptido seleccionado de polipéptidos que comprenden cualesquiera de las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NOs: 8 a 19 del Listado de Secuencias; [28] un método para incrementar la expresión de un receptor interleucina-2 en un linfocito citotóxico, caracterizado porque el método comprende el paso de llevar a cabo la inducción, mantenimiento y expansión, al menos una de ellas, de un linfocito citotóxico, en la presencia de fibronectina, un fragmento de la misma, o una mezcla de los mismos ; [29] un método para mejorar una proporción de célula CD8-positiva en un linfocito citotóxico, caracterizado porque el método comprende el paso de llevar a cabo la inducción, mantenimiento y expansión, al menos una de ellas, de un linfocito citotóxico, en la presencia de fibronectina, un fragmento de la misma o una mezcla de los mismos; [30] un método para mejorar o mantener la actividad citotóxica en un linfocito citotóxico, caracterizado porque el método comprende el paso de llevar a cabo la inducción, mantenimiento y expansión, al menos una de ellas, de un linfocito citotóxico, en la presencia de fibronectina, un fragmento de la misma o una mezcla de los mismos; [31] el método de acuerdo con cualesquiera de los incisos [1] a [13] anteriores, que además comprende el paso de transducir un gen extraño a un linfocito citotóxico; y [32] el método de acuerdo con el inciso [31] anterior, en donde el gen extraño es transducido usando un retrovirus, adenovirus, un virus adeno-asociado o un virus de simio.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es una vista esquemática que muestra una estructura de dominio de fibronectina .

EL MEJOR MODO PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN La presente invención ha sido llevada a término debido a los descubrimientos de que en el linfocito citotóxico preparado en la presencia de fibronectina y/o un fragmento de la misma, se mantiene una alta actividad citotóxica, y se incrementa significativamente el nivel de expresión del IL-2R, y se mejora la proporción de la célula CD8-positiva . A propósito, la preparación de un linfocito citotóxico, tal como se usa en la presente, se refiere a un paso que comprende un paso que tiene cada uno de los pasos de inducción (activación) , mantenimiento y expansión de la célula, o los pasos combinados del mismo. La preparación de un linfocito citotóxico de la presente invención se refiere también al cultivo de un linfocito citotóxico. La presente invención se explicará concretamente a continuación. (1) Fibronectina y Fragmento de la misma Usados en la Presente Invención La fibronectina y un fragmento de la misma, tal como se mencionó en la presente, pueden ser aquellos obtenidos de la naturaleza, o aquellos que hayan sido sintetizados artificialmente. La fibronectina y un fragmento de la misma se pueden preparar en una forma substancialmente pura, a partir de una substancia de origen natural, en base a la descripción de Ruoslahti E. et al. [J. Biol. Chem. , 256(14), 7277-7281 (1981)]. El término "fibronectina o fragmento de fibronectina substancialmente puro", como se hace referencia en la presente, significa que esta fibronectina y fragmento de fibronectina substancialmente no contienen otras proteínas y similares, que existan de manera conjunta con la fibronectina en la naturaleza. Tanto la fibronectina como un fragmento de la misma, mencionados anteriormente, se pueden usar en la presente invención, solos o en una mezcla de muchos tipos. La información útil referente a los fragmentos de fibronectina que pueden ser usados en la presente invención y la preparación de los fragmentos, puede obtenerse de Kimiduka F. , et al., [J. Biochem. , 110, 284-291 (1991)], Kornbrihtt A. R. et al., [EMBO J. , 4(7), 1755-1759 (1985)], Sekiguchi K. , et al., [Biochemistry, 25(17), 4936-4941 (1986)], y similares. En la presente invención, el fragmento de fibronectina está e emplificado, por ejemplo, por un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos algunas de las regiones de III-8 (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 en el Listado de Secuencias), III-9 (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 en el Listado de Secuencias), 111-10 (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3 en el Listado de Secuencias) , 111-12 (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4 en el Listado de Secuencias) , 111-13 (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5 en el Listado de Secuencias), 111-14 (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 6 en el Listado de Secuencias) , y CS-1 (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 7 en el Listado de Secuencias) (ver la figura 1) . Además, como el fragmento se puede usar preferentemente un fragmento que tenga una actividad de adhesión celular y/o una actividad de enlazamiento a la heparina . La actividad de adhesión celular se puede evaluar realizando el ensayo de enlazamiento del fragmento (su dominio de enlazamiento celular) usado en la presente invención, a una célula, usando un método conocido. Por ejemplo, el método mencionado anteriormente incluye un método de Williams D. A., et al., [Nature, 352, 438-441 (1991)] . El método es un método para determinar el enlazamiento de una célula a un fragmento inmovilizado en una placa para cultivos. Además, la actividad de enlazamieno a la heparina puede ser evaluada realizando el ensayo de enlazamiento del fragmento (su dominio de enlazamiento a la heparina) usado en la presente invención, a heparina, usando un método conocido. Por ejemplo, el enlazamiento del fragmento a heparina puede ser evaluado en la misma manera mediante el uso de heparina, por ejemplo, una heparina marcada, en lugar de la célula usada en el método de Williams D. A. et al., mencionado anteriormente. Además, el fragmento de fibronectina está ejemplificado por un polipéptido seleccionado de C-274 (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 8 en el Listado de Secuencias), H-271 (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 9 en el Listado de Secuencias) , H-296 (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 10 en el Listado de Secuencias), CH-271 (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 11 en el Listado de Secuencias), CH-296 (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 12 en el Listado de Secuencias) o C-CS1 (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 13 en el Listado de Secuencias) . Cada uno de los fragmentos mencionados anteriormente CH-271, CH-296, C-274 y C-CS1 es un polipéptido que tiene un dominio de enlazamiento celular con una actividad de enlazamiento al VLA-5. También, el C-CS1, H-296 o CH-296 es un polipéptido que tiene un dominio de enlazamiento celular con una actividad de enlazamiento al VLA-4. Además, el H-271 , . H-296 , CH-271 o CH-296 es un polipéptido que tiene un dominio de enlazamiento a la heparina. En la presente invención se puede usar también un fragmento en el que cada uño de los dominios anteriores se encuentre modificado. El dominio de enlazamiento a la heparina, de la fibronectina , está constituido por tres secuencias tipo III (111-12, 111-13, y 111-14) . En la presente invención también se puede usar un fragmento que contenga un dominio de enlazamiento a la heparina, que tenga una supresión de una o dos de las secuencias tipo III. Por ejemplo, los fragmentos pueden estar1 e emplificados por el CHV-89 (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 14 del Listado de Secuencias), CHV-90 (secuencia de aminoácidos mostrada' en la SEQ ID O: 15 del Listado de Secuencias) o CHV-92 (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 16 del Listado de Secuencias) , el cual es un fragmento en el que un sitio de enlazamiento celular de la fibronectina (dominio de enlazamiento VLA-5: de Pro 1239 a Ser 1515) y una de las secuencias del tipo III se encuentran enlazadas, o CHV-179 (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 17 del Listado de Secuencias) o CHV-181 (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 18 del Listado de Secuencias) , el cual es un fragmento en el que el sitio de enlazamiento celular de la fibronectina y dos de las secuencias tipo III se encuentran enlazados. El CHV-89, CHV-90 y CHV-92 contienen 111-13, 111-14 y 111-12, respectivamente, y el CHV-179 contiene 111-13 y 111-14, y el CHV-181 contiene 111-12 y 111-13, respectivamente. Además, en la presente invención se puede usar un fragmento que tenga la adición de un aminoácido adicional, a cada uno de los fragmentos mencionados anteriormente. Por ejemplo, el fragmento puede ser preparado adicionando un aminoácido deseado, a cada fragmento mencionado anteriormente, de acuerdo con el método para la preparación del ?-275-Cys descrito en los ejemplos de preparación presentados posteriormente. Por ejemplo, el ?-275-Cys (secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 19 del Listado de Secuencias) es un fragmento que tiene un dominio de enlazamiento a la heparina, de la fibronectina, y un residuo cisteína en una C-terminal. El fragmento usado en la presente invención puede ser uno de aquellos que comprendan un polipéptido que contenga una secuencia de aminoácidos que tenga una substitución, supresión, inserción o adición de uno o más aminoácidos, en una secuencia de aminoácidos de un polipéptido que constituya un fragmento que contenga, al menos parcialmente, una secuencia de aminoácidos de la fibronectina natural, ejemplificada anteriormente, en donde el polipéptido tenga una función equivalente a la del fragmento, siempre y cuando se obtengan los efectos deseados de la presente invención. Es preferible que la substitución o similar, de los aminoácidos, se lleve a cabo en un grado tal que pueda cambiar las características fisicoquímicas y similares, de un polipéptido inherente, dentro de un intervalo en el que se pueda mantener la función del polipéptido. Por ejemplo, la substitución o similar, de aminoácidos, es conservadora, dentro del intervalo en el que las características poseídas inherentemente por el polipéptido (por ejemplo, hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga eléctrica, pK y similares) no sean cambiadas substancialmente . Por ejemplo, la substitución de los aminoácidos son substituciones dentro de cada uno de los grupos de: (1) glicina, alanina; (2) valina, isoleucina, leucina; (3) ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, glutamina; (4) serina, treonina; (5) lisina, arginina (6) fenilalanina, tirosina. La supresión, adición o inserción de aminoácidos es la supresión, adición o inserción en los aminoácidos que tengan características similares a las características de los alrededores del sitio en cuestión en el polipéptido, dentro del intervalo en el que las características de los alrededores del sitio en cuestión, no sean cambiadas substancialmente.

Además, la frase "que tenga una función equivalente" se refiere a que tenga al menos algunas de las funciones de (i) una función de mantener una actividad citotóxica de un linfocito citotóxico, (ii) una función de aumentar un nivel de expresión del IL-2R, o (iii) una función de mejorar una proporción de la célula CD8-positiva. El hecho de que el fragmento que comprenda un polipéptido que tenga una substitución o similar, de aminoácidos, tenga o no esas funciones, puede ser confirmado apropiadamente de acuerdo con el método descrito en los ejemplos posteriores. Además, como el fragmento que comprende el polipéptido que tiene la substitución o similar de aminoácidos, se prefiere el fragmento que tenga una actividad de adhesión celular y/o una actividad de enlazamiento a la heparina. La actividad de adhesión celular y la actividad de enlazamiento a la heparina, pueden ser evaluadas de acuerdo con los métodos mencionados anteriormente para determinar esas actividades. Como el fragmento que comprenda un polipéptido que tenga una substitución o similar, de aminoácidos, por ejemplo, en la presente invención se puede usar también un fragmento que tenga uno o más aminoácidos insertados como un enlazador entre dos dominios diferentes. A propósito, como la fibronectina per se, similarmente, en la presente invención se puede usar un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos que tenga una substitución, supresión, inserción o adición de uno o más aminoácidos en una secuencia de aminoácidos que constituya el polipéptido de la fibronectina, en donde el polipéptido tiene al menos algunas de las funciones de la (i) a la (iii) mencionadas anteriormente. El fragmento de fibronectina, al que se hace referencia en la presente, se puede preparar también a partir de un recombinante genético, en base a la descripción de, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 5,198,423. Por ejemplo, cada uno de los fragmentos del H-271 (SEQ ID NO: 9), H-296 (SEQ ID NO: 10) , CH-271 (SEQ ID NO: 11) y CH-296 (SEQ ID NO: 12) y un método de preparación de estos fragmentos, se describen con detalle en la especificación de esta patente. Además, el fragmento C-274 (SEQ ID NO: 8) mencionado anteriormente, se puede obtener de acuerdo con el método descrito en la patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 5,102,988. Además, un fragmento C-CS1 (SEQ ID NO: 13) se puede obtener de acuerdo con el método descrito en la Gaceta de Patente Japonesa No. 3104178. Cada fragmento del CHV-89 (SEQ ID NO: 14), CHV-90 (SEQ ID NO: 15) o CHV-179 (SEQ ID NO: 17) puede ser obtenido de acuerdo con el método descrito en la Gaceta de Patente Japonesa No. 2729712. Además, el fragmento CHV-181 (SEQ ID NO: 18) se puede obtener de acuerdo con el método descrito en la WO 97/18318. EL fragmento CHV-92 (SEQ ID NO: 16) se puede obtener a través de una técnica de ingeniería genética, usando un plásmido construido en una manera usual, en base al plásmido descrito en estas literaturas, haciendo referencia a la Gaceta de Patente Japonesa No. 2729712 y la WO 97/18318. Estos fragmentos, o fragmentos que pueden ser derivados a partir de estos fragmentos, en una manera usual, pueden ser preparados mediante el uso de microorganismos depositados en la Depositaría Internacional de Organismos de Patente, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzadas, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón (código postal 305-8566) bajo los siguientes números de acceso, o modificando un plásmido portado en' cada microorganismo de acuerdo con un método conocido. FERM BP-2264 (Escherichia coli que porta un plásmido que codifica el H-271, Fecha de Depósito: 30 de Enero de 1989) ; FERM BP-2800 (Escherichia coli que porta un plásmido que codifica el CH-296, Fecha de Depósito: 12 de Mayo de 1989) ; FERM BP-2799 (Escherichia coli que porta un plásmido que codifica el H-271, Fecha de Depósito: 12 de Mayo de 1989) ; FERM BP-7420 (Escherichia coli que porta un plásmido que codifica el H-296, Fecha de Depósito: 12 de Mayo de 1989) ; FERM BP-1915 (Escherichia coli que porta un plásmido que codifica el C-274, Fecha de Depósito: 17 de Junio de 1988) ; FERM BP-5723 (Escherichia coli que porta un plásmido que codifica el C-CS1, Fecha de Depósito: 5 de Marzo de 1990) ; FERM BP-12182 (Escherichia coli que porta un plásmido que codifica el CHV-89, Fecha de Depósito: 8 de Abril de 1991) ; y FERM BP-12183 (Escherichia coli que porta un plásmido que codifica el CHV-179, Fecha de Depósito: 8 de Abril de 1991) . Dado que la fibronectina es una glicoproteina qigantesca, no es necesariamente fácil prepararla y usarla como una proteina natural para el propósito industrial y para el propósito de la preparación del medicamento. Además, la fibronectina existe en una gran cantidad en el plasma en un cuerpo vivo. Por lo tanto, cuando se usa una fibronectina obtenida de plasma, como una preparación de sangre, existe el riesgo de contaminación de los componentes diferentes a la fibronectina, de manera tal que se considera un problema desde el aspecto de la seguridad. Además, dado que la fibronectina es un^-^proteina multifuncional , pueden considerarse algunas desventajas causadas por una región diferente a la región que exhiba el efecto, mediante el método de la presente invención, dependiendo de las circunstancias de su uso. Por estas razones, en la presente invención se puede usar preferentemente un fragmento de fibronectina, más preferentemente se puede usar un fragmento de fibronectina recombinante obtenido como se describió anteriormente, desde los puntos de vista de disponibilidad, fácil manipulación y seguridad. Además, se puede usar de manera especialmente preferente un fragmento de fibronectina que pueda exhibir un efecto tal como la mejora en una proporción de expansión de un linfocito, el incremento del nivel de expresión del IL-2R en un linfocito expandido, o la mejora en una proporción de la célula CD8-positiva, en una población de linfocitos expandidos como se describe posteriormente. Además, el peso molecular del fragmento de fibronectina usado en la presente invención es, aunque no está particularmente limitado a, preferentemente de 1 a 200 kD, más preferentemente de 5 a 190 kD, y en forma inclusive más preferente de 10 a 180 kD. (2) Método para Preparar el Linfocito Citotóxico de la Presente Invención El método para preparar el linfocito citotóxico de la presente invención se explicará concretamente a continuación. El método de la presente invención es un método para preparar un linfocito citotóxico, que comprende el paso de llevar a cabo la inducción, mantenimiento y expansión, al menos una de ellas, de un linfocito citotóxico, en la presencia de la fibronectina mencionada anteriormente, un fragmento de la misma o una mezcla de los mismos. El "linfocito citotóxico" como se usa en la presente, significa un grupo de células que contiene un linfocito citotóxico. En un sentido limitado, al linfocito citotóxico se puede hacer referencia únicamente como un linfocito citotóxico contenido en el grupo de células, mencionado anteriormente, en algunos casos. Además, la preparación del linfocito citotóxico, en la presente invención, comprende la inducción de una célula precursora que pueda ser transformada en el linfocito de la presente invención, en un linfocito que tenga una actividad citotóxica, el mantenimiento del linfocito citotóxico, y la expansión del linfocito citotóxico, usando el linfocito citotóxico y/o la célula precursora. El linfocito citotóxico de la presente invención incluye, aunque no está particularmente limitado a, por ejemplo, la célula T citotóxica (CTL) , la célula supresora activada por linfocina (célula LAK) , el linfocito de infiltración en tumores (TIL) , la célula NK y similares, cada una de las cuales tiene una actividad citotóxicá específica para el antígeno. En la presente invención, la célula precursora que puede ser transformada en un linfocito citotóxico, es decir la célula precursora que tiene la capacidad de diferenciarse y producir un linfocito, está ejemplificada por la PBMC, célula NK, célula sin afectación, célula de memoria, célula totipotente hemopoyética, célula mononuclear de sangre de cordón umbilical y similares. Además, siempre y cuando una célula sea un hemocito, la célula puede ser usada como una célula precursora en la presente invención. Cualesquiera de estas células que sean recolectadas de un cuerpo vivo, pueden ser usadas directamente, o se pueden usar aquellas que hayan sido sometidas a un almacenamiento bajo congelación. A propósito, en el método para preparar un linfocito citotóxico de la presente invención, se puede usar un material que contenga las células mencionadas anteriormente, por ejemplo, una sangre tal como la sangre periférica o sangre de cordón umbilical; uno obtenido mediante la remoción de componentes tales como eritrocitos y plasma, de la sangre; un fluido de la médula ósea y similares .

Una de las principales características del método para preparar un linfocito citotóxico de la presente invención reside en que el linfocito citotóxico se prepara en la presencia de un ingrediente eficaz seleccionado de fibronectina, un fragmento de la misma o una mezcla de los mismos . En el método de la presente invención, la inducción, mantenimiento y/o expansión del linfocito citotóxico, se lleva a cabo usualmente en un medio que contenga los componentes determinados, en la presencia del ingrediente eficaz, mencionado anteriormente, de la presente invención. Por ejemplo, en el método de la presente invención, cuando se pretende la inducción o expansión del linfocito citotóxico, el número de células (linfocitos citotóxicos y/o células precursoras) al inicio del cultivo, usadas en la presente invención, no está particularmente limitado. Por ejemplo, el número es preferentemente de 1 a 1 x 108 células/ml. Además, las condiciones del cultivo no están particularmente limitadas, y se pueden emplear condiciones usuales para el cultivo de células. Por ejemplo, las células pueden ser cultivadas bajo las condiciones de 37 °C en la presencia de 5% de CO2 y similares. Además, el medio puede ser cambiado por un medio fresco a intervalos apropiados.

El medio usado en el método para preparar un linfocito citotóxico de la presente invención no está particularmente limitado, y se puede usar un medio conocido, preparado mediante el mezclado de componentes necesarios para mantener y hacer crecer un linfocito citotóxico o su célula precursora. Por ejemplo se puede usar un medio disponible comercialmente . Estos medios pueden contener proteínas apropiadas, citocinas y otros componente^ además de los constituyentes inherentes. Preferentemente, en la presente invención se usa un medio que contenga IL-2. La concentración de IL-2 en el medio se encuentra, aunque no está particularmente limitada a, por ejemplo, preferentemente de 0.01 a 1 x 105 U/ml, más preferentemente de 0.1 a 1 x 104 U/ml. Además, una célula precursora que pueda formar un linfocito citotóxico, puede ser cultivada conjuntamente en un medio que además contenga un anticuerpo anti-CD3. La concentración del anticuerpo anti-CD3 en un medio es, por ejemplo, aunque no está particularmente limitada a, preferentemente de 0.01 a 100 µg/ml . El anticuerpo CD3 puede ser adicionado con el propósito de activar un receptor sobre un linfocito. También, además de lo anterior, se puede adicionar un factor estimulador de linfocitos, tal como lecitina. La concentración del componente en un medio no está particularmente limitada, siempre y cuando se puedan obtener los efectos deseados. Además de la coexistencia de estos componentes mediante la disolución de los componentes en un medio, se pueden usar mediante inmovilización en una fase sólida apropiada, por ejemplo en un equipo para cultivo de células (que incluya cualesquiera de los sistemas abiertos y sistemas cerrados) , tal como una caja de Petri, un matraz o una bolsa, o en un portador de cultivo de células, tales como cuentas, una membrana o un portaobjetos de vidrio. Los materiales para esas fases sólidas no están particularmente limitados siempre y cuando los materiales puedan ser usados para el cultivo de células. Cuando los componentes son inmovilizados en, por ejemplo, el equipo mencionado anteriormente, se prefiere inmovilizar una cantidad determinada de cada componente, a la cantidad del medio que se va a colocar en el equipo, de manera tal que el medio tenga una proporción similar a una concentración deseada del caso en donde los componentes se usen disolviendo los componentes en un medio, al colocar el medio en el equipo. La cantidad de los componentes inmovilizados no está particularmente limitada, siempre y cuando se puedan obtener los efectos deseados. El portador mencionado anteriormente se usa sumergiendo el portador en un medio de cultivo en el equipo para cultivo de células, durante el cultivo de células. Cuando los componentes mencionados enlazamiento al CD44; (B) una substancia capaz de regular una señal emitida por el enlazamiento de un ligando del CD44 al CD44; (C) una substancia capaz de inhibir el enlazamiento de un factor del crecimiento a un receptor del factor del crecimiento; y (D) un "substancia capaz de regular una señal-emitida por el enlazamiento de un factor del. crecimiento, a un receptor del factor del crecimiento. La substancia mencionada anteriormente, que tiene una actividad de enlazamiento al CD44, está ejemplificada, por ejemplo, por un ligando del CD44 y/o un anticuerpo anti-CD44. La substancia capaz de regular una señal emitida por el enlazamiento de un ligando del CD44, al CD44, incluye, por ejemplo, varios inhibidores para fosfoenzimas . La substancia capaz de inhibir el enlazamiento de un factor del crecimiento a un receptor del factor del crecimiento, incluye, por ejemplo, una substancia que tenga una actividad de enlazamiento a un factor del crecimiento y que forme un complejo con el factor del crecimiento, inhibiendo por ello en enlazamiento del factor del crecimiento a un receptor del factor del crecimiento, o una substancia que tenga una actividad de enlazamiento a un receptor del factor del crecimiento, inhibiendo por ello el enlazamiento del factor del crecimiento a un receptor del factor del crecimiento. Además, la substancia capaz de regular una señal emitida mediante el enlazamiento de un factor del crecimiento, a un receptor del factor del crecimiento, incluye, por ejemplo, varios inhibidores de fosfoenzimas . La concentración de estos componentes en el medio no está particularmente limitada, siempre y cuando se puedan obtener los efectos deseados. También, estos componentes se pueden usar mediante inmovilización a la fase sólida apropiada,, como se mencionó anteriormente, además de la coexistencia de estos componentes en el medio, disolviendo los componentes en el medio . Aquí, cada una de las diferentes substancias mencionadas anteriormente pueden ser usadas solas o en mezcla de dos o más tipos. En la presente invención, la frase "en la presencia del ingrediente eficaz mencionado anteriormente" se refiere al hecho de que el ingrediente eficaz se encuentra presente en un estado tal que el ingrediente eficaz, mencionado anteriormente, puede exhibir su función cuando se lleve a cabo la inducción, mantenimiento y expansión del linfocito citotóxico, y la manera existente no está particularmente limitada. Por ejemplo, cuando el ingrediente eficaz se disuelve en el medio que va a ser usado, el contenido del ingrediente eficaz de la presente invención en el medio en el cual se lleva a cabo el cultivo conjunto, no está particularmente limitado, siempre y cuando se obtengan los efectos deseados. El contenido del ingrediente eficaz es, por ejemplo, en forma preferente, de 0.01 a 1000 µg/ml, en forma más preferente de 0.1 a 1000 Ug/ml y en forma inclusive más preferente de 1 a 100 ug/ml. Además de la coexistencia del ingrediente eficaz, disolviendo el ingrediente eficaz en un medio como anteriormente, se puede usar por inmovilización a una fase sólida apropiada, por ejemplo, a un equipo para cultivo de células (que incluye cualquier sistema abierto y sistema cerrado), tal como una caja de Petri, un matraz o una bolsa, o en un portador de cultivo de células tal como cuentas, una membrana o un portaobjetos de vidrio. Desde el punto de vista de la administración del linfocito citotóxico cultivado, a un cuerpo vivo, se desea que el ingrediente eficaz mencionado anteriormente sea inmovilizado, pero no está particularmente limitado a lo mismo . Una vez que varios componentes mencionados anteriormente, o el ingrediente eficaz de la presente invención, se encuentran inmovilizados a la fase sólida, el linfocito citotóxico puede ser separado fácilmente del ingrediente eficaz o similar, después de que el linfocito es obtenido mediante el método de la presente invención, únicamente separando el linfocito de la fase sólida, de manera tal que se pueda prevenir la contaminación del ingrediente eficaz al linfocito. Cuando el ingrediente eficaz de la presente invención es inmovilizado, por ejemplo, al equipo mencionado anteriormente, es preferible inmovilizar una cantidad determinada de cada ingrediente eficaz, a la cantidad del medio que vaya a ser colocado en el equipo, de manera tal que el medio tenga una proporción similar a una concentración deseada en un caso en donde el ingrediente eficaz sea usado disolviendo el ingrediente eficaz en un medio, al colocar el medio en el equipo. La cantidad del ingrediente eficaz no está limitada particularmente, siempre y cuando se obtengan los efectos deseados. Cuando el ingrediente eficaz sea inmovilizado en el portador mencionado anteriormente, es preferible inmovilizar una cantidad determinada de cada ingrediente eficaz en la cantidad del medio que vaya a ser colocado en un equipo, de manera tal que el medio tenga una proporción similar a una concentración deseada en un caso en donde el ingrediente eficaz se use disolviendo el ingrediente eficaz en un medio al colocar el portador en el medio. La cantidad del ingrediente eficaz no está particularmente limitada, siempre y cuando se obtengan los efectos deseados. Por ejemplo, la inmovilización del fragmento de fibronectina puede llevarse a cabo con los métodos descritos en la WO 97/18318 y en la WO 00/09168. Cuando el nivel de expresión del IL-2R es determinado para el linfocito citotóxico obtenido mediante el .método de la presente invención, se reconoce un incremento significativo en el nivel de expresión del IL-2R en comparación con un linfocito citotóxico obtenido al llevar a cabo la .inducción, mantenimiento y expansión, al menos una de ellas, en la ausencia de fibronectina, un fragmento de la misma o una mezcla de los mismos. Aquí, el nivel de expresión del IL-2R puede ser determinado a través de un método conocido, por ejemplo, usando un anticuerpo anti-IL-2R. Como se describió anteriormente, el linfocito citotóxico obtenido a través del método de la presente invención, tiene un nivel de expresión del IL-2R, incrementado. El IL-2R es un marcador de activación que es expresado sobre una superficie de una célula T activada, y con la expresión de esta molécula es activada la producción de citocina, la actividad citotóxica, la activación de la proliferación o similares. Por lo tanto, el linfocito citotóxico obtenido a través del método de la presente invención, es un grupo de células que tienen una función elevada . Además, dado que el linfocito citotóxico obtenido a través del método de la presente invención tiene un nivel de expresión del IL-2R, incrementado, el linfocito citotóxico tiene una sensibilidad incrementada a una estimulación por el IL-2R adicionado a un medio, o IL-2 producido por una célula precursora de un linfocito citotóxico, un linfocito mismo u otra célula coexistente. Por esta razón el linfocito citotóxico puede ser activado por si mismo, inclusive bajo el ambiente de una cantidad más pequeña de IL-2 (por ejemplo, en un cuerpo vivo o similar) . Además, en el linfocito citotóxico obtenido a través del método de la presente invención, la proporción de existencia de la célula (CD8-positiva) que tiene un marcador CD8, es alta en comparación con la del linfocito citotóxico obtenido al llevar a cabo la inducción, mantenimiento y expansión, al menos una de ellas, en la ausencia de fibronectina, un fragmento de la misma, o una mezcla de los mismos. Este hecho tiene algunas ventajas, por ejemplo, (1) que la célula CD8-positiva produce una citocina tal como el interferón-?, causando por ello que la activación inmunológica cambie un equilibrio de células T auxiliares en el sistema dominante Thl, (2) que la célula CD8-positiva es un inmunocito celular que puede excluir eficientemente una substancia extraña tal como un virus o una célula tumoral, (3) que cuando la célula CD8-positiva es obtenida, la célula CD8-positiva puede ser enriquecida cultivando la célula de acuerdo con el método de la presente invención, mientras la célula CD8-positiva ha sido purificada convencionalmente con cuentas magnéticas o un citómetro de flujo, (4) que el linfocito citotóxico es usado convenientemente como una célula precursora durante la inducción del CTL, porque la proporción de la célula CD8-positiva es alta, (5) que inclusive una población de células que tenga una menor proporción de la célula CD8-positiva, puede ser cultivada con el incremento de la proporción de la célula CD8-positiva y similar. Por lo tanto, el método de la presente invención es muy útil en la preparación de un linfocito citotóxico. Aquí, la proporción de la célula CD8-positiva en el linfocito citotóxico obtenido mediante el método de la presente invención, puede ser determinada, por ejemplo, aunque no particularmente limitado a, el uso de un anticuerpo anti-CD8. Además, el linfocito citotóxico, especialmente el CTL, preparado de acuerdo con el método de al presente invención, tiene una excelente característica de que no existe una reducción drástica en la actividad citotóxica como se observó previamente, aún cuando una célula posterior al cultivo sea mantenida por un largo período, o la célula prolifere. En otras palabras, el linfocito citotóxico mantiene una alta actividad citotóxica en comparación con un linfocito citotóxico obtenido al llevar a cabo la inducción, mantenimiento y expansión, al menos una de ellas, en la ausencia de fibronectina, un fragmento de la misma o una mezcla de los mismos. Por lo tanto puede ser mantenido como un linfocito que tenga una actividad citotóxica estable, mediante la clonación de linfocito citotóxico cultivado. Además, el CTL inducido puede ser proliferado y expandido mediante la estimulación del CTL con un antígeno, varios tipos de citocinas, o un anticuerpo anti-CD3. Se puede usar un método conocido para el mantenimiento o expansión del linfocito citotóxico sin estar particularmente limitado al mismo. El mantenimiento del linfocito citotóxico mencionado anteriormente se refiere al mantenimiento del linfocito citotóxico, manteniendo su actividad citotóxica. Las condiciones del cultivo durante el mantenimiento no están particularmente limitadas, y se pueden usar las condiciones usadas en el cultivo de células ordinarias. Por ejemplo, las células pueden ser cultivadas bajo las condiciones de 37 °C en la presencia de 5% de CO2, y similares. Además, el medio puede ser cambiado por uno fresco, a intervalos apropiados. El medio que debe usarse y otros componentes usados simultáneamente con el mismo y similares, son los mismos que se mencionaron anteriormente.

Una de las principales características de mantenimiento y expansión del linfocito citotóxico en el método de la presente invención reside en que el método comprende respectivamente cultivar y expandir en forma continua el linfocito · citotóxico en un medio, en la presencia del ingrediente eficaz de la presente invención, es decir la fibronectina, un fragmento de la misma o una mezcla de los mismos. De acuerdo con la expansión, el número de células del linfocito citotóxico se puede incrementar en un estado tal que se mantenga la actividad citotóxica poseída por el linfocito citotóxico. En otras palabras, como una modalidad del método de la presente invención se proporciona un método para expandir un linfocito citotóxico. En el método para expandir un linfocito citotóxico de la presente invención, las condiciones de cultivo no están particularmente limitadas, y se pueden utilizar las condiciones usadas para el cultivo ordinario de células. Por ejemplo, las células pueden ser cultivadas bajo las condiciones de 37 °C en la presencia de 5% de C02, y similares. Además, el medio puede ser cambiado por uno fresco a intervalos apropiados. El medio a ser usado y otros componentes usados simultáneamente con el mismo y similares, son iguales a los mencionados anteriormente. De acuerdo con el método para expansión de la presente invención, por ejemplo, en el caso de la expansión del CTL, se puede obtener un CTL cuyo número de células se haya incrementado de 100 a 1000 veces, mediante por expansión por 14 días. Además, como un ejemplo del caso de expansión de la célula LAK, se puede obtener una célula LAK incrementada en aproximadamente 200 veces, cultivando la célula por 7 dias, y en aproximadamente 1000 veces, cultivando la célula por 9 dias. Además, el linfocito citotóxico asi obtenido, especialmente el CTL, tiene una actividad citotóxica mayor en comparación con uno obtenido a través de un método convencional para expandir un linfocito citotóxico, por ejemplo, un método REM o un método REM modificado. Los efectos de la presente invención descritos anteriormente pueden ser confirmados mediante la determinación de una actividad citotóxica poseída por el CTL o similar, expandido a través del método de la presente invención, de acuerdo con el método descrito en los ejemplos presentados posteriormente. Además, el método para preparar un linfocito citotóxico de la presente invención tiene la característica de que el cultivo puede iniciarse con un bajo número de células. Se requiere de una gran cantidad de linfocitos para llevar a cabo la inmunoterapia adoptada, pero es difícil obtener una gran cantidad de linfocitos de un paciente. Además, en una expansión ordinaria del linfocito citotóxico, se ha necesitado la selección de un equipo para cultivo de células, que tenga un área de cultivo apropiada, dependiendo del número de células que vayan a ser usadas, y el cultivo en una cantidad apropiada del medio. En otras palabras, usualmente el cultivo se inicia bajo condiciones de alta densidad tales que la cantidad (número) de células para un área de cultivo en un equipo para cultivo de células [es decir área (cm2) de un área superficial del equipo que haga contacto con el medio] es 1 x 106 células/cm2 o más, y la concentración de células es de 1 x 106 células/ml o más. Cuando el cultivo se lleva a cabo bajo las condiciones por debajo de este nivel de células, la proporción de expansión (una proporción del número de células después de la expansión, con respecto al número de células antes de la expansión (número de células después de la expansión/número de células antes de la expansión)] se vuelve muy baja, por lo cual se requiere de un período de cultivo a largo plazo antes de que se obtengan linfocitos citotóxicos en una gran cantidad. Por lo tanto, en general, comúnmente se prepara un gran número de linfocitos, por ejemplo mediante el inicio del cultivo usando un equipo para cultivo de células pequeño, y posteriormente usando un equipo para cultivo de células, a gran escala, por etapas, o un método para incrementar el número de equipos para cultivo de células y repitiendo procedimientos de dilución.

Como se describió anteriormente, se requiere de una pluralidad de sistemas de cultivo en la expansión ordinaria del linfocito citotóxico. De acuerdo con el método de la presente invención, aún cuando se inicie con una pequeña cantidad de células, la célula puede ser cultivada con una gran proporción de expansión, sin importar el tamaño del equipo para cultivo de células. Por lo tanto, un procedimiento complicado, tal como el del cambio del equipo para cultivo de células y los procedimientos de dilución descritos anteriormente, se vuelven innecesarios. En otras palabras, de acuerdo con el método de la presente invención, la expansión del linfocito citotóxico puede ser llevada a cabo satisfactoriamente a través de procedimientos de cultivo usando un equipo para el cultivo de células, es decir, un sistema de cultivo. Por lo tanto, el método de la presente invención consiste en un método para preparar un linfocito citotóxico, que excluye el paso de dilución o el paso de cambiar un equipo para el cultivo de células. Especialmente, cuando la célula LA se expande de acuerdo con el método de la presente invención, la célula LAK puede ser expandida mediante la adición de una célula que pueda ser transformada en una célula LAK y un medio en un equipo para el cultivo de células, de gran volumen, y adicionando al mismo solamente IL-2 en etapas subsecuentes. La presente invención es muy útil en el aspecto de que se puede obtener una gran cantidad de células LAK a través de un procedimiento simple. Aquí, el fragmento de fibronectina puede ser usado preferentemente como el ingrediente eficaz de la presente invención, para ser usado desde el punto de vista de la obtención de una mayor proporción de expansión. Como se describió anteriormente, de acuerdo con el método de la presente invención, se puede obtener una cantidad necesaria del linfocito citotóxico, en un periodo menor. Por ejemplo, cuando la inducción, mantenimiento y expansión, alguna de ellas, de un linfocito citotóxico, sea iniciada con un número bajo de células en un equipo de cultivo que contenga un medio en la presencia del ingrediente eficaz de la presente invención, la inducción, mantenimiento o expansión se puede llevar a cabo usando una cantidad de células que satisfaga las condiciones seleccionadas de los siguientes incisos (a) y (b) al inicio del cultivo: (a) la proporción de la cantidad de células para el área de cultivo, en el equipo para cultivo de células, que debe ser usada, es preferentemente de 1 a 5 x 105 células/cm2, más preferentemente de 10 a 1 x 105 células/cm2, de manera especialmente preferentemente de 1 x 102 a 5 x 104 células/cm2; y (b) la concentración de las células en el medio es preferentemente de 1 a 5 x 105 células/ml, más preferentemente de 10 a 1 x 105 células/ml, de manera especialmente preferentemente de 1 x 102 a 5 x 104 células/ml . La cantidad de células, tal como se usa en la presente, se refiere al número de linfocitos citotóxicos y/o de células precursoras. Además, en el método de la presente invención se ejemplifica un método que comprende llevar a cabo una inducción, mantenimiento y expansión, al menos una de ellas, de un linfocito citotóxico en un sistema de cultivo, que excluye el paso de cambio de un equipo para el cultivo de células o el paso del procedimiento de dilución. El método de la presente invención será explicado tomando como un ejemplo la preparación del CTL. La inducción del CTL se lleva a cabo incubando (cultivando) una célula precursora capaz de diferenciarse en CTL junto con una célula presentadora de antigeno, apropiada, en la presencia del ingrediente eficaz mencionado anteriormente, por ejemplo en algún medio, a fin de proporcionar al CTL la capacidad de reconocer el antigeno deseado. La célula precursora no está particularmente limitada, siempre y cuando la célula precursora sea una célula que se encuentre en una etapa antes de que la célula se convierta en CTL y que haya estado predestinada a diferenciarse en CTL, e incluye, por ejemplo, célula mononuclear de la sangre periférica (PBMC) , células sin afección, célula de memoria, célula mononuclear de sangre de cordón umbilical, célula totipotente hemopoyética , y similares. La célula presentadora de antígeno no está particularmente limitada, siempre y cuando la célula tenga la capacidad de presentar un antígeno que vaya a ser reconocido por la célula T. Por ejemplo, en la presente invención se puede usar una célula mononuclear, una célula B, una célula T, un macrófago, una célula dendrítica, un fibroblasto o similar, al que se le permita presentar un antígeno deseado. En la presente invención, las condiciones de cultivo para una célula precursora o similar, durante la preparación del CTL, pueden ser, por ejemplo, establecidas de acuerdo con las condiciones en general conocidas [ver, por ejemplo, Cárter J. et al., Im unology 57(1), 123-129 (1986) ] . Además la célula puede ser cultivada conjuntamente con una célula alimentadora . Cuando el CTL se cultiva conjuntamente con la célula alimentadora, se desea que el medio sea uno que sea apropiado para el mantenimiento y crecimiento tanto del CTL como de la célula alimentadora. Como medio se puede usar un medio disponible comercialmente .

La célula alimentadora usada para el método de la presente invención no está particularmente limitada, siempre y cuando la célula alimentadora estimule el CTL en forma cooperativa con un anticuerpo anti-CD3 para activar el receptor de la célula T. En la presente invención, por ejemplo, se usa una PBMC o célula B transformada con el virus de Epstein-Barr (célula EBV-B ) . Usualmente, se usa una célula alimentadora después de que se ha privado de su capacidad de proliferación, mediante irradiación o similar. A propósito, el contenido de la célula alimentadora en el medio puede ser determinado de acuerdo con las condiciones conocidas. Por ejemplo, el contenido es preferentemente de 1 x 105"7 células/ml. En una modalidad particularmente preferida de la presente invención, una célula no infectada con virus, por ejemplo, una célula diferente a la célula EVB-B, se usa como célula alimentadora. Usando la célula no infectada con virus, se puede eliminar la posibilidad de que la célula EVB-B se mezcle en un CTL expandido, haciendo con ello posible incrementar la seguridad en tratamientos médicos que utilicen CTL, tal como la inmunoterapia adoptiva. La célula presentadora de antigeno puede ser preparada adicionando un péptido antigénico a una célula que tenga una capacidad presentadora de antigeno, permitiendo con ello que la célula presente el péptido antigénico sobre su superficie [ver, por ejemplo Bendnarek M.A. et al., J. Immunol . 147(12), 4047-4053(1991)]. Además, en el caso de que la célula que tenga una capacidad presentadora de antígeno, tenga la capacidad de procesar un antigeno, se adiciona un antigeno a la célula, por lo cual el antigeno se incorpora a la célula y es procesado en la misma, y péptidos antigénicos fragmentados son presentados sobre la superficie de la célula. A propósito, cuando un péptido antigénico es adicionado a una célula que tiene una capacidad presentadora de antigeno, se usan un péptido antigénico que coincida con la restricción MHC de la célula presentadora de antigeno usada y el CTL que vaya a ser inducido . A propósito, el antigeno usado en la presente invención no está particularmente limitado, e incluye, por ejemplo, antigenos exógenos tales como bacterias y virus, antigenos endógenos tales como antigenos asociados con tumores (antígenos del cáncer), y similares. En la presente invención es preferible que la célula presentadora de antigeno se haga no proliferativa . A fin de hacer no proliferativa a la célula, la célula puede ser, por ejemplo, sometida a irradiación con rayos X o similares, o a un tratamiento con un agente tal como la mitomicina . En la presente invención, las condiciones comunes para incubar (cultivar conjuntamente) una célula precursora capaz de diferenciarse en CTL junto con una célula presentadora de antigeno, en la presencia del ingrediente eficaz seleccionado de fibronectina, un fragmento de la misma o una mezcla de los mismos, para inducir un CTL, pueden ser condiciones conocidas [ver, por ejemplo Bendnarek M.A. et al., J. Immunol. 147(12), 4047-4053(1991)]. Las condiciones de cultivo · conjunto no están particularmente limitadas, y se pueden usar las condiciones usualmente utilizadas para el cultivo de células. Por ejemplo, las células pueden ser cultivadas bajo las condiciones de 37 °C en la presencia de 5% de CO2, y similares. El cultivo conjunto se lleva a cabo usualmente por un tiempo desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 15 días, tiempo durante el cual la célula presentadora de antigeno puede ser cambiada con una recientemente preparada para causar la reestimulación. Además, el medio puede ser cambiado por uno fresco, a intervalos apropiados. El CTL asi obtenido a través del método de la presente invención tiene la capacidad de reconocer específicamente el antígeno deseado, por ejemplo, destruyendo específicamente una célula que tenga el antígeno, mediante su actividad citotóxica. Esta actividad citotóxica del CTL puede ser evaluada a través de un método conocido. Por ejemplo, la actividad citotóxica del CTL contra una célula objetivo marcada con una substancia radiactiva, una substancia fluorescente o similar, puede ser evaluada determinando la radiactividad o intensidad de la fluorescencia adscrita a la célula objetivo destruida por el CTL. Además se puede detectar determinando la cantidad de una citocina tal como GM-CSF o antígeno liberado por IFN-?, específicamente del CTL o una célula objetivo. Además de los mismos, la actividad citotóxica puede ser confirmada directamente mediante el uso de un complejo de peptido antigénico-MHC en el que el péptido se encuentre marcado con un pigmento fluorescente o similar. En este caso, por ejemplo, el CTL se pone en contacto con un primer marcador fluorescente acoplado con un anticuerpo específico para el CTL, y luego con un complejo de péptido antigénico-MHC, en el que el péptido esté acoplado con un segundo marcador fluorescente, y la presencia de una célula doblemente marcada es detectada mediante el análisis FACS (clasificación de células activada por fluorescencia) , por medio de lo cual se puede evaluar la actividad citotóxica del CTL. A propósito, el método para expandir el CTL de la presente invención no está limitado particularmente, siempre y cuando el ingrediente eficaz mencionado anteriormente, exista en el sistema de cultivo usado en el método. La presente invención comprende también una modalidad en la que el método se lleva a cabo por la existencia del ingrediente eficaz mencionado anteriormente, en el sistema de cultivo, en un método convencional para la expansión del CTL, diferente a aquellos descritos anteriormente, es decir, el cultivo de una célula precursora o similar se lleva a cabo en la presencia del ingrediente eficaz de la presente invención (por ejemplo, adicionando el ingrediente eficaz mencionado anteriormente, a un medio que vaya a ser usado en el cultivo) . A continuación se explicará con detalle el método para cultivar la célula LAK. El cultivo de la célula LAK se lleva a cabo incubando una célula que puede ser transformada en una célula LAK junto con IL-2 en la presencia del ingrediente eficaz mencionado anteriormente. La célula que puede ser transformada en célula LAK incluye, aunque ' no está particularmente limitada a, por ejemplo, una célula mononuclear de sangre periférica (PBMC) , una célula NK, una célula mononuclear de sangre de cordón umbilical, una célula totipotente hemopoyética, componentes de la sangre que contengan estas células, y similares. Además, las condiciones generales para cultivar la célula LAK pueden ser establecidas de acuerdo con las condiciones conocidas [por ejemplo, ver Saibó Kogaku (Cell Technology), 14(2), 223-227 (1995); Saibó Baiyo (Cell Culture) 17(6), 192-195 (1991); THE LANCET, 356, 802-807 (2000); Current Protocole in Immunology, supplement 17, UNIT 7.7]. Las condiciones de cultivo conjunto no están particularmente limitadas, y se pueden emplear las condiciones que se usan en el cultivo de células ordinario. Por ejemplo, el cultivo se puede llevar a cabo bajo las condiciones de 37 °C en la presencia de 5% de CO2, y similares. Este cultivo conjunto se lleva a cabo usualmente por un tiempo desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 15 días. Además, el medio puede ser cambiado por uno fresco, a intervalos apropiados. En la misma manera que aquella para la inducción mencionada anteriormente, el mantenimiento o expansión del CTL o de la célula LAK, en lo referente al TIL, un grupo de células que tenga una actividad citotóxica alta, puede ser preparado cultivando las células en la presencia de fibronectina, un fragmento de la misma o una mezcla de los mismos. En la presente invención no existe limitación particular en los procedimientos para activar estas células siempre y cuando la fibronectina, un fragmento de la misma o una mezcla de los mismos coexista con las mismas, y los procedimientos pueden llevarse a cabo usando un medio apropiado para el cultivo o activación de las células mencionadas anteriormente. En cuanto a la cantidad de fibronectina, se puede usar un fragmento de la misma o una mezcla de los mismos, y para el método de adicionar el componente y similares, se puede seleccionar uno apropiado de acuerdo con el método mencionado anteriormente . De acuerdo con el método mencionado anteriormente, para preparar un linfocito citotóxico de la presente invención, se obtiene un linfocito citotóxico en el que la actividad citotóxica se mantenga en un alto nivel, en el que el nivel de expresión del IL-2R se incremente significativamente, y se mejore una proporción de una célula CD8-positiva, y el linfocito citotóxico es apropiado para uso en medicina. Por consiguiente, como una modalidad del método de la presente invención, se proporciona además un método para incrementar la expresión de un receptor de interleucina-2 en un linfocito citotóxico, que comprende el paso de llevar a cabo la inducción, mantenimiento y expansión, al menos una de ellas, de un linfocito citotóxico, en la presencia del ingrediente eficaz de la presente invención; un método para mejorar una proporción de célula CD8-positiva en un linfocito citotóxico, que comprende el paso de llevar a cabo una inducción, mantenimiento y expansión, al menos una de ellas, de un linfocito citotóxico, en la presencia del ingrediente eficaz de la presente invención; y un método para mejorar o mantener una actividad citotóxica en un linfocito citotóxico, que comprende el paso de llevar a cabo una inducción, mantenimiento y expansión, al menos una de ellas, de un linfocito citotóxico, en la presencia del ingrediente eficaz de la presente invención. En otra modalidad de la presente invención se proporciona un agente para mejorar la expresión del IL-2R sobre la superficie de una célula, que comprende como ingrediente eficaz fibronectina, un fragmento de la misma o una mezcla de los mismos. El agente mej orador comprende el ingrediente eficaz mismo y además otro ingrediente opcional, por ejemplo, un medio, una proteína, y una citocina (preferentemente IL-2) que sea apropiada para que una célula sea activada, y otros componentes deseados. También, el medio que contiene el agente mej orador mencionado anteriormente puede ser empleado como un medio para aumentar la expresión del IL-2R en un linfocito citotóxico. El medio mencionado anteriormente contiene opcionalmente componentes básicos para el cultivo celular. Aquí, el agente mej orador y el medio para mejorar la expresión del IL-2R, mencionados anteriormente, pueden ser preparados usando el ingrediente activo de la presente invención, de acuerdo con un método conocido. El contenido del ingrediente eficaz de la presente invención y similares, en el agente mej orador o el medio para mejorar la expresión del IL-2R mencionado anteriormente, no está particularmente limitado, siempre y cuando se obtengan los efectos deseados de la presente invención. Por ejemplo, el contenido puede ser determinado apropiadamente de acuerdo con el contenido del ingrediente eficaz y similar, en el medio mencionado anteriormente, usado en el método de la presente invención, según se desee. Además, el agente mej orador mencionado anteriormente puede ser administrado directamente a un cuerpo vivo, por lo cual pueda mejorarse la expresión del IL- 2R en una célula en un cuerpo vivo. Todavía en otra modalidad de la presente invención, se proporciona un agente para mejorar una proporción de la célula CD8 -positiva en una población de linfocitos cultivados, caracterizado porque el agente comprende como un ingrediente eficaz, fibronectina, un fragmento de la misma o una mezcla de los mismos. El agente mej orador de la proporción comprende el ingrediente eficaz mismo y además otro ingrediente opcional, por ejemplo, un medio, una proteína, y una citocina (preferentemente IL- 2 ) que sean apropiados para que una célula sea activada, y otros componentes deseados. También, el medio que contiene el agente mejorador de la proporción, mencionado anteriormente, puede ser empleado como un medio para mejorar una proporción de la célula CD8 -positiva en un linfocito citotóxico. El medio mencionado anteriormente contiene en forma opcional componentes básicos para el cultivo de células. Aqui, el agente mejorador de la proporción, y el medio para mejorar la proporción, mencionados anteriormente, pueden ser preparados usando el ingrediente eficaz de la presente invención, de acuerdo con un método conocido. El contenido del ingrediente eficaz de la presente invención y similares, en el agente mejorador de la proporción, o el medio para mejorar una proporción de la célula CD8-positiva, mencionado anteriormente, puede ser determinado apropiadamente según se desee, en la misma manera que el caso del agente, mencionado anteriormente, para expresar el IL-2R y similares. Además, el agente mejorador de la proporción, mencionado anteriormente, puede ser administrado directamente a un cuerpo vivo, por lo cual se pueda mejorar la proporción de un linfocito citotóxico en un cuerpo vivo. En otra modalidad de la presente invención se proporciona un agente para mejorar o mantener la actividad citotóxica en un linfocito citotóxico, caracterizado porque el agente comprende como un ingrediente eficaz, fibronectina , un fragmento de la misma o una mezcla de los mismos. El agente mejorador o de mantenimiento comprende el ingrediente eficaz mismo y además otro ingrediente opcional, por ejemplo, un medio, una proteina, y una citocina (preferentemente IL-2) que sean apropiados para activar a una célula, y otros componentes deseados.

También, el medio que contiene el agente mej orador o de mantenimiento, mencionado anteriormente, puede ser empleado como un medio para mejorar o mantener una actividad citotóxica en un linfocito citotóxico. El medio mencionado anteriormente contiene, de manera opcional, componentes básicos para el cultivo de células. Aquí, el agente mej orador o de mantenimiento y el medio mej orador o de mantenimiento, mencionado anteriormente, pueden ser preparados usando el ingrediente eficaz de la presente invención, de acuerdo con un método conocido. El contenido del ingrediente eficaz de la presente invención, en el agente mej orador o de mantenimiento, y el medio mej orador o de mantenimiento mencionado anteriormente, no están particularmente limitados, siempre y cuando se obtengan los efectos deseados de la presente invención. Por ejemplo, el contenido puede ser determinado apropiadamente de acuerdo con el contenido del ingrediente eficaz en el medio mencionado anteriormente, usado en el método de la presente invención, según se desee. Además, el agente mejorador o de mantenimiento, mencionado anteriormente, puede ser administrado directamente a un cuerpo vivo, con lo cual se pueda mejorar o mantener la actividad del linfocito citotóxico en un cuerpo vivo. Además, el agente mejorador de la expresión, el agente mejorador de la proporción y el agente para mejorar o mantener una actividad citotóxica, mencionado anteriormente, puede encontrarse en una forma tal que los componentes sean inmovilizados en una fase sólida apropiada, por ejemplo, en un equipo para cultivo de células tal como una caja de Petri, un matraz o una bolsa (incluyendo sistemas tanto abiertos como cerrados), y en un portador de cultivo de células tales como cuentas, una membrana o un portaobjetos de vidrio. Usualmente, en el cultivo que contiene el linfocito, obtenido mediante el uso del método para preparar un linfocito citotóxico como el que se describió anteriormente, células diferentes a un linfocito citotóxico, tales como células T auxiliares, se encuentran mezcladas en el mismo. Sin embargo, dado que los linfocitos que tienen una actividad citotóxica se encuentran contenidos en una gran cantidad en el cultivo que contiene linfocitos, obtenido mediante la presente invención, las células en el cultivo pueden ser recolectadas del cultivo por centrifugación o técnica similar, y pueden ser usadas directamente como un linfocito citotóxico obtenido a través del método de la presente invención. Además, si el ingrediente eficaz o similar, mencionado anteriormente, es inmovilizado en un equipo para cultivo de células o similar, no hay riesgo del mezclado del componente o similar, en el linfocito citotóxico resultante.

Además, una población de células (o cultivo) rica en un linfocito citotóxico, puede ser separada adicionalmente del cultivo a través de un método conocido, y usada como un linfocito citotóxico de la presente invención. En otras palabras, el método para preparar un linfocito citotóxico obtenido mediante el método de la presente invención, puede comprender el paso de seleccionar una población de células rica en un linfocito citotóxico, del cultivo obtenido mediante el método. El método para seleccionar una población de células rica en un linfocito citotóxico, no está particularmente limitado. El método es ejemplificado, por ejemplo, por un método que comprende recolectar selectivamente únicamente la célula deseada del cultivo, usando un equipo para cultivo de células o portador al cual se enlace un anticuerpo contra un antigeno de la superficie celular expresado sobre la superficie celular deseada, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD8, o un método que use un citómetro de flujo. El portador mencionado anteriormente es ejemplificado por cuentas magnéticas o por una columna. Además, la población de células rica en la célula deseada puede ser obtenida, removiendo por adsorción, células diferentes a la célula deseada, del cultivo. Por ejemplo, la célula T auxiliar puede ser removida del cultivo de linfocitos, usando un anticuerpo contra un antigeno de la superficie celular, expresado sobre una superficie de la célula T auxiliar, un anticuerpo anti-CD4. En este paso se puede usar también un citómetro de flujo. La población de células rica en el linfocito citotóxico, asi obtenida, tiene una actividad citotóxica más potente, en comparación con la de la población de células recolectada de manera no selectiva a partir de un cultivo, de manera tal que la población de células pueda ser usada de manera especialmente preferente, en el campo médico. Además, la presente invención proporciona un linfocito citotóxico obtenido a través del método para preparar un linfocito citotóxico de la presente invención, mencionado anteriormente. El linfocito, especialmente el CTL, tiene una alta actividad citotóxica, que tiene una característica que consiste en una poca reducción de la actividad citotóxica, inclusive cuando el linfocito sea sometido al cultivo o expansión continua por un largo período. Además, la presente invención proporciona un medicamento (agente terapéutico) que comprende el linfocito como un ingrediente eficaz. Especialmente, el agente terapéutico mencionado anteriormente, que comprende el linfocito, es usado apropiadamente en inmunoterapia adoptiva. En la inmunoterapia adoptiva, el linfocito que tiene una actividad citotóxica apropiada para tratar a un paciente, es administrado al paciente, por ejemplo, mediante administración intravenosa. El agente terapéutico puede ser preparado, por ejemplo, mediante el mezclado del linfocito preparado a través del método de la presente invención, como un ingrediente efectivo, por ejemplo con un portador orgánico o inorgánico conocido, apropiado para la administración no oral, un excipiente, un agente estabilizante y similar, de acuerdo con un método conocido en el campo farmacéutico. A propósito, varias condiciones para el agente terapéutico, tales como el contenido del linfocito de la presente invención en el agente terapéutico, y la dosis del agente terapéutico, pueden ser determinadas apropiadamente de acuerdo con la inmunoterapia adoptiva conocida. El método para preparar un linfocito citotóxico de la presente invención puede comprender además el paso de transducir un gen extraño al linfocito. En otras palabras, una modalidad de la presente invención proporciona un método para preparar un linfocito citotóxico, que comprende además el paso de transducir un gen extraño a un linfocito citotóxico. Aquí, el término "extraño" se refiere a aquellos que son extraños para un linfocito en el cual se va a transducir un gen. Al llevar a cabo el método para preparar un linfocito citotóxico de la presente invención, especialmente el método para expandir un linfocito citotóxico, se mejora la capacidad de replicación del ñDN del linfocito cultivado. Por lo tanto, al incluir el paso de transducción de un gen, en el método para preparar un linfocito citotóxico de la presente invención, se espera un incremento en el método de transducción del gen. Los métodos para tranducir un gen extraño no están particularmente limitados, y se puede seleccionar un método apropiado, de un método conocido para transducir un gen. El paso de transducción de un gen puede llevarse a cabo en cualquier punto durante la preparación de un linfocito citotóxico. Por ejemplo, es preferible llevar a cabo el paso simultáneamente con cualquier paso de inducción, mantenimiento y/o expansión, mencionada anteriormente, del linfocito, o después del paso, desde el punto de vista de eficiencia en el trabajo. Como el método mencionado anteriormente para transducir un gen, en la presente invención se pueden emplear cualesquiera de los métodos que usen un vector viral, y métodos que no usen ese vector. Los detalles de esos métodos se encuentran ya publicados en numerosas literaturas . El vector viral mencionado anteriormente no está particularmente limitado, y se usa un vector viral conocido, usado ordinariamente en el método para transducir un gen, por ejemplo un vector retroviral, un vector lentiviral, un vector adenoviral, un vector viral adeno-asociado, un vector viral de simio, un vector viral de vacunas, un vector viral Sendai, o similares. Especialmente preferente, como el vector viral se usa un retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociado o virus de simio. Como el vector viral mencionado anteriormente son preferibles aquellos que carezcan de capacidad de replicación, de manera tal que el vector viral no pueda replicarse por si mismo en una célula infectada. El vector retroviral se usa para el propósito de la terapia con genes o similares, porque se puede incorporar establemente un gen extraño insertado en el vector, en el ADN cromosómico en la célula en la cual se vaya a transducir el vector. Dado que el vector tiene una alta eficiencia de infección a la célula durante la mitosis y proliferación, la transducción de genes se lleva a cabo preferentemente, en el método para preparar un linfocito citotóxico, por ejemplo, en el paso de expansión. Como el método para transducir un gen sin usar un vector viral, se puede emplear, aunque sin estar particularmente limitado a, por ejemplo, un método que use un portador tal como un liposoma o ligando-polilisina, un método que use fosfato de calcio, un método de electroporación, un método con cañón de partículas o similares. En este caso se transduce un gen extraño incorporado en el ADN plásmido o en el ADN lineal. El gen extraño que va a ser transducido en un linfocito citotóxico, en la presente invención, no está limitado particularmente, y se puede seleccionar un gen arbitrario que se desee transducir en la célula mencionada anteriormente. Como el gen descrito anteriormente, además de un gen que codifique una proteina (por ejemplo, una enzima, una citocina, un receptor o similar) , se puede usar por ejemplo, un gen que codifique un ácido nucleico antisentido o una ribozima. Además, un gen marcador apropiado, que pueda seleccionar una célula en la cual se vaya a transducir un gen, puede ser transducido simultáneamente . El gen extraño mencionado anteriormente puede ser, por ejemplo, insertado en un vector, un plásmido, o similar, de manera tal que el gen extraño sea expresado bajo el control de un promotor apropiado, y usado. Además, a fin de conseguir una transcripción eficiente de un gen, puede existir en un vector otro elemento regulador que coopere con un promotor o un sitio de inicio de la transcripción, por ejemplo, una secuencia reforzadora o una secuencia terminadora. Además, con el propósito de insertar un gen extraño en un cromosoma, en un linfocito en el que el gen sea transducido por recombinación homologa, por ejemplo, un gen extraño puede ser dispuesto entre secuencias flanqueadoras que comprendan secuencias de nucleótidos, cada una de las cuales tenga homología de secuencias de nucleótidos localizadas sobre ambos lados del sitio de inserción objetivo, deseado, del gen en el cromosoma. El gen extraño que va a ser transducido puede ser uno natural o uno generado artificialmente, o puede ser uno en el cual las moléculas de ADN que tengan diferentes orígenes entre sí sean enlazadas a través de medios conocidos tales como ligación. Además, el gen extraño puede ser uno que tenga una secuencia en la que se introduzca una mutación en una secuencia natural, dependiendo de su propósito . De acuerdo con el método de la presente invención, por ejemplo, un gen que codifica una enzima asociada con la resistencia a un fármaco usado para el tratamiento de un paciente con cáncer o similar, es transducido en un linfocito citotóxico, proporcionando con ello al linfocito una resistencia contra fármacos. Si se usa el linfocito citotóxico descrito anteriormente, se puede combinar la inmunoterapia y la terapia con fármacos y por lo tanto se pueden obtener efectos terapéuticos mayores. El gen con resistencia a fármacos está e emplificado, por ejemplo, por un gen con resistencia a múltiples fármacos. Por otra parte, a la inversa de la modalidad mencionada anteriormente, un gen, a fin de proporcionar una sensibilidad contra un fármaco en particular, es transducido en un linfocito citotóxico, proporcionando con ello la sensibilidad contra el fármaco. En este caso, el linfocito, después de ser transplantado a un cuerpo vivo, puede ser removido mediante la administración del fármaco. El gen para proporcionar sensibilidad contra un fármaco está ejemplificado, por ejemplo, por un gen de timidincinasa .

EJEMPLOS La presente invención se describirá de manera más concreta mediante los ejemplos, que de ninguna manera limitan el alcance de la presente invención.

Ejemplo de Preparación 1. Preparación de un Fragmento de Fibronectina . (1) Preparación de un fragmento de fibronectina El H-271, un fragmento derivado de fibronectina humana, fue preparado a partir de Escherichia coli HBlOl/pHDlOl ( FERM BP-2264) de acuerdo con el método descrito en la patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 5,198,423. Además, el H-296, CH-271 y CH-296, fragmentos derivados de fibronectina humana, fueron preparados, cada uno, a partir de un cultivo obtenido mediante el cultivo de Escherichia coli HB101/pHD102 (FER BP-7420), Escherichia coli HBlOl/pCHIOl (FERM BP-2799) o Escherichia coli HB101/pCH101/pCH102 (FERM BP-2800), de acuerdo con el método descrito en la gaceta mencionada anteriormente. El C-274, un fragmento derivado a partir de fibronectina humana, fue preparado a partir de un cultivo obtenido mediante el cultivo de Escherichia coli JM109/pTF7221 (FERM BP-1915) de acuerdo con el método descrito en la patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 5,102,988. El C-CS1, un fragmento derivado de fibronectina humana, fue preparado a partir de un cultivo obtenido cultivando Escherichia coli HB101/pCS25 (FERM BP-5723) de acuerdo con el método descrito en la Gaceta de Patente Japonesa No. 3104178. El CHV-89 Y CHV-179, fragmentos derivados de fibronectina humana, fueron preparados, cada uno, a partir de un cultivo obtenido cultivando Escherichia coli HB101/pCHV89 (FERM P-12182) o Escherichia coli HB101/pCHV179 (FERM P-12183), de acuerdo con el método descrito en la Gaceta de Patente Japonesa No. 2729712. Además, el CHV-90, un fragmento derivado de fibronectina humana, se preparó de acuerdo con el método descrito en la Gaceta de Patente Japonesa No. 2729712. Concretamente, un plásmido pCHV90 fue construido de acuerdo con los procedimientos descritos en la Gaceta, y posteriormente se cultivó un transformante que portaba el plásmido, y se preparó el CHV-90 a partir del cultivo. El CHV-181, un fragmento derivado de fibronectina humana, fue preparado construyendo el plásmido (pCHV181) que comprendía un ADN que codificaba el CHV-181 de acuerdo con el método descrito en la WO 97/18318, cultivando posteriormente la Escherichia coli HB10l/pCHV181 en la cual había sido introducido el plásmido, y preparando el fragmento a partir del cultivo, en la misma manera que para el CHV-179 anterior. (2) Preparación del CHV-92 Con referencia al pCHV181, un plásmido para expresar el polipéptido CHV-181 mencionado anteriormente, se construyó un plásmido CHV92 que tenía una supresión de una región que codificaba una región III -13 en la región que codificaba el CHV-181. Los procedimientos de supresión se llevaron a cabo de acuerdo con procedimientos para eliminar una región codificadora 111-14 de un plásmido pCHV179, los cuales se describen en la Patente Japonesa No. 2729712. Se cultivó Escherichia coli HB101 {Escherichia coli HB10l/pCHV92 ) , transformada con el plásmido pCHV92 mencionado anteriormente, y los procedimientos de purificación se llevaron a cabo de acuerdo con el método de purificación del polipéptido CHV-89 descrito en la Gaceta de .Patente Japonesa NO. 2729712, para obtener una preparación de CHV-92 purificada, a partir del cultivo resultante. (3) Preparación de ?-275-Cys Se construyó un plásmido para expresar un polipéptido ?-275-Cys de acuerdo con los siguientes procedimientos. Concretamente se preparó un plásmido pCH102 a partir de Escherichia coli HB101/pCHV102 (FERM BP-2800) . Se llevó a cabo la PCR usando un cebador 12S que tenia la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 20 del Listado de Secuencias y un cebador 14A que tenia la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 21 del Listado de Secuencias, con el plásmido anterior como una plantilla, para dar un fragmento de ADN de aproximadamente 0.8 kb, que codificaba un polipéptido de enlazamiento a heparina, de la fibronectina . El fragmento de ADN resultante se digirió con Ncol y BamHI (ambos fabricados por Takara Bio Inc.)/ y posteriormente fue ligado con pTV118N (fabricado por Takara Bio Inc.) digerido con Ncol y BamHI, para construir un plásmido pRHl . Un vector plásmido pINIII-ompAi [Ghrayeb J. et al., EMBO J.,M 3(10), 2437-2442 (1984)] fue digerido con BawRl y HincII (fabricados por Takara Bio Inc.) para recolectar un fragmento de ADN de aproximadamente 0.9 kb, que contenia una región terminadora de lipoproteina . Este fragmento fue mezclado y ligado con el plásmido pRHl mencionado anteriormente, que había sido digerido con BamHI y HincII, para dar un plásmido pRHl-T que contenía un promotor lac, un fragmento de ADN que codificaba un polipéptxdo de enlazamiento a heparina y un terminador de lipoproteina, en este orden. La reacción para PCR se llevó a cabo usando un cebador Cys-A que tenía la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 22 del Listado de Secuencias y un cebador Cys-S que tenía la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 23 del Listado de Secuencias, con el plásmido pRHl-T como una plantilla. Posteriormente el fragmento de ADN amplificado, recolectado, se digirió con Notl (fabricado por Takara Bio Inc.) y el fragmento de ADN fue autoligado adicionalmente . Un ADN cíclico así obtenido fue digerido con Spel y Seal (fabricados por Takara Bio Inc.) para dar un fragmento de ADN de 2.3 kb, y el fragmento resultante fue mezclado y ligado con un fragmento de ADN de 2.5 kb, obtenido digiriendo el plásmido pRHl-T con Spel y Seal (fabricados por Takara Bio Inc.) para dar un plásmido pRH-Cys. El plásmido codifica un polipéptxdo H-275-Cys en el que se adicionaron cuatro aminoácidos Met-Ala-Ala-Ser a un lado" de la terminal N del H-271 mencionado anteriormente, y se agregó Cys adicional a una C-terminal del H-271. El polipéptido ?-275-Cys fue preparado mediante el siguiente método. Escherichia coli HB101 transformada con el plásmido pRH-Cys mencionado anteriormente {Escherichia coli HB101/pRH-Cys) fue cultivada durante toda la noche a 37 °C en 120 mi de un medio LB. Las células recolectadas del medio de cultivo fueron suspendidas en 40 mi de una solución reguladora para ruptura (50 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA, 150 mM de NaCl, 1 mM de DTT, 1 mM de PMSF, pH 7.5), y la suspensión fue sometida a tratamiento ultrasónico para romper las células. El sobrenadante obtenido por centrifugación se sometió a una columna de HITrap-heparina (fabricada por Pharrciacia) que había sido equilibrada con una solución reguladora purificadora (50 mM de Tris-HCl, pH 7.5) . La fracción no absorbida en la columna se lavó con la misma solución reguladora, y posteriormente se llevó a cabo la elución con una solución reguladora purificadora que tenía un gradiente de concentración de 0 a 1 M de NaCl . El eluato fue analizado mediante SDS-electroforesis en gel de poliacrimida, y las fracciones correspondientes a un peso molecular de ?-275-Cys fueron recolectadas para dar una preparación de ?-275-Cys purificada.

Ejemplo 1. Proporción de Células CD8 -Positivas en CTLs (1) Aislamiento y Almacenamiento de PBMCs Se recolectaron componentes de la sangre de un donador individual, normal, humano, que tenía HLA-A2.1, obtenida con consentimiento informado. El componente de la sangre recolectada se diluyó 2 veces con PBS(-), se colocó encima de Ficoll-paque (fabricado por Pharmacia) , y se centrifugó a 500 x g durante 20 minutos. Las células mononucleares de la sangre periférica (PBMCs) en la capa intermedia fueron recolectadas con una pipeta y lavadas. Las PBMCs recolectadas se suspendieron en una solución de almacenamiento de 90% de FBS (fabricada por Bio Whittaker) /10% de DMSO (fabricado por SIGMA), y almacenados en nitrógeno líquido. Durante la inducción de CTL, estas PBMCs almacenadas fueron fundidas rápidamente en un baño de agua a 37 °C, y se lavaron con medio RPMI 1640 (fabricado por Bio Whittaker) que contenía 10 µg/ml de Dnase (fabricado por Calbiochem) . Posteriormente se calculó el número de células vivas mediante el método de tinción con azul de tripano, y las células fueron sometidas a cada experimento . (2) Inducción de CTLs de memoria contra el virus de la influenza La inducción de CTLs de memoria contra el virus de la influenza, se llevó a cabo modificando parcialmente el método de Bednarek et al., [J. Immunology, 147(12), 4047-4053 (1991)]. Concretamente, las PBMC preparadas en el inciso (1) del ejemplo 2, fueron suspendidas en medio RPMI 1640 (fabricado por Bio hittaker) que contenia 5% de suero del tipo AB humano, 0.1 mM de aminoácidos no esenciales, 1 mM de piruvato de sodio, 2 mM de L-glutamina (todos los anteriores fabricados por Bio Whittaker), 10 mM de HEPES (fabricado por nakalai tesque) , 1% de estreptomicina-penicilina (fabricada por Gibco BRL) (a la que de aquí en adelante se hace referencia simplemente como "5HRPMI") a fin de que tuviera una concentración de 1 a 4 x 106 células/ml. Posteriormente la suspensión se colocó sobre una placa para cultivo de células de 24 pozos (fabricada por Falcon) en un volumen de 1 ml/pozo, y las células fueron incubadas en una incubadora de tipo húmedo con 5% de C02 a 37 °C por 1.5 horas, para separar los monocitos que se adherían al plástico. Posteriormente las células no adherentes fueron recolectadas usando medio RPMI 1640, y se almacenaron sobre hielo como células respondedoras. A los monocitos separados se adicionaron 0.5 mi, tanto de 5HRPMI que contenía como un péptido antigénico 5 ug/ml de péptido epítopo derivado de la proteína del virus de influenza (péptido de enlazamiento al A2.1 derivado de la proteína de matriz de la SEQ ID NO: 24 del Listado de Secuencias) como 1 pg/ml de microglobulina ß2 (fabricada por Scrips) . La mezcla fue incubada a temperatura ambiente por 2 horas, y posteriormente las células fueron sometidas a irradiación con rayos X (5500R) para proporcionar células presentadoras de antigeno. La solución del péptido se removió por succión de cada uno de los pozos, y los pozos fueron lavados con medio RPMI 1640. Posteriormente, las células respondedoras previamente almacenadas en hielo fueron aspiradas en 5HRPMI a fin de tener una concentración de 0.5 a 2 x 106 células/ml, y la suspensión se adicionó a células presentadoras de antigeno, en una cantidad de 1 mi por pozo. En este momento se adicionó, a cada uno, un fragmento de fibronectina (al que se hace referencia de aquí en adelante como "FNfr") descrito en el ejemplo de preparación 1, a fin de tener una concentración final de 10 ug/ml. Un grupo sin adición de FNfr fue fijado como el control. La placa se cultivó a 37 °C en la presencia de 5% de C02. El segundo día desde el inicio del cultivo, 1 mi de 5HRPMI que contenia 60 U/ml de IL-2 (fabricado por Shionogi & Co . , Ltd.) y 10 ug/ml de FNfr fueron adicionados a cada pozo (el control contenia únicamente IL-2) . También, el quinto día, se removió la mitad del sobrenadante del cultivo, y al mismo se adicionaron 1 mi del medio que contenía tanto IL-2 como FNfr (el control contenía únicamente IL-2) , los mismos mencionados anteriormente. El séptimo día, las células presentadoras de antígeno fueron preparadas en la misma manera que como se mencionó anteriormente, y posteriormente, las células respondedoras que habían sido cultivadas por una semana, fueron suspendidas en 5HRPMI a fin de tener una concentración de 0.5 a 2 x 106 células/ml. La suspensión se adicionó a las células presentadoras de antígeno preparadas en una cantidad de 1 ml/pozo, para reestimular la célula. En este momento se adicionó FNfr a fin de tener una concentración final de 10 yg/ml (el control no tenía adición) . El segundo día de la reestimulación, se adicionó a cada pozo 1 mi de 5HRPMI que contenía 60 U/ml de IL-2 y 10 µg ml de FNfr (el control contenía únicamente IL-2). También, el quinto día, se removió la mitad del sobrenadante del cultivo, y 1 mi del medio que tenía el mismo contenido que el de antes de la remoción, fue adicionado al mismo. El cultivo se continuó por dos días adicionales, induciendo con ello CTLs. (3) Determinación de la Actividad Citotóxica de CTLs La actividad citotóxica de CTLs preparados en el inciso (2) del ejemplo 1, el día catorce después del inicio de la inducción, fue evaluada mediante un método de determinación para la actividad citotóxica, usando Calcein-AM [R. Lichtenfels et al., J. Immunological Methods, 172(2), 227-239 (1994)]. Células B transformadas con EBV que tenía el HLA-A2.1 (nombre de la células: 221A2.1), que fueron cultivadas durante toda la noche junto con un péptido epítopo o en la ausencia del péptido epítopo, fueron suspendidas en medio RP I 1640 que contenía 5% de FBS (fabricado por Bio Whittaker) a fin de obtener una concentración de 1 x 106 células/ml. Posteriormente se adicionó Calcein-A (fabricado por Dotite) a la suspensión, a fin de tener una concentración final de 25 µ?, y las células fueron cultivadas a 37 °C por 1 hora. Las células fueron lavadas con un medio que no contenía Calcein-AM, y posteriormente fueron mezcladas con células K562 (ATCC CCL-243) en una cantidad de 20 veces la de las células, para dar células objetivo marcadas con Calcein. Las células K562 fueron usadas para excluir la actividad citotóxica, no específica, por células NK mezcladas en la células respondedoras. La CTLs de memoria preparadas en el inciso (2) del ejemplo 1 fueron diluidas en forma escalonada, con 5HRPMI a fin de tener una concentración de 1 x 105 a 9 x 106 células/ml como células efectoras. Posteriormente cada una de las diluciones fue vertida en cada pozo de una placa de cultivos de 96 pozos, en una cantidad de 100 µ?/cada pozo. A las mismas se adicionaron células objetivo marcadas con Calcein, preparadas para que tuvieran una concentración de 1 x 105 células/ml en una cantidad de 100 µ?/cada pozo. La placa que contenía la suspensión de células anterior fue centrifugada a 400 x g por 1 minuto, y posteriormente se incubó en una incubadora de tipo húmedo con C02 a 37 °C por 4 horas. Después de 4 horas se recolectaron, de cada pozo, 100 µ? del sobrenadante del cultivo, y la cantidad de Calcein liberada (intensidad de la fluorescencia) en el sobrenadante del cultivo, fue determinada mediante el uso de un lector de placas de fluorescencia (485 nm/538 nm) . La actividad de la citotoxicidad de los CTL fue calculada mediante la siguiente ecuación 1: Ecuación 1: Actividad Citotóxica (%) = [ (Valor Encontrado en cada Pozo - Mínima Cantidad Liberada) / (Máxima Cantidad Liberada - Mínima Cantidad Liberada) ] x 100 En la ecuación anterior, la mínima cantidad liberada es la cantidad de calcein liberada en el pozo que contenía únicamente células objetivo y células K562, que muestra la cantidad de calcein liberada en forma natural por las células objetivo. Además, la máxima cantidad liberada se refiere a la cantidad de calcein liberada cuando las células se encontraban completamente rotas por la adición de 0.1% del agente tensioactivo Tritón X-100 (fabricado por nakalai tesque) a las células objetivo. Como un resultado, la actividad citotóxica fue inducida inmediatamente después de la inducción, pero difícilmente hubo diferencias en la actividad citotóxica debido a la presencia o ausencia de la adición de FNfr durante la inducción . (4) Determinación de la Proporción de Contenido de Células CD8 -positivas en una población de Células de CTLs Los CTL que fueron preparados en el inciso (2) del ejemplo 1, en una cantidad de 2 x 105 células, fueron fijados con PBS (fabricado por Nissui) que contenía 1% de paraformaldehído (fabricado por nakalai tesque) , y luego fueron lavados con PBS. Las células fijadas fueron suspendidas en 100 µ? de PBS que contenía 1% de BSA (fabricado por SIGMA) , y IgGl de ratón marcado con FITC o anticuerpo CD8 antihumano de ratón, marcado con FITC (ambos fabricados por DAKO) fueron adicionados al mismo y posteriormente la mezcla fue incubada sobre hielo por 30 minutos. Después de la incubación las células fueron lavadas con PBS, y se suspendieron nuevamente en PBS que contenía 1% de paraformaldehído . Las células fueron sometidas a citometrí de flujo usando FACS Vantage (fabricado por Becton Dickinson) , y se determinó la proporción de contenido de las células CD8 -positivas . Los resultados se presentan en la tabla.

Tabla 1 Como se muestra en la Tabla 1, en el grupo con adición de varios fragmentos de fibronectina durante la inducción de CTL, la proporción de células CD8-positivas en el día catorce después del inicio de la inducción de CTL es alta en comparación con la del control sin adición de estos fragmentos de fibronectina . En otras palabras, se aclaró el hecho de que los CTL podrían ser inducidos con una proliferación significativa de las células CD8-positivas, debido a la presencia conjunta del fragmento de fibronectina .

Ejemplo 2. Inducción de la Expresión del Receptor Interleucina-2 (1) Inducción de CTLs de memoria contra el virus de la influenza La inducción de CTLs de memoria contra el virus de la influenza, se llevó a cabo en la misma manera que en el inciso (2) del ejemplo 1, usando las PBMC que fueron aisladas y almacenadas en la misma manera que en el inciso (1) del ejemplo 1. La actividad citotóxica de CTLs el día 14 después del inicio de la inducción, fue evaluada en la misma manera que en el inciso (3) del ejemplo 1. Como un resultado difícilmente hubo diferencias en la actividad citotóxica debido a la presencia o ausencia de la adición de FNfr durante la inducción. (2) Determinación de la Proporción de Expresión del Receptor Interleucina-2 en CTLs La proporción de la expresión del receptor interleucina-2 (IL-2R) en los CTL que fueron preparados en el inciso (1) del ejemplo 2, el día 14 desde el inicio de la inducción, fue determinada de acuerdo con el método descrito en el inciso (4) del ejemplo 1. Aquí, en este procedimiento, el anticuerpo CD8 anti-humano de ratón, etiquetado con FITC, fue cambiado por un anticuerpo IL-2R(CD25) anti-humano de ratón, marcado con FITC (fabricado por DAKO) . Los resultados se presentan en la tabla 2.

Tabla 2 Fragmento de Fibronectina Proporción de Contenido de Células Positivas a la expresión del IL-2R (%) Control (Sin adición de FNfr) 29.8 CH-296 65.9 H-296 59.4 H-271 54.6 C-274 61.5 ?-275-Cys 78.2 CHV-89 82.3 CHV-90 48.3 CHV-92 55.6 CHV-179 50.3 CHV-181 44.8 Control (Sin adición de FNfr) 46.9 CH-271 60.9 C-CS1 72.3 Como se muestra en la tabla 2, en todos los CTL inducidos con la adición de varios fragmentos de fibronectina, se observó un incremento en la proporción de la expresión del IL-2R en la población de células. En otras palabras, se aclaró el hecho de que los CTL podrían ser inducidos incrementando el nivel de expresión del IL-2R, llevando a cabo la inducción en la presencia conjunta del fragmento de fibronectina .

Ejemplo 3. Expansión de CTLs (1) Inducción de CTLs de memoria contra el virus de la influenza La inducción de CTLs de memoria contra el virus de la influenza se llevó a cabo en la misma manera que en inciso (2) del ejemplo 1, usando las PBMC que fueron aisladas y almacenadas de la misma manera que en el inciso (1) del ejemplo 1. La actividad citotóxica de los CTLs el día 15 después del inicio de la inducción, fue evaluada en la misma manera que en el inciso (3) del ejemplo 1. Como un resultado difícilmente hubo diferencias en la actividad citotóxica debido a la presencia o ausencia de la adición de FNfr durante la inducción. (2) Expansión de CTLs Los CTL preparados en el inciso (1) del ejemplo 3 fueron lavados con 5HRPMI, y luego se incorporaron en la forma de una suspensión que tenia una concentración de 3 x 104 células/ml . Por otra parte, PBMCs alogénicas que no tenían HLA-A2.1, y que habían sido recolectadas en la misma manera que en el inciso (1) del ejemplo 1, fueron sometidas a irradiación con rayos X (3300R), y las células fueron lavadas con el medio y luego se incorporaron en la forma de una suspensión que tenía una concentración de 2 a 5 x 106 células/ml. Estos CTLs (3 x 104 células) y PBMCs alogénicas (de 4 a 10 x 106 células) fueron suspendidos en 10 mi de 5HRPMI, o medio RPMI 1640 (fabricado por Bio Whittaker) que contenía 10% de Hyclone FBS, 0.1 mM de aminoácidos no esenciales, 1 mM de piruvato de sodio, 2 mM de L-glutamina (todos fabricados por Bio Whittaker) , 10 mM de HEPES (fabricado por nakalai tesque) y 1% de estreptomicina-penicilina (fabricada por Gibco BRL) (a la que se hace referencia simplemente, posteriormente en la presente, como 10 HycloneRPMI ) , y posteriormente fue adicionado anticuerpo anti-CD3 (fabricado por Janssen-Kyowa) al mismo, a fin de dar una concentración final de 50 ng/ml. La mezcla se colocó en un matraz de 12.5 cm2 (fabricado por Falcon) , y las células fueron cultivadas en una incubadora de tipo húmedo con C02, a 37 °C por 14 días. Durante el cultivo se adicionó FNfr a fin de tener una concentración final de 10 ug/ml que fue el mismo que se adicionó durante la inducción de CTL. Tampoco se adicionó FNfr a un grupo de control en el cual la inducción se había llevado a cabo sin adición de FNfr. Durante este cultivo no se adicionó del todo estimulación mediante un péptido. El primer día después del inicio de la expansión, se adicionó IL-2 a fin de tener una concentración final de 120 U/ml. Además, el cuarto día y los siguientes, después del inicio del cultivo, se llevaron a cabo, cada 2 a 3 días, procedimientos para remover la mitad del sobrenadante del cultivo, y posteriormente la adición de 5 mi de 5HRPMI que contenía 60 U/ml de 11-2 o lOHycloneRPMI a cada matraz. Durante el cultivo, FNfr en la misma concentración fue adicionado al medio para el grupo con adición de FNfr. El día catorce después del inicio de la expansión, se determinó la actividad citotóxica de los CTL en la misma manera que en el inciso (3) del ejemplo 1. El grado en el que se mantuvo la actividad citotóxica antes de la expansión, fue calculado como "mantenimiento de la actividad citotóxica (%)". El "mantenimiento de la actividad citotóxica (%)" fue calculado de acuerdo con la siguiente ecuación 2: Ecuación 2: Mantenimiento de la Actividad Citotóxica (%) = [Actividad Citotóxica (%) Después de Expansión/ Actividad Citotóxica (%) Antes de la Expansión] x 100 Los resultados de la determinación se presentan en la tabla 3. En la tabla, una proporción E/T significa una proporción del número de células efectoras (E) con respecto al número de las células objetivo (T) .

Tabla 3 Medio Fragmento de Fibronectina Mantenimiento de Actividad Citotóxica · (%) Proporción E/T = 3 5HRPMI Control (Sin Adición de 17.3 FNfr) CH-271 53.5 H-296 49.3 C-CS1 49.3 CHV-92 66.2 lOHycloneRPMI Control (Sin Adición de 48.1 FNfr) CH-271 250.8 H-296 162.3 H-271 72.2 C-CS1 100.2 CHV-92 157.8 Medio Fragmento de Fibronectina Mantenimiento de Actividad Citotóxica (%) Proporción E/T = 10 lOHycloneRPMI Control (Sin Adición de 46.3 FNfr) CHV-89 69.0 CHV-90 75.6 Medio Fragmento de Fibronectina Mantenimiento de Actividad Citotóxica (%) Proporción E/T = 3 lOHycloneRPMI Control (Sin Adición de 70.4 FNfr) CH-296 113.5 lOHycloneRPMI Control (Sin Adición de 79.3 FNfr) CHV-179 190.0 CHV-181 94.5 Como se muestra en la tabla 3, los CTLs del grupo con adición de varios fragmentos de fibronectina, durante la inducción y la expansión, mantuvieron uria alta actividad citotóxica, específica, inclusive después de la expansión por 14 días en comparación con la del control sin adición del fragmento de fibronectina . En otras palabras se aclaró el hecho de que los CTLs podrían ser expandidos en un estado en el que una alta actividad citotóxica fuese mantenida por un largo período, llevando a cabo la inducción y la expansión en la presencia conjunta del fragmento de fibronectina .

Ejemplo 4 Expresión del IL-2R en una Población de Células Después de la Expansión de los CTLs (1) Inducción de CTLs de memoria contra el virus de la influenza La inducción de CTLs de memoria contra el virus de la influenza, se llevó, a cabo en la misma manera que en el inciso (2) del ejemplo 1, usando las PBMC que fueron aisladas y almacenadas en la misma manera que en el inciso (1) del ejemplo 1. La actividad citotóxica de los CTLs, el día catorce después del inicio de la inducción, fue evaluada en la misma manera que en el inciso (3) del ejemplo 1. Como un resultado, difícilmente hubo diferencias en la actividad citotóxica debido a la presencia o ausencia de la adición de FNfr durante la inducción. (2) Determinación de la Proporción de la Expresión del Receptor Interleucina-2 en CTLs Expandidos Los CTLs preparados en el inciso (1) del ejemplo 4 fueron expandidos de la misma manera que en el inciso (2) del ejemplo 3. La proporción de células positivas a la expresión del IL-2R fue determinada para los CTLs después de la expansión así obtenida, en la misma manera que en el inciso (2) del ejemplo 2. Los resultados se presentan en la tabla 4. Tabla 4 Fragmento de Fibronectina Proporción del contenido de Células Positivas a la expresión del IL-2R (%) Control (Sin adición de FNfr) 19 .5 CH-271 45 .3 H-296 47 .7 H-271 48 .3 C-274 53 .5 C-CS 39 .7 CHV-891 28 .6 CHV-90 60 .0 CHV-179 53 .7 CHV-181 50 .3 Control (Sin adición de FNfr) 26 .8 CH-296 36 .1 Control (Sin adición de FNfr) 18 .4 ?-275-Cys 56 .5 CHV-92 59 .9 Como se muestra e.n la tabla 4, en todos los grupos con adición de varios fragmentos de fibronectina durante la inducción y la expansión de los CTL, se observó un incremento en la proporción de células que expresan el IL-2R en la población de células. En otras palabras, quedó claro que los CTL podrían ser expandidos incrementando el nivel de expresión del IL-2R, llevando a cabo la inducción y expansión de los CTL en la presencia del fragmento de fibronectina.

Ejemplo 5 Inducción y Expansión de CTLs en la Presencia de Fibronectina (1) Inducción de CTLs de memoria contra el virus de la influenza La inducción, de CTLs de memoria contra el virus de la influenza se llevó a cabo de acuerdo con el método descrito en el inciso (2) del ejemplo 1, usando las PB C aisladas y almacenadas de acuerdo con el método descrito en el inciso (1) del ejemplo 1. Durante la inducción, se adicionó fibronectina (fabricada por Calbiochem) en lugar de Fnfr, a fin de tener una concentración final de 10 ug/ml (en donde un control no presentaba adición) . La actividad citotóxica de los CTL, el día catorce después del inicio de la inducción, fue determinada en la misma manera que en el inciso (3) del ejemplo 1. Como un resultado difícilmente hubo diferencias en la actividad citotóxica debido a la presencia o ausencia de la adición de fibronectina durante la inducción. (2) Determinación de la Proporción de Expresión del Receptor Interleucina-2 en CTLs La proporción de células positivas a la expresión del IL-2R fue determinada para los CTL preparados en el inciso (1) del ejemplo 5, en la misma manera que en el inciso (2) del ejemplo 2. Los resultados se presentan en la tabla 5.

Tabla 5 Fibronectina Proporción del Contenido de Células Positivas a la Expresión del IL-2R (%) Control (Sin Adición de 34.0 fibronectina) Fibronectina 64.6 Como se muestra en la tabla 5, en CTLs inducidos en la presencia de fibronectina, se observó un incremento en el nivel de expresión del IL-2R en la población de células. En otras palabras, quedó claro que los CTL podrían ser inducidos incrementado el nivel de expresión del IL-2R llevando a cabo la inducción de CTLs en la presencia de la fibronectina . (3) Expansión de CTLs CTLs preparados en el inciso (1) del ejemplo 5, fueron expandidos en la misma manera que en el inciso (2) del ejemplo 3. Durante la expansión, al grupo con adición de fibronectina durante la inducción, se adicionó fibronectina (fabricada por Calbiochem) , a fin de tener una concentración final del 10 yg/ml (un control no presentaba adición) . La actividad citotóxica de los CTL obtenidos fue determinada en la misma manera que para el inciso (3) del ejemplo 1, y el grado en el cual se mantuvo la actividad citotóxica antes de la expansión fue calculado como "mantenimiento de actividad citotóxica (%)". Los resultados de la determinación se presentan en la tabla 6.

Tabla 6 Fibronectina Mantenimiento de Actividad Citotóxica Proporción E/T = 3 Control (Sin Adición de 48.1 fibronectina) Fibronectina 148.9 Como se muestra en la tabla 6, el grupo en el cual se llevó a cabo la inducción y expansión de los CTL en la presencia de fibronectina, mantuvo una alta actividad citotóxica. Por otra parte, la actividad citotóxica del control sin adición de fibronectina durante la inducción y la expansión de los CTL fue claramente reducida. En otras palabras, quedó claro que los CTL podrían ser expandidos en un estado en el que una actividad citotóxica específica fuese mantenida por un largo período mediante la adición de fibronectina durante la inducción y la expansión de los CTL.

Ejemplo 6. Expansión de CTLs en la Presencia de un Fragmento de Fibronectina (FN) Inmovilizado (1) Inmovilización del Fragmento de FN Un fragmento de fibronectina fue inmovilizado en un equipo (recipiente) para cultivos, usado en el siguiente experimento. Concretamente, se adicionó PBS que contenía varios fragmentos de fibronectina (concentración final: 10 yg/ml) en una cantidad de 1 a 2 mi, tanto a una placa de cultivo de células de 24 pozos como a un matraz de 12.5 cm2. La placa y el matraz fueron sometidos a incubación a temperatura ambiente por 5 horas, y luego se almacenaron a 4 °C hasta usarse. Además, la placa y el matraz fueron lavados dos veces con PBS antes de usarse. (2) Inducción de CTLs de Memoria contra el Virus de la Influenza La inducción de CTLs de memoria contra el virus de la influenza se llevó a cabo de acuerdo con el método descrito en el inciso (2) del ejemplo 1, usando las PBMC aisladas y almacenadas de acuerdo con el método descrito en el inciso (1) del ejemplo 1. Durante la inducción se usó una placa inmovilizada con FNfr como un equipo para cultivo (para un control se usó una placa sin tratamiento de inmovilización) . La actividad citotóxica de los CTL después de la inducción fue evaluada en la misma manera que en el inciso (3) del ejemplo 1. Como un resultado difícilmente hubo diferencias en la actividad citotóxica debido a la presencia o ausencia de inmovilización de la FNfr a la placa usada durante la inducción . (3) Expansión de CTLs Los CTL preparados en el inciso (2) del ejemplo 6 fueron expandidos de la misma manera que en el inciso (2) del ejemplo 3. Durante la expansión, matraces con varios FNfr inmovilizados a los mismos, fueron usados como equipos para cultivo (para un control se usó un matraz sin tratamiento de inmovilización) . Además se usó como un medio el lOHycloneRPMI.

El grado en el que se mantuvo la actividad citotóxica de los CTL asi expandidos, en comparación con el grado antes de la expansión, fue evaluado como "mantenimiento de la actividad citotóxica (%)". Los resultados de la determinación se presentan en la tabla 7.

Tabla 7 Fragmento de Fibronectina Mantenimiento de Actividad Citotóxica (%) Proporción E/T = 3 Control (Sin inmovilización de 48.1 FNfr) CH-271 95.4 H-296 95.0 H-271 133.9 C-CS1 73.8 ?-275-Cys 137.7 CHV-92 92.7 Control (Sin inmovilización de 18.7 FNfr) CH296 67.4 C-CS1 78.5 CHV-89 90.8 CHV-90 73.0 CHV-179 112.5 CHV-181 25.6 Como se muestra en la tabla 7, en el grupo en el que se usó el equipo de cultivo (placa, matraz) inmovilizado con el fragmento de fibronectina, durante la inducción y expansión de CTLs, los CTL mantuvieron una alta actividad citotóxica especifica, inclusive después de la expansión. Por otra parte, en el control en el que se usó el equipo sin inmovilización con el fragmento de fibronectina, durante la inducción y expansión de los CTL, la actividad citotóxica se dio claramente reducida. En otras palabras, se aclaró el hecho de que los CTL podrían ser expandidos en un estado en el que mantuviera una alta actividad citotóxica por un largo período, en comparación con la del fragmento disuelto en el medio, usando el fragmento de fibronectina inmovilizado.

Ejemplo 7. Proporción de Contenido de Células CD8-Positivas en una Población de Células Después de la Expansión de los CTL (1) Inducción de CTLs de Memoria Contra el Virus de la Influenza La inducción de CTLs de memoria contra el virus de la influenza, se llevó a cabo de la misma manera que en el inciso (2) del ejemplo 1, usando las PBMC que fueron aisladas y almacenadas en la misma manera que en el inciso (1) del ejemplo 1. La actividad citotóxica de los CTL el día catorce después del inicio de la inducción, fue evaluada en la misma manera que en el inciso (3) del ejemplo 1. Como resultado difícilmente hubo diferencias en la actividad citotóxica debido a la presencia o ausencia de la adición de FNfr durante la inducción. (2) Determinación de la Proporción de Contenido de Células CD8-Positivas en CTLs Expandidos Los CTL preparados en el inciso (1) del ejemplo 7 fueron expandidos en la misma manera que en el inciso (2) del ejemplo 3. La proporción de contenido de células CD8-positivas fue determinada para los CTL después de la expansión así obtenida, en la misma manera que en el inciso (4) del ejemplo 1. Los resultados se presentan en la tabla 8.

Tabla 8 Fragmento de Fibronectina Proporción de Contenido de Células CD8- Positivas Control (Sin Adición de FNfr) 40.9 CH-296 85.1 CH-271 72.1 H-271 83.9 Control (Sin Adición de FNfr) 75.4 H-296 87.2 C-CS1 86.5 Control (Sin Adición de FNfr) 33.4 CHV-90 72.9 CHV-92 51.6 CHV-179 57 CHV-181 63.5 Como se muestra en la tabla 8, en todos los grupos con adición de varios fragmentos de fibronectina durante la inducción y la expansión de CTLs, se observó un incremento en la proporción de contenido de células CD8-positivas en la población de células después de la expansión . En otras palabras, se aclaró que los CTL podrían ser expandidos con células CD8-positivas significativamente proliferantes, llevando a cabo la inducción y expansión de CTLs en la presencia del fragmento de fibronectina.

Ejemplo 8. Inducción de la Expresión del Receptor Interleucina-2 en CTLs Inducidos en la Presencia de Fragmento de Fibronectina Inmovilizado (1) Inmovilización del Fragmento de FN Un fragmento de fibronectina fue inmovilizado en un equipo para cultivo (recipiente) en la misma manera que en el inciso (1) del ejemplo 6. (2) Inducción de CTLs de Memoria Contra el Virus de la Influenza La inducción de CTLs de memoria contra el virus de la influenza se llevó a cabo de acuerdo con el método descrito en el inciso (2) del ejemplo 1, usando las PBMC aisladas y almacenadas de acuerdo con el método descrito en el inciso (1) del ejemplo 1. Durante la inducción, una placa inmovilizada con FNfr preparado en el inciso (1) del ejemplo 8, se usó como un equipo para cultivo (para un control se usó una placa sin tratamiento de inmovilización) . La actividad citotóxica de los CTL después de la inducción fue evaluada de la misma manera que en el inciso (3) del ejemplo 1. Como un resultado, difícilmente hubo diferencias en la actividad citotóxica debido a la presencia o ausencia de inmovilización de FNfr a la placa usada durante la inducción. (3) Expansión de CTLs Los CTL preparados en el inciso (2) del ejemplo 8 fueron expandidos en la misma manera que en el inciso (2) del ejemplo 3. Durante la expansión, un matraz con FNfr inmovilizado al mismo, preparado en el inciso (1) del ejemplo 8, se usó como un equipo para cultivo (para un control se usó un matraz sin tratamiento de inmovilización) . Además, como un medio se usó el lOHycloneRPMI . La proporción de células positivas a la expresión del IL-2R fue determinada de la misma manera que en el inciso (2) del ejemplo 2 para los CTL, antes y después de la expansión así obtenida.

Los resultados de la determinación se presentan en la tabla 9.

Tabla 9 Fragmento de Proporción de Proporción de Fibronectina Contenido de Contenido de Células Positivas a Células Positivas a Expresión del IL-2R Expresión del IL-2R Antes de la Después de la Expansión Expansión (%) (%) Control (Sin 14 .4 6. 8 Inmovilización de FNfr) CH-296 68 .1 34. .0 CH-271 28 .3 14. .7 H-296 21 .3 22. .9 C-274 30 .3 20. .5 C-CS1 56 .8 34 , .1 ?-275-Cys 43 .6 17 , .2 CHV-89 34 .6 36. .8 CHV-90 47 .3 29. .1 CHV-92 37 .2 13. .0 CHV-179 52 .3 16. ,3 CHV-181 37 .4 18. ,3 Como se muestra en la tabla 9 para los CTL, en el grupo en el que el equipo de cultivo (placa, matraz) inmovilizado con el fragmento de fibronectina, se usó durante la inducción y expansión de los CTL, se observó un 1 1 incremento en la proporción de la expresión del IL-2R, en comparación con la del grupo de control, tanto antes como después de la expansión. En otras palabras se aclaró que los CTL podrían ser expandidos manteniendo un alto nivel de expresión del IL-2R, en comparación con el del fragmento disuelto en el medio, usando el fragmento de fibronectina inmovilizado .

Ejemplo 9. Inducción de la Expresión del Receptor de Interleucina-2 en la superficie de Células CD8 (1) Inducción de CTLs de Memoria contra el Virus de la Influenza La inducción de CTLs de memoria contra el virus de la influenza se llevó a cabo en la misma manera que en el inciso (2) del ejemplo 1, usando las PBMC que fueron aisladas y almacenadas en la misma manera que en el inciso (1) del ejemplo 1. La actividad citotóxica de los CTL, el día catorce después del inicio de la inducción, fue evaluada de la misma manera que en el inciso (3) del ejemplo 1. Como un resultado, difícilmente hubo diferencias en la actividad citotóxica debido a la presencia o ausencia de la adición de la FNfr de la inducción. (2) Determinación de la Proporción de Expresión del Receptor Interleucina-2 en CTLs La proporción de la expresión del receptor interleucina -2 (IL-2R) en los CTL (especialmente en la superficie de la célula CD8-positiva) preparados en el inciso (1) del ejemplo 9, el día catorce a partir del inicio de la inducción, fue determinado de acuerdo con el método descrito en el inciso (4) del ejemplo 1. Aquí, en este procedimiento se usó un anticuerpo CD8 anti-humano de ratón, marcado con FITC, como un anticuerpo primario, y se usó un anticuerpo IL-2R (CD25) anti-humano, de ratón, marcado con PE (fabricado por DAKO) como un anticuerpo secundario. Los resultados se presentan en la tabla 10.

Tabla 10 Fragmento de Fibronectina Proporción de Contenido de Población de Células CD8/IL- 2R-Doble Positivas (%) Control (Sin Adición de FNfr) ~ 30.7 CH-296 56.8 Como se muestra en la tabla 10, en los CTL inducidos con adición de varios fragmentos de fibronectina, se observó un incremento en la proporción de la expresión de IL-2R en la población de células CD8-positivas . En otras palabras, se aclaró que los CTL podrían ser inducidos al incrementar el nivel de expresión del IL-2R en la superficie de células CD8, llevando a cabo la inducción en la presencia conjunta del fragmento de fibronectina.

Ejemplo 10. Proporciones de Contenidos de Células CD8-Positivas en la Población de Células, Antes y Después de la Expansión de CTLs (Comparación de Fibronectina con Fragmento de Fibronectina) (1) Inducción de CTLs de Memoria contra el Virus de la Influenza La inducción de CTLs de memoria contra el virus de la influenza se llevó a cabo de la misma manera que en el inciso (2) del ejemplo 1, usando las PBMC que fueron aisladas y almacenadas en la misma manera que en el inciso (1) del ejemplo 1. La actividad citotóxica de los CTL, el día catorce después del inicio de inducción, fue evaluada de la misma manera que en el inciso (3) del ejemplo 1. Como un resultado, difícilmente hubo diferencias en la actividad citotóxica, debido a la presencia o ausencia de la adición de fibronectina y FNfr durante la inducció . (2) Determinación de la Proporción de Contenido de Células CD8-Positivas en CTL Expandidos Los CTL preparados en el inciso (1) del ejemplo 10 fueron expandidos en la misma manera que en el inciso (2) del ejemplo 3. La proporción de contenido de células CD8-positivas , fue determinada para los CTL antes y después de la expansión así obtenida, en la misma manera que en el inciso (4) del ejemplo 1. Los resultados se presentan en la tabla 11.

Tabla 11 Como se muestra en la tabla 11, en todos los grupos con adición de varios fragmentos de fibronectina, durante la inducción y expansión de CTLs, se observó un incremento en la proporción de contenidos de células CD8- positivas en la población de células, antes de la expansión y después de la expansión, en comparación con la del grupo de control. En otras palabras, se aclaró que los CTL podrían ser expandidos favorablemente con células CD8-positivas, significativamente proliferativas , tanto antes de la expansión como después de la expansión, llevando a cabo a la inducción y expansión de CTLs en la presencia del fragmento de fibronectina, en comparación con la fibronectina per se.

Ejemplo 11. Inducción de la Expresión del IL-2R en la Población de Células, Antes y Después de 'la Expansión de CTLs (Comparación de la Fibronectina con el Fragmento de Fibronectina (1) Inducción de CTLs de Memoria contra el Virus de la Influenza La inducción de CTLs de memoria contra el virus de la influenza, se llevó a cabo de la misma manera que en el inciso (2) del ejemplo 1, usando las PBMC que fueron aisladas y almacenadas de la misma manera que en el inciso (1) del ejemplo 1. La actividad citotóxica de los CTLs, el día catorce después del inicio de inducción, fue evaluada en la misma manera que en el inciso (3) del ejemplo 1. Como un resultado, difícilmente hubo diferencias en la actividad citotóxica, debido a la presencia o ausencia de la adición de fibronectina y FNfr durante la inducción. (2) Determinación de la Proporción de Contenido de Células Positivas a la Expresión del IL-2R en CTLs Expandidos Los CTL preparados en el inciso (1) del ejemplo 11 fueron expandidos de la misma manera que en el inciso (2) del ejemplo 3. La proporción de contenido de células positivas a la expresión del IL-2R, fue determinada para los CTL antes y después de la expansión obtenida de la misma manera que en el inciso (2) del ejemplo 2. Los resultados se presentan en la tabla 12.

Tabla 12 Como se muestra en la tabla 12, en todos los grupos con adición de fragmento de fibronectina durante la inducción y expansión de CTLs, se observó un incremento en la proporción de contenido de células positivas a la expresión del IL-2R en la población de células, antes de la expansión y después de la expansión, en comparación con la del grupo de control. Esta proporción creciente fue significativamente alta en comparación con la del grupo con adición de fibronectina . En otras palabras, se aclaró que los CTL podrían ser expandidos favorablemente con células positivas a la expresión del IL-2R con proliferación significativa, tanto antes de la expansión como después de la expansión, llevando a cabo la inducción y expansión de CTLs en la presencia del fragmento de fibronectina, en comparación con la fibronectina per se.

Ejemplo 12. Expansión de CTLs (Comparación de la Fibronectina con el Fragmento de Fibronectina) (1) Inducción de CTLs de Memoria contra el Virus de la Influenza La inducción de CTLs de memoria contra el virus de la influenza se llevó a cabo de la misma manera que en el inciso (2) del ejemplo 1, usando las PBMC que fueron aisladas y almacenadas de la misma manera que en el inciso (1) del ejemplo 1. La actividad citotóxica de CTLs el día catorce después del inicio de la inducción, fue evaluada de la misma manera que en el inciso (3) del ejemplo 1. Como un resultado difícilmente hubo diferencias en la actividad citotoxica, debido a la presencia o ausencia de la adición de fibronectina y FNfr durante la inducción . (2) Expansión de CTLs Los CTLs preparados en el inciso (2) del ejemplo 12 fueron expandidos de la misma manera que en el inciso (2) del ejemplo 3. Además, se usó lOHycloneRPMI como un medio. El grado en el cual se mantuvo la actividad citotoxica de CTLs expandidos, en comparación con el grado antes de la expansión, fue evaluado como "mantenimiento de la actividad citotoxica (%)". Los resultados de la determinación se presentan en la tabla 13.

Tabla 13 Mantenimiento de Actividad Citotoxica (%) Proporción E/T = 3 Control (Sin Adición de FNfr) 48.1 Fibronectina 148.9 CH-271 250.8 Como se muestra en la tabla 13, los CTL del grupo con adición del fragmento de fibronectina, durante la inducción y la expansión, mantuvieron una actividad citotóxica alta, específica, inclusive después de la expansión por 14 días, en comparación con la del grupo de control sin adición del fragmento de fibronectina . También, su actividad fue significativamente alta, en comparación con la del grupo con la adición de fibronectina . En otras palabras, se aclaró que los CTLs podrían ser expandidos favorablemente en un estado en el cual se mantuviera una alta actividad citotóxica por un largo período, llevando a cabo la inducción y expansión en la presencia conjunta del fragmento de fibronectina, en comparación con la presencia conjunta de la fibronectina per se.

Ejemplo 13. Determinación de las Veces de Expansión en el Sistema de Cultivo de Células LAK (Células Supresoras Activadas 'con Linfocina) (1) Inmovilización del Anticuerpo CD3 antihumano y FN o fragmento de FN. Anticuerpo CD3 anti -humano y fibronectina o fragmento FN fueron inmovilizados en un equipo (recipiente) para cultivos, usado en el siguiente experimento.

Concretamente, se adicionó 1 mi (en el caso de una placa de 24 pozos) ó 2 mi (en el caso de un matraz de 12.5 cm2) tanto de PBS que contenía un anticuerpo CD3 anti-humano 1 (fabricado por Janssen-Kyowa) (concentración final de 5 Ug/ml) se adicionó a una placa de cultivos de células de 24 pozos o a un matraz de cultivo de células de 12.5 era2 (fabricado por Falcon) . Durante la adición, fibronectina o cada uno de los fragmentos de fibronectina (FNfr) listados en el ejemplo de preparación 1, fue adicionada al grupo con adición de fibronectina o fragmento de FN, a fin de tener una concentración final de 10 ug/ml (en el caso de la placa de 24 pozos) ó 25 ug/ml (en el caso del matraz de 12.5 cm2) . Como un control se fijó también un grupo sin adición de fibronectina y FNfr. Después que estos equipos para cultivo fueron incubados a temperatura ambiente por 5 horas, los equipos para cultivo fueron almacenados a 4 °C hasta su uso. Inmediatamente antes del uso, el PBS que contenia el anticuerpo y FNfr fueron removidos por aspiración de estos equipos para cultivo, y posteriormente cada pozo fue lavado dos veces con PBS, y luego una vez con medio XVIVO20 (fabricado por Bio Whittaker) que contenía 5% de suero tipo AB humano (fabricado por Bio Whittaker) y 1% de estreptomicina-penicilina (fabricada por GIBCO BRL) (a la que se hace referencia de aquí en adelante, simplemente como 5HXVIVO20) , y los equipos para cultivo fueron sometidos a cada experimento. (2) Inducción y Cultivo de Células LAK PBMCs que fueron preparadas en el inciso (1) del ejemplo 1 fueron suspendidas en 5HXVIVO20 a fin de tener una concentración de 0.5 a 1 x 106 células/ml, y posteriormente la suspensión se colocó sobre una placa inmovilizada con anticuerpo CD3 anti-humano, o una placa inmovilizada con anticuerpo CD3 anti-humano y fibronectina o FNfr preparado en el inciso (1) del ejemplo 13 en un volumen de 1 ml/pozo, y IL-2 (fabricado por Shionogi . &Co. Ltd.) fueron adicionados al mismo a fin de tener una concentración final de 1000 U/ml. Estas placas fueron sometidas a cultivo a 37 °C en 5% de C02 (día cero del cultivo) . En el segundo y tercer dias desde el inicio del cultivo, se adicionó 5HXVIVO20 que contenia 1000 U/ml de IL-2, en un volumen de 1 ml/pozo. El cuarto día desde el inicio del cultivo, un medio de cultivo apropiadamente diluido con 5HXVIVO20 fue transferido a un matraz fresco al cual no se había inmovilizado nada, y se adicionó IL-2 a fin de tener una concentración final de 500 U/ml. El cultivo se continuó, el medio de cultivo se diluyó apropiadamente con 5HXVIVO20 cada 2 ó 3 días en la misma manera que el quinto día desde el inicio del cultivo, y se adicionó IL-2 a fin de tener una concentración final de 300 a 500 U/ml. Del séptimo al décimo quinto día desde el inicio del cultivo, se contó el número de células vivas mediante el método de tinción con azul de tripano y se calculó como un número de veces de expansión, comparando ese número con el número de células al inicio del cultivo. Los resultados se presentan en la tabla 14.

Tabla 14 Número de FN/Fragmento de FN de Expansión Días de (Veces) Cultivo 7 Días Control (Sin Inmovilización 103 de FN/FNfr) Fibronectina 233 CH-296 218 H-296 247 9 Días Control (Sin Inmovilización 250 de FN/FNfr) Fibronectina 1190 CH-296 1286 H-296 1075 11 Días Control (Sin Inmovilización x 576 de FN/FNfr) Fibronectina x 2304 CH-296 x 1728 H-296 x 2088 Control (Sin Inmovilización x 660 de FN/FNfr) C-CS1 x 1170 Días Control (Sin Inmovilización 1980 de FN/FNfr) Fibronectina 3348 CH-296 5364 Control (Sin Inmovilización x 2906 de FN/FNfr) C-CS1 x 5117 Como se muestra en la tabla 14, en el grupo en el que usó el equipo de cultivo inmovilizado con cada uno de los fragmentos de fibronectina, en una etapa temprana de la inducción de células LAK, las veces de expansión de las células LAK es alta en comparación con la del grupo de control. Además, las veces de expansión del grupo inmovilizado con cada uno de los fragmentos de fibronectina, fue mayor que para el grupo que usó el equipo para cultivos inmovilizado con fibronectina el día quince a partir del inicio del cultivo. Por lo tanto, se aclaró que en el caso en donde la expansión se lleva a cabo por un largo periodo, la inducción y cultivo de células LAK se llevan a cabo apropiadamente con un número inclusive mayor de veces de expansión, por la presencia conjunta del fragmento de fibronectina en una etapa temprana de la inducción de células LAK, en comparación con la fibronectina per se.

Ejemplo 14. Determinación de la Proporción de Proliferación en un Sistema de Cultivo de Células LAK (1) Inducción y Cultivo de Células LAK La inducción y cultivo de células LAK se llevaron a cabo de la misma manera que en el inciso (2) del ejemplo 13. Se calculó la proporción de proliferación de las células desde el cuarto día al séptimo día desde el inicio del cultivo, durante esta etapa. Los resultados se presentan en la tabla 15.

Tabla 15 Número de Células Fragmento de Proporción de al Inicio del Fibronectina Proliferación del Cultivo 4 o dia al 7o dia (número de veces) x 10 células /mi Control (Sin Inmoviliza2.7 veces ción de FNfr) CH-296 16.9 veces Control (Sin Inmoviliza33.5 veces ción de FNfr) H-296 49.5 veces 1 x 10b células/ml Control (Sin Inmoviliza6.2 veces ción de FNfr) CH-296 20.4 veces Control (Sin Inmoviliza23.5 veces ción de FNfr) H-296 43.5 veces Como se muestra en la tabla 15, en el grupo que usó el equipo de control inmovilizado con cada uno de los fragmentos de fibronectina, en una etapa temprana de la inducción de células LAK, la proporción de proliferación de células LAK a partir del cuarto dia hasta el séptimo dia del inicio del cultivo, es alta en comparación con el del grupo de control. En otras palabras, se aclaró que las células LAK podrían ser inducidas y cultivadas con una tasa de proli eración más rápida, debido a la presencia conjunta del fragmento de fibronectina en una etapa temprana de la inducción de células LAK.

Ejemplo 15. Determinación del Número de Veces de Expansión en un Sistema de Cultivo de Células LAK (Inducción y Cultivo de Células LAK a Partir de un Bajo Número de Células ) (1) Inducción y Cultivo de células LAK La inducción y el cultivo de células LAK se llevaron a cabo de la misma manera que para el inciso (2) del ejemplo 13. Durante esta etapa la concentración de células al inicio del cultivo, se ajustó a fin de tener una concentración de 2 x 105 a 1 x 106 células/ml (de 1 x 105 a 5 x 105 células/cm2) . El dia quince desde el inicio del cultivo, se contó el número de células vivas mediante el método de tinción con azul de tripano, y se calculó el número de veces de la expansión, en comparación con el número de células al inicio del cultivo. Los resultados se presentan en la tabla 16.

Tabla 16 Número de Células al Fragmento de Número de Inicio del Cultivo Fibronectina Veces de Expansión (veces ) 2 x 10b células/ml Control (Sin x 48.6 Inmovilización de FNfr) (1 x 10 5 células/cm2) CH-296 x 1004 x 10b células/ml Control (Sin x 438 Inmovilización de FNfr) (2.5 x 105 células/cm2) CH-296 x 1094 1 x 106 células/ml Control (Sin x 1020 Inmovilización de FNfr) (5 x 10 5 células/cm2) CH-296 x 1476 Como se muestra en la tabla 16, en el grupo en el que se usó el equipo para cultivo, inmovilizado con cada uno de los fragmentos de fibronectina, durante la inducción de células LAK, se obtuvo un alto número de veces de expansión, el día 15 a partir del inicio del cultivo, sin importar el número de células al inicio del cultivo. En contraste, en el grupo de control, el número de veces de expansión el día quince a partir del inicio del cultivo, fue bajo cuando el número de células al inicio del cultivo era bajo. En otras palabras, se aclaró que las células LAK podrían ser inducidas y cultivadas con un alto número de veces de expansión, debido a la presencia conjunta del fragmento de fibronectina, durante la inducción de células LAK a partir del bajo número de células, sin importar el número de células al inicio del cultivo.

Ejemplo 16. Determinación del Número de Veces de Expansión en el Sistema de Cultivo de Células LAK (Inducción y Cultivo de Células LAK a Partir de un Bajo Número de Células/Cultivo sin Procedimientos de Dilución) (1) Inducción y Cultivo de Células LAK PBMCs que fueron preparadas en el inciso (1) del ejemplo 1 fueron suspendidas en 5HXVIVO20 a fin de tener una concentración de 1 x 104 células/ml, y posteriormente la suspensión se colocó sobre una placa inmovilizada con el anticuerpo CD3 anti-humano, o una placa de 6 pozos inmovilizada con el anticuerpo CD3 anti-humano y fibronectina o FNfr preparado en la misma manera que en el inciso (1) del ejemplo 13 en un volumen de 1 ml/pozo. A lo mismo se adicionaron cuatro mililitros de 5HXVIVO20 (1 x 103 células/cm2) , y IL-2 (fabricado por Shionogi & Co . , Ltd. ) si adicionó al mismo a fin de tener una concentración final de 500 U/ml. Estas placas se sometieron al cultivo a 37 °C en 5% de C02 (día cero del cultivo) . El segundo, tercer y cuarto días desde el inicio del cultivo, se adicionó IL-2 a fin de tener una concentración final de 500 U/ml. Se continuó el cultivo y se adicionó IL-2 cada dos o tres días a fin de tener una concentración final de 500 U/ml desde el séptimo día y desde el inicio del cultivo. Durante la adición no se llevó a cabo del todo el procedimiento de dilución del medio de cultivo.

El día quince desde el inicio del cultivo, se contó el número de células vivas mediante el método de tinción con azul de tripano, y se calculó como un número de veces de expansión, comparando ese número con el número de células al inicio del cultivo. Los resultados se presentan en la tabla 17.

Tabla 17 Como se muestra en la tabla 17, en el grupo en el que se usó el equipo para cultivos inmovilizado con cada uno de los fragmentos de fibronectina, durante la inducción de células LAK, a partir del bajo número de células, se obtuvo un alto número de veces de expansión, el día quince a partir del inicio del cultivo, sin requerir del procedimiento de dilución de las células durante el transcurso de la inducción. También este número de veces de expansión fue alto inclusive al compararlo con el grupo que usó el equipo para cultivos inmovilizado con la fibronectina . En contraste, en el grupo de control, las células se proliferaron con dificultad, inclusive el día quince desde el inicio del cultivo. En otras palabras, se aclaró que las células LAK podrían ser inducidas y cultivadas con un alto número de veces de expansión, debido a la presencia conjunta de la fibronectina o fragmento de fibronectina, preferentemente el fragmento de fibronectina, durante la inducción de células LAK a partir del bajo número de células, sin requerir del todo del procedimiento de dilución.

Ejemplo 17. Inducción de la Expresión del IL-2R en Células LAK (1) Inducción y Cultivo de Células LAK La inducción y el cultivo de células LAK se llevaron a cabo de la misma manera que para el inciso (2) del ejemplo 13. (2) Determinación de la Proporción de la Expresión del IL-2R en Células LAK La proporción de la expresión del IL-2R en las células LAK que fueron sometidas a inducción y cultivo en el inciso (1) del ejemplo 17, se determinó de acuerdo con el método descrito en el inciso (2) del ejemplo 2. Los resultados se presentan en la tabla 18. En la tabla, la proporción de contenido de células positivas a la expresión del IL-2R (%) se presenta como la proporción de expresión del IL-2R (%) .

Tabla 18 Número de Días FN/Fragmento de FN Proporción de de Cultivo Expresión del IL-2R (%) 4 Días Control (Sin Inmovilización 86.5 del FN/FNfr) Fibronectina 97.2 CH-296 97.6 H-296 97.7 C-CS1 94.9 7 Dias Control (Sin Inmovilización 59.3 del FN/FNfr) Fibronectina 77.6 CH-296 90.4 H-296 89.1 C-CS1 65.8 Como se muestra en la tabla 18, en el grupo que se usó el equipo para cultivos inmovilizado con cada uno de los fragmentos de fibronectina, en una etapa temprana de la inducción de células LAK, se obtuvo una alta proporción de expresión del IL-2R sobre la superficie de las células LAK durante el cultivo. También, esta proporción de la expresión del IL-2R fue alta inclusive cuando se comparó con el grupo que usó el equipo para cultivos inmovilizado con la fibronectina . En otras palabras, se aclaró que las células LAK podrían ser inducidas y cultivadas con una proporción de expresión del IL-2R que fuera favorablemente mayor que la de la fibronectina per se, mediante la presencia conjunta del fragmento de- fibronectina durante la inducción de las células LAK.

Ejemplo 18. Inducción de la Expresión del IL-2R en Células LAK (1) Inducción y Cultivo de Células LAK La inducción y cultivo de células LAK se llevaron a cabo en la misma manera que para el inciso (2) del ejemplo 13. (2) Determinación de la Proporción de la Expresión del IL-2R en Células LAK La proporción de la expresión del IL-2R sobre las superficies de células CD4 y células CD8 en las células LAK que fueron inducidas y cultivadas en el inciso (1) del ejemplo 18 el día siete, se determinó de acuerdo con el método descrito en el inciso (2) del ejemplo 9. Aquí, en este procedimiento, se usó un anticuerpo CD4 anti-humano de ratón, marcado con FITC, o un anticuerpo CD8 anti-humano, de ratón, marcado con FITC, como un anticuerpo primario, y se usó un anticuerpo IL-2R (CD25) anti-humano de ratón, marcado con PE, como un anticuerpo secundario. Los resultados se presentan en la tabla 19.

Tabla 19 Como se muestra en la tabla 19, en el grupo que usó el equipo para cultivos inmovilizado con cada uno de los fragmentos de fibronectina, en una etapa temprana de la inducción de células- LAK, una alta proporción de expresión del IL-2R podía ser inducida sobre la superficie de células LAK (células tanto CD4-positivas como CD8- positivas) durante el cultivo. En otras palabras, se aclaró que las células LAK podrían ser inducidas y cultivadas con una alta proporción de expresión del IL-2R sobre las superficies de las células, tanto de células CD4-positivas como CD8-positivas, mediante la presencia conjunta del fragmento de fibronectina durante la inducción de las células LAK.

Ejemplo 19. Proporción de Contenido de Células CD8-Positivas en una Población de Céluas LAK (1) Inducción y Cultivo de Células LAK La inducción y el cultivo de células LAK se llevó a cabo de la misma manera que para el inciso (2) del ejemplo 13. (2) Determinación de la Proporción de Contenido de la Población de Células CD8-Positivas en Células LAK. La proporción de contenido de células CD8-positivas en las células LAK, que fueron inducidas y cultivadas en el inciso (1) del ejemplo 19, el dia quince, fue determinada de acuerdo con el método descrito en el inciso (4) del ejemplo 1. Los resultados se presentan en la tabla 20.

Tabla 20 Fragmento de Fibronectina Proporción de Contenido de Células CD8-Positivas (%) Control (Sin Inmovilización de 42.9 FN/FNfr) CH-296 72.1 H-296 76.0 Como se muestra en la tabla 20, en el grupo que usó el equipo para cultivos, inmovilizado con cada uno de los fragmentos de fibronectina, en una etapa temprana de inducción de las células LAK, una alta proporción de contenidos de células CD8-positivas podía ser inducida en células LAK durante el cultivo. En otras palabras, se aclaró que las células LAK podrían ser inducidas y cultivadas con una alta proporción de contenido de células CD8-positivas en células LAK, mediante la presencia conjunta del fragmento de fibronectina durante la inducción de células LAK.

Ejemplo 21. Determinación del Número de Veces de Expansión en el Sistema de Cultivo de Células LAK (1) Inducción y Cultivo de Células LAK PBMCs que fueron preparadas en el inciso (1) del ejemplo 1, fueron suspendidas en 5HXVIVO20 a fin de tener una concentración de 0.5 a 1 x 106 células/ml, y posteriormente la suspensión se colocó sobre una placa inmovilizada con el anticuerpo CD3 anti-humano, o una placa inmovilizada con el anticuerpo CD3 anti-humano y FNfr preparado en el inciso (1) del ejemplo 13, en un volumen de 1 ml/pozo, y se adicionó IL-2 (fabricado por Shionogi & Co., Ltd.) al mismo, a fin de tener una concentración final de 1000 U/ml. Estas placas fueron sometidas a cultivo a 37 °C en 5% de C02 (día cero del cultivo) . El segundo y tercer días a partir del inicio del cultivo, se adicionó 5HXVIVO20 que contenia 1000 U/ml IL-2, en un volumen de 1 ml/pozo. El cuarto día desde el inicio del cultivo, un medio de cultivo diluido apropiadamente con 5HXVIVO20 fue transferido a un matraz fresco al cual no se había inmovilizado nada, y se adicionó IL-2 a fin de tener una concentración final de 500 U/ml. El día ocho o nueve desde el inicio del cultivo, un medio de cultivo diluido apropiadamente con 5HXVIVO20 fue transferido a un matraz inmovilizado con el anticuerpo CD3 anti-humano, o a un matraz inmovilizado con el anticuerpo CD3 anti-humano y FNfr (con tal que la concentración del anticuerpo CD3 anti-humano, usado en la inmovilización, fuese de 0.5 pg/ml) preparado en la misma manera que en el inciso (1) del ejemplo 13, y se adicionó IL-2 a fin de tener una concentración final de 500 U/ml. El día once o el día doce desde el inicio del cultivo, un medio de cultivo apropiadamente diluido nuevamente con 5HXVIVO20 fue transferido a un matraz fresco al cual no se había inmovilizado nada, y se adicionó IL-2 a fin de tener una concentración final de 500 U/ml. El día quince desde el inicio del cultivo, se contó el número de células vivas mediante el método de tinción con azul de tripano, y se calculó como un número de veces de expansión, comparando ese número con el número de células al inicio del cultivo. Los resultados se muestran en las tablas 21 y 22. En la tabla "Donador" denota donadores de PBMC.

Tabla 21 Donador Fragmento de Estimulación Estimulación Número de Fibronectina el día 0 el Día 8 Veces de desde el desde el Expansión Inicio del Inicio del (veces) Cultivo Cultivo A Control (Sin Anti-CD3 Ninguna x 80 Inmovilización del FNfr) Anti-CD3 Anti-CD3 x 38 CH-296 Anti-CD3+CH- Ninguna x 1452 296 Anti-CD3+CH- Anti-CD3 x 1620 296 Anti-CD3+CH- Anti-CD3+CH- x 2700 296 296 B Control (Sin Anti-CD3 Ninguna x 710 Inmovilización del FNfr) Anti-CD3 Anti-CD3 x 2363 CH-296 Anti-CD3+CH- Ninguna x 504 296 Anti-CD3+CH- Anti-CD3 x 5468 296 Anti-CD3+CH- Anti-CD3+CH- x 14243 296 296 C Control (Sin Anti-CD3 Ninguna x 1805 Inmovilización del FNfr) Anti-CD3 Anti-CD3 x 4200 CH-296 Anti-Cd3+CH- Anti-CD3+CH- x 35700 296 296 H-296 Anti-CD3+H- Anti-CD3+H- x 16950 296 296 Tabla 22 Como se muestra en las tablas 21 y 22, en el grupo que usó el equipo para cultivos en el que cada uno de los fragmentos de fibronectina y del anticuerpo CD3 anti-humano fueron inmovilizados repetidamente en una etapa temprana y en una etapa intermedia, de la inducción de células LAK, un número de veces de expansión de las células LAK es alto en comparación con el del grupo de control. Estas proporciones de expansión fueron mucho más altas que el número de expansión en el grupo que usó el equipo para cultivos en el que únicamente el anticuerpo anti-humano CD3 había sido inmovilizado repetidamente en una etapa temprana y en una etapa intermedia de la inducción de células LAK. En otras palabras, se aclaró que las células LAK podrían ser inducidas y cultivadas con un número de veces de expansión, mayor, mediante la estimulación usando el fragmento de fibronectina y el anticuerpo anti-humano CD3 en etapa temprana y en una etapa intermedia de la inducción de células LAK.

Ejemplo 21. Determinación de la Proporción de Proliferación en el Sistema de Cultivo de Células LAK (1) Inducción y Cultivo de Células LAK La inducción y el cultivo de células LAK se llevaron a cabo de la misma manera que para el inciso (1) del ejemplo 20. La proporción de la proliferación de las células desde el día cuatro hasta el día ocho desde el inicio del cultivo, y la proporción de la proliferación de las células desde el día once al día quince desde el inicio del cultivo, durante los procedimientos, fueron calculadas. Los resultados se presentan en las tablas 23 y 24.

Tabla 23 Donador Fragmento de Estimulación Estimulación Proporción de Fibronectina el Día 0 el dia 8 Proliferación desde Inicio desde el de los días del Cultivo Inicio del 11 a 15 Cultivo (veces) A Control (Sin Anti-CD3 Ninguna 6.7 veces Inmovilización del FNfr) Anti-CD3 Anti-CD3 8.3 veces CH-296 Anti- Ninguna 2.6 veces CD3+CH-296 Anti- Anti-CD3 5.5 veces CD3+CH-296 Anti- Anti- 11.1 veces CD3+CH-296 CD3+CH-296 B Control (Sin Anti-CD3 Ninguna 7.4 veces Inmovilización del FNfr) Anti-CD3 Anti-CD3 17.5 veces CH-296 Anti- Ninguna 0.9 veces CD3+CH-296 Anti- Anti-CD3 19.8 veces CD3+CH-296 Anti- Anti- 60.3 veces CD3+CH-296 CD3+CH-296 C Control (Sin Anti-CD3 Ninguna 5.2 veces Inmovilización del FNfr) Anti-CD3 Anti-CD3 22.2 veces CH-296 Anti- Anti- 94.0 veces CD3+CH-296 CD3+CH-296 H-296 Anti-CD3+H- Anti-CD3+H- 35.0 veces 296 296 Tabla 24 Como se muestra en las tablas 23 y 24, en el grupo que usó el equipo para cultivos en el que cada uno de los fragmentos de fibronectina y el anticuerpo anti-CD3 fueron inmovilizados repetidamente en una etapa temprana y en una etapa intermedia, de la inducción de células LAK, la proporción de la proliferación de células LAK fue alta en una etapa tardía de la inducción, en comparación con la del control . Estas proporciones de proliferación fueron mucho mayores que la proporción de proliferación de células LAK en la etapa tardía de la inducción del grupo que usó el equipo para cultivos en el que únicamente el anticuerpo anti- CD3 .fue inmovilizado repetidamente en una etapa temprana y en una etapa intermedia de la inducción de las células LAK. En otras palabras se aclaró que las células LAK podrían ser inducidas y cultivadas con una mayor proporción de proliferación, mediante la estimulación usando el fragmento de fibronectina y el anticuerpo anti-CD3 en una etapa temprana y en una etapa intermedia de la inducción de células LAK.

Ejemplo 22. Inducción de la Expresión del IL-2R en Células LAK (1) Inducción y Cultivo.de Células LAK La inducción y el cultivo de células LAK se llevaron a cabo de la misma manera que para el inciso (1) del ejemplo 20. (2) Determinación de la Proporción de la Expresión del IL-2R en Células LAK La proporción de la expresión del IL-2R en las células LAK que fueron sometidas a la inducción y cultivo en el inciso (1) del ejemplo 22, el día quince, fue determinada de acuerdo con el método descrito en el inciso (2) del ejemplo 2. Los resultados se presentan en las tablas 25 y 26. En las tablas, la proporción de contenido de las células positivas a la expresión del IL-2R (%) se muestra como una proporción de la expresión del IL-2R (%) .

Tabla 25 Fragmento de Estimulación Estimulación Proporción de Fibronectina el día 0 desde el día 9 desde Expresión del el Inicio del el Inicio del IL-2R Cultivo Cultivo (%) Control (Sin Anti-CD3 Ninguna 4.8 Inmovilización del FNfr) Anti-CD3 Anti-CD3 32.6 CH-296 Anti-CD3+CH- Ninguna 2.5 296 Anti-CD3+CH- Anti-CD3 72.3 296 Anti-CD3+CH- Anti-CD3+CH- 94.7 296 296 H-296 Anti-CD3+H- Ninguna 1.4 296 Anti-CD3+H- Anti-CD3 50.2 296 Anti-CD3+H- Anti-CD3+H- 89.6 296 296 Tabla Como se muestra en las tablas 25 y 26, en el grupo que usó el equipo para cultivos en el que cada uno de los fragmentos de fibronectina y el anticuerpo anti-CD3 fueron inmovilizados repetidamente en una etapa temprana y en una etapa intermedia, de la inducción de células LAK, la proporción de la expresión del IL-2R sobre la superficie de las células LAK el día quince después del inicio del cultivo, fue alta en comparación a la del control. Estas proporciones de la expresión del 'IL-2R fueron mucho mayores que las proporciones de la expresión del IL-2R en el grupo que usó el equipo para cultivos en el que únicamente el anticuerpo anti-CD3 fue inmovilizado repetidamente en una etapa temprana y en una etapa intermedia de la inducción de las células LAK. En otras palabras, se aclaró que las células LAK podrían ser inducidas y cultivadas con una proporción mayor de expresión del IL-2R mediante la estimulación usando el fragmento de fibronectina en una etapa temprana y en una etapa intermedia de la inducción de las células LAK.

Ejemplo 23. Determinación de la Proporción de Células CD8-Positivas en Células LAK (1) Inducción y Cultivo de Células LAK La inducción y el cultivo de células LAK se llevaron a cabo de la misma manera que para el inciso (1) del ejemplo 20. (2) Determinación de la Proporción de Contenido de Células CD8-Positivas en una Población de Células LAK La proporción de contenido de células CD8- positivas en la población de células LAK que fueron sometidas a la inducción y cultivo en el inciso (1) del ejemplo 23, el día quince, se determinó de acuerdo con el método descrito en el inciso (4) del ejemplo 1. Los resultados se presentan en la tabla 27.

Tabla 27 Como se muestra en la tabla 27, en el grupo que usó el equipo para cultivos en el que cada uno de los fragmentos de fibronectina y el anticuerpo anti-CD3 fueron inmovilizados repetidamente en una etapa temprana y en una etapa intermedia de la inducción de las células LAK, la proporción de contenido de células CD8-positivas en la población de células LAK, el día quince desde el inicio del cultivo, fue alta en comparación con la del control. Estas proporciones de contenidos de células CD8-positivas fueron mucho mayores que las proporciones de contenido de células CD8-positivas en el grupo que usó el equipo de cultivo en el que únicamente el anticuerpo anti-CD3 fue inmovilizado repetidamente en una etapa temprana y en una etapa intermedia de la inducción de células LAK. En otras palabras, se aclaró que las células LAK podrían ser inducidas y cultivadas con una mayor proporción de contenidos de células CD8-positivas, mediante la estimulación usando el fragmento de fibronectina en una etapa temprana y en una etapa intermedia de la inducción de las células LAK.

TEXTO INDEPENDIENTE DEL LISTADO DE SECUENCIAS SEQ ID NO : i; Región parcial de fibronectina denominada III - 8. SEQ ID NO : 2; Región parcial de fibronectina denominada III - 9. SEQ ID NO : 3 ; Región parcial de fibronectina denominada III - 10. SEQ ID NO : 4; Región parcial de fibronectina denominada III - 12. SEQ ID NO : 5; Región parcial de fibronectina denominada III- 13. SEQ ID NO : 6; Región parcial de fibronectina denominada III- 14. SEQ ID NO : 7; Región parcial de fibronectina denominada CS-1 • SEQ ID NO: 8; Fragmento de fibronectina llamado C-274.

SEQ ID NO: 9; Fragmento de fibronectina llamado H-271.

SEQ ID NO: 10; Fragmento de fibronectina llamado H-296. SEQ ID NO: 11; Fragmento de fibronectina llamado CH-271. SEQ ID NO: 12; Fragmento de fibronectina denominado CH-296. SEQ ID NO: 13; Fragmento de fibronectina denominado C-CS1. SEQ ID NO: 14; Fragmento de fibronectina denominado CHV- 89. SEQ ID NO : 15; Fragmento de fibronectina denominado CHV- 90. SEQ ID NO : 16; Fragmento de fibronectina denominado CHV- 92. SEQ ID NO : 17 ; Fragmento de fibronectina denominado CHV- 179 SEQ ID NO : 18; Fragmento de fibronectina denominado CHV- 181 SEQ ID NO : 19; Fragmento de fibronectina denominado H- 275- Cys • SEQ ID NO: 20; Cebador 12S. SEQ ID NO: 21; Cebador 14A. SEQ ID NO: 22; Cebador Cys-A. SEQ ID NO: 23; Cebador Cys-S. SEQ ID NO : 24 ; Péptido designado en base a la proteína matriz derivada del virus de la influenza.

APLICA3ILIDAD INDUSTRIAL De acuerdo con el proceso para preparar un linfocito citotóxico de la presente invención, se obtiene un linfocito citotóxico en el que se mantiene una alta actividad citotóxica, un nivel de expresión del IL-2R se incrementa significativamente, y se mejora una proporción de células CD8-positivas . El linfocito es usado convenientemente, por ejemplo, en una inmunoterapia adoptiva. Por lo tanto se espera una gran contribución del proceso de la presente invención, al campo médico.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un método para preparar un linfocito citotóxico caracterizado porque el método comprende el paso de llevar a cabo una inducción, mantenimiento y expansión, al menos una de ellas, de un linfocito citotóxico, en la presencia de fibronectina, un fragmento de la misma o una mezcla de los mismos.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el linfocito citotóxico expresa en gran medida un receptor interleucina-2 , en comparación con un linfocito citotóxico obtenido mediante el método para preparar un linfocito citotóxico en la ausencia de ibronectina, un fragmento de la misma o una mezcla de los mismos .
3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el linfocito citotóxico contiene células CD8-positivas en una mayor proporción en comparación con un linfocito citotóxico obtenido mediante el método para preparar un linfocito citotóxico en la ausencia de fibronectina, un fragmento de la misma o una mezcla de los mismos.
4. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el linfocito citotóxico mantiene en gran medida la actividad citotóxica, en comparación con un linfocito citotóxico obtenido mediante el método para preparar un linfocito citotóxico en la ausencia de fibronectina, un fragmento de la misma o una mezcla de los mismos.
5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque un número de veces de la expansión del linfocito citotóxico es alto en comparación con el del método para preparar un linfocito citotóxico en la ausencia de fibronectina , un fragmento de la misma o una mezcla de los mismos.
6. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la fibronectina , un fragmento de la misma o una mezcla de los mismos, es inmovilizada en una fase sólida.
7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la fase sólida es un equipo para cultivo de células o un portador de cultivo de células.
8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el equipo para el cultivo de células es una caja de Petri, un matraz o una bolsa, y el portador de cultivo de células son cuentas, una membrana o un portaobjetos de vidrio.
9. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la inducción, mantenimiento y expansión, al menos una de ellas, de un linfocito citotóxico, se lleva a cabo en un medio que contenga fibronectina, un fragmento de la misma o una mezcla de los mismos.
10. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el fragmento de fibronectina es un polipéptido que comprende al menos una de las secuencias de aminoácidos representadas por la SEQ ID NOs : 1 a 7 del Listado de Secuencias, o un polipéptido que tiene una substitución, supresión, inserción o adición de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de ese polipéptido, en donde el polipéptido tiene funciones equivalentes a la de ese polipéptido .
11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el fragmento de fibronectina tiene una actividad de adhesión celular y/o una actividad de enlazamiento a la heparina.
12. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el fragmento de fibronectina es un polipéptido seleccionado de polipéptidos que comprenden cualesquiera de las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NOs : 8 a 19 del Listado de Secuencias.
13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende llevar a cabo la inducción, mantenimiento y expansión, al menos una de ellas, de un linfocito citotóxico, en la presencia de fibrónectina , un fragmento de la misma o una mezcla de los mismos, en un equipo para cultivo de tejidos que contenga un medio, en donde el método satisface algunas de las condiciones de: (a) una proporción del número de células al inicio del cultivo, con respecto al área de cultivo en el equipo para cultivo de células, es de 1 célula/cm2 a 5 x 105 células/cm2 ; y (b) una concentración en un medio al inicio del cultivo es de 1 célula/ml a 5 x 105 células/ml.
14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el método excluye un paso de dilución o una etapa para cambiar un equipo para cultivo de células.
15. Un linfocito citotóxico caracterizado porque se obtiene mediante el método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 1 .
16. Un medicamento caracterizado porque comprende como un ingrediente eficaz, un linfocito citotóxico obtenido mediante el método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 14.
17. Un agente para aumentar la expresión del receptor interleucina-2 , de una célula, caracterizado porque el agente comprende como ingrediente eficaz, fibrónectina, un fragmento de la misma o una mezcla de los mismos .
18. El agente. de conformidad con. la reivindicación 17, caracterizado porque el fragmento de fibronectina es un polipéptido que comprende al menos una de las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOs : 1 a 7 del Listado de Secuencias, o un polipéptido que tiene una substitución, supresión, inserción o adición de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de ese polipéptido, en donde el polipéptido tiene funciones equivalentes a las de ese polipéptido.
19. El agente de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el fragmento de fibronectina tiene una actividad de adhesión celular y/o una actividad de enlazamiento a la heparina.
20. El agente de conformidad con la reivindicación 18, caracter zado porque el fragmento de fibronectina es un polipéptido seleccionado de polipéptidos que comprenden cualesquiera de las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NOs : 8 a 19 del Listado de Secuencias.
21. Un agente' para mejorar una proporción de células CD8 -positivas en un linfocito, caracterizado porque el agente comprende .como ingrediente eficaz fibronectina, un fragmento de la misma o una mezcla de los mismos.
22. El agente de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el fragmento de fibronectina es un polipéptido que comprende al menos una de las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOs : 1 a 7 del Listado de Secuencias, o un polipéptido que tiene una substitución, supresión, inserción o adición de uno o más aminoácidos, en la secuencia de aminoácidos de ese polipéptido, en donde el polipéptido tiene funciones equivalentes a las de ese polipéptido.
23. El agente de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el fragmento de fibronectina tiene una actividad de adhesión celular y/o una actividad de enlazamiento a la heparina.
24. El agente de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el fragmento de fibronectina es un polipéptido seleccionado de polipéptidos que comprenden cualesquiera de las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NOs : 8 a 19 del Listado de Secuencias.
25. Un agente para mejorar o mantener la actividad citotóxica en un linfocito citotóxico, caracterizado porque el agente comprende como un ingrediente eficaz fibronectina, un fragmento de la misma o una mezcla de los mismos.
26. El agente de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el fragmento de fibronectina es un polipéptido que comprende al menos una de las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOs : 1 a 7 del Listado de Secuencias, o un polipéptido que tiene una substitución, supresión, inserción o adición de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de ese polipéptido, en donde el polipéptido tiene funciones equivalentes a las de ese polipéptido.
27. El agente de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el- fragmento de fibronectina tiene una actividad de adhesión celular y/o una actividad de enlazamiento a la heparina.
28. El agente de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el fragmento de fibronectina es un polipéptido seleccionado de polipéptidos que comprenden cualesquiera de las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NOs : 8 a 19 del Listado de Secuencias .
29. Un método para incrementar la expresión de un receptor interleucina-2 en un linfocito citotóxico, caracterizado porque el método comprende el paso de llevar a cabo la inducción, mantenimiento y expansión, al menos una de ellas, de un linfocito citotóxico, en la presencia de fibronectina, un fragmento de la misma o una mezcla de los mismos.
30. Un método para mejorar una proporción de células CD8 -positivas en un linfocito citotóxico, caracterizado porque el método comprende el paso de llevar a cabo la inducción, mantenimiento y expansión, al menos una de ellas, de un linfocito citotóxico, en la presencia de fibronectina , un fragmento de la misma o una mezcla de los mismos.
31. Un método para mejorar o mantener la actividad citotóxica en un linfocito citotóxico, caracterizado porque el método comprende el paso de llevar a cabo la inducción, mantenimiento y expansión, al menos una de ellas, de un linfocito citotóxico, en la presencia de fibronectina , un fragmento de la misma o una mezcla de los mismos.
32. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 14 , caracterizado porque además comprende el paso de transducir un gen extraño a un linfocito citotóxico.
33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el gen extraño es transducido usando un retrovirus, un adenovirus, un virus adeno-asociado o un virus de simio.