CN101735981A - 制备细胞毒性淋巴细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及制备细胞毒性淋巴细胞的方法，其特征在于所述方法包括在纤连蛋白、其片段或其混合物存在下进行至少细胞毒性淋巴细胞的诱导、维持和扩增之一项的步骤。

Description

制备细胞毒性淋巴细胞的方法
本申请是申请日为2003年3月25日，申请号为03811464.X的、发明名称和本发明相同的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及制备可用于医疗领域的细胞毒性淋巴细胞的方法。
背景技术
生物体主要通过免疫应答保护其免受外来物质的侵害，其免疫系统由各种细胞及这些细胞产生的可溶性因子建立起来。在这些细胞当中，白细胞尤其是淋巴细胞起到关键的作用。淋巴细胞可分为两类，分别是B淋巴细胞(以下称为B细胞)和T淋巴细胞(以下称为T细胞)，两者都能特异性地识别某种抗原并作用于该抗原，以对生物体进行保护。
T细胞可细分为具有CD(集群名称)4标记的辅助T细胞(以下称为TH)，其主要辅助抗体的生产和诱导各种免疫应答；和具有CD8标记的细胞毒性T细胞(Tc：细胞毒性T淋巴细胞，也称为杀伤T细胞，以下简称CTL)，其主要具有细胞毒性活性。CTL在肿瘤细胞、病毒感染细胞等的识别、破坏和消除方面发挥着最重要的作用，但它并不象B细胞那样产生能特异性地与抗原发生发应的抗体，而是直接识别和作用于来自靶细胞的抗原(抗原肽)，所述靶细胞与存在于靶细胞细胞膜表面上的主要组织相容性复合体[MHC，在人类中也称为人白细胞抗原(HLA)]I类分子结合。此时，存在于CTL细胞膜表面上的T细胞受体(以下称为TCR)特异性地识别上述抗原肽和MHC I类分子，确定所述抗原肽是衍自自身或是衍自异身。然后已被确定衍自异身的靶细胞被CTL特异性地破坏和消除。
近年来，人们对会给患者身体造成较重负担的疗法如药物疗法和放射疗法进行了反思，而且人们对只给患者身体造成较轻负担的免疫疗法的兴趣日益提高。尤其是，人们已注意到过继免疫疗法的效果，在过继免疫疗法当中，能特异性地与目的抗原反应的CTL可在体外从衍自具有正常免疫功能的人体的淋巴细胞诱导而来，或其不经诱导即可扩增，然后被转移给患者。例如，已有人提出，在动物模型中过继免疫疗法对于病毒感染和肿瘤是一种有效的疗法[Greenberg，P.D.著，Advances in Immunology，1992年出版；Reusser P.等著，Blood，78(5)，1373-1380(1991)]。在这种疗法中，重要的是维持或增加处于CTL抗原特异性细胞毒性活性得以维持或增强的状态的细胞的数量。
在上述过继免疫疗法当中，必须使给予的细胞毒性淋巴细胞的数量达到设定数量或更高，以获得治疗效果。换句话说，可以说主要问题在于要在短时间内在体外获得上述数量的细胞。
为维持或增强CTL的抗原特异性细胞毒性活性，通常采用这样的方法，即当诱导CTL对抗原的特异性应答时，可用目的抗原进行反复刺激。然而，在这种方法中，最终获得的CTL的数量往往会减少，以至于不能获得足够数量的细胞。
用以制备能有效治疗疾病的T细胞的方法已知有例如使用高浓度的用IL-2诱导的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL的过继免疫疗法[N.Engl.J.Med.，316，1310-1321(1996)；Rosenberg S.A.等，N.Engl.J. Med.，319(25)，1676-1680(1988)；Ho M.等，Blood，81(8)，2093-2101(1993)]。
其次，对于抗原特异性CTL的制备，已报道用自身CMV感染成纤维细胞和IL-2[Riddell S.A.等，J.Immunol.，146(8)，2795-2804(1991)]或用抗CD3单克隆抗体(抗CD3mAb)和IL-2[Riddell S.A.等，J.Immunol.Methods，128(2)，189-201(1990)]分离和扩增CMV特异性CTL克隆的方法。
此外，WO 96/06929公开了REM方法(快速扩增方法)。此REM方法是一种在短时间内扩增含有抗原特异性CTL和TH的初级T细胞群体的方法。换句话说，此方法的特征在于，可通过增殖单独的T细胞克隆提供大量的T细胞，且通过使用抗CD3抗体、IL-2和经辐射造成其增殖能力有缺陷的PBMC(外周血单核细胞)以及Epstein-Barr病毒(以下简称EBV)感染细胞，抗原特异性CTL的数量得到提高。
此外，WO 97/32970公开了改进的REM方法，该方法使用能与PBMC区别开来的能表达T细胞刺激成分的未分化哺乳动物细胞株作为饲养细胞，以减少所用的PBMC的数量。
淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)是具有细胞毒性活性的功能性细胞群体，其可通过将IL-2加入到含有淋巴细胞的外周血(外周血白细胞)、脐带血、组织液等，并将淋巴细胞在体外培养数天而获得。在培养过程中，可通过向LAK细胞中加入抗CD3抗体并培养细胞来进一步加速LAK细胞的增殖。这样获得的LAK细胞具有对各种癌细胞和其它靶标没有特异性的细胞毒性活性。LAK细胞也可以与上述CTL相同的方式用于过继免疫疗法中。
如上所述，在获得细胞毒性淋巴细胞如CTL、LAK细胞、TIL等的步骤中必须使用IL-2。淋巴细胞可进一步通过将IL-2结合到细胞表面的白细胞介素-2受体(IL-2R)来激活。此外，还知IL-2R是淋巴细胞的激活标记。从以上观点出发，重要的是要改善细胞表面上的IL-2R表达。此外，在CTL的诱导中，重要的是提高CTL前体细胞经受抗原刺激诱导成为CTL的效率，即提高诱导后的一组细胞中CD8阳性细胞的比例(比率)。
纤连蛋白是分子量为25万的巨大糖蛋白，存在于动物血液中、培养细胞的表面上或组织的胞外基质中，已知其具有多种功能。其结构域结构可分为7个部分(以下参见图1)，其中三种类似的序列包含于其一氨基酸序列中，重复这三种序列的每一种就构成了整个序列。这三种类似的序列分别指定为I型、II型和III型。这三种序列当中，III型由71-96个氨基酸残基构成，其中这些氨基酸残基的重合比率为17-40％。纤连蛋白中有14个III型序列，这当中第8个、第9个或第10个序列(以下分别称为III-8、III-9或III-10)包含于细胞结合结构域，而第12个、第13个或第14个序列(以下分别称为III-12、III-13或III-14)包含于肝素结合结构域。此外，VLA(极迟活化抗原)-5结合区包含于III-10中，其核心序列为RGDS。此外，称为IIICS的区域存在于肝素结合结构域的C末端。由25个氨基酸构成且具有VLA-4结合活性的称为CS-1的区域存在于IIICS(Deane F.Momer，FIBRONECTIN，ACADEMIC PRESS INC.，1-8(1998)；Kimizuka F.等，J.Biochem.110，284-291(1991)；Hanenberg H.等，Human Gene Therapy 8，2193-2206(1997))。
发明内容
本发明之一是一种制备具有高水平细胞毒性活性的细胞毒性淋巴细胞的方法，所述淋巴细胞适合用于医疗领域。
具体而言，本发明涉及：
[1]一种制备细胞毒性淋巴细胞的方法，所述方法的特征在于所述方法包括在纤连蛋白、其片段或其混合物存在下进行至少细胞毒性淋巴细胞的诱导、维持和扩增之一的步骤；
[2]上述[1]的方法，其中与在纤连蛋白、其片段或其混合物不存在下通过进行至少诱导、维持和扩增之一而获得的细胞毒性淋巴细胞相比，所述细胞毒性淋巴细胞高度表达白细胞介素-2受体；
[3]上述[1]的方法，其中与在纤连蛋白、其片段或其混合物不存在下通过进行至少诱导、维持和扩增之一而获得的细胞毒性淋巴细胞相比，所述细胞毒性淋巴细胞含有更高比率的CD8阳性细胞；
[4]上述[1]-[3]之任一项的方法，其中与在纤连蛋白、其片段或其混合物不存在下通过进行至少诱导、维持和扩增之一而获得的细胞毒性淋巴细胞相比，所述细胞毒性淋巴细胞高度保持细胞毒性活性；
[5]上述[1]-[4]之任一项的方法，其中所述纤连蛋白、其片段或其混合物固定化在固相上；
[6]上述[5]的方法，其中所述固相为细胞培养设备或细胞培养载体；
[7]上述[6]的方法，其中所述细胞培养设备为培养皿、培养瓶或培养袋，所述细胞培养载体为珠粒、薄膜或载玻片；
[8]上述[1]-[4]之任一项的方法，其中至少细胞毒性淋巴细胞的诱导、维持和扩增之一在含有纤连蛋白、其片段或其混合物的培养基中进行；
[9]上述[1]-[8]之任一项的方法，其中所述纤连蛋白片段为包含由序列表的SEQ ID NO：1-7代表的氨基酸序列中至少一个序列的多肽，或为在上述多肽的氨基酸序列中存在一个或多个氨基酸取代、缺失、插入或添加的多肽，其中所述多肽具有与上述多肽等同的功能；
[10]上述[9]的方法，其中所述纤连蛋白片段具有细胞黏附活性和/或肝素结合活性；
[11]上述[9]的方法，其中所述纤连蛋白片段为选自包含序列表的SEQ ID NO：8-19所示的氨基酸序列中任一序列的多肽的多肽；
[12]上述[1]的方法，所述方法包括在包含培养基的细胞培养设备中、在纤连蛋白、其片段或其混合物存在下，进行至少细胞毒性淋巴细胞的诱导、维持和扩增之一，其中所述方法满足以下条件之任一项：
(a)培养初始时细胞数量与细胞培养设备的培养面积的比率为1-5×105细胞/cm2；
(b)培养初始时培养基中的细胞浓度为1-5×105细胞/ml；
[13]上述[12]的方法，其中所述方法排除了稀释步骤或调换细胞培养设备的步骤；
[14]通过上述[1]-[13]之任一项的方法获得的细胞毒性淋巴细胞；
[15]包含作为有效成分的通过上述[1]-[13]之任一项的方法获得的细胞毒性淋巴细胞的药物；
[16]用以增强细胞的白细胞介素-2受体表达的药物，所述药物的特征在于所述药物包含作为有效成分的纤连蛋白、其片段或其混合物；
[17]上述[16]的药物，其中所述纤连蛋白片段为包含由序列表的SEQID NO：1-7代表的氨基酸序列中至少一个序列的多肽，或为在上述多肽的氨基酸序列中存在一个或多个氨基酸取代、缺失、插入或添加的多肽，其中所述多肽具有与上述多肽等同的功能；
[18]上述[17]的药物，其中所述纤连蛋白片段具有细胞黏附活性和/或肝素结合活性；
[19]上述[17]的药物，其中所述纤连蛋白片段为选自包含序列表的SEQ ID NO：8-19所示的氨基酸序列中任一序列的多肽的多肽；
[20]用以提高淋巴细胞中CD8阳性细胞的比率的药物，所述药物的特征在于所述药物包含作为有效成分的纤连蛋白、其片段或其混合物；
[21]上述[20]的药物，其中所述纤连蛋白片段为包含由序列表的SEQID NO：1-7代表的氨基酸序列中至少一个序列的多肽，或为在上述多肽的氨基酸序列中存在一个或多个氨基酸取代、缺失、插入或添加的多肽，其中所述多肽具有与上述多肽等同的功能；
[22]上述[21]的药物，其中所述纤连蛋白片段具有细胞黏附活性和/或肝素结合活性；
[23]上述[21]的药物，其中所述纤连蛋白片段为选自包含序列表的SEQ ID NO：8-19所示的氨基酸序列中任一序列的多肽的多肽；
[24]用以提高或维持细胞毒性淋巴细胞的细胞毒性活性的药物，所述药物的特征在于所述药物包含作为有效成分的纤连蛋白、其片段或其混合物；
[25]上述[24]的药物，其中所述纤连蛋白片段为包含由序列表的SEQID NO：1-7代表的氨基酸序列中至少一个序列的多肽，或为在上述多肽的氨基酸序列中存在一个或多个氨基酸取代、缺失、插入或添加的多肽，其中所述多肽具有与上述多肽等同的功能；
[26]上述[25]的药物，其中所述纤连蛋白片段具有细胞黏附活性和/或肝素结合活性；
[27]上述[25]的药物，其中所述纤连蛋白片段为选自包含序列表的SEQ ID NO：8-19所示的氨基酸序列中任一序列的多肽的多肽；
[28]用以增强淋巴细胞的白细胞介素-2受体表达的方法，所述方法的特征在于所述方法包括在纤连蛋白、其片段或其混合物存在下进行至少细胞毒性淋巴细胞的诱导、维持和扩增之一的步骤；
[29]用以提高淋巴细胞中CD8阳性细胞的比率的方法，所述方法的特征在于所述方法包括在纤连蛋白、其片段或其混合物存在下进行至少细胞毒性淋巴细胞的诱导、维持和扩增之一的步骤；
[30]用以提高或维持细胞毒性淋巴细胞的细胞毒性活性的方法，所述方法的特征在于所述方法包括在纤连蛋白、其片段或其混合物存在下进行至少细胞毒性淋巴细胞的诱导、维持和扩增之一的步骤；
[31]上述[1]-[13]之任一项的方法，所述方法进一步包括将外源基因转导到细胞毒性淋巴细胞的步骤；
[32]上述[31]的方法，其中外源基因用逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒或猿猴病毒转导。
附图简介
图1为表示纤连蛋白结构域结构的示意图。
本发明的最佳实施方式
本发明是基于以下发现得以完成的：在纤连蛋白和/或其片段存在下制备的细胞毒性淋巴细胞中，高细胞毒性活性得以维持，IL-2R的表达水平显著提高，且CD8阳性细胞的比率也得以提高。
顺便说明一下，本文所用的细胞毒性淋巴细胞的制备指细胞的诱导(激活)、维持和扩增步骤中的各个步骤，或这些步骤的组合。本发明细胞毒性淋巴细胞的制备也称为细胞毒性淋巴细胞的培养。
以下具体说明本发明。
(1)本发明所用的纤连蛋白及其片段
本文提到的纤连蛋白及其片段可从天然获得或人工合成。纤连蛋白及其片段可按Ruoslahti E.等的公开方法[J.Biol.Chem.，256(14)，7277-7281(1981)]从天然来源的物质制备成大致纯形式。本文所指的术语“大致纯纤连蛋白及其片段”指这些纤连蛋白及其片段基本上不含与纤连蛋白一起天然存在的其它蛋白质等。上述各纤连蛋白及其片段在本发明中可单独使用，或多种纤连蛋白及其片段混合使用。
有关可用于本发明的纤连蛋白片段以及所述片段的制备的有用信息可从Kimiduka F.等[J.Biochem.，110，284-291(1991)]、Kornbrihtt A.R.等[EMBO J.，4(7)，1755-1759(1985)]、Sekiguchi K.等[Biochemistry，25(17)，4936-4941(1986)]等处获得。
在本发明中，纤连蛋白片段可通过例如包括包含至少以下任一区域的氨基酸序列的多肽来示例说明：区域III-8(序列表中SEQ ID NO：1所示氨基酸序列)、区域III-9(序列表中SEQ ID NO：2所示氨基酸序列)、区域III-10(序列表中SEQ ID NO：3所示氨基酸序列)、区域III-12(序列表中SEQ ID NO：4所示氨基酸序列)、区域III-13(序列表中SEQID NO：5所示氨基酸序列)、区域III-14(序列表中SEQ ID NO：6所示氨基酸序列)及区域CS-1(序列表中SEQ ID NO：7所示氨基酸序列)(参见图1)。
此外，就片段而言，优选使用具有细胞黏附活性和/或肝素结合活性的片段。细胞黏附活性可通过用已知方法分析用于本发明的片段(其细胞结合结构域)与细胞的结合情况来评价。例如上述方法包括Williams D.A.等的方法[Nature，352，438-441(1991)]。该方法测定细胞与固定到培养板的片段的结合情况。此外，肝素结合活性可通过用已知方法分析用于本发明的片段(其肝素结合结构域)与肝素的结合情况来评价。例如，片段与肝素的结合情况可通过使用肝素(如标记肝素)取代细胞，按与上述Williams D.A.等的方法相同的方式来评价。
另外，纤连蛋白片段可通过选自以下的多肽来示例说明：C-274(序列表中SEQ ID NO：8所示氨基酸序列)、H-271(序列表中SEQID NO：9所示氨基酸序列)、H-296(序列表中SEQ ID NO：10所示氨基酸序列)、CH-271(序列表中SEQ ID NO：11所示氨基酸序列)、CH-296(序列表中SEQ ID NO：12所示氨基酸序列)或C-CS1(序列表中SEQ ID NO：13所示氨基酸序列)。
上述片段CH-271、CH-296、C-274和C-CS1均为含有具有与VLA-5的结合活性的细胞结合结构域的多肽。而且，C-CS1、H-296或CH-296为含有具有与VLA-4的结合活性的细胞结合结构域的多肽。另外，H-271、H-296、CH-271或CH-296为含有肝素结合结构域的多肽。
在本发明中，也可使用其中上述各结构域被修饰的片段。纤连蛋白的肝素结合结构域由三个III型序列(III-12、III-13和III-14)构成。在本发明中也可使用包含缺失一个或两个III型序列的肝素结合结构域的片段。例如，所述片段的示例为CHV-89(序列表中SEQ ID NO：14所示氨基酸序列)、CHV-90(序列表中SEQ ID NO：15所示氨基酸序列)或CHV-92(序列表中SEQ ID NO：16所示氨基酸序列)，它们为其中纤连蛋白的细胞结合位点(VLA-5结合结构域：Pro1239-Ser1515)与III型序列中的一个序列结合的片段，或CHV-179(序列表中SEQ ID NO：17所示氨基酸序列)或CHV-181(序列表中SEQ ID NO：18所示氨基酸序列)，它们为其中纤连蛋白的细胞结合位点与III型序列中的两个序列结合的片段。CHV-89、CHV-90和CHV-92分别含有III-13、III-14和III-12，CHV-179含有III-13和III-14，CHV-181含有III-12和III-13。
此外，在本发明中可使用在上述各片段中添加了另外的氨基酸的片段。例如，所述片段可按照下述制备实施例中介绍的制备H-275-Cys的方法，将所需的氨基酸添加到上述各片段来制备。例如，H-275-Cys(序列表中SEQ ID NO：19所示氨基酸序列)为具有纤连蛋白的肝素结合结构域且在C末端有半胱氨酸残基的片段。
本发明所用片段可为这样的包含多肽的片段：所述多肽包含在构成至少部分含有以上例示的天然纤连蛋白的氨基酸序列的片段的多肽氨基酸序列中，有一个或多个氨基酸取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列，其中所述多肽具有与所述片段等同的功能，只要获得本发明所需的效果。
优选氨基酸的取代等进行到这样的程度，使得固有多肽的物理化学特性等发生改变，而多肽的功能又能得以维持。例如，氨基酸的取代等保守在这样的范围：多肽所固有的特性(例如疏水性、亲水性、电荷、pK等)基本上没有改变。例如，氨基酸的取代为以下各组氨基酸内的取代：①甘氨酸、丙氨酸；②缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；③天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷酰胺；④丝氨酸、苏氨酸；⑤赖氨酸、精氨酸；⑥苯丙氨酸、酪氨酸。氨基酸的缺失、添加或插入是在具有与多肽中主题位点周围的特性类似的特性的氨基酸中进行缺失、添加或插入，而又基本上不改变所述主题位点周围的特性。
此外，术语“具有等同功能”指具有至少以下任一功能：(i)维持细胞毒性淋巴细胞的细胞毒性活性的功能，(ii)增强IL-2R表达水平的功能，或(iii)提高CD8阳性细胞比率的功能。可按照下述实施例介绍的方法适当地确定包含具有氨基酸取代等的多肽的片段是否具有上述功能。此外，作为包含具有氨基酸取代等的多肽的片段，优选具有细胞黏附活性和/或肝素结合活性的片段。细胞黏附活性和肝素结合活性可按照用以确定这些活性的上述方法进行评价。
作为包含具有氨基酸取代等的多肽的片段，例如在两个不同的结构域之间有一个或多个氨基酸作为接头插入的片段也可用于本发明。
顺便说明一下，作为纤连蛋白本身，同样在本发明中可使用这样的多肽：所述多肽具有在构成纤连蛋白多肽的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列，其中所述多肽具有至少任一上述(i)-(iii)的功能。
本文所指的纤连蛋白片段也可在例如美国专利第5,198,423号介绍内容基础上从遗传重组子制备得到。例如，在上述专利的说明书详细介绍了H-271(SEQ ID NO：9)、H-296(SEQ ID NO：10)、CH-271(SEQID NO：11)和CH-296(SEQ ID NO：12)各片段以及制备这些片段的方法。此外，上述C-274(SEQ ID NO：8)片段可按照美国专利第5,102,988号中介绍的方法获得。另外，C-CS1(SEQ ID NO：13)片段可按照日本专利公报第3104178号中介绍的方法获得。CHV-89(SEQ ID NO：14)、CHV-90(SEQ ID NO：15)或CHV-179(SEQ ID NO：17)各片段可按照日本专利公报第2729712号中介绍的方法获得。此外，CHV-181(SEQ IDNO：18)片段可按照WO 97/18318中介绍的方法获得。CHV-92(SEQ IDNO：16)片段可使用在日本专利公报第2729712号和WO 97/18318中介绍的质粒的基础上按常规方式构建的质粒，通过遗传工程技术获得。
这些片段或可按常规方式衍自这些片段的片段可通过使用以以下保藏号保藏于International Patent Organism Depositary，National Instituteof Advanced Industrial Science and Technology，Tsukuba Central 6，1-1，Higashi l-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本(邮政编码305-8566)的微生物来制备，或通过用已知方法修饰各微生物所携带的质粒来制备。
FERM BP-2264(携带编码H-271的质粒的大肠杆菌，保藏日期：1989年1月30日)；
FERM BP-2800(携带编码CH-296的质粒的大肠杆菌，保藏日期：1989年5月12日)；
FERM BP-2799(携带编码H-271的质粒的大肠杆菌，保藏日期：1989年5月12日)；
FERM BP-7420(携带编码H-296的质粒的大肠杆菌，保藏日期：1989年5月12日)；
FERM BP-1915(携带编码C-274的质粒的大肠杆菌，保藏日期：1988年6月17日)；
FERM BP-5723(携带编码C-CS1的质粒的大肠杆菌，保藏日期：1990年3月5日)；
FERM P-12182(携带编码CHV-89的质粒的大肠杆菌，保藏日期：1991年4月8日)；
FERM P-12183(携带编码CHV-179的质粒的大肠杆菌，保藏日期：1991年4月8日)；
由于纤连蛋白是巨大的糖蛋白，出于工业目的和药物制备目的而制备和使用天然蛋白质未必容易。另外，纤连蛋白大量存在于生物体的血浆中。因此，当获自血浆的纤连蛋白被用作血制品时，存在污染纤连蛋白以外的成分的风险，所以从安全方面出发，可以想象会存在问题。此外，由于纤连蛋白是多功能蛋白，取决于其使用情况，可以想象会存在某些由与通过本发明方法显示效果的区域不同的区域造成的缺点。由于以上原因，优选在本发明中使用纤连蛋白片段，从可获得性、容易处理性和安全性的观点出发，更优选使用如上所述获得的重组纤连蛋白片段。另外，特别优选使用显示如以下效果的纤连蛋白片段：淋巴细胞扩增比率的提高、在扩增的淋巴细胞中IL-2R表达水平的提高、或在如下所述的扩增淋巴细胞群体中CD8阳性细胞比率的提高。此外，本发明中使用的纤连蛋白片段的分子量为但不具体局限于优选1-200kD，更优选5-190kD，甚至更优选10-180kD。
(1)制备本发明细胞毒性淋巴细胞的方法
以下具体说明制备本发明细胞毒性淋巴细胞的方法。本发明的方法是这样的制备细胞毒性淋巴细胞的方法，该方法包括在上述纤连蛋白、其片段或其混合物存在下进行至少细胞毒性淋巴细胞的诱导、维持和扩增之任一项的步骤。
本文所用的“细胞毒性淋巴细胞”指包含细胞毒性淋巴细胞的一组细胞。狭义上，在某些情况下细胞毒性淋巴细胞可只指包含于上述细胞组中的淋巴细胞。此外，本发明中细胞毒性淋巴细胞的制备包括以下任一项：将能形成本发明淋巴细胞的前体细胞诱导成具有细胞毒性活性的淋巴细胞、维持该细胞毒性淋巴细胞和用细胞毒性淋巴细胞和/或前体细胞扩增细胞毒性淋巴细胞。
本发明细胞毒性淋巴细胞包括但不具体限于例如细胞毒性T细胞(CTL)、淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、NK细胞等，以上各细胞具有抗原特异性细胞毒性活性。
在本发明中，可形成细胞毒性淋巴细胞的前体细胞，即具有分化成所述淋巴细胞的能力的前体细胞的例子有PBMC、NK细胞、原初细胞、记忆细胞、造血干细胞、脐带血单核细胞等。此外，只要细胞是血细胞，所述细胞即可在本发明中用作前体细胞。可直接使用从生物体收集的以上这些细胞之任一种，或可使用冻藏细胞。顺便说明一下，在制备本发明细胞毒性淋巴细胞的方法中，可使用含有上述细胞的材料，例如，血液如外周血或脐带血；从血中除去某些成分如红细胞和血浆获得的材料；骨髓液等。
制备本发明细胞毒性淋巴细胞的方法的一大特征在于所述淋巴细胞是在选自纤连蛋白、其片段或其混合物的有效成分存在下制备的。
在本发明的方法中，细胞毒性淋巴细胞的诱导、维持和/或扩增通常在上述本发明有效成分的存在下在含有特定组分的培养基中进行。
例如，在本发明的方法中，当打算进行细胞毒性淋巴细胞的诱导或扩增时，培养开始时用于本发明的细胞(细胞毒性淋巴细胞和/或前体细胞)数量没有具体限制。例如，细胞数量优选在1-1×108细胞/ml。此外，对培养条件没有具体限制，可使用一般的细胞培养条件。例如，细胞可在5％CO2存在下在37℃等条件下培养。此外，可适当定时用新鲜培养基更换所用培养基。
对在制备本发明细胞毒性淋巳细胞的方法中使用的培养基没有具体限制，可使用通过混合细胞毒性淋巴细胞或其前体细胞的维持和生长所必需的组分制备而成的已知培养基。例如，可使用市售培养基。这些培养基除含有固有成分外，还含有合适的蛋白质、细胞因子和其它组分。优选在本发明中使用含有IL-2的培养基。培养基中IL-2的浓度为但不具体限于例如优选0.01-1×105U/ml，更优选0.1-1×104U/ml。
此外，可形成细胞毒性淋巴细胞的前体细胞可在进一步含有抗CD3抗体的培养基中共培养。培养基中抗CD3抗体的浓度为但不具体限于例如优选0.01-100μg/ml。加入抗CD3抗体的目的是激活淋巴细胞上的受体。而且，除以上之外，也可加入淋巴细胞刺激因子如卵磷脂。对培养基中各组分的浓度没有具体限制，只要获得所需的效果即可。
除将上述组分溶解在培养基中使它们与培养基共存在一起外，也可将它们固定到合适的固相上，如细胞培养设备(包括任何开放体系设备或密闭体系设备)，如培养皿、培养瓶或培养袋，或固定到细胞培养载体上，如珠粒、薄膜或载玻片；对上述固相的材料没有具体限制，只要它们可用于细胞培养即可。当将各组分固定到例如上述设备时，优选相对于待加入到所述设备的培养基的量，固定特定量的各组分，使得所得培养基与在所述培养基加入到所述设备时通过在培养基中溶解所述组分来使用所述组分的情况所需的浓度相比，具有类似的浓度比例。对固定的各组分的量没有具体限制，只要获得所需的效果即可。上述载体可通过在细胞培养过程中将载体浸入细胞培养设备中的培养基中来使用。当上述组分固定到上述载体时，优选相对于待加入到所述设备的培养基的量，固定特定量的各组分，使得所得培养基与在所述载体加入到所述培养基时通过在培养基中溶解所述组分来使用所述组分的情况所需的浓度相比，具有类似的浓度比例。对固定的各组分的量没有具体限制，只要获得所需的效果即可。
在两种情况下，上述组分的固定化可通过已知方法来进行，例如下述的固定纤连蛋白片段的方法。
另外，可与上述组分一起使用的物质是选自WO 02/14481介绍的以下化合物：酸性多糖、酸性寡糖、酸性单糖及其盐，它们对具有抗原特异性细胞毒性活性的细胞毒性T细胞的诱导有效，或选自以下(A)-(D)的物质：
(A)具有结合CD44活性的物质；
(B)能调节由CD44配体与CD44的结合所发出的信号的物质；
(C)能抑制生长因子与生长因子受体的结合的物质；
(D)能调节由生长因子与生长因子受体的结合所发出的信号的物质。
具有CD44结合活性的上述物质的例子有例如CD44配体和/或抗CD44抗体。能调节由CD44配体与CD44的结合所发出的信号的物质包括例如磷酸酶的各种抑制剂。能抑制生长因子与生长因子受体的结合的物质包括例如具有与生长因子结合的活性且能与生长因子形成复合体、从而抑制生长因子与生长因子受体的结合的物质，或具有与生长因子受体结合的活性、从而抑制生长因子与生长因子受体的结合的物质。另外，能调节由生长因子与生长因子受体的结合所发出的信号的物质包括例如磷酸酶的各种抑制剂。对这些组分在培养基中的浓度没有具体限制，只要获得所需的效果即可。而且，除将这些组分溶解在培养基中使它们在培养基中共存在一起外，也可将它们固定到上述合适的固相上来使用。
在此，上述各种物质可单独使用，或两种或多种混合使用。
在本发明中，术语“在上述有效成分存在下”指这样一个事实：有效成分的存在状态使得当进行细胞毒性淋巴细胞的诱导、维持和扩增时，上述有效成分的能发挥其功能，但对有效成分的存在方式没有具体限制。例如，当有效成分溶解于备用的培养基时，对在进行共培养的培养基中的本发明有效成分的含量没有具体限制，只要获得所需的效果即可。有效成分的含量为例如优选0.01-1000μg/ml，更优选0.1-1000μg/ml，甚至更优选1-100μg/ml。除如上将有效成分溶解在培养基中使其与培养基共存在一起外，也可将它们固定到合适的固相上来使用，如细胞培养设备(包括任何开放体系设备或密闭体系设备)，如培养皿、培养瓶或培养袋，或固定到细胞培养载体上，如珠粒、薄膜或载玻片。从将培养的细胞毒性淋巴细胞给予生物体的观点出发，希望将上述有效成分固定化，但对此没有具体限制。
一旦上述各种组分或本发明有效成分固定到固相上，通过本发明方法获得细胞毒性淋巴细胞后，只须将所述淋巴细胞从固相上分离，即可容易地将所述淋巴细胞从有效成分等中分离出来，这样可以防止有效成分对所述淋巴细胞的污染。
当本发明有效成分固定到例如上述设备上，优选相对于待加入到所述设备的培养基的量，固定特定量的各有效成分，使得所得培养基与在所述培养基加入到所述设备时通过在培养基中溶解所述有效成分来使用所述有效成分的情况所需的浓度相比，具有类似的浓度比例。对固定的各有效成分的量没有具体限制，只要获得所需的效果即可。当上述有效成分固定到上述载体时，优选相对于待加入到所述设备的培养基的量，固定特定量的各有效成分，使得所得培养基与在所述载体加入到所述培养基时通过在培养基中溶解所述有效成分来使用所述有效成分的情况所需的浓度相比，具有类似的浓度比例。对固定的各有效成分的量没有具体限制，只要获得所需的效果即可。
例如，纤连蛋白片段的固定化可按照WO 97/18318和WO00/09168中介绍的方法来进行。
当测定通过本发明方法获得的细胞毒性淋巴细胞的IL-2R表达水平时，认为与通过在纤连蛋白、其片段或其混合物不存在下进行至少诱导、维持和扩增之任一项获得的细胞毒性淋巴细胞相比，IL-2R的表达水平显著提高。在此，IL-2R的表达水平可通过已知方法测定，如用抗IL-2R抗体测定。
如上所述，通过本发明方法获得的细胞毒性淋巴细胞的IL-2R表达水平提高。IL-2R是一种在活化T细胞表面上表达的活化标记，随着此分子的表达，细胞因子生产、细胞毒性活性、增殖活化等都被激活。因此，通过本发明方法获得的细胞毒性淋巴细胞是一组具有高度功能的细胞。
此外，由于通过本发明方法获得的细胞毒性淋巴细胞的IL-2R表达水平提高，所述细胞毒性淋巴细胞对加入到培养基中的IL-2、或细胞毒性淋巴细胞的前体细胞、淋巴细胞本身或其它共存的细胞产生的IL-2的刺激的敏感性提高。由于这个原因，即使在IL-2的量更少的环境中(例如在生物体中等)，细胞毒性淋巴细胞也可自我激活。
另外，与通过在纤连蛋白、其片段或其混合物不存在下进行至少诱导、维持和扩增之任一项获得的细胞毒性淋巴细胞相比，在通过本发明方法获得的细胞毒性淋巴细胞中，具有CD8标记的(CD8阳性)细胞的存在比率要高。这个事实带来一些优点，例如，①CD8阳性细胞产生细胞因子如干扰素-γ，从而促动免疫活化，以改变辅助T细胞的平衡成为Thl优势体系，②CD8阳性细胞是能有效排除外来物质如病毒或肿瘤细胞的细胞免疫细胞，③当获得了CD8阳性细胞时，只要CD8阳性细胞已用磁珠或流式细胞仪进行常规纯化，CD8阳性细胞就可通过按照本发明方法培养细胞来富集，④在CTL的诱导过程中，细胞毒性淋巴细胞可合适地用作前体细胞，因为CD8阳性细胞的比率高，⑤甚至可培养CD8阳性细胞比率较低的细胞群体，以提高CD8阳性细胞的比率等等。因此，本发明方法非常适用于制备细胞毒性淋巴细胞。
在此，通过本发明方法获得的细胞毒性淋巴细胞中的CD8阳性细胞的比率可通过例如但不具体限于使用抗CD8抗体来测定。
此外，按照本发明方法制备的细胞毒性淋巴细胞尤其是CTL具有以下优越特性：细胞毒性活性不象以前观察到的那样剧烈下降，甚至当细胞培养后进行长时间维持时或细胞增殖时也是如此。换句话说，与通过在纤连蛋白、其片段或其混合物不存在下进行至少诱导、维持和扩增之任一项获得的细胞毒性淋巴细胞相比，所述细胞毒性淋巴细胞维持高细胞毒性活性。因此，通过克隆培养的细胞毒性淋巴细胞，可以维持具有稳定细胞毒性活性的淋巴细胞。此外，诱导的CTL可通过用抗原、各种细胞因子或抗CD3抗体刺激CTL来增殖和扩增。可用已知方法维持或扩增细胞毒性淋巴细胞，但所述方法不受具体限制。
上述细胞毒性淋巴细胞的维持指通过保持其细胞毒性活性来维持细胞毒性淋巴细胞。对维持过程中的培养条件没有具体限制，可采用一般的细胞培养所用的条件。例如，细胞可在5％CO2存在下在37℃等条件下培养。此外，可适当定时用新鲜培养基更换所用培养基。所用培养基及与其同时使用的其它组分等与上述的相同。
用本发明方法维持和扩增本发明细胞毒性淋巴细胞的一大特征在于，所述方法包括在本发明有效成分即纤连蛋白、其片段或其混合物存在下，在培养基中分别连续培养和扩增细胞毒性淋巴细胞。随着扩增，细胞毒性淋巴细胞的数量可增加，使得细胞毒性淋巴细胞所具有的细胞毒性活性得以维持。换句话说，本发明方法的一个实施方案是提供扩增细胞毒性淋巴细胞的方法。
在扩增本发明细胞毒性淋巴细胞的方法中，对培养条件没有具体限制，可采用一般的细胞培养所用的条件。例如，细胞可在5％CO2存在下在37℃等条件下培养。此外，可适当定时用新鲜培养基更换所用培养基。所用培养基及与其同时使用的其它组分等与上述的相同。
根据本发明的扩增方法，例如在CTL扩增的情况中，扩增14天后获得的CTL的细胞数量可增加100-1000倍。此外，作为LAK细胞扩增情况的一个实例，LAK细胞培养7天后获得的细胞数量可增加约200倍，培养9天后可增加约1000倍。另外，这样获得的细胞毒性淋巴细胞尤其是CTL，与通过常规的细胞毒性淋巴细胞扩增方法(例如REM方法和改进的REM方法)获得的细胞毒性淋巴细胞相比，具有更高的细胞毒性活性。以上所述的本发明效果可通过按照下述实施例介绍的方法，测定用本发明方法扩增的CTL等所具有的细胞毒性活性来确认。
另外，本发明制备细胞毒性淋巴细胞的方法具有这样的特色，即细胞的培养可在较低的细胞数量下开始。为进行过继免疫疗法，需要大量的淋巴细胞，但难以从患者体内获得大量的淋巴细胞。此外，在一般的细胞毒性淋巴细胞扩增中，需要视待用的细胞数量而定选择具有合适培养面积的细胞培养设备，需要在合适量的培养基中培养。换句话说，通常培养是在高密度条件下开始的，此条件下细胞数量(数目)与细胞培养设备的培养面积之比[即与培养基接触的设备表面的面积(cm2)]为1×106细胞/cm2或更高，细胞浓度为1×106细胞/ml或更高。当在低于此细胞水平的条件下进行培养时，扩增率[扩增后的细胞数量与扩增前的细胞数量之比(扩增后的细胞数量/扩增前的细胞数量)]变得非常低，因而需要较长的培养时间才能获得大量的细胞毒性淋巴细胞。因此，一般来说，目前通过例如以下方法制备大量的淋巴细胞：用小的细胞培养设备开始培养，然后采用逐级扩大的大规模细胞培养设备；或采用增加细胞培养设备的数量和重复稀释步骤的方法。如上所述，在普通的细胞毒性淋巴细胞扩增中，需要多个培养系统。
根据本发明方法，即使在用少量细胞开始培养时，不论细胞培养设备的尺寸如何，细胞也可以较高的扩增率进行培养。因此，诸如以上所述的更换细胞培养设备和稀释步骤之类的复杂程序不再有必要。换句话说，根据本发明方法，细胞毒性淋巴细胞的扩增可满意地通过使用一个细胞培养设备即一个培养系统的培养程序来进行。因此，本发明方法是排除了稀释步骤或细胞培养设备的更换步骤的细胞毒性淋巴细胞制备方法。尤其当根据本发明方法扩增LAK细胞时，可如下扩增LAK细胞：将能形成LAK细胞的细胞和培养基加入到大容量细胞培养设备中，以及在随后各步骤中向细胞培养设备中只加入IL-2。在大量的LAK细胞可通过简单程序获得这方面，本发明非常有用。在此，从获得更高的扩增率的观点出发，纤连蛋白片段可优选用作待用的本发明有效成分。如上所述，根据本发明方法，可在更短的时间内获得必需数量的细胞毒性淋巴细胞。
例如，当在本发明有效成分存在下，在含有培养基的细胞培养设备中以较低的细胞数量开始至少细胞毒性淋巴细胞的诱导、维持和扩增之任一项时，所述诱导、维持和扩增可通过在培养开始时使用满足选自以下(a)和(b)的条件的细胞数量来进行：
(a)细胞数量与待用的细胞培养设备中的培养面积之比优选在1-5×105细胞/cm2，更优选10-1×105细胞/cm2，特别优选1×102-5×104细胞/cm2；
(b)培养基中的细胞浓度优选在1-5×105细胞/ml，更优选10-1×105细胞/ml，特别优选1×102-5×104细胞/ml。
本文所用的细胞数量指细胞毒性淋巴细胞和/或前体细胞的数量。
此外，在本发明方法中，可举出这样的方法，所述方法包括在一个培养系统中进行至少细胞毒性淋巴细胞的诱导、维持和扩增之任一项，该方法排除了细胞培养设备的更换步骤或稀释程序的步骤。
本发明方法用CTL的制备作为实例进行说明。
CTL的诱导可通过在上述有效成分的存在下在例如任何培养基中将能分化成CTL的前体细胞与合适的抗原呈递细胞一起孵化(培养)来进行，以赋予CTL识别所需抗原的能力。对前体细胞没有具体限制，只要所述前体细胞是处于变成CTL之前的阶段且注定会分化成CTL的细胞，包括例如外周血单核细胞(PBMC)、原初细胞、记忆细胞、脐带血单核细胞、造血干细胞等。对抗原呈递细胞没有具体限制，只要该细胞具有呈递待识别抗原到T细胞的能力。例如，据认为可呈递所需的抗原的单核细胞、B细胞、T细胞、巨噬细胞、树突细胞、成纤维细胞等可用于本发明中。
在本发明中，在CTL的制备过程中前体细胞等的培养条件可例如按照一般公知的条件进行设定[参见例如Carter J.等，Immunology 57(1)，123-129(1986)]。
此外，所述细胞可与合适的饲养细胞一起共培养。当CTL与饲养细胞共培养时，要求培养基适合CTL和饲养细胞的维持和生长。可用市售培养基作为培养基。
对用于本发明方法的饲养细胞没有具体限制，只要所述饲养细胞与抗CD3抗体协同刺激CTL以激活T细胞受体。在本发明中，使用例如PBMC或用Epstein-Barr病毒转化的B细胞(EBV-B细胞)。通常，饲养细胞在其增殖能力通过辐射等方式除去后使用。顺便说明一下，培养基中饲养细胞的含量可按照已知条件进行确定。例如，所述含量优选为1×105-7细胞/ml。
在本发明特别优选的实施方案中，将非病毒感染的细胞如除EBV-B细胞以外的细胞用作饲养细胞。通过使用非病毒感染的细胞，可消除EBV-B细胞与扩增的CTL混合的可能性，从而有可能提高应用CTL的医学治疗如过继免疫疗法的安全性。
抗原呈递细胞可通过将抗原肽加入到具有抗原呈递能力的细胞来制备，从而使所述细胞能呈递其表面上的抗原肽[参看例如BendnarekM.A.等，J. Immunol.147(12)，4047-4053(1991)]。此外，在具有抗原呈递能力的细胞具有加工抗原的能力的情况中，将抗原加入到所述细胞，使得抗原被掺入细胞中并被加工，然后成片段的抗原肽在细胞表面上被呈递。顺便说明一下，当将抗原肽加入到具有抗原呈递能力的细胞时，使用与所用的抗原呈递细胞和待诱导的CTL的MHC限制相匹配的抗原肽。
顺便说明一下，对用于本发明的抗原没有具体限制，所述抗原包括例如外源抗原如细菌和病毒，内源抗原如肿瘤相关抗原(癌抗原)等。
在本发明中，优选使抗原呈递细胞不能增殖。为使抗原呈递细胞不能增殖，所述细胞可例如用X射线等辐射，或用药物如丝裂霉素处理。
在本发明中，用以将能分化成CTL的前体细胞与抗原呈递细胞在选自纤连蛋白、其片段或其混合物的有效成分存在下一起孵化(共培养)以诱导CTL的一般条件可以是已知条件[参见例如Bendnarek M.A.等，J.Immunol.，147(12)，4047-4053(1991)]。对共培养条件没有具体限制，可以使用细胞培养通常所用的条件。例如，细胞可在5％CO2存在下在37℃等条件下培养。共培养通常进行约2-约15天，期间所述抗原呈递细胞可用新鲜制备的抗原呈递细胞更换，以进行再刺激。此外，所述培养基可适当定时用新鲜培养基更换。
通过本发明方法这样获得的CTL具有特异性地识别所需抗原的能力，例如通过其细胞毒性活性特异性地破坏携有所述抗原的细胞。CTL的这种细胞毒性活性可通过已知方法进行评价。例如，CTL针对用放射性物质、荧光物质等标记的靶细胞的细胞毒性活性可通过测定归属CTL所破坏的靶细胞的放射性或荧光强度来评价。此外，可通过测定抗原特异性地从CTL或靶细胞释放的细胞因子如GM-CSF或IFN-γ的量来进行检测。除以上方法外，细胞毒性活性可通过使用其中的肽用荧光色素等标记的抗原肽-MHC复合体直接进行确认。在这种情况下，例如CTL与偶联了CTL特异性抗原的第一种荧光标记接触，然后与其中的肽偶联了第二种荧光标记的抗原肽-MHC复合体接触，通过FACS(荧光激活细胞分选)分析法检测双重标记细胞的存在，从而可以评价CTL的细胞毒性活性。
顺便说明一下，对本发明扩增CTL的方法没有具体限制，只要上述有效成分存在于所述方法中所用的培养系统中。本发明也包括这样的实施方案，其中所述方法要在培养系统中存在上述有效成分，按与以上所述不同的CTL扩增常规方法来进行，即前体细胞等的培养在本发明有效成分存在下(例如将上述有效成分加入到待用于培养的培养基中)进行。
下面详细说明培养LAK细胞的方法。
LAK细胞的培养是通过在上述有效成分存在下将能形成LAK细胞的细胞与IL-2一起孵化进行的。能形成LAK细胞的细胞包括但不具体限于例如外周血单核细胞(PBMC)、NK细胞、脐带血单核细胞、造血干细胞、含有这些细胞的血液组分等。
此外，培养LAK细胞的一般条件可按已知条件进行设定[例如参看Saibo Kogaku(Cell Technology)，14(2)，223-227(1995)；Saibo Baiyo(Cell Culture)17(6)，192-195(1991)；THE LANCET，356，802-807(2000)；Current Protocols in Immunology，supplement 17，UNIT 7.7]。对共培养条件没有具体限制，可采用用于一般细胞培养的条件。例如，细胞可在5％CO2存在下在37℃等条件下培养。此共培养通常进行约2-约15天。此外，可适当定时用新鲜培养基更换所用培养基。
对于TIL，可按与上述CTL或LAK细胞的诱导、维持或扩增相同的方式，通过在纤连蛋白、其片段或其混合物存在下培养细胞来制备具有高细胞毒性活性的一组细胞。在本发明中，对激活这些细胞的程序没有具体限制，只要纤连蛋白、其片段或其混合物与所述细胞共存，且所述程序可用适合培养或激活上述细胞的培养基来进行。对于所用的纤连蛋白、其片段或其混合物的量，及加入组分等的方法，可按照上述方法进行合适的选择。
根据上述的本发明制备细胞毒性淋巴细胞的方法，获得这样的细胞毒性淋巴细胞，其中细胞毒性活性维持在高水平，IL-2R的表达显著提高以及CD8阳性细胞的比率提高，所述细胞毒性淋巴细胞适用于医学中。因此，本发明方法的一个实施方案是进一步提供增强细胞毒性淋巴细胞的白细胞介素-2受体表达的方法，所述方法包括在本发明有效成分存在下进行至少细胞毒性淋巴细胞的诱导、维持和扩增之任一项的步骤；提高细胞毒性淋巴细胞中CD8阳性细胞的比率的方法，所述方法包括在本发明有效成分存在下进行细胞毒性淋巴细胞的诱导、维持和扩增之任一项的步骤；以及提高或维持细胞毒性淋巴细胞中细胞毒性活性的方法，所述方法包括在本发明有效成分存在下进行至少细胞毒性淋巴细胞的诱导、维持和扩增之任一项的步骤；
本发明的另一实施方案是提供增强细胞表面上的IL-2R表达的药物，所述药物包括作为有效成分的纤连蛋白、其片段或其混合物。所述增强药物包括有效成分本身以及进一步任选的其它成分，例如适合待激活细胞的培养基、蛋白质和细胞因子(优选IL-2)，及其它需要的组分。同时，包含上述增强药物的培养基可用作用以增强细胞毒性淋巴细胞的IL-2R表达的培养基。上述培养基任选含有用于细胞培养的基本组分。在此，增强药物和上述用以增强IL-2R表达的培养基可按照已知方法用本发明有效成分进行制备。对增强药物或上述用以增强IL-2R表达的培养基中的本发明有效成分等的含量没有具体限制，只要获得本发明所需的效果即可。例如，所述含量可按照用于本发明方法的上述培养基中的有效成分等的含量按需进行适当的确定。此外，上述增强药物可直接给予生物体，从而增强生物体内细胞上的IL-2R表达。
本发明的又一实施方案是提供用以提高培养的淋巴细胞群体中CD8阳性细胞的比率的药物，其特征是所述药物包括作为有效成分的纤连蛋白、其片段或其混合物。所述比率提高药物包括有效成分本身以及进一步任选的其它成分，例如适合待激活细胞的培养基、蛋白质和细胞因子(优选IL-2)，及其它需要的组分。同时，包含上述比率提高药物的培养基可用作用以提高细胞毒性淋巴细胞中的CD8阳性细胞比率的培养基。上述培养基任选含有用于细胞培养的基本组分。上述培养基任选含有用于细胞培养的基本组分。在此，比率提高药物和上述用以提高比率的培养基可按照已知方法用本发明有效成分进行制备。比率提高药物或上述用以提高CD8阳性细胞比率的培养基中的本发明有效成分等的含量可按照与用于IL-2R表达等的上述药物的情况同样的方式按需进行适当的确定。此外，上述比率提高药物可直接给予生物体，从而提高生物体内细胞毒性淋巴细胞的比率。
本发明的另一实施方案是提供提高或维持细胞毒性淋巴细胞的细胞毒性活性的药物，其特征是所述药物包括作为有效成分的纤连蛋白、其片段或其混合物。所述提高或维持药物包括有效成分本身以及进一步任选的其它成分，例如适合待激活细胞的培养基、蛋白质和细胞因子(优选IL-2)，及其它需要的组分。同时，包含上述提高或维持药物的培养基可用作用以提高或维持细胞毒性淋巴细胞的细胞毒性活性的培养基。上述培养基任选含有用于细胞培养的基本组分。在此，提高或维持药物和上述用以提高或维持的培养基可按照已知方法用本发明有效成分进行制备。对提高或维持药物或上述用以提高或增强的培养基中的本发明有效成分等的含量没有具体限制，只要获得本发明所需的效果即可。例如，所述含量可按照用于本发明方法的上述培养基中的有效成分等的含量按需进行适当的确定。此外，上述提高或维持药物可直接给予生物体，从而提高或增强生物体内细胞毒性淋巴细胞的活性。
另外，上述表达增强药物、比率提高药物和提高或维持细胞毒性活性的药物可以为这样形式，所述形式中各组分固定到合适的固相上，例如细胞培养设备如培养皿、培养瓶或培养袋(包括开放体系设备和密闭体系设备)，及细胞培养载体如珠粒、薄膜或载玻片。
通常，在通过使用上述制备细胞毒性淋巴细胞的方法获得的含淋巴细胞培养物中，除细胞毒性淋巴细胞之外的细胞如辅助T细胞也混合在其中。但是，由于在通过本发明方法获得的含淋巴细胞培养物中含有大量的具有细胞毒性活性的淋巴细胞，可通过离心等方式从培养物中收获培养细胞，直接用作通过本发明方法获得的细胞毒性淋巴细胞。此外，如果上述有效成分等固定到细胞培养设备等中，就不存在组分等物质混入在所得细胞毒性淋巴细胞中的这样的风险了。
此外，富含细胞毒性淋巴细胞的细胞群体(或培养物)可通过已知方法进一步从培养物中分离，直接用作本发明细胞毒性淋巴细胞。换句话说，制备通过本发明方法获得的细胞毒性淋巴细胞的方法可包括从通过所述方法获得的培养物中选择富含细胞毒性淋巴细胞的细胞群体的步骤。
对选择富含细胞毒性淋巴细胞的细胞群体的方法没有具体限制。所述方法可由例如以下方法例示，该方法包括使用细胞培养设备或载体从培养物中选择性地只收集需要的细胞，其中细胞培养设备或载体上结合有抗表达于需要的细胞表面上的细胞表面抗原的抗体(例如抗CD8抗体)，或使用流式细胞仪的方法例示。上述载体的实例有磁珠或柱子。此外，富含需要的细胞的细胞群体可通过从培养物中吸附除去需要的细胞之外的细胞来获得。例如，可使用抗表达于辅助T细胞表面上的细胞表面抗原的抗体(如抗CD4抗体)将辅助T细胞从淋巴细胞培养物中除去。在此步骤中，也可使用流式细胞仪。这样获得的富含细胞毒性淋巴细胞的细胞群体与从培养物中非选择性地收集的细胞群体相比，具有更强的细胞毒性活性，使得所述细胞群体可特别优选用于医疗领域中。
另外，本发明提供通过上述本发明制备细胞毒性淋巴细胞的方法获得的细胞毒性淋巴细胞。所述淋巴细胞尤其是CTL具有高细胞毒性活性，其特点是即使当所述淋巴细胞长时间进行连续培养或扩增时，细胞毒性活性也几乎不会降低。此外，本发明提供包含淋巴细胞作为有效成分的药物(治疗药物)。尤其是，包含淋巴细胞的上述治疗药物适合用于过继免疫疗法。在过继免疫疗法中，适合于治疗患者的具有细胞毒性活性的淋巴细胞可通过例如静脉给药方式给予患者。治疗药物可通过例如以下方法制备：按照药学领域公知的方法，将通过本发明方法制备的作为有效成分的淋巴细胞与例如适合非口服给药的已知有机或无机载体、赋形剂、稳定剂等混合。顺便说明一下，治疗药物的不同条件，如治疗药物中本发明的淋巴细胞的含量和治疗药物的剂量，可按照已知的过继免疫疗法进行适当的确定。
本发明制备细胞毒性淋巴细胞的方法可进一步包括将外源基因转导到淋巴细胞的步骤。换句话说，本发明的一个实施方案提供制备细胞毒性淋巴细胞的方法，所述方法进一步包括将外源基因转导到淋巴细胞的步骤。在此，术语“外源”指对于待转导入基因的淋巴细胞而言，所述基因是外源的。
通过进行本发明制备细胞毒性淋巴细胞的方法，尤其是进行扩增细胞毒性淋巴细胞的方法，培养的淋巴细胞的DNA复制能力得到提高。因此，通过将转导基因的步骤包括在本发明制备细胞毒性淋巴细胞的方法中，可预计在基因转导方法中获得DNA复制能力的提高。
对转导外源基因的方法没有具体限制，可从已知的转导基因的方法中选择合适的方法。转导基因的步骤可在制备细胞毒性淋巴细胞过程中的任何给定点进行。例如，从工作效率的观点出发，优选将该步骤与上述淋巴细胞的诱导、维持和/或扩增的任何步骤同时进行，或在这些步骤之后进行。
本发明可采用使用病毒载体的任何方法和不使用载体的方法作为上述转导基因的方法。这些方法的详细内容已在许多文献中公开。
对上述病毒载体没有具体限制，可使用在转导基因的方法中一般应用的已知病毒载体，例如逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体、猿猴病毒载体、痘苗病毒载体、仙台病毒载体等。特别优选使用逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒或猿猴病毒作为病毒载体。优选使用那些缺乏复制能力而不能进行自我复制的病毒载体作为上述病毒载体。
出于基因治疗等的目的使用逆转录病毒，是因为在待转导入载体的细胞的染色体DNA中可稳定地掺入已插入到载体中的外源基因。因为所述载体在有丝分裂和增殖过程中对细胞的感染效率高，基因转导优选在制备细胞毒性淋巴细胞的方法中进行，例如在扩增步骤中进行。
作为不使用病毒载体的转导基因的方法，可采用但不具体限于例如使用载体如脂质体或配体-聚赖氨酸的方法、磷酸钙方法、电穿孔方法、基因枪方法等。在这种情况下，外源基因被转导掺入质粒DNA或线性DNA中。
对待转导到本发明细胞毒性淋巴细胞中的外源基因没有具体限制，可选择需要转导到上述细胞中的任意基因。作为上述基因，除编码蛋白质(例如酶、细胞因子、受体等)的基因外，可使用例如编码反义核酸或核酶的基因。此外，可同时转导合适的能选择转导有基因的细胞的标记基因。
上述外源基因可例如插入到载体、质粒等，使得所述外源基因可在合适的启动子控制下表达，以此加以使用。此外，为实现基因的有效转录，在载体中可存在与启动子或转录起始位点协同作用的其它调节元件，例如增强子序列或终止子序列。此外，出于将外源基因插入到淋巴细胞(在其中外源基因通过同源重组转导)的染色体的目的，例如外源基因可排列于侧翼序列之间，所述侧翼序列包括分别与位于染色体中需要的基因目标插入位点两边的核苷酸序列同源的核苷酸序列。待转导的外源基因可以是天然基因或人工生产的基因，或者可以是在其中具有各不相同的来源的DNA分子通过已知方法如连接反应结合的外源基因。此外，所述外源基因可以是具有这样一段序列的基因，根据该基因的目的，在所述序列中有变异被引入到天然序列中。
根据本发明方法，例如将编码与用于治疗癌症等患者的药物的抗药性有关的酶的基因转导到细胞毒性淋巴细胞中，从而赋予所述淋巴细胞药物抗性。如果使用上述细胞毒性淋巴细胞，可合并过继免疫疗法和药物疗法，从而可获得更高的治疗效果。药物抗性基因的实例为例如广谱抗药基因。
另一方面，与上述实施方案相反，可将用以赋予对特定药物的敏感性的基因转导到细胞毒性淋巴细胞中，从而赋予对药物的敏感性。在这种情况下，所述淋巴细胞被移植到生物体后，可通过给予药物来除去。用以赋予对药物的敏感性的基因的实例为例如胸苷激酶基因。
实施例
以下通过实施例对本发明进行更具体的介绍，但这些实施例无论如何都不是对本发明范围的限制。
制备实施例1   纤连蛋白片段的制备
(1)纤连蛋白片段的制备
按照美国专利第5,198,423号介绍的方法，从大肠杆菌(Escherichia coli)HB101/pHD101(FERM BP-2264)制备衍自人纤连蛋白的片段H-271。
此外，按照上述专利公报介绍的方法，从通过培养大肠杆菌HB101/pHD102(FERM BP-7420)、大肠杆菌HB101/pCH101(FERMBP-2799)或大肠杆菌HB101/pCH102(FERM BP-2800)获得的培养物分别制备衍自人纤连蛋白的片段H-296、CH-271和CH-296。
按照美国专利第5,102,988号介绍的方法，从通过培养大肠杆菌JM109/pTF7221(FERM BP-1915)获得的培养物制备衍自人纤连蛋白的片段C-274。
按照日本专利公报第3104178号介绍的方法，从通过培养大肠杆菌HB101/pCS25(FERM BP-5723)获得的培养物制备衍自人纤连蛋白的片段C-CS1。
按照日本专利公报第2729712号介绍的方法，从通过培养大肠杆菌HB101/pCHV89(FERM P-12182)或大肠杆菌HB101/pCHV179(FERM P-12183)获得的培养物制备衍自人纤连蛋白的片段CHV-89和CHV-179。
此外，按照日本专利公报第2729712号介绍的方法，制备衍自人纤连蛋白的片段CHV-90。具体而言，按照上述公报介绍的程序构建质粒pCHV90，然后培养携有该质粒的转化子，再从培养物中制备CHV-90。
可如下制备衍自人纤连蛋白的片段CHV-181：按照WO 97/18318介绍的方法构建包含DNA编码CHV-181的质粒(pCHV181)，然后培养已引入所述质粒的大肠杆菌HB 101/pCHV181，再按与上述CHV-179相同的方式从培养物中制备片段。
(2)CHV-92的制备
根据表达上述多肽CHV-181的质粒pCHV181，构建在编码CHV-181的区域中缺失了编码III-13区域的区域的质粒CHV92。缺失程序可按照日本专利公报第2729712号介绍的从质粒pCHV179中缺失III-14编码区域的程序进行。
培养转化有上述质粒pCHV92的大肠杆菌HB101(大肠杆菌HB101/pCHV92)，按照日本专利公报第2729712号介绍的纯化CHV-89多肽的方法进行纯化程序，从所得培养物中获得纯化的CHV-92制品。
(3)H-275-Cys的制备
按照以下程序构建表达多肽H-275-Cys的质粒。具体而言，从大肠杆菌HB101/pCH102(FERM BP-2800)制备质粒pCH102。以上述质粒为模板，用具有序列表的SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列的引物12S和具有序列表的SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列的引物14A进行PCR，得到长约0.8kb、编码纤连蛋白的肝素结合多肽的DNA片段。所得DNA片段用NcoI和BamHI(均由Takara Bio Inc.生产)消化，然后用已用NcoI和BamHI消化的pTV118N(Takara Bio Inc.生产)连接，构建质粒pRH1。
用BamHI和HincII(Takara Bio Inc.生产)消化质粒载体pINIII-ompA1[Ghrayeb J.等，EMBO J.，3(10)，2437-2442(1984)]，以收集长约0.9kb、含有脂蛋白终止子区域的DNA片段。将此片段与上述已用BamHI和HincII消化的质粒pRH1混合及连接，得到按顺序含有lac启动子、编码肝素结合多肽的DNA片段和脂蛋白终止子的质粒pRH1-T。
以此质粒pRH1-T为模板，用具有序列表的SEQ ID NO：22所示的核苷酸序列的引物Cys-A和具有序列表的SEQ ID NO：23所示的核苷酸序列的引物Cys-S进行PCR反应。然后，将收集到的扩增DNA片段用NotI(Takara Bio Inc.生产)消化，所述DNA片段进一步进行自身连接。将这样获得的环DNA用SpeI和ScaI(Takara Bio Inc.生产)消化，得到长约2.3kb的DNA片段，将所得片段与通过用SpeI和ScaI(TakaraBio Inc.生产)消化质粒pRH1-T获得的2.5kb的DNA片段混合及连接，得到质粒pRH-Cys。此质粒编码多肽H-275-Cys，其中四个氨基酸Met-Ala-Ala-Ser加到上述H-271的N末端，且还有Cys加到H-271的C末端。
多肽H-275-Cys通过以下方法制备。将转化有上述质粒pRH-Cys的大肠杆菌HB101(大肠杆菌HB101/pRH-Cys)在120ml的LB培养基中在37℃下培养过夜。将从培养基中收集的细胞悬浮于40ml破裂缓冲液(50mM Tris-HCl、1mM EDTA、150mM NaCl、1mM DTT、1mMPMSF，pH 7.5)，超声处理所述悬浮液以使细胞破裂。将离心获得的上清液加到已用纯化缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.5)平衡的HiTrap-肝素柱(Pharmacia生产)。将柱中的非吸收部分用同一缓冲液洗涤，然后用具有0-1M NaCl浓度梯度的纯化缓冲液进行洗脱。洗脱液用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，收集对应于H-275-Cys分子量的部分，得到纯化的H-275-Cys制品。
实施例1  CTL中CD8阳性细胞的比率
(1)PBMC的分离和储存
经知情同意，从具有HLA-A2.1的人类正常个体供血者收集血液组分。将收集到的血液组分用PBS(-)稀释两倍，加载到Ficoll-paque(Pharmacia生产)，在500×g离心20分钟。用吸液管收集中间层的外周血单核细胞(PBMC)并洗涤。将收集的PBMC悬浮于90％FBS(Bio Whittaker生产)/10％DMSO(SIGMA生产)的贮存液中并在液氮中保藏。在CTL诱导过程中，这些储藏PBMC在37℃水浴中快速融化，并用含有10μg/ml DNA酶(Calbiochem生产)的RPMI 1640培养基(Bio Whittaker生产)洗涤。然后，用台盼蓝染色法计算活细胞数量，将所述细胞用于各个实验中。
(2)抗流感病毒记忆CTL的诱导
抗流感病毒记忆CTL的诱导通过部分改进Bednarek等的方法[J.Immunology，147(12)，4047-4053(1991)]来进行。具体而言，将实施例的(1)项中制备的PBMC悬浮于含有5％人AB型血清、0.1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺(以上均由Bio Whittaker生产)、10mM HEPES(nakalai tesque生产)、1％链霉素-青霉素(Gibco BRL生产)的RPMI 1640培养基(Bio Whittaker生产)(以下简称“5HRPMI”)中，以使细胞浓度为1-4×106细胞/ml。然后，将悬浮液以1ml/孔的体积加入到24孔细胞培养板(Falcon生产)上，在37℃的5％CO2湿型培养箱中孵化细胞1.5小时，以分离塑料粘附性单核细胞。然后，用RPMI1640培养基收集非粘附细胞，保藏于冰上作为反应细胞。向分离的单核细胞各加入0.5ml的5HRPMI，其中含有5μg/ml作为抗原肽的衍自流感病毒蛋白的表位肽(衍自序列表的SEQ ID NO：24的基质蛋白的A2.1-结合肽)和1μg/ml β2微珠蛋白(Scrips生产)。将所得混合物在室温下孵化2小时，然后用X射线辐射(5500R)处理细胞，得到抗原呈递细胞。从各孔中吸去肽溶液，用RPMI 1640培养基洗涤各孔。然后，将原先储藏在冰上的反应细胞吸入到5HRPMI，使细胞浓度为0.5-2×106细胞/ml。将所得悬浮液以每孔1ml的量加入到抗原呈递细胞。此时，加入制备实施例1中介绍的各纤连蛋白片段(以下称“FNfr”)，使其终浓度为10μg/ml。将不加FNfr的组留作对照组。将培养板在5％CO2存在下和37℃下培养。从培养开始起的第二天，向各孔中加入1ml含60U/ml IL-2(Shionogi & Co.，Ltd生产)和10μg/ml FNfr的5HRPMI(对照组只含IL-2)。而在第五天，除去一半的培养上清液，各加入1ml与上述相同的含IL-2和FNfr的培养基(对照组只含IL-2)。在第七天，按与上述相同的方式制备抗原呈递细胞，然后将已培养一周的反应细胞悬浮于5HRPMI，使细胞浓度为0.5-2×106细胞/ml。将所得悬浮液以1ml/孔的量分别加入到制备的抗原呈递细胞中，以再次刺激细胞。此时，加入FNfr使其终浓度为10μg/ml(对照组不加入)。自再次刺激起第二天，向各孔中加入1ml含60U/ml IL-2和10μg/ml FNfr的5HRPMI(对照组只含IL-2)。而在第五天，除去一半的培养上清液，各加入1ml与除去上清前的培养基含量相同的培养基。再继续培养2天，以诱导CTL。
(3)CTL的细胞毒性活性的测定
实施例1的(2)项制备的CTL在诱导开始后第十四天的细胞毒性活性可通过使用钙荧光素-AM的细胞毒性活性测定方法[R.Lichtenfels等，J. Immunological Methods，172(2)，227-239(1994)]进行评价。将与表位肽一起或在表位肽不存在下培养过夜的具有HLA-A2.1、EBV转化的B细胞(细胞名称：221A2.1)悬浮于含5％FBS(BioWhittaker生产)的RPMI 1640培养基，使细胞浓度为1×106细胞/ml。然后将钙荧光素-AM(Dotite生产)加入到所得悬浮液中，使其终浓度为25μM，再将细胞在37℃下培养1小时。所述细胞用不含钙荧光素-AM的培养基洗涤，然后与20倍量的K562细胞(ATCC CCL-243)混合，得到钙荧光素标记的靶细胞。K562细胞用来排除混合在反应细胞中的NK细胞的非特异性细胞毒性活性。
用5HRPMI逐步稀释实施例1的(2)项制备的记忆CTL，使细胞浓度为1×105-9×106细胞/ml，用作效应细胞。然后，将各稀释液以100μl/孔的量倾入96孔细胞培养板的各孔中。以100μl/孔的量向各孔加入制备得到的浓度为1×105细胞/ml的钙荧光素标记靶细胞。将含有上述细胞悬浮液的培养板在400×g离心1分钟，然后在湿型CO2培养箱中37℃孵化4小时。4小时后，从各孔收集100μl培养上清液，用荧光板读数器(485nm/538nm)测定释放到培养上清液的钙荧光素的量(荧光强度)。CTL的细胞毒性活性可用以下公式1计算：
公式1：细胞毒性活性(％)＝
[(各孔测定值-最小释放量)/
(最大释放量-最小释放量)]×100
在以上公式中，最小释放量为在只含有靶细胞和K562细胞的孔中释放的钙荧光素的量，表示从靶细胞自然释放的钙荧光素的量。此外，最大释放量指当通过向靶细胞加入0.1％表面活性剂Triton X-100(nakalai tesque生产)来完全破坏细胞时所释放的钙荧光素的量。结果，在诱导后立即有细胞毒性活性被诱导，但在诱导过程中添加或不添加FNfr得到的细胞毒性活性几乎没有任何差别。
(4)CTL细胞群体中CD8阳性细胞的含量比率的测定
实施例1的(2)项制备的量为2×105个细胞的CTL用含1％低聚甲醛(nakalai tesque生产)的PBS(Nissui生产)固定，然后用PBS洗涤。将固定细胞悬浮于100μl含1％BSA(SIGMA生产)的PBS，加入FITC标记的鼠IgG1或FITC标记的鼠抗人CD8抗体(两者均由DAKO生产)，然后将所得混合物在冰上孵化30分钟。孵化后，用PBS洗涤细胞，然后再悬浮于含1％低聚甲醛的PBS。用FACSVantage(Becton Dickinson生产)对细胞进行流式细胞术计数，测定CD8阳性细胞的含量比率。结果在表1显示。
表1
Figure G2009102171437D00341
如表1所示，在CTL诱导过程中添加各种纤连蛋白片段的组与不添加这些纤连蛋白片段的对照组相比，CTL诱导开始后第十四天的CD8阳性细胞的比率高。换句话说，现清楚CTL在纤连蛋白片段的共存下可被诱导并显著增殖CD8阳性细胞。
实施例2白细胞介素-2受体表达的诱导
(1)抗流感病毒记忆CTL的诱导
抗流感病毒记忆CTL的诱导用按与实施例1的(1)项相同的方式分离和储藏的PBMC，按与实施例1的(2)项相同的方式进行。诱导开始后第十四天CTL的细胞毒性活性按与实施例1的(3)项相同的方式进行评价。结果，在诱导过程中添加或不添加FNfr得到的细胞毒性活性几乎没有任何差别。
(2)CTL中白细胞介素-2受体表达比率的测定
实施例2的(1)项制备的CTL在诱导开始后第十四天的白细胞介素-2受体(IL-2R)表达比率按照实施例1的(4)项介绍的方法进行测定。在此，在本程序中，FITC标记的小鼠抗人CD8抗体改变为FITC标记的小鼠抗人IL-2R(CD25)抗体(DAKO生产)。结果在表2显示。
表2
Figure G2009102171437D00361
如表2所示，在所有添加各种纤连蛋白片段诱导的CTL中，观察到细胞群体中IL-2R表达的比率提高。换句话说，现清楚在纤连蛋白片段的共存下进行诱导时，CTL可被诱导并提高IL-2R的表达水平。
实施例3   CTL的扩增
(1)抗流感病毒记忆CTL的诱导
抗流感病毒记忆CTL的诱导用按与实施例1的(1)项相同的方式分离和储藏的PBMC，按与实施例1的(2)项相同的方式进行。诱导开始后第十四天CTL的细胞毒性活性按与实施例1的(3)项相同的方式进行评价。结果，在诱导过程中添加或不添加FNfr得到的细胞毒性活性几乎没有任何差别。
(2)CTL的扩增
用5HRPMI洗涤实施例3的(1)项制备的CTL，然后制成细胞浓度为3×104细胞/ml的悬浮液。另一方面，对按与实施例1的(1)项相同的方式收集的不含有HLA-A2.1的同种异体PBMC进行X射线辐射(3300R)，用培养基洗涤细胞，然后制成细胞浓度为2-5×106细胞/ml的悬浮液。将这些CTL(3×104细胞)和同种异体PBMC(4-10×106细胞)悬浮于10ml的5HRPMI或含以下成分的RPMI 1640培养基(BioW/hittaker生产)：10％Hyclone FBS、0.1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、2mM L谷氨酰胺(均由Bio Whittaker生产)、10mM HEPES(nakalai tesque生产)和1％链霉素-青霉素(Gibco BRL生产)(以下简称10HycloneRPMI)，再加入抗CD3抗体(Janssen-Kyowa生产)，使终浓度为50ng/ml。将所得混合物装入12.5cm2培养瓶(Falcon生产)，在湿型CO2培养箱中37℃培养细胞14天。培养过程中，添加FNfr，使终浓度为10μg/ml，与CTL诱导过程中的添加FNfr所得浓度相同。同时，对不添加FNfr进行诱导的对照组，则不添加FNfr。在此培养过程中，完全不进行肽刺激。在扩增开始后第一天，添加IL-2，使终浓度为120U/ml。另外，在培养开始后第四天及以后每隔1-2天，进行以下程序：除去一半的培养上清液，然后向各培养瓶中加入5ml含60U/ml IL-2的5HRPMI或10HycloneRPMI。在培养过程中，将FNfr以相同的浓度添加到需添加FNfr的组的培养基中。在扩增开始后第十四天，按实施例1的(3)项相同的方式测定CTL的细胞毒性活性。维持扩增前的细胞毒性活性的程度以“细胞毒性活性维持率(％)”进行计算。
“细胞毒性活性维持率(％)”按以下方程式2进行计算：
方程式2：“细胞毒性活性维持率(％)”＝
[扩增后细胞毒性活性(％)/
扩增前细胞毒性活性(％)]×100
测定结果在表3显示。在表中，E/T比率指效应细胞(E)数量与靶细胞(T)数量的比率。
表3
如表3所示，在诱导和扩增过程中添加各种纤连蛋白片段的组与与不添加纤连蛋白片段的对照组相比，其CTL即使在扩增14天后也能维持特异性的高细胞毒性活性。换句话说，现清楚通过在纤连蛋白片段共存下进行诱导和扩增，CTL可在高细胞毒性活性得以长时间维持的状态下进行扩增。
实施例4  CTL扩增后细胞群体中IL-2R的表达
(1)抗流感病毒记忆CTL的诱导
抗流感病毒记忆CTL的诱导用按与实施例1的(1)项相同的方式分离和储藏的PBMC，按与实施例1的(2)项相同的方式进行。诱导开始后第十四天CTL的细胞毒性活性按与实施例1的(3)项相同的方式进行评价。结果，在诱导过程中添加或不添加FNfr得到的细胞毒性活性几乎没有任何差别。
(2)扩增的CTL中白细胞介素-2受体表达比率的测定
按与实施例3的(2)项相同的方式扩增实施例4的(1)项中制备的CTL。按与实施例2的(2)项相同的方式测定扩增后获得的CTL中IL-2R表达阳性细胞的比率。结果在表4显示。
表4
如表4所示，在CTL诱导和扩增过程中添加各种纤连蛋白片段的所有组中，观察到细胞群体中IL-2R表达细胞的比率提高。
换句话说，现清楚通过在纤连蛋白片段存在下进行诱导和扩增，CTL可被扩增并提高IL-2R的表达水平。
实施例5  在纤连蛋白存在下CTL的诱导和扩增
(1)抗流感病毒记忆CTL的诱导
抗流感病毒记忆CTL的诱导用按照实施例1的(1)项介绍的方法分离和储藏的PBMC，按照实施例1的(2)项介绍的方法进行。在诱导过程中，添加纤连蛋白(Calbiochem生产)而不是FNfr，使终浓度为10μg/ml(对照组不添加)。诱导开始后第十四天CTL的细胞毒性活性按与实施例1的(3)项相同的方式进行测定。结果，在诱导过程中添加或不添加纤连蛋白得到的细胞毒性活性几乎没有任何差别。
(2)CTL中白细胞介素-2受体表达比率的测定
按与实施例2的(2)项相同的方式测定实施例5的(1)项制备的CTL中IL-2R表达阳性细胞的比率。结果在表5显示。
表5
Figure G2009102171437D00411
如表5所示，在纤连蛋白存在下诱导的CTL中，观察到细胞群体中IL-2R表达细胞的比率提高。
换句话说，现清楚通过在纤连蛋白存在下进行CTL的诱导，CTL可被诱导并提高IL-2R的表达水平。
(3)CTL的扩增
实施例5的(1)项制备的CTL按与实施例3的(2)项相同的方式进行扩增。在扩增过程中，向需在诱导过程中添加纤连蛋白的组添加纤连蛋白(Calbiochem生产)，使终浓度为10μg/ml(对照组不添加)。所获得的CTL的细胞毒性活性按与实施例1的(3)项相同的方式进行测定，维持扩增前的细胞毒性活性的程度以“细胞毒性活性维持率(％)”进行计算。
测定结果在表6显示。
表6
Figure G2009102171437D00421
如表6所示，CTL的诱导和扩增在纤连蛋白存在下进行的组维持着高细胞毒性活性。相反，在CTL的诱导和扩增过程中不添加纤连蛋白的对照组的细胞毒性活性明显降低。换句话说，现清楚通过在CTL的诱导和扩增过程中添加纤连蛋白，CTL可在特异性细胞毒性活性得以长时间维持的状态下进行扩增。
实施例  6CTL在固定化纤连蛋白(FN)片段存在下的扩增
(1)FN片段的固定化
将纤连蛋白片段固定到用于以下实验的培养设备(容器)。具体而言，含有各种纤连蛋白片段(终浓度：10μg/ml)的PBS以1-2ml的量分别加入到24孔细胞培养板和12.5cm2培养瓶中。将所述细胞培养板和培养瓶在室温下孵化5小时，然后在4℃下保存备用。此外，所述细胞培养板和培养瓶在使用前用PBS洗涤两次。
(2)抗流感病毒记忆CTL的诱导
抗流感病毒记忆CTL的诱导用按照实施例1的(1)项介绍的方法分离和储藏的PBMC，按照实施例1的(2)项介绍的方法进行。在诱导过程中，将固定有FNfr的培养板用作培养设备(对照组用不经固定化处理的培养板)。诱导后CTL的细胞毒性活性按与实施例1的(3)项相同的方式进行评价。结果，不管在诱导过程中所用培养板是否固定有FNfr，细胞毒性活性几乎没有任何差别。
(3)CTL的扩增
实施例6的(2)项制备的CTL按与实施例3的(2)项相同的方式进行扩增。在扩增过程中，固定有各种FNfr的培养瓶用作培养设备(对照组用不经固定化处理的培养瓶)。此外，用10HycloneRPMI作为培养基。
这样扩增的CTL与扩增前相比维持其细胞毒性活性的程度以“细胞毒性活性维持率(％)”进行评价。
测定结果在表7显示。
表7
Figure G2009102171437D00431
如表7所示，在CTL的诱导和扩增过程中使用固定有纤连蛋白片段的培养设备(培养板、培养瓶)的组中，CTL即使在扩增后也维持着特异性的高细胞毒性活性。相反，在CTL的诱导和扩增过程中使用不固定有纤连蛋白片段的培养设备的对照组，其细胞毒性活性明显降低。换句话说，现清楚通过使用固定化纤连蛋白片段，CTL可在高细胞毒性活性得以长时间维持的状态下进行扩增，结果与使用溶于培养基中的片段的结果相近。
实施例7  CTL扩增后细胞群体中CD8阳性细胞的含量比率
(1)抗流感病毒记忆CTL的诱导
抗流感病毒记忆CTL的诱导用按与实施例1的(1)项相同的方式分离和储藏的PBMC，按与实施例1的(2)项相同的方式进行。诱导开始后第十四天CTL的细胞毒性活性按与实施例1的(3)项相同的方式进行评价。结果，在诱导过程中添加或不添加FNfr得到的细胞毒性活性几乎没有任何差别。
(2)扩增的CTL中CD8阳性细胞含量比率的测定
按与实施例3的(2)项相同的方式扩增实施例7的(1)项中制备的CTL。按与实施例1的(4)项相同的方式测定扩增后获得的CTL中CD8阳性细胞的含量比率。结果在表8显示。
表8
如表8所示，在CTL诱导和扩增过程中添加各种纤连蛋白片段的所有组中，观察到扩增后的细胞群体中CD8阳性细胞的含量比率提高。
换句话说，现清楚通过在纤连蛋白片段存在下进行CTL诱导和扩增，CTL可被扩增并显著增殖CD8阳性细胞。
实施例8  在固定化纤连蛋白片段存在下诱导的CTL中白细胞介素-2 受体表达的诱导
(1)FN片段的固定化
按与实施例6的(1)项相同的方式将纤连蛋白片段固定到培养设备(容器)。
(2)抗流感病毒记忆CTL的诱导
抗流感病毒记忆CTL的诱导用按照实施例1的(1)项介绍的方法分离和储藏的PBMC，按照实施例1的(2)项介绍的方法进行。在诱导过程中，将实施例8的(1)项制备的固定有FNfr的培养板用作培养设备(对照组用未经固定化处理的培养板)。诱导后CTL的细胞毒性活性按与实施例1的(3)项相同的方式进行评价。结果，不管在诱导过程中所用培养板是否固定有FNfr，细胞毒性活性几乎没有任何差别。
(3)CTL的扩增
实施例8的(2)项制备的CTL按与实施例3的(2)项相同的方式进行扩增。在扩增过程中，实施例8的(1)项制备的固定有FNfr的培养瓶用作培养设备(对照组用不经固定化处理的培养瓶)。此外，用10HycloneRPMI作为培养基。
扩增前的CTL中和扩增后获得的CTL中IL-2R表达阳性细胞的比率按与实施例2的(2)项相同的方式进行测定。
测定结果在表9显示。
表9
Figure G2009102171437D00471
如表9所示，在CTL的诱导和扩增过程中使用固定有纤连蛋白片段的培养设备(培养板、培养瓶)的组与对照组相比，在扩增前和扩增后都观察到CTL中IL-2R表达比率提高。换句话说，现清楚通过使用固定化纤连蛋白片段，CTL可被扩增并维持高IL-2R表达水平，结果与使用溶于培养基中的片段的结果相近。
实施例9  CD8细胞表面上白细胞介素受体表达的诱导
(1)抗流感病毒记忆CTL的诱导
抗流感病毒记忆CTL的诱导用按与实施例1的(1)项相同的方式分离和储藏的PBMC，按与实施例1的(2)项相同的方式进行。诱导开始后第十四天CTL的细胞毒性活性按与实施例1的(3)项相同的方式进行评价。结果，在诱导过程中添加或不添加FNfr得到的细胞毒性活性几乎没有任何差别。
(2)CTL中白细胞介素-2受体表达比率的测定
实施例9的(1)项制备的CTL(尤其是CD8细胞表面上)在诱导开始起第十四天的白细胞介素-2受体(IL-2R)表达比率按照实施例1的(4)项介绍的方法进行测定。在此，在本程序中，FITC标记的小鼠抗人CD8抗体用作第一抗体，PE标记的小鼠抗人IL-2R(CD25)抗体(DAKO生产)用作第二抗体。结果在表10显示。
表10
Figure G2009102171437D00481
如表10所示，在添加各种纤连蛋白片段诱导的CTL中，观察到CD8阳性细胞群体中IL-2R表达比率提高。换句话说，现清楚通过在纤连蛋白片段共存下进行诱导，CTL可被诱导且提高CD8细胞表面上的IL-2R表达水平。
实施例10  CTL扩增前后细胞群体中CD8阳性细胞的含量比率
(纤连蛋白与纤连蛋白片段的比较)
(1)抗流感病毒记忆CTL的诱导
抗流感病毒记忆CTL的诱导用按与实施例1的(1)项相同的方式分离和储藏的PBMC，按与实施例1的(2)项相同的方式进行。诱导开始后第十四天CTL的细胞毒性活性按与实施例1的(3)项相同的方式进行评价。结果，在诱导过程中添加或不添加纤连蛋白和FNfr得到的细胞毒性活性几乎没有任何差别。
(2)扩增的CTL中CD8阳性细胞含量比率的测定
按与实施例3的(2)项相同的方式扩增实施例10的(1)项中制备的CTL。按与实施例1的(4)项相同的方式测定扩增前的CTL中和扩增后获得的CTL中CD8阳性细胞的含量比率。结果在表11显示。
表11
Figure G2009102171437D00491
如表11所示，在CTL诱导和扩增过程中添加各种纤连蛋白片段的所有组与对照组相比，观察到扩增前和扩增后的细胞群体中CD8阳性细胞的含量比率提高。
换句话说，现清楚与只存在纤连蛋白本身的结果相比，通过在纤连蛋白片段存在下进行CTL诱导和扩增，CTL可有利地得以扩增，且扩增前和扩增后CD8阳性细胞都显著增殖。
实施例11  CTL扩增前后细胞群体中IL-2R表达的诱导
(纤连蛋白与纤连蛋白片段的比较)
(1)抗流感病毒记忆CTL的诱导
抗流感病毒记忆CTL的诱导用按与实施例1的(1)项相同的方式分离和储藏的PBMC，按与实施例1的(2)项相同的方式进行。诱导开始后第十四天CTL的细胞毒性活性按与实施例1的(3)项相同的方式进行评价。结果，在诱导过程中添加或不添加纤连蛋白和FNfr得到的细胞毒性活性几乎没有任何差别。
(2)扩增的CTL中IL-2R表达阳性细胞含量比率的测定
按与实施例3的(2)项相同的方式扩增实施例11的(1)项中制备的CTL。按与实施例2的(2)项相同的方式测定扩增前的CTL中和扩增后获得的CTL中IL-2R表达阳性细胞的含量比率。结果在表12显示。
表12
如表12所示，在CTL诱导和扩增过程中添加纤连蛋白片段的所有组与对照组相比，观察到扩增前和扩增后的细胞群体中IL-2R表达阳性细胞的含量比率提高。与添加纤连蛋白的组相比，此提高率显著地高。
换句话说，现清楚与只存在纤连蛋白本身的结果相比，通过在纤连蛋白片段存在下进行CTL诱导和扩增，CTL可有利地得以扩增，且扩增前和扩增后IL-2R表达阳性细胞都显著增殖。
实施例12  CTL的扩增(纤连蛋白与纤连蛋白片段的比较)
(1)抗流感病毒记忆CTL的诱导
抗流感病毒记忆CTL的诱导用按与实施例1的(1)项相同的方式分离和储藏的PBMC，按与实施例1的(2)项相同的方式进行。诱导开始后第十四天CTL的细胞毒性活性按与实施例1的(3)项相同的方式进行评价。结果，在诱导过程中添加或不添加纤连蛋白和FNfr得到的细胞毒性活性几乎没有任何差别。
(2)CTL的扩增
实施例12的(2)项制备的CTL按与实施例3的(2)项相同的方式进行扩增。此外，用10HycloneRPMI作为培养基。
这样扩增的CTL与扩增前相比维持其细胞毒性活性的程度以“细胞毒性活性维持率(％)”进行评价。
测定结果在表13显示。
表13
Figure G2009102171437D00511
如表13所示，在诱导和扩增过程中添加纤连蛋白片段的组与不添加纤连蛋白片段的对照组相比，其CTL即使在扩增14天后也维持着特异性的高细胞毒性活性。同时，与添加纤连蛋白的组相比，其活性显著地高。
换句话说，现清楚与只共存纤连蛋白本身的结果相比，通过在纤连蛋白片段共存下进行诱导和扩增，CTL可在高细胞毒性活性得以长时间维持的状态下进行有利的扩增。
实施例13  LAK细胞(淋巴因子激活的杀伤细胞)培养系统中扩增倍数 的测定
(1)抗人CD3抗体和FN或FN片段的固定化
将抗人CD3抗体和纤连蛋白或FN片段固定到用于以下实验的培养设备(容器)。具体而言，向24孔细胞培养板或12.5cm2细胞培养培养瓶(Falcon生产)中各加入1ml(24孔板的情况下)或2ml(12.5cm2培养瓶的情况下)含抗人CD3抗体(Jassen-Kyowa生产)(终浓度为5μg/ml)的PBS。在加入过程中，将纤连蛋白或制备实施例1中所列的各纤连蛋白片段(FNfr)加入到需添加纤连蛋白或FN片段的组中，使终浓度为10μg/ml(24孔板的情况下)或25μg/ml(12.5cm2培养瓶的情况下)。还留出不添加纤连蛋白和FNfr的组作为对照组。
这些培养设备在室温下孵化5小时后，将其在4℃下保存备用。使用前，从这些培养设备中吸去含抗体和FNfr的PBS。然后各孔用PBS洗涤两次，再用含5％人AB型血清(Bio Whittaker生产)和1％链霉素-青霉素(GIBCO BRL生产)的XVIVO20培养基(Bio Whittaker生产)(以下简称5HXVIVO20)洗涤一次。所述培养设备用于各个实验。
(2)LAK细胞的诱导和培养
将在实施例1的(1)项中制备的PBMC悬浮于5HXVIVO20，使细胞浓度为0.5-1×106细胞/ml，然后将所得悬浮液以1ml/孔的量加入到实施例13的(1)项制备的固定有抗人CD3抗体的培养板或固定有抗人CD3抗体和纤连蛋白或FNfr的培养板，再加入IL-2(Shionogi &Co.，Ltd生产)，使终浓度为1000U/ml。将这些培养板在5％CO2和37℃下培养(培养的第零天)。在培养开始起第二和第三天，以1ml/孔的量加入含1000U/ml IL-2的5HXVIVO20。在培养开始起第四天，将用5HXVIVO20适当稀释的培养基转移到不固定任何东西的新培养瓶中，加入IL-2，使终浓度为500U/ml。继续进行培养，按与培养开始起第五天相同的方式每隔1-2天用5HXVIVO20适当稀释培养基，加入IL-2，使终浓度为300-500U/ml。在培养开始起第七至第十五天，用台盼蓝染色法计算活细胞数量，通过将所得数量与培养开始时的细胞数量相比计算为扩增倍数。结果在表14表示。
表14
Figure G2009102171437D00531
如表14所示，在LAK细胞诱导的早期使用固定有各纤连蛋白片段的培养设备的组与对照组相比，其LAK细胞的扩增倍数高。此外，在培养开始起第十五天，固定有各纤连蛋白片段的组与使用固定有纤连蛋白的培养设备的组相比，其扩增倍数更高。因此，现清楚在进行长时间扩增的情况下，与使用纤连蛋白本身相比，通过在LAK细胞诱导的早期共存纤连蛋白片段，可适当地以更高的扩增倍数进行LAK细胞的诱导和扩增。
实施例14  LAK细胞培养系统中增殖比率的测定
(1)LAK细胞的诱导和培养
LAK细胞的诱导和培养按与实施例13的(2)项相同的方式进行。计算此阶段自培养开始起第四天至第七天的细胞增殖比率。结果在表15显示。
表15
Figure G2009102171437D00541
如表15所示，在LAK细胞诱导的早期使用固定有各纤连蛋白片段的培养设备的组与对照组相比，其自培养开始起第四天至第七天的LAK细胞增殖比率高。换句话说，现清楚通过在LAK细胞诱导的早期共存纤连蛋白片段，可以更快的扩增速率诱导和培养LAK细胞。
实施例15  LAK细胞培养系统中扩增倍数的测定(从低细胞数量诱导 和培养LAK细胞)
(1)LAK细胞的诱导和培养
LAK细胞的诱导和培养按与实施例13的(2)项相同的方式进行。在此阶段中，调整培养开始时的细胞浓度至2×105-1×106细胞/ml(1×105-5×105细胞/cm2)。在自培养开始起的第十五天，用台盼蓝染色法计算活细胞数量，通过与培养开始时的细胞数量比较计算扩增倍数。结果在表16显示。
表16
如表16所示，在LAK细胞诱导过程中使用固定有各纤连蛋白片段的培养设备的组，不管其培养开始时细胞数量如何，在自培养开始起的第十五天获得了高扩增倍数。相反，在对照组中，当培养开始时的细胞数量低时，自培养开始起的第十五天的扩增倍数也低。换句话说，现清楚不管培养开始时的细胞数量如何，通过在LAK细胞诱导过程中共存纤连蛋白片段，可以高的扩增倍数从低细胞数量出发诱导和培养LAK细胞。
实施例16  LAK细胞培养系统中扩增倍数的测定(从低细胞数量诱导 和培养LAK细胞/不用稀释程序的培养)
(1)LAK细胞的诱导和培养
将实施例1的(1)项制备的PBMC悬浮于5HXVIVO20，使细胞浓度为1×104细胞/ml，然后以1ml/孔的量将所得悬浮液加入到按与实施例13的(1)项相同的方式制备的固定有抗人CD3抗体的培养板或固定有抗人CD3抗体和纤连蛋白或FNfr的6孔培养板中。加入4毫升5HXVIVO20(1×103细胞/cm2)，再加入IL-2(Shionogi & Co.，Ltd.生产)，使终浓度为500U/ml。将这些培养板在5％CO2和37℃下培养(培养的第零天)。在培养开始起第二、第三和第四天，加入IL-2，使终浓度为500U/ml。继续进行培养，自培养开始起第七天及以后，每隔1-2天加入IL-2，使终浓度为500U/ml。在加入过程中，完全不进行培养基的稀释程序。
自培养开始起第十五天，用台盼蓝染色法计算活细胞数量，通过与培养开始时的细胞数量比较计算扩增倍数。结果在表17显示。
表17
Figure G2009102171437D00561
如表17所示，在从低细胞数量出发进行的LAK细胞诱导过程中使用固定有各纤连蛋白片段的培养设备的组，在诱导的整个过程中不需要进行细胞的稀释程序，在自培养开始起的第十五天也获得高扩增倍数。而且，即使与使用固定有纤连蛋白的培养设备的组相比，此扩增倍数也高。相反，在对照组中，就算在自培养开始起的第十五天，细胞也几乎不扩增。换句话说，现清楚通过在LAK细胞诱导过程中共存纤连蛋白或纤连蛋白片段(优选纤连蛋白片段)，完全不需要进行稀释程序，也可以高的扩增倍数从低细胞数量出发诱导和培养LAK细胞。
实施例17  LAK细胞中IL-2R表达的诱导
(1)LAK细胞的诱导和培养
LAK细胞的诱导和培养按与实施例13的(2)项相同的方式进行。
(2)LAK细胞中IL-2R表达比率的测定
在实施例17的(1)项中进行诱导和培养的LAK细胞中IL-2R表达的比率按实施例2的(2)项中介绍的方法进行测定。结果在表18显示。在该表中，IL-2R表达阳性细胞的含量比率(％)表示为IL-2R表达比率(％)。
表18
Figure G2009102171437D00571
如表18所示，在LAK细胞诱导的早期使用固定有各纤连蛋白片段的培养设备的组中，培养过程中在LAK细胞表面获得高IL-2R表达比率。而且，即使与使用固定有纤连蛋白的培养设备的组相比，此IL-2R表达比率也高。换句话说，现清楚与只共存纤连蛋白本身的结果相比，通过在LAK细胞诱导过程中共存纤连蛋白片段，LAK细胞可被诱导和培养，且IL-2R表达比率有利地更高。
实施例18  LAK细胞中IL-2R表达的诱导
(1)LAK细胞的诱导和培养
LAK细胞的诱导和培养按与实施例13的(2)项相同的方式进行。
(2)LAK细胞中IL-2R表达比率的测定
在实施例18的(1)项中诱导和培养的LAK细胞中的CD4细胞和CD8细胞，在第七天其表面上的IL-2R表达比率按实施例9的(2)项介绍的方法进行测定。在此，在本程序中，FITC标记的小鼠抗人CD4抗体或FITC标记的小鼠抗人CD8抗体用作第一抗体，PE标记的小鼠抗人IL-2R(CD25)抗体用作第二抗体。结果在表19显示。
表19
如表19所示，在LAK细胞诱导的早期使用固定有各纤连蛋白片段的培养设备的组中，培养过程中在LAK细胞(CD4阳性和CD8阳性细胞)表面可诱导高IL-2R表达比率。换句话说，现清楚通过在LAK细胞诱导过程中共存纤连蛋白片段，LAK细胞可被诱导和培养，且CD4阳性和CD8阳性细胞的表面上IL-2R表达比率高。
实施例19  LAK细胞群体中CD8阳性细胞的含量比率
(1)LAK细胞的诱导和培养
LAK细胞的诱导和培养按与实施例13的(2)项相同的方式进行。
(2)LAK细胞中CD8阳性细胞群体含量比率的测定
在实施例19的(1)项诱导和培养的LAK细胞中，第十五天CD8阳性细胞的含量比率按实施例1的(4)项介绍的方法进行测定。结果在表20显示。
表20
Figure G2009102171437D00591
如表20所示，在LAK细胞诱导的早期使用固定有各纤连蛋白片段的培养设备的组中，培养过程中在LAK细胞当中可诱导高含量比率的CD8阳性细胞。换句话说，现清楚通过在LAK细胞诱导过程中共存纤连蛋白片段，LAK细胞可被诱导和培养，且LAK细胞当中CD8阳性细胞的含量比率高。
实施例21  LAK细胞培养系统中扩增倍数的测定
(1)LAK细胞的诱导和培养
将实施例1的(1)项制备的PBMC悬浮于5HXVIVO20，使细胞浓度为0.5-1×106细胞/ml，然后以1ml/孔的量将所得悬浮液加入到实施例13的(1)项制备的固定有抗人CD3抗体的培养板或固定有抗人CD3抗体和FNfr的培养板中。加入IL-2(Shionogi & Co.，Ltd.生产)，使终浓度为1000U/ml。将这些培养板在5％CO2和37℃下培养(培养的第零天)。在培养开始起第二和第三天，以1ml/孔的量加入含1000U/mlIL-2的5HXVIVO20。在培养开始起第四天，将用5HXVIVO20适当稀释的培养基转移到不固定任何东西的新培养瓶中，加入IL-2，使终浓度为500U/ml。在培养开始起第八或第九天，将用5HXVIVO20适当稀释的培养基转移到按与实施例13的(1)项相同的方式制备的固定有抗人CD3抗体的培养瓶中，或固定有抗人CD3抗体和FNfr的培养瓶中(条件是固定化所用的抗人CD3抗体的浓度为0.5μg/ml)，加入IL-2，使其终浓度为500U/ml。在培养开始起第十一或第十二天，将用5HXVIVO20适当稀释的培养基转移到不固定任何东西的新培养瓶中，加入IL-2，使终浓度为500U/ml。在培养开始起第十五天，用台盼蓝染色法计算活细胞数量，通过与培养开始时的细胞数量比较计算扩增倍数。结果在表21和22显示。表中“供体”指PBMC供体。
表21
Figure G2009102171437D00601
表22
Figure G2009102171437D00611
如表21和22所示，在LAK细胞诱导的早期和中期使用反复固定各纤连蛋白片段和抗CD3抗体的培养设备的组，其与对照组相比LAK细胞的扩增倍数高。这些扩增比率远高于在LAK细胞诱导的早期和中期使用只反复固定抗CD3抗体的培养设备的组的扩增倍数。换句话说，现清楚通过在LAK细胞诱导的早期和中期用纤连蛋白片段和抗CD3抗体进行刺激，LAK细胞可以更高的扩增倍数进行诱导和培养。
实施例21  LAK细胞培养系统中扩增比率的测定
(1)LAK细胞的诱导和培养
LAK细胞的诱导和培养按与实施例20的(1)项相同的方式进行。计算此程序中自培养开始起第四天至第八天的细胞扩增比率和自培养开始起第十一天至第十五天的细胞增殖比率。结果在表23和24显示。
表23
Figure G2009102171437D00621
表24
Figure G2009102171437D00631
如表23和24所示，在LAK细胞诱导的早期和中期使用反复固定各纤连蛋白片段和抗CD3抗体的培养设备的组，其与对照组相比在诱导的稍后阶段LAK细胞的扩增比率高。这些扩增比率远高于在LAK细胞诱导的早期和中期使用只反复固定抗CD3抗体的培养设备的组在诱导的稍后阶段LAK细胞的扩增比率。换句话说，现清楚通过在LAK细胞诱导的早期和中期用纤连蛋白片段和抗CD3抗体进行刺激，LAK细胞可以更高的扩增比率进行诱导和培养。
实施例22  LAK细胞中IL-2R表达的诱导
(1)LAK细胞的诱导和培养
LAK细胞的诱导和培养按与实施例20的(1)项相同的方式进行。
(2)LAK细胞中IL-2R表达比率的测定
在实施例22的(1)项进行诱导和培养的LAK细胞，其第十五天的IL-2R表达比率按实施例2的(2)项介绍的方法进行测定。结果在表25和26显示。表中IL-2R表达阳性细胞的含量比率(％)表示为IL-2R表达比率(％)。
表25
Figure G2009102171437D00641
表26
Figure G2009102171437D00651
如表25和26所示，在LAK细胞诱导的早期和中期使用反复固定各纤连蛋白片段和抗CD3抗体的培养设备的组，其与对照组相比，在培养开始后第十五天LAK细胞表面上的IL-2表达比率高。这些IL-2R表达比率远高于在LAK细胞诱导的早期和中期使用只反复固定抗CD3抗体的培养设备的组的IL-2R表达比率。换句话说，现清楚通过在LAK细胞诱导的早期和中期用纤连蛋白片段进行刺激，LAK细胞可以更高的IL-2R表达比率进行诱导和培养。
实施例23  LAK细胞中CD8阳性细胞比率的测定
(1)LAK细胞的诱导和培养
LAK细胞的诱导和培养按与实施例20的(1)项相同的方式进行。
(2)LAK细胞群体中CD8阳性细胞含量比率的测定
在实施例23的(1)项进行诱导和培养的LAK细胞群体，其第十五天的CD8阳性细胞含量比率按实施例1的(4)项介绍的方法进行测定。结果在表27显示。
表27
Figure G2009102171437D00661
如表27所示，在LAK细胞诱导的早期和中期使用反复固定各纤连蛋白片段和抗CD3抗体的培养设备的组，其与对照组相比，在培养开始起第十五天LAK细胞群体中CD8阳性细胞的含量比率高。这些CD8阳性细胞的含量比率远高于在LAK细胞诱导的早期和中期使用只反复固定抗CD3抗体的培养设备的组的CD8阳性细胞的含量比率。换句话说，现清楚通过在LAK细胞诱导的早期和中期用纤连蛋白片段进行刺激，LAK细胞可以更高的CD8阳性细胞的含量比率进行诱导和培养。
序列表独立文本
SEQ ID NO：1；命名为III-8的纤连蛋白部分区域
SEQ ID NO：2；命名为III-9的纤连蛋白部分区域
SEQ ID NO：3；命名为III-10的纤连蛋白部分区域
SEQ ID NO：4；命名为III-12的纤连蛋白部分区域
SEQ ID NO：5；命名为III-13的纤连蛋白部分区域
SEQ ID NO：6；命名为III-14的纤连蛋白部分区域
SEQ ID NO：7；命名为CS-1的纤连蛋白部分区域
SEQ ID NO：8；命名为C-274的纤连蛋白片段
SEQ ID NO：9；命名为H-271的纤连蛋白片段
SEQ ID NO：10；命名为H-296的纤连蛋白片段
SEQ ID NO：11；命名为CH-271的纤连蛋白片段
SEQ ID NO：12；命名为CH-296的纤连蛋白片段
SEQ ID NO：13；命名为C-CS1的纤连蛋白部分片段
SEQ ID NO：14；命名为CHV-89的纤连蛋白片段
SEQ ID NO：15；命名为CHV-90的纤连蛋白片段
SEQ ID NO：16；命名为CHV-92的纤连蛋白片段
SEQ ID NO：17；命名为CHV-179的纤连蛋白片段
SEQ ID NO：18；命名为CHV-181的纤连蛋白片段
SEQ ID NO：19；命名为H-275-Cys的纤连蛋白片段
SEQ ID NO：20；引物12S
SEQ ID NO：21；引物14A
SEQ ID NO：22；引物Cys-A
SEQ ID NO：23；引物Cys-S
SEQ ID NO：24；基于衍自流感病毒的基质蛋白而设计的肽
工业适用性
根据本发明制备细胞毒性淋巳细胞的方法，获得其中高细胞毒性活性得以保持、IL-2R表达水平显著提高、CD阳性细胞的比率提高的细胞毒性淋巴细胞。所述淋巴细胞可合适地应用于例如过继免疫疗法中。因此，预计本发明方法将对医疗领域作出巨大的贡献。
序列表
<110>TAKARA BIO INC.
<120>制备细胞毒性活性淋巴细胞的方法
<130>03-021-CN-D
<150>JP 2002-84414
<151>2002-03-25
<160>24
<210>1
<211>87
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>称为III-8的纤连蛋白部分区域
<400>1
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg
  1               5                  10                  15
Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu
                 20                  25                  30
Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu
                 35                  40                  45
Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu
                 50                  55                  60
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln
                 65                  70                  75
His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr
                 80                  85
<210>2
<211>90
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>称为III-9的纤连蛋白部分区域
<400>2
Gly Leu Asp Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala
  1               5                  10                  15
Asn Ser Phe Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr
                 20                  25                  30
Gly Tyr Arg Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro
                 35                  40                  45
Arg Glu Asp Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr
                 50                  55                  60
Asn Leu Thr Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu
                 65                  70                  75
Asn Gly Arg Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr
                 80                  85                  90
<210>3
<211>94
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>称为III-10的纤连蛋白部分区域
<400>3
Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro
  1               5                  10                  15
Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg
                 20                  25                  30
Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val
                 35                  40                  45
Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser
                 50                  55                  60
Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val
                 65                  70                  75
Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile
                 80                  85                  90
Asn Tyr Arg Thr
<210>4
<211>92
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>称为III-12的纤连蛋白部分区域
<400>4
Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro
  1               5                  10                  15
Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr
                 20                  25                  30
Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met
                 35                  40                  45
Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser
                 50                  55                  60
Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu
                 65                  70                  75
Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln Gly Val ValThr Thr
                 80                  85                  90
Leu Glu
<210>5
<211>89
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>称为III-13的纤连蛋白部分区域
<400>5
Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu
  1               5                  10                  15
Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr
                 20                  25                  30
Gly Phe Gln Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile
                 35                  40                  45
Gln Arg Thr Ile Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly
                 50                  55                  60
Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn
                 65                  70                  75
Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser Thr
                 80                  85
<210>6
<211>90
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>称为III-14的纤连蛋白部分区域
<400>6
Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro
  1               5                  10                  15
Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr
                 20                  25                  30
Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu
                 35                  40                  45
Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr Ile Thr
                 50                  55                  60
Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala Leu
                 65                  70                  75
Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys Thr
                 80                  85                  90
<210>7
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>称为CS-1的纤连蛋白部分区域
<400>7
Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His
  1                5                 10                  15
Gly Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr
                 20                  25
<210>8
<211>274
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>称为C-274的纤连蛋白片段
<400>8
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg
  1               5                  10                  15
Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu
             20                  25                  30
Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu
                 35                  40                  45
Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu
                 50                  55                  60
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln
                 65                  70                  75
His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp
                 80                  85                  90
Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe
                 95                 100                 105
Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg
                110                 115                 120
Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp
                125                 130                 135
Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr
                140                 145                 150
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg
                155                 160                 165
Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp
                170                 175                 180
Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu
                185                 190                 195
Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg
                200                 205                 210
Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe
                215                 220                 225
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys
                230                 235                 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg
                245                 250                 255
Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg
                260                 265                 270
Thr Glu Ile Asp
<210>9
<211>271
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>称为H-271的纤连蛋白片段
<400>9
Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro
  1               5                  10                  15
Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr
                 20                  25                  30
Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met
                 35                  40                  45
Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser
                 50                  55                  60
Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu
                 65                  70                  75
Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr
                 80                  85                  90
Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala
                 95                 100                 105
Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr
                110                 115                 120
Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr
                125                 130                 135
Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile
                140                 145                 150
Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr
                155                 160                 165
Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser
                170                 175                 180
Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr
                185                 190                 195
Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile
                200                 205                 210
Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg
                215                 220                 225
Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr Ile
                230                 235                 240
Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala
                245                 250                 255
Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys
                260                 265                 270
Thr
<210>10
<211>296
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>称为H-296的纤连蛋白片段
<400>10
Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro
  1               5                  10                  15
Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr
                 20                  25                  30
Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met
                 35                  40                  45
Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser
                 50                  55                  60
Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu
                 65                  70                  75
Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr
                 80                  85                  90
Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala
                 95                 100                 105
Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr
                110                 115                 120
Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr
                125                 130                 135
Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile
                140                 145                 150
Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr
                155                 160                 165
Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser
                170                 175                 180
Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr
                185                 190                 195
Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile
                200                 205                 210
Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg
                215                 220                 225
Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr Ile
                230                 235                 240
Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala
                245                 250                 255
Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys
                260                 265                 270
Thr Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu
                275                 280                 285
His Gly Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr
                290                 295
<210>11
<211>549
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>称为CH-271的纤连蛋白片段
<400>11
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg
  1               5                  10                  15
Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu
                 20                  25                  30
Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu
                 35                  40                  45
Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu
                50                   55                  60
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln
                 65                  70                  75
His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp
                 80                  85                  90
Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe
                 95                 100                 105
Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg
                110                 115                 120
Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp
                125                 130                 135
Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr
                140                 145                 150
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg
                155                 160                 165
Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp
                170                 175                 180
Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu
                185                 190                 195
Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg
                200                 205                 210
Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe
                215                 220                 225
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys
                230                 235                 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg
                245                 250                 255
Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg
                260                 265                 270
Thr Glu Ile Asp Lys Pro Ser Met Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp
                275                 280                 285
Leu Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp
                290                 295                 300
Thr Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr
                305                 310                 315
Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro
                320                 325                 330
Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys
                335                 340                 345
Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg
                350                 355                 360
Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro
                365                 370                 375
Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile
                380                 385                 390
Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp
                395                 400                 405
Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys
                410                 415                 420
Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr
                425                 430                 435
Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser
                440                 445                 450
Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser
                455                 460                 465
Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser
                470                 475                 480
Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr
                485                 490                 495
Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg
                500                 505                 510
Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr
                515                 520                 525
Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser
                530                 535                 540
Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys Thr
                545
<210>12
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>称为CH-296的纤连蛋白片段
<400>12
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg
  1               5                  10                  15
Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu
                 20                  25                  30
Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu
                 35                  40                  45
Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu
                 50                  55                  60
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln
                 65                  70                  75
His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp
                 80                  85                  90
Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe
                 95                 100                 105
Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg
                110                 115                 120
Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp
                125                 130                 135
Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr
                140                 145                 150
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg
                155                 160                 165
Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp
                170                 175                 180
Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu
                185                 190                 195
Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg
                200                 205                 210
Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe
                215                 220                 225
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys
                230                 235                 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg
                245                 250                 255
Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg
                260                 265                 270
Thr Glu Ile Asp Lys Pro Ser Met Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp
                275                 280                 285
Leu Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp
                290                 295                 300
Thr Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr
                305                 310                 315
Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro
                320                 325                 330
Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys
                335                 340                 345
Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg
                350                 355                 360
Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro
                365                 370                 375
Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile
                380                 385                 390
Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp
                395                 400                 405
Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys
                410                 415                 420
Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr
                425                 430                 435
Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser
                440                 445                 450
Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser
                455                 460                 465
Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser
                470                 475                 480
Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr
                485                 490                 495
Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg
                500                 505                 510
Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr
                515                 520                 525
Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser
                530                 535                 540
Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys Thr Asp Glu Leu Pro Gln Leu
                545                 550                 555
Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly Pro Glu Ile Leu Asp
                560                 565                 570
Val Pro Ser Thr
<210>13
<211>302
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>称为C-CS1的纤连蛋白片段
<400>13
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg
  1               5                  10                  15
Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu
                 20                  25                  30
Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu
                 35                  40                  45
Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu
                 50                  55                  60
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln
                 6                  570                  75
His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp
                 80                  85                  90
Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe
                 95                 100                 105
Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg
                110                 115                 120
Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp
                125                 130                 135
Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr
                140                 145                 150
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg
                155                 160                 165
Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp
                170                 175                 180
Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu
                185                 190                 195
Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg
                200                 205                 210
Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe
                215                 220                 225
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys
                230                 235                 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg
                245                 250                 255
Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg
                260                 265                 270
Thr Glu Ile Asp Lys Pro Ser Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr
                275                 280                 285
Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro
                290                 295                 300
Ser Thr
<210>14
<211>367
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>称为CHV-89的纤连蛋白片段
<400>14
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg
  1               5                  10                  15
Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu
                 20                  25                  30
Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu
                 35                  40                  45
Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu
                 50                  55                  60
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln
                 65                  70                  75
His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp
                 80                  85                  90
Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe
                 95                 100                 105
Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg
                110                 115                 120
Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp
                125                 130                 135
Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr
                140                 145                 150
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg
                155                 160                 165
Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp
                170                 175                 180
Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu
                185                 190                 195
Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg
                200                 205                 210
Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe
                215                 220                 225
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys
                230                 235                 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg
                245                 250                 255
Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg
                260                 265                 270
Thr Glu Ile Asp Lys Pro Ser Met Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg
                275                 280                 285
Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp
                290                 295                 300
Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala Val
                305                 310                 315
Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys Pro Asp
                320                 325                 330
Val Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr
                335                 340                 345
Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro
                350                 355                 360
Val Val Ile Asp Ala Ser Thr
                365
<210>15
<211>368
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>称为CHV-90的纤连蛋白片段
<400>15
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg
  1               5                  10                  15
Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu
                 20                  25                  30
Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu
                 35                  40                  45
Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu
                 50                  55                  60
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln
                 65                  70                  75
His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp
                 80                  85                  90
Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe
                 95                 100                 105
Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg
                110                 115                 120
Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp
                125                 130                 135
Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr
                140                 145                 150
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg
                155                 160                 165
Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp
                170                 175                 180
Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu
                185                 190                 195
Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg
                200                 205                 210
Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe
                215                 220                 225
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys
                230                 235                 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg
                245                 250                 255
Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg
                260                 265                 270
Thr Glu Ile Asp Lys Pro Ser Met Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn
                275                 280                 285
Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp
                290                 295                 300
Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu
                305                 310                 315
Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro
                320                 325                 330
Gly Val Thr Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu
                335                 340                 345
Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu
                350                 355                 360
Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys Thr
                365
<210>16
<211>370
<212>PRT
<213>入工序列
<220>
<223>称为CHV-92的纤连蛋白片段
<400>16
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg
  1               5                  10                  15
Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu
                 20                  25                  30
Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu
                 35                  40                  45
Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu
                 50                  55                  60
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln
                 65                  70                  75
His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp
                 80                  85                  90
Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe
                 95                 100                 105
Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg
                110                 115                 120
Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp
                125                 130                 135
Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr
                140                 145                 150
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg
                155                 160                 165
Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp
                170                 175                 180
Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu
                185                 190                 195
Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg
                200                 205                 210
Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe
                215                 220                 225
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys
                230                 235                 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg
                245                 250                 255
Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg
                260                 265                 270
Thr Glu Ile Asp Lys Pro Ser Met Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp
                275                 280                 285
Leu Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp
                290                 295                 300
Thr Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr
                305                 310                 315
Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro
                320                 325                 330
Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys
                335                 340                 345
Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg
                350                 355                 360
Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr Leu Glu
                 365丂丂丂丂丂丂丂丂370
<210>17
<211>457
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>称为CHV-179的纤连蛋白片段
<400>17
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg
  1               5                  10                  15
Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu
                 20                  25                  30
Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu
                 35                  40                  45
Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu
                 50                  55                  60
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln
                 65                  70                  75
His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp
                 80                  85                  90
Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe
                 95                 100                 105
Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg
                110                 115                 120
Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp
                125                 130                 135
Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr
                140                 145                 150
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg
                155                 160                 165
Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp
                170                 175                 180
Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu
                185                 190                 195
Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg
                200                 205                 210
Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe
                215                 220                 225
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys
                230                 235                 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg
                245                 250                 255
Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg
                260                 265                 270
Thr Glu Ile Asp Lys Pro Ser Met Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg
                275                 280                 285
Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp
                290                 295                 300
Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala Val
                305                 310                 315
Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys Pro Asp
                320                 325                 330
Val Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr
                335                 340                 345
Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro
                350                 355                 360
Val Val Ile Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu
                365                 370                 375
Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val  Ser Trp Gln
                380                 385                 390
Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Lys
                395                 400                 405
Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly
                410                 415                 420
Val Thr Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr
                425                 430                 435
Thr Ile Tyr Val Ile Ala Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro
                440                 445                 450
Leu Ile Gly Arg Lys Lys Thr
                455
<210>18
<211>459
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>称为CHV-181的纤连蛋白片段
<400>18
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg
  1               5                  10                  15
Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu
                 20                  25                  30
Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu
                 35                  40                  45
Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu
                 50                  55                  60
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln
                 65                  70                  75
His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp
                 80                  85                  90
Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe
                 95                 100                 105
Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg
                110                 115                 120
Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp
                125                 130                 135
Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr
                140                 145                 150
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg
                155                 160                 165
Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp
                170                 175                 180
Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu
                185                 190                 195
Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg
                200                 205                 210
Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe
                215                 220                 225
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys
                230                 235                 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg
                245                 250                 255
Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg
                260                 265                 270
Thr Glu Ile Asp Lys Pro Ser Met Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp
                275                 280                 285
Leu Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp
                290                 295                 300
Thr Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr
                305                 310                 315
Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro
                320                 325                 330
Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys
                335                 340                 345
Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg
                350                 355                 360
Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro
                365                 370                 375
Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile
                380                 385                 390
Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp
                395                 400                 405
Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys
                410                 415                 420
Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr
                425                 430                 435
Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser
                4404                 45                 450
Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser Thr
                455
<210>19
<211>276
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>称为H-275-Cys的纤连蛋白片段
<400>19
Met Ala Ala Ser Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr
  1               5                  10                  15
Gln Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro Asn
                 20                  25                  30
Val Gln Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys
                 35                  40                  45
Thr Gly Pro Met Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser
                 50                  55                  60
Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser
                 65                  70                  75
Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln Gly
                 80                  85                  90
Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg
                 95                 100                 105
Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr
                110                 115                 120
Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala Val Pro Ala
                125                 130                 135
Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys Pro Asp Val Arg
                140                 145                 150
Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys Ile
                155                 160                 165
Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val
                170                 175                 180
Ile Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe
                185                 190                 195
Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro Pro
                200                 205                 210
Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Lys Pro Gly
                215                 220                 225
Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr
                230                 235                 240
Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile
                245                 250                 255
Tyr Val Ile Ala Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile
                260                 265                 270
Gly Arg Lys Lys Thr Cys
                275
<210>20
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物12S
<400>20
aaaccatggc agctagcgct attcctgcac caactgac            38
<210>21
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物14A
<400>21
aaaggatccc taactagtct ttttccttcc aatcag                  丂36
<210>22
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Cys-A
<400>22
aaaagcggcc gctagcgcaa gccatggtct gtttcctgtg                40
<210>23
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Cys-S
<400>23
aaaagcggcc gcactagtgc atagggatcc ggctgagcaa c              41
<210>24
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>根据来自流感病毒的基质蛋白设计的肽
<400>24
Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu
  1               5

Claims (15)

1.一种制备细胞毒性淋巴细胞的方法，所述方法的特征在于所述方法包括在重组纤连蛋白片段或其混合物存在下，进行细胞毒性淋巴细胞的诱导、维持、扩增至少之一的步骤，其中，所述重组纤连蛋白片段具有细胞黏附活性和/或肝素结合活性，且所述重组纤连蛋白片段为包含序列表中SEQ ID NO：1-11和13-19所示的氨基酸序列至少其中之一的多肽。
2.权利要求1的方法，其中与不存在纤连蛋白、其片段或其混合物下通过制备细胞毒性淋巴细胞的方法而获得的细胞毒性淋巴细胞相比，所述细胞毒性淋巴细胞高度表达白细胞介素-2受体。
3.权利要求1的方法，其中与不存在纤连蛋白、其片段或其混合物下通过制备细胞毒性淋巴细胞的方法而获得的细胞毒性淋巴细胞相比，所述细胞毒性淋巴细胞含有更高比率的CD8阳性细胞。
4.权利要求1-3之任一项的方法，其中与不存在纤连蛋白、其片段或其混合物下通过制备细胞毒性淋巴细胞的方法而获得的细胞毒性淋巴细胞相比，所述细胞毒性淋巴细胞高度保持细胞毒性活性。
5.权利要求1的方法，其中与不存在纤连蛋白、其片段或其混合物下制备细胞毒性淋巴细胞的方法相比，细胞毒性淋巴细胞的扩增倍数高。
6.权利要求1-5之任一项的方法，其中所述重组纤连蛋白片段或其混合物固定在固相上。
7.权利要求6的方法，其中所述固相为细胞培养设备或细胞培养载体。
8.权利要求7的方法，其中所述细胞培养设备为培养皿、培养瓶或培养袋，所述细胞培养载体为珠粒、薄膜或载玻片。
9.权利要求1-5之任一项的方法，其中细胞毒性淋巴细胞的诱导、维持、扩增至少之一在含有重组纤连蛋白片段或其混合物的培养基中进行。
10.权利要求1的方法，所述方法包括在包含培养基的细胞培养设备中，在重组纤连蛋白片段或其混合物存在下，进行细胞毒性淋巴细胞的诱导、维持和扩增至少之一，其中所述方法满足以下条件之任一项：
(a)培养初始时细胞数量与细胞培养设备的培养面积的比率为1细胞/cm2-5×105细胞/cm2；
(b)培养初始时培养基中的细胞浓度为1细胞/ml-5×105细胞/ml。
11.权利要求10的方法，其中所述方法没有稀释步骤或调换细胞培养设备的步骤。
12.通过权利要求1-11之任一项的方法获得的细胞毒性淋巴细胞。
13.一种药物，其包含作为有效成分的通过权利要求1-11之任一项的方法获得的细胞毒性淋巴细胞。
14.权利要求1-11之任一项的方法，所述方法进一步包括将外源基因转导入细胞毒性淋巴细胞的步骤。
15.权利要求14的方法，其中外源基因用逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒或猿猴病毒转导。
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