WO2023085351A1 - Ｔ細胞の分化調節剤及び組成物 - Google Patents

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WO2023085351A1
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cell differentiation
cell
differentiation regulator
microalgae
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斉 久野
亜紀子 神野
さと子 小松
美恵 亀谷
志乃 大島
裕介 大野
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株式会社デンソー
学校法人東海大学
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Definitions

  • the present invention relates to a T cell differentiation regulator and composition.
  • Staphylococcus aureus enterotoxin contains a superantigen and is known to cause toxic shock syndrome (TSS) in affected patients (Non-Patent Document 1). These superantigens cross-link the T-cell receptor (TCR) V ⁇ chain and major histocompatibility complex antigens, inducing T-cell receptor signaling (TCR signaling).
  • TSS toxic shock syndrome
  • TCR signaling TCR signaling
  • Patent Document 1 an antiviral agent containing an extract of Coccomyxa algae as an active ingredient has been disclosed (Patent Document 1).
  • Patent Document 2 the development of an anti-influenza agent and a herpesvirus relapsing inhibitor containing an extract of Coccomyxa algae as an active ingredient is also underway (Patent Documents 2 and 3).
  • Patent Document 4 in the presence of fucoidan, which is a sulfated polysaccharide derived from brown algae, antigen-specific cells are obtained by incubating progenitor cells having the ability to differentiate into cytotoxic T cells with antigen-presenting cells. In vitro induction of cytotoxic T cells with cytotoxic activity has been described.
  • T cells suppress excessive immune responses and play an important role in maintaining the homeostasis of the body. is suppressed, and the body's immune system may not function normally, which has been a problem. Therefore, there is a demand for the development of a new means for suppressing over-activation of T-cells after T-cell stimulation by superantigens and the subsequent exhaustion of the immune system.
  • the present invention appropriately controls the differentiation of activated T cells in order to avoid excessive activation of T cells after T cell stimulation by superantigens and the subsequent decline in immune function (immune system exhaustion).
  • the object is to provide a means that can
  • a T-cell differentiation regulator comprising, as an active ingredient, algal bodies of microalgae belonging to the genus Coccomyxa, its dry powder, or its extract.
  • the T cell differentiation regulator of [1] which has an effect of promoting the proliferation of activated effector T cells and an effect of preserving memory T cells.
  • the T cell differentiation regulator of [1] or [2] which suppresses excessive activation of T cells.
  • the microalgae is Coccomyxa sp.
  • the T cell differentiation regulator according to any one of [1] to [3], which is a KJ strain or a mutant strain thereof.
  • a composition comprising the T cell differentiation regulator of any one of [1] to [6].
  • the composition of [7] which is a food, food additive, or feed.
  • [A] A method for regulating T cell differentiation, comprising administering algal bodies of microalgae belonging to the genus Coccomyxa, dry powder thereof, or extracts thereof to a subject in need of regulation of T cell differentiation.
  • [B] An algal body of microalgae belonging to the genus Coccomyxa, a dry powder thereof, or an extract thereof, for use in the treatment of regulation of differentiation of T cells.
  • T cell differentiation regulator capable of appropriately controlling T cell differentiation. This is expected to suppress the excessive activation of T cells after T cell stimulation by a superantigen or the like and the subsequent decline in immune function (immune system exhaustion).
  • FIG. 2 shows the total cell number when human PBMC were stimulated with TSST-1 in the presence of various concentrations of CE, showing the small lymphocyte gate (upper panel) and the large lymphocyte gate (activated lymphocytes) ( Figure below) shows the ratio of cells.
  • FIG. 3 shows morphological observations (KEYENCE BZ-X710 phase contrast) when human PBMCs were stimulated with TSST-1 in the presence of various concentrations of CE (right panel).
  • FIG. 4 shows FCM patterns of lymphocyte subsets.
  • FIG. 6 shows the results of proliferation assays of T cells stimulated with anti-CD3 mAb or anti-CD3/CD28 microbeads.
  • the horizontal axis represents the fluorescence intensity of CFSE, and the peak indicates cell division (left 9 panels; 24 hours, middle 9 panels; 48 hours, right 9 panels 72 hours).
  • the upper panel shows the results without TSST-1 stimulation, the middle panels show the results with TSST-1 stimulation, and the lower panels show the results with TSST-1 stimulation and 3000 ⁇ g/mL CE.
  • Figure 7 shows the mean fluorescence intensity (MFI) of CD25 in the CD4 gate (Th cells) and the CD8 gate (Tc cells). Closed bars are the small lymphocyte gate and open bars are the results of the large lymphocyte gate.
  • FIG. 9 shows FCM patterns of activated and exhausted T cells in the presence or absence of CE. Panels above the dotted line show typical FACS patterns of pre-culture (Day 0) T cells. In FIG. 9, small and large lymphocytes were gated on CD45+CD3+ cells, separated into CD4 and CD8 T cells, and analyzed for CD25 and PD-1 expression levels.
  • FIG. 10 shows IL-10 concentrations in culture supernatants.
  • FIG. 11 shows the percentages of Th1, Th2, and Th17 cells before culture (Day 0) among CD4+ T cells. Closed bars are the small lymphocyte gate and open bars are the results of the large lymphocyte gate.
  • FIG. 12 shows the percentage of Th1, Th2 and Th17 cells after adding different concentrations of CE and culturing for 72 hours. Closed bars are the small lymphocyte gate and open bars are the results of the large lymphocyte gate.
  • FIG. 13 shows FCM patterns of Th cell subsets in the presence or absence of CE.
  • FIG. 14 shows the concentration of each cytokine produced by human PBMC.
  • FIG. 15 shows the expression of naive/memory T cell markers, unstimulated (TSST-1(-)) or stimulated with 0-3000 ⁇ g/ml CE, showing the FCM pattern of CD45RA and CD62L expression on T cells.
  • Figure 17 shows the analysis results of the expression levels of CCR7, CD127, CXCR3, CD95 and CD45RO.
  • FIG. 18 shows FCM patterns for analysis of CD45RA and CD45RO expression levels.
  • small or large lymphocytes were gated on CD3+ cells, separated into CD4 and CD8 T cells, and analyzed for expression levels of CD45RA and CD45RO.
  • a T cell differentiation regulator is an agent for regulating T cell differentiation associated with activation.
  • the T cell differentiation regulator of the present invention accelerates the proliferation of already activated T cells (effector T cells) and at the same time preserves non-activated cell groups (memory T cells). , suppresses depletion of T cells. In this way, since the depletion of T cells is suppressed, it is possible to prevent an immunosuppressive state (lowered immune function), or to escape from the immunosuppressive state (lowered immune function), thereby improving the immune function. Improvement is expected.
  • memory T cells TSCM cells , TCM cells, TEM cells
  • TSCM cells have high self-renewal ability and proliferation ability and survive for a long period of time. It can effectively suppress cell exhaustion and preserve T cells.
  • the T cell differentiation regulator of the present invention regulates the differentiation of activated T cells (effector T cells), reduces the proportion of exhausted T cells, and suppresses the induction of apoptosis.
  • T cell differentiation regulators accelerate the proliferation of activated T cells (effector T cells), but work to prevent T cells from becoming exhausted. If we can reduce the proportion of exhausted T cells and apoptosis, we can prevent excessive suppression of immune function.
  • the T cell differentiation-regulating agent of the present invention regulates the production of inflammatory cytokines. Since overproduction of inflammatory cytokines leads to the induction of cytokine storms, regulating the production of inflammatory cytokines has the effect of suppressing the occurrence of cytokine storms and the associated attenuation of immune function. Be expected.
  • the term "agent” may consist of only “algal bodies of microalgae belonging to the genus Coccomyxa, its dry powder or its extract” as an active ingredient, or may contain additives other than the above active ingredients. may contain. That is, the agent for regulating T cell differentiation of the present invention also includes "algal bodies of microalgae belonging to the genus Coccomyxa, dry powder thereof, or extracts thereof" per se for use in regulating T cell differentiation.
  • the T cell differentiation regulator of the present invention contains algal bodies of microalgae belonging to the genus Coccomyxa, dried powder thereof, or extracts thereof as active ingredients. There are no particular restrictions on the type of microalgae of the genus Coccomyxa, but preferred examples include Coccomyxa sp. KJ strains or variants thereof may be mentioned. Coco Mixa sp. The KJ strain (KJ Denso) was registered on June 4, 2013 by the National Institute of Technology and Evaluation, National Institute of Technology and Evaluation, Biotechnology Center, Patent Organism Depositary Center (NITE-IPOD) (2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Room 120). ) under Accession No. FERM P-22254 and transferred to the International Deposit on June 2, 2015 under the provisions of the Putabest Treaty under Accession No. FERM BP-22254.
  • Mutants of the KJ strain can be obtained by irradiation with ultraviolet rays, X-rays, gamma rays, etc., mutagen treatment, heavy beam irradiation, genetic manipulation (introduction of foreign genes, gene disruption, genetic modification by genome editing, etc.), etc. .
  • the method for obtaining the mutant strain, its characteristics, etc. are not particularly limited.
  • the medium for culturing the genus Coccomyxa microalgae may be one commonly used for culturing microalgae.
  • a medium for known freshwater microalgae containing various nutrients, trace metal salts, vitamins, etc. any medium for marine microalgae can be used.
  • the medium include AF6 medium.
  • the composition of AF6 medium (per 100 ml) is as follows.
  • Nutrients include, for example, nitrogen sources such as NaNO 3 , KNO 3 , NH 4 Cl and urea, and phosphorus sources such as K 2 HPO 4 , KH 2 PO 4 and sodium glycerophosphate.
  • Trace metals include iron, magnesium, manganese, calcium, zinc and the like, and vitamins include vitamin B 1 and vitamin B 12 .
  • the culture method should be agitation while supplying carbon dioxide under aeration conditions. At that time, culture is performed by irradiating light with a fluorescent lamp for 12 hours, irradiating light with a light-dark cycle such as dark conditions for 12 hours, or irradiating with continuous light.
  • the culture conditions are not particularly limited as long as they do not adversely affect the growth of the genus Coccomyxa microalgae.
  • the dry powder of algal bodies can be prepared by subjecting the collected algal bodies to drying treatment and crushing (crushing) treatment.
  • drying treatment for example, drum drying, spray drying, freeze drying, or the like can be employed.
  • a bead crusher, homogenizer, French press, mixer/blender, pulverizer, etc. can be used for the crushing treatment.
  • the order of drying treatment and crushing treatment does not matter.
  • a device having drying and crushing functions may be used to perform the drying treatment and the crushing treatment at the same time.
  • the particle size of the dry powder is not particularly limited.
  • a dry powder having an average particle size of 0.2 ⁇ m to 2 mm, preferably 0.4 ⁇ m to 400 ⁇ m is preferable.
  • the extract of the KJ strain is an extract of Coccomyxa sp.
  • the collected supernatant may be used as it is as an algal extract, or the collected supernatant may be dried and used as an extract.
  • drying treatment of the supernatant for example, drum drying, spray drying, freeze drying, etc. can be employed.
  • the temperature of the water used for extraction may be, for example, a high temperature of 85°C or a low temperature of 10°C or less. preferably.
  • the extraction time is preferably 1 to 100 hours.
  • the dry powder used for extraction can also be the residue obtained by extracting fat-soluble components using an organic solvent such as acetone, ethanol, or hexane.
  • an organic solvent such as acetone, ethanol, or hexane.
  • Microalgae to be used are Kokkomikusa sp. It is not limited to the KJ strain, and other Coccomyxa strains may be used.
  • T cell differentiation regulator of the present invention and compositions containing the same can be used in various applications.
  • the T cell differentiation-regulating agent of the present invention and a composition containing the same can be used, for example, as a pharmaceutical (therapeutic or prophylactic), food, or feed.
  • the T cell differentiation regulator of the present invention or a composition containing the same is, for example, pharmaceuticals, quasi-drugs, cosmetics, sundries, foods, and food additives. , or as a bait, for example, for treatment to improve immune function or prevention of immune attenuation. Effects of drugs include (1) prevention of immunosuppressive state (lowered immune function), (2) improvement of immune function, (3) suppression of excessive immune reaction, and the like.
  • Formulations for manufacturing pharmaceuticals, quasi-drugs, cosmetics and miscellaneous goods can be carried out according to standard methods.
  • Formulation using pharmaceutically acceptable additives e.g., excipients, disintegrants, buffers, emulsifiers, suspending agents, soothing agents, stabilizers, preservatives, preservatives, physiological saline, etc.
  • pharmaceutically acceptable additives e.g., excipients, disintegrants, buffers, emulsifiers, suspending agents, soothing agents, stabilizers, preservatives, preservatives, physiological saline, etc.
  • lactose starch, sorbitol, D-mannitol, white sugar and the like can be used.
  • Starch, carboxymethyl cellulose, calcium carbonate and the like can be used as the disintegrant.
  • Phosphate, citrate, acetate and the like can be used as buffers.
  • Gum arabic, sodium alginate, tragacanth and the like can be used as emulsifiers.
  • suspending agents glyceryl monostearate, aluminum monostearate, methylcellulose, carboxymethylcellulose, hydroxymethylcellulose, sodium lauryl sulfate and the like can be used.
  • Benzyl alcohol, chlorobutanol, sorbitol and the like can be used as analgesics.
  • Propylene glycol, ascorbic acid and the like can be used as stabilizers.
  • Preservatives that can be used include phenol, benzalkonium chloride, benzyl alcohol, chlorobutanol, methylparaben, and the like.
  • antiseptics benzalkonium chloride, paraoxybenzoic acid, chlorobutanol, and the like can be used.
  • the dosage form for formulation is also not particularly limited.
  • dosage forms include tablets, powders, fine granules, granules, capsules, syrups, injections, external preparations (ointments, creams, lotions, liquids, gels, poultices, plasters, tapes , aerosols, etc.), and suppositories.
  • Drugs and quasi-drugs can be administered orally or parenterally (local injection to the affected area, intravenous, intraarterial, subcutaneous, intradermal, intramuscular, or intraperitoneal injection, percutaneous, intranasal) depending on the dosage form. , transmucosal, etc.).
  • Systemic administration and local administration are also indicated by the subject. These administration routes are not mutually exclusive, and two or more arbitrarily selected routes can be used in combination.
  • the pharmaceuticals, quasi-drugs, and cosmetics of the present invention contain an amount of active ingredient necessary to obtain the expected effects (that is, a therapeutically or preventively effective amount).
  • the amount of the active ingredient in the medicament of the present invention generally varies depending on the dosage form, but the amount of the active ingredient is set, for example, within the range of about 0.1% to about 99% by weight so as to achieve the desired dosage.
  • the dosage of the pharmaceuticals, quasi-drugs, and cosmetics of the present invention is set so that the expected effects can be obtained.
  • symptoms, age, sex and weight of the patient are generally taken into consideration.
  • a person skilled in the art can take these matters into consideration and set an appropriate dosage.
  • the dosage can be set so that the amount of the active ingredient per day is 1 mg to 20 mg, preferably 2 mg to 10 mg, for an adult (about 60 kg body weight).
  • As an administration schedule for example, once to several times a day, once every two days, or once every three days can be adopted. In preparing the dosing schedule, the patient's condition and duration of effect of the active ingredient can be taken into consideration.
  • treatment with other medicaments for example, T cell differentiation regulators such as glucocorticoids
  • T cell differentiation regulators such as glucocorticoids
  • Combining the active ingredient of the present invention with a drug having a different mechanism of action can provide multiple actions/effects, and can increase therapeutic effects when applied to improve immune function.
  • the present invention is characterized by administering a therapeutically or prophylactically effective amount of a drug containing the T cell differentiation-regulating agent of the present invention to a patient with weakened immune function or a patient at risk of weakened immune function. Also provided are methods for treatment to improve immune function or to prevent a decline in immune function.
  • Subjects for treatment or prevention are typically humans, but non-human mammals (e.g., monkeys, cows, pigs, horses, goats, sheep, dogs, cats, rabbits, etc.), birds (chickens, geese, etc.). etc. may be applied.
  • T cell differentiation regulators examples include general foods (cereals, vegetables, meat, various processed foods, confectionery and desserts, milk, soft drinks, fruit juice drinks, coffee beverages, vegetable juice drinks, alcoholic beverages, etc.), nutritional supplements (supplements, nutritional drinks, etc.), food additives, pet foods, and pet nutritional supplements.
  • nutritional supplements or food additives they can be provided in the form of powder, granule powder, tablet, paste, liquid, or the like. By providing it in the form of a food composition, it becomes easier to take the active ingredient of the present invention on a daily basis or continuously.
  • the T cell differentiation regulator and composition of the present invention can also be used as a food additive.
  • feed containing a T cell differentiation regulator examples include feed (feed for livestock, poultry, etc.) and pet food.
  • the food or feed of the present invention preferably contains an amount of active ingredient that can be expected to have a therapeutic or preventive effect.
  • the amount to be added can be determined in consideration of the condition, age, sex, weight, etc. of the person to whom it is used.
  • Coccomyxa microalgae extract was added thereto, and the cells were collected after culturing for 24 hours, 48 hours, and 72 hours, and washed with phosphate-buffered saline (PBS).
  • PBS phosphate-buffered saline
  • Pan T cell isolation kit (manufactured by Miltenyi Biotech) was used for sorting T cells. Human PBMC collected and washed by the method described above were incubated with a Pan Tcell Biotin-Antibody cocktail at 4° C. for 5 minutes. Then, after adding 40 ⁇ l of washing buffer, 20 ⁇ l of Pan Tcell Micro Bead Cocktail was added and incubated at 4° C. for 10 minutes. T cells were sorted by the Automax system (program: depletion) (manufactured by Miltenyi Biotech) and labeled with the CellTrace TM Cell Proliferation Kit (manufactured by Thermo Fisher Scientific) according to the manufacturer's manual.
  • Automax system program: depletion
  • CellTrace TM Cell Proliferation Kit manufactured by Thermo Fisher Scientific
  • CFSE 5-(6)-carboxyfluorescein-diacetate-succinimidyl ester
  • Mononuclear cells from each well were harvested, counted, stained with appropriate dilutions of fluorochrome-labeled mAbs for 15 minutes (at 4°C), and treated with 1% (w/v) bovine serum albumin (BSA, Sigma) in PBS. - Aldrich), cells were analyzed at 72 hours to detect surface expression of differentiation antigens using a BD LSRFortessaTM flow cytometer (BD Biosciences). For each analysis, propidium lodide (PI)-negative cells were further gated and viable cells were extracted prior to further analysis with FlowJo software v10.3 (BD). The mAbs used for staining are as follows. For CFSE analysis, a BD FACSVerse TM flow cytometer (manufactured by BD Biosciences) was used.
  • cytokines were quantified using bead-based multiplex LEGENDplex (manufactured by Biolegend) according to the product manual. Specifically, a mixture of 25 ⁇ L of supernatant and 25 ⁇ L of Capture Beads was incubated at room temperature for 2 hours. Beads were washed, mixed with detection antibody and incubated for 1 hour at room temperature. SA-PE was then added and incubated for 30 minutes at room temperature. Finally, the beads were washed and subjected to flow cytometry.
  • Cytokines quantified include IL-1 ⁇ , IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , TNF- ⁇ , MCP-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17A, IL-17F, IL-18, IL-22, IL-23 and IL-33.
  • a BD FACSVerse TM flow cytometer (manufactured by BD Biosciences) was used for the analysis. Data were analyzed with LEGENDPlex TM V8.0 software (manufactured by Biolegend), expressed in pg/ml, and entered into a database.
  • FIG. 1 shows cell numbers when human PBMC were stimulated with TSST-1 in the presence of various concentrations of CE. As shown in FIG. 1, total cell number increased after TSST-1 stimulation, but the level decreased significantly in a CE concentration-dependent manner.
  • FIG. 2 shows the percentage of cells in the large lymphocyte gate (activated lymphocytes) and the small lymphocyte gate. As shown in FIG. 2, the percentage of T cells in the large lymphocyte gate indicating lymphocyte activation was significantly decreased after TSST-1 stimulation in a CE concentration-dependent manner.
  • the size of clusters formed by cell aggregation increased in CE culture at 3000 ⁇ g/ml.
  • the percentage of helper T cells (Th cells) increased slightly but significantly, the percentages of killer T cells (Tc cells), B cells and NK cells decreased significantly, but the percentage of NKT cells did not change. (Figs. 4 and 5).
  • CE enhances differentiation of effector T cells.
  • activated T cells effector T cells
  • effector T cells proliferated faster and that effector T cells were extensively produced by CE. Therefore, surface activation markers of activated T cells (effector T cells) were analyzed.
  • CD25 and programmed cell death-1 (PD-1) expression on both CD4 and CD8 T cells increased after TSST-1 stimulation.
  • PD-1 expression was significantly increased in both CD4 and CD8 T cells, but PD-1 expression was particularly reduced in CD4 T cells (Figs. 7, 8 and 9).
  • CD25 and PD-1 are not only activation markers but also activation markers of regulatory T cells (Treg). Therefore, the amount of secreted IL-10, which is secreted from Treg cells and is known to suppress immune activation, was investigated. As a result, IL-10 secretion was significantly reduced (FIG. 10), suggesting that CE did not enhance Treg differentiation, but cells were activated and not exhausted.
  • Th1 cells increased significantly in the small lymphocyte gate in a CE concentration-dependent manner.
  • Th2 and Th17 cells also tended to increase (FIGS. 11, 12 and 13).
  • CE enhances differentiation of memory T cells. As described above, it was shown that T cells stimulated with TSST-1 in the presence of CE contained both non-proliferating and rapidly dividing cells (activated T cells), suggesting that the T cells of these cells were phenotypically analyzed. As a result, it was found that the proportion of the T cell fraction expressing both CD45RA and CD62L increased in the large lymphocyte gate in a CE concentration-dependent manner (FIGS. 15 and 16). CD45RA and CD62L double positive cells indicate naive T cells. Therefore, we further analyzed the expression levels (MFI) of naive and memory T cell markers such as CCR7, CD127, CD95 and CXCR3.
  • MFI expression levels
  • T cells stimulated with TSST-1 in the presence of CE contain stem cell-like memory T cells (T SCM ).
  • T SCM stem cell-like memory T cells
  • CD45RO Fig. 18
  • CD8 T cells are CD45RO-negative and are typical It was suggested to contain Tscm.
  • CE plays a role in regulating the differentiation of activated T cells stimulated with TSST-1. Specifically, it was suggested that CE activates effector T cells and promotes their differentiation into early memory T cells with a phenotype similar to that of TSCM cells. This suggests that CE can enhance the function of effector T cells while maintaining memory cells with cell proliferation ability.
  • TSST-1-stimulated T cells proliferated faster in the presence of high concentrations of CE.
  • the proportion of effector T cells as Th1, Th2, Th17 cells tended to increase in PBMC.
  • CD25 expression was increased in these T cells, suggesting that some of the T cells were extensively activated.
  • IL-1 ⁇ was observed in these T cells, whereas levels of TNF- ⁇ and IL-10 were significantly decreased. It has been shown that CE can modulate the inflammatory cytokine profile of lymphocytes and/or innate immune cells.
  • PD-1 is a late-activation marker, cells expressing PD-1 are exhausted, and PD-L1/PD-1 signals induce apoptosis.
  • the reduction of PD-1 suggests that T cell exhaustion was suppressed in the presence of CE.
  • CD45RO is not expressed in normal TSCM cells
  • CD45RO is expressed in inducible TSCM cells, central memory T cells ( TCM cells) and effector memory T cells ( TEM cells).
  • CE promotes the differentiation of TSST-1-stimulated and activated T cells into not only central memory T cells ( TCM cells) and effector memory T cells ( TEM cells), but also early memory cells such as TSCM cells. It may be regulated by inducing signals to develop into T cells.
  • the T-cell differentiation-regulating agent of the present invention contains a substance derived from microalgae as an active ingredient, and is capable of regulating the differentiation of T-cells stimulated and activated by TSST-1. For this reason, it is possible to provide prevention and treatment strategies for the reduction in immune function associated with excessive activation of T cells.
  • the T-cell differentiation-regulating agent of the present invention can suppress T-cell exhaustion and apoptosis, it provides a new therapeutic strategy for preventing the onset of cytokine storm and suppressing the deterioration of immune function.
  • the T cell differentiation regulator of the present invention can be expected to be highly safe because its active ingredient is algal bodies of microalgae.

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Abstract

本発明は、スーパー抗原等によるＴ細胞刺激後のＴ細胞の過剰活性化と、それに続く免疫機能の低下（免疫系の疲弊）を回避すべく、Ｔ細胞の分化を適切に制御し得る手段を提供することを課題とする。本発明は、コッコミクサ属に属する微細藻類の藻体、その乾燥粉末又はその抽出物を有効成分として含む、Ｔ細胞の分化調節剤に関する。

Description

Ｔ細胞の分化調節剤及び組成物
　本発明は、Ｔ細胞の分化調節剤及び組成物に関する。
　黄色ブドウ球菌エンテロトキシンにはスーパー抗原が含まれており、罹患患者にｔｏｘｉｃ　ｓｈｏｃｋ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　（ＴＳＳ）を引き起こすことが知られている（非特許文献１）。これらのスーパー抗原は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｖβ鎖と主要組織適合性複合体抗原を架橋し、Ｔ細胞受容体シグナル伝達（ＴＣＲシグナル伝達）を誘導する。しかしながら、反応するＴ細胞は抗原特異性によって選択されないため、多数のＴ細胞が同時に活性化し、サイトカインストームと呼ばれるサイトカインの過剰な産生状態が引き起こされる。サイトカインストームが誘導された場合、過剰な免疫反応を抑制するためにＴ細胞のアポトーシスが生じるとともに制御性Ｔ細胞が広範囲に分化するが、それにより患者の免疫系を疲弊させ、その免疫機能を長期間減衰させることがある（非特許文献２）。
　ところで、従来、藻類は、食品、飼料等に利用されている。藻類の利用方法の一つとして、コッコミクサ藻体の抽出物を有効成分とする抗ウイルス剤が開示されている（特許文献１）。また、コッコミクサ藻体の抽出物を有効成分とする抗インフルエンザ剤やヘルペスウイルス回帰発症抑制剤の開発も進められている（特許文献２及び３）。また、特許文献４には、褐藻類由来の硫酸化多糖であるフコイダンの存在下において細胞傷害性Ｔ細胞への分化能を有する前駆細胞を抗原提示細胞とインキュベートすることによって、抗原特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞を生体外で誘導することが記載されている。
特許第４４１１５２３号公報 特開２０２０－０１９７３０号公報 特開２０２０－０１９７２９号公報 特許第４２３１６８８号公報
Ｊ．Ｅ．　Ａｌｏｕｆ，ｅｔ　ａｌ．，　Ｉｎｔ　Ｊ　Ｍｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　２９２　（２００３）　４２９－４４０．１０．１０７８／１４３８－４２２１－００２３２． Ａ．　Ｔａｙｌｏｒ，ｅｔ　ａｌ．，ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１８５　（２０１０）　６５９１－６５９８．
　制御性Ｔ細胞は過剰な免疫反応を抑制し、生体の恒常性（ホメオスターシス）の維持に重要な役割を果たしているが、T細胞のアポトーシスと制御性Ｔ細胞増殖により、長期間に亘り免疫機能が抑制され、体内の免疫システムが正常に機能しない場合があり問題となっていた。このため、スーパー抗原等によるＴ細胞刺激後のＴ細胞の過剰活性化とそれに続く免疫系の疲弊を抑制する新たな手段の開発が求められている。
　そこで本発明は、スーパー抗原等によるＴ細胞刺激後のＴ細胞の過剰活性化と、それに続く免疫機能の低下（免疫系の疲弊）を回避すべく、活性化したＴ細胞の分化を適切に制御し得る手段を提供することを課題とする。
　上記課題を解決すべく鋭意検討をした結果、コッコミクサ属微細藻類の抽出物が、活性化されたＴ細胞（エフェクターＴ細胞）の増殖を早めつつも、メモリーＴ細胞への分化を亢進させ得ることが見出された。このように、コッコミクサ属微細藻類の抽出物により、Ｔ細胞の過剰活性化を抑制し、メモリーＴ細胞を温存することで、免疫機能減衰の予防や低下した免疫機能が改善される可能性が示唆された。本発明によれば、以下の発明が提供される。
［１］　コッコミクサ属に属する微細藻類の藻体、その乾燥粉末又はその抽出物を有効成分として含む、Ｔ細胞の分化調節剤。
［２］　活性化されたエフェクターＴ細胞の増殖を促進する作用、及びメモリーＴ細胞を温存する作用を有する、［１］に記載のＴ細胞の分化調節剤。
［３］　Ｔ細胞の過剰活性化を抑制する、［１］又は［２］に記載のＴ細胞の分化調節剤。
［４］　前記微細藻類がコッコミクサｓｐ．ＫＪ株又はその変異株である、［１］から［３］の何れか一に記載のＴ細胞の分化調節剤。
［５］　医薬、医薬部外品、化粧品、又は雑貨品である、［１］から［４］の何れか一に記載のＴ細胞の分化調節剤。
［６］　食品、食品添加剤、又は餌である、［１］から［４］の何れか一に記載のＴ細胞の分化調節剤。
［７］　［１］から［６］の何れか一に記載のＴ細胞の分化調節剤を含む組成物。
［８］　医薬、医薬部外品、化粧品、又は雑貨品である、［７］に記載の組成物。
［９］　食品、食品添加剤、又は餌である、［７］に記載の組成物。
［Ａ］　コッコミクサ属に属する微細藻類の藻体、その乾燥粉末又はその抽出物を、Ｔ細胞の分化調節を必要とする対象に投与することを含む、Ｔ細胞の分化調節方法。
［Ｂ］　Ｔ細胞の分化調節の処置において使用するための、コッコミクサ属に属する微細藻類の藻体、その乾燥粉末又はその抽出物。
［Ｃ］　Ｔ細胞の分化調節剤の製造のための、コッコミクサ属に属する微細藻類の藻体、その乾燥粉末又はその抽出物の使用。
　本発明によれば、Ｔ細胞の分化を適切に制御し得るＴ細胞の分化調節剤を提供することができる。これにより、スーパー抗原等によるＴ細胞刺激後のＴ細胞の過剰活性化と、それに続く免疫機能の低下（免疫系の疲弊）を抑制することが期待される。
図１は、ヒトＰＢＭＣを様々な濃度のＣＥの存在下でＴＳＳＴ－１により刺激した場合の総細胞数を示す（スチューデントのｔ検定：*p = 0.05、** p = 0.01、*** p = 0.001、**** p = 0.0001）。 図２は、ヒトＰＢＭＣを様々な濃度のＣＥの存在下でＴＳＳＴ－１により刺激した場合の総細胞数のうち、小リンパ球ゲート（上図）と大リンパ球ゲート（活性化リンパ球）（下図）の細胞の比を示す。 図３は、ヒトＰＢＭＣを様々な濃度のＣＥの存在下でＴＳＳＴ－１により刺激した場合の形態学的観察結果（ＫＥＹＥＮＣＥ　ＢＺ－Ｘ７１０位相差）（右パネル）を示す。左パネルは、ＦＣＭパターン（ＦＳＣ／ＳＳＣ）を示す。 図４は、リンパ球サブセットのＦＣＭパターンを示す。 図５は、ＴＳＳＴ－１で刺激した後、異なる濃度のＣＥの存在下で７２時間培養した後のリンパ球サブセット（Ｔ細胞、Ｔｈ細胞、Ｔｃ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞及びＮＫＴ細胞）の割合を示す（スチューデントのｔ検定：*p = 0.05、** p = 0.01、*** p = 0.001）。小リンパ球ゲート（黒塗り）と大リンパ球ゲート（白塗り）の細胞の比を示す。 図６は、ａｎｔｉ－ＣＤ３　ｍＡｂまたはａｎｔｉ－ＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズで刺激されたＴ細胞の増殖分析結果を示す。横軸はＣＦＳＥの蛍光強度を表し、ピークは細胞の分裂を示す（左９パネル；２４時間、中９パネル；４８時間、右９パネル７２時間）。上段パネルはＴＳＳＴ－１の刺激なし、中段パネルはＴＳＳＴ－１の刺激あり、下段パネルはＴＳＳＴ－１の刺激と３０００μｇ／ｍＬのＣＥありの結果である。 図７は、ＣＤ４ゲート（Ｔｈ細胞）およびＣＤ８ゲート（Ｔｃ細胞）におけるＣＤ２５の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。黒塗りバーは小リンパ球ゲートであり、白塗りバーは大リンパ球ゲートの結果である。 図８は、ＣＤ４ゲート（Ｔｈ細胞）およびＣＤ８ゲート（Ｔｃ細胞）におけるＰＤ－１の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す（スチューデントのｔ検定：*p = 0.05、** p = 0.01、*** p = 0.001）。黒塗りバーは小リンパ球ゲートであり、白塗りバーは大リンパ球ゲートの結果である。 図９は、ＣＥ存在下もしくは非存在下における活性化Ｔ細胞および疲弊Ｔ細胞のＦＣＭパターンを示す。点線より上部のパネルは培養前（Ｄａｙ０）Ｔ細胞の典型的なＦＡＣＳパターンを示す。図９では、小リンパ球と大リンパ球をＣＤ４５＋ＣＤ３＋細胞にゲートし、ＣＤ４Ｔ細胞とＣＤ８Ｔ細胞に分け、ＣＤ２５とＰＤ－１の発現レベルを解析している。３日目（点線より下部のパネル）については、大リンパ球ゲートの細胞のみを示す。なお小リンパ球ゲートと大リンパ球ゲートの両方の分析結果は図７及び８に示す。 図１０は、培養上清中のＩＬ－１０濃度を示す。 図１１は、ＣＤ４＋Ｔ細胞のうち、培養前（Ｄａｙ０）のＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７細胞の割合を示す。黒塗りバーは小リンパ球ゲートであり、白塗りバーは大リンパ球ゲートの結果である。 図１２は、異なる濃度のＣＥを添加し７２時間培養した後の、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７細胞の割合を示す。黒塗りバーは小リンパ球ゲートであり、白塗りバーは大リンパ球ゲートの結果である。 図１３は、ＣＥ存在下もしくは非存在下におけるＴｈ細胞サブセットのＦＣＭパターンを示す。点線より上部のパネルは培養前（Ｄａｙ０）Ｔ細胞の典型的なFCMパターンを示す。図１３では、小リンパ球と大リンパ球をＣＤ４５＋ＣＤ３＋細胞にゲートし、ケモカインレセプターの発現（Ｄａｙ０）に従ってＴｈ細胞サブセットを解析した。３日目（点線より下部のパネル）については、小リンパ球ゲートの細胞のみを示す。 図１４は、ヒトＰＢＭＣが産生する各サイトカイン濃度を示す。縦軸は各サイトカイン濃度（ｐｇ／ｍl）を示す（スチューデントのｔ検定：*p = 0.05、** p = 0.01）。 図１５は、非刺激（ＴＳＳＴ－１（－））または０～３０００μｇ／ｍl　ＣＥで刺激される、ナイーブ／メモリーＴ細胞マーカーの発現を示し、Ｔ細胞上のＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌ発現のFCMパターンを示す。 図１６は、図１５の解析におけるＣＤ４５ＲＡ／ＣＤ６２Ｌダブルポジティブ細胞の割合を示す（スチューデントのｔ検定： ** p = 0.01）。 図１７は、ＣＣＲ７、ＣＤ１２７、ＣＸＣＲ３、ＣＤ９５およびＣＤ４５ＲＯの発現レベルの解析結果を示す。ひとつひとつのパネル内の５つのデータは、上段より、非刺激（ＴＳＳＴ－１（－））、ＣＥ濃度０μｇ／ｍl 、０．３μｇ／ｍl 　、３０μｇ／ｍl 、３０００μｇ／ｍl のデータである。 図１８は、ＣＤ４５ＲＡとＣＤ４５ＲＯの発現レベルを解析するためのFCMパターンを示す。図１８では、小リンパ球または大リンパ球をＣＤ３＋細胞にゲートし、ＣＤ４Ｔ細胞とＣＤ８Ｔ細胞に分け、ＣＤ４５ＲＡとＣＤ４５ＲＯの発現レベルを解析している。
　以下において、本発明について詳細に説明する。以下に記載する構成要件の説明は、代表的な実施形態や具体例に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に限定されるものではない。
１．Ｔ細胞の分化調節剤
　本明細書において、Ｔ細胞の分化調節剤とは、活性化に伴うＴ細胞の分化を調節するための剤である。具体的には、本発明のＴ細胞の分化調節剤は、既に活性化されたＴ細胞（エフェクターＴ細胞）の増殖を早めると同時に、活性化しない細胞群（メモリーＴ細胞）を温存することで、Ｔ細胞の枯渇を抑制する。このように、Ｔ細胞の枯渇が抑制されるため、免疫抑制状態（免疫機能低下状態）となることが予防されたり、免疫抑制状態（免疫機能低下状態）からの脱却が可能となり、免疫機能の改善が期待される。なお、メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ細胞、ＴＣＭ細胞、ＴＥＭ細胞）のうちＴＳＣＭ細胞は、自己複製能や増殖能が高く長期間生存するため、ＴＳＣＭ細胞の割合が増えることで、Ｔ細胞の疲弊を効果的に抑制し、Ｔ細胞を温存することができる。
　また、本発明のＴ細胞の分化調節剤は、活性化されたＴ細胞（エフェクターＴ細胞）の分化を調節し、疲弊したＴ細胞の割合を減らし、アポトーシスの誘導を抑制する。このように、Ｔ細胞の分化調節剤は、活性化されたＴ細胞（エフェクターＴ細胞）の増殖を早めるが、Ｔ細胞を疲弊させないように働く。疲弊したＴ細胞の割合やアポトーシスを減らすことができれば、免疫機能が過度に抑制されることを防ぐことができる。
　さらに、本発明のＴ細胞の分化調節剤は、炎症性サイトカインの産生を調節する。炎症性サイトカインの過剰生成はサイトカインストームの誘導につながるため、炎症性サイトカインの産生を調節することで、サイトカインストームの発生の抑制と、それに伴う免疫機能の減衰を抑制する効果が発揮されることが期待される。
　本明細書において「剤」とは、有効成分としての「コッコミクサ属に属する微細藻類の藻体、その乾燥粉末又はその抽出物」のみからなるものでもよいし、上記の有効成分以外の添加物を含むものでもよい。即ち、本発明のＴ細胞の分化調節剤としては、Ｔ細胞の分化調節のために使用するための「コッコミクサ属に属する微細藻類の藻体、その乾燥粉末又はその抽出物」そのものも含まれる。
２．Ｔ細胞の分化調節剤の有効成分
　本発明のＴ細胞の分化調節剤は、コッコミクサ属（Ｃｏｃｃｏｍｙｘａ）に属する微細藻類の藻体、その乾燥粉末又はその抽出物を有効成分とする。
　コッコミクサ属微細藻類は特に限定されないが、好ましい例としては、コッコミクサｓｐ．ＫＪ株又はその変異株を挙げることができる。コッコミクサｓｐ．ＫＪ株（ＫＪデンソー）は、２０１３年６月４日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構　バイオテクノロジーセンター　特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ－ＩＰＯＤ）（千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２０号室）に受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ－２２２５４として寄託され、２０１５年６月２日付でプタベスト条約の規定下で受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２２５４として国際寄託に移管されている。
　コッコミクサｓｐ．ＫＪ株の変異株は、紫外線、Ｘ線、γ線などの照射、変異原処理、重ビーム照射、遺伝子操作（外来遺伝子の導入、遺伝子破壊、ゲノム編集による遺伝子改変等）等によって得ることができる。活性化したＴ細胞の分化を調節できる変異株が得られる限りにおいて、変異株の取得方法、特性等は特に限定されない。
　コッコミクサ属微細藻類の培養方法は特に限定されない。コッコミクサ属微細藻類を培養するための培地としては、微細藻類の培養に通常使用されているものでよく、例えば、各種栄養塩、微量金属塩、ビタミン等を含む公知の淡水産微細藻類用の培地、海産微細藻類用の培地のいずれも使用可能である。培地としては、例えば、ＡＦ６培地が挙げられる。ＡＦ６培地の組成（１００ｍｌあたり）は以下のとおりである。
　ＮａＮＯ３　　１４ｍｇ
　ＮＨ４ＮＯ３　　２．２ｍｇ
　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　３ｍｇ
　ＫＨ２ＰＯ４　　１ｍｇ
　Ｋ２ＨＰＯ４　　０．５ｍｇ
　ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ　　１ｍｇ
　ＣａＣＯ３　　１ｍｇ
　Ｆｅ－ｃｉｔｒａｔｅ　　０．２ｍｇ
　Ｃｉｔｒｉｃ　ａｃｉｄ　　０．２ｍｇ
　Ｂｉｏｔｉｎ　　０．２μｇ
　Ｔｈｉａｍｉｎｅ　ＨＣｌ　　１μｇ
　Ｖｉｔａｍｉｎ　Ｂ６　　０．１μｇ
　Ｖｉｔａｍｉｎ　Ｂ１２　　０．１μｇ
　Ｔｒａｃｅ　ｍｅｔａｌｓ　　０．５ｍＬ
　Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ　ｗａｔｅｒ　　９９．５ｍＬ
　栄養塩としては、例えば、ＮａＮＯ３、ＫＮＯ３、ＮＨ４Ｃｌ、尿素などの窒素源、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、グリセロリン酸ナトリウムなどのリン源が挙げられる。また、微量金属としては、鉄、マグネシウム、マンガン、カルシウム、亜鉛等が挙げられ、ビタミンとしてはビタミンＢ１、ビタミンＢ１２等が挙げられる。
　培養方法は、通気条件で二酸化炭素の供給とともに攪拌を行えばよい。その際、蛍光灯で１２時間の光照射、１２時間の暗条件などの明暗サイクルをつけた光照射、又は、連続光照射して培養する。培養条件も、コッコミクサ属微細藻類の増殖に悪影響を与えない範囲内であれば特に制限はされないが、例えば培養液のｐＨは３～９とし、培養温度は１０～３５℃とすることが好ましい。
　尚、コッコミクサｓｐ．ＫＪ株の培養方法に関しては、特開２０１５－１５９１８号公報、国際公開第２０１５／１９０１１６号、Satoh,A.et al.,Characterization of the Lipid Accumulation in a New Microalgal Species, Pseudochoricystis ellipsoidea (Trebouxiophyceae) J. Jpn. Inst. Energy (2010) 89:909-913.等に記載の方法を適宜採用できる。
　藻体の乾燥粉末は、回収した藻体を乾燥処理と破砕（粉砕）処理に供することによって調製することができる。乾燥処理としては例えば、ドラムドライ、スプレードライ、凍結乾燥等を採用することができる。破砕処理には、ビーズ式破砕装置、ホモジナイザー、フレンチプレス、ミキサー／ブレンダー、微粉砕機等を利用することができる。乾燥処理と破砕処理の順序は問わない。また、乾燥及び破砕の機能を備えた装置を利用し、乾燥処理と破砕処理を同時に行うことにしてもよい。
　乾燥粉末の粒子径は特に限定されない。例えば、平均粒子径が０．２μｍ～２ｍｍ、好ましくは０．４μｍ～４００μｍの乾燥粉末にすることが好ましい。
　コッコミクサｓｐ．ＫＪ株の抽出物とは、溶媒に水を用い、コッコミクサｓｐ．ＫＪ株の乾燥粉末から抽出される物質である。回収した藻体を乾燥した後、乾燥物を蒸留水に懸濁混合し、遠心分離して得られる上清を採取することで得ることができる。採取した上清は、藻体の抽出物としてそのまま用いられてもよく、採取した上清を乾燥処理したものを抽出物として用いてもよい。なお、上清の乾燥処理としては、例えば、ドラムドライ、スプレードライ、凍結乾燥等を採用することができる。 抽出に使用する水の温度は、例えば85度の高温でも良いし、10度以下の低温でも良く、活性成分を十分に抽出できる範囲内であれば特に限定されず、１０～５０℃の範囲とすることが好ましい。また、抽出時間は、１～１００時間とすることが好ましい。抽出に使用する乾燥粉末は、アセトン、エタノール、ヘキサン等の有機溶媒を用い、脂溶性成分を抽出した残渣を使用することもできる。また使用する微細藻類はコッコミクサｓｐ．ＫＪ株に限定されず、他のコッコミクサ属でもよい。
３．Ｔ細胞の分化調節剤の用途・使用方法
　本発明のＴ細胞の分化調節剤、およびそれを含む組成物は、各種用途に用いることができる。本発明のＴ細胞の分化調節剤、およびそれを含む組成物は、例えば、医薬（治療薬又は予防薬）、食品、又は餌として使用することができる。
（１）医薬、医薬部外品、化粧品及び雑貨品
　本発明のＴ細胞の分化調節剤又はそれを含む組成物は、例えば、医薬、医薬部外品、化粧品、雑貨品、食品、食品添加剤、又は餌として使用することができ、例えば、免疫機能改善のための治療又は免疫減衰予防に使用することができる。医薬の効果としては、（１）免疫抑制状態（免疫機能低下状態）の予防、（２）免疫機能の改善、（３）過剰な免疫反応の抑制、等が含まれる。
　医薬、医薬部外品、化粧品及び雑貨品を製造するための製剤化は常法に従って行うことができる。製剤上許容される添加物（例えば、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を使用して、製剤化を行ってもよい。
　賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、Ｄ－マンニトール、白糖等を用いることができる。
　崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。
　緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。
　乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。
　懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。
　無痛化剤としてはベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。
　安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。
　保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。
　防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。
　製剤化する場合の剤形も特に限定されない。
　剤形の例は錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤、外用剤（軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、液剤、ゲル剤、パップ剤、プラスター剤、テープ剤、エアゾール剤等）、及び座剤である。
　医薬及び医薬部外品はその剤形に応じて経口投与又は非経口投与（患部への局所注入、静脈内、動脈内、皮下、皮内、筋肉内、又は腹腔内注射、経皮、経鼻、経粘膜など）によって対象に適用される。また、全身的な投与と局所的な投与も対象により適応される。これらの投与経路は互いに排他的なものではなく、任意に選択される二つ以上を併用することもできる。
　本発明の医薬、医薬部外品、化粧品には、期待される効果を得るために必要な量（即ち治療又は予防上有効量）の有効成分が含有される。本発明の医薬中の有効成分量は一般に剤形によって異なるが、所望の投与量を達成できるように有効成分量を例えば約０．１重量％～約９９重量％の範囲内で設定する。
　本発明の医薬、医薬部外品、化粧品の投与量は、期待される効果が得られるように設定される。治療又は予防上有効な投与量の設定においては一般に症状、患者の年齢、性別、及び体重などが考慮される。当業者であればこれらの事項を考慮して適当な投与量を設定することが可能である。投与量の例を示すと、成人（体重約６０ｋｇ）を対象として一日当たりの有効成分量が１ｍｇ～２０ｍｇ、好ましくは２ｍｇ～１０ｍｇとなるよう投与量を設定することができる。投与スケジュールとしては例えば一日一回～数回、二日に一回、或いは三日に一回などを採用できる。投与スケジュールの作成においては、患者の状態や有効成分の効果持続時間などを考慮することができる。
　本発明の医薬による治療又は予防に並行して他の医薬（例えば、グルココルチコイドなどのＴ細胞の分化調節剤）による処置を施すことにしてもよい。本発明の有効成分と作用機序の異なる薬剤を併用すれば、複合的な作用／効果が得られ、免疫機能の改善に適用した場合には治療効果の増大を図ることができる。
　本発明は、免疫機能が低下した患者又は免疫機能が低下するおそれのある患者に対して、本発明のＴ細胞の分化調節剤を含む医薬を、治療又は予防上有効量投与することを特徴とする、免疫機能を改善するための治療又は免疫機能の低下を予防するための方法も提供する。治療又は予防の対象は典型的にはヒトであるが、ヒト以外の哺乳動物（例えばサル、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、等）、鳥類（ニワトリ、ガチョウなど）等に適用することにしてもよい。
（２）食品、食品添加物及び餌
　Ｔ細胞の分化調節剤を含む食品の例として一般食品（穀類、野菜、食肉、各種加工食品、菓子・デザート類、牛乳、清涼飲料水、果汁飲料、珈琲飲料、野菜汁飲料、アルコール飲料等）、栄養補助食品（サプリメント、栄養ドリンク等）、食品添加物、愛玩動物用食品、愛玩動物用栄養補助食品を挙げることができる。栄養補助食品又は食品添加物の場合、粉末、顆粒末、タブレット、ペースト、液体等の形状で提供することができる。食品組成物の形態で提供することによって、本発明の有効成分を日常的に摂取したり、継続的に摂取したりすることが容易となる。
　また、本発明のＴ細胞の分化調節剤及び組成物は、食品添加物として使用することもできる。
　Ｔ細胞の分化調節剤を含む餌の例は、例えば飼料（家畜、家禽などの餌）、ペットフードである。
　本発明の食品又は餌は、治療的又は予防的効果が期待できる量の有効成分が含有されることが好ましい。添加量は、それが使用される対象となる者の状態、年齢、性別、体重などを考慮して定めることができる。
　以下に実施例と比較例を挙げて本発明の特徴をさらに具体的に説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す具体例により限定的に解釈されるべきものではない。
＜方法＞
１．コッコミクサ属微細藻類の抽出物（ＣＥ）の調製
　凍結乾燥Ｃｏｃｃｏｍｙｘａ　ｓｐ．　ＫＪ　（ＩＰＯＤ　ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２２５４）２．５ｇを蒸留水２５ｍＬに加え、３７℃で６時間振り混ぜた。次に懸濁液を６０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を採取し、凍結乾燥した。
２．ヒトＰＢＭＣの培養
　ヒトＰＢＭＣは末梢血（ＰＢ）から単離し、単離した細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で５分間、４℃で３００×ｇで洗浄した後、６ウェルプレートに播種した。そして、３７℃かつ５％ＣＯ２条件の下、１μｇ／ｍlのＴＳＳＴ－１（Ｔｏｘｉｎ　Ｔｅｃ．Ｓａｒａｓｏｔａ，ＵＳＡ）存在下、ＲＰＭＩ　１６４０培地「ニッスイ」（日水製薬株式会社製）で培養（１ｘ１０６／ml）した。なお、ＲＰＭＩ　１６４０培地「ニッスイ」には、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、シグマ－アルドリッチ社製）と抗生物質（ストレプトマイシン０．１ｍｇ／ｍl、ペニシリン１００ｕｎｉｔ／ｍl（明治製菓株式会社））が含まれていた。ここに、種々の量のコッコミクサ属微細藻類の抽出物（ＣＥ）を添加し、２４時間、４８時間、７２時間培養後の細胞を収集し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。
３．フローサイトメトリーによる分析
　Ｔ細胞の選別にはＰａｎ　Ｔ細胞単離キット（ミルテニーバイオテク社製）を用いた。上述した方法で採取・洗浄されたヒトＰＢＭＣを、Ｐａｎ　Ｔｃｅｌｌ　Ｂｉｏｔｉｎ－Ａｎｔｉｂｏｄｙカクテルと、４℃で５分間インキュベートした。次いで、洗浄用緩衝液４０μlを加えた後、Ｐａｎ　Ｔｃｅｌｌ　Ｍｉｃｒｏ　Ｂｅａｄ　Ｃｏｃｋｔａｉｌ　２０μlを加え、４℃で１０分間インキュベートした。Ｔ細胞はオートマックスシステム（プログラム：ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）（ミルテニーバイオテク社製）により選別し、製品マニュアルに従って、ＣｅｌｌＴｒａｃｅＴＭ細胞増殖キット（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）で標識した。具体的には、５－（６）－カルボキシフルオレセイン－ジアセテート－スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）粉末をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、富士フイルム和光純薬株式会社製）により５ｍＭの濃度とした後、３７℃、暗所条件下において、Ｔ細胞をＣＦＳＥ（最終濃度５μＭ）で２０分間インキュベートした。その後、Ｔ細胞をＰＢＳで洗浄し、ＲＰＭＩ　１６４０培地で再懸濁した。次いで、マイクロプレートにコーティングされたＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｈｕｍａｎ　Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ＣＤ３／ＣＤ２８（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）またはａｎｔｉ－ＣＤ３でＴ細胞を刺激した。３日間、経時的にＴ細胞を採取し、細胞周期を下記のようにFCMにより分析した。
　各ウェルから単核細胞を採取し、計数し、蛍光色素標識ｍＡｂの適切な希釈液で１５分間染色（４℃環境下）し、ＰＢＳ含有１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、シグマ－アルドリッチ社製）で洗浄し、７２時間で細胞を分析して、ＢＤ　ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａＴＭフローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス社製）を用いて分化抗原の表面発現を検出した。それぞれの分析では、プロピジウムロジド（ＰＩ）陰性細胞をさらにゲートし、生きている細胞を抽出したのち、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアｖ１０．３（ＢＤ）でさらに分析した。染色に用いたｍＡｂは以下のとおりである。なお、ＣＦＳＥ分析は、ＢＤ　ＦＡＣＳＶｅｒｓｅＴＭフローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス社製）を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
４．サイトカインの定量
　＜２．ヒトＰＢＭＣの培養＞において得られた培養上清を採取し、製品マニュアルに従ってｂｅａｄ－ｂａｓｅｄ　ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘ（バイオレジェンド社製）を用いてサイトカイン定量を行った。具体的には、上清２５μＬと２５μＬのＣａｐｔｕｒｅ　Ｂｅａｄｓを混合したものを室温で２時間インキュベートした。ビーズを洗浄し、検出抗体と混合し、室温で１時間インキュベートした。次にＳＡ－ＰＥを加え、室温で３０分間インキュベートした。最後に、ビーズを洗浄し、フローサイトメトリーに供した。定量されたサイトカインは、ＩＬ－１α、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＭＣＰ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－１８、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３およびＩＬ－３３であった。分析には、ＢＤ　ＦＡＣＳＶｅｒｓｅＴＭフローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス社製）を用いた。データはＬＥＧＥＮＤＰｌｅｘＴＭＶ８．０ソフトウェア（バイオレジェンド社製）で解析し、ｐｇ／ｍｌで表し、データベースに入力した。
５．統計解析
　統計解析は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ　Ｅｘｃｅｌ　又はＡＮＯＶＡ　（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ，　Ｒｅｄｍｏｎｄ，　ＷＡ　ＵＳＡ）を用いて行った。データは平均値±標準偏差で表した。
＜結果＞
１．ＣＥは活性化Ｔ細胞の数を調節する。
　図１は、ヒトＰＢＭＣを様々な濃度のＣＥの存在下でＴＳＳＴ－１により刺激した場合の細胞数を示している。図１に示されているように、総細胞数はＴＳＳＴ－１刺激後に増加したが、そのレベルはＣＥ濃度依存的に有意に減少した。
　図２は、大リンパ球ゲート（活性化リンパ球）及び小リンパ球ゲートの細胞の割合を示している。図２に示されているように、リンパ球の活性化を示す大リンパ球ゲートのＴ細胞割合は、ＴＳＳＴ－１刺激後にＣＥ濃度依存的に有意に減少した。
　また、図３に示されているように、３０００μｇ／ｍlのＣＥ培養で細胞の凝集により形成されるクラスターの大きさが拡大した。なお、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ　ｃｅｌｌ）の割合はわずかではあるが有意に増加し、キラーＴ細胞（Ｔｃ　ｃｅｌｌ）、Ｂ細胞およびＮＫ細胞の割合は有意に減少したが、ＮＫＴ細胞の割合は変化しなかった（図４及び図５）。これらの結果はＣＥがＴＳＳＴ－１刺激後のＴ細胞の活性化に影響を与えていることを示唆している。
２．ＣＥはＴ細胞の増殖を調節する。
　上記結果より、ＣＥはＰＢＭＣ細胞数を減少させ、凝集の形態を変化させることが示唆されたので、ＣＥがＴ細胞増殖速度に影響するかについて調べた。
　３，０００μｇ／ｍlのＣＥの存在化もしくは非存在化で、Ｔ細胞を、ＴＳＳＴ－１で７２時間刺激した後に浄化し、ＣＦＳＥでラベル付けし、ａｎｔｉ－ＣＤ３　ｍＡｂ単独またはａｎｔｉ－ＣＤ３およびａｎｔｉ－ＣＤ２８ｍＡｂ結合ビーズで刺激した。２４～７２時間後に細胞を採取し、ＣＦＳＥ減衰法により増殖の程度を測定した。その結果、小リンパ球ゲートと大リンパ球ゲートのＴ細胞は異なるレベルのＣＦＳＥ強度を示し、その傾向は２４時間後も残存していた（図６）。しかし、４８時間後には、高強度ピークは観察されず、大リンパ球ゲートの細胞が分裂し、ピークが減少していることが示唆された。また、図６に示されるように、３，０００μｇ／ｍlのＣＥの存在化で培養された細胞は、ＣＥなしで培養した細胞と比較して、早期（４８ｈｒｓ）の増殖開始を示したが、ＴＳＳＴ－１のみで刺激したＴ細胞と比較して、相当量のＴ細胞は３日目（７２ｈｒｓ）においても非増殖状態のままであった。ＴＳＳＴ－１刺激細胞分画の中で、ＣＤ－３／ＣＤ２８刺激細胞はＣＥ添加に関係なく、ＣＤ３刺激細胞より増殖が少なかった。
　これらの結果は、ＣＥはＴ細胞刺激で細胞増殖しない細胞を温存し増殖細胞の増殖能を維持する一方で、活性化Ｔ細胞の増殖を亢進させることが示唆された。
３．ＣＥはエフェクターＴ細胞の分化を増強する。
　上記結果より、活性化Ｔ細胞（エフェクターＴ細胞）はより速く増殖し、エフェクターＴ細胞はＣＥにより広範囲に産生されることが示唆された。そこで、活性化Ｔ細胞（エフェクターＴ細胞）の表面活性化マーカーを解析した。
　大リンパ球ゲートでは、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の両方のＣＤ２５およびプログラム細胞死－１（ＰＤ－１）発現がＴＳＳＴ－１刺激後に増加した。ＣＥ存在下では、ＣＤ４およびＣＤ８　Ｔ細胞ともにＣＤ２５の発現が有意に増加したが、特にＣＤ４　Ｔ細胞ではＰＤ－１の発現が減少していた（図７、図８及び図９）。
　ＣＤ２５とＰＤ－１は活性化マーカーだけでなく、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の活性化マーカーでもある。このため、Ｔｒｅｇ細胞から分泌され、免疫活性化を抑制することが知られているＩＬ－１０分泌量を調べた。その結果、ＩＬ－１０分泌が有意に減少しており（図１０）、ＣＥはＴｒｅｇの分化を亢進させなかったが、細胞は活性化され疲弊しなかったことが示唆された。
　さらに、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７細胞を検出するための表面マーカーについても解析した。その結果、Ｔｈ１細胞はＣＥ濃度依存的に小リンパ球ゲートで有意に増加した。Ｔｈ２，Ｔｈ１７細胞も増加傾向にあった（図１１、図１２及び図１３）。
　また、ＣＥがサイトカインの分泌に及ぼす影響についても検討した。その結果、ほとんどの炎症性サイトカインは低値に維持されていたが、ＩＬ－１，ＩＬ－１７は有意に増加し、ＩＬ－４，ＩＬ－１３は増加傾向を示した（図１４）。一方、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１８およびＩＬ－２は有意に減少し、ＩＬ－１２ｐ７０は減少傾向を示した。これらの結果は、ＣＥが効果的にエフェクターＴ細胞を発達させたことを示唆する。Ｔｈ１サイトカインは減少傾向にあったが、Ｔｈ１７，Ｔｈ２とともにＴｈ１細胞の比率は増加していた。
４．ＣＥはメモリーＴ細胞の分化を増強する。
　上述したとおり、ＣＥ存在下でＴＳＳＴ－１で刺激されたＴ細胞は非増殖細胞と速やかに分裂する細胞（活性化Ｔ細胞）の両方を含んでいたことが示されたため、これら細胞のＴ細胞の表現型を解析した。その結果、ＣＤ４５ＲＡとＣＤ６２Ｌの両方を発現するＴ細胞分画の割合が大リンパ球ゲートでＣＥ濃度依存的に増加することが見出された（図１５及び図１６）。ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌのダブルポジティブ細胞はナイーブＴ細胞を示す。このため、さらに、ＣＣＲ７、ＣＤ１２７、ＣＤ９５およびＣＸＣＲ３といったナイーブＴ細胞やメモリーＴ細胞のマーカーの発現レベル（ＭＦＩ）を解析した。その結果、３０００μｇ／ｍlのＣＥ培養液のダブルポジティブ細胞は、これらの全マーカー、とりわけＣＤ９５の発現を増加または維持していた（図１７）。これは、ＣＥ存在下でＴＳＳＴ－１で刺激されたＴ細胞に幹細胞様メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が含まれていることを示唆している。なお、CD4ではほとんどのＴ細胞はＣＤ４５ＲＯも発現しており（図１８）、これら細胞は典型的なメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）ではないが、ＣＤ８Ｔ細胞の多くはＣＤ４５ＲＯ陰性であり、典型的なＴｓｃｍを含むことが示唆された。
５．考察
　以上の結果から、ＣＥは、ＴＳＳＴ－１で刺激された活性化Ｔ細胞の分化を調節する役割を果たすことが示された。具体的には、ＣＥはエフェクターＴ細胞を活性化しつつ、ＴＳＣＭ細胞と同様の表現型をもつ初期メモリーＴ細胞への分化を促すことが示唆された。これは、ＣＥが細胞増殖能を有する記憶細胞を維持しつつ、同時にエフェクターＴ細胞の働きを増強し得ることを示唆している。
　ＴＳＳＴ－１で刺激されたＴ細胞は、高濃度のＣＥ存在下でより速く増殖した。Ｔｈ１，Ｔｈ２，Ｔｈ１７細胞としてのエフェクターＴ細胞の割合は、ＰＢＭＣ中で増加する傾向が見られた。また、これらのＴ細胞においては、ＣＤ２５発現が増加しており、Ｔ細胞の一部が広範囲に活性化されていることが示唆された。さらに、これらのＴ細胞においては、ＩＬ‐１βの有意な増加を観察したが、ＴＮＦ‐αとＩＬ‐１０のレベルは有意に減少した。ＣＥはリンパ球および／または自然免疫細胞の炎症性サイトカインプロファイルを調節し得ることが示された。
　また、活性化Ｔ細胞は、ＰＤ－１発現を増加させなかった。ここで、ＰＤ－１はｌａｔｅ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｍａｒｋｅｒであり、ＰＤ－１を発現した細胞は疲弊し、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１シグナルによりアポトーシスが誘導される。このため、ＰＤ‐１の減少は、ＣＥの存在下でＴ細胞の消耗が抑制されたことを示唆している。
　一方、大リンパ球ゲートでは、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２ＬのダブルポジティブＴ細胞の割合が増加し（最大９０％）、このダブルポジティブＴ細胞においては、ＣＣＲ７など他のナイーブマーカーの増強が確認されたが、メモリーマーカーであるＣＤ９５も増強されており、ＴＳＣＭ細胞が産生された可能性が示された。なお、ＣＤ８Ｔ細胞はＣＤ４５ＲＯを発現しないが、大部分のＣＤ４Ｔ細胞のダブルポジティブＴ細胞はＣＤ４５ＲＯを発現していた。ＣＤ４５ＲＯは、通常のＴＳＣＭ細胞では発現していないが、ＣＤ４５ＲＯは、誘導型ＴＳＣＭ細胞やセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）・エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞）に発現する。このため、ＣＥはＴＳＳＴ－１で刺激され活性化したＴ細胞の分化を、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）とエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞）だけでなく、ＴＳＣＭ細胞などの初期メモリーＴ細胞へと発達させるシグナルを誘導することで制御している可能性がある。
　本発明のＴ細胞の分化調節剤は微細藻類由来の物質を有効成分とするものであり、ＴＳＳＴ－１で刺激され活性化したＴ細胞の分化を調節し得る。このため、Ｔ細胞の過剰活性化に伴う免疫機能低減の予防や治療戦略を提供できる。また、本発明のＴ細胞の分化調節剤はＴ細胞の疲弊とアポトーシスを抑制し得るため、サイトカインストームの発症予防や免疫機能低下の抑制のための新たな治療戦略を提供する。そして、本発明のＴ細胞の分化調節剤においては、その有効成分が微細藻類の藻体であるため、高い安全性も期待できる。

Claims (9)

  1. 　コッコミクサ属に属する微細藻類の藻体、その乾燥粉末又はその抽出物を有効成分として含む、Ｔ細胞の分化調節剤。
  2. 　活性化されたエフェクターＴ細胞の増殖を促進する作用、及びメモリーＴ細胞を温存する作用を有する、請求項１に記載のＴ細胞の分化調節剤。
  3. 　Ｔ細胞の過剰活性化を抑制する、請求項１又は２に記載のＴ細胞の分化調節剤。
  4. 　前記微細藻類がコッコミクサｓｐ．ＫＪ株又はその変異株である、請求項１から３の何れか一項に記載のＴ細胞の分化調節剤。
  5. 　医薬、医薬部外品、化粧品、又は雑貨品である、請求項１から４の何れか一項に記載のＴ細胞の分化調節剤。
  6. 　食品、食品添加剤、又は餌である、請求項１から４の何れか一項に記載のＴ細胞の分化調節剤。
  7. 　請求項１から６の何れか一項に記載のＴ細胞の分化調節剤を含む組成物。
  8. 　医薬、医薬部外品、化粧品、又は雑貨品である、請求項７に記載の組成物。
  9. 　食品、食品添加剤、又は餌である、請求項７に記載の組成物。
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