ES2356814T3 - Proceso para producir linfocitos citotóxicos. - Google Patents
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-
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Abstract
Un método para preparar un linfocito citotóxico o una preparación de linfocitos citotóxicos en donde dicho método comprende el paso de llevar a cabo al menos uno de inducción, mantenimiento y expansión de un linfocito citotóxico en presencia de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 12.
Description
Proceso para producir linfocitos
citotóxicos.
La invención se refiere a un método para
preparar un linfocito citotóxico, que es útil en el campo
médico.
Un cuerpo vivo está protegido de sustancias
exógenas principalmente por una respuesta inmune, y se ha
establecido un sistema inmunitario por varias células y los factores
solubles producidos por ellas. Entre ellas, los leucocitos, en
especial los linfocitos, desempeñan un papel clave. Los linfocitos
se clasifican en dos tipos principales, linfocito B (al que se puede
denominar de aquí en adelante como célula B) y linfocito T (al que
se puede denominar de aquí en adelante como célula T), ambos
reconocen de forma específica un antígeno y actúan sobre el antígeno
para proteger el cuerpo vivo.
Las células T se subclasifican en células T
cooperadoras que tienen el marcador CD (grupo de
diferenciación)4 (de aquí en adelante denominadas T_{H}),
principalmente implicadas en asistir en la producción de anticuerpos
e inducción de varias respuestas inmunitarias, y células T
citotóxicas que tienen el marcador CD8 (T_{C}: linfocito T
citotóxico, también denominada célula T citolítica y que se puede
denominar de aquí en adelante como CTL), que muestran principalmente
una actividad citotóxica. El CTL, que desempeña el papel más
importante en reconocer, destruir y eliminar células tumorales,
células infectadas por virus o similares, no produce un anticuerpo
que reaccione específicamente con un antígeno, como en la célula B,
pero directamente reconoce y actúa sobre antígenos (péptidos
antigénicos) de una célula diana que se asocia con las moléculas del
complejo mayor de histocompatibilidad [MHC, que también se puede
denominar como antígeno de leucocito humano (HLA) en seres humanos]
de clase I que existen en la superficie de la membrana de la célula
diana. En este punto, el receptor de la célula T (de aquí en
adelante denominado TCR) que existe en la superficie de la membrana
de las CTL específicamente reconoce los péptidos antigénicos
anteriormente mencionados y las moléculas de MHC de clase I, y
determina si el péptido antigénico deriva de sí mismo o es extraño.
La célula diana que se ha determinado que es extraña específicamente
se destruye y elimina después por CTL.
En los últimos años, se ha reconsiderado una
terapia que causaría una carga física más pesada en un paciente, tal
como farmacoterapia o radioterapia, y ha aumentado el interés en una
inmunoterapia con una carga física más ligera en un paciente. En
especial, se ha remarcado la eficacia de la inmunoterapia adoptiva
en la se inducen in vitro CTL capaces de específicamente
reaccionar con un antígeno de interés a partir de linfocitos
derivados de un ser humano que tiene función inmunitaria normal, o
se expande el linfocito sin inducción, y después se transfiere a un
paciente. Por ejemplo, se ha sugerido que la inmunoterapia adoptiva
en un modelo animal es una terapia eficaz para infección por virus y
tumores [escrito por Greenberg, P. D., Advances in
Immunology, publicado en 1992; Reusser P., et al., Blood,
78(5), 1373-1380 (1991)]. En esta
terapia, es importante mantener o aumentar el número de células en
un estado en el que se mantenga o aumente la actividad citotóxica
específica de antígeno del CTL.
En la inmunoterapia adoptiva como se describe
anteriormente, es necesario administrar linfocitos citotóxicos en el
número de células de una cantidad determinada o mayor para obtener
un efecto terapéutico. En otras palabras, se puede decir que es un
problema principal obtener el número anterior de células in
vitro en un corto periodo de tiempo.
Para mantener y aumentar una actividad
citotóxica específica de antígeno de CTL, en general se ha empleado
un método de estimulación repetida con un antígeno de interés cuando
se induce una respuesta específica a un antígeno para CTL. Sin
embargo, en este método el número de CTL finalmente obtenidos
normalmente puede disminuir, de modo que no se puede obtener un
número suficiente de células.
Como método para preparar células T que sea
eficaz para el tratamiento de una enfermedad, se conoce, por
ejemplo, inmunoterapia adoptiva que usa linfocitos infiltrantes en
tumor (TIL) inducidos con IL-2 a una concentración
alta [N. Engl. J. Med., 316, 1310-1321
(1986); Rosenberg S. A. et al, N. Engl. J. Med.,
319(25), 1676-1680 (1988); Ho M. et
al., Blood, 81(8), 2093-2101
(1993)].
A continuación, respecto a la preparación del
CTL específico de antígeno, se ha descrito un método para aislar y
expandir un clon de CTL específico de CMV usando fibroblastos
infectados con auto-CMV e IL-2
[Riddell S. A. et al., J. Immunol., 146(8),
2795-2804 (1991)] o usando un anticuerpo monoclonal
anti-CD3 (mAc anti-CD3) e
IL-2 [Riddell S. A. et al., J. Immunol.
Methods, 128(2), 189-201
(1990)].
Además, el documento WO 96/06929 divulga un
método REM (método de expansión rápida). Este método REM es un
método para expandir una población primaria de células T que
contiene CTL específicas de antígeno y T_{H} en un corto periodo
de tiempo. En otras palabras, este método se caracteriza en que se
puede suministrar una gran cantidad de células T mediante
proliferación de clones individuales de células T y en que el número
de CTL específicas de antígeno aumenta usando un anticuerpo
anti-CD3, IL-2 y PBMC (células
mononucleares de sangre periférica) hechas deficientes en la
capacidad de proliferación mediante irradiación, y células
infectadas con virus de Epstein-Barr (de aquí en
adelante simplemente denominadas células infectadas con EBV).
Además, el documento WO 97/32970 divulga un
método REM modificado, en donde el método es un método que usa como
célula alimentadora una cepa de células de mamífero indiferenciadas
que expresa un componente que estimula células T que es distinguible
de PBMC para reducir la cantidad de PMBC usadas.
La célula citolítica activada por linfoquinas
(célula LAK) es una población de células funcionales que tiene
actividad citotóxica, que se obtiene añadiendo IL-2
a sangre periférica (leucocitos de sangre periférica), sangre de
cordón umbilical, líquido tisular o similares que contiene
linfocitos, y cultivando las células in vitro durante varios
días. Durante el cultivo, la proliferación de células LAK se acelera
además añadiendo un anticuerpo anti-CD3 a las mismas
y cultivando las células. La célula LAK obtenida de esta manera
tiene una actividad citotóxica no específica hacia varias células
cancerosas y otras dianas. La célula LAK también se usa en la
inmunoterapia adoptiva de la misma manera que el CTL mencionado
anteriormente.
Como se ha descrito anteriormente, la
utilización de IL-2 es esencial en el paso de
obtener un linfocito citotóxico, por ejemplo, CTL, célula LAK, TIL o
similar. La célula se activa adicionalmente por unión de
IL-2 al receptor de interleuquina-2
(IL-2R) en la superficie de una célula. Además, se
conoce IL-2R como un marcador de activación para un
linfocito. Desde estos puntos de vista, es importante mejorar la
expresión de IL-2R en la superficie celular. Además,
en la inducción de CTL, es importante mejorar una eficacia para
inducir una célula precursora de CTL sometida a estimulación por un
antígeno como CTL, es decir, mejorar una proporción (relación) de la
célula CD8 positiva en un grupo de células después de la
inducción.
La fibronectina es una glicoproteína gigantesca
que tiene un peso molecular de 250 mil, que existe en la sangre
animal, en la superficie de células cultivadas o en la matriz
extracelular de un tejido, y se sabe que tiene varias funciones. Una
estructura de dominios de la misma se divide en siete partes (de
aquí en adelante referido a la figura 1), en donde tres tipos de
secuencias similares están contenidas en una secuencia de
aminoácidos de la misma, las repeticiones de cada una de estas
secuencias constituyen la secuencia entera. Los tres tipos de
secuencias similares se denominan tipo I, tipo II y tipo III. Entre
ellas, el tipo III está constituida por de 71 a 96 residuos de
aminoácidos, en donde la relación de coincidencia de estos residuos
de aminoácidos es del 17 al 40%. En la fibronectina, hay catorce
secuencias de tipo III, entre las cuales la secuencia 8ª, 9ª o 10ª
(cada una se denomina de aquí en adelante III-8,
III-9 o III-10) está contenida en un
dominio de unión a células, y la secuencia 12ª, 13ª o 14ª (cada una
se denomina de aquí en adelante III-12,
III-13 o III-14) está contenida en
un dominio de unión a heparina. Además, una región a unión a VLA
(antígeno de activación muy tardía)-5 está contenida
en III-10 y su secuencia núcleo es RGDS. Además,
existe una región denominada IIICS en el lado
C-terminal del dominio de unión a heparina. Una
región denominada CS-1 que consiste en 25
aminoácidos y que tiene una actividad de unión a
VLA-4 existe en III-CS (Deane F.
Momer, FIBRONECTIN, ACADEMIC PRESS INC., 1-8
(1988); Kimizuka F. et al., J. Biochem. 110,
284-291 (1991); Hanenberg H. et al., Human Gene
Therapy 8, 2193-2206 (1997)). Por último,
Mizobata S. et al., British Journal of Cancer, 74,
1598-1604, (1996) describe el uso de linfocitos
citotóxicos tratados con fibronectina en inmunoterapia adoptiva.
La invención proporciona un método para preparar
un linfocito citotóxico que tiene una actividad citotóxica a alto
nivel, que se usa de forma adecuada en el campo médico.
En concreto, la invención se refiere a:
- [1]
- un método para preparar un linfocito citotóxico o una preparación de linfocitos citotóxicos en donde dicho método comprende el paso de llevar a cabo al menos uno de inducción, mantenimiento y expansión de un linfocito citotóxico en presencia de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 12,
- [3]
- el método según el anterior [1], en donde el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 12 está inmovilizada en una fase sólida,
- [3]
- el método según el anterior [2], en donde la fase sólida es un equipo de cultivo celular o un soporte de cultivo de células,
- [4]
- un método según el anterior [3], en donde el equipo de cultivo celular es una placa de Petri, una botella o una bolsa, y el soporte de cultivo de células es bolas, una membrana o un portaobjetos de vidrio,
- [5]
- el método según los anteriores [1] o [2], en donde se lleva a cabo al menos uno de inducción, mantenimiento y expansión de un linfocito citotóxico en un medio que contiene el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 12,
- [6]
- el método según el anterior [1], que comprende llevar a cabo al menos uno de inducción, mantenimiento y expansión de un linfocito citotóxico en presencia del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 12 en un equipo de cultivo celular que contiene un medio, en donde el método satisface cualquiera de las condiciones de:
- (a)
- una relación del número de células al inicio del cultivo respecto a un área de cultivo en el equipo de cultivo celular que es de 1 célula/cm^{2} a 5 x 10^{5} células/cm^{2}; y
- (b)
- una concentración de células en un medio al inicio del cultivo que es de 1 célula/ml a 5 x 10^{5} células/ml,
- [7]
- el método según el anterior [6], en donde el método excluye un paso de dilución o un paso de intercambiar el equipo de cultivo celular,
- [8]
- el método según los anteriores [1] a [7], que comprende además el paso de transducir un gen exógeno en un linfocito citotóxico,
- [9]
- el método según el anterior [8], en donde el gen exógeno se transduce usando retrovirus, adenovirus, virus adenoasociado o virus simio,
- [10]
- un método in vitro para aumentar la expresión del receptor de interleuquina-2 de una célula, para mejorar la relación de células CD-8 positivas en una población de linfocitos citotóxicos o para mejorar o mantener la actividad citotóxica en un linfocito citotóxico caracterizado en que el método comprende el paso de llevar a cabo al menos uno de inducción, mantenimiento y expansión de un linfocito citotóxico en presencia de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 12.
La figura 1 es una vista esquemática que muestra
una estructura de dominios de fibronectina.
Los descubrimientos divulgados aquí han
completado que en el linfocito citotóxico preparado en presencia de
fibronectina y/o un fragmento de la misma, se mantiene una alta
actividad citotóxica, el nivel de expresión de IL-2R
aumenta significativamente y la relación de células CD8 positivas
mejora.
Dicho sea de paso, la preparación de un
linfocito citotóxico como se usa aquí se refiere a un paso que
abarca cada uno de los pasos de inducción (activación),
mantenimiento y expansión de la célula, o los pasos combinados de
los mismos. La preparación de un linfocito citotóxico como se
divulga aquí también se denomina cultivo de un linfocito
citotóxico.
La invención se explicará específicamente a
continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
La fibronectina y un fragmento de la misma como
se menciona aquí pueden ser los obtenidos de la naturaleza o los que
se sintetizan de forma artificial. La fibronectina y un fragmento de
la misma se pueden preparar en una forma sustancialmente pura a
partir de una sustancia de origen natural, en base a la divulgación
de Ruoslahti E. et al. [J. Biol. Chem.,
256(14), 7277-7281 (1981)]. El término
"fibronectina o fragmento de fibronectina sustancialmente pura"
como se cita aquí significa que estas fibronectina y fragmento de
fibronectina no contienen sustancialmente otras proteínas y
similares que existen junto a fibronectina en la naturaleza. Cada
uno de los anteriormente mencionados fibronectina y fragmento de la
misma se pueden usar aquí solos o en mezcla de tipos plurales.
La información útil respecto a los fragmentos de
fibronectina que se puede usar aquí y la preparación de los
fragmentos se puede obtener de Kimiduka F., et al. [J.
Biochem., 110, 284-291 (1991)],
Kornbrihtt A. R. et al. [EMBO J., 4(7),
1755-1759 (1985)], Sekiguchi K., et al.
[Biochemistry, 25(17),
4936-4941 (1986)], y similares.
El fragmento de fibronectina descrito aquí se
ejemplifica mediante, por ejemplo, un polipéptido que comprende una
secuencia de aminoácidos que comprende al menos cualquiera de las
regiones de III-8 (secuencia de aminoácidos mostrada
en SEQ ID NO: 1),
III-9 (secuencia de aminoácidos
mostrada en SEQ ID NO: 2),
III-10 (secuencia de aminoácidos
mostrada en SEQ ID NO: 3),
III-12 (secuencia de aminoácidos
mostrada en SEQ ID NO: 4),
III-13 (secuencia de aminoácidos
mostrada en SEQ ID NO: 5),
III-14 (secuencia de aminoácidos
mostrada en SEQ ID NO: 6),
y CS-1 (secuencia de aminoácidos
mostrada en SEQ ID NO: 7) (véase la figura 1).
Además, como el fragmento, se puede usar
preferiblemente un fragmento que tenga actividad de adhesión a
células y/o una actividad de unión a heparina. La actividad de
adhesión a células se puede evaluar ensayando la unión del fragmento
(su dominio de unión a células) usado aquí a una célula usando un
método conocido. Por ejemplo, el método mencionado anteriormente
incluye un método de Williams D. A., et al. [Nature,
352, 438-441 (1991)]. El método es un método
de determinar la unión de una célula a un fragmento inmovilizado en
una placa de cultivo. Además, se puede evaluar la actividad de unión
a heparina ensayando la unión del fragmento (su dominio de unión a
heparina) usado aquí a heparina usando un método conocido. Por
ejemplo, se puede evaluar la unión del fragmento a heparina de la
misma manera, usando heparina, por ejemplo, una heparina marcada en
lugar de la célula en el método anteriormente mencionado de Williams
D. A. y col.
Además, el fragmento de fibronectina se
ejemplifica mediante un polipéptido seleccionado de
C-274 (secuencia de aminoácidos
mostrada en SEQ ID NO: 8),
H-271 (secuencia de aminoácidos
mostrada en SEQ ID NO: 9),
H-296 (secuencia de aminoácidos
mostrada en SEQ ID NO: 10),
CH-271 (secuencia de aminoácidos
mostrada en SEQ ID NO: 11),
CH-296 (secuencia de aminoácidos
mostrada en SEQ ID NO: 12) o
C-CS1 (secuencia de aminoácidos
mostrada en SEQ ID NO: 13).
Cada uno de los fragmentos mencionados
anteriormente CH-271, CH-296,
C-274 y C-CS1 es un polipéptido que
tiene un dominio de unión a células con actividad de unión a
VLA-5. Además, C-CS1,
H-296 o CH-296 es un polipéptido que
tiene un dominio de unión a células con actividad de unión a
VLA-4. Además, H-271,
H-296, CH-271 o
CH-296 es un polipéptido que tiene un dominio de
unión a heparina.
También se puede usar un fragmento en el que
cada uno de los dominios anteriores está modificado. El dominio de
unión a heparina de la fibronectina está constituido por tres
secuencias de tipo III (III-12,
III-13 y III-14). También se puede
usar aquí un fragmento que contiene un dominio de unión a heparina
que tiene una deleción de una o dos de las secuencias de tipo III.
Por ejemplo, los fragmentos se puede ejemplificar mediante
CHV-89 (secuencia de aminoácidos
mostrada en SEQ ID NO: 14),
CHV-90 (secuencia de aminoácidos
mostrada en SEQ ID NO: 15) o
CHV-92 (secuencia de aminoácidos
mostrada en SEQ ID NO: 16),
que es un fragmento en el que están unidos un
sitio de unión a células de la fibronectina (dominio de unión a
VLA-5: Pro1239 a Ser1515) y una de las secuencias de
tipo III, o CHV-179 (secuencia de aminoácidos
mostrada en SEQ ID NO: 17) o CHV-181 (secuencia de
aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 18), que es un fragmento en el
que están unidos el sitio de unión a células de la fibronectina y
dos de las secuencias de tipo III. CHV-89,
CHV-90 y CHV-92 contienen
III-13, III-14 y
III-12, respectivamente, y CHV-179
contiene III-13 y III-14, y
CHV-181 contiene III-12 y
III-13, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Además, se puede usar aquí un fragmento que
tiene la adición de un aminoácido adicional a cada uno de los
fragmentos mencionados anteriormente. Por ejemplo, se puede preparar
el fragmento añadiendo un aminoácido deseado a cada uno de los
fragmentos mencionados anteriormente según el método para preparar
H-275-Cys descrito en los ejemplos
de preparación explicado posteriormente. Por ejemplo,
H-275-Cys (secuencia de aminoácidos
mostrada en SEQ ID NO: 19) es un fragmento que tiene un dominio de
unión a heparina de la fibronectina y un residuo de cisteína en
C-terminal.
El fragmento descrito aquí puede ser esos que
comprenden un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos
que tiene una sustitución, deleción, inserción o adición de uno o
más aminoácidos en una secuencia de aminoácidos de un polipéptido
que constituye un fragmento que contiene al menos parcialmente una
secuencia de aminoácidos de la fibronectina natural ejemplificada
anteriormente, en donde el polipéptido tiene una función equivalente
al fragmento, siempre que se obtengan los efectos deseados como se
describen aquí.
Es preferible que la sustitución o similar de
los aminoácidos se lleve a cabo a un grado que pueda cambiar las
características fisicoquímicas y similares de un polipéptido
inherente en el intervalo que se puede mantener la función del
polipéptido. Por ejemplo, la sustitución o similar de aminoácidos es
conservadora, en el intervalo que las características que posee
inherentemente el polipéptido (por ejemplo, hidrofobicidad,
hidrofilicidad, carga eléctrica, pK y similares) no cambian
sustancialmente. Por ejemplo, la sustitución de los aminoácidos es
sustituciones dentro de cada uno de los grupos de: 1) glicina,
alanina; 2) valina, isoleucina, leucina; 3) ácido aspártico, ácido
glutámico, asparraguina, glutamina; 4) serina, treonina; 5) lisina,
arginina; 6) fenilalanina, tirosina. La deleción, adición o
inserción de aminoácidos es deleción, adición o inserción en los
aminoácidos que tienen características similares a las
características de los alrededores del sitio sujeto en el
polipéptido dentro del intervalo que las características de los
alrededores del sitio sujeto no cambian sustancialmente.
Además, la frase "que tiene una función
equivalente" se refiere a que tiene al menos cualquiera de las
funciones de (i) una función de mantener una actividad citotóxica de
un linfocito citotóxico, (ii) una función de aumentar un nivel de
expresión de IL-2R o (iii) una función de mejorar
una relación de células CD8 positivas. Si el fragmento que comprende
un polipéptido que tiene sustitución o similar de aminoácidos tiene
esas funciones o no se puede confirmar de forma apropiada según el
método descrito en los ejemplos como se explica posteriormente.
Además, como el fragmento que comprende un polipéptido que tiene una
sustitución o similar de aminoácidos, se prefiere el fragmento que
tiene actividad de adhesión a células y/o una actividad de unión a
heparina. La actividad de adhesión a células y la actividad de unión
a heparina se pueden evaluar según los métodos anteriormente
mencionados para determinar esas actividades.
Como el fragmento que comprende un polipéptido
que tiene una sustitución o similar de aminoácidos, por ejemplo,
también se puede usar aquí un fragmento que tiene uno o más
aminoácidos insertados como un enlazador entre dos dominios
diferentes.
Por cierto, como la fibronectina por si, de
forma similar, se puede usar aquí un polipéptido que tiene una
secuencia de aminoácidos que tiene una sustitución, deleción,
inserción o adición de uno o más aminoácidos en una secuencia de
aminoácidos que constituye el polipéptido de la fibronectina, en
donde el polipéptido tiene al menos cualquiera de las funciones de
los anteriormente mencionados (i) a (iii).
El fragmento de fibronectina como se cita aquí
también se puede preparar a partir de un recombinante genético
basado en la descripción de, por ejemplo, la patente de EE UU No.
5.198.423. Por ejemplo, se describen en detalle cada uno de los
fragmentos de H-271 (SEQ ID NO: 9),
H-296 (SEQ ID NO: 10), CH-271 (SEQ
ID NO: 11) y CH-296 (SEQ ID NO: 12) y un método de
preparar estos fragmentos en la especificación de esta patente.
Además, el fragmento mencionado anteriormente C-274
(SEQ ID NO: 8) se puede obtener según el método descrito en la
patente de EE UU No. 5.102.988. Además, se puede obtener un
fragmento C-CS1 (SEQ ID NO: 13) según el método
descrito en el boletín de patente japonesa No. 3104178. Se puede
obtener cada uno de los fragmentos CHV-89 (SEQ ID
NO: 14), CHV-90 (SEQ ID NO: 15) o
CHV-179 (SEQ ID NO: 17) según el método descrito en
el boletín de patente japonesa No. 2729712. Además, se puede obtener
el fragmento CHV-181 (SEQ ID NO: 18) según el método
descrito en el documento WO 97/18318. Se puede obtener el fragmento
CHV-92 (SEQ ID NO: 16) mediante técnica de
manipulación genética usando un plásmido construido de una manera
normal basado en el plásmido descrito en esta bibliografía con
referencia al boletín de patente japonesa No. 2729712 y WO
97/18318.
Se pueden preparar estos fragmentos o fragmentos
que pueden derivar de estos fragmentos de una manera normal usando
microorganismos depositados en el Depositario Internacional de
Organismos de Patentes, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología
Avanzada, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi
1-chome, Tsukuba-shi,
Ibaraki-ken, Japón (código postal
305-8566) con los siguientes números de acceso, o
modificando un plásmido que lleva cada microorganismo según un
método conocido.
FERM BP-2264 (Escherichia
coli que lleva un plásmido que codifica H-271,
fecha de depósito: 30 de enero, 1989);
FERM BP-2800 (Escherichia
coli que lleva un plásmido que codifica CH-296,
fecha de depósito: 12 de mayo, 1989);
FERM BP-2799 (Escherichia
coli que lleva un plásmido que codifica H-271,
fecha de depósito: 12 de mayo, 1989);
FERM BP-7420 (Escherichia
coli que lleva un plásmido que codifica H-296,
fecha de depósito: 12 de mayo, 1989);
FERM BP-1915 (Escherichia
coli que lleva un plásmido que codifica C-274,
fecha de depósito: 17 de junio, 1988);
FERM BP-5723 (Escherichia
coli que lleva un plásmido que codifica C-CS1,
fecha de depósito: 5 de marzo, 1990);
FERM P-12182 (Escherichia
coli que lleva un plásmido que codifica CHV-89,
fecha de depósito: 8 de abril, 1991) y
FERM P-12183 (Escherichia
coli que lleva un plásmido que codifica CHV-179,
fecha de depósito: 8 de abril, 1991).
Puesto que la fibronectina es una glicoproteína
gigantesca, no es necesariamente fácil preparar y usar una proteína
natural para el propósito industrial y para el propósito de la
preparación del medicamento. Además, la fibronectina existe en una
gran cantidad en plasma en un cuerpo vivo. Por tanto, cuando se usa
una fibronectina obtenida de plasma como preparación sanguínea, hay
un riesgo de contaminación de componentes diferentes de la
fibronectina, de modo que se considera que hay un problema desde el
aspecto de la seguridad. Además, puesto que la fibronectina es una
proteína multifuncional, se pueden considerar ciertas desventajas
producidas por una región diferente de la región que muestra el
efecto por el método descrito aquí dependiendo de las circunstancias
de su uso. Por estas razones, se puede usar preferiblemente aquí un
fragmento de fibronectina, más preferiblemente se puede usar un
fragmento de fibronectina recombinante obtenido como se ha descrito
anteriormente desde los puntos de vista de disponibilidad, manejo
fácil y seguridad. Además, se puede usar en especial preferiblemente
un fragmento de fibronectina que puede mostrar un efecto tal como
mejora en una relación de expansión de un linfocito, aumento en un
nivel de expresión de IL-2R en un linfocito
expandido o mejora en una relación de células CD8 positivas en una
población expandida de linfocitos como se describe posteriormente.
Además, el peso molecular del fragmento de fibronectina descrito
aquí es, pero no está particularmente limitado a, preferiblemente de
1 a 200 kD, más preferiblemente de 5 a 190 kD, incluso más
preferiblemente de 10 a 180 kD.
\vskip1.000000\baselineskip
El método descrito aquí para preparar el
linfocito citotóxico se explicará concretamente a continuación. El
método descrito aquí es un método para preparar linfocitos
citotóxicos que comprende el paso de llevar a cabo al menos
cualquiera de inducción, mantenimiento y expansión de un linfocito
citotóxico en presencia de la fibronectina mencionada anteriormente,
un fragmento de la misma o una mezcla de los mismos.
El "linfocito citotóxico" como se usa aquí
significa un grupo de células que contienen un linfocito citotóxico.
En un sentido estricto, se puede denominar linfocito citotóxico solo
a un linfocito citotóxico contenido en el grupo de células
mencionado anteriormente en algunos casos. Además, la preparación
del linfocito citotóxico como se describe aquí abarca cualquiera de
inducción a partir de una célula precursora que puede formar el
linfocito como se describe aquí a un linfocito que tiene una
actividad citotóxica, mantenimiento del linfocito citotóxico y
expansión del linfocito citotóxico usando el linfocito citotóxico
y/o la célula precursora.
El linfocito citotóxico descrito aquí incluye,
pero no está particularmente limitado a, por ejemplo, célula T
citotóxica (CTL), célula citolítica activada por linfoquinas (LAK),
linfocito infiltrante en tumores (TIL), célula NK y similares, cada
uno tiene una actividad citotóxica específica de antígeno.
La célula precursora descrita aquí que se puede
transformar en un linfocito citotóxico, es decir, la célula
precursora que tiene la capacidad de diferenciarse al linfocito, se
ejemplifica por PBMC, célula NK, célula indiferenciada, célula de
memoria, célula troncal hematopoyética, célula mononuclear de sangre
de cordón umbilical y similar. Además, siempre que la célula sea un
hemocito, la célula se puede usar aquí como célula precursora.
Cualquiera de estas células que se recogen de un cuerpo vivo se
pueden usar directamente o se pueden usar las que se someten a
almacenamiento congelado. Por cierto, en el método descrito aquí
para preparar un linfocito citotóxico, se puede usar un material que
contenga las células mencionadas anteriormente, por ejemplo, sangre
tal como sangre periférica o sangre de cordón umbilical; uno
obtenido eliminando componentes tales como eritrocitos y plasma de
la sangre, un líquido medular y similares.
Una de las características principales del
método para preparar un linfocito citotóxico de la presente
invención reside en que el linfocito citotóxico se prepara en
presencia de un ingrediente eficaz seleccionado de fibronectina, un
fragmento de la misma o una mezcla de los mismos.
En el método descrito aquí, la inducción,
mantenimiento y/o expansión del linfocito citotóxico normalmente se
realiza en un medio que contiene componentes determinados en
presencia del ingrediente eficaz anteriormente mencionado.
Por ejemplo, en el método descrito aquí cuando
se pretende la inducción o expansión del linfocito citotóxico, el
número de células (linfocitos citotóxicos y/o células precursoras)
al inicio del cultivo usado aquí no está particularmente limitado.
Por ejemplo, el número es preferiblemente de 1 a 1 x 10^{8}
células/ml. Además, las condiciones de cultivo no están
particularmente limitadas, y se pueden emplear condiciones normales
para cultivo de células. Por ejemplo, las células se pueden cultivar
en condiciones de 37ºC en presencia de CO_{2} al 5% y similares.
Además, el medio se puede intercambiar con medio reciente a
intervalos apropiados.
El medio usado en el método descrito aquí para
preparar un linfocito citotóxico no está particularmente limitado, y
se puede usar un medio conocido preparado mezclando componentes
necesarios para el mantenimiento y crecimiento un linfocito
citotóxico o su célula precursora. Por ejemplo, se puede usar medio
comercialmente disponible. Estos medios pueden contener proteínas
apropiadas, citoquinas y otros componentes además de los
constituyentes inherentes. Preferiblemente, aquí se usa un medio que
contiene IL-2. La concentración de
IL-2 en el medio es, pero no está particularmente
limitada a, por ejemplo, preferiblemente de 0,01 a 1 x 10^{5}
U/ml, más preferiblemente de
0,1 a 1 x 10^{4} U/ml.
0,1 a 1 x 10^{4} U/ml.
Además, se puede cocultivar una célula
precursora que puede formar un linfocito citotóxico en un medio que
contiene además un anticuerpo anti-CD3. La
concentración del anticuerpo anti-CD3 en el medio
es, pero no está particularmente limitada a, por ejemplo,
preferiblemente desde 0,01 a 100 \mug/ml. El anticuerpo
anti-CD3 se puede añadir con el propósito de activar
un receptor en un linfocito. Además de lo anterior, también se puede
añadir un factor estimulante de linfocitos tal como lecitina. La
concentración del componente en un medio no está particularmente
limitada, siempre se que puedan obtener los efectos deseados.
Además de la coexistencia de estos componentes
disolviendo los componentes en un medio, se pueden usar mediante
inmovilización a una fase sólida apropiada, por ejemplo, un equipo
de cultivo celular (incluyendo cualquiera de los de sistema abierto
y sistema cerrado), tal como una placa de petri, una botella o una
bolsa, o a un soporte de cultivo celular tal como bolas, una
membrana o un portaobjetos de vidrio. Los materiales para esas fases
sólidas no están particularmente limitados siempre que los
materiales se puedan usar para cultivo de células. Cuando los
componentes se inmovilizan en, por ejemplo, el equipo anteriormente
mencionado, es preferible inmovilizar una cantidad determinada de
cada componente respecto a la cantidad del medio a colocar en el
equipo de modo que el medio tenga una proporción similar a una
concentración deseada del caso en que los componentes se usan
disolviendo los componentes en un medio después de colocar el medio
en el equipo. La cantidad de los componentes inmovilizados no está
particularmente limitada, siempre que se puedan obtener los efectos
deseados. El soporte mencionado anteriormente se usa sumergiendo el
soporte en un medio de cultivo en el equipo de cultivo celular
durante el cultivo de células. Cuando los componentes anteriormente
mencionados se inmovilizan en el soporte anteriormente mencionado,
es preferible inmovilizar una cantidad determinada de cada
componente respecto a la cantidad de medio a ser colocada en el
equipo de modo que el medio tenga una proporción similar a una
concentración deseada del caso donde los componentes se usan
disolviendo los componentes en un medio tras colocar el soporte en
el medio. La cantidad de los componentes inmovilizados no está
particularmente limitada, siempre que se puedan obtener los efectos
deseados.
En ambos casos, la inmovilización de los
componentes anteriormente mencionados se puede llevar a cabo
mediante un método conocido, por ejemplo, un método para inmovilizar
un fragmento de fibronectina explicado posteriormente.
Además, se puede usar junto con los componentes
mencionados anteriormente un compuesto seleccionado del grupo que
consiste en polisacáridos ácidos, oligosacáridos ácidos,
monosacáridos ácidos y sales de los mismos que son eficaces para la
inducción de una célula T citotóxica que tiene actividad citotóxica
específica de antígeno, descrita en el documento WO 02/14481, o una
sustancia seleccionada de los siguientes (A) a (D):
- (A)
- una sustancia que tiene una actividad de unión a CD44;
- (B)
- una sustancia capaz de regular una señal emitida por la unión de un ligando de CD44 a CD44;
- (C)
- una sustancia capaz de inhibir la unión de un factor de crecimiento a un receptor de factor de crecimiento; y
- (D)
- una sustancia capaz de regular una señal emitida por la unión de un factor de crecimiento a un receptor de factor de crecimiento.
\vskip1.000000\baselineskip
La sustancia mencionada anteriormente que tiene
una actividad de unión a CD44 se ejemplifica mediante, por ejemplo,
un ligando de CD44 y/o un anticuerpo anti-CD44. La
sustancia capaz de regular una señal emitida por la unión de un
ligando de CD44 a CD44 incluye, por ejemplo, varios inhibidores para
fosfoenzimas. La sustancia capaz de inhibir la unión de un factor de
crecimiento al receptor de un factor de crecimiento incluye, por
ejemplo, una sustancia que tiene actividad de unión a un factor de
crecimiento y que forma un complejo con el factor de crecimiento,
inhibiendo de esta manera la unión del factor de crecimiento al
receptor del factor de crecimiento, o una sustancia que tiene
actividad de unión a un receptor de un factor de crecimiento,
inhibiendo de esta manera la unión del factor de crecimiento al
receptor del factor de crecimiento. Además, la sustancia capaz de
regular una señal emitida por la unión de un factor de crecimiento a
un receptor del factor de crecimiento incluye, por ejemplo, varios
inhibidores para fosfoenzimas. La concentración de estos componentes
en el medio no está particularmente limitada, siempre que se puedan
obtener los efectos deseados. Además, estos componentes se pueden
usar mediante inmovilización a la fase sólida apropiada como se ha
mencionado anteriormente además de la coexistencia de estos
componentes en medio disolviendo los componentes en el medio.
Aquí, cada una de las varias sustancias
mencionadas anteriormente se pueden usar solas o en mezcla de dos o
más tipos.
La frase "en presencia del ingrediente eficaz
mencionado anteriormente" se refiere al hecho de que el
ingrediente eficaz esté presente en un estado en que el ingrediente
eficaz anteriormente mencionado pueda mostrar su función cuando se
lleva a cabo la inducción, mantenimiento y expansión del linfocito
citotóxico, y la manera existente no está particularmente limitada.
Por ejemplo, cuando el ingrediente eficaz está disuelto en el medio
a ser usado, el contenido del ingrediente eficaz de la presente
invención en el medio en el que se lleva a cabo el cocultivo no está
particularmente limitado, siempre que se obtengan los efectos
deseados. El contenido del ingrediente eficaz es, por ejemplo,
preferiblemente desde 0,01 hasta 1000 \mug/ml, más preferiblemente
desde 0,1 hasta 1000 \mug/ml, incluso más preferiblemente desde 1
hasta 100 \mug/ml. Además de la coexistencia del ingrediente
eficaz disolviendo el ingrediente eficaz en un medio como antes, se
puede usar mediante inmovilización a una fase sólida apropiada, por
ejemplo, un equipo de cultivo celular (incluyendo cualquiera de los
de sistema abierto y sistema cerrado), tales como una placa de
petri, una botella o una bolsa, o a un soporte de cultivo de células
tal como bolas, una membrana o un portaobjetos de vidrio. Desde el
punto de vista de administrar el linfocito citotóxico a un cuerpo
vivo, se desea que el ingrediente eficaz anteriormente mencionado
esté inmovilizado, pero no está particularmente limitado a ello.
\newpage
Una vez que varios componentes mencionados
anteriormente o el ingrediente eficaz descrito aquí se inmoviliza a
la fase sólida, el linfocito citotóxico se puede separar fácilmente
del ingrediente eficaz o similar después de obtener el linfocito
mediante el método descrito aquí solamente separando el linfocito de
la fase sólida, de modo que se pueda prevenir la contaminación del
ingrediente eficaz en el linfocito.
Cuando el ingrediente eficaz descrito aquí se
inmoviliza a, por ejemplo, el equipo anteriormente mencionado, es
preferible inmovilizar una cantidad determinada de cada ingrediente
eficaz respecto a la cantidad de medio a ser colocada en el equipo
de modo que el medio tenga una proporción similar a una
concentración deseada en un caso donde el ingrediente eficaz se usa
disolviendo el ingrediente eficaz en un medio tras colocar el medio
en el equipo. La cantidad del ingrediente eficaz no está
particularmente limitada, siempre que se obtengan los efectos
deseados. Cuando el ingrediente eficaz se inmoviliza al soporte
anteriormente mencionado, es preferible inmovilizar una cantidad
determinada de cada ingrediente eficaz respecto a la cantidad de
medio a ser colocada en un equipo de modo que el medio tenga una
proporción similar a una concentración deseada en un caso donde el
ingrediente eficaz se usa disolviendo el ingrediente eficaz en un
medio tras colocar el soporte en el medio. La cantidad del
ingrediente eficaz no está particularmente limitada, siempre que se
obtengan los efectos deseados.
Por ejemplo, la inmovilización del fragmento de
fibronectina se puede llevar a cabo según los métodos descritos en
los documentos WO 97/18318 y WO 00/09168.
Cuando se determina el nivel de expresión de
IL-2R para el linfocito citotóxico obtenido mediante
el método descrito aquí, se reconoce un aumento significativo en el
nivel de expresión de IL-2R comparado con un
linfocito citotóxico obtenido al llevar a cabo al menos cualquiera
de inducción, mantenimiento y expansión en ausencia de fibronectina,
un fragmento de la misma o una mezcla de los mismos. Aquí, se puede
determinar el nivel de expresión de IL-2R por un
método conocido, por ejemplo, usando un anticuerpo
anti-IL-2R.
Como se ha descrito anteriormente, el linfocito
citotóxico obtenido por el método descrito aquí tiene un nivel de
expresión aumentado de IL-2R. IL-2R
es un marcador de activación que se expresa en la superficie de una
célula T activada, y con la expresión de esta molécula, se activa la
producción de citoquinas, actividad citotóxica, activación de
proliferación o similares. Por tanto, el linfocito citotóxico
obtenido por el método descrito aquí es un grupo de células que
tiene una función alta.
Además, puesto que el linfocito citotóxico
obtenido por el método descrito aquí tiene un nivel de expresión
aumentado de IL-2R, el linfocito citotóxico tiene
una sensibilidad aumentada a estimulación por IL-2
añadida al medio, o IL-2 producida por una célula
precursora de un linfocito citotóxico, un linfocito mismo u otra
célula coexistente. Por esta razón, el linfocito citotóxico se puede
activar a si mismo incluso en un medio de una cantidad menor de
IL-2 (por ejemplo, en un cuerpo vivo o similar).
Además, en el linfocito citotóxico obtenido por
el método descrito aquí, la relación de existencia de células (CD8
positivas) que tienen un marcador CD8 es alta comparada con la del
linfocito citotóxico obtenido llevando a cabo al menos cualquiera de
inducción, mantenimiento y expansión en ausencia de fibronectina, un
fragmento de la misma o una mezcla de los mismos. Este hecho tiene
algunas ventajas, por ejemplo, 1) que la célula CD8 positiva produce
una citoquina tal como interferón-\gamma,
produciendo de esta manera activación inmunológica para cambiar un
equilibrio de células T cooperadoras en el sistema dominante Th1, 2)
que la célula CD8 positiva es un inmunocito celular que puede
excluir de forma eficaz una sustancia exógena tal como un virus o
una célula tumoral, 3) que cuando se obtiene la célula CD8 positiva,
la célula CD8 positiva se puede enriquecer cultivando la célula
según el método descrito aquí mientras que la célula CD8 se ha
purificado convencionalmente con bolas magnéticas o un citómetro de
flujo, 4) que el linfocito citotóxico se usa adecuadamente como una
célula precursora durante la inducción de CTL, porque la relación de
células CD8 positivas es alta; 5) que incluso una población de
células que tiene una relación menor de la célula CD8 positiva se
puede cultivar aumentado la relación de la célula CD8 positiva y
similares. Por tanto, el método descrito aquí es muy útil en la
preparación de un linfocito citotóxico.
Aquí, la relación de la célula CD8 positiva en
el linfocito citotóxico obtenido por el método descrito aquí se
puede determinar, por ejemplo, pero no particularmente limitado a,
usando un anticuerpo anti-CD8.
Además, el linfocito citotóxico, en especial
CTL, preparado según el método descrito aquí tiene una
característica excelente de que no hay disminución drástica en
actividad citotóxica como se había observado previamente, incluso
cuando una célula después del cultivo se mantiene durante un largo
periodo de tiempo, o la célula prolifera. En otras palabras, el
linfocito citotóxico mantiene una alta actividad citotóxica
comparado con un linfocito citotóxico obtenido llevando a cabo al
menos cualquiera de inducción, mantenimiento y expansión en ausencia
de fibronectina, un fragmento de la misma o una mezcla de los
mismos. Por tanto, se puede mantener como un linfocito que tiene una
actividad citotóxica estable clonando el linfocito citotóxico
cultivado. Además, el CTL inducido puede proliferar y expandirse
estimulando el CTL con un antígeno, varios tipos de citoquinas o un
anticuerpo anti-CD3. Se puede usar un método
conocido para el mantenimiento o expansión del linfocito citotóxico
sin estar particularmente limitado.
El mantenimiento del linfocito citotóxico
anteriormente mencionado se refiere al mantenimiento del linfocito
citotóxico manteniendo su actividad citotóxica. Las condiciones de
cultivo durante el mantenimiento no están particularmente limitadas,
y se pueden usar las condiciones usadas para cultivo de células
normal. Por ejemplo, se pueden cultivar las células en las
condiciones de 37ºC y en presencia de CO_{2} al 5% y similares.
Además, el medio se puede intercambiar por uno reciente a los
intervalos de tiempo apropiados. El medio a ser usado y otros
componentes simultáneamente usados con el mismo y similares son
iguales a los mencionados anteriormente.
Una de las características principales del
mantenimiento y expansión del linfocito citotóxico en el método
descrito aquí reside en que el método comprende respectivamente
cultivo y expansión continuos del linfocito citotóxico en un medio
en presencia del ingrediente eficaz descrito aquí, es decir,
fibronectina, un fragmento de la misma o una mezcla de los mismos.
Según la expansión, el número de células del linfocito citotóxico
puede aumentar en un estado que se mantenga la actividad citotóxica
que posee el linfocito citotóxico. En otras palabras, aquí se
proporciona un método para expandir un linfocito citotóxico. En el
método descrito aquí para expandir el linfocito citotóxico, las
condiciones de cultivo no están particularmente limitadas y se
pueden usar condiciones normales usadas para cultivo de células. Por
ejemplo, se pueden cultivar las células en las condiciones de 37ºC y
en presencia de CO_{2} al 5% y similares. Además, el medio se
puede intercambiar por una reciente a los intervalos de tiempo
apropiados. El medio a ser usado y otros componentes simultáneamente
usados con el mismo y similares son iguales a los mencionados
anteriormente.
Según el método descrito aquí para la expansión,
por ejemplo, en el caso de expansión de CTL, se pueden obtener CTL
cuyo número de células aumenta de 100 a 1000 veces por expansión
durante 14 días. Además, como ejemplo del caso de expansión de una
célula LAK, se pueden obtener células LAK aumentadas en alrededor de
200 veces cultivando la célula durante 7 días, y en alrededor de
1000 veces cultivando la célula durante 9 días. Además, el linfocito
citotóxico así obtenido, especialmente CTL, tiene una actividad
citotóxica mayor comparado con uno obtenido por un método
convencional para expandir un linfocito citotóxico, por ejemplo, un
método REM o un método REM modificado. Los efectos como se han
descrito anteriormente se pueden confirmar determinando la actividad
citotóxica que posee el CTL o similar expandido por el método
descrito aquí, según el método descrito en los ejemplos mostrados
posteriormente.
Además, el método descrito aquí para preparar un
linfocito citotóxico tiene la característica de que el cultivo se
puede iniciar a un número bajo de células. Se requiere una gran
cantidad de linfocitos para llevar a cabo inmunoterapia adoptada,
pero es difícil obtener una gran cantidad de linfocitos de un
paciente. Además, en una expansión normal del linfocito citotóxico,
se necesita selección de un equipo de cultivo celular que tiene un
área de cultivo apropiada dependiendo del número de células a ser
usadas, y cultivar en una cantidad apropiada de medio. En otras
palabras, normalmente, el cultivo se inicia en condiciones de alta
densidad que la cantidad (número) de células respecto de un área de
cultivo en un equipo de cultivo celular [es decir, área (cm^{2})
de un área de superficie del equipo en contacto con el medio] es 1 x
10^{6} células/cm^{2} o más, y la concentración de células es 1
x 10^{6} células/ml o más. Cuando el cultivo se lleva a cabo en
condiciones por debajo de este nivel celular, una relación de
expansión [una relación del número de células después de la
expansión respecto al número de células antes de la expansión
(número de células después de la expansión/número de células antes
de la expansión)] se hace muy bajo, requiriendo de esta manera un
periodo de cultivo a largo plazo antes de obtener los linfocitos
citotóxicos en una gran cantidad. Por tanto, en general, actualmente
se preparan un gran número de linfocitos, por ejemplo, iniciando el
cultivo usando un equipo de cultivo celular pequeño, y después de
ello usando un equipo de cultivo de gran escala por pasos, o un
método de aumentar el número de equipos de cultivo celular y
repitiendo procedimientos de dilución. Como se ha descrito
anteriormente, se requieren una pluralidad de sistemas de cultivo en
la expansión normal del linfocito citotóxico.
Según el método descrito aquí, incluso cuando se
inicia con una cantidad pequeña de células, la célula se puede
cultivar con una gran relación de expansión independientemente del
tamaño del equipo de cultivo celular. Por tanto, se hace innecesario
un procedimiento complicado tal como un intercambio del equipo de
cultivo celular y los procedimientos de dilución como se describen
anteriormente. En otras palabras, según el método descrito aquí, la
expansión del linfocito citotóxico se puede llevar a cabo de forma
satisfactoria mediante procedimientos de cultivo que usan un equipo
de cultivo celular, es decir un sistema de cultivo. Por tanto, el
método como se describe aquí es un método para preparar un linfocito
citotóxico que excluye el paso de dilución o el paso de intercambiar
un equipo de cultivo celular. En especial, cuando se expande una
célula LAK según el método descrito aquí, la célula LAK se puede
expandir añadiendo una célula que puede formar una célula LAK y un
medio a un equipo de cultivo celular de gran volumen, y añadiendo
solo IL-2 al mismo en pasos posteriores. La
invención es muy útil en el aspecto de que se puede obtener una gran
cantidad de células LAK mediante un procedimiento sencillo. Aquí, el
fragmento de fibronectina se puede usar preferiblemente como el
ingrediente eficaz de la presente invención a ser usado desde el
punto de vista de obtener una mayor relación de expansión. Como se
describe anteriormente, según el método descrito aquí, se puede
obtener una cantidad necesaria del linfocito citotóxico en un
periodo de tiempo más corto.
Por ejemplo, cuando se inicia al menos
cualquiera de inducción, mantenimiento y expansión de un linfocito
citotóxico a un número bajo de células en un equipo de cultivo
celular que contiene un medio en presencia del ingrediente eficaz
descrito aquí, se puede llevar a cabo la inducción, mantenimiento o
expansión usando una cantidad de células que satisface las
condiciones seleccionadas de las siguientes (a) y (b) al inicio del
cultivo:
(a) la relación de la cantidad de células
respecto al área de cultivo en el equipo de cultivo celular a ser
usado es preferiblemente de 1 a 5 x 10^{5} células/cm^{2}, más
preferiblemente de 10 a 1 x 10^{5} células/cm^{2}, en especial
preferiblemente de 1 x 10^{2} hasta 5 x 10^{4} células/cm^{2};
y
(b) la concentración de las células en el medio
es preferiblemente de 1 hasta 5 x 10^{5} células/ml, más
preferiblemente de 10 hasta 1 x 10^{5} células/ml, en especial
preferiblemente de 1 x 10^{2} hasta 5 x 10^{4} células/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
La cantidad de células usada aquí se refiere al
número de linfocitos citotóxicos y/o células precursoras.
Además, en el método descrito aquí, se puede
ejemplificar un método que comprende llevar a cabo al menos
cualquiera de inducción, mantenimiento y expansión de un linfocito
citotóxico en un sistema de cultivo, que excluye el paso de
intercambio de un equipo de cultivo celular o el paso del
procedimiento de dilución.
El método descrito aquí se explicará tomando
como ejemplo la preparación de CTL.
La inducción de CTL se lleva a cabo incubando
(cultivando) una célula precursora capaz de diferenciarse a CTL
junto con una célula presentadora de antígeno apropiada en presencia
del ingrediente eficaz mencionado anteriormente en, por ejemplo,
cualquier medio, para dar al CTL una capacidad de reconocer el
antígeno deseado. La célula precursora no está particularmente
limitada, siempre que la célula precursora sea una célula que está
en una fase antes de que la célula se transforme en CTL y destinada
a diferenciarse a CTL, e incluye, por ejemplo, célula mononuclear de
sangre periférica (PBMC), célula indiferenciada, célula de memoria,
célula mononuclear de sangre de cordón umbilical, célula troncal
hematopoyética y similares. La célula presentadora de antígeno no
está particularmente limitada, siempre que la célula tenga la
capacidad de presentar un antígeno a ser reconocido por la célula T.
Por ejemplo, aquí se puede usar una célula mononuclear, célula B,
célula T, macrófago, célula dendrítica, fibroblasto o similar a la
que se permite presentar un antígeno deseado.
Las condiciones de cultivo como se divulgan aquí
para una célula precursora o similar durante la preparación de CTL
se pueden, por ejemplo, ajustar según condiciones conocidas en
general [véase, por ejemplo, Carter J. et al., Immunology
57(1), 123-129 (1986)].
Además, la célula se puede cocultivar con una
célula alimentadora apropiada. Cuando se cocultiva el CTL con la
célula alimentadora, se desea que el medio sea uno adecuado para el
mantenimiento y crecimiento tanto del CTL como de la célula
alimentadora. Como medio, se puede usar un medio comercialmente
disponible.
La célula alimentadora usada para el método
descrito aquí no está particularmente limitada, siempre que la
célula alimentadora estimule el CTL de forma cooperativa con un
anticuerpo anti-CD3 para activar el receptor de
células T. Por ejemplo, se usan aquí PBMC o célula B transformada
con el virus de Epstein-Barr (célula
B-EBV). Normalmente, se usa una célula alimentadora
después de eliminar su capacidad de proliferación por medio de
irradiación o similar. Por cierto, el contenido de la célula
alimentadora en el medio se puede determinar según condiciones
conocidas. Por ejemplo, el contenido es preferiblemente de 1 x
10^{5-7} células/ml.
Aquí se usa particularmente una célula no
infectada por virus, por ejemplo, una célula diferente de célula
B-EBV como célula alimentadora. Usando la célula no
infectada con virus, se puede eliminar la posibilidad de que la
célula B-EBV se mezcle con un CTL expandido,
haciendo de esta manera posible aumentar la seguridad en
tratamientos médicos que utilizan CTL, tal como la inmunoterapia
adoptiva.
La célula presentadora de antígeno se puede
preparar añadiendo un péptido antigénico a una célula que tiene una
capacidad presentadora de antígeno, dejando de esta manera que la
célula presente el péptido antigénico en su superficie [véase, por
ejemplo, Bendnarek M. A. et al., J. Immunol.
147(12), 4047-4053 (1991)]. Además, en
el caso donde una célula que tiene capacidad de presentar antígeno
tiene capacidad de procesar un antígeno, se añade un antígeno a la
célula, de modo que se incorpore el antígeno en la célula y se
procese en la misma, y se presentan los péptidos antigénicos
fragmentados en la superficie de la célula. Por cierto, cuando se
añade un péptido antigénico a una célula que tiene capacidad de
presentar antígenos se usa un péptido antigénico que se ajusta a la
restricción de MHC de la célula presentadora de antígeno usada y el
CTL a ser inducido.
Por cierto, el antígeno usado aquí no está
particularmente limitado e incluye, por ejemplo, antígenos exógenos
tales como bacterias y virus, antígenos endógenos tales como
antígenos asociados a tumor (antígenos cancerosos) y similares.
Es preferible que la célula presentadora de
antígeno se haga aquí no proliferativa. Para hacer la célula no
proliferativa, la célula se puede, por ejemplo, someter a
irradiación con rayos X o similar, o a un tratamiento con un agente
tal como mitomicina.
Las condiciones comunes para incubar
(cocultivar) aquí una célula precursora capaz de diferenciarse a CTL
junto con una célula presentadora de antígeno en presencia de un
ingrediente eficaz seleccionado de fibronectina, un fragmento de la
misma o una mezcla de los mismos para inducir CTL pueden ser
condiciones conocidas [véase, por ejemplo, Bendnarek M. A. et
al., J. Immunol. 147(12),
4047-4053 (1991)]. Las condiciones de cocultivo no
están particularmente limitadas y se pueden usar las condiciones
normalmente usadas para el cultivo celular. Por ejemplo, las células
se pueden cultivar en condiciones de 37ºC en presencia de CO_{2}
al 5% y similares. El cocultivo normalmente se lleva a cabo durante
alrededor de 2 horas hasta alrededor de 15 días, tiempo durante el
cual la célula presentadora de antígeno se puede intercambiar una
recién preparada para reestimulación. Además, se puede intercambiar
el medio con uno reciente a los intervalos de tiempo apropiados.
El CTL así obtenido mediante el método descrito
aquí tiene una capacidad de específicamente reconocer el antígeno
deseado, por ejemplo destruyendo específicamente una célula que
tiene el antígeno mediante su actividad citotóxica. Esta actividad
citotóxica del CTL se puede evaluar por un método conocido. Por
ejemplo, se puede evaluar la actividad citotóxica del CTL contra una
célula diana marcada con una sustancia radioactiva, una sustancia
fluorescente o similar determinando la radioactividad o intensidad
fluorescente atribuida a la célula diana destruida por el CTL.
Además, se puede detectar determinando la cantidad de una citoquina
tal como GM-CSF o IFN-\gamma
liberado de forma específica de antígeno del CTL o una célula diana.
Además de ellos, la actividad citotóxica se puede confirmar
directamente usando un complejo péptido
antigénico-MHC en el que el péptido está marcado con
un pigmento fluorescente o similar. En este caso, por ejemplo, se
pone en contacto el CTL con un primer marcador fluorescente acoplado
con un anticuerpo específico de CTL y después con un complejo
péptido antigénico-MHC en el que el péptido está
acoplado con un segundo marcador fluorescente, y se detecta la
presencia de una célula doblemente marcada mediante análisis de FACS
(separación celular activada por fluorescencia), mediante lo cual se
puede evaluar la actividad citotóxica del CTL.
Por cierto, el método descrito aquí para
expandir CTL no está particularmente limitado, siempre que el
ingrediente eficaz anteriormente mencionado exista en el sistema de
cultivo usado en el método. También se abarca un método como se
describe aquí en el que el método se lleva a cabo mediante la
existencia del ingrediente eficaz anteriormente mencionado en el
sistema de cultivo en un método convencional para la expansión de
CTL diferente de los descritos anteriormente, es decir, el cultivo
de una célula precursora o similar se lleva a cabo en presencia del
ingrediente eficaz descrito aquí (por ejemplo, añadiendo el
ingrediente eficaz anteriormente mencionado a un medio a ser usado
en el cultivo).
A continuación se explicará en detalle el método
para cultivar una célula LAK.
El cultivo de la célula LAK se lleva a cabo
incubando una célula que puede formar una célula LAK junto con
IL-2, en presencia del ingrediente eficaz
anteriormente mencionado. La célula que puede formar una célula LAK
incluye, pero no está particularmente limitada a, por ejemplo,
célula mononuclear de sangre periférica (PBMC), célula NK, célula
mononuclear de sangre de cordón umbilical, célula troncal
hematopoyética, componentes sanguíneos que contienen estas células y
similares.
Además, las condiciones generales para cultivar
una célula LAK se pueden ajustar según condiciones conocidas [por
ejemplo, véase, Saibo Kogaku (Cell Technology),
14(2), 223-227 (1995); Saibo Baiyo
(Cell Culture) 17(6), 192-195
(1991); THE LANCET, 356, 802-807
(2000); Current Protocols in Immunology, suplemento
17, UNIDAD 7.7]. Las condiciones de cocultivo no están
particularmente limitadas y se pueden emplear las condiciones
normalmente usadas para el cultivo celular. Por ejemplo, el cultivo
se puede llevar a cabo en condiciones de 37ºC en presencia de
CO_{2} al 5% y similares. Este cocultivo normalmente se lleva a
cabo durante alrededor de 2 horas hasta alrededor de 15 días.
Además, se puede intercambiar el medio con uno reciente a los
intervalos de tiempo apropiados.
De la misma manera que esos para los mencionados
anteriormente inducción, mantenimiento o expansión del CTL o la
célula LAK, como para TIL, se puede preparar un grupo de células que
tenga un alta actividad citotóxica cultivando las células en
presencia de fibronectina, un fragmento de la misma o una mezcla de
los mismos.
No hay limitación particular en los
procedimientos de activación de estas células siempre que
fibronectina, un fragmento de la misma o una mezcla de los mismos
coexista con las mismas, y los procedimientos se pueden llevar a
cabo usando un medio apropiado para el cultivo o activación de las
células mencionadas anteriormente. Respecto a la cantidad de
fibronectina, un fragmento de la misma o una mezcla de los mismos
usados, el método de añadir el componente y similar, se pueden
seleccionar los apropiados según el método mencionado
anteriormente.
Según el método anteriormente mencionado
descrito aquí para preparar un linfocito citotóxico, se obtiene un
linfocito citotóxico en el que se mantiene la actividad citotóxica a
un nivel alto, el nivel de expresión de IL-2R
aumenta significativamente y se mejora la relación de una célula CD8
positiva, linfocito tóxico que es adecuado para su uso en medicina.
Según esto, aquí se proporcionan además un método para aumentar la
expresión de un receptor de interleuquina-2 en un
linfocito citotóxico, que comprende el paso de llevar a cabo al
menos cualquiera de inducción, mantenimiento y expansión de un
linfocito citotóxico en presencia de un ingrediente eficaz descrito
aquí; un método para mejorar una relación de célula CD8 positiva en
un linfocito citotóxico, que comprende el paso de llevar a cabo al
menos cualquiera de inducción, mantenimiento y expansión de un
linfocito citotóxico en presencia de un ingrediente eficaz descrito
aquí; y un método para mejorar o mantener una actividad citotóxica
en un linfocito citotóxico, que comprende el paso de llevar a cabo
al menos cualquiera de inducción, mantenimiento y expansión de un
linfocito citotóxico en presencia de un ingrediente eficaz descrito
aquí.
También se proporciona aquí un agente para
aumentar la expresión de IL-2R en una superficie
celular, que comprende como un ingrediente eficaz fibronectina, un
fragmento de la misma o una mezcla de los mismos. El agente
potenciador comprende el ingrediente eficaz mismo y además otro
ingrediente opcional, por ejemplo, un medio, una proteína y una
citoquina (preferiblemente IL-2) que son apropiados
para activar una célula, y otros componentes deseados. Además, el
medio que contiene el agente potenciador anteriormente mencionado se
puede emplear como medio para aumentar la expresión de
IL-2R en un linfocito citotóxico. El medio
anteriormente mencionado opcionalmente contiene componentes básicos
para el cultivo celular. Aquí, el agente potenciador y el medio para
aumentar la expresión de IL-2R anteriormente
mencionados se puede preparar usando el ingrediente eficaz descrito
aquí según un método conocido. El contenido del ingrediente eficaz
descrito aquí y similar en el agente potenciador o el medio para
aumentar la expresión de IL-2R mencionado
anteriormente no está particularmente limitado, siempre que se
obtengan los efectos deseados descritos aquí. Por ejemplo, el
contenido se puede determinar de forma apropiada según el contenido
del ingrediente eficaz y similar en el medio anteriormente
mencionado usado en el método descrito aquí según se desee. Además,
el agente potenciador anteriormente mencionado se puede administrar
directamente a un cuerpo vivo, por lo que se puede aumentar la
expresión de IL-2R en una célula en un cuerpo
vivo.
También se proporciona aquí un agente para
mejorar una relación de una célula CD8 positiva en una población de
linfocitos cultivados, caracterizado en que el agente comprende como
ingrediente eficaz fibronectina, un fragmento de la misma o una
mezcla de los mismos. El agente que mejora la relación comprende el
ingrediente eficaz mismo y además otro ingrediente opcional, por
ejemplo, un medio, una proteína y una citoquina (preferiblemente
IL-2) que son apropiados para activar una célula, y
otros componentes deseados. Además, se puede emplear el medio que
contiene el agente que mejora la relación anteriormente mencionado
como medio para mejorar una relación de una célula CD8 positiva en
un linfocito citotóxico. El medio anteriormente mencionado
opcionalmente contiene componentes básicos para el cultivo celular.
Aquí, el agente que mejora la relación y el medio para mejorar la
relación anteriormente mencionados se pueden preparar usando el
ingrediente eficaz descrito aquí según un método conocido. El
contenido del ingrediente eficaz descrito aquí y similar en el
agente que mejora la relación o el medio para mejorar una relación
de una célula CD8 positiva mencionado anteriormente se puede
determinar de forma apropiada según se desee de la misma manera que
en el caso del agente anteriormente mencionado para expresar
IL-2R y similar. Además, el agente que mejora la
relación anteriormente mencionado se puede administrar directamente
a un cuerpo vivo, por lo que se puede mejorar la relación de un
linfocito citotóxico en un cuerpo vivo.
También se proporciona aquí un agente para
mejorar o mantener una actividad citotóxica en un linfocito
citotóxico, caracterizado en que el agente comprende como un
ingrediente eficaz fibronectina, un fragmento de la misma o una
mezcla de los mismos. El agente de mejora o mantenimiento comprende
el ingrediente eficaz mismo y además otro ingrediente opcional, por
ejemplo, un medio, una proteína y una citoquina (preferiblemente
IL-2) que son adecuados para activar una célula, y
otros componentes deseados. Además, el medio que contiene el agente
de mejora o mantenimiento anteriormente mencionado se puede emplear
como medio para mejorar o mantener una actividad citotóxica en un
linfocito citotóxico. El medio anteriormente mencionado
opcionalmente contiene componentes básicos para el cultivo celular.
Aquí, el agente de mejora o mantenimiento y el medio para mejora o
mantenimiento anteriormente mencionados se pueden preparar usando el
ingrediente eficaz descrito aquí según un método conocido. El
contenido del ingrediente eficaz descrito aquí en el agente de
mejora o mantenimiento y el medio para la mejora o mantenimiento
mencionado anteriormente no está particularmente limitado, siempre
que se obtengan los efectos deseados descritos aquí. Por ejemplo, el
contenido se puede determinar de forma apropiada según el contenido
del ingrediente eficaz en el medio anteriormente mencionado usado en
el método descrito aquí según se desee. Además, el agente de mejora
o mantenimiento anteriormente mencionado se puede administrar
directamente a un cuerpo vivo, por lo que se puede mejorar o
mantener la actividad del linfocito citotóxico en un cuerpo
vivo.
Además, el agente potenciador de la expresión,
el agente que mejora la relación y el agente para la mejora o
mantenimiento de una actividad citotóxica mencionado anteriormente
puede estar en la forma en que los componentes se inmovilizan a una
fase sólida apropiada, por ejemplo, un equipo de cultivo celular tal
como una placa de petri, una botella o una bolsa (incluyendo tanto
los de un sistema abierto como de sistema cerrado) y un soporte de
cultivo celular tal como bolas, una membrana o un portaobjetos de
vidrio.
Normalmente, en el cultivo que contiene
linfocito obtenido usando el método para preparar un linfocito
citotóxico como se describe anteriormente, se mezclan células
diferentes del linfocito citotóxico tal como células T cooperadoras
en el mismo. Sin embargo, puesto que los linfocitos que tienen
actividad citotóxica están contenidos en una gran cantidad en el
cultivo que contiene linfocitos obtenido aquí, las células en el
cultivo se pueden recoger del cultivo mediante centrifugación o
similar, y usar directamente como un linfocito citotóxico obtenido
por el método descrito aquí. Además, si el ingrediente eficaz
anteriormente mencionado o similar está inmovilizado a un equipo de
cultivo celular o similar, no hay riesgo de mezcla del componente o
similar en el linfocito citotóxico resultante.
Además, una población (o cultivo) celular rica
en un linfocito citotóxico se puede separar adicionalmente del
cultivo mediante un método conocido, y usarse aquí como un linfocito
citotóxico. En otras palabras, el método para preparar un linfocito
citotóxico obtenido por el método descrito aquí puede comprender el
paso de seleccionar una población celular rica en un linfocito
citotóxico del cultivo obtenido por el método.
El método de seleccionar una población celular
rica en un linfocito citotóxico no está particularmente limitado. El
método se ejemplifica mediante, por ejemplo, un método que comprende
recoger de forma selectiva solo la célula deseada del cultivo usando
un equipo o soporte de cultivo celular al que está unido un
anticuerpo contra un antígeno de superficie celular expresado en la
superficie de la célula deseada, por ejemplo, un anticuerpo
anti-CD8, o un método usando un citómetro de flujo.
El soporte anteriormente mencionado se ejemplifica mediante bolas
magnéticas o una columna. Además, la población celular rica en la
célula deseada se puede obtener eliminando mediante adsorción las
células diferentes de la célula deseada del cultivo. Por ejemplo, se
puede eliminar la célula T cooperadora del cultivo de linfocitos
usando un anticuerpo contra un antígeno de superficie celular
expresado en la superficie de la célula T cooperadora, por ejemplo,
un anticuerpo anti-CD4. En este paso, también se
puede usar un citómetro de flujo. La población celular en el
linfocito citotóxico obtenida de esta manera tiene una actividad
citotóxica más potente, comparada con la de una población celular
recogida de forma no selectiva de un cultivo, de modo que la
población celular se puede usar en especial preferiblemente en el
campo médico.
\newpage
\global\parskip0.870000\baselineskip
Además, aquí se proporciona el linfocito
citotóxico obtenido por el método descrito aquí para preparar un
linfocito citotóxico. El linfocito, en especial CTL, tiene una
actividad citotóxica alta, que tiene una característica de hay poca
disminución de la actividad citotóxica, incluso cuando el linfocito
se somete a cultivo o expansión continuos durante un largo periodo
de tiempo. Además, aquí se proporciona un medicamento (agente
terapéutico) que comprende el linfocito como ingrediente eficaz. En
especial, el agente terapéutico mencionado anteriormente, que
comprende el linfocito se usa de forma adecuada en inmunoterapia
adoptiva. En la inmunoterapia adoptiva, el linfocito citotóxico que
tiene una actividad citotóxica adecuada para tratar un paciente se
administra al paciente mediante, por ejemplo, administración
intravenosa. El agente terapéutico se puede preparar, por ejemplo,
mezclando el linfocito preparado por el método descrito aquí como un
ingrediente eficaz con, por ejemplo, un soporte orgánico o
inorgánico conocido adecuado para la administración no oral, un
excipiente, un agente estabilizante y similar, según un método
conocido en el campo farmacéutico. Por cierto, se pueden determinar
de forma apropiada varias condiciones para el agente terapéutico,
tal como el contenido de linfocito como se describe aquí en el
agente terapéutico y la dosis del agente terapéutico, según la
inmunoterapia adoptiva conocida.
El método descrito aquí para preparar un
linfocito citotóxico puede comprender además el paso de transducir
un gen exógeno en el linfocito. En otras palabras, aquí se
proporciona un método para preparar un linfocito citotóxico, que
comprende además el paso de transducir un gen exógeno en un
linfocito citotóxico. Aquí, el término "exógeno" se refiere a
los que son exógenos a un linfocito en el que se transduce el
gen.
Al llevar a cabo el método descrito aquí para
preparar un linfocito citotóxico, en especial el método para
expandir un linfocito citotóxico, la capacidad de replicación del
ADN del linfocito cultivado aumenta. Por tanto, al incluir el paso
de transducir un gen en el método descrito aquí para preparar un
linfocito citotóxico se espera un aumento en el método de
transducción génica.
Los métodos de transducir un gen exógeno no
están particularmente limitados, y se puede seleccionar un método
apropiado de un método conocido para transducir un gen. El paso de
transducir un gen se puede llevar a cabo en cualquier punto
determinado durante la preparación de un linfocito citotóxico. Por
ejemplo, es preferible llevar a cabo el paso de forma simultánea con
cualquier paso de los anteriormente mencionados de inducción,
mantenimiento y/o expansión del linfocito o después del paso, desde
el punto de vista de eficacia de trabajo.
Como el método anteriormente mencionado para
transducir un gen, se puede emplear aquí cualquiera de los métodos
usando un vector vírico y métodos sin usar el vector. Los detalles
de esos métodos ya se han publicado en numerosas referencias.
El vector vírico anteriormente mencionado no
está particularmente limitado, y se usa un vector vírico conocido
normalmente usado en los métodos para transducir un gen, por
ejemplo, vector retrovírico, vector lentivírico, vector adenovírico,
vector de virus adenoasociado, vector de virus simio, vector del
virus vaccinia, vector de virus Sendai o similar. En especial
preferiblemente, como el vector vírico se usa retrovirus,
adenovirus, virus adenoasociado o virus simio. Como el vector vírico
anteriormente mencionado, son preferibles los que carecen de
capacidad de replicación de modo que el vector vírico no se puede
auto-replicar en una célula infectada.
El vector retrovírico se usa para el propósito
de terapia génica o similar porque se puede incorporar de forma
estable un gen exógeno insertado en el vector en el ADN cromosómico
en la célula en la que se va a transducir el vector. Puesto que el
vector tiene una eficacia de infección alta en la célula durante
mitosis y proliferación, la transducción génica se lleva a cabo
preferiblemente en el método para preparar un linfocito citotóxico,
por ejemplo, el paso de expansión.
Como el método para transducir un gen sin usar
un vector vírico, se puede emplear, pero no particularmente limitado
a, por ejemplo, un método que usa un soporte tal como liposoma o
ligando-polilisina, método del fosfato de calcio,
método de electroporación, método de bombardeo de partículas o
similar. En este caso, se transduce un gen exógeno incorporado en
ADN plasmídico o ADN lineal.
El gen exógeno a ser transducido en un linfocito
citotóxico descrito aquí no está particularmente limitado, y se
puede seleccionar un gen arbitrario que se desea transducir en la
célula anteriormente mencionada. Como el gen descrito anteriormente,
además de un gen que codifica una proteína (por ejemplo, una enzima,
una citoquina, un receptor o similar), por ejemplo, se puede usar un
gen que codifica un ácido nucleico antisentido o una ribozima.
Además, se puede transducir de forma simultánea un gen marcador
apropiado que sea capaz de seleccionar una célula en la que se
transduce un gen.
El gen exógeno mencionado anteriormente se
puede, por ejemplo, insertar en un vector, un plásmido o similar, de
modo que el gen exógeno se exprese bajo el control de un promotor
apropiado, y usar. Además, para alcanzar una transcripción eficaz de
un gen, puede existir en un vector otro elemento regulador que
coopere con el promotor o un sitio de inicio de la transcripción,
por ejemplo, una secuencia potenciadora o una secuencia terminadora.
Además, para el propósito de insertar un gen exógeno en un cromosoma
de un linfocito en el que el gen se transduce por recombinación
homóloga, por ejemplo, se puede organizar un gen exógeno entre
secuencias flanqueantes que comprenden secuencias de nucleótidos que
tiene cada una homología a las secuencias de nucleótidos localizadas
en ambos lados del sitio de inserción diana deseado del gen en el
cromosoma. El gen exógeno a ser transducido puede ser uno natural o
uno generado de forma artificial, o puede ser uno en el que se unen
moléculas de ADN que tienen orígenes diferentes por un medio
conocido tal como ligación. Además, el gen exógeno puede ser uno que
tenga una secuencia en la que se introduce una mutación en una
secuencia natural dependiendo de su fin.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Según el método descrito aquí, por ejemplo, se
transduce en un linfocito citotóxico un gen que codifica una enzima
asociada con la resistencia a un fármaco usado para el tratamiento
de un paciente con cáncer o similar, dando de esta manera al
linfocito resistencia al fármaco. Si se usa el linfocito citotóxico
como se ha descrito anteriormente, se pueden combinar inmunoterapia
adoptiva y terapia con fármacos y, por tanto, se pueden obtener
efectos terapéuticos mayores. El gen de resistencia a fármaco se
ejemplifica mediante, por ejemplo, un gen de multirresistencia
a
fármacos.
fármacos.
Por otra parte, al contrario de la forma de
realización anteriormente mencionada, se transduce en un linfocito
citotóxico un gen de modo que de sensibilidad contra un fármaco
particular, dando de esta manera sensibilidad contra el fármaco. En
este caso, se puede eliminar el linfocito después de ser
trasplantado a un cuerpo vivo administrando el fármaco. El gen para
dar sensibilidad contra un fármaco se ejemplifica mediante, por
ejemplo, un gen de timidina quinasa.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención se describirá de forma más concreta
por medio de los ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de preparación
1
H-271, un fragmento derivado de
fibronectina humana, se preparó de Escherichia coli
HB101/pHD101 (FERM BP-2264) según el método descrito
en la patente de EE UU No. 5.198.423.
Además, H-296,
CH-271 y CH-296, fragmentos
derivados de fibronectina humana, se prepararon cada uno de un
cultivo obtenido cultivando Escherichia coli HB101/pHD102
(FERM BP-7420), Escherichia coli HB101/pCH101
(FERM BP-2799) o Escherichia coli
HB101/pCH102 (FERM BP-2800), según el método
descrito en el boletín mencionado anteriormente.
C-274, un fragmento derivado de
fibronectina humana, se preparó de un cultivo obtenido cultivando
Escherichia coli JM109/pTF7221 (FERM BP-1915)
según el método descrito en la patente de EE UU No. 5.102.988.
C-CS1, un fragmento derivado de
fibronectina humana, se preparó de un cultivo obtenido cultivando
Escherichia coli HB101/pCS25 (FERM BP-5723)
según el método descrito en el boletín de patente japonesa No.
3104178.
CHV-89 y
CHV-179, fragmentos derivados de fibronectina
humana, se prepararon cada uno de un cultivo obtenido cultivando
Escherichia coli HB101/pCHV89 (FERM P-12182)
o Escherichia coli HB101/pCHV179 (FERM
P-12183), según el método descrito en el boletín de
patente japonesa No. 2729712.
Además, CHV-90 un fragmento
derivado de fibronectina humana, se preparó según el método descrito
en el boletín de patente japonesa No. 2729712. En concreto, se
construyó un plásmido pCHV90 según los procedimientos descritos en
el boletín, y después de ello se cultivó un transformante que lleva
el plásmido y se preparó CHV90 del cultivo.
CHV-181, un fragmento derivado
de fibronectina humana, se preparó construyendo el plásmido
(pCHV181) que comprende un ADN que codifica CHV-181
según el método descrito en el documento WO 97/18318, cultivando
después de ello Escherichia coli HB101/pCHV181 en la que se
había introducido el plásmido, y preparando el fragmento del cultivo
de la misma manera que para CHV-179 anterior.
\vskip1.000000\baselineskip
Como para pCHV181, un plásmido para expresar el
anteriormente mencionado polipéptido CHV-181, se
construyó un plásmido CHV92 que tenía la deleción de una región que
codifica una región III-13 en la región que codifica
CHV-181. Los procedimientos de deleción se
realizaron según procedimientos para delecionar una región
codificante III-14 de un plásmido pCHV179, que se
describen en el boletín de patente japonesa No. 2729712.
Se cultivó Escherichia coli HB101
(Escherichia coli HB101/pCHV92) transformada con el plásmido
anteriormente mencionado pCHV92, y los procesos de purificación se
llevaron a cabo según el método de purificar el polipéptido
CHV-89 descrito en el boletín de patente japonesa
No. 2729712, para obtener una preparación de CHV-92
purificada del cultivo resultante.
\vskip1.000000\baselineskip
Se construyó un plásmido para expresar el
polipéptido H-275-Cys según los
siguientes procedimientos. En concreto, se preparó un plásmido
pCH102 de Escherichia coli HB101/pCH102 (FERM
BP-2800). Se llevó a cabo PCR usando un cebador 12S
que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 20 y un
cebador 14A que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID
NO: 21 con el plásmido anterior como molde, para dar un fragmento de
ADN de alrededor de 0,8 kb, que codifica un polipéptido de unión a
heparina de fibronectina. El fragmento de ADN resultante se digirió
con NcoI y BamHI (ambas fabricadas por Takara Bio Inc.) y después de
ello se ligó con pTV118N (fabricado por Takara Bio Inc.) digerido
con NcoI y BamHI, para construir un plásmido pRH1.
Se digirió un vector plasmídico
pINIII-ompA_{1} [Ghrayeb J. et al., EMBO
J., 3(10), 2437-2442 (1984)] con
BamHI y HincII (fabricadas por Takara Bio Inc.) para recoger un
fragmento de ADN de alrededor de 0,9 kb, que contiene una región
terminadora de lipoproteína. Este fragmento se mezcló y ligó con el
plásmido pRH1 anteriormente mencionado que se había digerido con
BamHI y HincII, para dar un plásmido pRH1-T que
contenía un promotor lac, un fragmento de ADN que codifica un
polipéptido de unión a heparina y un terminador de lipoproteína en
este orden.
La reacción para PCR se llevó a cabo usando un
cebador Cys-A que tiene la secuencia de nucleótidos
mostrada en SEQ ID NO: 22 y un cebador Cys-S que
tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 23 con este
plásmido pRH1-T como molde. Después de ello, el
fragmento de ADN amplificado recogido se digirió con NotI (fabricada
por Takara Bio Inc.), y el fragmento de ADN además se
auto-ligó. Se digirió un ADN cíclico así obtenido
con SpeI y ScaI (fabricadas por Takara Bio Inc.) para dar un
fragmento de ADN de 2,3 kb, y el fragmento resultante se mezcló y
ligo con un fragmento de ADN de 2,5 kb obtenido digiriendo el
plásmido pRH1-T con SpeI y ScaI (fabricadas por
Takara Bio Inc.), para dar un plásmido pRH-Cys. El
plásmido codifica un polipéptido
H-275-Cys en el que se añadieron
cuatro aminoácidos
Met-Ala-Ala-Ser en
un extremo N-terminal del anteriormente mencionado
H-271, y se añadió una Cys adicional al
C-terminal del H-271.
El polipéptido
H-275-Cys se preparó mediante el
siguiente método. Se cultivo Escherichia coli HB101
transformada con el plásmido mencionado anteriormente
pRH-Cys (Escherichia coli
HB101/pRH-Cys) durante la noche a 37ºC en 120 ml de
medio LB. Las células recogidas del medio de cultivo se
resuspendieron en 40 ml de un tampón para rotura
(Tris-HCl 50 mM, EDTA 1 mM, NaCl 150 mM, DTT 1 mM,
PMSF 1 mM, pH 7,5), y la suspensión se sometió a tratamiento
ultrasónico para romper las células. El sobrenadante obtenido por
centrifugación se sometió a una columna
HiTrap-heparina (fabricada por Pharmacia) que se
había equilibrado con un tampón de purificación
(Tris-HCl 50 mM, pH 7,5). La fracción no adsorbida
en la columna se lavó con el mismo tampón, y después de ello se
llevó a cabo la elución con un tampón de purificación que tenía un
gradiente de concentración de NaCl de 0 a 1 M. El eluato se analizó
mediante electroforesis en gel SDS-poliacrilamida, y
se recogieron las fracciones correspondientes a un peso molecular de
H-275-Cys para dar una preparación
purificada de H-275-Cys.
\vskip1.000000\baselineskip
Se recogió el componente sanguíneo de un donante
individual humano normal que tenía HLA-A2.1,
obtenido con consentimiento informado. El componente sanguíneo
recogido se diluyó 2 veces con PBS(-), se aplicó sobre
Ficoll-paque (fabricado por Pharmacia) y se
centrifugó a 500 x g durante 20 minutos. Las células mononucleares
de sangre periférica (PBMC) en la capa intermedia se recogieron con
una pipeta y se lavaron. Las PBMC recogidas se resuspendieron en una
solución de almacenamiento de SBF al 90% (fabricado por Bio
Whittaker)/DMSO al 10% (fabricado por SIGMA) y se almacenaron en
nitrógeno líquido. Durante la inducción de CTL, estas PBMC
almacenadas se descongelaron rápidamente en un baño de agua a 37ºC y
se lavaron con medio RPMI 1640 (fabricado por Bio Whittaker) que
contenía Dnasa 10 \mug/ml (fabricada por Calbiochem). Después de
ello, se calculó el número de células vivas por el método de tinción
con azul de tripán y las células se sometieron a cada
experimento.
\vskip1.000000\baselineskip
La inducción de CTL de memoria
anti-virus de la gripe se realizó modificando
parcialmente el método de Bednarek et al. [J.
Immunology, 147(12), 4047-4053
(1991)]. En concreto, las PBMC preparadas en el punto (1) del
ejemplo 2 se resuspendieron en medio RPMI 1640 (fabricado por Bio
Whittaker) que contenía suero humano de tipo AB al 5%, aminoácidos
no esenciales 0,1 mM, piruvato de sodio 1 mM,
L-glutamina 2 mM (todos los anteriores están
fabricados por Bio Whittaker), HEPES 10 mM (fabricado por nakalai
tesque), estreptomicina-penicilina al 1% (fabricado
por Gibco BRL) (de aquí en adelante simplemente denominado
"5HRPMI") de modo que tuviera una concentración de 1 a 4 x
10^{6} células/ml. Después de ello, la suspensión se puso en una
placa de cultivo de 24 pocillos (fabricada por Falcon) en un volumen
de 1 ml/pocillo, y las células se incubaron en un incubador de tipo
húmedo con CO_{2} al 5% a 37ºC durante 1,5 horas para separar los
monocitos adherentes a plástico. Después de ello, las células no
adherentes se recogieron usando medio RPMI 1640 y se almacenaron en
hielo como células respondedoras. A los monocitos separados se
añadieron 0,5 ml de 5HRPMI que contenía como péptido antigénico 5
\mug/ml del péptido epítopo derivado de proteína del virus de la
gripe (péptido de unión a A2.1 derivado de la proteína de matriz de
SEQ ID NO: 24) y 1 \mug/ml de microglobulina \beta2 (fabricada
por Scrips). La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 2
horas y después de ello las células a irradiación con rayos X
(5500R) para dar células presentadoras de antígeno. La solución
peptídica se eliminó por succión de cada uno de los pocillos, y los
pocillos se lavaron con medio RPMI 1640. Después de ello, las
células respondedoras previamente almacenadas en hielo se aspiraron
en 5HRPMI para tener una concentración de 0,5 a 2 x 10^{6}
células/ml, y la suspensión se añadió a las células presentadoras de
antígeno en una cantidad de 1 ml por pocillo. A este tiempo, se
añadió cada fragmento de fibronectina (de aquí en adelante
denominado "FNfr") descrito en el ejemplo de preparación 1 de
modo que se tuviera una concentración final de 10 \mug/ml. Se fijó
un grupo sin adición de FNfr como control. La placa se cultivó a
37ºC en presencia de CO_{2} al 5%. El segundo día desde el inicio
del cultivo, se añadió 1 ml de 5HRPMI que contenía
IL-2 60 U/ml (fabricada por Shionogi & Co. Ltd.)
y FNfr 10 \mug/ml a cada pocillo (el control contenía solo
IL-2). Además, el quinto día, se retiró la mitad del
sobrenadante del cultivo, y se añadió al mismo a cada 1 ml de medio
que contenía IL-2 y FNfr (el control contenía solo
IL-2), los mismos que los mencionados anteriormente.
El séptimo día, se prepararon células presentadoras de antígeno de
la misma manera que antes, y después de ello las células
respondedoras que se habían cultivado durante una semana se
resuspendieron en 5HRPMI para tener una concentración de 0,5 a 2 x
10^{6} células/ml. La suspensión se añadió a las células
presentadoras de antígeno preparadas en una cantidad de 1 ml/pocillo
para reestimular las células. A este tiempo, se añadió FNfr de modo
que tuviera una concentración final de 10 \mug/ml (siendo el
control sin adición). El segundo día desde la reestimulación, se
añadió a cada pocillo 1 ml de 5HRPMI que contenía
IL-2 60U/ml y FNfr 10 \mug/ml (el control contenía
solo IL-2). Además, el quinto día, se retiró la
mitad del sobrenadante del cultivo, y se añadió al mismo 1 ml del
medio que tenía el mismo contenido que el de antes de la retirada.
El cultivo se siguió durante dos días adicionales, induciendo con
ello CTL.
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluó la actividad citotóxica de los CTL
preparados en el punto (2) del ejemplo 1 el decimocuarto día después
del inicio de la inducción mediante un método de determinación para
la actividad citotóxica usando calceína-AM [R.
Lichtenfels et al., J. Immunological Methods,
172(2), 227-239 (1994)]. Se
resuspendieron células B transformadas con EBV que tenían
HLA-A2.1 (nombre de las células: 221A2.1), que se
cultivaron durante la noche junto con un péptido de epítopo o en
ausencia del péptido de epítopo, en medio RPMI 1640 que contenía SBF
al 5% (fabricado por Bio Whittaker) de modo que tuvieran una
concentración de 1 x 10^{6} células/ml. Después de ello, se añadió
calceína-AM (fabricada por Dotite) a la suspensión
para dar una concentración final de 25 \muM y las células se
cultivaron a 37ºC durante 1 hora. Las células se lavaron con un
medio que no contenía calceína-AM y después de ello
se mezclaron con células K562 (ATCC CCL-243) en una
cantidad de 20 veces la de las células, para dar células diana
marcadas con calceína. Las células K562 se usaron para excluir
actividad citotóxica no específica por células NK mezcladas en las
células respondedoras.
Los CTL de memoria preparados en el punto (2)
del ejemplo 1 se diluyeron por pasos con 5HRPMI de modo que tuvieran
una concentración de 1 x 10^{5} a 9 x 10^{6} células/ml como
células efectoras. Después de ello, cada una de las diluciones se
echó en un pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos en una
cantidad de 100 \mul/pocillo. Se añadieron a los mismos las
células diana marcadas con calceína preparadas para tener una
concentración de 1 x 10^{5} células/ml en una cantidad de 100
\mul/pocillo. La placa que contenía la suspensión de células
anterior se centrifugó a 400 x g durante 1 minuto y después de ello
se incubó en un incubador de tipo húmedo de CO_{2} a 37ºC durante
4 horas. Después de 4 horas, se recogieron 100 \mul de
sobrenadante del cultivo de cada pocillo y se determinó la cantidad
de calceína liberada (intensidad de fluorescencia) en el
sobrenadante del cultivo usando un lector de fluorescencia de placas
(485 nm/538 nm). La actividad citotóxica de los CTL se calculó
mediante la siguiente ecuación 1:
Ecuación
1
Actividad
citotóxica (%) = [(Valor determinado en cada pocillo - cantidad
liberada mínima)/ (cantidad liberada máxima - cantidad
liberada mínima)] x
100
En la ecuación anterior, la cantidad liberada
mínima es la cantidad de calceína liberada en el pocillo que
contiene solo células diana y células K562, que muestra la cantidad
de calceína liberada de forma natural por las células diana. Además,
la cantidad liberada máxima se refiere a la cantidad de calceína
liberada cuando las células se rompen por completo añadiendo el 0,1%
del tensioactivo Triton X-100 (fabricado por nakalai
tesque) a las células diana. Como resultado, la actividad citotóxica
se indujo de forma inmediata después de la inducción, pero apenas
había diferencias en la actividad citotóxica por la presencia o
ausencia de la adición de FNfr durante la inducción.
\vskip1.000000\baselineskip
Se fijaron los CTL que se prepararon en el punto
(2) del ejemplo 1 en una cantidad de 2 x 10^{5} células con PBS
(fabricado por Nissui) que contenía paraformaldehído al 1%
(fabricado por nakalai tesque), y después se lavaron con PBS. Las
células fijadas se resuspendieron en 100 \mul de PBS que contenía
BSA al 1% (fabricado por SIGMA), se añadió a las mismas IgG1 de
ratón marcada con FITC o anticuerpo anti-CD8 humano
de ratón marcado con FITC (ambos fabricados por DAKO) y después de
ello la mezcla se incubó en hielo durante 30 minutos. Después de la
incubación, las células se lavaron con PBS y se resuspendieron de
nuevo en PBS que contenía paraformaldehído al 1%. Las células se
sometieron a citometría de flujo usando FACS Vantage (fabricado por
Becton Dickinson) y se determinó la relación de contenido de las
células CD8 positivas. Los resultados se muestran en la tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Como se muestra en la tabla 1, en el grupo con
adición de varios fragmentos de fibronectina durante la inducción de
CTL, la relación de las células CD8 positivas el decimocuarto día
después del inicio de la inducción de los CTL es alta, comparada con
la del control sin adición de estos fragmentos de fibronectina. En
otras palabras, se aclaró que los CTL se podían inducir con
proliferación significativa de células CD8 positivas por la
copresencia del fragmento de fibronectina.
\vskip1.000000\baselineskip
La inducción de CTL de memoria
anti-virus de la gripe se llevó a cabo de la misma
manera que en el punto (2) del ejemplo 1 usando las PBMC que se
aislaron y almacenaron de la misma manera que en el punto (1) del
ejemplo 1. La actividad citotóxica de los CTL el decimocuarto día
después del inicio de la inducción se evaluó de la misma manera que
en el punto (3) del ejemplo 1. Como resultado, apenas hubo
diferencias en la actividad citotóxica por la presencia o ausencia
de la adición de FNfr durante la inducción.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó la relación de la expresión del
receptor de interleuquina-2 (IL-2R)
en los CTL que se prepararon en el punto (1) del ejemplo 2 el
decimocuarto día desde el inicio de la inducción según el método
descrito en el punto (4) del ejemplo 1. Aquí, en este procedimiento,
se cambió un anticuerpo de ratón anti-CD8 humano
marcado con FITC por un anticuerpo de ratón
anti-IL-2R (CD25) humano marcado con
FITC (fabricado por DAKO). Los resultados se muestran en la tabla
2.
Como se muestra en la tabla 2, en todos los CTL
inducidos con adición de varios fragmentos de fibronectina, se
observó un aumento en la relación de la expresión de
IL-2R en la población celular. En otras palabras, se
aclaró que los CTL se podían inducir con aumento del nivel de
expresión de IL-2R llevando a cabo la inducción en
copresencia del fragmento de fibronectina.
\vskip1.000000\baselineskip
La inducción de CTL de memoria
anti-virus de la gripe se llevó a cabo de la misma
manera que en el punto (2) del ejemplo 1 usando las PBMC que se
aislaron y almacenaron de la misma manera que en el punto (1) del
ejemplo 1. La actividad citotóxica de los CTL el decimocuarto día
después del inicio de la inducción se evaluó de la misma manera que
en el punto (3) del ejemplo 1. Como resultado, apenas hubo
diferencias en la actividad citotóxica por la presencia o ausencia
de la adición de FNfr durante la inducción.
\vskip1.000000\baselineskip
Los CTL preparados en el punto (1) del ejemplo 3
se lavaron con 5HRPMI y después se hizo una suspensión que tenía una
concentración de 3 x 10^{4} células/ml. Por otra parte, se
sometieron PBMC alogénicas que no tenían HLA-A2.1
que se recogieron de la misma manera que en el punto (1) del ejemplo
1 a irradiación por rayos X (3300R) y las células se lavaron con el
medio y después se hizo una suspensión que tenía una concentración
de 2 a 5 x 10^{6} células/ml. Se resuspendieron estos CTL (3 x
10^{4} células) y PBMC alogénicas (de 4 a 10 x 10^{6} células)
en 10 ml de 5HRPMI o medio RPMI 1640 (fabricado por Bio Whittaker)
que contenía SBF Hyclone al 10%, aminoácidos no esenciales 0,1 mM,
piruvato de sodio 1 mM, L-glutamina 2 mM (todos
fabricados por Bio Whittaker), HEPES 10 mM (fabricado por nakalai
tesque) y estreptomicina-penicilina al 1% (fabricado
por Gibco BRL) (de aquí en adelante simplemente denominado
10HycloneRPMI) y se añadió al mismo un anticuerpo
anti-CD3 (fabricado por
Janssen-Kyowa) de modo que diera una concentración
final de 50 ng/ml. La mezcla se colocó en una botella de 12,5
cm^{2} (fabricada por Falcon) y las células se cultivaron en un
incubador de tipo húmedo de CO_{2} a 37ºC durante 14 días. Durante
el cultivo, se añadió FNfr de modo que tuviera una concentración
final de 10 \mug/ml que era la misma que la añadida durante la
inducción de los CTL. Además, no se añadió FNfr a un grupo control
en el que la inducción se llevó a cabo sin la adición de FNfr. La
estimulación por un péptido no se añadió en absoluto durante este
cultivo. El primer día después del inicio de la expansión, se añadió
IL-2 de modo que tuviera una concentración final de
120 U/ml. Además, el cuarto día y sucesivos después del inicio del
cultivo se llevaron a cabo procedimientos de retirar la mitad del
sobrenadante del cultivo y después de ello añadir 5 ml de 5HRPMI que
contenía IL-2 60 U/ml o 10HycloneRPMI a cada botella
cada 2 a 3 días. Durante el cultivo, se añadió al medio FNfr a la
misma concentración para el grupo con adición de FNfr. El
decimocuarto día después del inicio de la expansión, se determinó la
actividad citotóxica de los CTL de la misma manera que el punto (3)
del ejemplo 1. El grado en que se mantiene la actividad citotóxica
antes de la expansión se calculó como "mantenimiento de la
actividad citotóxica (%)".
El "mantenimiento de la actividad citotóxica
(%)" se calculó según la siguiente ecuación 2:
Ecuación
2
Mantenimiento
de la actividad citotóxica (%) = [Actividad citotóxica (%) después
de la expansión/actividad citotóxica (%) antes de la
expansión] x
100
Los resultados de la determinación se muestran
en la tabla 3. En la tabla, un cociente E/T significa un cociente
del número de células efectoras (E) respecto al número de las
células diana (T).
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\vskip1.000000\baselineskip
Como se muestra en la tabla 3, los CTL del grupo
con adición de varios fragmentos de fibronectina durante la
inducción y la expansión mantuvieron una actividad citotóxica
específica alta incluso después de la expansión durante 14 días
comparada con la del control sin adición del fragmento de
fibronectina. En otras palabras, se aclaró que los CTL se podían
expandir en un estado en el que se mantenía una alta actividad
citotóxica durante un periodo de tiempo largo llevando a cabo la
inducción y la expansión en copresencia del fragmento de
fibronectina.
\vskip1.000000\baselineskip
La inducción de CTL de memoria
anti-virus de la gripe se llevó a cabo de la misma
manera que en el punto (2) del ejemplo 1 usando las PBMC que se
aislaron y almacenaron de la misma manera que en el punto (1) del
ejemplo 1. La actividad citotóxica de los CTL el decimocuarto día
después del inicio de la inducción se evaluó de la misma manera que
en el punto (3) del ejemplo 1. Como resultado, apenas hubo
diferencias en la actividad citotóxica por la presencia o ausencia
de la adición de FNfr durante la inducción.
\vskip1.000000\baselineskip
Los CTL preparados en el punto (1) del ejemplo 4
se expandieron de la misma que en el punto (2) del ejemplo 3. Se
determinó la relación de células con expresión positiva de
IL-2R para los CTL después de la expansión así
obtenida de la misma manera que el punto (2) del ejemplo 2. Los
resultados se muestran en la tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Como se muestra en la tabla 4, en todos los
grupos con adición de varios fragmentos de fibronectina durante la
inducción y la expansión de CTL, se observó un aumento en la
relación de células que expresan IL-2R en la
población celular.
En otras palabras, se aclaró que los CTL se
podían expandir con aumento en el nivel de expresión de
IL-2R llevando a cabo la inducción y expansión de
los CTL en presencia del fragmento de fibronectina.
\vskip1.000000\baselineskip
La inducción de CTL de memoria
anti-virus de la gripe se llevó a cabo de la misma
manera que en el punto (2) del ejemplo 1 usando las PBMC aisladas y
almacenadas según el método descrito en el punto (1) del ejemplo 1.
Durante la inducción, se añadió fibronectina (fabricada por
Calbiochem) en lugar de FNfr de modo que se tuviera una
concentración final de 10 \mug/ml (el control es sin adición). La
actividad citotóxica de los CTL el decimocuarto día después del
inicio de la inducción se determinó de la misma manera que en el
punto (3) del ejemplo 1. Como resultado, apenas hubo diferencias en
la actividad citotóxica por la presencia o ausencia de la adición de
fibronectina durante la inducción.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó la relación de células con
expresión positiva de IL-2R para los CTL preparados
en el punto (1) del ejemplo 5 de la misma manera que el punto (2)
del ejemplo 2. Los resultados se muestran en la tabla 5.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Como se muestra en la tabla 5, en CTL inducidos
en presencia de fibronectina, se observó un aumento en el nivel de
expresión de IL-2R en la población celular.
En otras palabras, se aclaró que se podían
inducir CTL con aumento en el nivel de expresión de
IL-2R llevando a cabo la inducción de los CTL en
presencia de fibronectina.
\vskip1.000000\baselineskip
Se expandieron los CTL preparados en el punto
(1) del ejemplo 5 de la misma manera que en el punto (2) del ejemplo
3. Durante la expansión, al grupo con adición de fibronectina
durante la inducción, se añadió fibronectina (fabricada por
Calbiochem) de modo que se tuviera una concentración final de 10
\mug/ml (un control sin adición). La actividad citotóxica de los
CTL obtenidos se determinó de la misma manera que la del punto (3)
del ejemplo 1, y se calculó el grado en que se mantiene la actividad
citotóxica antes de la expansión como "mantenimiento de la
actividad citotóxica (%)".
Los resultados de la determinación se muestran
en la tabla 6.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.900000\baselineskip
Como se muestra en la tabla 6, el grupo en el
que la inducción y la expansión de los CTL se llevaron a cabo en
presencia de fibronectina mantuvieron una alta actividad citotóxica.
Por otra parte, la actividad citotóxica del control sin adición de
fibronectina durante la inducción y expansión de los CTL claramente
disminuyó. En otras palabras, se aclaró los CTL se podían expandir
en un estado en el que se mantenía una actividad citotóxica
específica durante un periodo de tiempo largo añadiendo fibronectina
durante la inducción y la expansión de los CTL.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inmovilizó un fragmento de fibronectina en un
equipo de cultivo celular (recipiente) usado en el siguiente
experimento. En concreto, se añadió PBS que contenía varios
fragmentos de fibronectina (concentración final: 10 \mug/ml) en
una cantidad de 1 a 2 ml a una placa de cultivo de 24 pocillo y a
una botella de 12,5 cm^{2}. La placa y la botella se sometieron a
incubación a temperatura ambiente durante 5 horas y después se
almacenaron a 4ºC hasta su uso. Además, la placa y la botella se
lavaron dos veces con PBS antes de usar.
\vskip1.000000\baselineskip
La inducción de CTL de memoria
anti-virus de la gripe se llevó a cabo según el
método descrito en el punto (2) del ejemplo 1 usando las PBMC
aislados y almacenados según el método descrito en el punto (1) del
ejemplo 1. Durante la inducción, se usó una placa con FNfr
inmovilizado como equipo de cultivo celular (para control, se uso
una placa sin tratamiento de inmovilización). La actividad
citotóxica de los CTL el decimocuarto día después del inicio de la
inducción se evaluó de la misma manera que en el punto (3) del
ejemplo 1. Como resultado, apenas hubo diferencias en la actividad
citotóxica por la presencia o ausencia de la inmovilización de FNfr
a la placa durante la inducción.
\vskip1.000000\baselineskip
Se expandieron los CTL preparados en el punto
(2) del ejemplo 6 de la misma manera que en el punto (2) del ejemplo
3. Durante la expansión, se usaron botellas con varios FNfr
inmovilizados a las mismas como equipos de cultivo celular (para
control, se usó una placa sin tratamiento de inmovilización).
Además, se usó como medio 10HycloneRPMI.
Se evaluó el grado en que se mantiene la
actividad citotóxica de los CTL así expandidos comparado con la de
antes de la expansión como "mantenimiento de la actividad
citotóxica (%)".
Los resultados de la determinación se muestran
en la tabla 7.
Como se muestra en la tabla 7, en el grupo en el
que se usó equipo de cultivo (placa, botella) con el fragmento de
fibronectina inmovilizado durante la inducción y la expansión de los
CTL, los CTL mantuvieron una actividad citotóxica específica alta
incluso después de la expansión. Por otra parte, en el control en el
que se uso equipo de cultivo sin inmovilización con el fragmento de
fibronectina durante la inducción y expansión de los CTL, la
actividad citotóxica claramente disminuyó. En otras palabras se
aclaró que los CTL se podían expandir en un estado en el que se
mantuviera una alta actividad citotóxica durante un periodo de
tiempo largo, comparable a la del fragmento disuelto en el medio,
usando el fragmento de fibronectina inmovilizado.
\global\parskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La inducción de CTL de memoria
anti-virus de la gripe se llevó a cabo de la misma
manera que en el punto (2) del ejemplo 1 usando las PBMC que se
aislaron y almacenaron de la misma manera que en el punto (1) del
ejemplo 1. La actividad citotóxica de los CTL el decimocuarto día
después del inicio de la inducción se evaluó de la misma manera que
en el punto (3) del ejemplo 1. Como resultado, apenas hubo
diferencias en la actividad citotóxica por la presencia o ausencia
de la adición de FNfr durante la inducción.
\vskip1.000000\baselineskip
Se expandieron los CTL preparados en el punto
(1) del ejemplo 7 de la misma manera que en el punto (2) del ejemplo
3. Se determinó la relación de contenido de células CD8 positivas
para los CTL después de la expansión así obtenidos de la misma
manera que en el punto (4) del ejemplo 1. Los resultados se muestran
en la tabla 8.
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\vskip1.000000\baselineskip
Como se muestra en la tabla 8, en todos los
grupos con adición de varios fragmentos de fibronectina durante la
inducción y la expansión de los CTL, se observó un aumento en la
relación del contenido de células CD8 positivas en la población
celular después de la expansión.
En otras palabras, se aclaró que los CTL se
podían expandir con proliferación significativa de células CD8
positivas llevando a cabo la inducción y la expansión de CTL en
presencia del fragmento de fibronectina.
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Se inmovilizó un fragmento de fibronectina a un
equipo de cultivo (recipiente) de la misma manera que en el punto
(1) del ejemplo 6.
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La inducción de CTL de memoria
anti-virus de la gripe se llevó a cabo según el
método descrito en el punto (2) del ejemplo 1 usando las PBMC
aisladas y almacenadas según el método descrito en el punto (1) del
ejemplo 1. Durante la inducción, se usó una placa con FNfr
inmovilizado preparada en el punto (1) del ejemplo 8 como equipo de
cultivo (para control, se usó una placa sin tratamiento de
inmovilización). La actividad citotóxica de los CTL después de la
inducción se evaluó de la misma manera que en el punto (3) del
ejemplo 1. Como resultado, apenas hubo diferencias en la actividad
citotóxica por la presencia o ausencia de la inmovilización de FNfr
a la placa durante la inducción.
\vskip1.000000\baselineskip
Se expandieron los CTL preparados en el punto
(2) del ejemplo 8 de la misma manera que en el punto (2) del ejemplo
3. Durante la expansión, se usó una botella con FNfr inmovilizado a
la misma preparada en el punto (1) del ejemplo 8 como equipos de
cultivo (para control, se uso una placa sin tratamiento de
inmovilización). Además, como medio se usó 10HycloneRPMI.
Se determinó la relación de células con
expresión positiva de IL-2R de la misma manera que
en el punto (2) del ejemplo 2 para los CTL antes y después de la
expansión así obtenida.
Los resultados de determinación se muestran en
la tabla 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Como se muestra en la tabla 9 para CTL, en el
grupo en que se usó el equipo de cultivo (placa, botella) con el
fragmento de fibronectina inmovilizado durante la inducción y la
expansión de CTL, se observó un aumento en la relación de expresión
de IL-2R comparada con la del grupo control tanto
antes como después de la expansión. En otras palabras, se aclaró que
los CTL se podían expandir manteniendo un nivel de expresión alto de
IL-2R, comparable al del fragmento disuelto en el
medio, usando el fragmento inmovilizado de fibronectina.
\vskip1.000000\baselineskip
La inducción de CTL de memoria
anti-virus de la gripe se llevó a cabo de la misma
manera que en el punto (2) del ejemplo 1 usando las PBMC que se
aislaron y almacenaron de la misma manera que en el punto (1) del
ejemplo 1. La actividad citotóxica de los CTL el decimocuarto día
después del inicio de la inducción se evaluó de la misma manera que
en el punto (3) del ejemplo 1. Como resultado, apenas hubo
diferencias en la actividad citotóxica por la presencia o ausencia
de la adición de FNfr durante la inducción.
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Se determinó la relación de la expresión del
receptor de interleuquina-2 (IL-2R)
en los CTL (en especial en la superficie de células CD8 positivas)
preparados en el punto (1) del ejemplo 9 el decimocuarto día desde
el inicio de la inducción según el método descrito en el punto (4)
del ejemplo 1. Aquí, en este procedimiento, se usó un anticuerpo de
ratón anti-CD8 humano marcado con FITC como
anticuerpo primario, y se usó un anticuerpo de ratón
anti-IL-2R (CD25) humano marcado con
PE (fabricado por DAKO) como anticuerpo secundario. Los resultados
se muestran en la tabla 10.
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\vskip1.000000\baselineskip
Como se muestra en la tabla 10, en los CTL
inducidos con adición de varios fragmentos de fibronectina, se
observó un aumento en la relación de expresión de
IL-2R en la población de células CD8 positivas. En
otras palabras, se aclaró que los CTL se podían inducir con aumento
en el nivel de expresión de IL-2R en la superficie
de células CD8 llevando a cabo la inducción en copresencia del
fragmento de fibronectina.
\vskip1.000000\baselineskip
La inducción de CTL de memoria
anti-virus de la gripe se llevó a cabo de la misma
manera que en el punto (2) del ejemplo 1 usando las PBMC que se
aislaron y almacenaron de la misma manera que en el punto (1) del
ejemplo 1. La actividad citotóxica de los CTL el decimocuarto día
después del inicio de la inducción se evaluó de la misma manera que
en el punto (3) del ejemplo 1. Como resultado, apenas hubo
diferencias en la actividad citotóxica por la presencia o ausencia
de la adición de fibronectina y FNfr durante la inducción.
\newpage
Los CTL preparados en el punto (1) del ejemplo
10 se expandieron de la misma manera que en el punto (2) del ejemplo
3. Se determinó la relación de contenido de células CD8 positivas
para los CTL antes y después de la expansión así obtenida de la
misma manera que en el punto (4) del ejemplo 1. Los resultados se
muestran en la tabla 11.
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Como se muestra en la tabla 11, en todos los
grupos con adición de varios fragmentos de fibronectina durante la
inducción y la expansión de CTL, se observó un aumento en la
relación de contenido de células CD8 positivas en la población
celular antes de la expansión y después de la expansión comparada
con la del grupo control.
En otras palabras, se aclaró que se podían
expandir favorablemente CTL con proliferación significativa de
células CD8 positivas tanto antes de la expansión como después de la
expansión llevando a cabo la inducción y expansión de CTL en
presencia del fragmento de fibronectina comparado con la de
fibronectina por si.
\vskip1.000000\baselineskip
La inducción de CTL de memoria
anti-virus de la gripe se llevó a cabo de la misma
manera que en el punto (2) del ejemplo 1 usando las PBMC que se
aislaron y almacenaron de la misma manera que en el punto (1) del
ejemplo 1. La actividad citotóxica de los CTL el decimocuarto día
después del inicio de la inducción se evaluó de la misma manera que
en el punto (3) del ejemplo 1. Como resultado, apenas hubo
diferencias en la actividad citotóxica por la presencia o ausencia
de la adición de fibronectina y FNfr durante la inducción.
\vskip1.000000\baselineskip
Los CTL preparados en el punto (1) del ejemplo
11 se expandieron de la misma manera que en el punto (2) del ejemplo
3. Se determinó la relación de contenido de células con expresión
positiva de IL-2R para los CTL antes y después de la
expansión así obtenida de la misma manera que en el punto (4) del
ejemplo 1. Los resultados se muestran en la tabla 12.
Como se muestra en la tabla 12, en todos los
grupos con adición de fragmentos de fibronectina durante la
inducción y la expansión de CTL, se observó un aumento en la
relación de contenido de células con expresión positiva de
IL-2R en la población celular antes de la expansión
y después de la expansión comparada con la del grupo control. Esta
relación aumentada fue significativamente alta comparada con el
grupo con la adición de fibronectina.
En otras palabras, se aclaró que se podían
expandir favorablemente CTL con proliferación significativa de
células con expresión positiva de IL-2R tanto antes
de la expansión como después de la expansión llevando a cabo la
inducción y expansión de CTL en presencia del fragmento de
fibronectina comparado con la de fibronectina por si.
\vskip1.000000\baselineskip
La inducción de CTL de memoria
anti-virus de la gripe se llevó a cabo de la misma
manera que en el punto (2) del ejemplo 1 usando las PBMC que se
aislaron y almacenaron de la misma manera que en el punto (1) del
ejemplo 1. La actividad citotóxica de los CTL el decimocuarto día
después del inicio de la inducción se evaluó de la misma manera que
en el punto (3) del ejemplo 1. Como resultado, apenas hubo
diferencias en la actividad citotóxica por la presencia o ausencia
de la adición de fibronectina y FNfr durante la inducción.
\vskip1.000000\baselineskip
Se expandieron los CTL preparados en el punto
(2) del ejemplo 12 de la misma manera que en el punto (2) del
ejemplo 3. Además, se usó como medio 10HycloneRPMI.
Se evaluó el grado en que se mantuvo la
actividad citotóxica de los CTL así expandidos comparada con la de
antes de la expansión como "mantenimiento de la actividad
citotóxica (%)".
Los resultados de la determinación se muestran
en la tabla 13.
Como se muestra en la tabla 13, los CTL del
grupo con adición de fragmento de fibronectina durante la inducción
y la expansión mantuvieron una actividad citotóxica específica alta
incluso después de la expansión durante 14 días comparada con la del
grupo control sin adición de fragmento de fibronectina. Además, su
actividad era significativamente alta comparada con el grupo con la
adición de fibronectina.
En otras palabras, se aclaró que los CTL se
podían expandir favorablemente en un estado en el que se mantenía la
alta actividad citotóxica durante un periodo de tiempo largo
llevando a cabo la inducción y la expansión en copresencia del
fragmento de fibronectina comparado con esa en copresencia de la
fibronectina por si.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inmovilizaron un anticuerpo
anti-CD3 humano y fibronectina o fragmento de FN a
un equipo de cultivo (recipiente) usado en el siguiente experimento.
En concreto, se añadieron 1 ml (en el caso de una placa de 24
pocillos) o 2 ml (en el caso de una botella de 12,5 cm^{2}) de PBS
que contenía anticuerpo anti-CD3 humano (fabricado
por Janssen-Kyowa) (concentración final 5 \mug/ml)
a una placa de cultivo de 24 pocillos o una botella de 12,5 cm^{2}
(fabricadas por Falcon). Durante la adición, se añadieron
fibronectina o cada uno de los fragmentos de fibronectina (FNfr)
enumerados en el ejemplo de preparación 1 al grupo con adición de
fibronectina o fragmentos de FN de modo que se tuviera una
concentración final de 10 \mug/ml (en el caso de una placa de 24
pocillos) o 25 \mug/ml (en el caso de una botella de 12,5
cm^{2}). Como control, también se fijó un grupo sin adición de
fibronectina y FNfr.
Después de incubar estos equipos de cultivo a
temperatura ambiente durante 5 horas, los equipos de cultivo se
almacenaron a 4ºC hasta su uso. Inmediatamente antes de usar, se
eliminó por aspiración el PBS que contenía el anticuerpo y FNfr de
estos equipos de cultivo, y después de ello cada pocillo se lavó dos
veces con PBS y después una vez con medio XVIVO20 (fabricado por Bio
Whittaker) que contenía suero humano de tipo AB al 5% (fabricado por
Bio Whittaker) y estreptomicina-penicilina al 1%
(fabricado por Gibco BRL) (de aquí en adelante simplemente
denominado 5HXVIVO20) y los equipos de cultivo se sometieron a cada
experimento.
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Las PBMC que se prepararon en el punto (1) del
ejemplo 1 se resuspendieron en 5HXVIVO20 de modo que se tuviera una
concentración de 0,5 a 1 x 10^{6} células/ml, y después de ello la
suspensión se colocó en una placa con el anticuerpo
anti-CD3 humano inmovilizado, o una placa con el
anticuerpo anti-CD3 humano y fibronectina o FNfr
inmovilizados preparadas en el punto (1) del ejemplo 13 en un
volumen de 1 ml/pocillo y se añadió a la misma IL-2
(fabricada por Shionogi & Co., Ltd.) de modo que se tuviera una
concentración final de 1000 U/ml. Estas placas se sometieron a
cultivo a 37ºC en CO_{2} al 5% (día cero de cultivo). El segundo y
tercer días desde el inicio del cultivo, se añadió 5HXVIVO20 que
contenía IL-2 1000 U/ml en un volumen de 1
ml/pocillo. El cuarto día desde el inicio del cultivo, se transfirió
un medio de cultivo adecuadamente diluido con 5HXVIVO20 a una
botella nueva en la que no había nada inmovilizado y se añadió
IL-2 de modo que se tuviera una concentración final
de 500 U/ml. Se siguió con el cultivo, el medio de cultivo se diluyó
adecuadamente con 5HXVIVO20 cada 2 o 3 días de la misma manera que
el quinto día desde el inicio del cultivo y se añadió
IL-2 de modo que se tuviera una concentración final
de 300 a 500 U/ml. Del séptimo al decimoquinto día desde el inicio
del cultivo, se contó el número de células vivas mediante el método
de tinción de azul de tripán y se calculó como nivel de expansión
comparando el número con el número de células al inicio del cultivo.
Los resultados se muestran en la tabla 14.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Como se muestra en la tabla 14, en el grupo en
que se usó el equipo de cultivo con cada uno de los fragmentos de
fibronectina inmovilizado en una fase temprana de la inducción de
células LAK, el nivel de expansión de las células LAK es alto
comparado con la del grupo control. Además, el nivel de expansión
del grupo con cada uno de los fragmentos de fibronectina
inmovilizado fue mayor que el grupo que usaba el equipo de cultivo
con fibronectina inmovilizada el decimoquinto día desde el inicio
del cultivo. Por tanto, se aclaró que en el caso donde la expansión
se lleva a cabo durante un periodo de tiempo largo, la inducción y
cultivo de células LAK se llevan a cabo adecuadamente en incluso un
nivel de expansión mayor por la copresencia del fragmento de
fibronectina en una fase temprana de la inducción de células LAK
comparada con la de fibronectina por sí.
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La inducción y el cultivo de células LAK se
llevaron a cabo de la misma manera que en el punto (2) del ejemplo
13. Se calculó la relación de proliferación de las células desde el
cuarto día al séptimo día desde el inicio del cultivo durante esta
fase. Los resultados se muestran en la tabla 15.
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Como se muestra en la tabla 15, en el grupo en
que se usó el equipo de cultivo con cada uno de los fragmentos de
fibronectina inmovilizado en una fase temprana de la inducción de
células LAK, la relación de proliferación de células LAK del cuarto
día al séptimo día del inicio del cultivo es alta comparada con de
la del grupo control. En otras palabras, se aclaró que se podían
inducir y cultivar células LAK a una velocidad de proliferación más
rápida por la copresencia del fragmento de fibronectina en una fase
temprana de la inducción de células LAK.
\vskip1.000000\baselineskip
La inducción y el cultivo de células LAK se
llevaron a cabo de la misma manera que en el punto (2) del ejemplo
13. Durante esta fase la concentración de células al inicio del
cultivo se ajustó de modo que se tuviera una concentración de 2 x
10^{5} a 1 x 10^{6} células/ml (de 1 x 10^{5} a 5 x 10^{5}
células/cm^{2}). El decimoquinto día desde el inicio del cultivo,
se contó el número de células vivas por el método de tinción con
azul de tripán, y se calculó del nivel de expansión comparado con el
del número de células al inicio del cultivo. Los resultados se
muestran en la tabla 16.
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Como se muestra en la tabla 16, en el grupo en
que se usó el equipo de cultivo inmovilizado con cada uno de los
fragmentos de fibronectina durante la inducción de células LAK, se
obtuvo un alto nivel de expansión el decimoquinto día desde el
inicio del cultivo, independientemente del número de células al
inicio del cultivo. Por el contrario, en el grupo control el nivel
de expansión el decimoquinto día desde el inicio del cultivo fue
bajo cuando el número de células al inicio del cultivo era bajo. En
otras palabras, se aclaró que las células LAK se podían inducir y
cultivar a un nivel de expansión alto por la copresencia del
fragmento de fibronectina durante la inducción de células LAK a
partir de un bajo número de células, independientemente del número
de células al inicio del cultivo.
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Las PBMC que se prepararon en el punto (1) del
ejemplo 1 se resuspendieron en 5HXVIVO20 de modo que se tuviera una
concentración de 1 x 10^{4} células/ml, y después de ello la
suspensión se colocó en una placa con el anticuerpo
anti-CD3 humano inmovilizado, o una placa de 6
pocillos con el anticuerpo anti-CD3 humano y
fibronectina o FNfr inmovilizados preparadas de la misma manera que
en el punto (1) del ejemplo 13 en un volumen de 1 ml/pocillo. Se
añadieron a la misma cuatro mililitros de 5HXVIVO20 (1 x 10^{3}
células/cm^{2}), y se añadió a la misma IL-2
(fabricada por Shionogi & Co., Ltd.) de modo que se tuviera una
concentración final de 500 U/ml. Estas placas se sometieron a
cultivo a 37ºC en CO_{2} al 5% (día cero de cultivo). El segundo,
tercer y cuarto días desde el inicio del cultivo, se añadió
IL-2 de modo que se tuviera una concentración final
de 500 U/ml. Se siguió con el cultivo, y se añadió
IL-2 cada dos o tres días de modo que se tuviera una
concentración final de 500 U/ml desde el séptimo día y siguientes
desde el inicio del cultivo. Durante la adición, no se llevó a cabo
el procedimiento de dilución del medio de cultivo.
El decimoquinto día desde el inicio del cultivo
se contó el número de células vivas por el método de tinción de azul
de tripán y se calculó como un nivel de expansión comparando el
número con el número de células al inicio del cultivo. Los
resultados se muestran en la tabla 17.
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Como se muestra en la tabla 17, en el grupo en
que se usó el equipo de cultivo con cada uno de los fragmentos de
fibronectina inmovilizado durante la inducción de células LAK a
partir del número bajo de células, se obtuvo un alto nivel de
expansión el decimoquinto día desde el inicio del cultivo, sin
requerir el procedimiento de dilución de las células durante el
curso de la inducción. Además, este nivel de expansión fue alto
incluso cuando se comparó con el grupo que usaba el equipo de
cultivo con fibronectina inmovilizada. Por el contrario, en el grupo
control las células apenas proliferaron incluso el decimoquinto día
desde el inicio del cultivo. En otras palabras, se aclaró que las
células LAK se podían inducir y cultivar a un nivel de expansión
alto por la copresencia de fibronectina o del fragmento de
fibronectina, preferiblemente el fragmento de fibronectina, durante
la inducción de células LAK a partir de un bajo número de células,
sin requerir el procedimiento de dilución.
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La inducción y el cultivo de células LAK se
llevaron a cabo de la misma manera que en el punto (2) del ejemplo
13.
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Se determinó la relación de la expresión de
IL-2R en las células LAK que se sometieron a
inducción y cultivo en el punto (1) del ejemplo 17 según el método
descrito en el punto (2) del ejemplo 2. Los resultados se muestran
en la tabla 18. En la tabla, se muestra la relación del contenido de
las células de expresión positiva de IL-2R (%) como
relación de la expresión de IL-2R (%).
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Como se muestra en la tabla 18, en el grupo en
que se usó el equipo de cultivo con cada uno de los fragmentos de
fibronectina inmovilizado en una fase temprana de la inducción de
células LAK, se obtuvo una relación alta de expresión de
IL-2R en la superficie de células LAK. Además, esta
relación de la expresión de IL-2R fue alta incluso
cuando se comparó con el grupo que usaba el equipo de cultivo con
fibronectina inmovilizada. En otras palabras, se aclaró que se
podían inducir y cultivar células LAK con una relación de expresión
de IL-2R que era favorablemente mayor que la de la
fibronectina por sí por la copresencia del fragmento de fibronectina
durante la inducción de células LAK.
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La inducción y el cultivo de células LAK se
llevaron a cabo de la misma manera que en el punto (2) del ejemplo
13.
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Se determinó la relación de la expresión de
IL-2R en las superficies de células CD4 y células
CD8 en las células LAK que se indujeron y cultivaron en el punto (1)
del ejemplo 18 el séptimo día según el método descrito en el punto
(2) del ejemplo 9. Aquí, en este procedimiento, se usó un anticuerpo
de ratón anti-CD4 humano marcado con FITC o un
anticuerpo de ratón anti-CD8 humano marcado con FITC
como anticuerpo primario, y se usó un anticuerpo de ratón
anti-IL-2R (CD25) humano marcado con
PE como anticuerpo secundario. Los resultados se muestran en la
tabla 19.
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Como se muestra en la tabla 19, en el grupo en
que se usó el equipo de cultivo con cada uno de los fragmentos de
fibronectina inmovilizado en una fase temprana de la inducción de
células LAK, se pudo inducir una relación alta de expresión de
IL-2R en la superficie de células LAK (tanto células
CD4 positivas como CD8 positivas) durante el cultivo. En otras
palabras, se aclaró que se podían inducir y cultivar células LAK con
una relación alta de expresión de IL-2R en las
superficies celulares tanto de células CD4 positivas como CD8
positivas por la copresencia del fragmento de fibronectina durante
la inducción de células LAK.
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La inducción y el cultivo de células LAK se
llevaron a cabo de la misma manera que en el punto (2) del ejemplo
13.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó la relación de contenido de células
CD8 positivas en las células LAK que se indujeron y cultivaron en el
punto (1) del ejemplo 19 el decimoquinto día según el método
descrito en el punto (4) del ejemplo 1. Los resultados se muestran
en la tabla 20.
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\vskip1.000000\baselineskip
Como se muestra en la tabla 20, en el grupo en
que se usó el equipo de cultivo con cada uno de los fragmentos de
fibronectina inmovilizado en una fase temprana de inducción de
células LAK, se pudo inducir una alta relación de contenido de
células CD8 positivas en células LAK durante el cultivo. En otras
palabras, se aclaró que las células LAK se podían inducir y cultivar
con una alta relación de contenido de células CD8 positivas en
células LAK por la copresencia del fragmento de fibronectina durante
la inducción de las células LAK.
\vskip1.000000\baselineskip
Las PBMC que se prepararon en el punto (1) del
ejemplo 1 se resuspendieron en 5HXVIVO20 de modo que se tuviera una
concentración de 0,5 a 1 x 10^{6} células/ml, y después de ello la
suspensión se colocó en una placa con el anticuerpo
anti-CD3 humano inmovilizado, o una placa con el
anticuerpo anti-CD3 humano y FNfr inmovilizados
preparadas en el punto (1) del ejemplo 13 en un volumen de 1
ml/pocillo y se añadió a la misma IL-2 (fabricada
por Shionogi & Co., Ltd.) de modo que se tuviera una
concentración final de 1000 U/ml. Estas placas se sometieron a
cultivo a 37ºC en CO_{2} al 5% (día cero de cultivo). El segundo y
tercer días desde el inicio del cultivo, se añadió 5HXVIVO20 que
contenía IL-2 1000 U/ml en un volumen de 1
ml/pocillo. El cuarto día desde el inicio del cultivo, se transfirió
un medio de cultivo adecuadamente diluido con 5HXVIVO20 a una
botella nueva en la que no había nada inmovilizado y se añadió
IL-2 de modo que se tuviera una concentración final
de 500 U/ml. El octavo o noveno día desde el inicio del cultivo, un
medio de cultivo diluido adecuadamente con 5HXVIVO20 se transfirió a
un botella con el anticuerpo anti-CD3 humano
inmovilizado o una botella con el anticuerpo
anti-CD3 humano y FNfr inmovilizados (siempre que la
concentración del anticuerpo anti-CD3 humano usado
en la inmovilización fuera 0,5 \mug/ml) preparada de la misma
manera que en el punto (1) del ejemplo 13, y se añadió
IL-2 de modo que se tuviera una concentración final
de 500 U/ml. El undécimo día o el duodécimo día desde el inicio del
cultivo, se transfirió un medio de cultivo adecuadamente diluido
otra vez con 5HXVIVO20 a una botella nueva en la que no había nada
inmovilizado y se añadió IL-2 de modo que se tuviera
una concentración final de 500 U/ml. El decimoquinto día desde el
inicio del cultivo se contó el número de células vivas por el método
de tinción de azul de tripán y se calculó como un nivel de expansión
comparando el número con el número de células en el inicio del
cultivo. Los resultados se muestran en las tablas 21 y 22. En la
tabla, "donante" indica donantes de PBMC.
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Como se muestra en las tablas 21 y 22, en el
grupo en que se usó el equipo de cultivo en el que se inmovilizaron
repetidamente los fragmentos de fibronectina y el anticuerpo
anti-CD3 en una fase temprana y una fase intermedia
de la inducción de células LAK, el nivel de expansión de células LAK
es alto comparado con el del grupo control. Estas relaciones de
expansión eran mucho mayores que el nivel de expansión en el grupo
que usaba el equipo de cultivo en el que solo se inmovilizó
repetidamente el anticuerpo anti-CD3 en una fase
temprana y una fase intermedia de la inducción de células LAK. En
otras palabras, se aclaró que se podían inducir y cultivar células
LAK con un nivel mayor de expansión mediante estimulación usando el
fragmento de fibronectina y el anticuerpo anti-CD3
en una fase temprana y una fase intermedia de la inducción de las
células LAK.
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La inducción y el cultivo de células LAK se
llevaron a cabo de la misma manera que la del punto (1) del ejemplo
20. Se calculó la relación de proliferación de las células desde el
cuarto día al octavo día desde el inicio del cultivo y la relación
de proliferación de las células desde el undécimo día al
decimoquinto día desde inicio del cultivo durante los
procedimientos. Los resultados se muestran en las tablas 23 y
24.
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\vskip1.000000\baselineskip
Como se muestra en las tablas 23 y 24, en el
grupo en que se usó el equipo de cultivo en el que se inmovilizaron
repetidamente cada uno de los fragmentos de fibronectina y el
anticuerpo anti-CD3 en una fase temprana y una fase
intermedia de la inducción de células LAK, la relación de
proliferación de células LAK fue alta en una fase posterior de la
inducción comparada con la del grupo control. Estas relaciones de
proliferación fueron mucho mayores que la relación de proliferación
de células LAK en la fase posterior de la inducción en el grupo que
usaba el equipo de cultivo en el que solo se inmovilizó
repetidamente el anticuerpo anti-CD3 en una fase
temprana y una fase intermedia de la inducción de células LAK. En
otras palabras, se aclaró que se podían inducir y cultivar células
LAK con una relación de proliferación mayor mediante estimulación
usando el fragmento de fibronectina y el anticuerpo
anti-CD3 en una fase temprana y una fase intermedia
de la inducción de las células LAK.
\vskip1.000000\baselineskip
La inducción y el cultivo de células LAK se
llevaron a cabo de la misma manera que la del punto (1) del ejemplo
20.
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Se determinó la relación de expresión de
IL-2R en células LAK que se sometieron a inducción y
cultivo en el punto (1) del ejemplo 22 el decimoquinto día según el
método descrito en el punto (2) del ejemplo 2. Los resultados se
muestran en las tablas 25 y 26. En las tablas, la relación de
contenido de las células de expresión positiva de
IL-2R (%) se muestra como relación de expresión de
IL-2R (%).
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Como se muestra en las tablas 25 y 26, en el
grupo en que se usó el equipo de cultivo en el que se inmovilizaron
repetidamente cada uno de los fragmentos de fibronectina y el
anticuerpo anti-CD3 en una fase temprana y una fase
intermedia de la inducción de células LAK, la relación de expresión
de IL-2R en la superficie de células LAK el
decimoquinto día desde inicio del cultivo fue alta comparada con la
del control. Estas relaciones de expresión de IL-2R
fueron mucho mayores que las relaciones de proliferación en el grupo
que usaba el equipo de cultivo en el que solo se inmovilizó
repetidamente el anticuerpo anti-CD3 en una fase
temprana y una fase intermedia de la inducción de células LAK. En
otras palabras, se aclaró que se podían inducir y cultivar células
LAK con una relación de expresión de IL-2R mayor
mediante estimulación usando el fragmento de fibronectina en una
fase temprana y una fase intermedia de la inducción de las células
LAK.
\vskip1.000000\baselineskip
La inducción y el cultivo de células LAK se
llevaron a cabo de la misma manera que la del punto (1) del ejemplo
20.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó la relación de contenido de células
CD8 positivas en la población de células LAK que se sometieron a
inducción y cultivo en el punto (1) del ejemplo 23 el decimoquinto
día según el método descrito en el punto (4) del ejemplo 1. Los
resultados se muestran en la tabla 27.
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\vskip1.000000\baselineskip
Como se muestra en la tabla 27, en el grupo en
que se usó el equipo de cultivo en el que se inmovilizaron
repetidamente cada uno de los fragmentos de fibronectina y el
anticuerpo anti-CD3 en una fase temprana y una fase
intermedia de la inducción de células LAK, la relación de contenido
de células CD8 positivas en la población de células LAK el
decimoquinto día desde inicio del cultivo fue alta comparada con la
del control. Estas relaciones de contenido de células CD8 positivas
fueron mucho mayores que la relación de contenido de células CD8
positivas en el grupo que usaba el equipo de cultivo en el que solo
se inmovilizó repetidamente el anticuerpo anti-CD3
en una fase temprana y una fase intermedia de la inducción de
células LAK. En otras palabras, se aclaró que se podían inducir y
cultivar células LAK con una relación de contenido de células CD8
positivas mayor mediante estimulación usando el fragmento de
fibronectina en una fase temprana y una fase intermedia de la
inducción de las células LAK.
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 1; Región parcial de fibronectina
llamada III-8.
SEQ ID NO: 2; Región parcial de fibronectina
llamada III-9.
SEQ ID NO: 3; Región parcial de fibronectina
llamada III-10.
SEQ ID NO: 4; Región parcial de fibronectina
llamada III-12.
SEQ ID NO: 5; Región parcial de fibronectina
llamada III-13.
SEQ ID NO: 6; Región parcial de fibronectina
llamada III-14.
SEQ ID NO: 7; Región parcial de fibronectina
llamada CS-1.
SEQ ID NO: 8; Fragmento de fibronectina llamado
C-274.
SEQ ID NO: 9; Fragmento de fibronectina llamado
H-271.
SEQ ID NO: 10; Fragmento de fibronectina llamado
H-296.
SEQ ID NO: 11; Fragmento de fibronectina llamado
CH-271.
SEQ ID NO: 12; Fragmento de fibronectina llamado
CH-296.
SEQ ID NO: 13; Fragmento de fibronectina llamado
C-CS1.
SEQ ID NO: 14; Fragmento de fibronectina llamado
CHV-89.
SEQ ID NO: 15; Fragmento de fibronectina llamado
CHV-90.
SEQ ID NO: 16; Fragmento de fibronectina llamado
CHV-92.
SEQ ID NO: 17; Fragmento de fibronectina llamado
CHV-179.
SEQ ID NO: 18; Fragmento de fibronectina llamado
CHV-181.
SEQ ID NO: 19; Fragmento de fibronectina llamado
H-275-Cys.
SEQ ID NO: 20; Cebador 12S
SEQ ID NO: 21; Cebador 14A.
SEQ ID NO: 22; Cebador Cys-A
SEQ ID NO: 23; Cebador Cys-S
SEQ ID NO: 24; Péptido diseñado basado en
proteína de matriz derivada del virus de la gripe.
\vskip1.000000\baselineskip
Según el proceso descrito aquí para preparar un
linfocito citotóxico se obtiene un linfocito citotóxico en el que se
mantiene una alta actividad citotóxica, el nivel de expresión de
IL-2R aumenta significativamente y la relación de
células CD8 positivas mejora. El linfocito se usa de forma adecuada,
por ejemplo, en inmunoterapia adoptiva. Por tanto, se espera una
gran contribución del proceso descrito aquí al campo médico.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> TAKARA BIO INC.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proceso para la preparación de
linfocito que tiene actividad citotóxica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
03-021-PCT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 2002-84414
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-03-25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región parcial de fibronectina
llamada III-8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región parcial de fibronectina
llamada III-9
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región parcial de fibronectina
llamada III-10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región parcial de fibronectina
llamada III-12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región parcial de fibronectina
llamada III-13
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región parcial de fibronectina
llamada III-14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región parcial de fibronectina
llamada CS-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 274
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento de fibronectina llamado
C-274
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 271
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento de fibronectina llamado
H-271
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 296
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento de fibronectina llamado
H-296
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 549
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento de fibronectina llamado
CH-271
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 574
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento de fibronectina llamado
CH-296
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 302
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento de fibronectina llamado
C-CS1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 367
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento de fibronectina llamado
CHV-89
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 368
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento de fibronectina llamado
CHV-90
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 370
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento de fibronectina llamado
CHV-92
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 457
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento de fibronectina llamado
CHV-179
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 459
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento de fibronectina llamado
CHV-181
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 276
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento de fibronectina llamado
H-275-Cys
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador 12S
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador 14A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Cys-A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Cys-S
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido diseñado basado en proteína
de matriz del virus de la gripe
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
Claims (10)
1. Un método para preparar un linfocito
citotóxico o una preparación de linfocitos citotóxicos en donde
dicho método comprende el paso de llevar a cabo al menos uno de
inducción, mantenimiento y expansión de un linfocito citotóxico en
presencia de un polipéptido que comprende una secuencia de
aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 12.
2. El método según la reivindicación 1, en donde
el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en
SEQ ID NO: 12 está inmovilizado en una fase sólida.
3. El método según la reivindicación 2, en donde
la fase sólida es un equipo de cultivo celular o un soporte de
cultivo celular.
4. El método según la reivindicación 3, en donde
el equipo de cultivo celular es una placa de petri, una botella o
una bolsa y el soporte de cultivo celular es bolas, una membrana o
un portaobjetos de vidrio.
5. El método según la reivindicación 1 o 2, en
donde al menos uno de inducción, mantenimiento y expansión de un
linfocito citotóxico se lleva a cabo en un medio que contiene el
polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en
SEQ ID NO: 12.
6. El método según la reivindicación 1 que
comprende llevar a cabo al menos uno de inducción, mantenimiento y
expansión de un linfocito citotóxico en presencia del polipéptido
que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 12
en un equipo de cultivo celular que contiene un medio, en donde el
método satisface cualquiera de las condiciones de:
- (a)
- una relación de células al inicio del cultivo respecto a un área de cultivo en el equipo de cultivo es de 1 célula/cm^{2} a 5 x 10^{5} células/cm^{2}; y
- (b)
- una concentración de células en un medio al inicio del cultivo es de 1 célula/ml a 5 x 10^{5} células/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
7. El método según la reivindicación 6, en donde
el método excluye un paso de dilución o un paso de intercambio del
equipo de cultivo.
8. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, que comprende además el paso de transducir
un gen exógeno en un linfocito citotóxico.
9. El método según la reivindicación 8, en donde
el gen exógeno se transduce usando un retrovirus, adenovirus, virus
adenoasociado o virus simio.
10. Un método in vitro para aumentar la
expresión del receptor de interlequina-2 de una
célula, para mejorar una relación de células CD8 positivas en una
población de linfocitos citotóxicos o para mejorar o mantener la
actividad citotóxica en un linfocito citotóxico caracterizado
en que el método comprende el paso de llevar a cabo al menos uno de
inducción, mantenimiento y expansión de un linfocito citotóxico en
presencia de un polipéptido que comprende la secuencia de
aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 12.
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