도 1 은 피브로넥틴의 도메인 구조를 나타내는 모식도이다.
(발명을 실시하기 위한 최선의 형태)
본 발명은, 피브로넥틴 및/또는 그 프래그먼트의 존재하에 제조된 세포상해성 림프구에 있어서, 세포상해 활성이 높게 유지되고, IL-2R 의 발현량이 유의하게 상승되며, 또한 CD8 양성 세포의 비율이 향상되는 것을 알아내어 완성하기에 이르렀다.
또, 본 명세서에 있어서 세포상해성 림프구의 제조란, 해당 세포의 유도 (활성화), 유지, 확대 배양의 각 공정 또는 이들을 조합한 공정을 포함하는 공정을 가리킨다. 또한 본 발명의 세포상해성 림프구의 제조를, 세포상해성 림프구의 배양이라고도 한다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
(1) 본 발명에 사용되는 피브로넥틴 및 그 프래그먼트
본 명세서 중에 기재된 피브로넥틴 및 그 프래그먼트는, 천연에서 얻어진 것 또는 인위적으로 합성된 것 어느 것이든 된다. 피브로넥틴 및 그 프래그먼트는 예를 들어 루오슬라티 E. 등〔Ruoslahti E. 등, J. Biol. Chem., 제256권, 제14호, 7277∼7281페이지(1981)〕의 개시에 근거하여 천연기원의 물질로부터 실질적으로 순수한 형태로 제조할 수 있다. 여기서, 본 명세서에 기재된 실질적으로 순수한 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 프래그먼트는, 이들이 천연에서 피브로넥틴과 함께 존재하는 다른 단백질을 본질적으로 함유하지 않는 것을 의미한다. 상기한 피브로넥틴 및 그 프래그먼트는 각각 단독으로, 또는 복수 종류인 것을 혼합하여 본 발명에 사용할 수 있다.
본 발명에 사용할 수 있는 피브로넥틴 프래그먼트 및 그 프래그먼트의 제조에 관한 유용한 정보는, 기미즈카 F. 등〔Kimiduka F. 등, J. Biochem., 제110권, 284∼291페이지(1991)〕, 콘브리트 A. R. 등〔Kornbrihtt A. R. 등, EMBO J., 제4권, 제7호, 1755∼1759(1985)〕 및 세키구치 K. 등〔Sekiguchi K. 등, Biochemistry, 제25권, 제17호, 4936∼4941(1986)〕 등에서 얻을 수 있다.
본 발명에서는, 피브로넥틴 프래그먼트로는, 예를 들어 적어도 Ⅲ-8 (서열목록의 서열번호 1 로 나타내는 아미노산 서열), Ⅲ-9 (서열목록의 서열번호 2 로 나타내는 아미노산 서열), Ⅲ-10 (서열목록의 서열번호 3 으로 나타내는 아미노산 서열), Ⅲ-12 (서열목록의 서열번호 4 로 나타내는 아미노산 서열), Ⅲ-13 (서열목록의 서열번호 5 로 나타내는 아미노산 서열), Ⅲ-14 (서열목록의 서열번호 6 으로 나타내는 아미노산 서열) 및 CS-1 (서열목록의 서열번호 7 로 나타내는 아미노산 서열) 중 어느 한 영역을 구성하는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 폴리펩티드 (도 1 참조) 가 예시된다.
또, 해당 프래그먼트로는 세포 접착 활성 및/또는 헤파린 결합 활성을 갖는 것을 바람직하게 사용할 수 있다. 세포 접착 활성은, 본 발명에서 사용되는 프래그먼트 (그 세포 결합 도메인) 과 세포와의 결합을 공지된 방법을 사용하여 분석함으로써 조사할 수 있다. 예를 들어, 이러한 방법에는 윌리엄즈 D. A. 등의 방법〔Williams D. A. 등, Nature, 제352권, 438∼441페이지(1991)〕이 포함된다. 해당 방법은, 배양 플레이트에 고정화한 프래그먼트에 대한 세포의 결합을 측정하는 방법이다. 또한, 헤파린 결합 활성은 본 발명에 사용되는 프래그먼트 (그헤파린 결합 도메인) 와 헤파린의 결합을 공지된 방법을 사용하여 분석함으로써 조사할 수 있다. 예를 들어, 상기 윌리엄즈 D. A. 등의 방법에 있어서, 세포 대신에 헤파린, 예를 들어 표식 헤파린을 사용함으로써 동일한 방법으로 프래그먼트와 헤파린의 결합을 평가할 수 있다.
게다가 피브로넥틴의 프래그먼트로는, C-274 (서열목록의 서열번호 8 로 나타내는 아미노산 서열), H-271 (서열목록의 서열번호 9 로 나타내는 아미노산 서열), H-296 (서열목록의 서열번호 10 으로 나타내는 아미노산 서열), CH-271 (서열목록의 서열번호 11 로 나타내는 아미노산 서열), CH-296 (서열목록의 서열번호 12 로 나타내는 아미노산 서열), 또는 C-CS1 (서열목록의 서열번호 13 으로 나타내는 아미노산 서열) 에서 선택되는 폴리펩티드가 예시된다.
상기 CH-271, CH-296, C-274, C-CS1 의 각 프래그먼트는 VLA-5 에 결합되는 활성을 갖는 세포 결합 도메인을 갖는 폴리펩티드이다. 또한, C-CS1, H-296, CH-296 은 VLA-4 에 결합되는 활성을 갖는 세포 결합 도메인을 갖는 폴리펩티드이다. 또한 H-271, H-296, CH-271 및 CH-296 은 헤파린 결합 도메인을 갖는 폴리펩티드이다.
본 발명에서는, 상기 각 도메인이 개변된 프래그먼트도 사용할 수 있다. 피브로넥틴의 헤파린 결합 도메인은 3개의 Ⅲ 형 서열 (Ⅲ-12, Ⅲ-13, Ⅲ-14) 에 의해 구성되어 있다. 상기 Ⅲ 형 서열 중 하나 또는 두 개를 결실한 헤파린 결합 도메인을 포함하는 프래그먼트도 본 발명에 사용할 수 있다. 예를 들어, 피브로넥틴의 세포 결합 부위 (VLA-5 결합 영역, Pro1239∼Ser1515) 와 하나의 Ⅲ 형서열이 결합한 프래그먼트인 CHV-89 (서열목록의 서열번호 14 로 나타내는 아미노산 서열), CHV-90 (서열목록의 서열번호 15 로 나타내는 아미노산 서열), CHV-92 (서열목록의 서열번호 16 으로 나타내는 아미노산 서열), 혹은 두 개의 Ⅲ 형 서열이 결합한 프래그먼트인 CHV-179 (서열목록의 서열번호 17 로 나타내는 아미노산 서열), CHV-181 (서열목록의 서열번호 18 로 나타내는 아미노산 서열) 이 예시된다. CHV-89, CHV-90, CHV-92 는 각각 Ⅲ-13, Ⅲ-14, Ⅲ-12 를 포함하는 것이며, CHV-179 는 Ⅲ-13 과 Ⅲ-14 를, CHV-181 은 Ⅲ-12 와 Ⅲ-13 을 각각 포함하고 있다.
또, 상기 각 프래그먼트에 추가로 아미노산을 부가한 프래그먼트도 본 발명에 사용할 수 있다. 해당 프래그먼트는, 예를 들어 후술하는 제조예에 기재된 H-275-Cys 의 제조방법에 준하여 상기 각 프래그먼트에 원하는 아미노산을 부가함으로써 제조할 수 있다. 예를 들어 H-275-Cys (서열목록의 서열번호 19 로 나타내는 아미노산 서열) 는 피브로넥틴의 헤파린 결합 도메인을 갖고, 또한 C 말단에 시스테인 잔기를 갖는 프래그먼트이다.
또, 본 발명에 사용되는 프래그먼트로는, 본 발명이 원하는 효과가 얻어지는 한, 상기에 예시한 천연 피브로넥틴의 아미노산 서열 중 일부 이상을 포함하는 프래그먼트와 동등한 기능을 갖는, 해당 프래그먼트를 구성하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 1개 이상의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 혹은 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 이루어지는 것이어도 된다.
아미노산의 치환 등은, 본래의 폴리펩티드의 기능이 유지될 수 있는 범위 내에서 그 폴리펩티드의 물리화학적 성상 등을 변화시킬 수 있는 정도인 것이 바람직하다. 예를 들어, 아미노산의 치환 등은 본래의 폴리펩티드가 가지는 성질 (예를 들어, 소수성, 친수성, 전하, pK 등) 을 실질적으로 변화시키지 않는 범위의 보존적인 것이다. 예를 들어 아미노산의 치환은, ① 글리신, 알라닌;② 발린, 이소류신, 류신;③ 아스파라긴산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민;④ 세린, 트레오닌;⑤ 리신, 아르기닌;⑥ 페닐알라닌, 티로신의 각 그룹 내에서의 치환이고, 아미노산의 결실, 부가, 삽입은 폴리펩티드에서의 그들 대상부위 주변의 성질과 유사한 성질을 갖는 아미노산의, 대상부위 주변의 성질을 실질적으로 변화시키지 않는 범위에서의 결실, 부가, 삽입이다.
또한 「동등한 기능을 갖는다」는 것은, 피브로넥틴 프래그먼트가 갖는 (ⅰ) 세포상해성 림프구의 세포상해 활성의 유지 기능, (ⅱ) IL-2R 발현량의 증강 기능, 또는 (ⅲ) CD8 양성 세포의 비율 향상 기능 중 적어도 어느 하나의 기능을 갖는 것을 말한다. 아미노산의 치환 등을 갖는 폴리펩티드로 이루어지는 프래그먼트가 이러한 기능을 가질지에 대해서는 후술하는 실시예에 기재된 방법에 준하여 적절하게 확인할 수 있다. 또, 아미노산의 치환 등을 갖는 폴리펩티드로 이루어지는 프래그먼트로는, 세포 접착 활성 및/또는 헤파린 결합 활성을 갖는 것이 바람직하다. 세포 접착 활성 및 헤파린 결합 활성은 이들의 상기 활성측정방법에 준하여 평가할 수 있다.
아미노산의 치환 등을 갖는 폴리펩티드로 이루어지는 프래그먼트로서, 예를 들어 2개의 다른 도메인 사이에 링커로서 1개 이상의 아미노산이 삽입된 프래그먼트도 본 발명에 사용할 수 있다.
또, 피브로넥틴 자체에 대해서도 마찬가지로 그 폴리펩티드의 아미노산 서열에 1개 이상의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이고, 적어도 상기 (ⅰ)∼(ⅲ) 중 어느 하나의 기능을 갖는 폴리펩티드를 본 발명에서 사용할 수 있다.
본 명세서 중에 기재된 피브로넥틴 프래그먼트는, 예를 들어 미국특허 제5,198,423호 명세서의 기재에 기초하여 유전자 재조합체에서 제조할 수도 있다. 예를 들어, 상기한 H-271 (서열번호 9), H-296 (서열번호 10), CH-271 (서열번호 11), CH-296 (서열번호 12) 의 각 프래그먼트 및 이들을 취득하는 방법은 해당 특허명세서에 상세하게 기재되어 있다. 또한, 상기한 C-274 (서열번호 8) 프래그먼트는 미국특허 제5,102,988호 명세서에 기재된 방법에 의해 얻을 수 있다. 게다가, C-CS1 (서열번호 13) 프래그먼트는 일본특허 제3104178호 명세서에 기재된 방법에 의해 얻을 수 있다. 상기 CHV-89 (서열번호 14), CHV-90 (서열번호 15), CHV-179 (서열번호 17) 의 각 프래그먼트는 일본특허 제2729712호 명세서에 기재된 방법에 의해 얻을 수 있다. 또한, CHV-181 (서열번호 18) 프래그먼트는 국제공개 제97/18318호 팜플렛에 기재된 방법에 준하여 얻을 수 있다. CHV-92 (서열번호 16) 프래그먼트는 일본특허 제2729712호 명세서 및 국제공개 제97/18318호 팜플렛을 참조하여, 이들 문헌에 기재된 플라스미드에 기초하여 정형적으로 플라스미드를 구축하고, 그 플라스미드를 사용하여 유전공학적으로 취득할 수 있다.
이들 프래그먼트 또는 이들 프래그먼트에서 정형적으로 유도할 수 있는 프래그먼트는, 우편번호 305-8566 일본국 이바라키현 츠쿠바시 히가시 1초메 1반치 주오 제6 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허미생물기탁센터에 하기 수탁번호하에 기탁된 미생물을 사용하여 제조하거나, 또는 각 미생물이 보존하는 플라스미드를 공지된 방법에 의해 개변함으로써 제조할 수 있다;
FERM BP-2264 (H-271 을 코드하는 플라스미드를 보유하는 대장균;기탁일 1989년 1월 30일),
FERM BP-2800 (CH-296 을 코드하는 플라스미드를 보유하는 대장균;기탁일 1989년 5월 12일),
FERM BP-2799 (CH-271 을 코드하는 플라스미드를 보유하는 대장균;기탁일 1989년 5월 12일),
FERM BP-7420 (H-296 을 코드하는 플라스미드를 보유하는 대장균;기탁일 1989년 5월 12일),
FERM BP-1915 (C-274 를 코드하는 플라스미드를 보유하는 대장균;기탁일 1988년 6월 17일),
FERM BP-5723 (C-CS1 을 코드하는 플라스미드를 보유하는 대장균;기탁일 1990년 3월 5일),
FERM P-12182 (CHV-89 를 코드하는 플라스미드를 보유하는 대장균;기탁일 1991년 4월 8일),
FERM P-12183 (CHV-179 를 코드하는 플라스미드를 보유하는 대장균;기탁일 1991년 4월 8일).
피브로넥틴은 거대한 당단백질이기 때문에, 천연기원의 단백질을 제조하여 사용하는 것은 산업상 및 의약품 제조상 그다지 용이하지 않다. 또한 피브로넥틴은 생체 내에서는 혈장 중에 다량으로 존재하고 있으며, 혈액제제로서 혈장에서 얻어지는 피브로넥틴을 사용하는 경우에는 피브로넥틴 이외의 성분의 오염의 우려가 있어, 안전면에서도 문제가 있는 것도 생각할 수 있다. 또한, 피브로넥틴은 다기능 단백질인 점에서, 그 사용의 상황에 따라서는 본 발명의 방법에 효과를 나타내는 영역과는 다른 영역에 기인하는 문제가 일어나는 것도 생각할 수 있다. 이러한 점에서, 본 발명에서는 입수, 취급의 용이성, 안전면의 관점에서 바람직하게는 피브로넥틴 프래그먼트, 더욱 바람직하게는 상기한 바와 같이 하여 얻어지는 재조합 피브로넥틴 프래그먼트를 사용할 수 있다. 게다가, 후술하는 림프구의 확대 배양률의 향상, 확대 배양된 림프구에서의 IL-2R 의 발현량 상승 및 확대 배양된 림프구 집단 중 CD8 양성 세포의 비율 향상 등의 효과를 나타낼 수 있는 피브로넥틴 프래그먼트를 특히 바람직하게 사용할 수 있다. 또, 본 발명에 사용되는 피브로넥틴 프래그먼트의 분자량으로는 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는 1∼200kD, 보다 바람직하게는 5∼190kD, 더욱 바람직하게는 10∼180kD 이다.
(2) 본 발명의 세포상해성 림프구의 제조방법
이하, 본 발명의 세포상해성 림프구의 제조방법에 대해 구체적으로 설명한다. 본 발명의 방법은, 상기한 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들 혼합물의 존재하에 세포상해성 림프구의 유도, 유지 및 확대 배양 중 하나 이상을 실시하는 세포상해성 림프구의 제조방법이다.
본 명세서에서 세포상해성 림프구란 세포상해성 림프구를 함유하는 세포군을 의미한다. 또, 좁은 의미에서는 상기 세포군에 함유되어 있는 세포상해성 림프구만 가리키는 경우가 있다. 또한 본 발명에서 세포상해성 림프구의 제조란, 본 발명의 세포상해성 림프구가 될 수 있는 전구세포로부터 세포상해 활성을 갖는 림프구로의 유도, 세포상해성 림프구의 유지, 세포상해성 림프구 및/또는 전구세포를 사용한 세포상해성 림프구의 확대 배양 모두를 포함하는 것이다.
본 발명의 세포상해성 림프구로는 특별히 한정하는 것은 아니지만, 예를 들어 항원특이적인 세포상해 활성을 갖는 세포상해성 T 세포 (CTL), 림포카인 활성화 킬러 세포 (LAK 세포), 종양 침윤 림프구 (TIL), NK 세포 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 세포상해성 림프구가 될 수 있는, 즉 그 림프구로의 분화능을 갖는 전구세포로는 PBMC, NK 세포, 나이브 세포, 메모리 세포, 조혈 줄기세포, 제대혈 단핵구 등이 예시된다. 또한, 혈구계 세포라면 본 발명에서 전구세포로서 사용할 수 있다. 이들 세포는 생체로부터 채취된 것을 그대로 또는 동결 저장한 것 모두 사용할 수 있다. 또, 본 발명의 세포상해성 림프구의 제조방법에서는, 상기 세포를 함유하는 재료, 예를 들어 말초혈액, 제대혈 등의 혈액이나, 혈액으로부터 적혈구나 혈장 등의 성분을 제거한 것, 골수액 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 세포상해성 림프구의 제조방법은, 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들 혼합물로부터 선택되는 유효성분의 존재하에 세포상해성 림프구를 제조하는 것을 하나의 큰 특징으로 한다.
본 발명의 방법에 있어서, 세포상해성 림프구의 유도, 유지 및/또는 확대 배양은, 통상 본 발명의 상기 유효성분의 존재하에 소정 성분을 포함하는 배지 중에서 실시된다.
예를 들어, 본 발명의 방법에서 세포상해성 림프구의 유도 또는 확대 배양을 의도하는 경우, 본 발명에서 사용되는 배양 개시시의 세포 (세포상해성 림프구 및/또는 전구세포) 수로는 특별히 한정은 없지만, 예를 들어 1∼1 ×108개 세포/㎖ 가 바람직하다. 또한, 배양조건에 특별히 한정은 없으며, 통상의 세포 배양에 사용되는 조건을 사용할 수 있다. 예를 들어 37℃, 5% CO2등의 조건에서 배양할 수 있다. 또한, 적당한 시간간격으로 배지를 신선한 것으로 교환할 수 있다.
본 발명의 세포상해성 림프구의 제조방법에서 사용되는 배지에는 특별히 한정은 없으며, 세포상해성 림프구, 그 전구세포의 유지, 생육에 필요한 성분을 혼합하여 제작된 공지의 배지를 사용할 수 있고, 예를 들어 시판되는 배지이어도 된다. 이들 배지는 그 본래의 구성성분 이외에 적당한 단백질, 사이토카인류, 그 밖의 성분을 함유하고 있어도 된다. 바람직하게는, IL-2 를 함유하는 배지가 본 발명에 사용된다. IL-2 의 배지 중의 농도로는 특별히 한정은 없지만, 예를 들어 바람직하게는 0.01∼1 ×105U/㎖, 보다 바람직하게는 0.1∼1 ×104U/㎖ 이다.
또, 항 CD3 항체를 더 함유하는 배지 중에서 세포상해성 림프구가 될 수 있는 전구세포를 공배양할 수도 있다. 항 CD3 항체의 배지 중 농도로는 특별히 한정은 없지만, 예를 들어 0.01∼100㎍/㎖ 가 바람직하다. 항 CD3 항체는 림프구 위의 리셉터를 활성화할 목적으로 첨가할 수 있다. 또한, 이 밖에 렉틴 등의 림프구 자극인자를 첨가할 수도 있다. 해당 성분의 배지 중 농도는 원하는 효과가 얻어진다면 특별히 한정되는 것은 아니다.
또, 이들 성분은 배지 중에 용해하여 공존시키는 것 외에 적절한 고상, 예를 들어 샤알레, 플라스크, 백 등의 세포 배양용 기재 (개방계인 것 및 폐쇄계인 것 모두 포함), 또는 비드, 멤브레인, 슬라이드글래스 등의 세포 배양용 담체에 고정화하여 사용해도 된다. 이들 고상 재질은 세포 배양에 사용할 수 있는 것이라면 특별히 한정되는 것은 아니다. 그 성분을 예를 들어 상기 기재에 고정화하는 경우, 배지를 그 기재에 넣었을 때 그 성분을 배지 중에 용해하여 사용하는 경우의 원하는 농도와 동일한 비율이 되도록 기재에 넣은 배지량에 대하여 각 성분의 일정량을 고정화하는 것이 바람직하지만, 해당 성분의 고정화량은 원하는 효과가 얻어진다면 특별히 한정되는 것은 아니다. 상기 담체는, 세포 배양시에 세포 배양용 기재 중의 배양액에 침지하여 사용된다. 상기 성분을 상기 담체에 고정화하는 경우, 그 담체를 배지에 넣었을 때 그 성분을 배지 중에 용해하여 사용하는 경우의 원하는 농도와 동일한 비율이 되도록 기재에 넣은 배지량에 대하여 각 성분의 일정량을 고정화하는 것이 바람직하지만, 해당 성분의 고정화량은 원하는 효과가 얻어진다면 특별히 한정되는 것은 아니다.
어느 경우도 상기 성분의 고정화는 공지된 방법, 예를 들어 후술하는 피브로넥틴 프래그먼트의 고정화방법에 준하여 실시할 수 있다.
또한, 국제공개 제02/14481호 팜플렛에 기재된 항원특이적인 세포상해 활성을 갖는 세포상해성 T 세포의 유도에 효과적인 산성 다당, 산성 올리고당, 산성 단당 및 그들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물이나, 하기 (A)∼(D) 에서 선택되는 물질을 상기 성분과 함께 사용해도 된다.
(A) CD44 에 결합활성을 갖는 물질
(B) CD44 리간드가 CD44 에 결합됨으로써 발생하는 시그널을 제어할 수 있는 물질
(C) 성장인자의 성장인자 리셉터에 대한 결합을 저해할 수 있는 물질
(D) 성장인자가 성장인자 리셉터에 결합됨으로써 발생하는 시그널을 제어할 수 있는 물질
상기 CD44 에 결합활성을 갖는 물질로는, 예를 들어 CD44 리간드 및/또는 항 CD44 항체가 예시된다. CD44 리간드가 CD44 에 결합됨으로써 발생하는 시그널을 제어할 수 있는 물질로는, 예를 들어 각종 인산화효소의 저해제를 들 수 있다. 성장인자의 성장인자 리셉터에 대한 결합을 저해할 수 있는 물질로는, 예를 들어 성장인자에 결합활성을 갖고 성장인자와 복합체를 형성함으로써 성장인자가 성장인자 리셉터에 결합되는 것을 저해하는 물질, 또는 성장인자 리셉터에 결합활성을 갖고 성장인자가 성장인자 리셉터에 결합되는 것을 저해하는 물질을 들 수 있다. 또한, 성장인자가 성장인자 리셉터에 결합됨으로써 발생하는 시그널을 제어할 수 있는 물질로는, 예를 들어 각종 인산화효소의 저해제를 들 수 있다. 이들 성분의 배지 중 농도는, 원하는 효과가 얻어진다면 특별히 한정되는 것은 아니다. 또, 이들 성분은 배지 중에 용해하여 공존시키는 것 외에, 상기한 바와 같은 적절한 고상으로 고정화하여 사용해도 된다.
또, 상기 각종 물질은 단독으로 또는 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 유효성분의 존재하란, 세포상해성 림프구의 유도, 유지 또는 확대 배양을 실시할 때 상기 유효성분이 그 기능을 발휘할 수 있는 상태로 존재하는 것을 말하며, 그 존재상태는 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 유효성분을 사용하는 배지에 용해시키는 경우, 공배양을 하는 배지 중에서의 본 발명의 유효성분의 함유량은 원하는 효과가 얻어진다면 특별히 한정하는 것은 아니지만, 예를 들어 바람직하게는 0.01∼10000㎍/㎖, 보다 바람직하게는 0.1∼1000㎍/㎖, 더욱 바람직하게는 1∼100㎍/㎖ 이다. 또, 유효성분은 이와 같이 배지 중에 용해하여 공존시키는 것 외에 적절한 고상, 예를 들어 샤알레, 플라스크, 백 등의 세포 배양용 기재 (개방계인 것 및 폐쇄계인 것 모두 포함), 또는 비드, 멤브레인, 슬라이드글래스 등의 세포 배양용 담체에 고정화하여 사용해도 된다. 배양된 세포상해성 림프구를 생체에 투여하는 관점에서는 특별히 한정은 없지만, 상기 유효성분을 고정화하여 사용하는 것이 바람직하다.
상기한 여러 가지의 성분이나 본 발명의 유효성분을 고상으로 고정화해 두면, 본 발명의 방법에 의해 세포상해성 림프구를 얻은 후 그 림프구와 고상을 분리하기만 하여 유효성분 등과 그 림프구를 쉽게 분리할 수 있어, 그 림프구에 대한 유효성분 등의 혼입을 막을 수 있다.
본 발명의 유효성분을 예를 들어 상기 기재에 고정화하는 경우, 배지를 그 기재에 넣었을 때 그 성분을 배지 중에 용해하여 사용하는 경우의 원하는 농도와동일한 비율이 되도록, 기재에 넣은 배지량에 대하여 각 성분의 일정량을 고정화하는 것이 바람직하지만, 원하는 효과가 얻어진다면 특별히 한정되는 것은 아니다. 유효성분을 상기 담체에 고정화하는 경우, 그 담체를 배지에 넣었을 때 그 성분을 배지 중에 용해하여 사용하는 경우의 원하는 농도와 동일한 비율이 되도록, 기재에 넣은 배지량에 대하여 각 성분의 일정량을 고정화하는 것이 바람직하지만, 원하는 효과가 얻어진다면 특별히 한정되는 것은 아니다.
예를 들어, 피브로넥틴의 프래그먼트의 고정화는 국제공개 제97/18318호 팜플렛 및 국제공개 제00/09168호 팜플렛에 기재된 방법에 의해 실시할 수 있다.
본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 세포상해성 림프구에 대하여 IL-2R 의 발현량을 측정하면, 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들 혼합물의 비존재하에 유도, 유지 및 확대 배양 중 하나 이상을 실시한 세포상해성 림프구에 비교하여 유의한 IL-2R 발현량의 증가가 인정된다. 여기서, IL-2R 발현량은 공지된 방법, 예를 들어 항 IL-2R 항체를 사용하여 측정할 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 세포상해성 림프구는 IL-2R 의 발현량이 증가하고 있다. IL-2R 는 활성화 T 세포 표면에 발현하는 활성화 마커이고, 이 분자의 발현에 따라 사이토카인 생성, 세포상해 활성, 증식활성 등이 활성화된다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 얻어지는 세포상해성 림프구는 높은 기능을 갖는 세포군이다.
또한, 본 발명의 방법에 의해 얻어지는 세포상해성 림프구는, IL-2R 의 발현량이 증가하고 있는 점에서, 배지 중에 첨가된 IL-2, 또는 세포상해성 림프구의 전구세포, 림프구 자체 또는 공존하는 그 밖의 세포가 생성한 IL-2 에 의한 자극에 대한 감수성이 향상되어 있다. 이 때문에, IL-2 가 적은 환경하 (예를 들어 체내 등) 에서도 스스로 활성화할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 세포상해성 림프구에서는, 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들 혼합물의 비존재하에 유도, 유지 및 확대 배양 중 하나 이상을 실시한 것에 비교하여 CD8 마커를 갖는 (CD8 양성) 세포가 존재하는 비율이 높다. 이것은, 예를 들어 ① CD8 양성 세포는 인터페론-γ 등의 사이토카인을 생성하여 면역 부활을 야기하고, 헬퍼 T 세포 밸런스를 Th1 계로 한다, ② CD8 양성 세포는 세포성 면역담당세포이고, 바이러스나 종양세포 등의 이물을 효율적으로 배제할 수 있다, ③ CD8 양성 세포를 얻는 경우는, 종래는 마그넷 비드나 플로우사이토미터로 CD8 양성 세포를 정제했었지만, 본 발명의 방법에서는 배양하면서 CD8 양성 세포를 많게(enrich) 할 수 있다, (4) CD8 양성 세포비가 많은 점에서, CTL 을 유도할 때의 전구세포로서의 사용에 적합하다, (5) CD8 양성 세포비가 적은 세포 집단으로부터도 CD8 양성 세포 비율을 높이면서 배양할 수 있다는 등의 이점이 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 세포상해성 림프구의 제조에서 매우 유용하다.
또, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 세포상해성 림프구에서의 CD8 양성 세포의 비율은 특별히 한정하는 것은 아니지만, 예를 들어 항 CD8 항체를 사용하여 측정할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법에 의해 제조된 세포상해성 림프구, 특히 CTL 에 관해서는 배양후의 세포를 장기간에 걸쳐 유지, 또는 이것을 증식시키더라도, 종래 관찰된 것과 같은 세포상해 활성의 현저한 저하가 없다는 우수한 성질을 갖고 있다. 즉, 그 세포상해성 림프구는, 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들 혼합물의 비존재하에 유도, 유지 및 확대 배양 중 하나 이상을 실시한 것에 비하여 세포상해 활성이 높게 유지된 것이다. 따라서, 배양된 세포상해성 림프구를 클론화함으로써 안정적인 세포상해 활성을 갖는 림프구로서 유지할 수도 있다. 또한, 유도된 CTL 에 항원, 각종 사이토카인, 항 CD3 항체 자극을 주어 증식시켜, 확대 배양할 수 있다. 이 세포상해성 림프구의 유지, 확대 배양에는 특별히 한정은 없으며, 공지된 방법을 사용할 수 있다.
상기한 세포상해성 림프구의 유지란, 세포상해성 림프구를 세포상해 활성이 있는 상태로 유지하는 것을 말한다. 그 때의 배양조건에 특별히 한정은 없으며, 통상의 세포 배양에 사용되는 조건을 적용할 수 있다. 예를 들어, 37℃, 5% CO2등의 조건에서 배양할 수 있다. 또한, 적당한 시간간격으로 배지를 신선한 것으로 교환할 수 있다. 사용되는 배지나 동시에 사용되는 그 밖의 성분 등은 상기한 것과 마찬가지이다.
본 발명의 방법에서의 세포상해성 림프구의 유지 및 확대 배양은, 본 발명의 유효성분, 즉 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들 혼합물의 존재하, 배지 중에서 세포상해성 림프구를 각각 계속 배양 및 확대 배양하는 것을 하나의 큰 특징으로 한다. 확대 배양에 의하면, 세포상해성 림프구가 갖는 세포상해 활성을 유지시킨 상태로 그 세포수를 증가시킬 수 있다. 즉, 본 발명의 방법은 하나의 양태로서 세포상해성 림프구의 확대 배양방법을 제공한다.
본 발명의 세포상해성 림프구의 확대 배양방법에 있어서, 그 배양조건에는 특별히 한정은 없으며 통상의 세포 배양에 사용되는 조건을 사용할 수 있고, 예를 들어 37℃, 5% CO2등의 조건에서 배양할 수 있다. 또한, 적당한 시간간격으로 배지를 신선한 것으로 교환할 수 있다. 사용되는 배지나 동시에 사용되는 그 밖의 성분 등은 상기한 것과 마찬가지이다.
본 발명의 확대 배양방법에 의하면, 예를 들어 CTL 의 확대 배양의 경우, 14일간의 확대 배양에 의해 100∼1000배로 세포수가 증가한 CTL 을 얻을 수 있다. 또, LAK 세포의 확대 배양의 경우의 일례로는, 7일간의 배양으로 약 200배, 9일간의 배양으로 1000배로 증가한 LAK 세포를 얻을 수 있다. 또한, 이렇게 하여 얻어진 세포상해성 림프구, 특히 CTL 에 대해서는 종래의 세포상해성 림프구의 확대 배양방법, 예를 들어 REM 법이나 개변 REM 법으로 얻어진 것에 비하여 보다 높은 세포상해 활성을 유지하고 있다. 이러한 본 발명의 효과는, 본 발명의 방법으로 확대 배양된 CTL 등이 갖는 세포상해 활성을 후술하는 실시예에 기재된 방법에 의해 측정하여 확인할 수 있다.
또한, 본 발명의 세포상해성 림프구의 제조방법의 특징으로서, 저세포수로부터 배양을 개시하는 것이 가능하다. 양자면역요법을 실시하기 위해서는 대량의 림프구가 필요해지지만, 환자로부터 대량의 림프구를 취득하는 것은 곤란하다.또한, 통상의 세포상해성 림프구의 확대 배양에서는, 사용하는 세포수에 따른 적절한 배양면적의 세포 배양용 기재의 선택이나, 적절한 배지량에서의 배양이 필요해진다. 즉, 통상은 세포 배양용 기재에서의 배양면적〔즉, 배지에 접촉하고 있는 기재 표면 부분의 면적(㎠)〕에 대한 세포량 (개수) 은 1 ×106개 세포/㎠ 이상, 세포농도는 1 ×106개 세포/㎖ 이상의 고밀도로 배양이 개시되고, 이 이하의 세포량 조건에서는 확대 배양률〔확대 배양전 세포수에 대한 확대 배양후 세포수의 비 (확대 배양후 세포수/확대 배양전 세포수)〕가 매우 낮아져, 대량의 세포상해성 림프구를 얻을 때까지 장기간의 배양기간을 요한다. 따라서, 일반적으로는 예를 들어 작은 세포 배양용 기재를 사용하여 배양을 개시한 후, 단계적으로 큰 스케일의 세포 배양용 기재를 사용하거나 또는 세포 배양용 기재의 수를 늘려 희석조작을 반복하는 등의 방법에 의해 대량의 림프구를 제조하는 것이 보통이다. 이와 같이, 통상의 세포상해성 림프구의 확대 배양에서는 복수의 배양계를 필요로 한다.
본 발명의 방법에 의해, 소량의 세포량으로 개시된 경우라도 세포 배양용 기재의 크기에 관계없이 높은 확대 배양률로 배양할 수 있다. 따라서, 종래와 같은 번거로운 세포 배양용 기재의 교환이나 희석조작은 불필요해진다. 즉, 본 발명의 방법에 의하면, 하나의 세포 배양용 기재를 사용한 배양조작에 의해, 바꿔 말하면 하나의 배양계에 의해 충분한 세포상해성 림프구의 확대 배양을 실시할 수 있다. 따라서 본 발명의 방법은, 희석하는 공정 또는 세포 배양용 기재를 교환하는 공정을 포함하지 않는 세포상해성 림프구의 제조방법이다. 특히 본 발명의 방법으로 LAK 세포를 확대 배양하는 경우, 대용량의 세포 배양용 기재에 LAK 세포가 될 수 있는 세포와 배지를 첨가하고, 그 이후는 IL-2 를 첨가하기만 하여 LAK 세포를 확대 배양하는 것이 가능하다. 간편한 조작으로 대량의 LAK 세포를 얻을 수 있다는 점에서 본 발명은 매우 유용하다. 이 때, 사용하는 본 발명의 유효성분으로는, 보다 높은 확대 배양률을 얻는다는 관점에서 바람직하게는 피브로넥틴 프래그먼트를 사용할 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 방법에 의하면 단시간에 필요량의 세포상해성 림프구를 얻을 수 있다.
예를 들어, 세포상해성 림프구의 유도, 유지 및 확대 배양 중 하나 이상을 본 발명의 유효성분의 존재하, 배지를 포함하는 세포 배양용 기재 중에서 저세포수로 개시하는 경우, 배양 개시시에 하기 (a) 및 (b) 에서 선택되는 조건을 만족시키는 세포량을 사용하여 실시할 수 있다.
(a) 사용하는 세포 배양용 기재에서의 배양면적에 대한 세포량의 비율이, 바람직하게는 1∼5 ×105개 세포/㎠, 보다 바람직하게는 10∼1 ×105개 세포/㎠, 특히 바람직하게는 1 ×102∼5 ×104개 세포/㎠ 이다.
(b) 배지 중의 세포의 농도가 바람직하게는 1∼5 ×105개 세포/㎖, 보다 바람직하게는 10∼1 ×105개 세포/㎖, 특히 바람직하게는 1 ×102∼5 ×104개 세포/㎖ 이다.
또, 여기에서 세포량이란 세포상해성 림프구 및/또는 전구세포의 개수를 말한다.
또 본 발명의 방법에서는, 세포 배양용 기재의 교환이나 희석조작의 공정을 포함하지 않는, 세포상해성 림프구의 유도, 유지 및 확대 배양 중 하나 이상을 하나의 배양계에서 실시하는 방법이 예시된다.
이하, 본 발명의 제조방법에 의해 CTL 을 제조하는 것을 예로 설명한다.
CTL 의 유도는, 상기 유효성분의 존재하 CTL 에 원하는 항원에 대한 인식능력을 부여하기 위해, 적절한 항원제시세포와 동시에 CTL 에 대한 분화능을 갖는 전구세포를, 예를 들어 임의의 배지 중에서 인큐베이트(배양)함으로써 실시된다. 전구세포는 CTL 이 되는 전단계에서 게다가 CTL 로 분화하도록 운명지어져 있는 세포라면 특별히 한정되는 것은 아니며, 예를 들어 말초혈 단핵구 (PBMC), 나이브 세포, 메모리 세포, 제대혈 단핵구, 조혈 줄기세포 등을 들 수 있다. 항원제시세포는, T 세포에 대하여 인식해야 할 항원을 제시하는 능력을 갖는 세포라면 특별히 한정은 없다. 예를 들어 단구, B 세포, T 세포, 매크로퍼지, 수상세포, 선유아세포 등에 원하는 항원을 제시시켜 본 발명에 사용할 수 있다.
본 발명에서는, 예를 들어 CTL 을 제조할 때의 전구세포 등의 배양조건은 일반적인 공지된 조건〔예를 들어, Carter J. 등, Immunology, 제57권, 제1호, 123∼129페이지(1986) 참조〕에 따르면 된다.
또한, 적절한 피더 세포와 공배양할 수도 있다. CTL 을 피더 세포와 공배양하는 경우에는, CTL, 피더 세포의 양자의 유지, 생육에 알맞은 배지인 것이 바람직하다. 해당 배지로는 시판되는 배지를 사용할 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 피더 세포는, 항 CD3 항체와 협동하여 CTL 을 자극하여 T 세포 리셉터를 활성화시키는 것이라면 특별히 한정은 없다. 본 발명에는, 예를 들어 PBMC 나 엡스타인-바 바이러스에 의해 형질전환된 B 세포 (EBV-B 세포) 가 사용된다. 통상, 피더 세포는 방사선 조사와 같은 수단으로 증식능을 빼앗은 후에 사용된다. 또, 피더 세포의 배지 중에서의 함유량은 공지된 방법에 따라 결정하면 되고, 예를 들어 1 ×105∼7개 세포/㎖ 가 바람직하다.
특히 바람직한 태양에서는, 피더 세포로서 비바이러스 감염세포, 예를 들어 EBV-B 세포 이외의 것이 사용된다. 이로써, 확대 배양된 CTL 중에 EBV-B 세포가 혼재할 가능성을 배제할 수 있어, 양자면역요법과 같은 CTL 을 이용한 의료의 안전성을 높이는 것이 가능해진다.
항원제시세포는, 항원제시능을 갖는 세포에 항원펩티드를 부가하고 그 표면에 항원펩티드를 제시시킴으로써 제조할 수 있다〔예를 들어, Bendnarek M. A. 등, J. Immunol., 제147권, 제12호, 4047∼4053페이지(1991) 참조〕. 또, 항원제시능을 갖는 세포가 항원을 처리(process)하는 능력을 갖고 있는 경우에는, 해당 세포에 항원을 부하함으로써 항원이 세포 내에 들어가 프로세싱을 받아 단편화된 항원펩티드가 세포 표면에 제시된다. 또, 항원펩티드를 항원제시능을 갖는 세포에 부가하는 경우, 사용되는 항원제시세포, 유도하고자 하는 CTL 의 MHC 구속성에 합치하는 항원펩티드가 사용된다.
또, 본 발명에서 사용되는 항원은 특별히 한정되는 것은 아니며, 예를 들어세균, 바이러스 등의 외래성 항원이나 종양 관련 항원 (암 항원) 등의 내재성 항원 등을 들 수 있다.
본 발명에서는, 항원제시세포는 비증식성으로 하는 것이 바람직하다. 세포를 비증식성으로 하기 위해서는, 예를 들어 X 선 등의 방사선 조사 또는 마이토마이신(mitomycin) 등의 약제에 의한 처리를 하면 된다.
본 발명에서의 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들 혼합물에서 선택되는 유효성분의 존재하, CTL 에 대한 분화능을 갖는 전구세포를 항원제시세포와 함께 인큐베이트(공배양)하여 CTL 을 유도하기 위한 일반적인 조건은, 공지된 조건〔예를 들어, Bendnarek M. A. 등, J. Immunol., 제147권, 제12호, 4047∼4053페이지(1991) 참조〕에 따르면 된다. 공배양 조건에는 특별히 한정은 없으며 통상의 세포 배양에 사용되는 조건을 사용할 수 있고, 예를 들어 37℃, 5% CO2등의 조건으로 배양할 수 있다. 이 공배양은 통상 2∼15일 정도 실시되지만, 그 사이에 항원제시세포를 새롭게 제조한 것으로 바꾸어 재자극해도 된다. 또한, 적당한 시간간격으로 배지를 신선한 것으로 교환할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 얻어지는 CTL 은 원하는 항원을 특이적으로 인식하는 능력을 갖고 있고, 예를 들어 그 항원을 갖는 세포를 그 세포상해 활성에 의해 특이적으로 파괴한다. 이 CTL 의 세포상해 활성은 공지된 방법에 의해 평가할 수 있다. 예를 들어, 방사성 물질, 형광 물질 등으로 표식한 표적세포에 대한 CTL 의 세포상해 활성을 CTL 에 의해 파괴된 표적세포에 유래되는 방사능이나 형광강도를 측정함으로써 평가할 수 있다. 또한, CTL 이나 표적세포에서 항원특이적으로 유리되는 GM-CSF, IFN-γ 등의 사이토카인량을 측정함으로써 검출할 수도 있다. 기타 형광색소 등에 의해 표식된 항원펩티드-MHC 복합체의 사용에 의해 직접 확인할 수도 있다. 이 경우, 예를 들어 CTL 을 CTL 특이성 항체와 커플링시킨 제 1 형광마커와 접촉시킨 후에 제 2 형광마커와 커플링시킨 항원펩티드-MHC 복합체를 접촉시키고, 그리고 2중 표식세포의 존재를 FACS (fluorescence-activated cell sorting) 분석함으로써 CTL 의 세포상해 활성을 평가할 수 있다.
또, 본 발명의 CTL 의 확대 배양방법에 관해서는, 상기 유효성분이 해당 방법에 사용되는 배양계에 존재하고 있다면 특별히 한정은 없고, 상기 이외의 종래의 CTL 확대 배양방법에 있어서 그 배양계에 상기 유효성분을 존재시켜, 즉 본 발명의 유효성분의 존재하에 전구세포 등의 배양 (예를 들어, 배양에 사용되는 배지에 상기 유효성분을 첨가하여) 이 실시되는 태양도 본 발명에 포함된다.
다음에 LAK 세포의 배양방법에 대해 상세하게 설명한다.
LAK 세포의 배양은, 상기 유효성분의 존재하 IL-2 와 함께 LAK 세포가 될 수 있는 세포를 인큐베이트함으로써 실시된다. LAK 세포가 될 수 있는 세포로는 특별히 한정되는 것은 아니며, 예를 들어 말초혈 단핵구 (PBMC), NK 세포, 제대혈 단핵구, 조혈 줄기세포, 이들 세포를 함유하는 혈액성분 등을 들 수 있다.
또한, LAK 세포를 배양하기 위한 일반적인 조건은, 공지된 조건〔예를 들어 세포공학, Vol.14, No.2, p223∼227, (1995년);세포 배양, 17, (6), p192∼195, (1991년);THE LANCET, Vol.356, p802∼807 (2000);Current Protocols inImmunology, supplement 17, UNIT7. 7 참조〕에 따르면 된다. 공배양 조건에는 특별히 한정은 없으며 통상의 세포 배양에 사용되는 조건을 사용할 수 있고, 예를 들어 37℃, 5% CO2등의 조건으로 배양할 수 있다. 이 공배양은 통상 2∼15일 정도 실시된다. 또한, 적당한 시간간격으로 배지를 신선한 것으로 교환해도 된다.
상기한 CTL, LAK 세포의 유도, 유지, 확대 배양과 같이, 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들 혼합물의 존재하에 배양함으로써 TIL 에 대해서도 높은 세포상해 활성을 갖는 세포군을 제조할 수 있다. 본 발명에서는 이들 세포의 활성화조작에서 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들 혼합물을 공존시키는 것 외에는 특별히 한정은 없으며, 상기 세포의 배양, 활성화에 알맞은 배지를 사용하여 실시할 수 있다. 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들 혼합물의 사용량, 첨가방법 등에 대해서는 상기 방법에 준하여 적절한 것을 선택하면 된다.
이상의 본 발명의 세포상해성 림프구의 제조방법에 의해 세포상해 활성이 높게 유지되고 IL-2R 의 발현량이 유의하게 상승하여, CD8 양성 세포의 비율이 향상된, 의료에 대한 사용에 적합한 세포상해성 림프구가 얻어진다. 따라서, 본 발명의 방법은, 그 한 양태로서, 추가로 본 발명의 유효성분의 존재하에 세포상해성 림프구의 유도, 유지 및 확대 배양 중 하나 이상을 실시하는 공정을 포함하는, 세포상해성 림프구에서의 인터류킨-2 리셉터의 발현을 증대시키는 방법, 본 발명의 유효성분의 존재하에 세포상해성 림프구의 유도, 유지 및 확대 배양 중 하나 이상을 실시하는 공정을 포함하는, 세포상해성 림프구에서의 CD8 양성 세포의 비율을 향상시키는 방법, 및 본 발명의 유효성분의 존재하에 세포상해성 림프구의 유도, 유지 및 확대 배양 중 하나 이상을 실시하는 공정을 포함하는, 세포상해성 림프구에서 세포상해 활성을 향상 또는 유지시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 양태로서, 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들 혼합물을 유효성분으로서 함유하는 세포 표면상의 IL-2R 발현 증강제가 제공된다. 해당 증강제는, 유효성분 그 자체, 또는 추가로 그 밖의 임의의 성분, 예를 들어 활성화하고자 하는 세포에 알맞은 배지, 단백질, 사이토카인류 (바람직하게는 IL-2), 원하는 기타 성분으로 이루어진다. 또, 상기 증강제를 함유하는 배지는 세포상해성 림프구에서의 IL-2R 발현 증강용 배지로서 사용할 수 있다. 상기 배지는 세포 배양을 위한 기본적인 성분을 임의로 함유하는 것이다. 또, 상기 증강제 및 IL-2R 발현 증강용 배지는, 본 발명의 유효성분을 사용하여 공지된 방법에 준하여 제조할 수 있다. 상기 증강제 또는 IL-2R 발현 증강용 배지 중 본 발명의 유효성분 등의 함유량은, 본 발명이 원하는 효과가 얻어진다면 특별히 한정되는 것은 아니며, 예를 들어 본 발명의 방법에 사용되는 상기 배지 중 유효성분 등의 함유량에 준하여 소망에 의해 적절히 결정할 수 있다. 또한 상기 증강제는, 직접 생체에 투여함으로써 생체내 세포 위의 IL-2R 의 발현을 증강시킬 수도 있다.
또, 본 발명의 다른 양태로서, 피브로넥틴, 그 프래그먼트 및 그들 혼합물에서 선택되는 것을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는, 배양된 림프구 집단에서의 CD8 양성 세포의 비율 향상제가 제공된다. 해당 비율 향상제는, 유효성분 그 자체, 또는 그 밖의 임의의 성분, 예를 들어 활성화하고자 하는 세포에 알맞은 배지, 단백질, 사이토카인류 (바람직하게는 IL-2), 원하는 기타 성분으로 이루어진다. 또, 상기 비율 향상제를 함유하는 배지는 세포상해성 림프구에서의 CD8 양성 세포의 비율 향상용 배지로서 사용할 수 있다. 상기 배지는 세포 배양을 위한 기본적인 성분을 임의로 함유하는 것이다. 또, 상기 비율 향상제 및 비율 향상용 배지는, 본 발명의 유효성분을 사용하여 공지된 방법에 준하여 제조할 수 있다. 상기 비율 향상제 또는 CD8 양성 세포의 비율 향상용 배지 중 본 발명의 유효성분 등의 함유량은, 상기 IL-2R 발현 증강제 등의 경우와 마찬가지로 소망에 의해 적절히 결정할 수 있다. 또한, 상기 비율 향상제는 직접 생체에 투여함으로써 생체 중 세포상해성 림프구의 비율을 향상시킬 수도 있다.
또, 본 발명의 다른 양태로서, 피브로넥틴, 그 프래그먼트 및 그들 혼합물에서 선택되는 것을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 세포상해성 림프구에서의 세포상해 활성의 향상제 또는 유지제가 제공된다. 해당 향상제 또는 유지제는 유효성분 그 자체, 또는 추가로 그 밖의 임의의 성분, 예를 들어 활성화하고자 하는 세포에 알맞은 배지, 단백질, 사이토카인류 (바람직하게는 IL-2), 원하는 그 밖의 성분으로 이루어진다. 또 상기 향상제 또는 유지제를 함유하는 배지는 세포상해성 림프구에서의 세포상해 활성의 향상용 또는 유지용 배지로서 사용할 수 있다. 상기 배지는 세포 배양을 위한 기본적인 성분을 임의로 함유하는 것이다. 또, 향상제, 유지제, 향상용 배지 및 유지용 배지는 본 발명의 유효성분을 사용하여 공지된 방법에 준하여 제조할 수 있다. 상기 향상제, 유지제,향상용 배지 및 유지용 배지의 본 발명의 유효성분의 함유량은, 본 발명이 원하는 효과가 얻어진다면 특별히 한정되는 것은 아니며, 예를 들어 본 발명의 방법에 사용되는 상기 배지 중 함유량에 준하여 소망에 의해 적절히 결정할 수 있다. 또한, 상기 향상제 및 유지제는 직접 생체에 투여함으로써 생체 중의 세포상해성 림프구의 활성을 향상 또는 유지시킬 수도 있다.
또한, 상기한 발현증강제, 비율 향상제, 세포상해 활성의 향상제 및 유지제는 그 성분이 적절한 고상, 예를 들어 샤알레, 플라스크, 백 등의 세포 배양용 기재 (개방계인 것 및 폐쇄계인 것 모두 포함), 또는 비드, 멤브레인, 슬라이드글래스 등의 세포 배양용 담체에 고정화된 형태인 것이어도 된다.
상기한 세포상해성 림프구의 제조방법을 사용하여 얻어진 림프구함유 배양물 중에는, 통상 헬퍼 T 세포 등의 세포상해성 림프구 이외의 세포도 혼재하고 있다. 그러나, 본 발명에 의해 얻어진 림프구함유 배양물 중에는 세포상해 활성을 유지하는 림프구가 많이 함유되어 있기 때문에, 그 배양물로부터 원심 분리 등에 의해 그 배양물 중의 세포를 회수하여 본 발명의 방법에 의해 얻어진 세포상해성 림프구로서 그대로 사용할 수 있다. 게다가, 상기 유효성분 등을 세포 배양용 기재 등에 고정화해두면, 얻어진 세포상해성 림프구에서의 그 성분 등의 혼입 우려는 없다.
또, 추가로 그 배양물로부터 공지된 방법에 의해 세포상해성 림프구를 많이 함유하는 세포 집단 (또는 배양물) 을 분리하여, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 세포상해성 림프구로서 사용할 수도 있다. 즉, 본 발명의 세포상해성 림프구의제조방법은, 해당 방법에 의해 얻어진 배양물에서 세포상해성 림프구를 많이 함유하는 세포 집단을 선택하는 공정을 포함할 수 있다.
세포상해성 림프구를 많이 함유하는 그 세포 집단의 선택방법에 대해서는 특별히 한정은 없지만, 예를 들어 배양물로부터 원하는 세포 표면상에 발현하고 있는 세포 표면 항원에 대한 항체, 예를 들어 항 CD8 항체를 결합시킨 세포 배양용 기재 또는 담체를 사용하여 원하는 세포만을 선택적으로 회수하는 방법이나, 플로우사이토미터를 사용하는 방법을 들 수 있다. 상기 담체로는 자기 비드나 칼럼이 예시된다. 또한, 배양물로부터 원하는 세포 이외의 세포를 흡착 제거함으로써, 원하는 세포를 많이 함유하는 세포 집단을 얻을 수도 있다. 예를 들어, 헬퍼 T 세포 표면 상에 발현하고 있는 세포 표면 항원에 대한 항체, 예를 들어 항 CD4 항체를 사용하여 해당 림프구 배양물로부터 헬퍼 T 세포를 제거할 수 있다. 이 공정에는 플로우사이토미터를 사용할 수도 있다. 이렇게 하여 얻어진 세포상해성 림프구를 많이 함유하는 세포 집단은, 배양물에서 비선택적으로 회수된 세포 집단과 비교하여 보다 강한 세포상해 활성을 갖고 있고, 특히 의료분야에서 바람직하게 사용할 수 있다.
또한 본 발명은, 상기한 본 발명의 세포상해성 림프구의 제조방법에서 얻어진 세포상해성 림프구를 제공한다. 해당 림프구, 특히 CTL 은 높은 세포상해 활성을 갖고 있고, 장기간에 걸친 계속 배양이나 확대 배양을 하더라도 세포상해 활성의 저하가 적다는 성질을 갖는다. 또한 본 발명은, 해당 림프구를 유효성분으로서 함유하는 의약(치료제)을 제공한다. 특히, 해당 림프구를 함유하는상기 치료제는 양자면역요법에 사용하기에 적합하다. 양자면역요법에서는, 환자의 치료에 알맞은 세포상해 활성을 갖는 림프구가, 예를 들어 정맥에 대한 투여에 의해 환자에게 투여된다. 해당 치료제는 제약분야에서 공지된 방법에 따라서, 예를 들어 본 발명의 방법에 의해 제조된 해당 림프구를 유효성분으로 하여 예를 들어 공지된 비경구 투여에 알맞은 유기 또는 무기의 담체, 부형제, 안정제 등과 혼합함으로써 제조할 수 있다. 또, 치료제에서의 본 발명의 림프구의 함유량, 치료제의 투여량, 해당 치료제에 관한 여러 가지 조건은 공지된 양자면역요법에 따라 적절히 결정할 수 있다.
본 발명의 세포상해성 림프구의 제조방법에서는, 해당 림프구에 외래 유전자를 도입하는 공정을 추가로 포함할 수 있다. 즉, 본 발명은 그 한 양태로서 세포상해성 림프구에 외래 유전자를 도입하는 공정을 추가로 포함하는 세포상해성 림프구의 제조방법을 제공한다. 또, 「외래」란 유전자 도입 대상인 림프구에 대하여 외래인 것을 말한다.
본 발명의 세포상해성 림프구의 제조방법, 특히 세포상해성 림프구의 확대 배양방법을 실시함으로써 배양되는 림프구의 DNA 복제능이 증강된다. 따라서, 본 발명의 세포상해성 림프구의 제조방법에 유전자의 도입공정을 포함함으로써 유전자 도입효율의 상승이 기대된다.
외래 유전자의 도입수단에는 특별히 한정은 없으며, 공지된 유전자 도입방법에 의해 적절한 것을 선택하여 사용할 수 있다. 유전자 도입의 공정은, 세포상해성 림프구를 제조할 때 임의의 시점에서 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기림프구의 유도, 유지 및/또는 확대 배양 중 어느 한 공정과 동시에 또는 그 공정 후에 실시하는 것이 작업효율의 관점에서 바람직하다.
상기한 유전자 도입방법으로는, 바이러스벡터를 사용하는 방법, 그 벡터를 사용하지 않는 방법 모두 본 발명에 사용할 수 있다. 이들 방법의 상세한 것에 관해서는 이미 많은 문헌이 공표되어 있다.
상기 바이러스벡터에는 특별히 한정은 없으며, 통상 유전자 도입방법에 사용되는 공지된 바이러스벡터, 예를 들어 레트로바이러스벡터, 렌티바이러스벡터, 아데노바이러스벡터, 아데노수반바이러스벡터, 시미안바이러스벡터, 백시니아바이러스벡터 또는 센다이바이러스벡터 등이 사용된다. 특히 바람직하게는, 바이러스벡터로는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노수반바이러스 또는 시미안바이러스가 사용된다. 상기 바이러스벡터로는 감염된 세포 중에서 자기복제할 수 없도록 복제능을 결손시킨 것이 바람직하다.
레트로바이러스벡터는, 해당 벡터가 도입되는 세포의 염색체 DNA 중에 그 벡터에 삽입되어 있는 외래 유전자를 안정적으로 넣을 수 있어, 유전자치료 등의 목적으로 사용되고 있다. 해당 벡터는 분열, 증식중인 세포에 대한 감염효율이 높은 점에서, 본 발명에서의 세포상해성 림프구의 제조공정, 예를 들어 확대 배양의 공정에서 유전자 도입을 실시하는데 바람직하다.
바이러스벡터를 사용하지 않는 유전자 도입방법에서는, 본 발명을 한정하는 것이 아니지만 예를 들어 리포솜, 리간드-폴리리신 등의 담체를 사용하는 방법이나 인산칼슘법, 일렉트로포레이션법, 파티클건법 등을 사용할 수 있다. 이 경우에는 플라스미드 DNA 나 직쇄상 DNA 에 넣어진 외래 유전자가 도입된다.
본 발명에서 세포상해성 림프구에 도입되는 외래 유전자에는 특별히 한정은 없으며, 상기 세포에 도입되었으면 하는 임의의 유전자를 선택할 수 있다. 이러한 유전자로는, 예를 들어 단백질 (예를 들어, 효소, 사이토카인류, 리셉터류 등) 을 코드하는 것 외에 안티센스핵산이나 리보자임을 코드하는 것을 사용할 수 있다. 또한, 유전자 도입된 세포의 선택을 가능하게 하는 적당한 마커 유전자를 동시에 도입해도 된다.
상기한 외래 유전자는, 예를 들어 적당한 프로모터의 제어하에 발현되도록 벡터나 플라스미드 등에 삽입하여 사용할 수 있다. 또한, 효율이 좋은 유전자의 전사를 달성하기 위해, 프로모터나 전사개시 부위와 협동하는 다른 조절요소, 예를 들어, 인핸서 서열이나 터미네이터 서열이 벡터 내에 존재하고 있어도 된다. 또, 외래 유전자를 상동(相同) 재조합에 의해 도입대상인 림프구의 염색체에 삽입하는 것을 목적으로 하여, 예를 들어 그 염색체에서의 그 유전자가 원하는 표적삽입 부위의 양측에 있는 염기서열에 각각 상동성을 갖는 염기서열로 이루어지는 프랭킹 서열 사이에 외래 유전자를 배치시켜도 된다. 도입되는 외래 유전자는 천연인 것이어도 되고 또는 인공적으로 제작된 것이어도 되며, 또는 기원을 달리하는 DNA 분자가 라이게이션 등의 공지된 수단에 의해 결합된 것이어도 된다. 또한, 그 목적에 따라 천연의 서열에 변이가 도입된 서열을 갖는 것이어도 된다.
본 발명의 방법에 의하면, 예를 들어 암 등의 환자의 치료에 사용되는 약제에 대한 내성에 관련되는 효소를 코드하는 유전자를 세포상해성 림프구에 도입하여그 림프구에 약제내성을 부여할 수 있다. 그와 같은 세포상해성 림프구를 사용하면 양자면역요법과 약제요법을 조합할 수 있고, 따라서, 보다 높은 치료효과를 얻을 수 있다. 약제내성유전자로는, 예를 들어 다제 내성유전자 (multidrug resistance gene) 가 예시된다.
한편, 상기한 양태와는 반대로 특정한 약제에 대한 감수성을 부여하는 유전자를 세포상해성 림프구에 도입하여, 그 약제에 대한 감수성을 부여할 수도 있다. 이러한 경우, 생체에 이식한 후의 림프구를 해당 약제의 투여에 의해 제거하는 것이 가능해진다. 약제에 대한 감수성을 부여하는 유전자로는, 예를 들어 티미딘키나아제 유전자가 예시된다.
본 발명의 목적은, 의료에 대한 사용에 적합한, 세포상해 활성을 높은 레벨로 유지한 세포상해성 림프구를 취득하는 방법을 제공하는 것에 있다.
즉, 본 발명은,
[1] 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들 혼합물의 존재하에 세포상해성 림프구의 유도, 유지 및 확대 배양 중 하나 이상을 실시하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포상해성 림프구의 제조방법,
[2] 세포상해성 림프구가, 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들 혼합물의 비존재하에 유도, 유지 및 확대 배양 중 하나 이상을 실시한 것에 비하여 인터류킨-2 리셉터를 고발현하는 것인 상기 [1] 에 기재된 방법,
[3] 세포상해성 림프구가, 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들 혼합물의 비존재하에 유도, 유지 및 확대 배양 중 하나 이상을 실시한 것에 비하여 CD8 양성 세포를 고비율로 함유하는 것인 상기 [1] 에 기재된 방법,
[4] 세포상해성 림프구가, 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들 혼합물의 비존재하에 유도, 유지 및 확대 배양 중 하나 이상을 실시한 것에 비하여 세포상해 활성이 높게 유지된 것인 상기 [1]∼[3] 중 어느 한 항에 기재된 방법,
[5] 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들 혼합물이 고상(高相)으로 고정화되어 이루어지는 것인 상기 [1]∼[4] 중 어느 한 항에 기재된 방법,
[6] 고상이 세포 배양용 기재 또는 세포 배양용 담체인 상기 [5] 에 기재된 방법,
[7] 세포 배양용 기재가 샤알레, 플라스크 또는 백이고, 세포 배양용 담체가 비드, 멤브레인 또는 슬라이드글래스인 상기 [6] 에 기재된 방법,
[8] 세포상해성 림프구의 유도, 유지 및 확대 배양 중 하나 이상을 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들 혼합물을 포함하는 배지 중에서 실시하는 상기 [1]∼[4] 중 어느 한 항에 기재된 방법,
[9] 피브로넥틴의 프래그먼트가, 서열목록의 서열번호 1∼7 로 나타내는 아미노산 서열을 하나 이상 포함하여 이루어지는 폴리펩티드이거나, 또는 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열에 1개 이상의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이고, 상기 폴리펩티드와 동등한 기능을 갖는 폴리펩티드인 상기 [1]∼[8] 중 어느 한 항에 기재된 방법,
[10] 피브로넥틴의 프래그먼트가, 세포 접착 활성 및/또는 헤파린 결합 활성을 갖는 것인 상기 [9] 에 기재된 방법,
[11] 피브로넥틴의 프래그먼트가, 서열목록의 서열번호 8∼19 로 나타내는 아미노산 서열 중 어느 하나로 이루어지는 폴리펩티드에서 선택되는 폴리펩티드인 상기 [9] 에 기재된 방법,
[12] 세포상해성 림프구의 유도, 유지 및 확대 배양 중 하나 이상을 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들 혼합물의 존재하, 배지를 포함하는 세포 배양용 기재 중에서 실시하는 상기 [1] 에 기재된 방법에 있어서,
(a) 배양 개시시의 세포수와 세포 배양용 기재에서의 배양면적의 비율이 1∼5 ×105개 세포/㎠ 이다, 및
(b) 배양 개시시 배지 중의 세포의 농도가 1∼5 ×105개 세포/㎖ 이다,
중 어느 하나의 조건을 만족시키는 방법,
[13] 희석하는 공정 또는 세포 배양용 기재를 교환하는 공정을 포함하지 않는 상기 [12] 에 기재된 방법,
[14] 상기 [1]∼[13] 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어지는 세포상해성 림프구,
[15] 상기 [1]∼[13] 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어지는 세포상해성 림프구를 유효성분으로서 함유하는 의약,
[16] 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들 혼합물을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 세포의 인터류킨-2 리셉터 발현 증강제,
[17] 피브로넥틴의 프래그먼트가, 서열목록의 서열번호 1∼7 로 나타내는 아미노산 서열을 하나 이상 포함하여 이루어지는 폴리펩티드이거나, 또는 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열에 1개 이상의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이고, 상기 폴리펩티드와 동등한 기능을 갖는 폴리펩티드인 상기 [16] 에 기재된 인터류킨-2 리셉터 발현 증강제,
[18] 피브로넥틴의 프래그먼트가, 세포 접착 활성 및/또는 헤파린 결합 활성을 갖는 것인 상기 [17] 에 기재된 인터류킨-2 리셉터 발현 증강제,
[19] 피브로넥틴의 프래그먼트가, 서열목록의 서열번호 8∼19 로 나타내는 아미노산 서열 중 어느 하나로 이루어지는 폴리펩티드에서 선택되는 폴리펩티드인 상기 [17] 에 기재된 인터류킨-2 리셉터 발현 증강제,
[20] 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들 혼합물을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 림프구 중의 CD8 양성 세포의 비율 향상제,
[21] 피브로넥틴의 프래그먼트가, 서열목록의 서열번호 1∼7 로 나타내는 아미노산 서열을 하나 이상 포함하여 이루어지는 폴리펩티드이거나, 또는 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열에 1개 이상의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이고, 상기 폴리펩티드와 동등한 기능을 갖는 상기 [20] 에 기재된 폴리펩티드인 CD8 양성 세포의 비율 향상제,
[22] 피브로넥틴의 프래그먼트가, 세포 접착 활성 및/또는 헤파린 결합 활성을 갖는 것인 상기 [21] 에 기재된 CD8 양성 세포의 비율 향상제,
[23] 피브로넥틴의 프래그먼트가, 서열목록의 서열번호 8∼19 로 나타내는 아미노산 서열 중 어느 하나로 이루어지는 폴리펩티드에서 선택되는 폴리펩티드인 상기 [21] 에 기재된 CD8 양성 세포의 비율 향상제,
[24] 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들 혼합물을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 세포상해성 림프구에서의 세포상해 활성의 향상제 또는 유지제,
[25] 피브로넥틴의 프래그먼트가, 서열목록의 서열번호 1∼7 로 나타내는 아미노산 서열을 하나 이상 포함하여 이루어지는 폴리펩티드이거나, 또는 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열에 1개 이상의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이고, 상기 폴리펩티드와 동등한 기능을 갖는 폴리펩티드인 상기 [24] 에 기재된 세포상해 활성의 향상제 또는 유지제,
[26] 피브로넥틴의 프래그먼트가, 세포 접착 활성 및/또는 헤파린 결합 활성을 갖는 것인 상기 [25] 에 기재된 세포상해 활성의 향상제 또는 유지제,
[27] 피브로넥틴의 프래그먼트가, 서열목록의 서열번호 8∼19 로 나타내는 아미노산 서열 중 어느 하나로 이루어지는 폴리펩티드에서 선택되는 폴리펩티드인 상기 [25] 에 기재된 세포상해 활성의 향상제 또는 유지제,
[28] 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들 혼합물의 존재하에 세포상해성 림프구의 유도, 유지 및 확대 배양 중 하나 이상을 실시하는 공정을 포함하는, 세포상해성 림프구에서의 인터류킨-2 리셉터의 발현을 증대시키는 방법,
[29] 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들 혼합물의 존재하에 세포상해성 림프구의 유도, 유지 및 확대 배양 중 하나 이상을 실시하는 공정을 포함하는, 세포상해성 림프구에서의 CD8 양성 세포의 비율을 향상시키는 방법,
[30] 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들 혼합물의 존재하에 세포상해성 림프구의 유도, 유지 및 확대 배양 중 하나 이상을 실시하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포상해성 림프구에서 세포상해 활성을 향상 또는 유지시키는 방법,
[31 세포상해성 림프구에 외래 유전자를 도입하는 공정을 추가로 포함하는 상기 [1]∼[13] 중 어느 한 항에 기재된 방법, 및
[32] 외래 유전자를 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노수반바이러스 또는 시미안바이러스를 사용하여 도입하는 상기 [31] 에 기재된 방법,
에 관한 것이다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들 기재에 조금도 한정되지 않는다.
제조예 1 피브로넥틴 프래그먼트의 제조
(1) 피브로넥틴 프래그먼트의 제조
인간 피브로넥틴 유래의 프래그먼트 H-271 는, Escherichia coli HB101/pHD101 (FERM BP-2264) 에서 미국특허 제5,198,423호 명세서에 기재된 방법에 의해 제조하였다.
또, 인간 피브로넥틴 유래의 프래그먼트 H-296, CH-271, CH-296 는 각각 Escherichia coli HB101/pHD102 (FERM BP-7420), Escherichia coli HB101/pCH101 (FERM BP-2799), Escherichia coli HB101/pCH102 (FERM BP-2800) 을 사용하여 이것을 상기한 명세서에 기재된 방법으로 배양해 그 배양물에서 제조하였다.
인간 피브로넥틴 유래의 프래그먼트 C-274 는 Escherichia coli JM109/pTF7221 (FERM BP-1915) 을 사용하여 이것을 미국특허 제5,102,988호 명세서에 기재된 방법으로 배양해 그 배양물에서 제조하였다.
인간 피브로넥틴 유래의 프래그먼트 C-CS1 은 Escherichia coli HB101/pCS25 (FERM BP-5723) 를 사용하여 일본특허 3104178호 명세서에 기재된 방법으로 배양해 그 배양물에서 제조하였다.
인간 피브로넥틴 유래의 프래그먼트 CHV-89, CHV-179 는 각각 Escherichia coli HB101/pCHV89 (FERM P-12182), Escherichia coli HB101/pCHV179 (FERM P-12183) 를 사용하여 일본특허 2729712호 명세서에 기재된 방법으로 배양해 그 배양물에서 제조하였다.
또, 인간 피브로넥틴 유래의 프래그먼트 CHV-90 은 일본특허 제2729712호 명세서에 기재된 방법으로 제조하였다. 즉, 해당 명세서에 기재된 조작에 의해 플라스미드 pCHV90 을 구축한 다음, 그 플라스미드를 보유하는 형질전환체를 배양하여 그 배양물에서 CHV-90 을 제조하였다.
인간 피브로넥틴 유래의 프래그먼트 CHV-181 은 국제공개 제97/18318호 팜플렛에 기재된 방법으로 CHV-181 를 코드하는 DNA 를 함유하는 플라스미드 (pCHV181) 를 구축한 후, 그 플라스미드가 도입된 대장균 (Escherichia coli HB101/pCHV181) 를 배양하여 그 배양물에서 상기 CHV-179 와 같은 방법으로 제조하였다.
(2) CHV-92 의 제조
상기 폴리펩티드 CHV-181 을 발현시키기 위한 플라스미드 pCHV181 에 관해, CHV-181 을 코드하는 영역 중 Ⅲ-13 영역을 코드하는 영역을 결실시킨 플라스미드 CHV92 를 구축하였다. 결실 조작은 일본특허 2729712호 명세서에 기재된, 플라스미드 pCHV179 로부터의 Ⅲ-14 코드 영역의 결실 조작에 준하여 실시하였다.
상기 플라스미드 pCHV92 로 형질전환된 대장균 HB101 (Escherichia coli HB101/pCHV92) 을 배양하여, 그 배양물에서 일본특허 제2729712호 명세서에 기재된 CHV-89 폴리펩티드의 정제방법에 준하여 정제조작하여 정제 CHV-92 표품을 얻었다.
(3) H-275-Cys의 제조
폴리펩티드 H-275-Cys 를 발현시키기 위한 플라스미드는 이하에 나타내는 조작에 따라 구축하였다. Escherichia coli HB101/pCH102 (FERM BP-2800) 에서 플라스미드 pCH102 를 제조하였다. 이 플라스미드를 주형으로 하여, 서열목록의 서열번호 20 에 염기서열을 나타내는 프라이머 12S 와 서열목록의 서열번호 21 에 염기서열을 나타내는 프라이머 14A 를 사용한 PCR 을 실시하여, 피브로넥틴의 헤파린 결합 도메인을 코드하는 약 0.8kb 의 DNA 단편을 얻었다. 얻어진 DNA 단편을 NcoI, BamHI (모두 다카라바이오사 제조) 로 소화한 후, NcoI, BamHI 으로 소화한 pTV118N (다카라바이오사 제조) 과 라이게이션함으로써 플라스미드 pRH1 을 구축하였다.
플라스미드벡터 pINⅢ-ompA1〔Ghrayeb J. 등, EMB0 J., 제3권, 제10호, 2437∼2442페이지(1984)〕를 BamHI 와 HincⅡ (다카라바이오사 제조) 로 소화하여 리포프로테인 터미네이터 영역을 포함하는 약 0.9kb 의 DNA 단편을 회수하였다. 이것을 BamHI 와 HincⅡ 로 소화한 상기 플라스미드 pRH1 과 혼합하여 라이게이션하여, lac 프로모터, 헤파린 결합 도메인을 코드하는 DNA 단편 및 리포프로테인 터미네이터를 이 순서로 포함하는 플라스미드 pRH1-T 를 얻었다.
이 플라스미드 pRH1-T 를 주형으로 하여, 서열목록의 서열번호 22 에 염기서열을 나타내는 프라이머 CyS-A 와 서열목록의 서열번호 23 에 염기서열을 나타내는 프라이머 Cys-S 를 사용한 PCR 반응 후, 회수한 증폭 DNA 단편을 NotI (다카라바이오사 제조) 로 소화하고, 다시 그 DNA 단편을 셀프라이게이션시켰다. 이렇게 하여 얻어진 고리형 DNA 를 SpeⅠ 과 ScaⅠ (다카라바이오사 제조) 로 소화하여 얻어지는 2.3kb 의 DNA 단편과, 플라스미드 pRH1-T 를 SpeⅠ 과 ScaⅠ (다카라바이오사 제조) 로 소화하여 얻어지는 2.5kb 의 DNA 단편을 혼합하여 라이게이션하여, 플라스미드 pRH-Cys 를 얻었다. 그 플라스미드에는, 상기 H-271 의 N 말단측에 Met-Ala-Ala-Ser 의 4 개 아미노산이 부가되고, 또한 C 말단에 CyS 가 부가된 폴리펩티드 H-275-CyS 가 코드되어 있다.
폴리펩티드 H-275-Cys 는 이하의 방법에 의해 제조하였다. 상기 플라스미드 pRH-Cys 로 형질전환된 대장균 HB101 (Escherichia coli HB101/pRH-Cys) 을 120㎖ 의 LB 배지 중 37℃ 에서 하룻밤 배양하였다. 배양액에서 회수한 균체를 40㎖ 의 파쇄용 완충액 (50mM Tris-HCl, 1mM EDTA, 150mM NaCl, 1mM DTT, 1mM PMSF, pH7.5) 에 현탁하고 초음파 처리하여 균체를 파쇄하였다. 원심 분리하여 얻어진 상청을 정제용 완충액 (50mM Tris-HCl, pH7.5) 으로 평형화된 하이트랩-헤파린 칼럼 (파르마시아사제) 에 제공하였다. 같은 완충액으로 칼럼 내의 비흡착 분획을 세정한 후, 0∼1M NaCl 농도구배를 갖는 정제용 완충액으로 용출하였다. 용출액을 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동으로 분석하여 H-275-Cys 의 분자량에 상당하는 분획을 모아 정제 H-275-Cys 표품을 얻었다.
실시예 1 CTL 에서의 CD8 양성 세포 비율
(1) PBMC 의 분리 및 보존
인폼드ㆍ콘센트가 얻어진 HLA-A2.1 보유 인간 정상인 도너에게서 성분 채혈한 후, 채혈액을 PBS(-)로 2배 희석하여 Ficoll-paque (파르마시아사제) 위에 중층하여 500×g 으로 20분간 원심 분리하였다. 중간층의 말초혈 단핵세포 (PBMC) 를 피펫으로 회수, 세정하였다. 채취한 PBMC 는 90% FBS (Bio Whittaker사 제조)/10% DMSO (SIGMA사 제조) 로 이루어지는 보존액에 현탁하여 액체질소 중에서 저장하였다. CTL 유도시에는 이들 보존 PBMC 를 37℃ 수욕 중에서 급속 융해하여 10㎍/㎖ DNase (Calbiochem사 제조) 를 함유하는 RPMI1640 배지 (Bio Whittaker사 제조) 로 세정한 후, 트리판블루 염색법으로 생세포수를 산출하여 각 실험에 제공하였다.
(2) 항인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 의 유도
항인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 의 유도는, Bednarek 등의 방법〔J. Immunology, 제147권, 제12호, 4047∼4053페이지(1991)〕를 일부 개변하여 실시하였다. 즉, 5% 인간 AB 형 혈청, 0.1mM 비필수아미노산, 1mM 피루브산나트륨, 2mM L-글루타민 (모두 Bio Whittaker사 제조), 10mM HEPES (나카라이테스크사 제조), 1% 스트렙토마이신-페니실린 (기브코 BRL사 제조) 을 함유하는 RPMI1640 배지 (Bio Whittaker사 제조) (이하 5HRPMI 라 함) 에 1∼4×106개 세포/㎖ 가 되도록 실시예 2-(1) 에서 제조한 PBMC 를 현탁한 후, 24웰 세포 배양 플레이트 (Falcon사 제조) 에 1㎖/웰씩 뿌리고 5% CO2습식 인큐베이터 중 37℃ 에서 1.5 시간 인큐베이트하여 플라스틱 접착성의 단구를 분리하였다. 그 후, 비접착성 세포를 RPMI1640 배지를 사용하여 회수하고, 리스폰더 세포로서 얼음 위에 보존하였다. 분리한 단구에는 항원펩티드로서 5㎍/㎖ 의 인플루엔자 바이러스 단백질 유래 에피토프 펩티드 (서열목록의 서열번호 24 에 기재된 매트릭스프로테인 유래 A2.1 결합성 펩티드) 및 1㎍/㎖ 의 β2 마이크로글로불린 (스크립스사 제조) 을 함유하는 5HRPMI 를 0.5㎖ 씩 첨가하여 2시간 실온에서 인큐베이트한 후 X 선 조사 (5500R) 하여 항원제시세포로 하였다. 각 웰로부터 펩티드액을 흡인 제거하고 웰을 RPMI1640 배지를 사용하여 세정한 후, 얼음 위에 보존해 둔 리스폰더 세포를 0.5∼2×106개 세포/㎖ 가 되도록 5HRPMI 에 현탁하여 1㎖/웰씩 항원제시세포 상에 첨가하였다. 이 때, 제조예 1 에 기재된 각 피브로넥틴 프래그먼트 (이하, FNfr 라 함) 를 최종 농도 10㎍/㎖ 가 되도록 첨가하였다. 대조로서, FNfr 를 첨가하지 않은 군도 설정하였다. 플레이트를 5% CO2중 37℃ 에서 배양하였다. 배양 개시후 2일째에 60U/㎖ 의 IL-2 (시오노기제약사 제조) 와 10㎍/㎖ 의 FNfr 을 함유하는 1㎖ 의 5HRPMI (대조는 IL-2 만 함유) 를 각 웰에 첨가, 또한 5일째에는 배양 상청을 반 제거한 후 동일한 IL-2 및 FNfr 함유 배지 (대조는 IL-2 만 함유) 를 1㎖ 씩 첨가하였다. 7일째에 상기와 같이 하여 항원제시세포를 제조한 후, 1주간 배양한 리스폰더 세포를 0.5∼2×106개 세포/㎖ 가 되도록 5HRPMI 에 현탁하고, 제조한 항원제시세포 상에 1㎖/웰씩 첨가하여 재자극하였다. 이 때, FNfr 을 최종 농도 10㎍/㎖ 가 되도록 첨가하였다 (대조는 무첨가). 재자극 후 2일째에 60U/㎖ 의 IL-2 및 10㎍/㎖ 의 FNfr 을 함유하는 (대조는 IL-2 만 함유) 1㎖ 의 5HRPMI 를 각 웰에 첨가하였다. 또한 5일째에는 배양 상청을 반 제거한 후 제거전과 동일한 내용의 배지를 1㎖ 씩 첨가하고 다시 배양을 2일 계속하여 CTL 을 유도하였다.
(3) CTL 세포상해 활성의 측정
실시예 1-(2) 에서 제조한 유도 개시후 14일째의 CTL 의 세포상해 활성은, Calcein-AM 을 사용한 세포상해 활성 측정법〔Lichtenfels R. 등, J. Immnol. Methods, 제172권, 제2호, 227∼239페이지(1994)〕으로 평가하였다. 하룻밤 에피토프펩티드와 공배양 혹은 에피토프펩티드 비존재하에서 배양한 HLA-A2.1 유지 EBV 트랜스폼 B 세포 (세포명 221A2.1) 를 1 ×106개 세포/㎖ 이 되도록 5% FBS (Bio Whittaker사 제조) 를 함유하는 RPMI1640 배지에 현탁한 후, 최종 농도 25μM 이 되도록 Calcein-AM (도타이트사 제조) 을 첨가하여 37℃ 에서 1시간 배양하였다. 세포를 Calcein-AM 을 함유하지 않은 배지에서 세정한 후 20배량의 K562 세포 (ATCC CCL-243) 와 혼합하여 Calcein 표식 표적 세포로 하였다. 또, K562세포는 리스폰더 세포 중에 혼입하는 NK 세포에 의한 비특이적 상해활성을 배제하기 위해 사용하였다.
실시예 1-(2) 에서 제조한 메모리 CTL 을 이펙터 세포로서 1 ×105∼9×106개 세포/㎖ 가 되도록 5HRPMI 에서 단계 희석후, 96웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 100㎕/웰씩 분주해 두고 여기에 1 ×105개 세포/㎖ 로 제조한 Calcein 표식 표적 세포를 100㎕/웰씩 첨가하였다. 상기 세포현탁액이 들어간 플레이트를 400 ×g 으로 1분간 원심 후, 37℃ 의 습식 CO2인큐베이터 안에서 4시간 인큐베이트하였다. 4시간 후 각 웰로부터 배양 상청 100㎕ 를 채취하고, 형광플레이트리더 (485㎚/538㎚) 에 의해 배양 상청 중에 방출된 calcein량 (형광강도) 을 측정하였다. CTL 의 세포상해 활성은 이하의 식 1 에 따라 산출하였다.
식 1:세포상해 활성 (%) =
〔(각 웰의 측정치-최소 방출량)/최대 방출량-최소 방출량)〕×100
상기 식에 있어서 최소방출량은 표적세포 및 K562 세포만 함유하는 웰의 calcein 방출량이고, 표적세포로부터의 calcein 자연방출량을 나타낸다. 또한, 최대방출량은 표적세포에 계면활성제인 TritonX-100 (나카라이테스크사 제조) 을 0.1% 가하여 세포를 완전 파괴하였을 때의 calcein 방출량을 나타내고 있다. 이 결과, 유도 직후에 세포상해 활성은 유도되고 있지만, 유도시 FNfr 첨가의 유무에 의한 세포상해 활성의 차는 거의 없었다.
(4) CTL 세포 집단 중에서의 CD8 양성 세포 함유 비율의 측정
실시예 1-(2) 에서 제조한 2×105개 세포의 CTL 을 1% 파라포름알데히드 (나카라이테스크사 제조) 를 함유하는 PBS (닛스이사 제조) 를 사용하여 고정한 후, PBS 로 세정하였다. 고정세포를 1% BSA (SIGMA사 제조) 를 함유하는 100㎕ 의 PBS 중에 현탁하고, FITC 표식 마우스 IgG1 또는 FITC 표식 마우스 항 인간 CD8 항체 (모두 DAK0사 제조) 를 첨가한 후 얼음 위에서 30분간 인큐베이트하였다. 인큐베이트후 세포를 PBS 로 세정하고 다시 1% 파라포름알데히드를 함유하는 PBS 에 현탁하였다. 이 세포를 FACS Vantage (벡튼 디킨슨사 제조) 를 사용한 플로우사이토메트리에 제공하여 CD8 양성 세포의 함유율을 측정하였다. 결과를 표 1 에 나타낸다.
피브로넥틴 프래그먼트 |
CD8 양성 세포 함유율 (%) |
대조 (FNfr 무첨가)CH-296CH-271H-271C-274H-275-CysCHV-89CHV-90CHV-181대조 (FNfr 무첨가)H-296C-CS1CHV-92CHV-179 |
60.288.865.781.486.279.070.277.073.133.040.141.644.037.8 |
표 1 에 나타내는 바와 같이, CTL 유도시에 각종 피브로넥틴 프래그먼트를 첨가한 군에서는, 이들을 첨가하지 않은 대조에 비하여 CTL 유도 개시후 14일째에서의 CD8 양성 세포의 비율이 높다. 즉, 피브로넥틴 프래그먼트를 공존시킴으로써, CD8 양성 세포를 유의하게 증식시키면서 CTL 을 유도할 수 있는 것이 분명해졌다.
실시예 2 인터류킨-2 리셉터 발현의 유도
(1) 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 의 유도
실시예 1-(1) 에 기재된 방법으로 분리, 보존한 PBMC 를 사용하여, 실시예 1-(2) 와 동일한 방법으로 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 을 유도하였다. 유도 개시후 14일째의 CTL 의 세포상해 활성을 실시예 1-(3) 에 기재된 방법으로 평가하였더니, 유도시 FNfr 첨가의 유무에 의한 세포상해 활성의 차는 거의 없었다.
(2) CTL 에서의 인터류킨-2 리셉터 발현율의 측정
실시예 2-(1) 에서 제조한 유도 개시후 14일째의 CTL 에서의 인터류킨-2 리셉터 (IL-2R) 발현율의 측정은, 실시예 1-(4) 에 기재된 방법에 준하여 실시하였다. 또, 이번 조작에서는 FITC 표식 마우스 항 인간 CD8 항체를 FITC 표식 마우스 항 인간 IL-2R (CD25) 항체 (DAK0사 제조) 로 변경하였다.
결과를 표 2 에 나타낸다.
피브로넥틴 프래그먼트 |
IL-2R 발현 양성 세포 함유율 (%) |
대조 (FNfr 무첨가)CH-296H-296H-271C-274H-275-CysCHV-89CHV-90CHV-92CHV-179CHV-181대조 (FNfr 무첨가)CH-271C-CS1 |
29.865.959.454.661.578.282.348.355.650.344.846.960.972.3 |
표 2 에 나타내는 바와 같이, 각종 피브로넥틴 프래그먼트를 첨가하여 유도된 CTL 에서는 모두 세포 집단 중 IL-2R 발현율의 상승이 보였다. 즉, 피브로넥틴 프래그먼트의 공존하에서 유도함으로써, IL-2R 발현량을 증가시키면서 CTL 을 유도할 수 있는 것이 분명해졌다.
실시예 3 CTL 의 확대 배양
(1) 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 의 유도
실시예 1-(1) 에 기재된 방법으로 분리, 보존한 PBMC 를 사용하여, 실시예 1-(2) 와 동일한 방법으로 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 을 유도하였다. 유도 개시후 14일째의 CTL 의 세포상해 활성을 실시예 1-(3) 에 기재된 방법으로 평가하였더니, 유도시 FNfr 첨가의 유무에 의한 세포상해 활성의 차는 거의 없었다.
(2) CTL 의 확대 배양
실시예 3-(1) 에서 제조한 CTL 을 5HRPMI 으로 세정후, 3×104개 세포/㎖ 로 제조하였다. 한편, 실시예 1-(1) 과 동일한 방법에 의해 채취한 HLA-A 2.1 비유지 allogenic PBMC 를 X 선 조사 (3300R) 하여 배지에서 세정후 2∼5 ×106개 세포/㎖ 으로 제조하였다. 이들 CTL (3×104개 세포) 과 allogenic PBMC (4∼10×106개 세포) 를 10㎖ 의 5HRPMI 또는 10% HycloneFBS, 0.1mM 비필수아미노산, 1mM 피루브산나트륨, 2mM L-글루타민 (모두 Bio Whittaker사 제조), 10mM HEPES (나카라이테스크사 제조), 1% 스트렙토마이신-페니실린 (기브코 BRL사 제조) 을 함유하는 RPMI1640 배지 (Bio Whittaker사 제조) (이하, 10HycloneRPMI 라 함) 에 현탁하고, 다시 최종 농도 50ng/㎖ 의 항 CD3 항체 (얀센교와사 제조) 를 가하고 12.5㎠ 의 플라스크 (팔콘사 제) 에 넣어, 37℃ 습식 CO2인큐베이터 속에서 14일간 배양하였다. 이 때, CTL 유도시에 첨가한 것과 동일한 최종 농도 10㎍/㎖ 의 FNfr 을 첨가하였다. 또, FNfr 을 첨가하지 않고 유도한 대조군에는 FNfr 은 첨가하지 않았다. 그 동안 펩티드에 의한 자극은 전혀 부가하지 않고, 배양 개시 1일째에 최종 농도 120U/㎖ 의 IL-2 를 첨가, 그리고 배양 개시후 4일째 이후는 2∼3일마다 배양 상청을 반 제거한 후, 60U/㎖ 의 IL-2 를 함유하는 5HRPMI 또는 10HycloneRPMI 5㎖ 를 각 플라스크에 첨가하였다. 이 때, FNfr 첨가군의 배지에는 동일 농도의 FNfr 을 첨가하였다. 확대 배양 개시후, 14일째에 실시예 1-(3) 과 동일한 방법으로 CTL 의 세포상해 활성을 측정하여, 확대 배양전 세포상해활성을 얼마나 유지하고 있는지를 「세포상해 활성 유지 (%)」로서 산출하였다.
「세포상해 활성 유지 (%)」는 이하의 식 2 에 따라 산출하였다.
식 2:세포상해 활성 유지 (%) =
〔확대 배양후 세포상해 활성(%)/확대 배양전 세포상해 활성(%)〕×100
측정결과를 표 3 에 나타낸다. 또, 표 중에서 E/T 비는 표적세포에 대한 이펙터 세포의 비를 나타낸다.
배지 |
피브로넥틴 프래그먼트 |
세포상해 활성 유지 (%)E/T 비=3 |
5HRPMI |
대조(FNfr 무첨가)CH-271H-296C-CS1CHV-92 |
17.353.549.349.366.2 |
10HycloneRPMI |
대조(FNfr 무첨가)CH-271H-296H-271C-CS1CHV-92 |
48.1250.8162.372.2100.2157.8 |
배지 |
피브로넥틴 프래그먼트 |
세포상해 활성 유지 (%)E/T 비=10 |
10HycloneRPMI |
대조(FNfr 무첨가)CHV-89CHV-90 |
46.369.075.6 |
배지 |
피브로넥틴 프래그먼트 |
세포상해 활성 유지 (%)E/T 비=3 |
10HycloneRPMI |
대조(FNfr 무첨가)CH-296 |
70.4113.5 |
10HycloneRPMI |
대조(FNfr 무첨가)CHV-179CHV-181 |
79.3190.094.5 |
표 3 에 나타내는 바와 같이, 유도시 및 확대 배양시에 각종 피브로넥틴 프래그먼트를 첨가한 군의 CTL 은, 피브로넥틴 프래그먼트를 첨가하지 않은 대조에 비하여 14일간의 확대 배양 후에도 특이적이고 높은 세포상해 활성을 유지하고 있었다. 즉, 피브로넥틴 프래그먼트의 공존하에서 유도, 확대 배양함으로써, 높은 세포상해 활성을 장기적으로 유지한 상태에서의 CTL 의 확대 배양할 수 있는 것이 분명해졌다.
실시예 4 CTL 확대 배양후 세포 집단에서의 IL-2R 의 발현
(1) 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 의 유도
실시예 1-(1) 에 기재된 방법으로 분리, 보존한 PBMC 를 사용하여, 실시예 1-(2) 와 동일한 방법으로 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 을 유도하였다. 유도 개시후 14일째의 CTL 의 세포상해 활성을 실시예 1-(3) 에 기재된 방법으로 평가하였더니, 유도시 FNfr 첨가의 유무에 의한 세포상해 활성의 차는 거의 없었다.
(2) 확대 배양된 CTL 에서의 인터류킨-2 리셉터 발현율의 측정
실시예 4-(1) 에서 제조한 CTL 을 실시예 3-(2) 와 동일한 방법으로 확대 배양하였다. 이렇게 해서 얻어진 확대 배양후의 CTL 에 대해, 실시예 2-(2) 에 기재된 방법으로 IL-2R 발현 양성 세포의 비율을 측정하였다. 결과를 표 4 에 나타낸다.
피브로넥틴 프래그먼트 |
IL-2R 발현 양성 세포 함유율 (%) |
대조 (FNfr 무첨가)CH-271H-296H-271C-274C-CSCHV-891CHV-90CHV-179CHV-181 |
19.545.347.748.353.539.728.660.053.750.3 |
대조 (FNfr 무첨가)CH-296 |
26.836.1 |
대조 (FNfr 무첨가)H-275-CysCHV-92 |
18.456.559.9 |
표 4 에 나타내는 바와 같이, CTL 유도시 및 확대 배양시에 각종 피브로넥틴 프래그먼트를 첨가한 군에서는 모두 확대 배양후의 세포 집단 상에서의 IL-2R 발현세포의 비율의 상승이 인정되었다.
즉, 피브로넥틴 프래그먼트의 존재하에 CTL 을 유도하여 확대 배양함으로써, IL-2R 의 발현량을 증가시키면서 CTL 을 확대 배양할 수 있는 것이 분명해졌다.
실시예 5 피브로넥틴 존재하에서의 CTL 유도, 확대 배양
(1) 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 의 유도
실시예 1-(1) 에 기재된 방법으로 분리, 보존한 PBMC 를 사용하여, 실시예 1-(2) 와 동일한 방법으로 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 을 유도하였다. 이 때, FNfr 대신에 피브로넥틴 (카르비오켐사 제조) 을 최종 농도 10㎍/㎖ 가 되도록 첨가하였다 (대조는 무첨가). 유도 개시후 14일째의 CTL 의 세포상해 활성을 실시예 1-(3) 에 기재된 방법으로 평가하였더니, 유도시 피브로넥틴 첨가의유무에 의한 세포상해 활성의 차는 거의 없었다.
(2) CTL 에서의 인터류킨-2 리셉터 발현율의 측정
실시예 5-(1) 에서 제조한 CTL 에 대해, 실시예 2-(2) 에 기재된 방법으로 IL-2R 발현 양성 세포의 비율을 측정하였다. 결과를 표 5 에 나타낸다.
피브로넥틴 |
IL-2R 발현 양성 세포 함유율 (%) |
대조 (피브로넥틴 무첨가)피브로넥틴 |
34.064.6 |
표 5 에 나타내는 바와 같이, 피브로넥틴 존재하에 유도된 CTL 에서는, 세포 집단 상에서의 IL-2R 의 발현량의 상승이 보였다.
즉, 피브로넥틴 존재하에 CTL 를 유도함으로써, IL-2R 의 발현량을 증가시키면서 CTL 을 유도할 수 있는 것이 분명해졌다.
(3) CTL 의 확대 배양
실시예 5-(1) 에서 제조한 CTL 을 실시예 3-(2) 와 동일한 방법으로 확대 배양하였다. 이 때, 유도시에 피브로넥틴이 첨가되어 있던 것에는 피브로넥틴 (칼비오켐사 제조) 을 최종 농도 10㎍/㎖ 가 되도록 첨가하였다 (대조는 무첨가). 얻어진 CTL 의 세포상해 활성을 실시예 1-(3) 과 동일한 방법으로 측정하여, 확대 배양전 세포상해 활성을 얼마나 유지하고 있는지를 「세포상해 활성 유지 (%)」로서 산출하였다.
측정결과를 표 6 에 나타낸다.
피브로넥틴 |
세포상해 활성 유지 (%) E/T 비=3 |
대조(피브로넥틴 무첨가)피브로넥틴 |
48.1148.9 |
표 6 에 나타내는 바와 같이, 피브로넥틴의 존재하에 CTL 유도 및 확대 배양을 한 군에서는 높은 세포상해 활성이 유지되고 있었다. 한편, CTL 유도시 및 확대 배양시 모두 피브로넥틴을 첨가하지 않은 대조의 세포상해 활성은 분명히 저하하고 있었다. 즉, 피브로넥틴을 CTL 유도시 및 확대 배양시에 첨가함으로써 특이적이고 세포상해 활성을 장기적으로 유지한 상태에서의 CTL 의 확대 배양할 수 있는 것이 분명해졌다.
실시예 6 고정화된 피브로넥틴 (FN) 프래그먼트 존재하에서의 CTL 확대 배양
(1) FN 프래그먼트 고정화
이하의 실험에서 사용하는 배양용 기재 (용기) 에 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화하였다. 즉, 24웰 세포 배양 플레이트, 12.5㎠ 플라스크에 각종 피브로넥틴 프래그먼트 (최종 농도 10㎍/㎖) 를 함유하는 PBS 를 1∼2㎖ 씩 첨가하여 실온에서 5시간 인큐베이트한 후, 사용시까지 4℃ 에서 보존하였다. 또 상기 플레이트, 플라스크는 사용전에 PBS 로 2회 세정하였다.
(2)항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 의 유도
실시예 1-(1) 에 기재된 방법으로 분리, 보존한 PBMC 를 사용하여, 실시예 1-(2) 의 방법에 준하여 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 를 유도하였다.이 때, 배양 기재로서 FNfr 을 고정화한 플레이트를 사용하였다 (대조에는 고정화 처리하지 않은 플레이트를 사용). 유도후의 CTL 의 세포상해 활성을 실시예 1-(3) 에 기재된 방법으로 평가하였더니, 유도시에 사용한 플레이트의 FNfr 고정화 유무에 의한 세포상해 활성의 차는 거의 없었다.
(3) CTL 의 확대 배양
실시예 6-(2) 에서 제조한 CTL 을 실시예 3-(2) 의 방법에 준하여 확대 배양하였다. 이 때, 배양 기재로서 각종 FNfr 을 고정화한 플라스크를 사용하였다 (대조에는 고정화 처리하지 않은 플라스크를 사용). 또, 배지에는 10 HycloneRPMI 를 사용하였다.
이렇게 하여 확대 배양된 CTL 의 세포상해 활성이 확대 배양전에 비하여 얼마나 유지되고 있는지를 「세포상해 활성 유지 (%)」로서 나타내어 평가하였다.
측정결과를 표 7 에 나타낸다.
피브로넥틴 프래그먼트 |
세포상해 활성 유지 (%)E/T 비=3 |
대조 (FNfr 비고정화)CH-271H-296H-271C-CS1H-275-CysCHV-92 |
48.195.495.0133.973.8137.792.7 |
대조 (FNfr 비고정화)CH296C-CS1CHV-89CHV-90CHV-179CHV-181 |
18.767.478.590.873.0112.525.6 |
표 7 에 나타내는 바와 같이, CTL 유도시 및 확대 배양시에 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 배양 기재 (플레이트, 플라스크) 를 사용한 군의 CTL 은 확대 배양후에도 특이적이고 높은 세포상해 활성을 유지하고 있었다. 한편, CTL 유도시 및 확대 배양시 모두 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화하지 않는 기재를 사용한 대조에서는, 세포상해 활성은 분명히 저하되고 있었다. 즉, 고정화된 피브로넥틴 프래그먼트를 사용함으로써, 배지 중에 용해되어 있는 프래그먼트와 같이 높은 세포상해 활성을 장기적으로 유지한 CTL 을 확대 배양할 수 있는 것이 분명해졌다.
실시예 7 CTL 확대 배양후 세포 집단에서의 CD8 양성 세포 함유 비율
(1) 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 의 유도
실시예 1-(1) 에 기재된 방법으로 분리, 보존한 PBMC 를 사용하여, 실시예 1-(2) 와 동일한 방법으로 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 를 유도하였다. 유도 개시후 14일째의 CTL 의 세포상해 활성을 실시예 1-(3) 에 기재된 방법으로 평가하였더니, 유도시 FNfr 첨가의 유무에 의한 세포상해 활성의 차는 거의 없었다.
(2) 확대 배양된 CTL 에서의 CD8 양성 세포 함유 비율의 측정
실시예 7-(1) 에서 제조한 CTL 을 실시예 3-(2) 와 동일한 방법으로 확대 배양하였다. 이렇게 해서 얻어진 확대 배양후의 CTL 에 대해, 실시예 1-(4) 에 기재된 방법으로 CD8 양성 세포 함유 비율을 측정하였다. 결과를 표 8 에 나타낸다.
피브로넥틴 프래그먼트 |
CD8 양성 세포 함유율(%) |
대조 (FNfr 무첨가)CH-296CH-271H-271 |
40.985.172.183.9 |
대조 (FNfr 무첨가)H-296C-CS1 |
75.487.286.5 |
대조 (FNfr 무첨가)CHV-90CHV-92CHV-179CHV-181 |
33.472.951.65763.5 |
표 8 에 나타내는 바와 같이, CTL 유도시 및 확대 배양시에 각종 피브로넥틴 프래그먼트를 첨가한 군에서는, 모두 확대 배양후의 세포 집단 중에서의 CD8 양성 세포 함유 비율의 상승이 인정되었다.
즉, 피브로넥틴 프래그먼트의 존재하에 CTL 을 유도하여 확대 배양함으로써, CD8 양성 세포를 유의하게 증식시키면서 CTL 을 확대 배양할 수 있는 것이 분명해졌다.
실시예 8 고정화된 피브로넥틴 프래그먼트 존재하에서 유도된 CTL 에서의 인터류킨-2 리셉터 발현의 유도
(1) FN 프래그먼트 고정화
실시예 6-(1) 과 동일한 방법으로, 배양 기재 (용기) 에 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화하였다.
(2) 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 의 유도
실시예 1-(1) 에 기재된 방법으로 분리, 보존한 PBMC 를 사용하여, 실시예 1-(2) 의 방법에 준하여 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 를 유도하였다.이 때, 배양 기재로서 실시예 8-(1) 에서 작성한 FNfr 고정화 플레이트를 사용하였다 (대조에는 고정화 처리하지 않은 플레이트를 사용). 유도후 CTL 의 세포상해 활성을 실시예 1-(3) 에 기재된 방법으로 평가하였더니, 유도시에 사용한 플레이트의 FNfr 고정화의 유무에 의한 세포상해 활성의 차는 거의 없었다.
(3) CTL 의 확대 배양
실시예 8-(2) 에서 제조한 CTL 을 실시예 3-(2) 의 방법에 준하여 확대 배양하였다. 이 때, 배양 기재로서 실시예 8-(1) 에서 작성한 FNfr 고정화 플라스크를 사용하였다 (대조에는 고정화 처리하지 않은 플라스크를 사용). 또한 배지에는 10HycloneRPMI 를 사용하였다.
이렇게 하여 얻어진 확대 배양 전후의 CTL 에 대해, 실시예 2-(2) 에 기재된 방법으로 IL-2R 발현 양성 세포 비율을 측정하였다.
측정결과를 표 9 에 나타낸다.
피브로넥틴 프래그먼트 |
확대 배양전 IL-2R발현 양성 세포 함유율 (%) |
확대 배양후 IL-2R발현 양성 세포 함유율 (%) |
대조 (FNfr 비고정화)CH-296CH-271H-296C-274C-CS1H-275-CysCHV-89CHV-90CHV-92CHV-179CHV-181 |
14.468.128.321.330.356.843.634.647.337.252.337.4 |
6.834.014.722.920.534.117.236.829.113.016.318.3 |
표 9 에 나타내는 바와 같이, CTL 유도시 및 확대 배양시에 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 배양 기재 (플레이트, 플라스크) 를 사용한 군의 CTL 은 확대 배양 전후 어느 쪽에서도 대조군과 비교하여 IL-2R 발현율의 상승을 볼 수 있었다. 즉, 고정화된 피브로넥틴 프래그먼트를 사용함으로써, 배지 중에 용해되어 있는 프래그먼트와 마찬가지로 IL-2R 발현량을 높게 유지하면서 CTL 을 확대 배양할 수 있는 것이 분명해졌다.
실시예 9 CD8 세포 표면상의 인터류킨-2 리셉터 발현의 유도
(1) 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 의 유도
실시예 1-(1) 에 기재된 방법으로 분리, 보존한 PBMC 를 사용하여, 실시예 1-(2) 와 동일한 방법으로 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 를 유도하였다. 유도 개시후 14일째의 CTL 의 세포상해 활성을 실시예 1-(3) 에 기재된 방법으로 평가하였더니, 유도시 FNfr 첨가의 유무에 의한 세포상해 활성의 차는 거의 없었다.
(2) CTL 에서의 인터류킨-2 리셉터 발현율의 측정
실시예 9-(1) 에서 제조한 유도 개시후 14일째의 CTL (특히 CD8 세포 표면상) 에서의 인터류킨-2 리셉터 (IL-2R) 발현율의 측정은, 실시예 1-(4) 에 기재된 방법에 준하여 실시하였다. 또, 이번 조작에서는 1차 항체로서 FITC 표식 마우스 항 인간 CD8 항체를, 2차 항체로서 PE 표식 마우스 항 인간 IL-2R (CD25) 항체 (DAK0사 제조) 를 사용하였다. 결과를 표 10 에 나타낸다.
피브로넥틴 프래그먼트 |
CD8/IL-2R 2중 양성 세포 집단 함유율 (%) |
대조 (FNfr 무첨가)CH-296 |
30.756.8 |
표 10 에 나타내는 바와 같이, 각종 피브로넥틴 프래그먼트를 첨가하여 유도된 CTL 에서는 CD8 양성 세포 집단에서의 IL-2R 발현율의 상승이 보였다. 즉, 피브로넥틴 프래그먼트의 공존하에서 유도함으로써 CD8 세포 표면상의 IL-2R 발현량을 증가시키면서 CTL 을 유도할 수 있는 것이 분명해졌다.
실시예 10 CTL 확대 배양 전후 세포 집단에서의 CD8 양성 세포 함유 비율
(피브로넥틴과 피브로넥틴 프래그먼트와의 비교)
(1) 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 의 유도
실시예 1-(1) 에 기재된 방법으로 분리, 보존한 PBMC 를 사용하여, 실시예 1-(2) 와 동일한 방법으로 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 를 유도하였다. 유도 개시후 14일째의 CTL 의 세포상해 활성을 실시예 1-(3) 에 기재된 방법으로 평가하였더니, 유도시의 피브로넥틴 및 FNfr 첨가의 유무에 의한 세포상해 활성의 차는 거의 없었다.
(2) 확대 배양된 CTL 에서의 CD8 양성 세포 함유 비율의 측정
실시예 10-(1) 에서 제조한 CTL 을 실시예 3-(2) 와 동일한 방법으로 확대 배양하였다. 이렇게 하여 얻어진 확대 배양 전후의 CTL 에 대해 실시예 1-(4) 에 기재된 방법으로 CD8 양성 세포 함유 비율을 측정하였다. 결과를 표 11 에 나타낸다.
|
확대 배양후CD8 양성 세포 함유율 (%) |
확대 배양전CD8 양성 세포 함유율 (%) |
대조 (FNfr 무첨가)피브로넥틴H-271CHV-90 |
50.567.375.171.3 |
31.222.551.343.5 |
표 11 에 나타내는 바와 같이, CTL 유도시 및 확대 배양시에 피브로넥틴 프래그먼트를 첨가한 군에서는, 모두 대조군에 대하여 확대 배양전 및 확대 배양후의 세포 집단 중에서의 CD8 양성 세포 함유 비율의 상승이 인정되었다.
즉, 피브로넥틴 그 자체에 비하여 피브로넥틴 프래그먼트의 존재하에 CTL 유도하여 확대 배양하는 것이, CD8 양성 세포를 확대 배양전 및 확대 배양후 어느 경우에도 유의하게 증식시키면서 CTL 을 확대 배양하기에 적합하다는 것이 분명해졌다.
실시예 11 CTL 확대 배양 전후 세포 집단에서의 IL-2R 발현의 유도
(피브로넥틴과 피브로넥틴 프래그먼트의 비교)
(1) 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 의 유도
실시예 1-(1) 에 기재된 방법으로 분리, 보존한 PBMC 를 사용하여, 실시예 1-(2) 와 동일한 방법으로 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 를 유도하였다. 유도 개시후 14일째의 CTL 의 세포상해 활성을 실시예 1-(3) 에 기재된 방법으로 평가하였더니, 유도시의 피브로넥틴 및 FNfr 첨가의 유무에 의한 세포상해 활성의 차는 거의 없었다.
(2) 확대 배양된 CTL 에서의 IL-2R 발현 양성 세포 함유 비율의 측정
실시예 11-(1) 에서 제조한 CTL 을 실시예 3-(2) 와 동일한 방법으로 확대 배양하였다. 이렇게 하여 얻어진 확대 배양 전후의 CTL 에 대해, 실시예 2-(2) 에 기재된 방법으로 IL-2R 발현 양성 세포 함유 비율을 측정하였다. 결과를 표 12 에 나타낸다.
|
확대 배양전 IL-2R 발현양성 세포 함유율 (%) |
확대 배양후 IL-2R 발현양성 세포 함유율 (%) |
대조 (FNfr 무첨가)피브로넥틴H-271 |
34.064.676.6 |
15.350.676.8 |
표 12 에 나타내는 바와 같이, CTL 유도시 및 확대 배양시에 피브로넥틴 프래그먼트를 첨가한 군에서는, 모두 대조군에 대하여 확대 배양전 및 확대 배양후의 세포 집단 중에서의 IL-2R 발현 양성 세포 함유 비율의 상승이 인정되었다. 이 상승률은 피브로넥틴을 첨가한 군에 비하여 유의하게 높은 것이었다.
즉, 피브로넥틴 그 자체에 비하여 피브로넥틴 프래그먼트의 존재하에 CTL 을 유도하여 확대 배양하는 것이, IL-2R 발현 양성 세포를 확대 배양전 및 확대 배양후 어느 경우에도 유의하게 증식시키면서 CTL 을 확대 배양하기에 적합하다는 것이 분명해졌다.
실시예 12 CTL 의 확대 배양 (피브로넥틴과 피브로넥틴 프래그먼트와의 비교)
(1) 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 의 유도
실시예 1-(1) 에 기재된 방법으로 분리, 보존한 PBMC 를 사용하여, 실시예 1-(2) 와 동일한 방법으로 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 를 유도하였다.유도 개시후 14일째의 CTL 의 세포상해 활성을 실시예 1-(3) 에 기재된 방법으로 평가하였더니, 유도시의 피브로넥틴 및 FNfr 첨가의 유무에 의한 세포상해 활성의 차는 거의 없었다.
(2) CTL 의 확대 배양
실시예 12-(1) 에서 제조한 CTL 을 실시예 3-(2) 와 동일한 방법으로 확대 배양하였다. 또한, 배지에는 10HycloneRPMI 를 사용하였다.
이렇게 하여 확대 배양된 CTL 의 세포상해 활성이 확대 배양전에 비하여 얼마나 유지되고 있는지를 「세포상해 활성 유지 (%)」로 나타내어 평가하였다.
측정결과를 표 13 에 나타낸다.
|
세포상해 활성 유지 (%)E/T 비=3 |
대조 (FNfr 무첨가)피브로넥틴CH-271 |
48.1148.9250.8 |
표 13 에 나타내는 바와 같이, 유도시 및 확대 배양시에 피브로넥틴 프래그먼트를 첨가한 군의 CTL 은, 피브로넥틴 프래그먼트를 첨가하지 않은 대조군에 비하여, 14일간의 확대 배양후도 특이적이고 높은 세포상해 활성을 유지하고 있었다. 또한 그 활성은 피브로넥틴을 첨가한 군과 비교하여 유의하게 높은 것이었다.
즉, 피브로넥틴 그 자체에 비하여 피브로넥틴 프래그먼트의 공존하에 유도, 확대 배양을 하는 것이 높은 세포상해 활성을 장기적으로 유지한 상태에서의 CTL 의 확대 배양에 바람직하다는 것이 분명해졌다.
실시예 13 LAK 세포 (Lymphokine-activated killer cells) 배양계에서의 확대 배양률의 측정
(1) 항 인간 CD3 항체 및 FN 또는 FN 프래그먼트 고정화
이하의 실험에서 사용하는 배양 기재 (용기) 에 항 인간 CD3 항체 및 피브로넥틴 또는 FN 프래그먼트를 고정화하였다. 즉 24웰 세포 배양 플레이트 또는 12.5㎠ 세포 배양 플라스크 (Falcon사 제조) 에 항 인간 CD3 항체 (얀센교와사 제조) (최종 농도 5㎍/㎖) 를 함유하는 PBS 를 1㎖ (24웰 플레이트의 경우) 또는 2㎖ (12.5㎠ 플라스크의 경우) 씩 첨가하였다. 이 때, 피브로넥틴 또는 FN 프래그먼트 첨가군에는 피브로넥틴 또는 제조예 1 에 기재된 각 피브로넥틴 프래그먼트 (FNfr) 를 최종 농도 10㎍/㎖ (24웰 플레이트의 경우) 또는 25㎍/㎖ (12.5㎠ 플라스크의 경우) 가 되도록 첨가하였다. 대조로서, 피브로넥틴 및 FNfr 을 첨가하지 않은 군도 설정하였다.
이들 배양 기재를 실온에서 5시간 인큐베이트한 후, 사용시까지 4℃ 에서 보존하였다. 사용 직전에는 이들 배양 기재로부터 항체ㆍFNfr 을 함유하는 PBS 를 흡인 제거한 후, 각 웰을 PBS 로 2회, 5% 인간 AB 형 혈청 (Bio whittaker사 제조), 1% 스트렙토마이신-페니실린 (기브코 BRL사 제조) 을 함유하는 XVIVO20 배지(Bio whittaker사 제조) (이하 5HXVIVO20 이라 함) 로 1회 세정하여 각 실험에 제공하였다.
(2) LAK 세포의 유도 및 배양
5HXVIVO20 에 0.5∼1 ×106개 세포/㎖ 가 되도록 실시예 1-(1) 에서 제조한PBMC 를 현탁한 후, 실시예 13-(1) 에서 제조한 항 인간 CD3 항체 고정화 플레이트 또는 항 인간 CD3 항체 및 피브로넥틴 또는 FNfr 고정화 플레이트에 1㎖/웰씩 뿌려 최종 농도 1000U/㎖ 가 되도록 IL-2 (시오노기제약사 제조) 를 첨가하였다. 이들 플레이트를 5% CO2중 37℃ 에서 배양하였다 (배양 0일째). 배양 개시후 2일째, 3일째에는 1000U/㎖ 의 IL-2 를 함유하는 5HXVIVO20 을 1 ㎖/웰씩 첨가하였다. 배양 개시후 4일째에는 적절히 5HXVIVO20 을 사용하여 희석한 배양액을 아무 것도 고정화하지 않은 새로운 플라스크로 옮겨 최종 농도 500U/㎖ 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양을 계속하여 2∼3일마다 배양 개시 5일째와 마찬가지로 적절히 5HXVIVO20 을 사용하여 희석하여 최종 농도 300∼500U/㎖ 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시후 7∼15일째에 트리판블루 염색법으로 생세포수를 계측하여, 배양 개시시의 세포수와 비교한 확대 배양률로서 산출하였다. 결과를 표 14 에 나타낸다.
배양일수 |
FN/FN 프래그먼트 |
확대 배양률 (배율) |
7일간 |
대조 (FN/FNfr 비고정화)피브로넥틴CH-296H-296 |
x103x233x218x247 |
9일간 |
대조 (FN/FNfr 비고정화)피브로넥틴CH-296H-296 |
x250x1190x1286x1075 |
11일간 |
대조 (FN/FNfr 비고정화)피브로넥틴CH-296H-296 |
x576x2304x1728x2088 |
|
대조 (FN/FNfr 비고정화)C-CS1 |
x660x1170 |
15일간 |
대조 (FN/FNfr 비고정화)피브로넥틴CH-296 |
x1980x3348x5364 |
|
대조 (FN/FNfr 비고정화)C-CS1 |
x2906x5117 |
표 14 에 나타내는 바와 같이, LAK 세포 유도 초기에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에서는, 대조군에 비하여 LAK 세포의 확대 배양률이 높다. 또한, 각 피브로넥틴 프래그먼트 고정화군의 확대 배양률은 배양 개시후 15일째에는 피브로넥틴을 고정화한 배양 기재를 사용한 군보다도 높은 것이었다. 따라서, 확대 배양이 장기에 걸치는 경우, 피브로넥틴 그 자체에 비하여 LAK 세포 유도 초기에 피브로넥틴 프래그먼트를 공존시키는 것이 보다 높은 확대 배양률로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하기에 바람직하다는 것이 분명해졌다.
실시예 14 LAK 세포 배양계에서의 증식률의 측정
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 13-(2) 와 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다. 이 때의 배양 개시후 4일째에서 7일째까지의 세포의 증식률을 산출하였다. 결과를표 15 에 나타낸다.
배양 개시시 세포수 |
피브로넥틴 프래그먼트 |
4일째에서 7일째까지의증식률 (배율) |
5 ×105개 세포/㎖ |
대조 (FNfr 비고정화)CH-296 |
2.7배16.9배 |
|
대조 (FNfr 비고정화)H-296 |
33.5배49.5배 |
1 ×106개 세포/㎖ |
대조 (FNfr 비고정화)CH-296 |
6.2배20.4배 |
|
대조 (FNfr 비고정화)H-296 |
23.5배43.5배 |
표 15 에 나타내는 바와 같이, LAK 세포 유도 초기에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에서는, 대조군에 비하여 배양 개시 4일째에서 7일째까지의 LAK 세포의 증식률이 높다. 즉 LAK 세포 유도 초기에 피브로넥틴 프래그먼트를 공존시킴으로써 빠른 증식속도로 LAK 세포를 유도ㆍ배양할 수 있는 것이 분명해졌다.
실시예 15 LAK 세포 배양계에서의 확대 배양률의 측정 (저세포수로부터의 LAK 세포 유도ㆍ배양)
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 13-(2) 와 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다. 이 때, 배양 개시시의 세포농도를 2×105∼1 ×106개 세포/㎖ (1 ×105∼5 ×105개 세포/㎠) 가 되도록 하였다. 배양 개시후 15일째에 트리판블루 염색법으로 생세포수를 계측하여 배양 개시시의 세포수와 비교한 확대 배양률을 산출하였다. 결과를 표 16 에 나타낸다.
배양 개시세포수 |
피브로넥틴 프래그먼트 |
확대 배양률(배율) |
2×105개 세포/㎖(1 ×105개 세포/㎠) |
대조 (FNfr 비고정화)CH-296 |
x48.6x1004 |
5 ×105개 세포/㎖(2.5 ×105개 세포/㎠) |
대조 (FNfr 비고정화)CH-296 |
x438x1094 |
1 ×106개 세포/㎖(5 ×105개 세포/㎠) |
대조 (FNfr 비고정화)CH-296 |
xl020x1476 |
표 16 에 나타내는 바와 같이, LAK 세포 유도시에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에서는, 배양 개시시의 세포수에 관계없이 배양 개시후 15일째에 높은 확대 배양률이 얻어졌다. 이것에 대하여 대조군에는 배양 개시시의 세포수가 낮은 경우, 배양 개시후 15일째의 확대 배양률이 낮았다. 즉 저세포수로부터 LAK 세포를 유도할 때 피브로넥틴 프래그먼트를 공존시킴으로써, 배양 개시시의 세포수에 관계없이 높은 확대 배양률로 LAK 세포를 유도ㆍ배양할 수 있는 것이 분명해졌다.
실시예 16 LAK 세포 배양계에서의 확대 배양률의 측정 (저세포수로부터의 LAK 세포 유도ㆍ배양/희석 조작하지 않은 배양)
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
5HXVIVO20 에 1 ×104개 세포/㎖ 가 되도록 실시예 1-(1) 에서 제조한 PBMC 를 현탁한 후, 실시예 13-(1) 과 동일한 방법으로 제조한 항 인간 CD3 항체 고정화 플레이트, 또는 항 인간 CD3 항체 및 피브로넥틴 또는 FNfr 고정화 6웰 플레이트에 1㎖/웰씩 뿌리고, 5HXVIVO20 4㎖ 을 가하고 (1 ×103개 세포/㎠), 그리고 최종 농도 500U/㎖ 가 되도록 IL-2 (시오노기제약사 제조) 를 첨가하였다. 이들 플레이트를 5% CO2중 37℃ 에서 배양하였다 (배양 0일째). 배양 개시후 2일째, 3일째, 4일째에는 최종 농도 500U/㎖ 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양을 계속하여 배양 개시후 7일째 이후 2∼3일마다 최종 농도 500U/㎖ 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 그 동안 배양액의 희석조작은 전혀 실시하지 않았다.
배양 개시후 15일째에 트리판블루 염색법으로 생세포수를 계측하여, 배양 개시시의 세포수와 비교한 확대 배양률을 산출하였다. 결과를 표 17 에 나타낸다.
배양일수 |
FN/FN 프래그먼트 |
확대 배양률 (배율) |
15일간 |
대조 (FN/FNfr 비고정화)피브로넥틴CH-296H-296 |
x15x628x773x960 |
표 17 에 나타내는 바와 같이, 저세포수로부터의 LAK 세포 유도시에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에서는, 유도 도중인 세포의 희석조작을 필요로 하지 않고 배양 개시후 15일째에 높은 확대 배양률이 얻어졌다. 또한, 이 확대 배양률은 피브로넥틴을 고정화한 배양 기재를 사용한 군과 비교하더라도 높은 것이었다. 이에 반하여 대조군에서는 배양 개시 15일째에서도 거의 증식되지 않았다. 즉 저세포수로부터 LAK 세포를 유도할 때 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 프래그먼트, 바람직하게는 피브로넥틴 프래그먼트를 공존시킴으로써, 전혀 희석 조작을 필요로 하지 않고 높은 확대 배양률로 LAK 세포를 유도ㆍ배양할수 있는 것이 분명해졌다.
실시예 17 LAK 세포에서의 IL-2R 발현의 유도
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 13-(2) 와 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다.
(2) LAK 세포에서의 IL-2R 발현율의 측정
실시예 17-(1) 에서 유도ㆍ배양한 LAK 세포에서의 IL-2R 발현율의 측정은 실시예 2-(2) 에 기재된 방법에 준하여 실시하였다. 결과를 표 18 에 나타낸다. 이러한 표에서는 IL-2R 발현 양성 세포 함유율 (%) 을 IL-2R 발현율 (%) 이라 표시한다.
배양일수 |
FN/FN 프래그먼트 |
IL-2R 발현율 (%) |
4일간 |
대조 (FN/FNfr 비고정화)피브로넥틴CH-296H-296C-CS1 |
86.597.297.697.794.9 |
7일간 |
대조 (FN/FNfr 비고정화)피브로넥틴CH-296H-296C-CS1 |
59.377.690.489.165.8 |
표 18 에 나타내는 바와 같이, LAK 세포 유도 초기에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에서는, 배양 중의 LAK 세포 표면상에서의 IL-2R 발현율을 높게 유도할 수 있었다. 또한, 이 IL-2R 발현율은 피브로넥틴을 고정화한 배양 기재를 사용한 군과 비교하더라도 높은 것이었다. 즉 LAK 세포를 유도할 때 피브로넥틴 프래그먼트를 공존시킴으로써, 피브로넥틴 그 자체보다도 바람직하게 IL-2R 발현율을 높게 하면서 LAK 세포를 유도ㆍ배양할 수 있는 것이 분명해졌다.
실시예 18 LAK 세포에서의 IL-2R 발현의 유도
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 13-(2) 와 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다.
(2) LAK 세포에서의 IL-2R 발현율의 측정
실시예 18-(1) 에서 유도ㆍ배양한 7일째의 LAK 세포 중에서의 CD4 세포, CD8 세포 표면상에서의 IL-2R 발현율의 측정을 실시예 9-(2) 에 기재된 방법에 준하여 실시하였다. 또, 이번 조작에서는 1차 항체로서 FITC 표식 마우스 항 인간 CD4 항체 또는 FITC 표식 마우스 항 인간 CD8 항체를, 2차 항체로서 PE 표식 마우스 항 인간 IL-2R (CD25) 항체를 사용하였다. 결과를 표 19 에 나타낸다.
피브로넥틴 프래그먼트 |
CD4/IL-2R2중 양성 세포 함유율 (%) |
CD8/IL-2R2중 양성 세포 함유율 (%) |
대조 (FNfr 비고정화)CH-296C-CS1 |
20.541.224.4 |
49.461.654.6 |
표 19 에 나타내는 바와 같이, LAK 세포 유도 초기에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에서는, 배양 중인 LAK 세포 (CD4 및 CD8 양성의 양세포) 표면상에서의 IL-2R 발현율을 높게 유도할 수 있었다. 즉 LAK 세포를 유도할 때 피브로넥틴 프래그먼트를 공존시킴으로써, CD4 및 CD8 양성의 양세포 표면상의 IL-2R 발현율을 높게 하면서 LA 세포를 유도ㆍ배양할 수 있는 것이 분명해졌다.
실시예 19 LAK 세포 집단 중에서의 CD8 양성 세포 함유 비율
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 13-(2) 와 같은 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다.
(2) LAK 세포에서의 CD8 양성 세포 집단 함유 비율의 측정
실시예 19-(1) 에서 유도ㆍ배양한 15일째의 LAK 세포 중에서의 CD8 양성 세포 함유 비율의 측정을 실시예 1-(4) 에 기재된 방법에 준하여 실시하였다. 결과를 표 20 에 나타낸다.
피브로넥틴 프래그먼트 |
CD8/양성 세포 함유율 (%) |
대조 (FNfr 비고정화)CH-296H-296 |
42.972.176.0 |
표 20 에 나타내는 바와 같이, LAK 세포 유도 초기에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에서는, 배양 중의 LAK 세포 중에서의 CD8 양성 세포 함유율을 높게 유도할 수 있었다. 즉 LAK 세포를 유도할 때 피브로넥틴 프래그먼트를 공존시킴으로써 LAK 세포 중의 CD8 양성 세포의 함유율을 높게 하면서 LAK 세포를 유도ㆍ배양할 수 있는 것이 분명해졌다.
실시예 21 LAK 세포 배양계에서의 확대 배양률의 측정
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
5HXVIVO20 에 0.5∼1 ×106개 세포/㎖ 가 되도록 실시예 1-(1) 에서 제조한 PBMC 를 현탁한 후, 실시예 13-(1) 에서 제조한 항 인간 CD3 항체 고정화 플레이트, 또는 항 인간 CD3 항체 및 FNfr 고정화 플레이트에 1㎖/웰씩 뿌리고, 최종 농도 1000U/㎖ 가 되도록 IL-2 (시오노기제약사 제조) 를 첨가하였다. 이들 플레이트를 5% CO2중 37℃ 에서 배양하였다 (배양 0일째). 배양 개시후 2일째, 3일째에는 1000U/㎖ 의 IL-2 를 함유하는 5HXVIVO20 을 1㎖/웰씩 첨가하였다. 배양 개시후 4일째에는 적절히 5HXVIVO20 을 사용하여 희석한 배양액을 아무것도 고정화하지 않은 새로운 플라스크에 옮겨, 최종 농도 500U/㎖ 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 8 또는 9일째에는 실시예 13-(1) 과 같은 방법으로 제조한 항 인간 CD3 항체 고정화 플라스크, 또는 항 인간 CD3 항체 및 FNfr 고정화 플라스크 (단, 고정화에 사용하는 항 인간 CD3 항체의 농도는 0.5㎍/㎖ 으로 함) 에 적절히 5HXVIVO20 을 사용하고 희석한 배양액을 옮겨, 최종 농도 500U/㎖ 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 11일째 또는 12일째에 다시 적절히 5HXVIVO20 을 사용하여 희석한 배양액을 아무것도 고정화하지 않은 새로운 플라스크에 옮겨, 최종 농도 500U/㎖ 가 되도록 IL-2 을 첨가하였다. 배양 개시 15일째에 트리판블루 염색법으로 생세포수를 계측하여, 배양 개시시의 세포수와 비교한 확대 배양률로서 산출하였다. 결과를 표 21 및 표 22 에 나타낸다. 표 중에서 donor 는 PBMC 도너의 기호를 나타낸다.
doner |
피브로넥틴 프래그먼트 |
배양 개시 0일째 자극 |
배양 개시 8일째 자극 |
확대배양률(배율) |
A |
대조 (FNfr 비고정화)CH-296 |
항 CD3항 CD3항 CD3+CH-296항 CD3+CH-296항 CD3+CH-296 |
없음항 CD3없음항 CD3항 CD3+CH-296 |
x80x38x1452x1620x2700 |
B |
대조 (FNfr 비고정화)CH-296 |
항 CD3항 CD3항 CD3+CH-296항 CD3+CH-296항 CD3+CH-296 |
없음항 CD3없음항 CD3항 CD3+CH-296 |
x710x2363x504x5468x14243 |
C |
대조 (FNfr 비고정화)CH-296H-296 |
항 CD3항 CD3항 CD3+CH-296항 CD3+H-296 |
없음항 CD3항 CD3+CH-296항 CD3+H-296 |
x1805x4200x35700x16950 |
donor |
피브로넥틴프래그먼트 |
배양 개시 0일째자극 |
배양 개시 9일째자극 |
확대배양률(배율) |
B |
대조 (FNfr 비고정화)CH-296CH-271H-296H-271C-274C-CS1CHV-90CHV-179CHV-181 |
항 CD3항 CD3항 CD3+CH-296항 CD3+CH-271항 CD3+H-296항 CD3+H-271항 CD3+C-274항 CD3+C-CS1항 CD3+CHV-90항 CD3+CHV-l79항 CD3+ CHV-181 |
없음항 CD3항 CD3+CH-296항 CD3+CH-271항 CD3+H-296항 CD3+H-271항 CD3+C-274항 CD3+C-CS1항 CD3+CHV-90항 CD3+CHV-179항 CD3+CHV-181 |
x2074x2880x38400x12672x67584x8755x8525x9677x10138x8294x5760 |
표 21 및 표 22 에 나타내는 바와 같이, LAK 세포 유도시 초기 및 중기에 반복하여 각 피브로넥틴 프래그먼트 및 항 CD3 항체를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에서는, 대조군에 비교하여 LAK 세포의 확대 배양률이 높다. 이들 확대 배양률은, LAK 세포 유도시 초기 및 중기에 반복하여 항 CD3 항체만을 고정화한 배양 기재를 사용한 군에서의 확대 배양률보다도 훨씬 높은 것이었다. 즉 LAK 세포 유도 초기 및 중기에 피브로넥틴 프래그먼트 및 항 CD3 항체를 사용하여 자극함으로써 보다 높은 확대 배양률로 LAK 세포를 유도ㆍ배양할 수 있는 것이 분명해졌다.
실시예 21 LAK 세포 배양계에서의 증식률의 측정
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 20-(1) 과 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다. 이 때의 배양 개시후 4일째에서 8일째까지의 세포의 증식률 및 배양 개시후 11일째에서 15일째까지의 세포의 증식률을 산출하였다. 결과를 표 23 및 표 24 에 나타낸다.
donor |
피브로넥틴프래그먼트 |
배양 개시 0일째 자극 |
배양 개시 8일째 자극 |
11∼15일째까지의 증식률 (배율) |
A |
대조 (FNfr 비고정화)CH-296 |
항 CD3항 CD3항 CD3+CH-296항 CD3+CH-296항 CD3+CH-296 |
없음항 CD3없음항 CD3항 CD3+CH-296 |
6.7배8.3배2.6배5.5배11.1배 |
B |
대조 (FNfr 비고정화)CH-296 |
항 CD3항 CD3항 CD3+CH-296항 CD3+CH-296항 CD3+CH-296 |
없음항 CD3없음항 CD3항 CD3+CH-296 |
7.4배17.5배0.9배19.8배60.3배 |
C |
대조 (FNfr 비고정화)CH-296H-296 |
항 CD3항 CD3항 CD3+CH-296항 CD3+H-296 |
없음항 CD3항 CD3+CH-296항 CD3+H-296 |
5.2배22.2배94.0배35.0배 |
donor |
피브로넥틴 프래그먼트 |
배양 개시 0일째 자극 |
배양 개시 9일째 자극 |
11∼15일째까지의 증식률 (배율) |
B |
대조 (FNfr 비고정화)CH-296CH-271H-296H-271C-274C-CS1CHV-90CHV-179CHV-181 |
항 CD3항 CD3항 CD3+CH-296항 CD3+CH-271항 CD3+H-296항 CD3+H-271항 CD3+C-274항 CD3+C-CS1항 CD3+CHV-90항 CD3+CHV-179항 CD3+CHV-181 |
없음항 CD3항 CD3+CH-296항 CD3+CH-271항 CD310+296항 CD3+H-271항 CD3+C-274항 CD3+C-CS1항 CD3+CHV-90항 CD3+CHV-179항 CD3+CHV-181 |
5.7배15.6배55.6배25.0배88.9배23.8배61.7배28.0배44.0배32.7배41.7배 |
표 23 및 표 24 에 나타내는 바와 같이, LAK 세포 유도시 초기 및 중기에 반복하여 각 피브로넥틴 프래그먼트 및 항 CD3 항체를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에서는, 대조군에 비하여 유도 후기에서의 LAK 세포의 증식률이 높다. 이들 증식률은 LAK 세포 유도시 초기 및 중기에 반복하여 항 CD3 항체만을 고정화한 배양 기재를 사용한 군에서의 유도 후기의 LAK 세포의 증식률보다도 훨씬 높은 것이었다. 즉 LAK 세포 유도 초기 및 중기에 피브로넥틴 프래그먼트 및 항 CD3 항체를 사용하여 자극함으로써, 보다 높은 증식률로 LAK 세포를 유도ㆍ배양할 수 있는 것이 분명해졌다.
실시예 22 LAK 세포에서의 IL-2R 발현의 유도
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 20-(1) 과 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다.
(2) LAK 세포에서의 IL-2R 발현율의 측정
실시예 22-(1) 에서 유도ㆍ배양후 15일째의 LAK 세포에서의 IL-2R 발현율의 측정은 실시예 2-(2) 에 기재된 방법에 준하여 실시하였다. 그 결과를 표 25및 표 26 에 나타낸다. 이러한 표에서는 IL-2R 발현 양성 세포 함유율 (%) 을 IL-2R 발현율 (%) 로 표시한다.
피브로넥틴 프래그먼트 |
배양 개시 0일째 자극 |
배양 개시 9일째 자극 |
IR-2R 발현율 (%) |
대조 (FNfr 비고정화) |
항 CD3항 CD3 |
없음항 CD3 |
4.832.6 |
CH-296 |
항 CD3+CH-296항 CD3+CH-296항 CD3+CH-296 |
없음항 CD3항 CD3+CH-296 |
2.572.394.7 |
H-296 |
항 CD3+H-296항 CD3+H-296항 CD3+H-296 |
없음항 CD3항 CD3+H-296 |
1.450.289.6 |
피브로넥틴 프래그먼트 |
배양 개시 0일째자극 |
배양 개시 9일째자극 |
IL-2R 발현율 (%) |
대조 (FNfr 비고정화)CH-296CH-271H-296H-271C-274C-CS1CHV-90CHV-179CHV-181 |
항 CD3항 CD3항 CD3+CH-296항 CD3+CH-271항 CD3+H-296항 CD3+H-271항 CD3+C-274항 CD3+C-CS1항 CD3+CHV-90항 CD3+CHV-179항 CD3+CHV-181 |
없음항 CD3항 CD3+CH-296항 CD3+CH-271항 CD3+H-296항 CD3+H-271항 CD3+C-274항 CD3+C-CS1항 CD3+CHV-90항 CD3+CHV-179항 CD3+CHV-181 |
4.818.084.067.179.951.666.472.552.663.468.3 |
표 25 및 표 26 에 나타내는 바와 같이, LAK 세포 유도시 초기 및 중기에 반복하여 각 피브로넥틴 프래그먼트 및 항 CD3 항체를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에서는, 대조군에 비하여 배양 개시 15일째의 LAK 세포 표면 위의 IR-2R 발현율이 높다. 이들 IL-2R 발현율은, LAK 세포 유도시 초기 및 중기에 반복하여 항 CD3 항체만을 고정화한 배양 기재를 사용한 군에서의 IL-2R 발현율보다도 훨씬 높은 것이었다. 즉 LAK 세포 유도 초기 및 중기에 피브로넥틴 프래그먼트를 사용하여 자극함으로써, 보다 높은 IL-2R 발현율로 LAK 세포를 유도ㆍ배양할 수 있는것이 분명해졌다.
실시예 23 LAK 세포에서의 CD8 양성 세포 비율의 측정
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 20-(1) 과 같은 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다.
(2) LAK 세포 집단 중에서의 CD8 양성 세포 함유 비율의 측정
실시예 23-(1) 에서 유도ㆍ배양한 15일째의 LAK 세포 집단 중에서의 CD8 양성 세포 함유 비율의 측정은 실시예 1-(4) 에 기재된 방법에 준하여 실시하였다. 그 결과를 표 27 에 나타낸다.
피브로넥틴프래그먼트 |
배양 개시 0일째자극 |
배양 개시 8일째자극 |
CD8 양성 세포함유율 (%) |
대조 (FNfr 비고정화) |
항 CD3항 CD3 |
없음항 CD3 |
42.955.2 |
CH-296 |
항 CD3+CH296항 CD3+CH296항 CD3+CH296 |
없음항 CD3항 CD3+CH-296 |
72.185.275.9 |
H-296 |
항 CD3+H296항 CD3+H296항 CD3+H296 |
없음항 CD3항 CD3+H296 |
76.082.077.1 |
표 27 에 나타내는 바와 같이, LAK 세포 유도시 초기 및 중기에 반복하여 각 피브로넥틴 프래그먼트 및 항 CD3 항체를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에서는, 대조군에 비하여 배양 개시 15일째의 LAK 세포 집단 중에서의 CD8 양성 세포 함유 비율이 높다. 이들 CD8 양성 세포 함유 비율은, LAK 세포 유도시 초기 및 중기에 반복하여 항 CD3 항체만을 고정화한 배양 기재를 사용한 군에서의 CD8 양성 세포 함유 비율보다도 훨씬 높은 것이었다. 즉 LAK 세포 유도 초기 및 중기에 피브로넥틴 프래그먼트를 사용하여 자극함으로써, 보다 높은 CD8 양성 세포 함유 비율로 LAK 세포를 유도ㆍ배양할 수 있는 것이 분명해졌다.
서열목록 프리텍스트
서열 번호 1; 피브로넥틴의 부분 영역 Ⅲ-8.
서열 번호 2; 피브로넥틴의 부분 영역 Ⅲ-9.
서열 번호 3; 피브로넥틴의 부분 영역 Ⅲ-10.
서열 번호 4; 피브로넥틴의 부분 영역 Ⅲ-12.
서열 번호 5; 피브로넥틴의 부분 영역 Ⅲ-13.
서열 번호 6; 피브로넥틴의 부분 영역 Ⅲ-14.
서열 번호 7; 피브로넥틴의 부분 영역 CS-1.
서열 번호 8; 피브로넥틴의 프래그먼트 C-274.
서열 번호 9; 피브로넥틴의 프래그먼트 H-271.
서열 번호 10; 피브로넥틴의 프래그먼트 H-296.
서열 번호 11; 피브로넥틴의 프래그먼트 CH-271.
서열 번호 12; 피브로넥틴의 프래그먼트 CH-296.
서열 번호 13; 피브로넥틴의 프래그먼트 C-CS1.
서열 번호 14; 피브로넥틴의 프래그먼트 CHV-89.
서열 번호 15; 피브로넥틴의 프래그먼트 CHV-90.
서열 번호 16; 피브로넥틴의 프래그먼트 CHV-92.
서열 번호 17; 피브로넥틴의 프래그먼트 CHV-179.
서열 번호 18; 피브로넥틴의 프래그먼트 CHV-181.
서열 번호 19; 피브로넥틴의 프래그먼트 H-275-Cys.
서열 번호 20; 프라이머 12S.
서열 번호 21; 프라이머 14A.
서열 번호 22; 프라이머 Cys-A.
서열 번호 23; 프라이머 Cys-S.
서열 번호 24; 인플루엔자 바이러스에서 유도된 매트릭스프로테인 기재의 고안된 펩티드.