JP2015015918A - 新規微細藻類 - Google Patents
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Abstract
【課題】炭化水素生産能が高い新規微細藻類及び炭化水素の製造方法を提供すること。
【解決手段】新規微細藻類シュードココミクサｓｐ．ＫＪ株（受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２２２５４）。炭化水素生産能を有する上記の新規微細藻類。微細藻類の乾燥重量に占める窒素重量の比率が２ｗｔ％未満の状態において炭化水素生産能を有する上記の新規微細藻類。上記のいずれかの新規微細藻類を培養し、培養物から炭化水素を採取することを特徴とする炭化水素の製造方法。
【選択図】 図２
【解決手段】新規微細藻類シュードココミクサｓｐ．ＫＪ株（受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２２２５４）。炭化水素生産能を有する上記の新規微細藻類。微細藻類の乾燥重量に占める窒素重量の比率が２ｗｔ％未満の状態において炭化水素生産能を有する上記の新規微細藻類。上記のいずれかの新規微細藻類を培養し、培養物から炭化水素を採取することを特徴とする炭化水素の製造方法。
【選択図】 図２
Description
本発明は、例えば、炭化水素（例えば油脂）の製造等に利用可能な新規微細藻類に関する。
従来、炭化水素生産能を有する微細藻類が知られている（特許文献１参照）。その微細藻類を用いて炭化水素を製造し、製造した炭化水素を化石燃料の代替品（例えばバイオディーゼル燃料）とすることが提案されている。
微細藻類を用いて製造した炭化水素で化石燃料を代替するには、炭化水素の製造コストを引き下げる必要がある。そのためには、炭化水素生産能が一層高い微細藻類が求められる。
本発明は以上の点に鑑みなされたものであり、炭化水素生産能が高い新規微細藻類及び炭化水素の製造方法を提供することを目的とする。
本発明の新規微細藻類は、シュードココミクサ（Pseudococcomyxa）ｓｐ．ＫＪ株（受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２２２５４）である。この新規微細藻類は、炭化水素生産能が高い。また、この新規微細藻類は、窒素欠乏状態（例えば、新規微細藻類の乾燥重量に占める窒素重量が２ｗｔ％未満の状態）において、炭化水素生産能を有する。そのため、新規微細藻類の単位乾燥重量当りの炭化水素含有量を高くすることができる。
本発明の炭化水素の製造方法は、上述した新規微細藻類を培養し、培養物から炭化水素を採取することを特徴とする。本発明によれば、炭化水素の製造を効率よく行うことができる。
本発明の実施形態を説明する。新規微細藻類シュードココミクサｓｐ．ＫＪ株は、日本国内の各地から温泉水を採取し、その３０ミリリットルに、ＡＦ６の組成を有する培地を添加し、蛍光灯の光照射下、約２０℃で静置培養したサンプルを顕微鏡下で観察することによって選出した。
新規微細藻類シュードココミクサｓｐ．ＫＪ株の藻類学的性質は以下のとおりである。
Ａ．形態的性質
（１）栄養型細胞は、楕円形又はやや曲がった腎臓形で両端は丸い。短径１〜２μｍ、長径３〜５μｍである。鞭毛を持たず運動性を示さない。アルカリ性では細胞は凝集する。
（２）栄養型細胞は外囲を細胞壁に囲まれ、内部に核、葉緑体が一個存在し、その他、ミトコンドリア、ゴルジ体、液胞、油滴等が認められる。葉緑体内にピレノイドは認められない。
Ｂ．生殖様式
（１）内生胞子は栄養細胞内に四個形成され、細胞内に均等に分布する。内生胞子はその細胞内に核、葉緑体を一個有する。
（２）二分裂による増殖も行う。
Ｃ．生理学・生化学性状
（１）培養液：淡水を素にした培養液中で生育できる。
（２）光合成能：光合成による光独立栄養生育ができる。
（３）含有色素：クロロフィルａ、クロロフィルｂ、及び他のカロチノイド類。
（４）同化貯蔵物質：澱粉。
（５）細胞内に存在する油滴はＮｉｌｅ ｒｅｄによる蛍光染色でオレンジ色の蛍光を示す。
Ａ．形態的性質
（１）栄養型細胞は、楕円形又はやや曲がった腎臓形で両端は丸い。短径１〜２μｍ、長径３〜５μｍである。鞭毛を持たず運動性を示さない。アルカリ性では細胞は凝集する。
（２）栄養型細胞は外囲を細胞壁に囲まれ、内部に核、葉緑体が一個存在し、その他、ミトコンドリア、ゴルジ体、液胞、油滴等が認められる。葉緑体内にピレノイドは認められない。
Ｂ．生殖様式
（１）内生胞子は栄養細胞内に四個形成され、細胞内に均等に分布する。内生胞子はその細胞内に核、葉緑体を一個有する。
（２）二分裂による増殖も行う。
Ｃ．生理学・生化学性状
（１）培養液：淡水を素にした培養液中で生育できる。
（２）光合成能：光合成による光独立栄養生育ができる。
（３）含有色素：クロロフィルａ、クロロフィルｂ、及び他のカロチノイド類。
（４）同化貯蔵物質：澱粉。
（５）細胞内に存在する油滴はＮｉｌｅ ｒｅｄによる蛍光染色でオレンジ色の蛍光を示す。
上記のとおり、新規微細藻類シュードココミクサｓｐ．ＫＪ株は、楕円形又はやや曲がった腎臓形の形状を有し、主要光合成色素として、クロロフィルａ、クロロフィルｂを含有している。また、遊走細胞のステージを持たず、二分裂又は四分胞子の形成によって生殖を行う。さらに、ピレノイドを欠く葉緑体を有する。これらの藻類学的性質は、シュードココミクサ属の藻類学的性質と一致する。
また、１８Ｓ ｒ ＤＮＡ遺伝子を指標とした分子系統解析を行ったところ、新規微細藻類シュードココミクサｓｐ．ＫＪ株は、図１における「Pseudococcomyxa sp.strain KJ」の部分に該当し、シュードココミクサ属と類縁関係を示した。なお、新規微細藻類シュードココミクサｓｐ．ＫＪ株の１８Ｓ ｒ ＤＮＡ遺伝子配列を添付の配列表に示す。
以上の点から、新規微細藻類シュードココミクサｓｐ．ＫＪ株は、シュードココミクサ属に属すると推察される。
ただし、新規微細藻類シュードココミクサｓｐ．ＫＪ株は、後述するように、藻体の乾燥重量に占める窒素重量が２ｗｔ％未満の窒素欠乏状態において炭化水素生産能を有する。この特性は既知のシュードココミクサ属の株には現れないものである。 よって、新規微細藻類シュードココミクサｓｐ．ＫＪ株は、シュードココミクサ属に属する、新種の微細藻類株であると判断できる。
ただし、新規微細藻類シュードココミクサｓｐ．ＫＪ株は、後述するように、藻体の乾燥重量に占める窒素重量が２ｗｔ％未満の窒素欠乏状態において炭化水素生産能を有する。この特性は既知のシュードココミクサ属の株には現れないものである。 よって、新規微細藻類シュードココミクサｓｐ．ＫＪ株は、シュードココミクサ属に属する、新種の微細藻類株であると判断できる。
新規微細藻類シュードココミクサｓｐ．ＫＪ株は、２０１３年６月４日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ−ＩＰＯＤ）（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２０号室）に受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２２２５４として寄託されている。
２．微細藻類を用いる炭化水素の製造方法
新規微細藻類シュードココミクサｓｐ．ＫＪ株は、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）の結果、炭化水素として、炭素数１６〜２４の脂肪酸、および前記脂肪酸とグリセリンとがエステル結合したモノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、トリアシルグリセロールを生産することが確認された。この炭化水素には、油脂に該当するものが含まれる。
新規微細藻類シュードココミクサｓｐ．ＫＪ株は、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）の結果、炭化水素として、炭素数１６〜２４の脂肪酸、および前記脂肪酸とグリセリンとがエステル結合したモノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、トリアシルグリセロールを生産することが確認された。この炭化水素には、油脂に該当するものが含まれる。
新規微細藻類シュードココミクサｓｐ．ＫＪ株を培養するための培地としては、微細藻類の培養に通常使用されているものでよく、例えば、各種栄養塩、微量金属塩、ビタミン等を含む公知の淡水産微細藻類用の培地、海産微細藻類用の培地のいずれも使用可能である。培地としては、例えば、ＡＦ６培地が挙げられる。ＡＦ６培地の組成（１００ｍｌあたり）は以下のとおりである。
NaNO3 14mg
NH4NO3 2.2mg
MgSO4・7H2O 3mg
KH2PO4 1mg
K2HPO4 0.5mg
CaCl2・2H2O 1mg
CaCO3 1mg
Fe-citrate 0.2mg
Citric acid 0.2mg
Biotin 0.2μg
Thiamine HCl 1μg
Vitamin B6 0.1μg
Vitamin B12 0.1μg
Trace metals 0.5mL
Distilled water 99.5mL
栄養塩としては、例えば、ＮａＮＯ３、ＫＮＯ３、ＮＨ４Ｃｌ、尿素などの窒素源；Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、グリセロリン酸ナトリウムなどのリン源が挙げられる。また、微量金属としては、鉄、マグネシウム、マンガン、カルシウム、亜鉛等が挙げられ、ビタミンとしてはビタミンＢ１、ビタミンＢ１２等が挙げられる。
NH4NO3 2.2mg
MgSO4・7H2O 3mg
KH2PO4 1mg
K2HPO4 0.5mg
CaCl2・2H2O 1mg
CaCO3 1mg
Fe-citrate 0.2mg
Citric acid 0.2mg
Biotin 0.2μg
Thiamine HCl 1μg
Vitamin B6 0.1μg
Vitamin B12 0.1μg
Trace metals 0.5mL
Distilled water 99.5mL
栄養塩としては、例えば、ＮａＮＯ３、ＫＮＯ３、ＮＨ４Ｃｌ、尿素などの窒素源；Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、グリセロリン酸ナトリウムなどのリン源が挙げられる。また、微量金属としては、鉄、マグネシウム、マンガン、カルシウム、亜鉛等が挙げられ、ビタミンとしてはビタミンＢ１、ビタミンＢ１２等が挙げられる。
培養方法は、通気条件で二酸化炭素の供給とともに攪拌を行えばよい。その際、蛍光灯で１２時間の光照射、１２時間の暗条件などの明暗サイクルをつけた光照射、又は、連続光照射して培養する。
また、培養条件も微細藻類の増殖に悪影響を与えない範囲内であれば特に制限はされないが、例えば培養液のｐＨは３〜５とすることが好ましく、培養温度は、２０〜３０℃にすることが好ましい。以上のような条件で培養すると、培養開始から６〜８日程度で、上記の炭化水素が採取できる。
また、培養方法として、例えば、窒素が欠乏していない状態（例えば、Ｎ／ＤＷが２ｗｔ％以上の状態）で新規微細藻類シュードココミクサｓｐ．ＫＪ株を増殖させ、次に、窒素欠乏状態（例えば、Ｎ／ＤＷが２ｗｔ％未満の状態）で新規微細藻類シュードココミクサｓｐ．ＫＪ株を培養し、油脂含量（藻体の単位乾燥重量当りの油脂含有量）を高めることができる。なお、Ｎ／ＤＷは、藻体の乾燥重量に占める窒素重量の比率である。
生産された炭化水素は培養藻体から採取できる。例えば、フレンチプレスやホモジナイザーなどの一般的な方法により細胞を破砕してからｎ−ヘキサンなどの有機溶媒によって抽出する方法や、細胞をガラス繊維等のフィルター上に回収し、乾燥させてから、有機溶媒などによって抽出する方法を用いることができる。
また、細胞を遠心分離で回収し、凍結乾燥して粉末化し、その粉末から有機溶媒で炭化水素を抽出することも可能である。抽出後の溶媒を、減圧又は常圧下で、また加温又は常温で揮散させることにより目的の炭化水素が得られる（炭化水素を製造できる）。
本発明により製造された炭化水素は、例えば、既存の化石燃料の代替となるバイオ燃料（例えばバイオディーゼル）、潤滑油、プラスチック・合成繊維・塗料などの工業原料として使用できる。本発明による炭化水素の製造は、光合成によって行われるため、地球温暖化の原因となっている二酸化炭素排出量を軽減でき、環境負荷を抑制できる。
以下の条件で、新規微細藻類シュードココミクサｓｐ．ＫＪ株を培養した。また、比較例として、既知の微細藻類シュードココミクサＯｂｉ株、及び既知の微細藻類シュードココミクサＮ１株も同条件で培養した。
培養の具体的な手順は以下のとおりとした。
（１）ＡＦ６培地を調製する。
（２）１２１℃、２０ｍｉｎの条件で培地を滅菌し、藻類を植藻する。
（３）２％Ｃ０２を通気する
（４）光（約１００μmol/m2/s）を照射しながら室温（25℃）にて培養する。
（１）ＡＦ６培地を調製する。
（２）１２１℃、２０ｍｉｎの条件で培地を滅菌し、藻類を植藻する。
（３）２％Ｃ０２を通気する
（４）光（約１００μmol/m2/s）を照射しながら室温（25℃）にて培養する。
培養中、所定時間ごとに、一定量の培養液をサンプルとして取り出し、ＯＤ値、ＤＷ、ｐＨ、及び油脂含量を測定した。ここで、ＯＤ値は、サンプル内を通る所定長の光路において光を吸収する程度を表す指標であり、サンプル中の藻体濃度（単位体積の培養液中の藻体の乾燥重量）が高いほど、高い値を示す。ＤＷは一定量のサンプル中に含まれる藻類の乾燥重量である。
図２に、藻体濃度の推移を示す。また、図３に、培養液全体に含まれる油脂の量（油脂蓄積量）の推移を示す。また、図４に、藻体の乾燥重量に占める窒素重量の比率（Ｎ／ＤＷ）と、油脂含量との相関関係を示す。
なお、藻体濃度は、取り出したサンプルの体積と、ＤＷとから算出できる。また、油脂蓄積量は、ＤＷ、油脂含量、取り出したサンプルの体積、及び培養液の全体積から算出できる。
図２に示すように、新規微細藻類シュードココミクサｓｐ．ＫＪ株は、藻体の増殖が早く、図３に示すように、油脂蓄積量が短時間で増大する。また、図４に示すように、Ｎ／ＤＷが２ｗｔ％未満の状態においても、油脂の蓄積を継続することができ、最終的な油脂蓄積量を高くすることができる。
基本的には前記実施例１と同様にして、新規微細藻類シュードココミクサｓｐ．ＫＪ株を培養した。ただし、本実施例では、培養液のｐＨを種々に変え、それぞれのｐＨで培養を行った。培養中、所定時間ごとに、一定量の培養液をサンプルとして取り出し、ＯＤ値、ＤＷ、ｐＨ、及び油脂含量を測定した。
培養液のｐＨと、一定時間培養後のＯＤ値との相関関係を図５に示す。また、培養液のｐＨと比増殖速度との相関を図６に示す。なお、比増殖速度は、時間の経過に伴うＤＷの変化量から算出できる。
図５、及び図６に示されているように、新規微細藻類シュードココミクサｓｐ．ＫＪ株は、培養液のｐＨが３〜５の場合、一層増殖が早くなり、ｐＨが３〜４の場合、さらに増殖が早くなった。
尚、本発明は前記実施の形態になんら限定されるものではなく、本発明を逸脱しない範囲において種々の態様で実施しうることはいうまでもない。
例えば、新規微細藻類シュードココミクサｓｐ．ＫＪ株を培養し、油脂を製造する方法は他の方法であってもよい。例えば、培養槽から微細藻類の一部を取り出し、その取り出した微細藻類については窒素欠乏状態として油脂含量を増大させるとともに、培養槽に残った微細藻類については、窒素を補充し、微細藻類を増殖させることができる。そして、以上の工程を繰り返すことができる。
例えば、新規微細藻類シュードココミクサｓｐ．ＫＪ株を培養し、油脂を製造する方法は他の方法であってもよい。例えば、培養槽から微細藻類の一部を取り出し、その取り出した微細藻類については窒素欠乏状態として油脂含量を増大させるとともに、培養槽に残った微細藻類については、窒素を補充し、微細藻類を増殖させることができる。そして、以上の工程を繰り返すことができる。
Claims (4)
- 新規微細藻類シュードココミクサｓｐ．ＫＪ株（受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２２２５４）。
- 炭化水素生産能を有する請求項１に記載の新規微細藻類。
- 前記新規微細藻類の乾燥重量に占める窒素重量の比率が２ｗｔ％未満の状態において炭化水素生産能を有する請求項２に記載の新規微細藻類。
- 請求項１〜３のいずれか１項に記載の新規微細藻類を培養し、培養物から炭化水素を採取することを特徴とする炭化水素の製造方法。
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