KR100715926B1 - 항원 특이적 세포 상해성 ｔ 세포 확대 배양 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 산성 다당, 산성 올리고당, 산성 단당 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 화합물을 유효성분으로 사용하는, 양자 면역 요법으로의 사용에 적합하고, 항원 특이적인 세포 상해 활성이 높은 수준으로 유지된 CTL (세포 상해성 T 세포) 을 유도, 유지 및 확대 배양하는 방법을 제공한다. 상기 화합물로는 푸코이단, 헤파린, 알긴산, 콘드로이틴 황산 A, 콘드로이틴 황산 B, 펙틴산, 히알루론산, 푸코이단 분해물, 황산화 글루코오스, 황산화 푸코오스 및 이들의 염으로 이루어지는 것을 들 수 있다.
Description
본 발명은 의료분야에 유용한, 항원 특이적인 세포 상해 활성을 갖는 세포 상해성 T 세포를 유도, 유지 및 확대 배양하는 방법에 관한 것이다.
생체는 주로 면역 응답에 의해 이물질로부터 보호되고 있으며, 면역 시스템은 각종 세포와 이것이 만들어내는 가용성 인자에 의해 성립하고 있다. 그 중에서도 중심적인 역할을 하는 것이 백혈구, 특히 림프구이다. 이 림프구는 B 림프구 (이하, B 세포) 와 T 림프구 (이하, T 세포) 라는 2 종류의 주요한 타입으로 분류되고, 모두 항원을 특이적으로 인식하며, 이것에 작용하여 생체를 방어한다.
T 세포는 CD (Cluster Designation) 4 마커를 가지며 주로 항체 생산의 보조나 각종 면역 응답의 유도에 관여하는 헬퍼 T 세포 (이하, TH), CD 8 마커를 갖고, 주로 세포 상해 활성을 나타내는 세포 상해성 T 세포 [Tc; 세포 상해성 T 림프구 (cytotoxic T lymphocyte), 킬러 T 세포라고도 함. 이하, CTL 이라고 기재하는 경우가 있다] 로 아분류된다. 종양세포나 바이러스 감염세포 등을 인식하여 파괴, 제거하는데 가장 중요한 역할을 하는 CTL 은 B 세포와 같이 항원에 대해 특이 적으로 반응하는 항체를 생산하는 것이 아니라, 표적세포막 표면 상에 존재하는 주요조직 적합 항원복합체 (MHC: 인간에 대해서는 인간 백혈구 항원 (HLA) 이라고도 한다) 클래스 I 분자에 회합된 표적세포 유래의 항원 (항원성 펩티드) 을 직접 인식하여 작용한다. 이 때, CTL 막 표면의 T 세포 리셉터 (이하, TCR 이라고 함) 가 전술한 항원성 펩티드 및 MHC 클래스 I 분자를 특이적으로 인식하여 항원성 펩티드가 자기 유래의 것인지, 또는 자기 유래의 것이 아닌지를 판단한다. 그리고, 자기 유래의 것이 아닌 것으로 판단된 표적세포는 CTL 에 의해 특이적으로 파괴, 제거된다.
최근, 약제 치료법이나 방사선 치료법과 같이 환자에게 심한 육체적 부담이 있는 치료법이 재검토되어 환자에게 육체적 부담이 적은 면역 치료법에 대한 관심이 고조되고 있다. 특히 면역기능이 정상인 인간 유래의 CTL 또는 T 세포로부터 목적으로 하는 항원에 대해 특이적으로 반응하는 CTL 을 생체외 (인 비트로: in vitro)에서 유도한 후, 환자에게 이입하는 양자 면역 치료법의 유효성이 주목받고 있다. 예컨대 동물모델을 이용한 양자 면역 요법이 바이러스 감염 및 종양에 대해 유효한 치료법임이 시사되어 있고 [Greenberg, P. D. 편저, Advances in Immunology, 1992 년 발행], 또한 면역 부전 환자에게 CTL 을 투여함으로써, 독성을 나타내지 않고, 급속하고 지속적으로 사이토메갈로 바이러스가 배제되는 특이적 CTL 응답의 재구축이 행해진 [Blood, 제 78 권, 제 1373∼1380 면 (1991)] 점 등에서, 선천성, 후천성 및 의원성에 의한 T 세포 면역 부전증 환자에 대한 사용도 주목받고 있다. 이 치료법에서는 CTL 의 항원 특이적 상해 활성을 유지하거나 증 강시킨 상태에서 그 세포수를 유지하거나 증가시키는 것이 중요하다.
또한 CTL 의 세포수의 유지 및 증가에 대해서는 동물모델에서의 연구로부터 인간의 양자 면역법에 유효한 세포수를 추측하면 109∼1010 개의 항원 특이적 T 세포가 필요로 되고 있다 [Greenberg, P. D. 편저, Advances in Immunology, 1992 년 발행]. 즉, 양자 면역법에서는 인 비트로에서 이러한 세포수를 단시간에 수득하는 것이 최대의 문제라고 할 수 있다.
CTL 의 항원 특이적 상해 활성의 유지 및 증강에 대해서는, CTL 의 항원에 특이한 응답을 유도할 때에, 목적으로 하는 항원을 사용한 자극을 반복하는 방법이 일반적이다. 그러나, 이 방법은 일시적으로는 세포수가 증가하는 경우도 있지만, 최종적으로는 세포수가 감소하여 필요로 하는 세포수를 수득할 수 없다. 이에 대한 대응책으로서는 항원에 의한 자극을 반복하는 초기단계에서 세포를 동결보존하거나, 클로닝을 수행하여 수득된 항원 특이적 CTL 클론의 일부를 동결보존한 후, 장기 배양에 의해 세포수나 항원 특이적 상해 활성이 저하되었을 때에, 동결된 세포를 융해시켜 다시 항원자극을 반복할 수밖에 없는 것이 현재의 상황이다.
마우스 T 세포를 이용하여 장기 배양에서 T 세포를 수립하는 방법 [Nature, 제 294 권, 제 697∼699 면 (1981)] 이 보고되어 있는데, 이는 T 세포를 단리ㆍ주화하는 방법이며, 이 방법으로 T 세포를 109∼1010 개의 세포까지 증식시키는 것은 불가능하다. 이어서, 미국특허 제5,057,423호에는 인터류킨 2 (IL-2) 을 고농도로 대량 사용하여 림포카인 활성화 킬러 (LAK) 세포를 유도하고, 3∼4 일 동안에 세포수를 100 배까지 증가시키는 방법이 개시되어 있다. 이는 통상 1 개의 세포가 분열하여 2 개로 증식되는 데 24 시간 걸리는 것을 감안하면 비약적인 세포수이다. 또한, 마찬가지로 고농도의 IL-2 를 이용하여 종양침윤 림프구 (TIL) 를 유도하여 양자 면역 요법을 시도하고 있다 (New Engl. J. Med.), 제 316 권, 제 1310∼1321 면 (1986); New Engl. J. Med., 제 319 권, 제 1676∼1680 면 (1988); Blood, 제 81 권, 제 2093∼2101 면 (1993)]. 그러나, 전자는 항원에 대해 비특이적인 T 세포의 취득법이며, 후자는 활성화되어 있는 폴리클로날 림프구 집단을 사용하기 때문에 특이성이 있다 하더라도 미미하다. 또한, 상기 방법에서는 모두 세포증식을 촉진하기 위해 고농도의 IL-2 를 사용하고 있고, 고농도의 IL-2로 처리된 T 세포가 IL-2 비존재하에서 특이적 항원자극을 받은 경우에 아포토시스 (apoptosis: 세포사) 를 일으킬 가능성이 있다는 보고 (Nature, 제 353 권, 제 858∼861 면 (1991)); Eur. J. Immunol., 제 23 권, 제 1552∼1560 면 (1992)] 로부터, 상기 방법으로 수득된 LAK 세포나 TIL 의 유효성에는 문제가 있다.
또한, T 세포를 T 세포 증식인자와 IL-2 존재하에서 저밀도 (5 ×103∼ 1 ×104 개/㎖) 로 배양하면 7 일간에 걸쳐 급속하게 증식되고, 최종적으로는 세포수가 3∼5 ×105 개/㎖ 라는 포화밀도까지 증식한다. 그러나, 일단 이 포화밀도에 도달하면 세포가 항상 죽어버린다는 보고도 있다. [Immunological Rev. 제 54 권, 제 81∼109 면 (1981)]. 따라서, LAK 세포, TIL 및 저밀도에 의한 T 세포 배양 방법은 실용면에서나 유용면에서도 문제가 있다.
이어서, 항원 특이적인 CTL 에 관해서는 동계(同系) 이종 유래의 사이토메갈로 바이러스 (CMV) 특이적 CTL 을 인 비트로에서 5∼12 주간 배양하여 CTL 을 증식시킨 후, 면역 부전 환자에게 정맥내 투여하는 양자 면역 요법 (Riddell 등, Science, 257: 238∼240, 1992), 자가 CMV 감염 선유아세포와 IL-2 [저널 오브 이뮤놀로지 (J. Immunology, 제 146 권, 제 2795∼2804 면 (1991)] 및 항 CD3 모노클로날 항체 (항 CD3mAb) 와 IL-2 [J. Imm. Methods, 제 128 권, 제 189∼201 면 (1990)] 를 이용하여 CMV 특이적 CTL 클론을 단리 및 대량 배양하는 방법이 보고되어 있다. 그러나, 이들 방법에는 큰 문제점이 존재한다. 즉, 1 × 109 개/㎖ 의 항원 특이적 CTL 을 수득하는데 약 3 개월을 필요로 하여 그 동안에 환자의 증상이 진행되어 버리기 때문에 상황에 따른 대응을 취하기 어렵다.
이같은 문제점을 해결하는 방법으로서 국제공개 제96/06929호 팜플렛에는 REM 법 (rapid expansion method) 이 개시되어 있다. 이 REM 법은 항원 특이적 CTL 및 TH 를 포함하는 T 세포의 초기집단을 단시간에 증식 (expand) 시키는 방법이다. 즉 개개의 T 세포 클론을 증식시켜 대량의 T 세포를 제공할 수 있는 점이 특징이지만, 다음과 같은 문제점이 있다. REM 법에서는 항 CD3 항체, IL-2, 및 방사선 조사에 의해 증식성을 없앤 PBMC (말초혈 단핵세포) 와 엡스타인 바 바이러스 (EBV) 감염세포를 이용하여 항원 특이적 CTL 수를 증식시키고 있는데, T 세포로의 EBV 트랜스폼 B 세포 (EBV-B 세포) 의 혼입 위험성이 부정되는 점 (안전성 문제), 피더(feeder) 세포로서 대량의 PBMC (필요로 하는 항원 특이적 CTL 수의 약 40 배 이상의 PBMC) 가 필요한 점, 증식된 CTL 의 항원 특이적 세포 상해 활성이 충분히 만족할 수 있는 것이 아닌 점, T 세포 클론 이외의 T 세포집단을 이용하여 증식시킨 경우, T 세포가 갖는 항원 특이적인 상해 활성이 세포의 증식과 함께 저하되는 점 등의 문제가 있다.
즉, 종래의 항원 특이적 CTL 제조법에서는 치료로의 사용에 유효한 항원 특이적인 세포 상해 활성을 갖는 CTL 을 단기간에 또한 충분한 양을 제조한다는 양자 면역법에 필요불가결한 문제가 아직 해결되어 있지 않은 것이 현재의 상황이다.
본 발명의 목적은 양자 면역 요법으로의 사용에 적합한, 항원 특이적인 세포 상해 활성이 높은 수준으로 유지된 CTL 을 유도, 유지 및 확대 배양하는 방법을 제공하는 데 있다.
발명의 개시
즉, 본 발명은
[1] 항원 특이적인 세포 상해 활성을 갖는 세포 상해성 T 세포를 유도하기 위한 방법으로서, 산성 다당, 산성 올리고당, 산성 단당 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 화합물의 존재하에 세포 상해성 T 세포로의 분화능을 갖는 전구세포를 항원 제시세포와 인큐베이트하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
[2] 화합물이 푸코이단, 헤파린, 알긴산, 콘드로이틴 황산 A, 콘드로이틴 황산 B, 펙틴산, 히알루론산, 푸코이단 분해물, 황산화 글루코오스, 황산화 푸코오스 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상의 화합물인 상기 [1] 기재의 방법,
[3] 항원 특이적인 세포 상해 활성을 갖는 세포 상해성 T 세포를 유지하기 위한 방법으로서, 산성 다당, 산성 올리고당, 산성 단당 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상의 화합물의 존재하에 세포 상해성 T 세포를 지속 배양하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법,
[4] 화합물이 푸코이단, 헤파린, 알긴산, 콘드로이틴 황산 A, 콘드로이틴 황산 B, 펙틴산, 히알루론산, 푸코이단 분해물, 황산화 글루코오스, 황산화 푸코오스 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상의 화합물인 상기 [3] 기재의 방법,
[5] 항원 특이적인 세포 상해 활성을 갖는 세포 상해성 T 세포를 확대 배양하는 방법으로서, 산성 다당, 산성 올리고당, 산성 단당 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상의 화합물의 존재하에 세포 상해성 T 세포를 인큐베이트하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법,
[6] 상기 공정에서, 추가로 항 CD3 항체의 존재하에 세포 상해성 T 세포를 인큐베이트하는 상기 [5] 기재의 방법,
[7] 상기 공정에서, 세포 상해성 T 세포를 피더 세포와 함께 인큐베이트하는 상기 [5] 또는 [6] 기재의 방법,
[8] 피더 세포가 비바이러스 감염세포인 상기 [7] 기재의 방법,
[9] 화합물이 푸코이단, 헤파린, 알긴산, 콘드로이틴 황산 A, 콘드로이틴 황산 B, 펙틴산, 히알루론산, 푸코이단 분해물, 황산화 글루코오스, 황산화 푸코오스 및 이 들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상의 화합물인 상기 [5] 내지 [8] 중 어느 하나에 기재된 방법,
[10] 상기 [1] 내지 [9] 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 수득된 세포 상해성 T 세포 함유 배양물로부터 항원 특이적인 세포 상해 활성을 갖는 세포 상해성 T 세포를 고함유하는 세포집단을 선택하는 공정을 포함하는 세포 상해성 T 세포의 회수 방법,
[11] 상기 [1] 내지 [10] 중 어느 하나에 기재된 방법으로 제조된 항원 특이적인 세포 상해 활성을 갖는 세포 상해성 T 세포, 및
[12] 상기 [11] 에 기재된 세포 상해성 T 세포를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 치료제에 관한 것이다.
도 1 은 개다시마 유래의 푸코이단의 DEAE-셀룰로파인 A-800 컬럼 용출 패턴을 나타내는 도면이다.
본 발명은 산선 다당, 산성 올리고당, 산성 단당 및 이들 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상의 화합물에 의해, 의외로 CTL 의 항원 특이적인 세포 상해 활성의 유지 또는 증강능 (이하, 작용이라고 하는 경우가 있다) 이 발휘되는 것을 발견하여 완성시키기에 이른 것이다. 본 발명에 의해, 상기 화합물을 유효성분으로 사용하는 양자 면역 요법에서의 사용에 적합하고, 항원 특이적인 세포 상해 활성이 높은 수준으로 유지된 CTL 을 유도, 유지 및 확대 배양하는 방법이 제 공된다. 또 본 발명의 유효성분으로 사용되는 화합물에 D 체와 L 체의 구별이 있는 경우, 양자 모두 사용가능하지만, L 체의 사용이 적합하다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
(1) 본 발명의 세포 상해성 T 세포의 유도방법
통상, 항원 제시세포에 의해 유도된 CTL 은 유지, 증식시키는 동안에 그 항원 특이적인 세포 상해 활성이 저하되어 가는 것으로 알려져 있다. 본 발명에 의해, 유도 후의 세포를 장기간에 걸쳐 유지 또는 증식시켜도 종래 관찰된 바와 같은 항원 특이적인 세포 상해 활성이 현저하게 저하되지 않는 항원 특이적인 CTL 의 유도방법이 제공된다.
본 발명의 CTL 의 유도방법은 상기 유효성분의 존재하에 CTL 을 유도하는 것을 하나의 큰 특징으로 한다. CTL 의 유도는 당해 유효성분의 존재하, 수득되는 CTL 에 원하는 항원에 대한 인식능력을 부여하기 위해 적절한 항원 제시세포와 함께 CTL 로의 분화능을 갖는 전구세포를 인큐베이트함으로써 실시된다. 전구세포는 CTL 이 되는 전단계에서, 더욱이 CTL 로 분화되도록 운명지어진 세포라면 특별히 한정되는 것은 아니며, 예컨대 말초혈 단핵구 (PBMC), 나이브 T 세포, 메모리 T 세포 등을 들 수 있다. 항원 제시세포는 T 세포에 대해 인식해야 할 항원을 제시하는 능력을 갖는 세포라면 특별히 한정되지 않는다. 예컨대 단구, B 세포, T 세포, 마크로파지, 수상세포, 선유아세포 등에 원하는 항원을 제시시켜 본 발명을 사용할 수 있다.
항원 제시세포는 항원 제시능을 갖는 세포에 항원 펩티드를 부가하고, 그 표 면에 항원 펩티드를 제시시킴으로써 제조할 수 있다 [예컨대, 문헌: Bednarek M. A. 등, J. Immunology 147 p4047-4053 (1991) 을 참조]. 또한, 항원 제시능을 갖는 세포가 항원을 처리 (process) 하는 능력을 갖고 있는 경우에는 당해 세포에 항원을 부가함으로써, 항원이 세포내에 도입되어 프로세싱되고, 단편화된 항원 펩티드가 세포 표면에 제시된다. 또 항원 펩티드를 항원 제시능을 갖는 세포에 부가하는 경우, 사용되는 항원 제시세포, 유도하고자 하는 CTL 의 HLA 구속성에 합치하는 항원 펩티드가 사용된다.
또한 본 발명에서 사용되는 항원은 특별히 한정되는 것은 아니며, 예컨대 세균, 바이러스 등의 외래성 항원이나 종양 관련 항원 (암 항원) 등의 내재성 항원 등을 들 수 있다.
본 발명에서는 항원 제시세포는 비증식성으로 하는 것이 바람직하다. 세포를 비증식성으로 하기 위해서는 예컨대 X 선 등의 방사선 조사 또는 마이토마이신 (mitomycin) 등의 약제에 의한 처리를 행하면 된다.
본 발명의 CTL 의 유도방법에서 사용되는 배지에는 특별한 한정은 없으며, CTL, 그 전구세포, 및 항원 제시세포의 유지, 생육에 필요한 성분을 혼합하여 제작된 공지된 배지를 사용할 수 있고, 예컨대 시판중인 배지여도 된다. 이들 배지는 그 본래의 구성성분 이외에 적당한 단백질, 사이토카인류, 그 밖의 성분을 함유해도 된다. 바람직하게는 인터류킨-2 (IL-2) 를 함유하는 배지가 본 발명에 사용된다.
본 발명의 유효성분으로서 사용되는 산성 다당으로는 동물 유래, 식물 유래, 미생물 유래, 조류 (藻類) 유래 및 합성 산성 다당 중 어느 것이나 사용할 수 있다. 또한 인산화 다당류, 예컨대 핵산도 본원 발명의 산성 다당에 포함된다.
동물 유래의 산성 다당으로는 예컨대 히알루론산이나 각종 황산화 다당을 사용할 수 있고, 황산화 다당으로는 콘드로이틴 황산, 케라탄 황산, 데르마탄 황산, 헤파란 황산, 헤파린 등을 사용할 수 있다. 또한, 해삼, 성게, 불가사리 등의 극피동물 유래의 황산화 다당, 상어연골 등의 어류 유래의 황산화 다당도 본 발명에 사용할 수 있다. 황산화 다당을 함유하는 해삼으로는 예컨대 일본 공개특허공보 평4-91027호에 기재된 해삼이 있으며, 당해 공보에 기재된 방법으로 해삼으로부터 황산화 다당을 제조할 수 있다.
식물 유래의 산성 다당으로는 예컨대 펩틴산 등을 사용할 수 있다.
미생물 유래의 산성 다당으로는 예컨대 히알루론산이나 잔탄을 사용할 수 있다.
조류 유래의 산성 다당으로는 갈조류, 홍조류, 녹조류, 남조류 유래의 산성 다당을 사용할 수 있다.
갈조류 유래의 산성 다당으로는 예컨대 각종 황산화 다당을 사용할 수 있고, 예컨대 푸코이단, 황산화 푸코갈락탄, 황산화 푸코글루쿠로노만난, 글루쿠로녹시로프칸, 사르갓산, 글루쿠로노만노갈락탄, 크실로푸코글루쿠로난, 아스코피란, 글루쿠로노갈락토프칸, 황산화 글루쿠로노프칸 등을 사용할 수 있다.
또한, 원료가 되는 갈조류로는 예컨대 개다시마 (Kjellmaniella crassifolia), 참다시마 (laminaria japonica), 토로로 다시마 (Kjellmaniella gyrata), 모자반 (Fucus), 큰실말, 오끼나와 큰실말, 미역 (Undaria pinnatifida), 쿠로메 (Ecklonia
kurome), 대황 (Eisenia bicyclis), 감태 (Ecklonia cava), 레소니아 니그레센스 (Lessonia nigrescens), 아스코필럼 노도섬 (Ascophyllum nodosum), 자이언트 켈프 (giant kelp) 등의 다시마목 (Laminariales), 민가지말목, 모자반목의 갈조를 들 수 있다.
갈조류 유래의 황산화 다당으로는 예컨대 개다시마로부터 푸코이단을 제조하고, 이 푸코이단을 글루쿠론산 함유 푸코이단 (U-푸코이단이라고 함) 과 글루쿠론산 비함유 푸코이단 (F-푸코이단이라고 함) 으로 분류할 수 있고, 본 발명의 유효성분으로서 각각의 푸코이단을 사용할 수 있다. 또한 개다시마로부터 황산화 푸코갈락탄 (이하, G-푸코이단이라고 함) 을 제조하여 본 발명에 사용할 수 있다.
U-푸코이단 및 F-푸코이단은 개다시마로부터 푸코이단을 제조후, 음이온 교환수지, 계면활성제 등을 이용하여 분리된다. 개다시마 유래의 U-푸코이단 및 F-푸코이단의 존재비는 약 1 : 2 이며, U-푸코이단은 푸코오스, 만노오스, 갈락토오스, 글루쿠론산 등을 함유하고 황산 함량은 약 20%, F-푸코이단은 푸코오스와 갈락토오스를 함유하고, 황산 함량은 약 50% 이고, 분자량은 양 물질 모두 약 20만을 중심으로 분포되어 있다 (제 18 회 당질 심포지움 요지집, 제 159 면, 1996년).
예컨대 개다시마로 제조한 푸코이단 용액을 DEAE-셀룰로파인 A-800 컬럼에 적용한 후, NaCl 함유 완충액으로 농도구배법에 의해 용출시킴으로써, U-푸코이단과 F-푸코이단으로 분리할 수 있다. 도 1 에 그 일례를 나타낸다. 즉, 도 1 은 U-푸코이단과 F-푸코이단의 분리를 나타내는 도면으로, 도면에서 전피크가 U- 푸코이단, 후피크가 F-푸코이단이다.
홍조류 유래의 산성 다당으로는 예컨대 황산화 갈락탄, 카라기난, 푸노란, 아갈로펙틴 등을 사용할 수 있다. 또한 홍조류 유래의 한천류, 아갈로오스에 대해서도 본 발명에 사용할 수 있다.
또한 홍조류로는 예컨대 마구사 (gelidium elegans kuetzing) , 우뭇가사리, 프테로크라디아 카필라세아 (Pterocladiella capillacea) 등을 들 수 있다.
녹조류 유래의 산성 다당으로는 예컨대 람난 황산을 사용할 수 있다. 녹조류로는 예컨대 석순, 파래, 삿갓말, 클로렐라 등을 들 수 있다. 또한 스피루리나 등의 남조류로부터 수득되는 산성 다당도 본 발명에 사용할 수 있다.
본 발명에서는 알긴산, 펙틱산, 히알루론산 등을 그대로 본 발명의 유효성분인 산성 다당으로서 사용할 수 있지만, 나아가 이것들에 대해 예컨대 황산기를 부가한 합성 산성 다당도 사용할 수 있다. 당해 합성 산성 다당으로는 예컨대 합성 황산화 다당을 들 수 있고, 셀룰로스, 전분, 만난, 크실란, 알긴산, 펙틴, 펙틴산, 히알루론산, 푸라쿠탄, 아라비난, 키틴, 풀루란, 크실로글루칸, 덱스트란, 스타치 등의 황산화물을 사용할 수 있다. 또한 예컨대 리보플라난 황산, 크실로프라난 황산, 렌티난 황산, 카드란 황산, 만노피라난 황산, 황산화 스타치, 황산화 펙틴 등의 합성 황산화 다당이나 팔미토일기를 갖는 리보플라난 황산 등의 합성 황산화 알킬 다당을 사용할 수 있다. 또한 황산화 다당을 더욱 황산화함으로써, 고황산화 황산화 다당을 제조하고, 합성 산성 다당으로서 본 발명에 사용할 수 있다. 이들 합성 산성 다당은 각각 공지된 방법으로 제조하여 본 발명에 사용할 수 있다. 또한 시판중인 덱스트란 황산, 황산화 셀룰로스도 본 발명에 사용할 수 있다. 또한 이들 합성 산성 다당의 염을 본 발명에 사용해도 된다.
이들 산성 다당의 제조는 각각 공지된 방법으로 제조하면 되고, 정제물 또는 당해 산성 다당 함유물 등을 본 발명에 사용할 수 있다. 산성 다당 함유물로는 예컨대 조류 유래 산성 다당 분획을 바람직하게 사용할 수 있고, 조류로는 전술한 조류를 원료로서 바람직하게 사용할 수 있다.
또한, 이들 산성 다당을 분해하여 수득되는 저분자화 산성 다당도 세포 상해성 T 세포의 항원 특이적인 세포 상해 활성의 유지 또는 증강능을 갖고 있으며, 본 발명의 산성 다당으로서 사용할 수 있다.
이어서 본 발명에서 사용할 수 있는 산성 올리고당, 산성 단당으로는 세포 상해성 T 세포의 항원 특이적인 세포 상해 활성의 유지 또는 증강능을 갖는 산성 올리고당, 산성 단당이면 되고, 특별한 한정은 없으나, 전술한 산성 다당의 분해물, 합성 산성 올리고당 및 합성 산성 단당을 사용할 수 있다. 또한 산성 올리고당, 산성 단당으로는 예컨대 황산화 올리고당 및 황산화 단당이 예시된다. 이들 황산화 올리당, 황산화 단당은 각각 대응하는 올리고당, 단당을 원료로 하여 각각 공지된 방법으로 황산화하여 제조할 수 있다. 또한, 이들의 염도 바람직하게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명에서 산성 단당으로는 예컨대 황산화 푸코오스, 황산화 글루코오스, 황산화 갈락토오스, 황산화 자일로스, 황산화 2-데옥시-글루코오스, 황산화 만노오스, 황산화 탈로오스 등의 황산화 단당이 예시된다. 이들 황산화 단당은 합성법으로 합성해도 되고, 또한 천연물에서 수득된 황산화 다 당을 분해하고, 당해 분해물로부터 정제하여 제조해도 된다. 또한 통상적인 방법에 따라 그 염을 제조하여 본 발명에 사용할 수도 있다. 또한 전술한 황산화 다당과 마찬가지로, 이들 황산화 올리고당 및 황산화 단당을 더욱 황산화함으로써, 고황산화 황산화 올리고당 및 고황산화 황산화 단당을 사용할 수 있다. 또 본 발명에서 올리고당이란 단당이 2 개 내지 10 개의 범위에서 이어진 당 화합물, 다당이란 단당이 11 개 이상 이어진 당 화합물로 정의한다.
또한 본 발명의 세포 상해성 T 세포의 항원 특이적인 세포 상해 활성의 유지 또는 증강능을 갖는 산성 다당의 분해물은 효소학적 방법, 화학적 방법, 물리적 방법 등의 공지된 방법으로 제조하고, 세포 상해성 T 세포의 특이적인 세포 상해 활성의 유지 또는 증강능을 갖는 분해물을 선택하여 사용할 수 있다.
또 분해물이란 분해대상으로 하는 산성 다당에 따라 달라지기도 하지만, 산성 다당을 분해하여 수득되는, 대략 분자량이 바람직하게는 10 만∼200, 보다 바람직하게는 3 만∼1000 범위인 것을 말한다.
본 발명에서 사용하는 산성 다당 분해물의 적합한 제조방법으로는 산분해법이 있으며, 당해 산성 다당을 산분해함으로써 세포 상해성 T 세포의 특이적인 세포 상해 활성의 유지 또는 증강능을 갖는 분해물을 제조할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 산성 다당의 산분해조건은 세포 상해성 T 세포의 특이적인 세포 상해 활성의 유지 또는 증강능을 갖는 분해물 (이하, 본 발명의 분해물이라고 함) 이 생성되는 조건이면 특별히 한정되지 않는다.
예컨대 산성 다당을 산 수용액 등에 용해 또는 현탁시켜 산 분해반응을 수행 함으로써 본 발명의 분해물이 생성된다. 또한 반응시에 가열함으로써, 본 발명의 분해물 생성에 필요한 시간이 단축된다.
산성 다당이 용해 또는 현탁되는 산의 종류는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 염산, 황산, 질산 등의 무기산, 시트르산, 포름산, 아세트산, 락트산, 아스코르브산 등의 유기산, 또한 양이온 교환수지, 양이온 교환섬유, 양이온 교환막 등의 고체산을 사용할 수 있다.
산의 농도도 특별히 한정되지는 않지만, 바람직하게는 0.0001∼5 N, 보다 바람직하게는 0.01∼1 N 정도의 농도로 사용할 수 있다. 또한, 반응온도도 특별히 한정되지는 않지만 바람직하게는 0∼200℃, 보다 바람직하게는 20∼130℃ 로 설정하면 된다.
또한, 반응시간도 특별히 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 수초∼수일로 설정하면 된다. 산의 종류와 농도, 반응온도 및 반응시간은 본 발명에 사용하는 분해물의 생성량, 분해물의 중합도에 따라 적절히 선택하면 된다. 예컨대 푸코이단의 분해물의 제조시에는 시트르산, 락트산, 말산 등의 유기산을 사용하고, 산의 농도는 수 10mM∼수 M, 가열온도는 50∼110℃, 바람직하게는 70∼95℃, 가열시간은 수분∼24 시간의 범위에서 적절히 선택함으로써, 본 발명의 분해물을 제조할 수 있다. 푸코이단의 산 분해물로는 개다시마 유래 푸코이단의 산 분해물이 예시된다.
본 발명의 분해물을 세포 상해성 T 세포의 특이적인 세포 상해 활성의 유지 또는 증강작용을 지표로 하여 더욱 분획할 수 있고, 예컨대 산 분해물을 겔여과법, 분자량 분획막에 의한 분획법 등에 의해 분자량 분획할 수 있다.
겔여과법의 예로는 셀룰로파인 GCL-300 을 사용하여, 예컨대 분자량 25000 초과, 분자량 25000∼10000 초과, 분자량 10000∼5000 초과, 분자량 5000 이하 등의 임의의 분자량 분획을 제조할 수 있고, 셀룰로파인 GCL-25 를 사용하여 예컨대 분자량 5000 이하의 분획을 분자량 5000∼3000 초과, 분자량 3000∼2000 초과, 분자량 2000∼1000 초과, 분자량 1000∼500 초과, 분자량 500 이하 등의 임의의 분자량 분획으로 제조할 수 있다.
또한 한외여과막을 사용하여 공업적으로 분자량 분획을 수행할 수 있고, 예컨대 다이셀사 제조 FE10-FUSO382 를 사용함으로써 분자량 30000 이하의 분획을 제조할 수 있고, 동일한 회사의 FE-FUS-T653 을 사용함으로써 분자량 6000 이하의 분획을 제조할 수 있다. 또한 나노필터막을 사용함으로써 분자량 500 이하의 분획을 수득할 수 있고, 이러한 겔여과법, 분자량 분획법을 조합함으로써 임의의 분자량 분획을 제조할 수 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 산성 다당의 분해물, 예컨대 푸코이단의 분해물로는 화학식 I로 표시되는 화합물, 화학식 II로 표시되는 화합물, 화학식 III으로 표시되는 화합물을 예시할 수 있고, 이들 화합물은 국제공개 제99/41288호 팜플렛, 국제공개 제96/34004호 팜플렛, 국제공개 제00/50464호 팜플렛에 기재된 방법으로 제조할 수 있다. 또 화학식 I로 표시되는 화합물을 기본골격으로 하고, 그 반복구조를 갖는 푸코이단 및 올리고당, 화학식 II로 표시되는 화합물을 기본골격으로 하고, 그 반복구조를 갖는 푸코이단 및 올리고당, 또한 화학식 III으로 표시되 는 화합물을 기본골격으로 하고, 그 반복구조를 갖는 푸코이단 및 올리고당도 각각 본 발명의 산성 다당 및 산성 올리고당으로 사용할 수 있다. 또한 본 발명의 산성 다당의 분해물로는 예컨대 푸코이단의 분해물로서 국제공개 제99/41288호 팜플렛, 국제공개 제96/34004호 팜플렛, 국제공개 제00/50464호 팜플렛에 기재된 푸코이단의 분해물을 예시할 수 있다.
(상기 식에서, R 은 OH 또는 OSO3H 이다.)
(상기 식에서, R 은 OH 또는 OSO3H 이다.)
(상기 식에서, R 은 OH 또는 OSO3H 이다.)
화학식 I로 표시되는 화합물은 상기 언급된 F-푸코이단을 알테로모나스 종 SN-1009 (FERM BP-5747) 가 생산하는 엔도형 황산화 다당 분해효소 (F-푸코이단 특이적 분해효소) 로 처리하고, 그의 분해물로부터 정제함으로써 수득할 수 있다. 당해 화합물 중의 황산기의 함량, 부위에 대해서는 그의 분해물 중으로부터 임의의 것을 정제할 수 있다. 또 당해 분해물 중에는 화학식 I로 표시되는 화합물의 다량체도 함유되어 있고, 목적에 따라 분리, 정제할 수 있다.
화학식 II로 표시되는 화합물은 이미 언급한 U-푸코이단을, 플라보박테리움 종 SA-0082 (FERM BP-5402) 가 생산하는 엔도형 황산화 다당 분해효소 (U-푸코이단 분해효소) 로 처리하고, 이의 분해물로부터 정제함으로써 수득할 수 있다. 당해 화합물 중의 황산기의 함량, 부위에 대해서는 그의 분해물 중으로부터 임의의 것을 정제할 수 있다. 또 당해 분해물 중에는 화학식 II로 표시되는 화합물을 기본골격으로 하는, 이의 다량체도 함유되어 있고, 목적에 따라 분리, 정제할 수 있다.
또한, 화학식 I로 표시되는 화합물의 예로서는 후술하는 화학식 (IV) 로 표시되는 화합물이 있다. 또 화학식 II로 표시되는 화합물의 예로서는 후술하는 화학식 (VI) 로 표시되는 화합물이 있다. 또한 화학식 III으로 표시되는 화합물의 예로는 후술하는 화학식 (V) 로 표시되는 화합물이 있다.
개다시마 유래의 푸코이단을 알테로모나스 종 SN-1009 (FERM BP-5747) 가 생산하는 F-푸코이단 분해효소 및 플라보박테리움 종 SA-0082(FERM BP-5402) 가 생산하는 U-푸코이단 분해효소로 분해하고, 분해물을 제거함으로써, 이미 언급한 G-푸코이단을 정제할 수 있다.
플라보박테리움 종 SA-0082 (FERM BP-5402) 는 이 G-푸코이단을 특이적으로 분해하는 엔도형 황산화 다당 분해효소 (G-푸코이단 분해효소) 도 생산하고, 당해 G-푸코이단 분해효소를 G-푸코이단에 작용시킴으로써, 당해 G-푸코이단의 분해물을 제조하여, 당해 분해물 중으로부터 목적에 따라 분해물을 정제할 수 있다. 화 학식 III으로 표시되는 화합물이 그 예이다. 당해 화합물 중의 황산기의 함량, 부위에 대해서는 그의 분해물 중으로부터 임의의 것을 정제할 수 있다. 또, 당해 분해물 중에는 화학식 III으로 표시되는 화합물을 기본골격으로 하는, 이의 다량체도 함유되어 있고, 목적에 따라 분리, 정제할 수 있다.
또 상기 각 효소에 대해서는 국제공개 제97/26896호 팜플렛 또는 국제공개 제00/50464호 팜플렛에 기재되어 있다.
또한 개다시마 유래의 푸코이단을 유기산 존재하에서, 가열처리함으로써 글루쿠론산과 만노오스의 중합체를 수득할 수 있고, 이 중합체도 본 발명의 세포 상해성 T 세포의 항원 특이적인 세포 상해 활성의 유지 또는 증간능을 갖는 산성 다당으로 사용할 수 있다. 또한 가열처리조건, 가열시간을 조정함으로써 임의의 중합도의 중합체를 제조할 수 있다.
이상, 본 발명에서 사용하는 유효성분은 CTL 의 항원 특이적인 세포 상해 활성을 유지 또는 증강하는 작용을 갖는 한 특별한 한정은 없으며, 각종 산성 다당, 산성 올리고당, 산성 단당 및/또는 이들의 염을 사용할 수 있지만, 특히 바람직하게는 푸코이단, 헤파린, 알긴산, 콘드로이틴 황산 A, 콘드로이틴 황산 B, 펙틴산, 히알루론산, 푸코이단 분해물, 황산화 글루코오스, 황산화 푸코오스 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상을 사용할 수 있다. 또한 본 발명에서는 지금까지 의약품으로 사용되어 온 산성 다당의 사용이 바람직하고, 예컨대 덱스트란 황산 나트륨, 히알루론산, 헤파린을 사용할 수 있다. 텍스트란 황산 나트륨은 류코노스톡 메센테로이데스 반 티에겜 (Leuconostoc mesenteroides van Tieghem)에 의한 자당의 발효에 의해 생산된 덱스트란의 부분 분해물을 황산화하여 수득한 황산화 에스테르의 나트륨염이다.
본 발명에 사용되는 산성 다당, 산성 올리고당, 산성 단당의 염으로는 CTL 의 항원 특이적인 세포 상해 활성을 유지 또는 증강시키는 작용을 갖는 한 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 알칼리금속 염, 알칼리토금속 염, 유기 염기 등과의 염을 예시할 수 있다. 예컨대 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄, 또는 디에탄올아민, 에틸렌디아민 등과의 염을 들 수 있다. 이들 염은 예컨대 산성 다당, 산성 올리고당, 산성 단당에 존재하는 산성 기, 예컨대 푸코이단 등에 존재하는 황산 기나 카르복실기를 공지된 방법으로 염으로 변환함으로써 수득된다. 이러한 염으로는 약리학적으로 허용될 수 있는 염이 바람직하다.
본 발명에서 유효성분으로 사용되는 산성 다당, 산성 올리고당, 산성 단당 및/또는 이들의 염은 단독으로 또는 2 종 이상 혼합하여 사용할 수 있다. 또한 당해 유효성분의 유도체, 예컨대 지방산 유도체 등도 CTL 의 특이적인 세포 상해 활성의 유지 또는 증강능을 나타내는 한, 특별히 한정없이 사용할 수 있다.
본 발명에서, CTL 로의 분화능을 갖는 전구세포를 항원 제시세포와 함께 인큐베이트 (공배양) 하여 CTL 을 유도하기 위한 일반적인 조건은 공지된 조건 [예컨대, 문헌: Bednarek M. A. 등, J. Immunology 147 p4047-4053 (1991) 참조] 에 따르면 된다. 공배양 조건에 특별한 한정은 없지만, 통상의 세포 배양에 사용되는 조건을 사용할 수 있고, 예컨대 37℃, 5% CO2 등의 조건으로 배양할 수 있다. 이 공배양은 통상 2∼15 일 정도 실시되지만, 그 동안에 항원 제시세포를 새롭게 제조한 것으로 교체하여 재자극을 행해도 된다. 또한 적당한 시간 간격으로 배지를 신선한 것으로 교환할 수 있다.
공배양을 행하는 배지 중에서의, 본 발명의 유효성분의 함유량은 원하는 효과가 얻어진다면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 0.001∼1000㎍/㎖, 보다 바람직하게는 0.01∼100㎍/㎖ 이다. 또 유효성분은 배지 중에 용해되어 존재하는 것이 바람직하다.
이렇게 하여 유도된 CTL 은 원하는 항원을 특이적으로 인식하는 능력을 갖고 있으며, 예컨대 이 항원을 갖는 세포를 그 세포 상해 활성에 의해 특이적으로 파괴한다. 이 CTL 의 세포 상해 활성은 공지된 방법에 의해 평가할 수 있다. 예컨대 항원 제시세포에 의해 제시된 펩티드와 방사선 물질, 형광물질 등으로 표지한 표적세포에 대한 상해성, 방사능의 도입에 의해 측정할 수 있는 CTL 증식의 항원 특이적인 증가 또는 CTL 이나 표적세포로부터 항원 특이적으로 유리되는 GM-CSF, IFN-γ등의 사이토카인량을 측정함으로써 평가할 수 있다 (후술하는 실시예 1-1-(3) 참조). 기타, 형광색소 등에 의해 표지된 항원 펩티드나 복합체의 사용에 의해 직접 확인할 수도 있다. 이 경우, 예컨대 CTL 을 CTL 특이성 항체와 커플링시킨 제 1 형광 마커와 접촉시킨 다음 제 2 형광 마커와 커플링시킨 항원 펩티드 MHC 복합체를 접촉시키고, 그리고 이중표지세포의 존재를 FACS (fluorescence-activated cell sorting) 분석에 의해 행할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 유도된 CTL 은 유도 후의 세포를 장기간에 걸쳐 유지, 또는 이들을 증식시켜도 종래 관찰된 바와 같은 항원 특이적인 세포 상해 활성 의 현저한 저하가 없다는 우수한 성질을 갖는다. 따라서, 유도된 CTL 을 클론화함으로써, 안정된 세포 상해 활성을 갖는 림프구로서 유지할 수도 있다. 예컨대 유도된 CTL 에 항원, 각종 사이토카인, 항 CD3 항체 자극을 부여함으로써 증식시켜 확대 배양할 수 있다. 이러한 CTL 의 유지, 확대 배양에는 후술하는 본 발명의 세포 상해성 T 세포의 유지방법, 확대 배양 방법의 사용이 적합하다.
이같은 본 발명의 효과는 본 발명의 방법으로 유도된 CTL 을 적절한 방법으로 유지, 또는 확대 배양한 후에 그 세포 상해 활성을 상기 기재된 방법에 의해 측정하여 확인할 수 있다.
(2) 본 발명의 세포 상해성 T 세포의 유지방법
본 발명의 세포 상해성 T 세포의 유지방법은 CTL 을 항원 특이적인 세포 상해 활성을 보존한 채로 유지하는 방법이다. 이 방법은 본 발명의 유효성분을 함유하는 배지 중에서 CTL 을 계속 배양하는 것을 하나의 큰 특징으로 하고, 이 세포가 갖는 항원 특이적인 세포 상해 활성을 계속적으로 유지시킬 수 있다.
상기 방법을 적용가능한 CTL 에는 한정은 없으며, 공지된 방법으로 수득된 CTL 을 그 항원 특이적인 상해 활성을 유지한 채, 본 발명의 방법으로 유지할 수 있다. 또한 상기 (1) 에 기재된 본 발명의 세포 상해성 T 세포의 유도방법에 의해 수득된 CTL 의 유지에도 적합하게 사용된다.
본 발명에서, CTL 의 계속 배양의 일반적인 조건은 공지된 조건 [예컨대, 문헌: Carter J. 등, Immunology 1986년 1월, 57(1) p123-129 참조] 에 따르면 된다. 본 발명의 세포 상해성 T 세포의 유지방법에 사용되는 배지도 특별히 한정하지 않 고, 예컨대 상기 CTL 의 유도방법에 사용되는 배지를 사용할 수 있다.
본 발명의 방법은 상기 유효성분을 배지에 첨가하여 실시된다. 배양을 행하는 배지 중에서의 본 발명의 유효성분의 함유량은 원하는 효과가 얻어진다면 특별히 한정되지는 않지만, 바람직하게는 0.001∼1000㎍/㎖, 보다 바람직하게는 0.01∼100㎍/㎖ 이다. 또 유효성분은 배지 중에 용해되어 존재하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 유효성분으로는 푸코이단, 헤파린, 알긴산, 콘드로이틴 황산 A, 콘드로이틴 황산 B, 펙틴산, 히알루론산, 푸코이단 분해물, 황산화 글루코오스, 황산화 푸코오스 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상이 바람직하다. 또한 배지에는 사이토카인이나 그 밖의 공지된 성분을 원하는 바에 따라 첨가할 수 있다. 본 발명에는 바람직하게는 IL-2 를 함유하는 배지가 사용된다. 배양 조건에는 특별한 한정은 없으며, 통상의 세포 배양에 사용되는 조건을 사용할 수 있고, 예컨대 37℃, 5% CO2 등의 조건으로 배양할 수 있다. 또한, 적당한 시간 간격으로 배지를 신선한 것으로 교환할 수 있다.
상기와 같이, 본 발명의 유효성분을 함유하는 배지 중에 CTL 을 계속적으로 배양함으로써, 이의 특이적인 세포 상해 활성의 저하를 억제하여 CTL 을 유지할 수 있다. 이같은 본 발명의 효과는 본 발명의 방법으로 유지된 CTL 이 갖는 세포 상해 활성을 상기 (1) 에 기재된 방법으로 측정하여 확인할 수 있다. 또한 이 방법으로 유지된 CTL 은 공지된 확대 배양법에 의해 증식시킬 수 있지만, 이렇게 하여 증식된 CTL 도 특이적인 세포 상해 활성을 유지하고 있다. 또 CTL 의 확대 배양 방법으로는 후술하는 본 발명의 CTL 의 확대 배양 방법을 바람직하게 이용 할 수 있다.
(3) 본 발명의 세포 상해성 T 세포의 확대 배양 방법
세포 상해성 T 세포는 적절한 조건하에서 배양함으로써, 세포수를 증가시킬 수 있다 (확대 배양). 종래, 몇몇 CTL 확대 배양 방법이 개발되었으나, 단시간에 효율적으로 CTL 을 증식시킬 수 있는 것으로서 리델 (Riddell) 등이 개발한 이미 언급한 REM 법이 알려져 있다. 이 방법은 X 선 조사에 의해 비증식성이 된 PBMC (피더 세포로서 사용) 와 EBV 에 의해 형질전환된 B 세포 (EBV-B 세포) 를 사용하고, IL-2, 항 CD3 모노클로날 항체의 존재하에 CTL 을 배양하는 방법이다. 그러나, 이 방법은 T 세포로의 EBV-B 세포의 혼입 위험성이 부정되지 않는 점이 문제였다.
본 발명의 세포상해성 T 세포의 확대 배양 방법은 항원 특이적인 세포 상해 활성을 유지한 상태로 당해 세포수를 증가시킬 수 있는 방법이다. 이 방법은 본 발명의 상기 유효성분의 존재하에 세포를 인큐베이트 (배양) 하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 방법에서 적용할 수 있는 CTL 에 한정은 없고, 공지된 방법으로 수득된 CTL 이나, 상기 (1) 에 기재된 본 발명의 CTL 의 유도방법에 의해 수득된 CTL 이나, 상기 (2) 에 기재된 본 발명의 CTL 의 유지방법에 의해 수득된 CTL 의 확대 배양에 바람직하게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명에서, CTL 의 확대 배양의 일반적인 조건은 공지된 조건 [예컨대, 문헌: Uberi J.P. 등, Clin. Immunol. Immunophathol. 1994년 3월, 70(3) p234-240 을 참조] 에 따르면 된다.
본 발명의 세포상해성 T 세포의 확대 배양 방법에서는, 상기 유효성분에 더하여 항 CD3 항체, 바람직하게는 항 CD3 모노클로날 항체를 추가로 함유하는 배지중에서 CTL 을 배양하는 것이 바람직하다. 또, 더욱 바람직하게는 CTL 은 적절한 피더 세포와 공배양된다.
상기 방법에 사용되는 배지는 특별히 한정되지 않고, CTL 의 배양, 생육에 필요한 성분을 혼합하여 제작된 공지된 배지를 사용할 수 있고, 예컨대 시판되고 있는 배지여도 된다. 또한, CTL 을 피더 세포와 공배양하는 경우에는 CTL, 피더 세포 양자의 유지, 생육에 적합한 배지인 것이 바람직하다. 이러한 배지는 그 본래의 구성성분 이외에 적당한 단백질, 사이토카인류, 그 외의 공지된 성분을 함유하고 있어도 되고, 예컨대 IL-2 를 함유하는 배지가 본 발명에 바람직하게 사용된다. 항 CD3 항체, 특히 항 CD3 모노클로날 항체는 CTL 상의 T 세포 리셉터를 활성화하는 목적으로 첨가할 수 있다. 또한, 항 CD3 항체의 배지 내의 함유량은 공지된 조건에 따라 결정하면 되고, 예컨대 0.01∼1㎍/㎖ 가 바람직하다.
본 발명의 CTL 의 확대 배양 방법은 상기 유효성분을 배지에 첨가하여 실시된다. 또한, 상기 유효성분으로는 푸코이단, 헤파린, 알긴산, 콘드로이틴 황산 A, 콘드로이틴 황산 B, 펙틴산, 히알루론산, 푸코이단 분해물, 황산화 글루코오스, 황산화 푸코오스 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종이 바람직하다. 또, 배양을 실시하는 배지 내의 본 발명의 유효성분의 함유량은 원하는 효과를 얻을 수 있으면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 0.001∼1000㎍/㎖, 보다 바람직하게는 0.01∼100㎍/㎖ 이다. 또한, 유효성분은 배지중에 용해되어 존재하는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에 사용되는 피더 세포는 항 CD3 항체와 협동하여 CTL 을 자극하고 T 세포 리셉터를 활성화하는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 본 발명에는 예컨대 PBMC 나 EBV-B 세포가 사용된다. 통상, 피더 세포는 방사선 조사와 같은 수단으로 증식능을 없앤 후에 사용된다. 또한, 피더 세포의 배지 내의 함유량은 공지된 조건에 따라 결정하면 되고, 예컨대 1 ×105∼1 ×107 세포/㎖ 가 바람직하다.
본 발명의 특히 바람직한 양태에서는, 피더 세포로서 비바이러스 감염세포, 예컨대 EBV-B 세포 이외의 것이 사용된다. 이로써, 확대 배양된 CTL 중에 EBV 가 혼재할 가능성을 배제할 수 있어 양자 면역 치료법과 같은 CTL 을 이용한 의료의 안전성을 높일 수 있게 된다.
본 발명의 세포상해성 T 세포의 확대 배양 방법에서, 그 배양 조건은 특별히 한정되지 않고, 통상적인 세포배양에 사용되는 조건을 사용할 수 있고, 예컨대 37℃, 5% CO2 등의 조건에서 배양할 수 있다. 또, 적당한 시간 간격으로 배지를 신선한 것으로 교환할 수 있다.
또한, CTL 의 확대 배양 방법에 대해서는, 본 발명의 유효성분을 사용되고 있는 배지에 첨가하고 있으면 특별히 한정되지 않고, 상기 이외의 종래의 CTL 확대 배양법에서 본 발명의 유효성분을 배지에 첨가하는 양태도 본 발명에 포함된다.
본 발명의 확대 배양 방법에 의하면, 예컨대 14 일간의 확대 배양에 의해 100∼1000 배로 세포수가 증가된 CTL 을 수득할 수 있다. 또한, 이렇게 수득된 CTL 은 종래의 CTL 확대 배양법, 예컨대 REM 법으로 수득된 것에 비해 보다 높은 항원 특이적인 세포 상해 활성을 유지하고 있다.
이와 같은 본 발명의 효과는, 본 발명의 방법으로 확대 배양된 CTL 이 갖는 세포 상해 활성을 상기 (1) 에 기재된 방법에 의해 측정하여 확인할 수 있다.
또, 본 발명에 사용되는 유효성분은 CTL 의 항원 특이적인 세포 상해 활성의 유지 또는 증강에 작용하는, CTL 유도제, CTL 유지제 또는 CTL 확대 배양제 (이하, 이것들을 CTL 배양제라고 함) 로 사용할 수 있다. 당해 CTL 배양제는 유효성분 그 자체, 또는 추가로 그 외의 임의의 성분, 예컨대 CTL 의 유도방법에서 사용되는 배지, CTL 의 유지방법에서 사용되는 배지 또는 CTL 의 확대 배양법에서 사용되는 배지에 포함되는, CTL 이나 피더 세포 등의 배양, 생육에 필요한 성분, 및 적당한 단백질, 사이토카인류 (바람직하게는 IL-2), 원하는 그 외의 성분으로 이루어진다. 또, 이들 CTL 배양제를 함유하는 배지는 CTL 유도용, 유지용 또는 확대 배양용 배지 (이하, 이것들을 CTL 용 배지라고 함) 로 사용할 수 있다. 이들 배지는 세포배양을 위한 기본적인 성분과 상기 화합물 외, 각각의 용도에 따른 적절한 성분을 임의로 함유하는 것이다. 또한, 상기 CTL 배양제 및 CTL용 배지는 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다.
상기 본 발명의 CTL 의 유도방법, 유지방법 및 확대 배양 방법을 사용함으로써 수득된 CTL 함유 배양물 중에는, 통상 헬퍼 T 세포 등의 CTL 이외의 세포도 혼재되어 있다. 본 발명에서는 이러한 배양물로부터 원심분리 등에 의해 이러한 배양물 중의 세포를 회수하고, 본 발명의 방법에 의해 수득된 CTL 로서 예컨대 그대로 사용할 수 있다.
또한 이 배양물로부터 항원 특이적인 세포 상해 활성을 갖는 CTL 을 고함유하는 세포집단 (또는 배양물) 을 분리하고, 본 발명의 방법에 의해 수득된 CTL 로서 사용할 수도 있다. 즉, 본 발명에서는 상기 CTL 함유 배양물 중의 CTL 이외의 세포 (예컨대, 헬퍼 T 세포) 와 CTL 과의 분리조작을 실시함으로써 항원 특이적인 세포 상해 활성에 관해 농축된 세포집단을 제조하여 사용할 수 있다. 이와 같은 상기 세포집단을 분리하는 것에 의한 항원 특이적인 세포 상해 활성의 농축은 종래의 REM 법으로 거론할 수 없었던 것이다. 따라서, 본 발명의 한 양태로서, 본 발명의 CTL 의 유도방법, 유지방법 및 확대 배양 방법 중 어느 하나에 의해 수득된 CTL 함유 배양물로부터 항원 특이적인 세포 상해 활성을 갖는 세포상해성 T 세포를 고함유하는 세포집단을 선택하는 공정을 포함하는 세포상해성 T 세포의 회수방법이 제공된다. 또한, 본 발명의 CTL 의 회수방법은 일반적으로 높은 항원 특이적인 세포 상해 활성을 갖는 CTL 의 세포집단을 선택적으로 수득하는 방법을 말하는데, 넓은 의미로는 당해 CTL 의 세포집단을 생산 또는 획득하는 방법을 말한다. 이러한 세포집단의 선택방법에 대해서는 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 상기 CTL 의 유도방법, 유지방법 및 확대 배양 방법을 사용하여 수득된 CTL 함유 배양물로부터 CTL 세포 표면 상에 발현되어 있는 세포 표면 항원에 대한 항체, 예컨대 항 CD8 항체를 결합시킨 자기비즈 또는 컬럼을 사용하여 CTL 만을 선택적으로 회수하여 CTL 을 고함유하는 세포집단을 수득할 수 있다. 플로우 사이토미터 (flow cytometer)를 사용하여 CTL 을 선택적으로 분리할 수도 있다. 또, 본 발명의 CTL 의 유도방법, 유지방법 및 확대 배양 방법에 의해 수득된 CTL 함유 배양물 중에서 CTL 이외의 세포를 제거함으로써 CTL 을 고함유하는 세포집단을 수득할 수 있다. 예컨대, 당해 배양물로부터 헬퍼 T 세포를 제거하기 위해 헬퍼 T 세포 표면 상에 발현되어 있는 세포 표면 항원에 대한 항체, 예컨대 항 CD3 항체, 항 CD4 항체를 결합시킨 자기비즈 또는 컬럼을 사용하여 헬퍼 T 세포를 선택적으로 제거하여 CTL 을 고함유하는 세포집단을 수득할 수 있다. 또, 헬퍼 T 세포의 제거에는 플로우 사이토미터를 사용할 수도 있다. 이와 같이 하여 수득된 CTL 을 고함유하는 세포집단은 CTL 함유 배양물로부터 비선택적으로 회수된 세포집단과 비교하여 보다 강한 세포 상해 활성을 갖고 있고, 본 발명의 방법에 의해 수득된 CTL 로서 보다 바람직하게 사용할 수 있다. 또, 본 발명에서는 CTL 을 고함유하는 세포집단으로서 CTL 만의 세포집단도 포함한다.
또, 본 발명의 CTL 의 유지방법 및 확대 배양 방법에 의해 수득된 CTL 을 사용하고, 또한 본 발명의 CTL 의 유지방법 및 확대 배양 방법에 의해 CTL 의 유지 또는 확대 배양을 실시할 수도 있다. 예컨대, 본 발명의 확대 배양 방법에 의해 수득된 CTL 에서 상기 방법에 의해 CTL 을 고함유하는 분획을 수득하고, 이 분획을 사용하여 본 발명의 확대 배양 방법을 실시함으로써 더욱 세포 상해 활성이 높은 CTL 을 수득할 수도 있다. 또, 본 발명의 확대 배양 방법에 의해 수득된 CTL 을 본 발명의 유지방법을 사용하여 그 세포 상해 활성을 유지시켜 둘 수도 있다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 CTL 의 유도방법, 유지방법 및 확대 배양 방법으로 수득된 CTL 을 제공한다. 이러한 CTL 은 모두 항원 특이적인 세포 상해 활성을 갖고 있어, 장기간에 걸친 계속 배양이나 확대 배양을 실시해도 세포 상해 활성의 저하가 적다는 성질을 갖는다. 또, 본 발명은 당해 CTL 을 유효성분으로 함유하는 치료제를 제공한다. 당해 치료제는 특히 양자 면역 치료법으로의 사용에 적합하다. 양자 면역 치료법에서는 환자의 치료에 적합한 항원 특이적인 세포 상해 활성을 갖는 CTL 이, 예컨대 정맥으로의 투여에 의해 환자에게 투여된다. 당해 치료제는, 제약분야에서 공지된 방법에 따라, 예컨대 본 발명의 방법에 의해 제조된 CTL 을 유효성분으로 하고, 예컨대 공지된 비경구 투여에 적합한 유기 또는 무기 담체, 부형제, 안정제 등과 혼합함으로써 제조할 수 있다. 당해 CTL 로는 특히 본 발명의 CTL 확대 배양 방법에 의해 EBV 감염세포를 사용하지 않고 제조된 CTL 이 이러한 목적에 바람직하다. 또한, 치료제에서의 CTL 의 함유량, 치료제의 투여량 등, 당해 치료제에 관한 여러 조건은 공지된 양자 면역 치료법에 따라 적절하게 결정할 수 있다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이러한 기재에 조금도 한정되지 않는다. 또한, 실시예에서의 % 는 특별한 사정이 없는 한 중량% 를 의미한다.
제조예 1
(1) 개다시마를 충분히 건조시킨 후, 건조물 20㎏ 을 자유 분쇄기 (Nara Kikai Seisakusho 제조) 에 의해 분쇄하였다. 수돗물 900ℓ에 염화칼슘 2수화물 (Nippon Soda Co., Ltd. 제조) 7.3㎏ 을 용해시키고, 이어서 개다시마 분쇄물 20㎏ 을 혼합하였다. 액체 온도가 12℃ 에서 90℃ 가 될 때까지 수증기 흡입에 의해 40 분간 승온시키고, 이어서 교반하에 90 내지 95℃ 에서 1 시간 보온하고, 이어서 냉각하여 냉각물 1100ℓ를 수득하였다. 이어서, 고액 분리장치 (West Farrier Separator 제조, CNA 형) 를 사용하여, 냉각물의 고액 분리를 실시하여 약 900ℓ의 고액 분리 상층액을 제조하였다. 고액 분리 상층액 360ℓ를 다이셀 케미칼 인더스트리사 제조 FE10-FC-FUS0382 (분획 분자량: 30,000) 를 사용하여 20ℓ까지 농축하였다. 이어서, 수돗물을 20ℓ첨가하고, 다시 20ℓ까지 농축을 5 회 반복실시하고, 탈염처리를 실시하여 개다시마 유래의 추출액 25ℓ를 제조하였다. 이 용액 1ℓ를 동결건조시켜 개다시마 유래 푸코이단 건조물 13g 을 수득하였다.
제조예 2
제조예 1 에 기재된 푸코이단 건조물 7g 을 50mM 의 염화나트륨과 10% 의 에탄올을 함유하는 20mM 의 이미다졸 완충액 (pH 8.0) 700㎖ 에 용해시키고 원심분리에 의해 불용물을 제거하였다. 동일 완충액으로 평형화시킨 DEAE-셀룰로파인 A-800 컬럼 (
11.4㎝ ×48㎝) (생화학공업사 제조) 상에 원심분리 상층액을 적용한 후, 동일 완충액으로 세정하고, 염화나트륨 50mM 로부터 1.95M 의 농도구배에 의해 용출시켰다 (분획 당 250㎖). 페놀 황산법 및 카르바졸 황산법으로 총 당 함량 및 우론산 함량을 측정하고, 용출순으로 분획 43 내지 49, 분획 50 내지 55, 분획 56 내지 67 의 분획을 수득하였다. 이어서, 이들 분획을 전기투석에 의해 탈염시킨 후, 동결건조시켜 분획 43 내지 49 에서 Ⅰ 분획 (340㎎), 분획 50 내지 55 에서 Ⅱ 분획 (870㎎), 분획 56 내지 67 에서 Ⅲ 분획 (2.64g) 을 각각 제조하였다. 도 1 은 개다시마 유래 푸코이단의 DEAE-셀룰로파인 A-800 컬럼 용출패턴을 나타낸다. 도 1 에서 종축은 카르바졸황산법에 의한 530㎚ 의 흡광도 (도식 중 흑색 원), 페놀 황산법에 의한 480㎚ 에서의 흡광도 (도식 중 백색 원), 및 전도도 (mS/cm: 도식 중 백색 사각), 횡축은 분획 번호를 나타낸다. 도식 중 전피크가 U-푸코이단, 후피크가 F-푸코이단이다.
제조예 3
(1) 알테로모나스 종 SN-1009 (FERM BP-5747) 를 글루코오스 0.25%, 펩톤 1.0%, 및 효모엑기스 0.05% 를 함유하는 인공 해수 (Jamarin Laboratory 제조) pH 8.2 를 함유하는 배지 600㎖ 를 분주하여 살균한 (120℃, 20 분간) 2ℓ의 삼각 플라스크에 접종하고, 25℃ 에서 26 시간 배양하여 종배양액으로 하였다. 펩톤 1.0%, 효모엑기스 0.02%, 하기 실시예 2-(2) 에 기재된 황산화 다당 0.2%, 및 소포제 (Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. 제조, KM70) 0.01% 를 함유하는 인공 해수 pH 8.0 으로 이루어지는 배지 20ℓ를 30ℓ용량의 자르 (jar) 발효기에 채우고, 120℃ 에서 20 분간 살균하였다. 냉각후, 상기의 종배양액 600㎖ 을 접종하고, 24℃ 에서 24 시간, 분 당 10ℓ의 통기량과 250rpm 의 교반속도의 조건에서 배양하였다. 배양종료 후, 배양액을 원심분리하여 균체 및 배양 상층액을 수득하였다. 수득된 배양 상층액을 배제분자량 10,000 의 홀로파이버 (holofiber) 를 장착시킨 한외여과기 (ultrafilter) 에 의해 농축한 후, 85% 포화 황산암모늄으로 염석하고, 형 성된 침전물을 원심분리에 의해 수합하여, 1/10 농도의 인공 해수를 함유하는 20mM 트리스-염산 완충액 (pH 8.2) 에 대해 충분히 투석하여, 600㎖ 의 F-푸코이단에 선택적으로 작용하는 F-푸코이단 분해 효소액을 제조하였다.
(2) 건조시킨 개다시마 2㎏ 을 직경 1㎜ 의 스크린을 장착시킨 커터밀 (Masuko Sangyo 제조) 에 의해 분쇄하고, 수득된 다시마의 칩을 20ℓ의 80% 에탄올 중에 현탁시키고, 현탁액을 25℃ 에서 3 시간 교반하고, 여과지로 여과한 후, 잔류물을 충분히 세정하였다. 수득된 잔류물을 95℃ 로 가온한 40ℓ의 50mM 염화나트륨을 함유하는 pH 6.5 의 20mM 인산나트륨 완충액에 현탁시키고, 현탁액을 여러 차례 교반하면서 95℃ 에서 2 시간 처리하여 황산화 다당을 추출하였다.
추출액 중의 현탁물을 여과하여 여과액을 제조한 후, 여과 잔류물을 3.5ℓ의 100mM 염화나트륨에 의해 세정하여 다시 여과액을 수득하였다.
양쪽 여과액을 합한 후, 30℃ 까지 온도를 낮추고, 3000U 의 알긴산 리아제 (나가세생화학공업사 제조) 를 첨가한 후, 에탄올을 4ℓ를 첨가하여 25℃ 에서 24 시간 교반하였다. 이어서, 혼합물을 원심분리하여, 수득된 상층액을 배제분자량 100,000 의 홀로파이버를 장착한 한외여과기에 의해 4ℓ로 농축하고, 다시 10% 의 에탄올을 함유하는 100mM 염화나트륨에 의해 착색성 물질이 여과되지 않을 때까지 한외여과를 계속하였다.
비여과액 중에 형성된 침전물을 원심분리에 의해 제거하고, 이 상층액을 5℃ 까지 온도를 낮추고, 0.5 N 염산에 의해 pH 를 2.0 으로 조정한 후, 형성된 단백질 등의 침전물을 원심분리에 의해 제거하고, 수득된 상층액을 신속히 1N 수산화나트 륨에 의해 pH 를 8.0 으로 조정하였다.
이어서, 배제분자량 100,000 의 홀로파이버를 장착시킨 한외여과기에 의해 한외여과를 실시하고, 용매를 pH 8.0 인 20mM 염화나트륨에 의해 완전히 치환한 후, 다시 pH 를 8.0 으로 조정하여 원심분리한 후, 동결건조를 실시하여 약 95g 의 황산화 다당을 제조하였다.
(3) 건조시킨 개다시마 2㎏ 을 직경 1㎜ 의 스크린을 장착시킨 커터밀에 의해 분쇄하고, 수득된 다시마의 칩을 20ℓ의 80% 에탄올 중에 현탁시키고, 25℃ 에서 3 시간 교반하고, 여과지로 여과한 후, 잔류물을 충분히 세정하였다. 수득된 잔류물을 30㎖ 의 상기 제조예 3-(1) 에서 제조한 F-푸코이단 분해효소, 10% 의 에탄올, 100mM 의 염화나트륨, 50mM 의 염화칼슘 및 50mM 의 이미다졸을 함유하는 20ℓ의 완충액 (pH 8.2) 에 현탁시키고, 25℃ 에서 48 시간 교반하였다. 이 현탁액을 그물코의 직경 32㎛ 의 스테인리스 철망으로 여과하고, 잔류물을 50mM 의 염화칼슘을 함유하는 10% 의 에탄올로 세정하였다. 또한, 그 잔류물을 10ℓ의 50mM 염화칼슘을 함유하는 10% 에탄올 중에 현탁시키고, 현탁액을 3 시간 동안 교반한 후, 스테인리스 철망으로 여과하고, 세정하였다. 또한, 그 잔류물을 동일 조건하에 현탁시킨 후, 16 시간 교반하고, 직경 32㎛ 의 스테인리스 철망으로 여과하고, 잔류물을 세정하였다.
이렇게 하여 수득된 여과액 및 세정액을 수합하여, 배제분자량 3000 의 홀로파이버를 장착시킨 한외여과기에 의해 한외여과함으로써, 여과액과 비여과액으로 분리하였다.
이 여과액을 회전증발기로 약 3ℓ로 농축 후, 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 수득된 상층액을 배제분자량 300 의 막을 장착시킨 전기투석기에 의해 탈염시키고, 이 용액에 0.1M 이 되도록 아세트산 칼슘을 첨가하여, 형성된 침전물을 원심분리에 의해 제거하였다. 수득된 상층액을 미리 50mM 의 아세트산 칼슘에 의해 평형화시킨 DEAE-셀룰로파인 (수지량: 4ℓ) 에 넣고, 50mM 의 아세트산 칼슘 및 50mM 의 염화나트륨으로 충분히 세정한 후, 50mM 내지 800mM 의 염화나트륨의 농도구배에 의해 용출시켰다. 이 때의 수합량은 분획 당 500㎖ 이었다. 수합한 분획을 셀룰로오스 아세테이트막 전기영동법 [Analytical Biochemistry, 제 37 권, 197∼202 면 (1970)] 에 의해 분석한 결과, 염화나트륨 농도가 약 0.4M 로 용출되는 황산화 당 (분획 번호 63 부근) 이 균일하였다.
그러므로, 우선 분획 번호 63 의 용액을 150㎖ 로 농축한 후, 농도가 4M 이 되도록 염화나트륨을 첨가하고, 미리 4M 의 염화나트륨에 의해 평형화시킨 페닐-셀룰로파인 컬럼 (수지량: 200㎖) (생화학공업사 제조) 에 넣고, 4M 의 염화나트륨에 의해 충분히 세정하였다. 비흡착성의 황산화 당분획을 수합하여 배제분자량 300 의 막을 장착시킨 전기투석기에 의해 탈염시켜, 탈염액 505㎖ 을 수득하였다.
수득된 탈염액 중 40㎖ 를 10% 의 에탄올을 함유하는 0.2M 의 염화나트륨에 의해 평형화시킨 셀룰로파인 GCL-90 의 컬럼 (4.1㎝ ×87㎝) 에 넣어 겔여과를 실시하였다. 수합은 분획 당 9.2㎖ 로 실시하였다.
모든 분획에 대하여 총 당 함량의 분석을 페놀 황산법 [Analytical Chemistry, 제 28 권, 제 350 면 (1956)] 에 의해 실시하였다.
그 결과, 황산화 당은 단일 피크를 형성하였기 때문에, 그 피크의 중앙부분인, 분획 번호 63 내지 70 을 수합하고, 배제분자량 300 의 막을 장착시킨 전기투석기에 의해 탈염시킨 후, 동결건조시켜 112㎎ 의 하기 화학식 Ⅳ로 표시되는 화합물의 건조품을 수득하였다. 이하, 이 화합물을 7-12SFd-F 라고 칭한다.
(4) 제조예 2 에서 제조한 Ⅲ 분획 (F-푸코이단) 의 2.5% 수용액 80㎖ 에 1M 트리스 염산 완충액 (pH 7.6) 을 16㎖, 1M CaCl2 수용액을 16㎖, 4M NaCl 수용액을 24㎖, 실시예 3-(1) 에서 수득된 F-푸코이단 분해효소액을 8㎖, 증류수를 176㎖ 첨가하여 30℃ 에서 3 시간 가열하였다. 이 효소처리 F-푸코이단 용액을 효소처리 F-푸코이단의 최종농도가 2% 가 되도록 회전증발기로 농축하고, 그 후 증류수중에서 투석조작을 실시하여, 2% 효소처리 F-푸코이단 수용액을 제조하였다. 이 시료를 HPLC (컬럼: SB802.5, 컬럼 온도: 35℃, 이동상: 50mM NaCl, 유속: 0.5㎖/분, 검출: RI ATT = 8) 로 분석하였다. 그 결과, 시료 중의 약 40% 가 화학식 Ⅳ에 기재된 7-12SFd-F 임이 판명되었다.
제조예 4
(1) 건조시킨 개다시마 2㎏ 을 구멍 직경 1㎜ 의 스크린을 장착한 커터밀 (Masuko Sangyo 제조) 을 사용하여 파쇄하고, 파쇄물을 20ℓ의 80% 에탄올 중에서 25℃ 에서 3 시간 동안 교반한 후, 여과하고, 세정하였다. 수득된 잔류물을 50mM 의 염화칼슘, 100mM 의 염화나트륨, 10% 의 에탄올, 및 제조예 3-(1) 에서 제조한 알테로모나스 종 SN-1009 (FERM BP-5747) F-푸코이단 분해효소를 1U 함유하는 20ℓ의 30mM 이미다졸 완충액 (pH 8.2) 중에 현탁시키고, 25℃ 에서 2 일 동안 교반하고, 이어서 구멍 직경 32㎛ 의 스테인리스 철망으로 여과하고, 세정하였다. 수득된 잔류물을 100mM 의 염화나트륨, 10% 의 에탄올, 및 4g 의 알긴산 리아제 (나가세생화학공업사 제조) 를 함유하는 40ℓ의 인산나트륨 완충액 (pH 6.6) 중에 현탁시키고, 25℃ 에서, 4 일간 교반한 후, 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 수득된 상층액 중에 함유되는 알긴산의 저분자 생성물을 제거하기 위해, 배제분자량 100,000 의 홀로파이버를 장착한 한외여과기에 의해 2ℓ로 농축한 후, 10% 의 에탄올을 함유하는 100mM 의 염화나트륨으로 용액 교환하였다. 이 용액에 등량의 400mM 아세트산칼슘을 첨가 교반한 후, 원심분리하고, 수득된 상층액을 빙냉하에 1N 의 염산으로 pH 2 로 조정하였다. 형성된 침전물을 원심분리에 의해 제거하고, 수득된 상층액을 1N 의 수산화나트륨에 의해 pH 8.0 으로 조정하였다. 이 용액을 한외여과에 의해 1ℓ로 농축 후, 100mM 의 염화나트륨으로 용액 교환하였다. 이 때 형성된 침전물을 원심분리에 의해 제거하였다. 수득된 상층액 중의 소수성 물질을 제거하기 위해, 상층액이 1M 이 되도록 염화나트륨을 첨가하고, 1M 의 염화나트륨으로 평형화시킨 3ℓ의 페닐-셀룰로파인 컬럼 (생화학공업사 제조) 에 넣어 용출 분획을 수합하였다. 이 분획을 한외여과기에 의해 농축한 후, 20mM 의 염화나트륨으로 용액 교환하여 동결건조시켰다 동결건조물의 중량은 29.3g 이었다.
(2) 상기의 동결건조물 15g 을 400mM 의 염화나트륨 및 국제공개 제97/26896호 팜플렛에 기재된 플라보박테리움 종 SA-0082 (FERM BP-5402) 를 배양하여, 이 배양물로부터 수득된 엔도형 황산화 다당 분해효소 (U-푸코이단 분해효소) 를 9U 함유하는 1.5ℓ의 50mM 트리스 염산 완충액 중에 용해시키고, 25℃ 에서 6 일간 반응시킨 후, 증발기로 약 300㎖ 로 농축하였다. 농축액을 배제분자량 3500 의 투석 튜브에 넣어 철저히 투석하고, 투석 튜브 내에 남은 용액을 50mM 염화나트륨으로 평형화시킨 4ℓ의 DEAE-셀룰로파인 A-800 에 적용시키고, 50mM 염화나트륨으로 충분히 세정한 후, 50 내지 650mM 의 염화나트륨의 농도 구배에 의한 용출을 실시하였다. 또한, 동일 컬럼을 650mM 의 염화나트륨으로 충분히 용출시켰다. 용출 분획 중, 650mM 의 염화나트륨으로 용출시킨 분획을 황산화 푸코갈락탄 분획으로 수합하고, 배제분자량 100,000 의 한외여과기에 의해 농축한 후, 10mM 의 염화나트륨으로 용액을 치환하고, 동결건조시켜 황산화 푸코갈락탄의 동결건조물을 0.85 g 수득하였다. 수득된 황산화 푸코갈락탄 (G-푸코이단) 은 구성 당으로서 갈락토오스 및 푸코오스를 함유하고, 그 몰비는 약 2:1 이었다.
(3) G-푸코이단 분해효소의 생산을 위해 플라보박테리움 종 SA-0082 (FERM BP-5402) 를 글루코스 0.1%, 펩톤 1.0%, 효모 엑기스 0.05% 를 함유하는 인공 해수 (Jamarin Laboratory 제조) pH 7.5 로 이루어지는 배지 600㎖ 를 120℃, 20분간 살균한 후, 이 배지에 접종하고, 24℃ 에서 23 시간 배양하여 종배양액으로 하였다. 실시예 4-(1) 의 방법으로 제조한 개다시마 유래의 푸코이단 분획 0.2%, 펩톤 2.0%, 효모 엑기스 0.01%, 및 소포제 (Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. 제조, KM70) 0.01% 를 함유하는 인공 해수 (pH 7.5) 로 이루어지는 배지 20ℓ를 30ℓ용량의 자르 발효기에 채우고, 120℃ 에서 20 분간 살균하였다. 냉각후, 상기의 종배양액 600㎖ 를 접종하고, 24℃ 에서 23 시간, 분당 10ℓ의 통기량과 분당 125rpm 의 교반속도의 조건에서 배양하였다. 배양종료 후, 배양액을 원심분리하여 균체를 수득하였다.
수득된 균체를 1200㎖ 의 0.4M 염화나트륨을 함유하는 10mM 의 트리스-염산 완충액 (pH 8.0) 중에 현탁시키고, 초음파 파쇄후, 원심분리하여 균체 추출액을 수득하였다. 수득된 균체 추출액을 동일한 완충액으로 충분히 투석하고, 원심분리하여 상층액을 수득한다. 수득된 상층액을 최종농도가 90% 포화가 되도록 황산암모늄을 첨가하여 형성된 침전을 원심분리하여 수합하였다. 수득된 침전물을 150㎖ 의 50mM 염화나트륨을 함유하는 10mM 트리스 염산 완충액 (pH 8.0) 에 용해시키고, 동일한 완충액으로 충분히 투석하고, 원심분리하였다. 수득된 상층액을 동일한 완충액으로 평형화시킨 500㎖ 의 DEAE-세파로스 FF (아마샴 파마시아사 제조) 의 컬럼에 넣고 동일한 완충액으로 세정한 후, 50mM 에서 600mM 의 염화나트륨의 농도구배에 의해 용출시켜 활성 분획을 수합하였다.
수득된 활성 분획을 0.1M 염화나트륨을 함유하는 10mM 트리스-염산 완충액 (pH 8.0) 으로 충분히 투석하고, 동일한 완충액으로 평형화시킨 100㎖ 의 DEAE-셀룰로파인 A-800 (생화학공업사 제조) 의 컬럼에 넣고, 동일한 완충액으로 세정한 후, 0.1M 에서 0.4M 의 염화나트륨의 농도구배에 의해 용출시켜 활성 분획을 수합하였다. 수득된 활성 분획에 4M 이 되도록 염화나트륨을 첨가하고, 4M 의 염화나트륨을 함유하는 10mM 의 트리스-염산 완충액 (pH 8.0) 으로 평형화시킨 20㎖ 의 페닐-셀룰로파인 (생화학공업사 제조) 의 컬럼에 넣고, 동일한 완충액으로 세정한 후, 4M 내지 1M 의 염화나트륨의 농도구배에 의해 용출시킨 후, 다시 1M 의 염화나트륨을 함유하는 10mM 의 트리스-염산 완충액 (pH 8.0) 으로 충분히 용출시켜 활성 분획을 수합하였다. 수득된 활성 분획에 3M 이 되도록 염화나트륨을 첨가하고, 3M 의 염화나트륨을 함유하는 10mM 의 트리스-염산 완충액 (pH 8.0) 으로 평형화시킨 10㎖ 의 페닐-셀룰로파인 (생화학공업사 제조) 의 컬럼에 넣고, 동일한 완충액으로 세정한 후, 3M 내지 0.5M 의 염화나트륨의 농도구배에 의해 용출시킨 후, 다시 0.5M 의 염화나트륨을 함유하는 10mM 의 트리스-염산 완충액 (pH 8.0) 으로 충분히 용출시켜 활성 분획을 수합하였다. 이와 같이 하여 수득된 정제효소를 G-푸코이단 분해효소로 사용하였다.
(4) 제조예 4-(2) 에 기재된 G-푸코이단에 상기 정제 G-푸코이단 분해효소를 작용시켜 저분자화물을 제조하였다. 즉, 1.94g 의 G-푸코이단을 0.2M 의 염화나트륨을 함유하는 25mM 트리스-염산 완충액 (pH 8.0) 에 용해시킨 후, 186mU 의 G-푸코이단 분해효소를 첨가하여 25℃ 에서 6 일간 반응시켰다. 반응액을 증발 기로 80㎖ 로 농축하고, 셀룰로파인 GCL-1000 (생화학공업사 제조) 의 컬럼 (4 ×90㎝) 에 의한 분자량 분획을 실시하였다. 분자량 15,000 이하의 분획을 수합하여 G-푸코이단 효소 소화물 분획으로 하였다.
(5) 상기 G-푸코이단 효소 소화물 분획을 증발기로 500㎖ 로 농축한 후, 전기투석장치에 의해 탈염시키고, 미리 10mM 의 염화나트륨을 함유하는 10mM 의 이미다졸-염산 완충액 (pH 8) 으로 평형화시킨 1ℓ의 DEAE-셀룰로파인 A-800 (생화학공업사 제조) 의 컬럼에 넣고, 동일 완충액으로 세정한 후, 10mM 내지 900mM 의 염화나트륨의 농도구배에 의해 용출시켰다. 용출분획은 61㎖ 씩 수합하고, 각각의 당 함량을 페놀-황산법으로 측정하였다. 270mM 부근의 염화나트륨으로 용출되는 분획이 당 함량의 피크를 형성하고 있었기 때문에, 그것을 수합하여 270mM 용출분획 (나) 으로 하였다.
또한 상기 270mM 용출분획 (나) 에 관해서는 150mM 의 염화나트륨을 함유하는 10mM 의 이미다졸-염산 완충액 (pH 8) 과 동일한 전도도가 되도록 물을 첨가하고, 미리 150mM 의 염화나트륨을 함유하는 10mM 의 이미다졸-염산 완충액 (pH 8) 으로 평형화시킨 200㎖ 의 DEAE-셀룰로파인 A-800 (생화학공업사 제조) 의 컬럼에 넣고, 동일 완충액으로 세정한 후, 150mM 에서 300mM 의 염화나트륨의 농도구배에 의해 용출시켰다. 용출분획은 12㎖ 씩 수합하고, 각각의 당 함량을 페놀-황산법으로 측정하였다. 160mM 에서 180mM 부근의 염화나트륨으로 용출되는 분획을 수합하여, 스피드 백 (SAVANT Instruments Inc.) 으로 2㎖ 로 농축한 후, 미리 10% 의 에탄올로 평형화시킨 200㎖ 의 셀룰로파인 GCL-25 (생화학공업사 제조) 의 컬럼 에 넣고, 동일 용액으로 용출시켰다. 용출분획은 2㎖ 씩 수합하고, 각각의 당 함량을 페놀-황산법으로 측정하였다. 당 함량이 피크를 형성하고 있는 분획을 수합하여 (D) 로 하였다.
상기 분획 (D) 에 대해 전기투석장치로의 탈염 후, 동결건조시켜 당 조성 및 질량을 분석하였다. 또한 정법에 의해 중수로 치환한 후 NMR 분석에 의한 구조해석을 하였다.
(D) 의 물성
당 조성 L-푸코오스 : D-갈락토오스 ＝ 2 : 4 (몰비)
황산기 5 분자
그리고, 1H-NMR 에 있어서의 피크의 귀속 번호는 하기 화학식 Ⅴ와 같다. 이하, 이 화합물을 6-5SFd-G 라고 칭한다.
제조예 5
제조예 3-(2) 에서 제조한 황산화 다당 120g 을 20mM 의 염화칼슘, 300mM 의 염화나트륨, 10% 의 에탄올, 및 10U 의 제조예 3-(1) 에서 제조한 F-푸코이단 분해효소를 함유하는 8ℓ의 20mM 이미다졸 완충액 (pH 7.5) 중에 현탁시켜 25℃ 에서 3 일간 교반하고, 배제분자량 100,000 의 홀로파이버를 장착시킨 한외여과장치를 사용하여 상기 완충액을 첨가하면서 한외여과하였다.
한외여과내 용액에 제조예 4-(2) 에 기재된 U-푸코이단 분해효소를 첨가하여 25℃ 에서 2 일간 교반하고, 배제분자량 100,000 의 홀로파이버를 장착시킨 한외여과를 실시하여, 물을 첨가하면서 한외여과하였다.
여과액을 모아 증발기로 1.5ℓ로 농축한 후, 탈염장치에 의해 완전히 탈염시 키고, 미리 30mM 의 염화나트륨을 함유하는 5mM 의 이미다졸염산 완충액 (pH 6.5) 으로 평형화시킨 3ℓ의 DEAE-셀룰로파인 A-800 의 컬럼에 넣고 6ℓ의 동일 완충액으로 세정한 후, 30mM 내지 500mM 의 염화나트륨의 농도구배에 의한 용출을 실시하였다. 용출에 필요한 액량은 48ℓ였다. 용출액은 180㎖ 씩 수합하여 그 당함량을 페놀-황산법에 의해 측정하였다. 또, 232㎚ 에서의 흡광도도 동시에 측정하였다. 130mM 내지 170mM 의 염화나트륨 용출분획이 하나의 피크를 형성하였기 때문에, 이들 분획을 모아 탈염장치에 의해 탈염시킨 후, 동결건조시켜 5.85g 의 올리고당을 수득하였다. 이 올리고당은 질량분석에 의해 분자량 1128 이며 NMR 분석에 의해 하기 화학식 Ⅵ으로 표시되는 화합물임을 확인하였다. 이하, 이 화합물을 6-2SFd-U 라고 칭한다.
제조예 6
(1) D-(+)-글루코오스 200㎎ (1.1m㏖) 을 피리딘 10㎖ 에 용해시키고, 실온 에서 피리딘 술퍼 트리옥시드 복합체 (Pyr·SO3: 토쿄카세이) 1.05g (6.6m㏖) 을 첨가한 후, 실온에서 수분간, 다시 60℃ 에서 1 시간 교반하였다. 반응액을 물로 희석하고, 포화 수산화바륨 수용액으로 pH 를 중성 부근으로 조정한 후, 감압하에 건조 고체화시켰다. 수득된 농축물에 다시 물을 첨가하여 다시 감압하에 건조 고체화시켰다. 이 조작을 한번 더 반복하였다. 수득된 농축물에 소량의 물을 첨가하여 원심 분리로 황산화 바륨의 침전을 제거하고, 수득된 상층액을 양이온 교환컬럼 [앰버라이트 IRA-120 (Na+) (오르가노)] 에 이용하였다. 그 결과 수득된컬럼 통과 분획을 감압농축하여 황산화 D-(+)-글루코오스나트륨염 700㎎ 을 제조하였다.
(2) L-푸코오스 500㎎ (3.05m㏖) 을 피리딘 10㎖ 에 용해시키고, 실온에서 Pyr·SO3 2.33g (14.6m㏖) 을 첨가한 후, 실온에서 수분간, 다시 60℃ 에서 1 시간 교반하고, 이하 제조예 6-(1) 과 동일한 조작으로 황산화 푸코오스나트륨염을 수득하였다.
실시예 1 항원 특이적 세포 상해 활성이 유지된 CTL 의 계속 배양 방법
실시예 1-1
(1) PBMC 의 분리 및 보존
HLA-A24 또는 A2.1 을 보유한 정상인이 제공한 혈액으로부터 성분 채혈을 실시한 후, 채혈액을 PBS(-) 로 2 배 희석하고, Ficoll-paque (파마시아사 제조) 상에 중층시킨 후 500g ×20 분 동안 원심하였다. 중간층의 말초혈 단핵세포 (PBMC) 를 피펫으로 회수, 세정하였다. 채취한 PBMC 를 90% FCS (JRH 바이오사이언스사 제조)/10% 디메틸술폭시드 (SIGMA 사 제조) 로 이루어지는 보존액에 현탁시키고, 액체 질소 중에서 보존하였다. CTL 유도시에는 이들 보존 PBMC 를 37℃ 수욕 중에서 급속 융해시키고, 10㎍/㎖ DNase (Calbiochem 사 제조) 를 함유하는 RPMI1640 배지 (Bio Whittaker 사 제조) 에서 세정한 후, 트리판블루염색법으로 생세포수를 산출하여 각 실험에 이용하였다.
(3) 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 의 유도
항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 의 유도는 Bednarek 등의 방법 (Bednarek M. A. 등, (1991) J. Immunology. 147 4047-4053) 을 일부 개변하여 실시하였다. 즉, 5% 인간 AB 형 혈청, 0.1mM 비필수아미노산, 1mM 피루브산나트륨, 2mM L-글루타민 (모두 Bio Whittaker 사 제조), 10mM HEPES (나카라이텍스사 제조), 1% 스트렙토마이신-페니실린 (기브코 BRL 사 제조) 을 함유하는 RPMI1640 배지 (Bio Whittaker 사 제조) (이하 5HRPMI 로 약칭함) 에 4 ×106 세포/㎖ 가 되도록 실시예 1-1-(1) 에서 제조한 PBMC 를 현탁시킨 후, 24 웰 세포배양 플레이트 (Falcon 사 제조) 에 1㎖/웰씩 뿌리고, 5% CO2 습식 인큐베이터 내에서 37℃ 에서 1.5 시간 인큐베이트하여 플라스틱 접착성 단구를 분리하였다. 그 후, 비접착성의 세포를 RPMI1640 배지를 사용하여 회수하고, 리스폰더 세포 (responder cell)로 빙상 보존하였다. 분리된 단구에는 항원 펩티드로서 인플루엔자 바이러스 단백질 유래 에피토프 펩티드 [서열목록의 서열번호: 1 에 기재된 뉴클레오프로테인 유래 HLA A24 결합성 펩티드 (FluNPA24) RFYIQMCTEL 또는 서열목록의 서열번호: 2 에 기재된 매트릭스프로테인 유래 HLA A2.1 결합성 펩티드 (FluMPA2.1) GILGFVFTL] 5㎍/㎖ 및 β2 마이크로 글로불린 (스크립스사 제조) 1㎍/㎖ 를 함유하는 5HRPMI 를 0.5㎖ 씩 첨가하고, 2 시간 실온에서 인큐베이트한 후, X 선 조사 (5500R) 하여 항원제시세포로 하였다. 각 웰에서 펩티드액을 흡인 제거하고, 웰을 RPMI1640 배지를 사용하여 세정한 후, 빙상 보존한 리스폰더 세포를 1∼2 ×106 세포/㎖ 가 되도록 5HRPMI 에 현탁시켜 1㎖/웰씩 항원제시세포 상에 첨가하였다. 이 때, 시료를 최종농도 10㎍/㎖ 가 되도록 첨가하였다. 대조로서 시료를 첨가하지 않는 군을 설정하였다. 시료로는 제조예 1 에서 제조한 개다시마 유래 푸코이단을 사용하였다. 플레이트를 5% CO2 중, 37℃ 에서 배양하였다. 배양개시후 2 일째에 IL-2 (시오노기제약사 제조) 60U/㎖ 와 10㎍/㎖ 의 최초로 첨가한 시료와 동일 시료를 함유하는 5HRPMI 1㎖ (대조는 IL-2 만 함유) 를 각 웰에 첨가하고, 또 5 일째에는 배양 상층액을 절반 제거후, 동일한 IL-2 및 시료함유 배지 (대조는 IL-2 만 함유) 를 1㎖ 씩 첨가하였다. 7 일째에 상기와 동일하게 하여 항원제시세포를 제조한 후, 1 주간 배양한 리스폰더 세포를 1∼2 ×106 세포/㎖ 가 되도록 5HRPMI 에 현탁시키고, 상기와 동일하게 하여 제조한 항원제시세포 상에 1㎖/웰씩 첨가하여 재자극하였다. 이 때, 시료를 최종농도 10㎍/㎖ 가 되도록 첨가하였다 (대조는 무첨가). 재자극후 2 일째에 IL-2 60U/㎖ 및 10㎍/㎖ 의 시료를 함유하는 (대조는 IL-2 만 함유) 5HRPMI 1㎖ 를 각 웰에 첨가, 또 5 일째에는 배양 상층액을 절반 제거후, 제거전과 동일한 내용의 배지를 1㎖ 씩 첨가하고, 다시 배양을 2 일동안 계속하여 CTL 을 유도하였다.
(3) CTL 세포 상해 활성의 측정
실시예 1-1-(2) 에서 제조한 유도개시후 14 일째의 CTL 의 세포 상해 활성은 Calcein-AM 을 사용한 세포 상해 활성 측정법 (Rudolf Lichtenfels 등, J. immunological methods 172 (1994) 227-239) 으로 평가하였다.
하룻밤 동안 에피토프 펩티드와 공배양, 또는 에피토프 펩티드 비존재하에서 배양한 HLA-A24 또는 A2.1 유지 EBV 트랜스폼 B 세포 (TISI 또는 221A2.1) 를 1 ×106 세포/㎖ 가 되도록 5% FCS (JRH 바이오사이언스사 제조) 를 함유하는 RPMI1640 배지에 현탁시킨 후, 최종농도 25μM 이 되도록 Calcein-AM (도타이트사 제조) 을 첨가하여 37℃ 에서 1 시간 배양하였다. 세포를 Calcein-AM 을 함유하지 않는 배지에서 세정한 후, 20 배량의 K562 세포와 혼합하여 Calcein 표지 표적세포로 하였다. 또한, K562 세포는 리스폰더 세포 내로 혼입되는 NK 세포에 의한 비특이적 상해활성을 배제하기 위해 사용하였다.
실시예 1-1-(2) 에서 제조한 메모리 CTL 을 이펙터(effecter) 세포로서 1 ×105∼9 ×106 세포/㎖ 가 되도록 5HRPMI 로 단계적으로 희석한 후, 96 웰 세포배양 플레이트의 각 웰에 100㎕/웰씩 각각 분주하고, 이것에 1 ×105 세포/㎖ 로 제조한 Calcein 표지 표적세포를 100㎕/웰씩 첨가하였다. 상기 세포현탁액이 들어 있는 플레이트를 400g ×1 분간 원심후, 37℃ 의 습식 CO2 인큐베이터 내 에서 4 시간 인큐베이트하였다.
4 시간후, 각 웰에서 배양 상층액 100㎕ 를 채취하여 형광 플레이트 리더 (485㎚/538㎚) 에 의해 배양 상층액 중에 방출된 Calcein 량을 측정하였다. 특이적 세포 상해 활성은 이하의 식 1 에 따라 산출하였다.
[(각 웰의 측정값-최소 방출량)/(최대 방출량-최소 방출량)] ×100
상기 식에서 최소 방출량은 표적세포 및 K562 세포만 함유하는 웰의 Calcein방출량으로 표적세포로부터의 Calcein 자연 방출량을 나타낸다. 또, 최대 방출량은 표적세포에 계면활성제 트리톤 X-100 (나카라이텍스사 제조) 을 첨가하여 세포를 완전히 파괴했을 때의 Calcein 방출량을 나타내고 있다. 그 결과, 유도직후에 특이적 세포 상해 활성은 유도되었으나, 유도시의 시료첨가의 유무에 의한 세포 상해 활성의 차이는 없었다.
(4) CTL 의 계속 배양
실시예 1-1-(2) 에서 제조하고, 실시예 1-1-(3) 에서 에피토프 펩티드 특이적 세포 상해 활성을 확인한 CTL 을 5HRPMI 로 세정한 후, 30U/㎖ 의 IL-2 를 함유하는 5HRPMI 중에서 다시 10∼14 일간 계속적으로 배양하였다. 그 때, CTL 유도시에 시료를 첨가한 군에는 CTL 유도시와 동일한 시료를 동일 농도로 배지에 첨가하여 배양하였다. 또, CTL 유도시에 시료를 첨가하지 않은 대조는 계속해서 시료를 첨가하지 않고 배양을 실시하였다. 이 사이에 펩티드에 의한 자극은 전혀 부가하지 않고, 2∼3 일 마다 배양 상층액을 절반 제거후, 제거전과 동일한 조성의 배지를 1㎖ 씩 첨가하였다. 계속 배양후, 실시예 1-1-(3) 과 동일한 방법으로 CTL 의 특이적 세포 상해 활성을 측정하였다. 측정결과를 표 1 에 나타낸다. 또한, 표중에서 E/T 비는 표적세포수 (T) 에 대한 이펙터 세포수 (E) 의 비를, 펩티드 부가는 표적세포에 대한 펩티드 부가의 유무를 의미한다.
| 펩티드 | 시료 | 시료첨가 | 펩티드 부가 | 세포 상해 활성(%) | |||
| CTL 유도시 | IL-2 배양시 | E/T 비 | |||||
| 1 | 3 | 10 | |||||
| FluMPA 2.1 | 대조 | － － | － － | － ＋ | N.T. N.T. | N.T. N.T. | 0 0 |
| E/T 비 | |||||||
| 0.7 | 2.2 | 7 | |||||
| 개다시마 유래 푸코이단 | ＋ ＋ | ＋ ＋ | － ＋ | 0 22.9 | 0 52.7 | 0 80.6 | |
| FluNPA 24 | E/T 비 | ||||||
| 1 | 3 | 10 | |||||
| 대조 | － － | － － | － ＋ | 0 5.7 | 0 21 | 11.8 65.1 | |
| 개다시마 유래 푸코이단 | ＋ ＋ | ＋ ＋ | － ＋ | 1.6 28.6 | 0 66.9 | 7.5 96.9 | |
(N.T. 는 평가하지 않은 것을 나타냄)
그 결과, CTL 유도시와 계속 배양시의 양 단계에서 시료를 첨가한 군에서는 10∼14 일간의 계속 배양후에도 그 활성을 높게 유지하였다. 그러나, 한편 CTL 유도중 및 계속 배양중 모두 개다시마 유래 푸코이단을 첨가하지 않은 군 (대조) 에서는 그 활성은 명백히 저하되었다.
이상의 결과를 통해, 개다시마 유래 푸코이단을 CTL 유도시와 계속 배양시에 첨가함으로써, 계속 배양시에 펩티드 등에 의한 자극을 부가하지 않고 항원 특이적인 세포 상해 활성을 유지한 상태에서 CTL 의 계속 배양이 가능해짐이 판명되었다.
실시예 1-2
(1) 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 의 유도
실시예 1-1-(1) 과 동일한 방법으로 PBMC 의 분리를 실시하고, 보존한 PBMC 를 사용하고, 실시예 1-1-(2) 와 동일한 방법으로 항 인플루엔자 바이러스 메모리-CTL 을 유도하였다. 이 때, 시료로서 제조예 1 에서 제조한 개다시마 유래 푸코이단, 제조예 2 에서 제조한 Ⅲ 분획 (F-푸코이단) 과 Ⅱ 분획 (U-푸코이단), 제조예 3 에서 제조한 7-12SFd-F 를 각각 최종농도 10㎍/㎖ 가 되도록 배지에 첨가하였다. 대조로서 시료를 첨가하지 않는 군을 설정하였다.
이렇게 하여 제조한 유도개시후 14 일째의 CTL 의 세포 상해 활성은 실시예 1-1-(3) 과 동일한 방법으로 평가하였다. 그 결과, 유도직후에 항원 특이적 세포 상해 활성은 유도되었으나, 유도시의 시료첨가 유무, 시료의 차이에 의한 세포 상해 활성의 차이는 없었다.
(2) CTL 의 계속 배양
실시예 1-2-(1) 에서 제조한 CTL 을 실시예 1-1-(4) 와 동일한 방법으로 다시 10∼14 일간 계속적으로 배양하였다. 이 때, 시료로서 실시예 1-2-(1) 에서 CTL 유도시에 첨가한 시료를 각각 최종농도 10㎍/㎖ 가 되도록 배지에 첨가하였다. 또, CTL 유도시에 시료를 첨가하지 않은 대조는 계속해서 시료를 첨가하지 않고 배양하였다. 계속 배양후, 실시예 1-1-(3) 과 동일한 방법에 의해 CTL 의 특이적 세포 상해 활성을 측정하였다. 측정결과를 표 2 에 나타낸다.
| 펩티드 | 시료 | 시료첨가 | 펩티드 부가 | 세포 상해 활성(%) | |||
| CTL 유도시 | IL-2 배양시 | E/T 비 | |||||
| 3 | 10 | 30 | |||||
| FluMPA 2.1 | 대조 | － － | － － | － ＋ | 4.6 11.0 | 5.0 23.4 | 13.1 47.9 |
| 개다시마 유래 푸코이단 | ＋ ＋ | ＋ ＋ | － ＋ | 5.9 53.3 | 4.9 86.0 | 12.3 100.9 | |
| F-푸코이단 | ＋ ＋ | ＋ ＋ | － ＋ | 2.1 41.1 | 2.4 66.8 | 7.2 82.8 | |
| U-푸코이단 | ＋ ＋ | ＋ ＋ | － ＋ | 1.6 46.3 | 4.1 75.2 | 9.2 92.3 | |
| 7-12SFd－F | ＋ ＋ | ＋ ＋ | － ＋ | 0.3 12.0 | 2.2 37.9 | 11.7 60.7 | |
그 결과, CTL 유도시와 계속 배양시의 양 단계에서 이들 시료를 첨가한 군은 모든 군에서 10∼14 일간의 계속 배양후에도 그 활성을 높게 유지하였다. 그러나, 한편 CTL 유도시 및 계속 배양시 모두 시료를 첨가하지 않은 군 (대조) 에서는 그 활성은 명백히 저하되었다.
이상의 결과를 통해, 개다시마 유래 푸코이단, F-푸코이단, U-푸코이단 또는 7-12SFd-F 를 CTL 유도시와 계속 배양시에 첨가함으로써, 펩티드 등에 의한 자극을 부가하지 않고 항원 특이적인 세포 상해 활성을 유지한 상태에서 CTL 의 계속 배양이 가능해짐이 판명되었다.
실시예 1-3
(1) 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 의 유도
실시예 1-1-(1) 에 기재된 방법으로 분리, 보존한 PBMC 를 사용하고, 실시예 1-1-(2) 와 동일한 방법으로 항 인플루엔자 바이러스 메모리-CTL 을 유도하였다. 이 때, 시료로서 L.M.W. 헤파린 (상품명 Ardeparin sodium; CELSUS LABORATORIES INC. 사 제조), 비팽윤성 알긴산 (와코쥰야쿠사 제조), 팽윤성 알긴산 (와코쥰야쿠사 제조), 제조예 6-(1) 에서 제조한 황산화 글루코오스나트륨염, 콘드로이틴 황산 A 나트륨 (생화학공업사 제조) 을 최종농도 10㎍/㎖ 가 되도록 배지에 첨가하였다. 또, 대조로서 시료를 첨가하지 않는 군을 설정하였다. 항원 펩티드에는 FluMPA2.1 을 사용하였다.
이렇게 하여 제조한 유도개시후 14 일째의 CTL 의 세포 상해 활성은 실시예 1-1-(3) 과 동일한 방법으로 평가하였다. 그 결과, 유도직후에 특이적 세포 상해 활성은 유도되었으나, 유도시의 시료첨가 유무, 시료의 차이에 의한 세포 상해 활성의 차이는 없었다.
(2) CTL 의 계속 배양
실시예 1-3-(1) 에서 제조한 CTL 을 실시예 1-1-(4) 와 동일한 방법으로 다시 10∼14 일간 계속적으로 배양하였다. 이 때, 실시예 1-3-(1) 에서 CTL 유도시에 첨가한 시료와 동일한 시료를 각각 최종농도 10㎍/㎖ 가 되도록 배지에 첨가하였다. 또, CTL 유도시에 시료를 첨가하지 않은 대조는 계속해서 시료를 첨가하지 않고 배양하였다. 계속 배양후, 실시예 1-1-(3) 과 동일한 방법에 의해 CTL 의 특이적 세포 상해 활성을 측정하였다. 측정결과를 표 3 에 나타낸다.
| 시료 | 시료첨가 | 펩티드 부가 | 세포 상해 활성 (%) | |||
| CTL 유도시 | IL-2 배양시 | E/T 비 | ||||
| 1 | 3 | 10 | ||||
| 대조 | － － | － － | － ＋ | 17.4 28.0 | 26.5 43.8 | 35.2 63.7 |
| L.M.W. 헤파린 | ＋ ＋ | ＋ ＋ | － ＋ | 11.7 49.0 | 14.2 71.7 | |
| 비팽윤성 알긴산 | ＋ ＋ | ＋ ＋ | － ＋ | 12.9 28.1 | 24.8 52.7 | 14.0 77.1 |
| 팽윤성 알긴산 | ＋ ＋ | ＋ ＋ | － ＋ | 12.5 39.8 | 26.5 75.3 | 22.2 86.9 |
| 황산화 글루코오스 | ＋ ＋ | ＋ ＋ | － ＋ | 14.3 34.0 | 27.8 67.8 | 21.0 92.1 |
| 콘드로이틴 황산 A | ＋ ＋ | ＋ ＋ | － ＋ | 21.1 75.5 | ||
그 결과, CTL 유도시와 계속 배양시의 양 단계에서 이들 시료를 첨가한 군은 모든 군에서 계속 배양후에도 그 활성을 높게 유지하였다. 그러나, 한편 CTL 유도시 및 계속 배양시 모두 시료를 첨가하지 않은 군 (대조) 에서는 그 활성은 명백히 저하되었다.
이상의 결과를 통해, 푸코이단과 마찬가지로 황산화 다당인 헤파린, 콘드로이틴 황산 A 나트륨을 CTL 유도시와 계속 배양시에 첨가함으로써, 펩티드 등에 의한 자극을 부가하지 않고 항원 특이적인 세포 상해 활성을 유지한 상태에서 CTL 의 계속 배양이 가능해짐이 판명되었다. 즉, 푸코이단 이외의 황산화 다당에도 동일한 활성이 있음이 판명되었다. 또한, 황산화 다당 이외에도, 황산화 단당인 황산화 글루코오스나트륨염에도 푸코이단과 같은 활성이 있기 때문에, 황산화된 당은 그 크기에는 관계없이 세포 상해 활성 유지효과를 갖고 있음이 판명되었다. 한편, 황산화 당이 아닌 비팽윤성 및 팽윤성 알긴산에도 푸코이단과 같은 활성이 있음이 나타내어짐으로써, 상기 활성은 황산화된 당에 특유한 것이 아니라 산성 당이면 당의 종류에는 영향을 받지 않고 세포 상해 활성 유지효과가 발현됨이 판명되었다.
실시예 1-4
(1) 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 의 유도
실시예 1-1-(1) 에 기재된 방법으로 분리, 보존한 PBMC 를 사용하고, 실시예 1-1-(2) 와 동일한 방법으로 항 인플루엔자 바이러스 메모리-CTL 을 유도하였다. 이 때, 시료로서 펙틴산 (나카라이텍스사 제조), 제조예 6-(2) 에서 제조한 황산화 푸코오스나트륨염, 콘드로이틴 황산 B 나트륨 (생화학공업사 제조) 을 각각 10㎍/㎖ 가 되도록 첨가하였다. 대조로서 시료를 첨가하지 않는 군을 설정하였다. 항원 펩티드에는 FluMPA2.1 을 사용하였다.
이렇게 하여 제조한 유도개시후 14 일째의 CTL 의 세포 상해 활성은 실시예 1-1-(3) 과 동일한 방법으로 평가하였다. 그 결과, 유도직후에 특이적 세포 상해 활성은 유도되었으나, 유도시의 시료첨가 유무, 시료의 차이에 의한 세포 상해 활성의 차이는 없었다.
(2) CTL 의 계속 배양
실시예 1-4-(1) 에서 제조한 CTL 을 실시예 1-1-(4) 와 동일한 방법으로 다시 10∼14 일간 계속적으로 배양하였다. 이 때, 실시예 1-4-(1) 에서 CTL 유도시에 첨가한 시료와 동일한 시료를 각각 최종농도 10㎍/㎖ 가 되도록 배지에 첨가 하였다. 또, CTL 유도시에 시료를 첨가하지 않은 대조는 계속해서 시료를 첨가하지 않고 배양하였다. 계속 배양후, 실시예 1-1-(3) 과 동일한 방법에 의해 CTL 의 특이적 세포 상해 활성을 측정하였다. 측정결과를 표 4 에 나타낸다.
| 시료 | 시료첨가 | 펩티드 부가 | 세포 상해 활성 (%) | |||
| CTL 유도시 | IL-2 배양시 | E/T 비 | ||||
| 2.5 | 5 | 10 | ||||
| 대조 | － － | － － | － ＋ | 0.5 10.9 | 4.0 19.7 | N.T. N.T. |
| 펙틴산 | ＋ ＋ | ＋ ＋ | － ＋ | 3.4 32.0 | 5.5 49.4 | N.T. N.T. |
| 황산화 푸코오스 | ＋ ＋ | ＋ ＋ | － ＋ | 0 17.6 | 0 36.6 | 0.2 55.3 |
| 콘드로이틴 황산 B | ＋ ＋ | ＋ ＋ | － ＋ | 0 28.1 | 0 38.1 | 0.8 60.7 |
(N.T. 는 평가하지 않은 것을 나타냄)
그 결과, CTL 유도시와 계속 배양시의 양 단계에서 이들 시료를 첨가한 군은 모든 군에서 계속 배양후에도 그 활성을 높게 유지하였다. 그러나, CTL 유도시 및 계속 배양시 모두 시료를 첨가하지 않은 군 (대조) 에서는 그 활성은 명백히 저하되었다.
이상의 결과를 통해, 황산화 다당인 콘드로이틴 황산 B 나트륨, 황산화 단당인 황산화 푸코오스나트륨염, 산성 다당인 펙틴산이 모두 세포 상해 활성 유지효과를 갖고 있음이 판명되었다.
실시예 1-5
(1) 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 의 유도
실시예 1-1-(1) 에 기재된 방법으로 분리, 보존한 PBMC 를 사용하고, 실시예 1-1-(2) 와 동일한 방법으로 항 인플루엔자 바이러스 메모리-CTL 을 유도하였다. 이 때, 상기 실시예에 사용된 바와 같은 시료는 전혀 첨가하지 않았다. 항원 펩티드에는 FluMPA2.1 을 사용하였다.
이렇게 하여 제조한 유도개시후 14 일째의 CTL 의 세포 상해 활성을 실시예 1-1-(3) 과 동일한 방법으로 평가하였다.
(2) CTL 의 계속 배양
실시예 1-5-(1) 에서 제조한 CTL 을 실시예 1-1-(4) 와 동일한 방법으로 다시 10∼14 일간 계속적으로 배양하였다. 이 때, 시료로서 제조예 1 에서 제조한 개다시마 유래 푸코이단, 제조예 2 에서 제조한 Ⅲ 분획 (F-푸코이단), Ⅱ 분획 (U-푸코이단), L.M.W. 헤파린 (상품명 Ardeparin sodium; CELSUS LABORATORIES INC. 사 제조), 펙틴산 (나카라이텍스사 제조), 비팽윤성 알긴산 (와코쥰야쿠사 제조), 팽윤성 알긴산 (와코쥰야쿠사 제조), 제조예 6-(1) 에서 제조한 황산화 글루코오스나트륨염, 제조예 6-(2) 에서 제조한 황산화 푸코오스나트륨염, 콘드로이틴 황산 B 나트륨 (생화학공업사 제조) 을 각각 최종농도 10㎍/㎖ 가 되도록 첨가하였다. 계속 배양후, 실시예 1-1-(3) 과 동일한 방법에 의해 CTL 의 특이적 세포 상해 활성을 측정하였다. 측정결과를 표 5 와 6 에 나타낸다.
| 시료 | 시료첨가 | 펩티드 부가 | 세포 상해 활성 (%) | |||
| CTL 유도시 | IL-2 배양시 | E/T 비 | ||||
| 1 | 3 | 10 | ||||
| 대조 | － － | － － | － ＋ | 0 5.6 | 1.6 7.0 | 4.9 13.7 |
| 개다시마 유래 푸코이단 | － － | ＋ ＋ | － ＋ | 0 7.0 | 0 11.0 | 3.1 27.9 |
| F-푸코이단 | － － | ＋ ＋ | － ＋ | 0 7.4 | 1.6 20.4 | |
| U-푸코이단 | － － | ＋ ＋ | － ＋ | 0 7.6 | 0 17.5 | |
| L.M.W. 헤파린 | － － | ＋ ＋ | － ＋ | 0 18.3 | ||
| 펙틴산 | － － | ＋ ＋ | － ＋ | 0 16.5 | ||
| 시료 | 시료첨가 | 펩티드 부가 | 세포 상해 활성 (%) | |||
| CTL 유도시 | IL-2 배양시 | E/T 비 | ||||
| 1 | 3 | 10 | ||||
| 대조 | － － | － － | － ＋ | 0 5.6 | 1.6 7.0 | 4.9 13.7 |
| 비팽윤성 알긴산 | － － | ＋ ＋ | － ＋ | 3.9 9.5 | 4.6 13.8 | 6.1 24.9 |
| 팽윤성 알긴산 | － － | ＋ ＋ | － ＋ | 3.3 12.6 | 1.3 18.7 | 8.8 35.6 |
| 황산화 글루코오스 | － － | ＋ ＋ | － ＋ | 2.2 8.1 | 2.4 17.8 | 7.5 32.5 |
| 황산화 푸코오스 | － － | ＋ ＋ | － ＋ | 0 8.9 | 0.4 12.6 | 3.3 26.4 |
| 콘드로이틴 황산 B | － － | ＋ ＋ | － ＋ | N.T. N.T. | N.T. N.T. | 4.6 24.0 |
(N.T. 는 평가하지 않은 것을 나타냄)
그 결과, CTL 유도시에 시료를 첨가하지 않아도 계속 배양의 단계에서 상기 시료를 첨가한 군은 모든 군에서 계속 배양후에도 그 활성을 높게 유지하였다. 그러나, 계속 배양중에 시료를 첨가하지 않은 군 (대조) 에서는 그 활성은 명백히 저하되었다.
이상의 결과를 통해, 개다시마 유래 푸코이단, F-푸코이단, U-푸코이단, L.M.W. 헤파린, 펙틴산 (나카라이텍스사 제조), 비팽윤성 알긴산, 팽윤성 알긴산, 황산화 글루코오스나트륨염, 황산화 푸코오스나트륨염, 콘드로이틴 황산 B 나트륨을 계속 배양시에 첨가함으로써, 펩티드 등에 의한 자극을 부가하지 않고 항원 특이적인 세포 상해 활성을 유지한 상태에서 CTL 의 계속 배양이 가능해짐이 판명되었다. 즉, 계속 배양시에만 산성 당을 첨가함으로써 항원 특이적인 세포 상해 활성을 유지한 CTL 을 계속 배양하는 것이 가능해짐이 판명되었다.
실시예 1-6
(1) 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 의 유도
실시예 1-1-(1) 에 기재된 방법으로 분리, 보존한 PBMC 를 사용하고, 실시예 1-1-(2) 와 동일한 방법으로 항 인플루엔자 바이러스 메모리-CTL 을 유도하였다. 이 때, 시료로서 제조예 1 에서 제조한 개다시마 유래 푸코이단, 제조예 2 에서 제조한 Ⅲ 분획 (F-푸코이단), Ⅱ 분획 (U-푸코이단) 을 최종농도 10㎍/㎖ 가 되도록 배지에 첨가하였다. 항원 펩티드에는 FluMPA2.1 을 사용하였다.
이렇게 하여 제조한 유도개시후 14 일째의 CTL 의 세포 상해 활성은 실시예 1-1-(3) 과 동일한 방법으로 평가하였다. 그 결과, 유도직후에 특이적 세포 상해 활성은 유도되었으나, 유도시의 시료첨가 유무, 시료의 차이에 의한 세포 상해 활성의 차이는 없었다.
(2) CTL 의 계속 배양
실시예 1-6-(1) 에서 제조한 CTL 을 실시예 1-1-(4) 와 동일한 방법으로 다시 10∼14 일간 계속적으로 배양하였다. 이 때, 실시예 1-6-(1) 에서 CTL 유도시에 첨가한 시료와 동일한 시료를 각각 최종농도 10㎍/㎖ 가 되도록 배지에 첨가한 군과 첨가하지 않는 군을 설정하였다. 또, CTL 유도시에 시료를 첨가하지 않은 대조는 계속해서 시료를 첨가하지 않고 배양하였다. 계속 배양후, 실시예 1-1-(3) 과 동일한 방법에 의해 CTL 의 특이적 세포 상해 활성을 측정하였다. 측정결과를 표 7 에 나타낸다.
| 시료 | 시료첨가 | 펩티드 부가 | 세포 상해 활성 (%) | |||
| CTL 유도시 | IL-2 배양시 | E/T 비 | ||||
| 2 | 10 | 30 | ||||
| 대조 | － － | － － | － ＋ | 4.6 11.0 | 5.0 23.4 | 13.1 47.9 |
| 개다시마 유래 푸코이단 | ＋ ＋ ＋ ＋ | ＋ ＋ － － | － ＋ － ＋ | 5.9 53.3 0 46.0 | 4.9 86.0 0 78.5 | 12.3 100.9 4.5 98.7 |
| F-푸코이단 | ＋ ＋ ＋ ＋ | ＋ ＋ － － | － ＋ － ＋ | 2.1 41.5 0 37.6 | 2.4 66.8 0 63.5 | 7.2 82.8 3.2 86.3 |
| U-푸코이단 | ＋ ＋ ＋ ＋ | ＋ ＋ － － | － ＋ － ＋ | 1.6 46.3 0 43.5 | 4.1 75.2 0 71.9 | 9.2 92.3 4.5 91.1 |
그 결과, CTL 유도시에 이들 시료를 첨가한 군에서는 계속 배양시의 시료첨가 유무에 관계없이 계속 배양후에도 그 활성을 높게 유지하였다. 한편, CTL 유도시 및 계속 배양시 모두 이들 시료 (개다시마 유래 푸코이단) 를 첨가하지 않은 군 (대조) 에서는 그 활성은 명백히 저하되었다.
이상의 결과를 통해, 개다시마 유래 푸코이단 등의 산성 당을 CTL 유도시에 첨가하고 계속 배양시에는 첨가하지 않는 경우에도, 펩티드 등에 의한 자극을 부가하지 않고 항원 특이적인 세포 상해 활성을 유지한 상태에서 CTL 의 계속 배양이 가능해짐이 판명되었다.
그리고, CTL 의 유도시와 계속 배양시에 산성 당을 첨가함으로써 CTL 의 특이적 세포 상해 활성을 장기적으로 유지한 상태에서 CTL 을 계속 배양할 수 있음이 판명되었다. 또한, 산성 당을 CTL 의 유도시 또는 계속 배양시 중 어느 한쪽에 첨가하는 것만으로도 CTL 의 특이적 세포 상해 활성을 장기적으로 유지한 상태에서 CTL 을 계속 배양할 수 있음이 판명되었다.
실시예 2 특이적 세포 상해 활성을 유지한 CTL 의 확대 배양
실시예 2-1
(1) 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 의 유도
실시예 1-1-(1) 에 기재된 방법으로 분리, 보존한 PBMC 를 사용하고, 실시예 1-1-(2) 와 동일한 방법으로 항 인플루엔자 바이러스 메모리-CTL 을 유도하였다. 그 때, 시료로서 제조예 1 에서 제조한 개다시마 유래의 푸코이단을 최종농도 10㎍/㎖ 가 되도록 배지에 첨가하였다. 또한, 시료를 첨가하지 않는 군도 설정하였다.
이렇게 하여 제조한 유도개시후 14 일째의 CTL 의 세포 상해 활성은 실시예 1-1-(3) 과 동일한 방법으로 평가하였다. 그 결과, 유도직후에 특이적 세포 상해 활성은 유도되었으나, 유도시의 시료첨가 유무에 의한 세포 상해 활성의 차이는 없었다.
(2) CTL 의 확대 배양
실시예 2-1-(1) 에서 제조한 CTL 을 5HRPMI 에서 세정한 후, 5 ×104 세포/㎖ 로 제조하였다. 한편, 실시예 1-1-(1) 과 동일하게 채취한 HLA-A24 및 A2.1 비유지 동종 PBMC 를 X 선 조사 (3300R) 하고 배지에서 세정한 후 5 ×106 세포/㎖ 로 제조하였다. 이들 CTL (2.5 ×104cells) 과 동종(allogenic) PBMC (1.25 ×107cells) 를 10㎖ 의 5HRPMI 에 현탁시키고, 추가로 최종농도 50ng/㎖ 의 항 CD3 항체 (얀센 쿄와사 제조) 를 첨가하여 12.5㎠ 의 플라스크 (Falcon 사 제조) 에 넣고, 37℃ 의 습식 CO2 인큐베이터 내에서 14 일간 배양하였다. 이 때, 시료로서 최종농도가 10㎍/㎖ 인 개다시마 유래 푸코이단을 첨가하는 군과 첨가하지 않는 군을 설정하였다. 이 사이에 펩티드에 의한 자극은 전혀 부가하지 않고, 배양개시 1 일째에 최종농도 120U/㎖ 의 IL-2 를 첨가하고, 또한 배양개시후 4 일째 이후에는 2∼3 일 마다 배양 상층액을 절반 제거후, IL-2 60U/㎖ 를 함유하는 5HRPMI 5㎖ 를 각 플라스크에 첨가하였다. 이 때, 시료첨가군의 배지에는 동일 농도의 개다시마 유래의 푸코이단을 첨가하였다. 확대 배양 개시후, 14 일째에 실시예 1-1-(3) 과 동일한 방법으로 CTL 의 특이적 세포 상해 활성을 측정하였다. 측 정결과를 표 8 에 나타낸다. 확대 증식률 (×배율) 은 확대 배양후의 세포수를 확대 배양전의 세포수로 나눠 구하였다.
| 펩티드 | 시료 | 시료첨가 | 확대 증식률 | 펩티드 부가 | 세포 상해 활성 (%) | ||||
| CTL 유도시 | 확대 배양시 | E/T 비 | |||||||
| 1 | 3 | 10 | 30 | ||||||
| FluMPA 2.1 | 대조 | － － | － － | ×494 ×494 | － ＋ | 2.5 5.2 | 1.2 14.7 | 2.0 38.8 | 8.4 70.3 |
| 개다시마 유래 푸코이단 | ＋ ＋ ＋ ＋ － － | ＋ ＋ － － ＋ ＋ | ×513 ×513 ×694 ×694 ×488 ×488 | － ＋ － ＋ － ＋ | 1.6 22.2 2.5 21.0 2.1 10.5 | 3.2 47.4 3.2 44.7 2.2 26.4 | 5.4 87.0 7.2 84.2 5.8 62.3 | 7.8 108.3 18.5 102.8 7.8 83.8 | |
| FluNPA 24 | 대조 | － － | － － | ×316 ×316 | － ＋ | 13.0 22.7 | 7.3 50.8 | N.T. N.T. | |
| 개다시마 유래 푸코이단 | ＋ ＋ ＋ ＋ － － | ＋ ＋ － － ＋ ＋ | ×360 ×360 ×338 ×338 ×448 ×448 | － ＋ － ＋ － ＋ | 0 35.7 4.8 48.6 2.9 26.7 | 0 76.7 9.4 85.1 0 76.2 | N.T. N.T. N.T. N.T. N.T. N.T. | ||
(N.T. 는 평가하지 않은 것을 나타냄)
그 결과, CTL 유도시 및 확대 배양시에 개다시마 유래 푸코이단을 첨가한 군에서는 CTL 은 14 일간의 확대 배양후에도 특이적으로 높은 세포 상해 활성을 유지하였다. 한편, CTL 유도시 및 확대 배양시 모두 개다시마 유래 푸코이단을 첨가하지 않은 군에서는 그 활성은 명백히 저하되었다. 또, CTL 유도시에 개다시마 유래 푸코이단을 첨가하지 않고, 항 CD3 항체에 의한 확대 배양시에 개다시마 유래 푸코이단을 첨가한 군, 및 CTL 유도시에 개다시마 유래 푸코이단을 첨가하고, 확대 배양시에는 이것을 첨가하지 않은 군에도 특이적으로 높은 세포 상해 활성을 장기적으로 보존한 상태에서 CTL 을 확대 배양할 수 있었다. 즉, 적어도 CTL 유도시 또는 확대 배양시 중 어느 한쪽에 개다시마 유래 푸코이단을 첨가함으로써, 특이적으로 높은 세포 상해 활성을 장기적으로 유지한 상태에서 CTL 을 확대 배양하는 것이 가능해짐이 판명되었다.
실시예 2-2
(1) 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 의 유도
실시예 1-1-(1)에 기재된 방법으로 분리, 보존한 PBMC 를 사용하고, 실시예 1-1-(2) 와 동일한 방법으로 항 인플루엔자 바이러스 메모리-CTL 을 유도하였다. 이 때, 시료로서 제조예 1 에서 제조한 개다시마 유래 푸코이단, 제조예 2 에서 제조한 Ⅲ 분획 (F-푸코이단), Ⅱ 분획 (U-푸코이단) 을 각각 최종농도 10㎍/㎖ 가 되도록 배지에 첨가하였다. 또한, 시료를 첨가하지 않는 군을 설정하였다. 항원 펩티드에는 FluMPA2.1 을 사용하였다.
이렇게 하여 제조한 유도개시후 14 일째의 CTL 의 세포 상해 활성은 실시예 1-1-(3) 과 동일한 방법으로 평가하였다. 그 결과, 유도직후에 특이적 세포 상해 활성은 유도되었으나, 유도시의 시료첨가 유무, 시료의 차이에 의한 세포 상해 활성의 차이는 없었다.
(2) CTL 의 확대 배양
실시예 2-2-(1) 에서 제조한 CTL 을 사용하고, 실시예 2-1-(2) 와 동일한 방법으로 CTL 을 확대 배양하였다. 이 때, 실시예 2-2-(1) 에서의 CTL 유도시에 첨가한 시료와 동일한 시료를 각각 최종농도 10㎍/㎖ 가 되도록 첨가하는 군과 유도시에 시료를 전혀 첨가하지 않는 군을 설정하였다. 이 사이에 펩티드에 의한 자극은 전혀 부가하지 않고, 배양개시 1 일째에 최종농도 120U/㎖ 의 IL-2 를 첨가하고, 또한 배양개시후 4 일째 이후에는 2∼3 일 마다 배양 상층액을 절반 제거후, IL-2 60U/㎖ 및 시료 10㎍/㎖ 를 함유하는 5HRPMI 5㎖ 를 각 플라스크에 첨가하였다. 단, 시료를 첨가하지 않은 군에서는 배지 교환시에도 시료는 첨가하지 않았다. 확대 배양 개시후, 14 일째에 실시예 1-1-(3) 과 동일한 방법으로 CTL 의 특이적 세포 상해 활성을 측정하였다. 측정결과를 표 9 에 나타낸다.
| 시료 | 시료첨가 | 확대 증식률 | 펩티드 부가 | 세포 상해 활성(%) | |
| CTL 유도시 | 확대 배양시 | E/T 비 | |||
| 10 | |||||
| 대조 | － － | － － | ×332 ×332 | － ＋ | 3.1 59.7 |
| 개다시마 유래 푸코이단 | ＋ ＋ | ＋ ＋ | ×388 ×388 | － ＋ | 2.4 85.2 |
| F-푸코이단 | ＋ ＋ | ＋ ＋ | ×340 ×340 | － ＋ | 2.1 77.7 |
| U-푸코이단 | ＋ ＋ | ＋ ＋ | ×290 ×290 | － ＋ | 1.2 81.6 |
그 결과, CTL 유도시 및 확대 배양시에 이들 시료를 첨가한 군에서는, CTL 은 14 일간의 확대 배양후에도 특이적으로 높은 세포 상해 활성을 유지하였다. 한편, CTL 유도시 및 확대 배양시 모두 이들 시료를 첨가하지 않은 군에서는 그 활성은 명백히 저하되었다. 즉, 푸코이단의 구조, 종류에 관계없이 푸코이단을 CTL 유도시와 확대 배양시에 첨가함으로써, 특이적으로 높은 세포 상해 활성을 장기적으로 유지한 상태에서 CTL 의 확대 배양이 가능해짐이 판명되었다.
실시예 2-3
(1) 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 의 유도
실시예 1-1-(1) 에 기재된 방법으로 분리, 보존한 PBMC 를 사용하고, 실시예 1-1-(2) 와 동일한 방법으로 항 인플루엔자 바이러스 메모리-CTL 을 유도하였다. 이 때, 시료로서 제조예 3 에서 제조한 7-12SFd-F 를 최종농도 10㎍/㎖ 가 되도록 배지에 첨가하였다. 또한, 시료를 첨가하지 않는 군도 설정하였다. 항원 펩티드에는 FluMPA2.1 을 사용하였다.
이렇게 하여 제조한 유도개시후 14 일째의 CTL 의 세포 상해 활성은 실시예 1-1-(3) 과 동일한 방법으로 평가하였다. 그 결과, 유도직후에 특이적 세포 상해 활성은 유도되었으나, 유도시의 시료첨가 유무에 의한 세포 상해 활성의 차이는 없었다.
(2) CTL 의 확대 배양
실시예 2-3-(1) 에서 제조한 CTL 을 사용하고, 실시예 2-1-(2) 와 동일한 방법으로 CTL 을 확대 배양하였다. 이 때, 실시예 2-3-(1) 에서의 CTL 유도시에 첨가한 시료와 동일한 시료를 최종농도 10㎍/㎖ 가 되도록 첨가하는 군과 유도시에 시료를 전혀 첨가하지 않는 군을 설정하였다. 이 사이에 펩티드에 의한 자극은 전혀 부가하지 않고, 배양개시 1 일째에 최종농도 120U/㎖ 의 IL-2 를 첨가하고, 또한 배양개시후 4 일째 이후에는 2∼3 일 마다 배양 상층액을 절반 제거후, IL-2 60U/㎖ 및 7-12SFd-F 10㎍/㎖ 를 함유하는 5HRPMI 5㎖ 를 각 플라스크에 첨가하였다. 단, 시료를 첨가하지 않은 군에서는 배지 교환시에도 시료는 첨가하지 않았다. 확대 배양 개시후, 14 일째에 실시예 1-1-(3) 과 동일한 방법으로 CTL 의 특이적 세포 상해 활성을 측정하였다. 측정결과를 표 10 에 나타낸다.
| 시료 | 시료첨가 | 확대 증식률 | 펩티드 부가 | 세포 상해 활성 (%) | ||
| CTL 유도시 | 확대 배양시 | E/T 비 | ||||
| 3 | 10 | |||||
| 대조 | － － | － － | ×260 ×260 | － ＋ | 2.5 54.2 | 5.0 84.3 |
| 7-12SFd-F | ＋ ＋ | ＋ ＋ | ×178 ×178 | － ＋ | 2.8 67.0 | 0 93.7 |
그 결과, CTL 유도시 및 확대 배양시에 7-12SFd-F 를 첨가한 군에서는, CTL 은 14 일간의 확대 배양후에도 특이적으로 높은 세포 상해 활성을 유지하였다. 한편, CTL 유도시 및 확대 배양시 모두 시료를 첨가하지 않은 군에서는 그 활성은 명백히 저하되었다. 즉, 푸코이단과 같은 고분자의 황산 다당뿐만 아니라 F-푸코이단의 구성단위인 7-12SFd-F 와 같이 분자량이 작은 황산화 당이라도 CTL 유도시와 확대 배양시에 첨가함으로써, 특이적으로 높은 세포 상해 활성을 장기적으로 유지한 상태에서 CTL 의 확대 배양이 가능해짐이 판명되었다.
실시예 2-4
(1) 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 의 유도
실시예 1-1-(1) 에 기재된 방법으로 분리, 보존한 PBMC 를 사용하고, 실시예 1-1-(2) 와 동일한 방법으로 항 인플루엔자 바이러스 메모리-CTL 을 유도하였다. 이 때, 시료로서 L.M.W. 헤파린 (상품명 Ardeparin sodium; CELSUS LABORATORIES INC. 사 제조), 펙틴산 (나카라이텍스사 제조), 비팽윤성 알긴산 (와코쥰야쿠사 제 조), 팽윤성 알긴산 (와코쥰야쿠사 제조), 제조예 6-(1) 에서 제조한 황산화 글루코오스나트륨염, 제조에 6-(2) 에서 제조한 황산화 푸코오스나트륨염, 콘드로이틴 황산 A 나트륨 (생화학공업사 제조), 콘드로이틴 황산 B 나트륨 (생화학공업사 제조) 을 최종농도 10㎍/㎖ 가 되도록 첨가하였다. 또한 시료를 첨가하지 않는 군도 설정하였다. 항원 펩티드에는 FluNPA24 를 사용하였다.
이렇게 하여 제조한 유도개시후 14 일째의 CTL 의 세포 상해 활성은 실시예 1-1-(3) 과 동일한 방법으로 평가하였다. 그 결과 후에 특이적 세포 상해 활성은 유도되었으나, 유도시의 시료첨가 유무, 시료의 차이에 의한 세포 상해 활성의 차이는 없었다.
(2) CTL 의 확대 배양
실시예 2-4-(1) 에서 제조한 CTL 을 사용하고, 실시예 2-1-(2) 와 동일한 방법으로 CTL 을 확대 배양하였다. 이 때, 실시예 2-4-(1) 에서의 CTL 유도시에 첨가한 시료와 동일한 시료를 각각 최종농도 10㎍/㎖ 가 되도록 첨가하는 군과 유도시에 시료를 전혀 첨가하지 않는 군을 설정하였다. 이 사이에 펩티드에 의한 자극은 전혀 부가하지 않고, 배양개시 1 일째에 최종농도 120U/㎖ 의 IL-2 를 첨가하고, 또한 배양개시후 4 일째 이후에는 2∼3 일 마다 배양 상층액을 절반 제거후, IL-2 60U/㎖ 및 시료 10㎍/㎖ 를 함유하는 5HRPMI 5㎖ 를 각 플라스크에 첨가하였다. 단, 시료를 첨가하지 않은 군에서는 배지 교환시에도 시료는 첨가하지 않았다. 확대 배양 개시후, 14 일째에 실시예 1-1-(3) 과 동일한 방법으로 CTL 의 특이적 세포 상해 활성을 측정하였다. 측정결과를 표 11 에 나타낸다.
| 시료 | 시료첨가 | 확대 증식률 | 펩티드 부가 | 세포 상해 활성 (%) | ||
| CTL 유도시 | 확대 배양시 | E/T 비 | ||||
| 3 | 10 | |||||
| 대조 | － － | － － | ×274 ×274 | － ＋ | 17.0 44.2 | 32.2 66.0 |
| L.M.W. 헤파린 | ＋ ＋ | ＋ ＋ | ×240 ×240 | － ＋ | 5.2 56.4 | 19.6 92.9 |
| 펙틴산 | ＋ ＋ | ＋ ＋ | ×160 ×160 | － ＋ | 11.6 47.0 | 7.3 69.8 |
| 비팽윤성 알긴산 | ＋ ＋ | ＋ ＋ | ×220 ×220 | － ＋ | 26.2 63.5 | 26.8 81.4 |
| 팽윤성 알긴산 | ＋ ＋ | ＋ ＋ | ×176 ×176 | － ＋ | 14.3 65.0 | 21.3 101.6 |
| 황산화 글루코오스 | ＋ ＋ | ＋ ＋ | ×220 ×220 | － ＋ | 10.3 62.3 | 25.6 127.4 |
| 황산화 푸코오스 | ＋ ＋ | ＋ ＋ | ×240 ×240 | － ＋ | 23.3 70.2 | |
| 콘드로이틴 황산 A | ＋ ＋ | ＋ ＋ | ×280 ×280 | － ＋ | 0 56.7 | 5.3 89.0 |
| 콘드로이틴 황산 B | ＋ ＋ | ＋ ＋ | ×178 ×178 | － ＋ | 1.0 57.8 | 10.7 98.2 |
그 결과, CTL 유도시 및 확대 배양시에 이들 시료를 첨가한 군의 CTL 은 모두 14 일간의 확대 배양후에 특이적으로 높은 세포 상해 활성을 유지하였다. 한편, CTL 유도시 및 확대 배양시 모두 이들 시료를 첨가하지 않은 군에서는 그 활성은 명백히 저하되었다. 즉, 황산화 당뿐만 아니라, 당의 종류, 수식 등에 관계없이 산성 당을 CTL 유도시와 확대 배양시에 첨가함으로써, 특이적으로 높은 세포 상해 활성을 장기적으로 유지한 상태에서 CTL 의 확대 배양이 가능해짐이 판명되었다.
실시예 2-5
(1) 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 의 유도
실시예 1-1-(1) 에 기재된 방법으로 분리, 보존한 PBMC 를 사용하고, 실시예 1-1-(2) 와 동일한 방법으로 항 인플루엔자 바이러스 메모리-CTL 을 유도하였다. 그 때, 상기 실시예에 사용된 바와 같은 시료는 전혀 첨가하지 않았다. 항원 펩티드에는 FluMPA 2.1 을 사용하였다.
이렇게 하여 제조한 유도개시후 14 일째의 CTL 의 세포 상해 활성은 실시예 1-1-(3) 과 동일한 방법으로 평가하였다.
(2) CTL 의 확대 배양
실시예 2-5-(1) 에서 제조한 CTL 을 사용하고, 실시예 2-1-(2) 와 동일한 방법으로 CTL 을 확대 배양하였다. 이 때, 최종농도 10㎍/㎖ 가 되도록 시료를 첨가하는 군과, 시료를 전혀 첨가하지 않는 군을 설정하였다. 이 사이에 펩티드에 의한 자극은 전혀 부가하지 않고, 배양개시 1 일째에 최종농도 120U/㎖ 의 IL-2 를 첨가하고, 또한 배양개시후 4 일째 이후에는 2∼3 일 마다 배양 상층액을 절반 제거후, IL-2 60U/㎖ 및 시료 10㎍/㎖ 를 함유하는 5HRPMI 5㎖ 를 각 플라스크에 첨가하였다. 단, 시료를 첨가하지 않은 군에서는 배지 교환시에도 시료는 첨가하지 않았다. 시료로는 제조예 2 에서 제조한 Ⅲ 분획 (F-푸코이단) 을 사용하였다. 확대 배양 개시후, 14 일째에 실시예 1-1-(3) 과 동일한 방법으로 CTL 의 특이적 세포 상해 활성을 측정하였다. 측정결과를 표 12 에 나타낸다.
| 시료 | 시료첨가 | 확대 증식률 | 펩티드 부가 | 세포 상해 활성 (%) | ||||
| CTL 유도시 | 확대 배양시 | E/T 비 | ||||||
| 1 | 3 | 10 | 30 | |||||
| 대조 | － － | － － | ×393 ×393 | － ＋ | 1.5 3.8 | 1.0 15.7 | 3.1 36.7 | 5.9 60.2 |
| F-푸코이단 | － － | ＋ ＋ | ×475 ×475 | － ＋ | 0 40.7 | 1.7 76.3 | ||
그 결과, 확대 배양시에 F-푸코이단을 첨가한 군의 CTL 은 14 일간의 확대 배양후에도 특이적으로 높은 세포 상해 활성을 유지하였다. 한편, CTL 유도시 및 확대 배양시 모두 시료를 첨가하지 않은 군에서는 그 활성은 명백히 저하되었다. 즉, F-푸코이단을 유도시부터가 아니라 확대 배양시에만 첨가해도 특이적으로 높은 세포 상해 활성을 장기적으로 유지한 상태에서 CTL 의 확대 배양이 가능해짐이 판명되었다.
실시예 2-6
(1) 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 의 유도
실시예 1-1-(1) 에 기재된 방법으로 분리, 보존한 PBMC 를 사용하고, 실시예 1-1-(2) 와 동일한 방법으로 항 인플루엔자 바이러스 메모리-CTL 을 유도하였다. 이 때, 시료는 전혀 첨가하지 않았다. 항원 펩티드에는 FluMPA2.1 을 사용하였다.
이렇게 하여 제조한 유도개시후 14 일째의 CTL 의 세포 상해 활성은 실시예 1-1-(3) 과 동일한 방법으로 평가하였다.
(2) CTL 의 확대 배양
실시예 2-6-(1) 에서 제조한 CTL 을 사용하고, 실시예 2-1-(2) 와 동일한 방법으로 CTL 을 확대 배양하였다. 이 때, 최종농도 10㎍/㎖ 가 되도록 시료를 첨가하는 군과, 시료를 전혀 첨가하지 않는 군을 설정하였다. 이 사이에 펩티드에 의한 자극은 전혀 부가하지 않고, 배양개시 1 일째에 최종농도 120U/㎖ 의 IL-2 를 첨가하고, 또한 배양개시후 4 일째 이후에는 2∼3 일 마다 배양 상층액을 절반 제거후, IL-2 60U/㎖ 및 시료 10㎍/㎖ 를 함유하는 5HRPMI 5㎖ 를 각 플라스크에 첨가하였다. 단, 시료를 첨가하지 않은 군에서는 배지 교환시에도 시료는 첨가하지 않았다. 시료로는 제조예 1 에서 제조한 개다시마 유래 푸코이단, 제조예 2 에서 제조한 Ⅱ 분획 (U-푸코이단), 제조예 3 에서 제조한 7-12SFd-F, L.M.W. 헤파린 (상품명 Ardeparin sodium; CELSUS LABORATORIES INC. 사 제조), 펙틴산 (나카라텍스사 제조), 비팽윤성 알긴산 (와코쥰야쿠사 제조), 팽윤성 알긴산 (와코쥰야쿠사 제조), 제조예 6-(1) 에서 제조한 황산화 글루코오스나트륨염, 제조예 6-(2) 에서 제조한 황산화 푸코오스나트륨염, 콘드로이틴 황산 A 나트륨 (생화학공업사 제조), 콘드로이틴 황산 B 나트륨 (생화학공업사 제조) 을 사용하였다. 확대 배양 개시후, 14 일째에 실시예 1-1-(3) 과 동일한 방법으로 CTL 의 특이적 세포 상해 활성을 측정하였다. 측정결과를 표 13 과 14 에 나타낸다.
| 시료 | 시료첨가 | 확대 증식률 | 펩티드 부가 | 세포 상해 활성 (%) | ||||
| CTL 유도시 | 확대 배양시 | E/T 비 | ||||||
| 1 | 3 | 10 | 30 | |||||
| 대조 | － － | － － | ×403 ×403 | － ＋ | 0.8 6.5 | 1.9 16.0 | 4.5 31.9 | 9.9 53.2 |
| 개다시마 유래 푸코이단 | － － | ＋ ＋ | ×425 ×425 | － ＋ | 0 13.1 | 0 18.3 | 3.9 40.3 | 12.3 72.4 |
| U-푸코이단 | － － | ＋ ＋ | ×358 ×358 | － ＋ | 0 13.2 | 0 25.9 | 2.9 45.6 | 5.3 69.4 |
| 7-12SFd-F | － － | ＋ ＋ | ×310 ×310 | － ＋ | 2.7 14.1 | 0 20.1 | 1.0 41.7 | 3.5 64.6 |
| L.M.W. 헤파린 | － － | ＋ ＋ | ×353 ×353 | － ＋ | 1.4 11.3 | 0 22.2 | 0.6 43.9 | 2.5 71.2 |
| 펙틴산 | － － | ＋ ＋ | ×350 ×350 | － ＋ | 2.3 18.2 | 4.1 33.3 | 8.2 64.2 | 15.9 87.8 |
| 시료 | 시료첨가 | 확대 증식률 | 펩티드 부가 | 세포 상해 활성 (%) | ||||
| CTL 유도시 | 확대 배양시 | E/T 비 | ||||||
| 1 | 3 | 10 | 30 | |||||
| 대조 | － － | － － | ×403 ×403 | － ＋ | 0.8 6.5 | 1.9 16.0 | 4.5 31.9 | 9.9 53.2 |
| 비팽윤성 알긴산 | － － | ＋ ＋ | ×335 ×335 | － ＋ | 0.5 13.5 | 5.2 24.1 | 6.5 50.4 | 14.4 76.0 |
| 팽윤성 알긴산 | － － | ＋ ＋ | ×378 ×378 | － ＋ | 0.1 15.4 | 0 22.0 | 2.1 47.8 | 10.6 81.7 |
| 황산화 글루코오스 | － － | ＋ ＋ | ×343 ×343 | － ＋ | 2.8 11.0 | 0 18.0 | 0 39.5 | 3.6 59.0 |
| 황산화 푸코오스 | － － | ＋ ＋ | ×448 ×448 | － ＋ | 0 32.5 | 1.3 64.9 | ||
| 콘드로이틴 황산 A | － － | ＋ ＋ | ×383 ×383 | － ＋ | 6.3 8.0 | 5.6 18.7 | 7.5 36.6 | 18.8 67.6 |
| 콘드로이틴 황산 B | － － | ＋ ＋ | ×383 ×383 | － ＋ | 3.9 15.2 | 4.4 27.2 | 8.3 48.1 | 11.8 76.2 |
그 결과, 확대 배양시에 이들 시료를 첨가한 군의 CTL 은 모두 14 일간의 확대 배양후에 특이적으로 높은 세포 상해 활성을 유지하였다. 한편, CTL 유도시 및 확대 배양시 양방에 시료를 첨가하지 않은 군에서는 그 활성은 명백히 저하되었다. 즉 산성 당을 유도시로부터가 아닌 확대 배양시에만 첨가해도 특이적으로 높은 세포 상해 활성을 장기적으로 유지한 상태에서 CTL 의 확대 배양이 가능해짐을 알 수 있었다.
실시예 2-7
(1) 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 의 유도
실시예 1-1-(1) 에 기재된 방법으로 분리, 보존한 PBMC 를 사용하고, 실시예 1-1-(2) 와 동일한 방법으로 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 을 유도하였다. 이 때, 시료를 최종농도 10㎍/㎖ 이 되도록 첨가하였다. 또한 시료를 첨가하지 않은 군도 설정하였다. 시료로는 제조예 1 에서 제조한 개다시마 유래 푸코이단, 제조예 2 에서 제조한 Ⅲ 분획 (F-푸코이단), Ⅱ 분획 (U-푸코이단), 제조예 3 에서 제조한 7-12SFd-F, L.M.W. 헤파린 (상품명 Ardeparin sodium; CELSUS LABORATORIES INC. 사 제조) 을 사용하였다. 항원 펩티드에는 FluMPA2.1 을 사용하였다.
이렇게 하여 제조한 유도개시후 14 일째의 CTL 의 세포 상해 활성은 실시예 1-1-(3) 과 동일한 방법으로 평가하였다. 그 결과, 유도직후에 특이적 세포 상해 활성은 유도되었으나, 유도시의 시료첨가 유무, 시료의 차이에 따른 세포 상해 활성의 차이는 없었다.
(2) CTL 의 확대 배양
실시예 2-7-(1) 에서 제조한 CTL 을 사용하고, 실시예 2-1-(2) 와 동일한 방 법으로 CTL 을 확대 배양하였다. 이 때, 실시예 2-7-(1) 에서의 CTL 유도시에 첨가한 시료와 동일한 시료를 첨가하는 군과 첨가하지 않는 군, 및 유도시로부터 시료를 전혀 첨가하지 않는 군을 설정하였다. 이 사이에 펩티드에 의한 자극은 전혀 부가하지 않고, 배양 개시 1 일째에 최종농도 120U/㎖ 의 IL-2 를 첨가하고, 또한 배양 개시후 4 일째 이후에는 2∼3 일 마다 배양 상층액을 절반 제거후, IL-2 60U/㎖ 및 시료 10㎍/㎖ 를 함유하는 5HRPMI 5㎖ 를 각 플라스크에 첨가하였다. 단, 시료를 첨가하지 않은 군에서는 배지교환시에도 시료는 첨가하지 않았다. 확대 배양 개시후, 14 일째에 실시예 1-1-(3) 과 동일한 방법으로 CTL 의 특이적 세포 상해 활성을 측정하였다. 측정결과를 표 15 에 나타낸다.
| 시료 | 시료첨가 | 확대 증식률 | 펩티드 부가 | 세포 상해 활성 (%) | ||||
| CTL 유도시 | 확대 배양시 | E/T 비 | ||||||
| 1 | 3 | 10 | 30 | |||||
| 대조 | － － | － － | ×393 ×393 | － ＋ | 1.5 3.6 | 1.0 15.7 | 3.1 36.7 | 5.9 60.2 |
| 개다시마 유래의 푸코이단 | ＋ ＋ ＋ ＋ | ＋ ＋ － － | ×310 ×310 ×166 ×166 | － ＋ － ＋ | 2.5 15.1 5.6 15.3 | 3.8 30.9 2.4 30.2 | 0 76.7 5.9 65.2 | 2.0 77.9 12.2 88.3 |
| F-푸코이단 | ＋ ＋ ＋ ＋ | ＋ ＋ － － | ×278 ×310 ×175 ×175 | － ＋ － ＋ | 1.5 9.2 2.2 6.7 | 1.2 21.2 0.8 16.3 | 4.4 41.9 1.2 47.3 | 1.3 65.4 2.4 74.4 |
| U-푸코이단 | ＋ ＋ ＋ ＋ | ＋ ＋ － － | ×214 ×214 ×173 ×173 | － ＋ － ＋ | 7.1 10.6 | 8.9 23.2 | 8.8 46.0 | 3.4 66.7 11.5 77.0 |
| 7-12SFd-F | ＋ ＋ ＋ ＋ | ＋ ＋ － － | ×258 ×258 ×283 ×283 | － ＋ － ＋ | 0 9.4 6.7 14.0 | 0 23.4 6.5 34.6 | 0 44.2 9.3 50.4 | 1.6 82.1 9.8 83.5 |
| L.M.W. 헤파린 | ＋ ＋ ＋ ＋ | ＋ ＋ － － | ×243 ×243 ×253 ×253 | － ＋ － ＋ | 5.6 16.3 5.2 12.5 | 2.5 22.7 4.5 26.9 | 1.1 43.9 6.6 57.8 | 0.9 72.8 7.0 83.7 |
그 결과, CTL 유도시와 확대 배양시의 양방에서 이들 시료를 첨가한 군, CTL 유도시에만 이들 시료를 첨가한 군 모두 14 일간의 확대 배양후의 CTL 은 특이적으로 높은 세포 상해 활성을 유지하고 있었다. 한편, CTL 유도시 및 확대 배양시 모두 개다시마 유래의 푸코이단을 첨가하지 않은 군에서는 그 활성은 명백히 저하되어 있었다. 즉 유도시에 산성 당을 첨가하면 확대 배양시에 산성 당 첨가 유무에 관계없이 특이적으로 높은 세포 상해 활성을 장기적으로 유지한 상태에서 CTL 의 확대 배양이 가능해짐을 알 수 있었다.
이상의 결과를 통해, CTL 의 유도시와 확대 배양시의 어느 일방 또는 양방에 산성 당을 첨가함으로써, 특이적으로 높은 세포 상해 활성을 장기적으로 유지한 상태에서 CTL 의 확대 배양이 가능해짐을 알 수 있었다.
실시예 3 REM 법과의 비교 및 REM 법과의 조합
실시예 3-1
(1) 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 의 유도
실시예 1-1-(1) 에 기재된 방법으로 분리, 보존한 PBMC 를 사용하고, 실시예 1-1-(2) 와 동일한 방법으로 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 을 유도하였다. 이 때, 시료로서 제조예 1 에서 제조한 개다시마 유래의 푸코이단을 최종농도 10㎍/㎖ 이 되도록 첨가하였다. 또한 시료를 첨가하지 않은 군도 설정하였다. 항원 펩티드에는 FluMPA2.1 을 사용하였다.
이렇게 하여 제조한 유도개시후 14 일째의 CTL 의 세포 상해 활성은 실시예 1-1-(3) 과 동일한 방법으로 평가하였다.
(2) CTL 의 확대 배양
실시예 3-1-(1) 에서 제조한 CTL 을 5HRPMI 에서 세정후, 5 ×104 세포/㎖ 로 제조하였다. 한편, 실시예 1-1-(1) 과 동일하게 채취한 HLA-A24 및 A2.1 비유지 동종 PBMC 를 X 선 조사 (3300R) 하고 배지에서 세정후 5 ×106 세포/㎖ 로 제조하였다. 이들 CTL (2.5 ×104cells) 과 동종 PBMC (1.25 ×107cells) 를 10㎖ 의 5HRPMI 에 현탁시키고, 추가로 최종농도 50ng/㎖ 의 항 CD3 항체 (얀센 쿄와사 제조) 를 첨가하여 12.5㎠ 의 플라스크 (Falcon 사 제조) 에 넣고, 37℃ 의 습식 CO2 인큐베이터 내에서 14 일간 배양하였다. 이 때, 시료로서 최종농도 10㎍/㎖ 가 되도록 제조예 1 에서 제조한 개다시마 유래의 푸코이단을 첨가하는 군과 첨가하지 않는 군을 설정하였다. 이 사이에 펩티드에 의한 자극은 전혀 부가하지 않고, 배양 개시 1 일째에 최종농도 120U/㎖ 의 IL-2 를 첨가하고, 또한 배양 개시후 4 일째 이후에는 2∼3 일 마다 배양 상층액을 절반 제거후, IL-2 60U/㎖ 를 함유하는 5HRPMI 5㎖ 를 각 플라스크에 첨가하였다. 이 때, 시료첨가군의 배지에는 최종농도 10㎍/㎖ 가 되도록 제조예 1 에서 제조한 개다시마 유래의 푸코이단을 첨가하였다. 확대 배양 개시후, 14 일째에 실시예 1-1-(3) 과 동일한 방법으로 CTL 의 특이적 세포 상해 활성을 측정하였다. 측정결과를 표 16 에 나타낸다.
한편, REM 법에 의한 확대 배양은 다음과 같이 실시하였다. HLA-A24 및 A2.1 비유지 동종 PBMC 를 X 선 조사 (3300R) 하여 배지에서 세정후 5 ×106 세포/㎖ 로 제조하였다. 또한 엡스타인 바 바이러스 (Epstein-Barr Virus) 감염 인간 B 세포주 (EBV-B 세포) 를 X 선 조사 (8000R) 하고, 배지에서 세정후 1 ×106 세포/㎖ 로 제조하였다. 실시예 3-1-(1) 에서 제조한 CTL (2.5 ×104cells) 과 동종 PBMC (1.25 ×107cells), EBV-B 세포 (2.5 ×106cells) 를 10㎖ 의 5HRPMI 에 현탁시키고, 추가로 최종농도 50ng/㎖ 의 항 CD3 항체 (얀센 쿄와사 제조) 를 첨가하여 12.5㎠ 의 플라스크 (Falcon 사 제조) 에 넣고, 37℃ 의 습식 CO2 인큐베이터 내 에서 14 일간 배양하였다. 이 때, 시료로서 최종농도 10㎍/㎖ 가 되도록 제조예 1 에서 제조한 개다시마 유래의 푸코이단을 첨가하는 군과 첨가하지 않는 군을 설정하였다. EBV-B 세포를 제외한 것이 이외에는 상기와 동일하게 제조한 플라스크도 동일하게 배양하였다. 이 사이에 펩티드에 의한 자극은 전혀 부가하지 않고, 배양 개시 1 일째에 최종농도 120U/㎖ 의 IL-2 를 첨가하고, 또한 배양 개시후 4 일째 이후에는 2∼3 일 마다 배양 상층액을 절반 제거후, IL-2 60U/㎖ 를 함유하는 5HRPMI 5㎖ 를 각 플라스크에 첨가하였다. 이 때, 시료첨가군의 배지에는 최종농도 10㎍/㎖ 가 되도록 제조예 1 에서 제조한 개다시마 유래의 푸코이단을 첨가하였다. 확대 배양 개시후, 14 일째에 실시예 1-1-(3) 과 동일한 방법으로 CTL 의 특이적 세포 상해 활성을 측정하였다. 그 결과를 표 17 에 나타낸다.
| 시료 | 시료첨가 | EBV-B 세포첨가 | 확대 증식률 | 펩티드 부가 | 세포 상해 활성 (%) | |||
| CTL 유도시 | 확대 배양시 | E/T 비 | ||||||
| 3 | 10 | 30 | ||||||
| 대조 | － － | － － | － － | ×494 ×494 | － ＋ | 1.2 14.7 | 2.0 38.8 | 8.4 70.3 |
| 개다시마 유래의 푸코이단 | － － ＋ ＋ ＋ ＋ | ＋ ＋ － － ＋ ＋ | － － － － － － | ×694 ×694 ×488 ×488 ×513 ×513 | － ＋ － ＋ － ＋ | 2.2 26.4 3.2 44.7 3.2 47.4 | 5.8 62.3 7.2 84.2 5.4 87.0 | 7.8 83.8 18.5 102.6 7.6 108.3 |
| 시료 | 시료첨가 | EBV-B 세포첨가 | 확대 증식률 | 펩티드 부가 | 세포 상해 활성 (%) | |||
| CTL 유도시 | 확대 배양시 | E/T 비 | ||||||
| 3 | 10 | 30 | ||||||
| 대조 | － － | － － | － － | ×494 ×494 | － ＋ | 1.2 14.7 | 2.0 38.8 | 8.4 70.3 |
| REM 법 | － － | － － | ＋ ＋ | ×713 ×713 | － ＋ | 0 27.5 | 0 68.4 | 4.8 94.9 |
| 개다시마 유래의 푸코이단 | － － ＋ ＋ ＋ ＋ | ＋ ＋ － － ＋ ＋ | ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ | ×656 ×656 ×662 ×662 ×638 ×638 | － ＋ － ＋ － ＋ | 0.8 35.2 1.1 72.7 0 65.0 | 0.8 74.1 1.8 95.3 1.5. 88.5 | 0 102.8 6.2 92.8 4.8 98.6 |
그 결과, 개다시마 유래의 푸코이단을 첨가하지 않고 유도한 CTL (CTL 유도제 무첨가) 은 REM 법으로 확대 배양한 경우에는 높은 세포 상해 활성을 유지하였다. 그러나, EBV-B 세포를 사용하지 않는 REM 법으로 확대 배양한 경우에는 세포 상해 활성은 현저히 저하되었다.
한편, 개다시마 유래의 푸코이단을 CTL 유도시와 확대 배양시 양방 또는 어느 일방에 첨가하면 EBV-B 세포를 첨가하지 않아도 14 일간의 대량 배양후에서의 CTL 세포 상해 활성을 충분히 높게 유지시킬 수 있었다. 또한 본 발명에 의한 확대 배양후의 항원 특이적 세포 상해 활성은 REM 법과 비교해도 높은 것이었다.
또한, REM 법으로 확대 배양하는 경우, 확대 배양에 앞서 CTL 유도시로부터 본 발명의 방법의 CTL 활성 유지효과를 갖는 화합물의 하나인 개다시마 유래의 푸코이단을 첨가해 두면 종래기술로 유도한 CTL 세포를 단지 REM 법으로 확대 배양함으로써 세포 상해 활성을 높게 유지할 수 있었다.
즉, 본 발명에 의한 CTL 활성 유지효과를 갖는 화합물을 첨가하는 확대 배양 방법에서는 REM 법에서는 필수인 EBV-B 세포를 필요로 하지 않고, EBV-B 세포를 사용하는 위험성을 회피할 수 있다. 또한 REM 법보다 높은 CTL 활성을 유지할 수 있다. 이러한 점에서, 본 발명의 CTL 세포의 확대방법은 REM 법보다 안전하고 우수한 방법이다.
또한, 본 발명에서 사용되는 화합물을 REM 법에 도입하면 더욱 높은 활성을 유지하는 CTL 을 확대 배양할 수 있다. 즉, 본 발명에서 사용되는 화합물은 온갖 CTL 의 확대 배양 방법으로의 적응이 가능하며, 각종 CTL 확대 배양 방법에 본 발명에서 사용되는 화합물을 사용함으로써, 특이적으로 높은 세포 상해 활성을 장기적으로 보존한 상태를 유지할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 3-2
(1) 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 의 유도
실시예 1-1-(1) 에 기재된 방법으로 분리, 보존한 PBMC 를 사용하고, 실시예 1-1-(2) 와 같은 방법으로 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 을 유도하였다. 이 때, 시료로서 히알루론산을 최종농도 10㎍/㎖ 가 되도록 첨가하였다. 또한 시료를 첨가하지 않는 군도 설정하였다.
이렇게 하여 제조한 유도개시후 14 일째의 CTL 의 세포 상해 활성은 실시예 1-1-(3) 과 동일한 방법으로 평가하였다. 항원 펩티드에는 FluMP A2.1 을 사용하였다.
(2) CTL 의 확대 배양
실시예 3-2-(1) 에서 제조한 CTL 을 실시예 3-1-(2) 와 동일하게 확대 배양하였다. 이 때, 시료로서 최종농도 10㎍/㎖ 가 되도록 히알루론산을 첨가하는 군과 첨가하지 않는 군을 설정하였다. 이 사이에 펩티드에 의한 자극은 전혀 부가하지 않고, 배양 개시 1 일째에 최종농도 120U/㎖ 의 IL-2 를 첨가하고, 또한 배양 개시후 4 일째 이후에는 2∼3 일 마다 배양 상층액을 절반 제거후, IL-2 60U/㎖ 를 함유하는 5HRPMI 5㎖ 를 각 플라스크에 첨가하였다. 이 때, 시료첨가군의 배지에는 최종농도 10㎍/㎖ 가 되도록 히알루론산을 첨가하였다. 확대 배양 개시후, 14 일째에 실시예 1-1-(3) 과 동일한 방법으로 CTL 의 특이적 세포 상해 활성을 측정하였다. 측정결과를 표 18 에 나타낸다.
| 시료 | 시료첨가 | EBV-B 세포첨가 | 확대 증식률 | 펩티드 부가 | 세포 상해 활성 (%) | |
| CTL 유도시 | 확대 배양시 | E/T 비 | ||||
| 10 | ||||||
| 대조 히알루론산 | － － ＋ ＋ | － － ＋ ＋ | － － － － | ×392 ×392 ×335 ×335 | － ＋ － ＋ | 6.2 10.6 2.3 60.0 |
| REM 법 REM 법＋ 히알루론산 | － － ＋ ＋ | － － ＋ ＋ | ＋ ＋ ＋ ＋ | ×427 ×427 ×587 ×587 | － ＋ － ＋ | 11.5 52.8 8.1 95.5 |
그 결과, 히알루론산을 첨가하지 않고 유도한 CTL (CTL 활성 유지 시약 무첨가) 은 REM 법으로 확대 배양한 경우에는 높은 세포 상해 활성을 유지하였다. 그러나, EBV-B 세포를 사용하지 않는 REM 법으로 확대 배양한 경우에는 세포 상해 활성은 현저히 저하되었다.
한편, 히알루론산을 CTL 유도시와 확대 배양시 양방에 첨가해 두면 EBV-B 세포를 첨가하지 않아도 14 일간의 대량 배양후에서의 CTL 세포 상해 활성을 충분히 높게 유지시킬 수 있었다. 또한 본 발명에 의한 확대 배양후의 표적특이적 세포 상해 활성은 REM 법과 비교해도 높은 것이었다.
또한, REM 법으로 확대 배양하는 경우, 확대 배양에 앞서 CTL 유도시로부터 본 발명의 방법의 CTL 활성 유지효과를 갖는 화합물의 하나인 히알루론산을 첨가해 두면, 종래기술로 유도한 CTL 세포를 단지 REM 법으로 확대 배양함으로써 세포 상해 활성을 높게 유지할 수 있었다.
즉 본 발명의 CTL 의 확대 배양 방법에서는 REM 법에서는 필수인 EBV-B 세포를 필요로 하지 않고, EBV-B 세포를 사용하는 위험성을 회피할 수 있다. 또한 REM 법보다 높은 CTL 활성을 유지할 수 있다. 이러한 점에서, 본 발명의 CTL 세포의 확대방법은 REM 법보다 안전하고 우수한 방법이다.
또한, 히알루론산을 REM 법에 도입하면 더욱 높은 활성을 유지할 수 있고, 히알루론산은 온갖 CTL 세포의 확대 배양 방법으로의 적응이 가능하며, 각종 CTL 확대 배양 방법에 본 발명에서 사용되는 화합물을 첨가함으로써, 특이적으로 높은 세포 상해 활성을 장기적으로 보존한 상태에서 CTL 의 확대 배양이 가능해진다.
실시예 4 히알루론산을 사용한 특이적 세포 상해 활성 유지 CTL 의 확대 배양
실시예 4-1
(1) 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 의 유도
실시예 1-1-(1) 에 기재된 방법으로 분리, 보존한 PBMC 를 사용하고, 실시예 1-1-(2) 와 같은 방법으로 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 을 유도하였다. 이 때, 히알루론산 (Calbiochem 사 제조) 을 최종농도 10㎍/㎖ 가 되도록 첨가하였다. 또한 히알루론산을 첨가하지 않는 군도 설정하였다. 항원 펩티드에는 FluMPA2.1 을 사용하였다.
이렇게 하여 제조한 유도개시후 14 일째의 CTL 의 세포 상해 활성은 실시예 1-1-(3) 과 동일한 방법으로 평가하였다. 그 결과, 유도직후에 특이적 세포 상해 활성은 유도되었으나, 유도시의 시료첨가 유무에 따른 세포 상해 활성의 차이는 거의 없었다.
(2) CTL 의 확대 배양
실시예 4-1-(1) 에서 제조한 CTL 을 사용하고, 실시예 2-1-(2) 와 동일한 방법으로 CTL 을 확대 배양하였다. 이 때, 실시예 4-1-(1) 에서의 CTL 유도시에 첨가한 히알루론산을 최종농도 10㎍/㎖ 가 되도록 첨가하는 군과 유도시로부터 히알루론산을 전혀 첨가하지 않는 군을 설정하였다. 이 사이에 펩티드에 의한 자극은 전혀 부가하지 않고, 배양 개시 1 일째에 최종농도 120U/㎖ 의 IL-2 를 첨가하고, 또한 배양 개시후 4 일째 이후에는 2∼3 일 마다 배양 상층액을 절반 제거후, IL-2 60U/㎖ 및 히알루론산 10 ㎍/㎖ 를 함유하는 5HRPMI 5㎖ 를 각 플라스크에 첨가하였다. 단, 히알루론산을 첨가하지 않은 군에서는 배지교환시에도 시료는 첨가하지 않았다. 확대 배양 개시후, 14 일째에 실시예 1-1-(3) 과 동일한 방법으로 CTL 의 특이적 세포 상해 활성을 측정하였다. 측정결과를 표 19 에 나타낸다.
| 시료 | 시료첨가 | 확대 증식률 | 펩티드 부가 | 세포 상해 활성 (%) | ||||
| CTL 유도시 | 확대 배양시 | E/T 비 | ||||||
| 1 | 3 | 10 | 30 | |||||
| 대조 | － － | － － | ×547 ×547 | － ＋ | 7.3 8.1 | 8.4 11.2 | 9.1 21.5 | 12.7 45.9 |
| 히알루론산 | ＋ ＋ | ＋ ＋ | ×493 ×493 | － ＋ | 7.3 31.1 | 8.6 49.8 | 13.1 90.8 | 17.0 105.6 |
그 결과, CTL 유도시 및 확대 배양시에 히알루론산을 첨가한 군에서는 CTL 은 14 일간의 확대 배양후에도 특이적으로 높은 세포 상해 활성을 유지하였다. 한편, CTL 유도시 및 확대 배양시 모두 시료를 첨가하지 않은 군에서는 그 활성은 명백히 저하되었다. 즉 히알루론산을 CTL 유도시 및 확대 배양시에 첨가함으로써, 특이적으로 높은 세포 상해 활성을 장기적으로 유지한 상태에서 CTL 의 확대 배양이 가능해짐을 알 수 있었다.
실시예 4-2
(1) 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 의 유도
실시예 1-1-(1) 에 기재된 방법으로 분리, 보존한 PBMC 를 사용하고, 실시예 1-1-(2) 와 같은 방법으로 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 을 유도하였다. 이 때, 히알루론산을 최종농도 10㎍/㎖ 가 되도록 첨가하였다. 또한 시료를 첨가하지 않는 군도 설정하였다. 항원 펩티드에는 FluMPA2.1 을 사용하였다.
이렇게 하여 제조한 유도개시후 14 일째의 CTL 의 세포 상해 활성은 실시예 1-1-(3) 과 동일한 방법으로 평가하였다. 그 결과, 유도직후에 특이적 세포 상 해 활성은 유도되었으나, 유도시의 시료첨가 유무에 따른 세포 상해 활성의 차이는 거의 없었다.
(2) CTL 의 확대 배양
실시예 4-2-(1) 에서 제조한 CTL 을 사용하고, 실시예 2-1-(2) 와 동일한 방법으로 CTL 을 확대 배양하였다. 이 때, 실시예 4-2-(1) 에서의 CTL 유도시에 첨가한 히알루론산은 전혀 첨가하지 않았다. 이 사이에 펩티드에 의한 자극은 전혀 부가하지 않고, 배양 개시 1 일째에 최종농도 120U/㎖ 의 IL-2 를 첨가하고, 또한 배양 개시후 4 일째 이후에는 2∼3 일 마다 배양 상층액을 절반 제거후, IL-2 60U/㎖ 를 함유하는 5HRPMI 5㎖ 를 각 플라스크에 첨가하였다. 확대 배양 개시후, 14 일째에 실시예 1-1-(3) 과 동일한 방법으로 CTL 의 특이적 세포 상해 활성을 측정하였다. 측정결과를 표 20 에 나타낸다.
| 시료 | 시료첨가 | 확대 증식률 | 펩티드 부가 | 세포 상해 활성 (%) | ||||
| CTL 유도시 | 확대 배양시 | E/T 비 | ||||||
| 1 | 3 | 10 | 30 | |||||
| 대조 | － － | － － | ×480 ×480 | － ＋ | 0 4 | 0 11.2 | 0.4 29.3 | 6.8 59.7 |
| 히알루론산 | ＋ ＋ ＋ ＋ | ＋ ＋ － － | ×423 ×423 ×393 ×393 | － ＋ － ＋ | 0 7.2 3.0 9.9 | 0 23.3 1.4 22.1 | 1.9 59.6 4.7 47.7 | 14.3 85.1 9.3 78.0 |
그 결과, CTL 유도시에만 히알루론산을 첨가한 군에서는 확대 배양시에 히알루론산을 첨가하지 않아도 14 일간의 확대 배양후에 특이적으로 높은 세포 상해 활 성을 유지하였다. 한편, CTL 유도시 및 확대 배양시 모두 히알루론산을 첨가하지 않은 군에서는 그 활성은 명백히 저하되었다. 즉 히알루론산을 CTL 유도시에만 첨가함으로써, 특이적으로 높은 세포 상해 활성을 장기적으로 유지한 상태에서 CTL 의 확대 배양이 가능해짐을 알 수 있었다.
실시예 5 종양 관련 항원 특이적 세포 상해 활성을 유지하는 CTL 의 확대 배양
실시예 5-1
(1) 항 종양 관련 항원 (MAGE3) 특이적 CTL 의 유도
실시예 1-1-(1) 에 기재된 방법으로 분리, 보존한 PBMC 를 사용하고, 항 종양 관련 항원 (MAGE 3) 특이적으로 CTL 을 유도하였다. 항 종양 관련 항원 (MAGE 3) 특이적 CTL 의 유도는 Plebanski 등의 방법 (Eur. J. Immunol. (1994) 25; 1783-1787) 을 일부 개변하여 실시하였다. 즉, 5% 인간 AB 형 혈청, 0.1mM 비필수 아미노산, 1mM 피루브산 나트륨, 2mM L-글루타민 (모두 Bio Whittaker 사 제조), 10mM HEPES (나카라이테스크사 제조), 1% 스트렙토마이신- 페니실린 (기브코 BRL 사 제조) 을 함유하는 RPMI 1640 배지 (Bio Whittaker 사 제조) (이하 5HRPMI 라고 함) 에 2∼4 ×107 세포/㎖ 가 되도록 실시예 1-1-(1) 에서 제조한 PBMC 를 현탁후 절반의 양으로 나누었다. 절반의 양은 리스폰더 세포로서 빙상 보존하고, 또 절반의 양은 항원 제시세포로 사용하고, 항원 펩티드로서 멜라노마 항원 MAGE3 유래 에피토프 펩티드 (서열목록의 서열번호: 3 에 기재된 멜라노마 항원 MAGE3 유래 HLA A2.1 결합성 펩티드 FLWGPRALV) 80㎍/㎖ 및 β2 마이크로 글로불린 (스크립스사 제조) 6㎍/㎖ 를 함유하는 5HRPMI 를 등량 첨가하고, 5% CO2 습식 인큐베이터 내에서 37℃ 에서 2 시간 인큐베이트하였다. 그 후, 5HRPMI 를 사용하여 세정하고 빙상 보존하였던 리스폰더 세포와 혼합한 후, 2 ×106 세포/㎖ 로 제조하였다. IL-7 및 KLH 를 각각 최종농도 25ng/㎖, 5㎍/㎖ 가 되도록 첨가하고, 24 웰 세포 배양 플레이트 (Falcon 사 제조) 에 2㎖/웰씩 넣었다. 이 때, L.M.W. 헤파린 (생화학공업사 제조) 또는 히알루론산 (Calbiochem 사 제조) 을 최종농도 10㎍/㎖ 가 되도록 첨가하였다. 또한 대조로서 시료를 첨가하지 않는 군도 설정하였다. 플레이트를 5% CO2 중, 37℃ 에서 배양하였다.
배양 개시후 4 일째에 배양 상층액을 절반 제거후, 60U/㎖ 의 IL-2 와 10㎍/㎖ 의 L.M.W. 헤파린 또는 히알루론산을 함유하는 5HRPMI 1㎖ (대조는 IL-2 만 함유) 를 각 웰에 첨가하였다.
7일째에 상기와 동일하게 하여 항원 제시세포를 제조한 후 X 선 조사 (5500R) 하여 4 ×106 세포/㎖ 가 되도록 제조하였다. 1 주간 배양한 리스폰더 세포를 2×106 세포/㎖ 가 되도록 5HRPMI 에 현탁, 제조한 항원 제시세포 위와 등량 혼합하고, 1㎖/웰씩 24 웰 세포 배양 플레이트에 첨가하고, 추가로 최종농도 25ng/㎖ 의 IL-7 을 첨가하여 재자극하였다. 이 때, L.M.W. 헤파린 또는 히알루론산을 최종농도 10㎍/㎖ 가 되도록 첨가하였다 (대조는 무첨가). 재자극후 1 일째에 IL-2 60U/㎖ 및 10㎍/㎖ 의 L.M.W. 헤파린 또는 히알루론산을 함유하는 (대조는 IL-2 만 함유) 5HRPMI 1㎖ 를 각 웰에 첨가, 또한 3일째에는 배양 상층액을 절반 제거후, 제거전과 동일한 내용의 배지를 1㎖ 씩 첨가하였다. 동일한 재자극을 1 주간에 1 번, 계 4 회 실시하여 CTL 을 유도하였다.
(2) CTL 세포 상해 활성의 측정
실시예 5-1-(1) 에서 제조한 유도개시후 35 일째의 CTL 의 세포 상해 활성은 실시예 1-1-(3) 과 동일한 방법으로 평가하였다. 단, 이의 표적세포로서 하룻밤 에피토프 펩티드와 공배양 또는 에피토프 펩티드 비존재하에서 배양한 HLA-A2.1 유지 EBV 트랜스폼 B 세포 (세포명 221A2.1) 를 사용하였다.
그 결과, 유도직후에 특이적 세포 상해 활성은 유도되었으나, 유도시의 L.M.W. 헤파린 및 히알루론산 첨가 유무에 따른 세포 상해 활성의 차이는 거의 없었다.
(3) CTL 의 확대 배양
실시예 5-1-(1) 에서 제조한 CTL 을 사용하고, 실시예 2-1-(2) 와 동일한 방법으로 CTL 을 확대 배양하였다. 이 때, 실시예 5-1-(1) 에서의 CTL 유도시에 첨가한 L.M.W. 헤파린 또는 히알루론산 10㎍/㎖ 이 되도록 첨가하는 군과 유도시로부터 시료를 전혀 첨가하지 않는 군을 설정하였다. 이 사이에 펩티드에 의한 자극은 전혀 부가하지 않고, 배양 개시 1 일째에 최종농도 120U/㎖ 의 IL-2 를 첨가하고, 또한 배양 개시후 4 일째 이후에는 2∼3 일 마다 배양 상층액을 절반 제거후, IL-2 60U/㎖ 및 L.M.W. 헤파린 또는 히알루론산 10㎍/㎖ 를 함유하는 5HRPMI 5㎖ 를 각 플라스크에 첨가하였다. 단, 시료를 첨가하지 않은 군에서는 배지교환시에도 시료는 첨가하지 않았다. 확대 배양 개시후, 14 일째에 실시예 1-1-(3) 과 동일한 방법으로 CTL 의 특이적 세포 상해 활성을 측정하였다. 측정결 과를 표 21 에 나타낸다.
| 시료 | 시료첨가 | 확대증식률 | 펩티드 부가 | 세포 상해 활성 (%) | ||
| CTL 유도시 | 확대 배양시 | E/T 비 | ||||
| 2 | 6 | |||||
| 대조 | － － | － － | ×237 ×237 | － ＋ | 0 29.8 | 0 56 |
| E/T 비 | ||||||
| 3 | 9 | |||||
| L.M.W. 헤파린 | ＋ ＋ | ＋ ＋ | ×433 ×433 | － ＋ | 2.6 65.3 | 3.7 104.8 |
| E/T 비 | ||||||
| 2 | 6 | |||||
| 히알루론산 | ＋ ＋ | ＋ ＋ | ×217 ×217 | － ＋ | 3.6 50.3 | 0 67.7 |
그 결과, CTL 유도시 및 확대 배양시에 L.M.W. 헤파린 또는 히알루론산을 첨가한 군에서는 CTL 은 14 일간의 확대 배양후에도 특이적으로 높은 세포 상해 활성을 유지하였다. 한편, CTL 유도시 및 확대 배양시 모두 이들 시료를 첨가하지 않은 군에서는 그 활성은 명백히 저하되었다. 즉 항 종양 관련 항원 (MAGE3) CTL 의 확대 배양시에도 L.M.W. 헤파린 또는 히알루론산을 CTL 유도시 및 확대 배양시에 첨가함으로써, 특이적으로 높은 세포 상해 활성을 장기적으로 유지한 상태에서 CTL 의 확대 배양이 가능해짐을 알 수 있었다
실시예 5-2
(1) 항 종양 관련 항원 (MART1) 특이적 CTL 의 유도
실시예 1-1-(1) 에 기재된 방법으로 분리, 보존한 PBMC 를 사용하고, 실시예 5-1-(1) 과 동일한 방법으로 항 종양 관련 항원 (MART 1) 특이적으로 CTL 을 유도 하였다. 항원 펩티드로서 멜라노마 항원 MART1 유래의 에피토프 펩티드 (서열목록의 서열번호: 4 에 기재된 멜라노마 항원 MART1 유래의 HLA A2.1 결합성 펩티드 AAGIGILTV) 를 사용하였다. 이 때, 개다시마 유래의 푸코이단 또는 히알루론산 (Calbiochem 사 제조) 을 최종농도 10㎍/㎖ 가 되도록 첨가하였다. 또한 대조로서 시료를 첨가하지 않는 군도 설정하였다.
이렇게 하게 제조한 유도직후의 CTL 의 세포 상해 활성은 실시예 1-1-(3) 과 동일한 방법으로 평가하였다. 단 이 때, 표적세포로서 에피토프 펩티드 비존재하에서 배양한 HLA-A2.1 유지 EBV 트랜스폼 B 세포 (세포명 221A2.1), 이틀밤 100U/㎖ IFN-γ존재하에서 배양한 HLA-A2.1 유지 암 세포주 (세포명 624mel;HLA-A2.1 유지 MART1 발현세포) 또는 HLA-A2.1 비유지 암 세포주 (세포명 888mel; HLA-A2.1 비유지 MART1 발현세포) 를 사용하였다.
그 결과, 유도직후에 특이적 세포 상해 활성은 유도되었으나, 유도시의 시료첨가 유무에 따른 세포 상해 활성의 차이는 거의 없었다.
(2) CTL 의 확대 배양
실시예 5-2-(1) 에서 제조한 CTL 을 사용하고, 실시예 2-1-(2) 와 동일한 방법으로 CTL 을 확대 배양하였다. 이 때, 실시예 5-2-(1) 에서의 CTL 유도시에 첨가한 개다시마 유래의 푸코이단 또는 히알루론산을 10㎍/㎖ 가 되도록 첨가하는 군과 유도시로부터 시료를 전혀 첨가하지 않는 군을 설정하였다. 이 사이에 펩티드에 의한 자극은 전혀 부가하지 않고, 배양 개시 1 일째에 최종농도 120U/㎖ 의 IL-2 를 첨가하고, 또한 배양 개시후 4 일째 이후에는 2∼3 일 마다 배양 상층액을 절반 제거후, IL-2 60U/㎖ 및 개다시마 유래 푸코이단 또는 히알루론산 10㎍/㎖ 를 함유하는 5HRPMI 5㎖ 를 각 플라스크에 첨가하였다. 단, 시료를 첨가하지 않은 군에서는 배지교환시에도 시료는 첨가하지 않았다. 확대 배양 개시후, 14 일째에 실시예 1-1-(3) 과 동일한 방법으로 CTL 의 특이적 세포 상해 활성을 측정하였다. 측정결과를 표 22 에 나타낸다.
| 시료 | 시료첨가 | 확대 증식률 | 펩티드 부가 | 표적세포 | 세포 상해 활성 (%) | |||
| CTL 유도시 | 확대 배양시 | E/T 비 | ||||||
| 2 | 7 | 20 | ||||||
| 대조 | － － － － | － － － － | ×287 ×287 ×287 ×287 | － ＋ － － | 221A2.1 221A2.1 888mel 624mel | 0 8.1 32.5 27.4 | 3.8 27.5 44.8 55.8 | 4.1 43.5 43.7 81.6 |
| E/T 비 | ||||||||
| 2 | 6 | 17 | ||||||
| 개다시마 유래의 푸코이단 | ＋ ＋ ＋ ＋ | ＋ ＋ ＋ ＋ | ×240 ×240 ×240 ×240 | － ＋ － － | 221A2.1 221A2.1 888mel 624mel | 0 28.8 8.2 40.7 | 0 63.2 22.4 78.5 | 0 84.0 19.2 92.2 |
| E/T 비 | ||||||||
| 2 | 6 | 17 | ||||||
| 히알루론산 | ＋ ＋ ＋ ＋ | ＋ ＋ ＋ ＋ | ×217 ×217 ×217 ×217 | － ＋ － － | 221A2.1 221A2.1 888mel 624mel | 0 9.1 0 29.6 | 0 52.8 0 73.8 | 0 74.4 0 90.6 |
그 결과, CTL 유도시 및 확대 배양시에 개다시마 유래의 푸코이단 또는 히알루론산을 첨가한 군에서는 CTL 은 14 일간의 확대 배양후에도 특이적으로 높은 세포 상해 활성을 유지하였다. 한편, CTL 유도시 및 확대 배양시 모두 이들 시료를 첨가하지 않은 군에서는 그 활성은 명백히 저하되었다. 즉, 종양 세포주에 대한 특이적 세포 상해 활성에 대해서도 CTL 유도시 및 확대 배양시에 개다시마 유 래의 푸코이단 또는 히알루론산을 첨가한 군에서는 CTL 은 14 일간의 확대 배양후에도 특이적으로 높은 세포 상해 활성을 유지하였다. 즉, 항 종양 관련 항원 (MART1) CTL 의 확대 배양시에도, 개다시마 유래의 푸코이단 또는 히알루론산을 CTL 유도시 및 확대 배양시에 첨가함으로써, 특이적으로 높은 세포 상해 활성을 장기적으로 유지한 상태에서 CTL 의 확대 배양이 가능해짐을 알 수 있었다.
실시예 6 항체 결합 마그네틱 비즈에 의한 세포선택
실시예 6-1
(1) 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 의 유도
실시예 1-1-(1) 에 기재된 방법으로 분리, 보존한 PBMC 를 사용하고, 실시예 1-1-(2) 와 동일한 방법으로 항 인플루엔자 바이러스 메모리 CTL 을 유도하였다. 이 때, 개다시마 유래의 푸코이단을 최종농도 10㎍/㎖ 가 되도록 첨가하였다. 또한 개다시마 유래의 푸코이단을 첨가하지 않는 군도 설정하였다.
이렇게 하게 제조한 유도개시후 14 일째의 CTL 의 세포 상해 활성은 실시예 1-1-(3) 과 동일한 방법으로 평가하였다. 그 결과, 유도직후에 특이적 세포 상해 활성은 유도되었으나, 유도시의 시료첨가 유무에 따른 세포 상해 활성의 차이는 거의 없었다.
(2) CTL 의 확대 배양
실시예 6-1-(1) 에서 제조한 CTL 을 사용하고, 실시예 3-1-(2) 와 동일한 방법으로 CTL 을 확대 배양하였다. 이 때, 시료로서 최종농도 10㎍/㎖ 가 되도록 개다시마 유래의 푸코이단을 첨가하는 군과 첨가하지 않는 군을 설정하였다. 이 사이에 펩티드에 의한 자극은 전혀 부가하지 않고, 배양 개시 1 일째에 최종농도 120U/㎖ 의 IL-2 를 첨가하고, 또한 배양 개시후 4 일째 이후에는 2∼3 일 마다 배양 상층액을 절반 제거후, IL-2 60U/㎖ 를 함유하는 5HRPMI 5㎖ 를 각 플라스크에 첨가하였다. 이 때, 시료첨가군의 배지에는 최종농도 10㎍/㎖ 가 되도록 개다시마 유래의 푸코이단을 첨가하였다. 확대 배양 개시후, 14 일째에 실시예 1-1-(3) 과 동일한 방법으로 CTL 의 특이적 세포 상해 활성을 측정하였다.
(3) 항체 결합 마그네틱 비즈에 의한 세포선택
실시예 6-1-(2) 에서 제조한 확대 배양후의 CTL 을 빙랭시킨 2%FBS/PBS 로 세정한 후, 동일한 버퍼에 의해 1 ×107 세포/㎖ 로 조정하였다. 이들 세포 현탁액에 미리 빙랭시킨 2%FBS/PBS 로 세정해 둔 Dynabeads M-450 CD4 (항 CD4 항체 결합 마그네틱 비즈, 다이나르사 제조) 를 1 ×107cells 의 세포 당 150㎕ 씩 첨가하였다. 비즈를 함유하는 세포현탁액을 4℃ 에서 천천히 진탕하면서 30 분 인큐베이트하였다. 인큐베이트 후의 세포현탁액이 들어 있는 튜브에 빙랭시킨 2% FBS/PBS 를 첨가하고, Dynabeads 용 자석대 (다이나르사 제조) 를 사용하여 비즈 및 비즈 결합 세포를 제거하였다. 이렇게 하여 수득된항 CD4 항체 결합 비즈 비결합 세포집단 및 선택전의 세포집단에 대해 플로우 사이토미터를 사용하여 CD8＋ 세포의 함유율을 확인하였다. 그 결과를 표 23 에 나타낸다. 또한 실시예 1-1-(3) 과 동일한 방법으로 CTL 의 특이적 세포 상해 활성을 비교하였다. 그 결과를 표 24 에 나타낸다.
| 시료 | 시료첨가 | EBV-B 세포첨가 | CD8＋ 세포함유율 (%) | ||
| CTL 유도시 | 확대 배양시 | 선택전 | 선택후 | ||
| 대조 | － | － | － | 18.1 | 88.0 |
| 개다시마 유래의 푸코이단 | ＋ | ＋ | － | 32.5 | 97.2 |
| REM 법＋개다시마 유래의 푸코이단 | ＋ | ＋ | ＋ | 55.8 | 97.3 |
| 시료 | 시료첨가 | EBV-B 세포첨가 | 펩티드 부가 | 세포 상해 활성 (%) (E/T 비 ＝ 30) | ||
| CTL 유도시 | 확대 배양시 | 선택전 | 선택후 | |||
| 대조 | － － | － － | － － | － ＋ | 10.4 24.0 | 9.4 21.1 |
| 개다시마 유래의 푸코이단 | ＋ ＋ | ＋ ＋ | － － | － ＋ | 7.6 41.8 | 8.4 75.3 |
| REM 법＋개다시마 유래의 푸코이단 | ＋ ＋ | ＋ ＋ | ＋ ＋ | － ＋ | 4.2 87.8 | 6.7 88.2 |
그 결과, CTL 유도시 및 확대 배양시에 개다시마 유래의 푸코이단을 첨가한 군에서는 항체 결합 비즈로 세포선택함으로써 그 세포 상해 활성을 더욱 향상시킬 수 있었다. 또한 REM 법에 의해 CTL 을 확대 배양하고, 항체 결합 비즈로 세포선택하여도 그 세포 상해 활성은 변하지 않았다. 또한 REM 법과 개다시마 유래의 푸코이단 첨가의 병용조건으로 확대 배양후에 항체 결합 비즈로 세포선택함으로써 그 세포 상해 활성을 더욱 향상시킬 수 있었다.
기탁된 생물재료
(1) 기탁기관의 명칭ㆍ수신인명
독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물 기탁센터
일본국 이바라키켕 츠쿠바시 히가시 1 쵸메 1 반치 츄오 다이 6 (우편번호 305-8566)
(2) 기탁된 미생물
(i) 알테로모나스 (Alteromonas) 종 SN-1009
원기탁일: 1996 년 2 월 13 일
국제기탁에 대한 이관 청구일: 1996 년 11 월 15 일
수탁번호: FERM BP-5747
(ii) 플라보박테리움 (Flavobacterium) 종 SA-0082
원기탁일: 1995 년 3 월 29 일
국제기탁에 대한 이관 청구일: 1996 년 2 월 15 일
수탁번호: FERM BP-5402
서열목록 프리텍스트
서열번호: 1 은 인플루엔자 바이러스 유래의 뉴클레오프로테인을 기초로 디자인한 HLA A24 결합성 펩티드이다.
서열번호: 2 는 인플루엔자 바이러스 유래의 매트릭스 프로테인을 기초로 디자인한 HLA A2.1 결합성 펩티드이다.
서열번호: 3 은 멜라노마 항원 MAGE3 유래의 HLA A2.1 결합성 펩티드를 기초로 디자인한 펩티드이다.
서열번호: 4 는 멜라노마 항원 MART1 유래의 HLA A2.1 결합성 펩티드를 기초로 디자인한 펩티드이다.
본 발명에 의해 항원 특이적인 세포 상해 활성이 높은 수준으로 유지된 CTL 을 유도, 유지 및 확대 배양하는 방법이 제공된다. 당해 방법은 대량의 CTL 을 필요로 하는 양자 면역 요법 등의 세포 의료 분야에서 매우 유용하다. 또한 당해 방법에 의해 제조되는 CTL 은 안전한 방법으로 제조되므로 매우 안전성이 높은 세포 의약이다.
<110> Takara Shuzo Co., Ltd.
<120> Method for expansion of antigen specific cytotoxic T lymphocyte
<130> 01-056-PCT
<150> JP 2000-247072
<151> 2000-08-16
<160> 4
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<228> Designed peptide based on nucleoprotein derived from influenza virus.
<400> 1
Arg Phe Tyr Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu
5 10
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide based on matrixprotein derived from influenza virus.
<400> 2
Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu
5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide based on HLA A2.1 binding peptide derived from melanoma antigen MAGE3.
<400> 8
Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val
5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide based on HLA A2.1 binding peptide derived from melanoraa antigen MART1.
<400> 4
Ala Ale Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val
5
Claims (12)
- 항원 특이적인 세포 상해 활성을 갖는 세포 상해성 T 세포를 유도하기 위한 방법으로서, 황산화 다당, 알긴산, 펙틴산, 히알루론산, 황산화 올리고당, 황산화 단당 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 화합물의 존재하에 세포 상해성 T 세포로의 분화능을 갖는 전구세포를 항원 제시세포와 인큐베이트하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 화합물이 푸코이단, 헤파린, 알긴산, 콘드로이틴 황산 A, 콘드로이틴 황산 B, 펙틴산, 히알루론산, 푸코이단 분해물, 황산화 글루코오스, 황산화 푸코오스 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상의 화합물인 방법.
- 항원 특이적인 세포 상해 활성을 갖는 세포 상해성 T 세포를 유지하기 위한 방법으로서, 황산화 다당, 알긴산, 펙틴산, 히알루론산, 황산화 올리고당, 황산화 단당 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상의 화합물의 존재하에 세포 상해성 T 세포를 지속 배양하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 3 항에 있어서, 화합물이 푸코이단, 헤파린, 알긴산, 콘드로이틴 황산 A, 콘드로이틴 황산 B, 펙틴산, 히알루론산, 푸코이단 분해물, 황산화 글루코오스, 황 산화 푸코오스 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상의 화합물인 방법.
- 항원 특이적인 세포 상해 활성을 갖는 세포 상해성 T 세포를 확대 배양하는 방법으로서, 황산화 다당, 알긴산, 펙틴산, 히알루론산, 황산화 올리고당, 황산화 단당 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상의 화합물의 존재하에 세포 상해성 T 세포를 인큐베이트하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 5 항에 있어서, 상기 공정에서, 추가로 항 CD3 항체의 존재하에 세포 상해성 T 세포를 인큐베이트하는 방법.
- 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 상기 공정에서, 세포 상해성 T 세포를 피더 세포와 함께 인큐베이트하는 방법.
- 제 7 항에 있어서, 피더 세포가 비바이러스 감염세포인 방법.
- 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 화합물이 푸코이단, 헤파린, 알긴산, 콘드로이틴 황산 A, 콘드로이틴 황산 B, 펙틴산, 히알루론산, 푸코이단 분해물, 황산화 글루코오스, 황산화 푸코오스 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상의 화합물인 방법.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 수득된 세포 상해성 T 세포 함유 배양물로부터 항원 특이적인 세포 상해 활성을 갖는 세포 상해성 T 세포를 고함유하는 세포집단을 선택하는 공정을 포함하는 세포 상해성 T 세포의 회수 방법.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된 항원 특이적인 세포 상해 활성을 갖는 세포 상해성 T 세포.
- 제 11 항에 기재된 세포 상해성 T 세포를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 치료제.
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