JP6036526B2

JP6036526B2 - 新規微細藻類及びその利用

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Publication number: JP6036526B2
Application number: JP2013097883A
Authority: JP
Inventors: 隆嶋村; 健郎徳弘; 福田　裕章; 裕章福田; さと子小松
Original assignee: Denso Corp
Current assignee: Denso Corp
Priority date: 2013-05-07
Filing date: 2013-05-07
Publication date: 2016-11-30
Anticipated expiration: 2033-05-07
Also published as: JP2014217303A

Description

本明細書は、新規微細藻類及びその利用に関する。

近年、食糧と競合しない微細藻類を用いたバイオ燃料が注目されている。例えば、炭素数１７〜２０の飽和又は不飽和脂肪族炭化水素生産能を有する微細藻類（シュードコリシスティスエリプソイディア）が開示されている（特許文献１）。また、培養を窒素欠乏条件下で行う前記炭化水素の製造方法も開示されている（特許文献１）。

国際公開第２００６／１０９５８８号明細書

特許文献１に開示される微細藻類は、光合成に要する窒素量が多く、また、夜間培養時での呼吸活性が高い。すなわち、光合成のために多くの窒素源を要し、増殖のために栄養源を消耗する傾向がある。このため、この微細藻類については、油脂や炭化水素等の生産性の一層の改善が望まれていた。

本明細書は、より効率的な光合成特性及び呼吸特性を有し、増殖性や代謝物の生産性に優れた微細藻類及びその利用を提供する。

本発明者らは、新規な微細藻類の探索及び収集を行った結果、ある微細藻類が、従来の微細藻類と比較して呼吸活性が低く、炭水化物等の生産性が良好な微細藻類であるという知見を得た。本明細書によれば以下の手段が提供される。

（１）コッコミクサ（Coccomyxa）属に属するＳＴＴ株（受領番号ＦＥＲＭＡＰ−２２２５０）である微細藻類。
（２）グリセリド生産能を有する、（１）に記載の微細藻類。
（３）炭化水素生産能を有する、（１）又は（２）に記載の微細藻類。
（４）エチレングリコール重合体生産能を有する、（１）〜（３）のいずれかに記載の微細藻類。
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載の微細藻類を培養する工程を備える、グリセリドの生産方法。
（６）（１）〜（４）のいずれかに記載の微細藻類を培養する工程を備える、炭化水素の生産方法。
（７）（１）〜（４）のいずれかに記載の微細藻類を培養する工程を備える、エチレングリコール重合体の生産方法。
（８）（１）〜（４）のいずれかに記載の微細藻類を、２０℃以上４０℃以下、ｐＨが３以上７以下で培養する、微細藻類の培養方法。

ＳＴＴ株を２週間培養した時の藻体濃度を示す図である。ＳＴＴ株を２週間培養した時の油脂蓄積量を示す図である。ＳＴＴ株の窒素欠乏条件以降における油脂生産速度を示す図である。ＳＴＴ株の乾燥重量あたりの光合成速度を示す図である。ＳＴＴ株の乾燥重量あたりの呼吸速度を示す図である。ＳＴＴ株の窒素十分条件及び窒素欠乏条件下での生成物を示す図（ＧＣ−ＭＳ）である。ＳＴＴ株の温度による増殖特性を示す図である。

本明細書の開示は、コッコミクサ（Coccomyxa)属に属する新規微細藻類及びその利用に関する。

（微細藻類）
本明細書に開示される新規微細藻類は、本発明者らが湖から分離したコッコミクサ・スピーシーズ（Coccomyxa sp.）に属するＳＴＴ株が挙げられる。

本微細藻類株は、日本国内の各地から温泉水、河川及び湖水に生息する藻類を採取し、その一部を下記表１に示す組成を有するＡＦ−６培地（ｐＨ３）を添加し、蛍光灯の光照射下、約２５℃で静置培養したサンプルをナイルレッドで染色して蛍光顕微鏡下で観察することによって選出した。ＳＴＴ株の藻類学的性質は以下のとおりである。

Ａ．形態的性質
（１）栄養型細胞は、楕円形又はやや曲がった腎臓形で両端は丸い。短径１〜２μｍ、長径３〜４μｍである。鞭毛を持たず運動性を示さない。アルカリ性では細胞は凝集する。
（２）栄養型細胞は外囲を細胞壁に囲まれ、内部に核、葉緑体が一個存在し、その他、ミトコンドリア、ゴルジ体、液胞、油滴等が認められる。葉緑体内にピレノイドは認められない。

Ｂ．生殖様式
（１）内生胞子は栄養細胞内に四個形成され、細胞内に均等に分布する。内生胞子はその細胞内に核、葉緑体を一個有する。
（２）二分裂による増殖も行う。
Ｃ．生理学・生化学性状
（１）培養液：淡水を素にした培養液中で生育できる。
（２）光合成能：光合成による光独立栄養生育ができる。
（３）含有色素：クロロフィルａ、クロロフィルｂ、及び他のカロチノイド類。
（４）同化貯蔵物質：澱粉。
（５）生育温度域：１５℃〜３５℃（至適温度２５℃）。
（６）生育ｐＨ域：ｐＨ３．０〜１１．０（至適ｐＨは７．０）。
（７）細胞内に存在する油滴はＮｉｌｅｒｅｄによる蛍光染色でオレンジ色の蛍光を示す。はＮｉｌｅｒｅｄ染色しＳＴＴ株の典型的な中性脂質の蛍光パターンを示す。

以上のとおり、ＳＴＴ株は楕円形又はやや曲がった腎臓形の形状を有し、主要光合成色素として、クロロフィルａ、クロロフィルｂを含有している。また、遊走細胞のステージを持たず、二分裂又は四分胞子の形成によって生殖を行う。さらに、ピレノイドを欠く葉緑体を有する。

以上の点から、ＳＴＴ株は形態学的には既知のトレボウクシア藻綱の緑藻であるコッコミクサ属によく一致し、コッコミクサ属に属すると推察された。また、１８ＳｒＤＮＡ遺伝子を指標とした分子系統解析を行った。結果を表２に示す。表２に示すように、ＳＴＴ株の１８ＳｒＤＮＡは、既知のコッコミクサ属と高い類縁関係を示し、なかでも、コッコミクサ・スピーシーズと高い類縁関係を示し、分子系統解析上も、コッコミクサ・スピーシーズに属すると推察された。ＳＴＴ株の１８ＳｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１に示す。

さらに、ＳＴＴ株は、グリセリド生産能、炭化水素生産能、及びエチレングリコール重合体生産能を有し、既知の微細藻類株（特許文献１記載のＭＢＩＣ１１２０４株及びＭＢＩＣ１１２２０株）に比較して低い呼吸活性（呼吸速度２００μｍｏｌＯ₂／ｇ／ｈ以下、好ましくは１５０μｍｏｌＯ₂／ｇ／ｈ以下、さらに好ましくは１４０μｍｏｌＯ₂／ｇ／ｈ以下、２５℃）であった。グリセリド生産能は、好適には窒素欠乏条件での培養で発揮され、炭化水素生産能は、好適には窒素十分条件での培養で発揮され、エチレングリコール重合体生産能は、好適には窒素欠乏条件での培養で発揮される。なお、窒素欠乏条件及び窒素十分条件については後段で詳述する。

以上のことから、本発明者らは、ＳＴＴ株をCoccomyxa属に属する新種の微細藻類株と判断し、Coccomyxa sp.に属するＳＴＴ株と命名した。

ＳＴＴ株は、２０１３年４月３０日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ）（〒２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８１２０号室）に受領番号ＦＥＲＭＡＰ−２２２５０として寄託されている。

（微細藻類を用いるグリセリドの生産方法）
本明細書に開示される、グリセリドの生産方法は、ＳＴＴ株を培養する工程を備える、グリセリドの生産方法が提供される。本明細書において「グリセリド」とは、グリセリンの脂肪酸とのエステルを意味しており、脂肪酸のエステル結合数は特に限定しないし、脂肪酸の種類も特に限定しない。なお、ＳＴＴ株の藻体内に見出される油滴を分析したところ、グリセリドの脂肪酸は、炭素数が１６以上１８以下の飽和又は不飽和脂肪族酸であった。なお、本グリセリドの生産方法で生産されるグリセリドには、炭素数１０〜２５の飽和若しくは不飽和脂肪酸をエステルとして有するグリセリドが含まれうる。

ＳＴＴ株を培養することで、ＳＴＴ株は、グリセリドを生産し藻体内に蓄積することができる。培養条件は特に限定しないが、窒素欠乏条件であると、酸素発生速度（光合成速度）も低下する傾向があるが、ＳＴＴ株は、厳しい窒素欠乏条件、すなわち、藻体の乾燥重量（ＤＷ）あたりの窒素含量（Ｎ）、すなわち、Ｎ／ＤＷが０．０７５以下の条件であっても、特許文献１記載のＭＢＩＣ１１２０４株及びＭＢＩＣ１１２２０株よりも、光合成速度が高く油脂を蓄積することができる。すなわち、より少ない窒素源でグリセリドを生産することができる。さらに好ましくは、０．０５以下であり、一層好ましくは、０．０３以下であり、より一層好ましくは０．０２以下である。また、Ｎ／ＤＷは０．０１５以上である。なお、こうした窒素欠乏条件は、通常の窒素含有量の培地でＳＴＴ株の培養を開始し、ＳＴＴ株が増殖してくることで、結果として窒素欠乏条件が成立する培養状態となることでも取得できる。あるいは、当初は、通常の窒素含有量の培地でＳＴＴ株を培養した後、窒素欠乏条件となる培地で培地交換することで取得してもよい。窒素欠乏条件が成立する培地としては、例えば、既述のＡＦ−６培地から窒素成分を全て除去した培地が挙げられる。

ＳＴＴ株を培養するための培地としては、微細藻類の培養に通常使用されているものでよく、例えば、各種栄養塩、微量金属塩、ビタミン等を含む公知の淡水産微細藻類用の培地、海産微細藻類用の培地のいずれも使用可能である。栄養塩としては、例えば、ＮａＮＯ_３、ＫＮＯ_３、ＮＨ_４Ｃｌ、尿素などの窒素源；Ｋ_２ＨＰＯ_４、ＫＨ_２ＰＯ_４、グリセロリン酸ナトリウムなどのリン源が挙げられる。また、微量金属としては、鉄、マグネシウム、マンガン、カルシウム、亜鉛等が挙げられ、ビタミンとしてはビタミンＢ_１、ビタミンＢ_１２等が挙げられる。培養方法は、通気条件で二酸化炭素の供給とともに攪拌を行えばよい。その際、蛍光灯で１２時間の光照射、１２時間の暗条件などの明暗サイクルをつけた光照射、又は、連続光照射して培養する。また培養条件も微細藻類の増殖に悪影響を与えない範囲内であれば特に制限はされない。

培養液のｐＨについては、３以上１１以下（好ましくは３．０以上１１．０以下）とすることができる。例えば、培養温度が１０℃以上２０℃未満程度の場合には、ｐＨは６以上８以下（好ましくは６．０以上８．０以下）であることが好ましく、同２０℃以上３０℃未満程度の場合には、ｐＨは３以上７以下（好ましくはｐＨ３．０以上７．０以下）であることが好ましく、同３０℃以上４０℃以下程度の場合には、ｐＨは４以上６以下（好ましくは４．０以上６．０以下）が好ましい。ＳＴＴ株は、３５℃程度の高い培養温度でも、炭酸ガスをバブリング等して培養液に導入する場合、培地の酸性化にもかかわらず高い増殖性を示すことができる。以上のことから、ＳＴＴ株を２０℃以上４０℃以下で培養する際、炭酸ガスの導入を伴ってあるいは伴わないでもｐＨが３以上７以下（好ましくは３．０以上７．０以下）で培養することが好ましい。本明細書の開示によれば、以上の培養条件でのＳＴＴ株の培養方法も提供される。なお、ＳＴＴ株は、ｐＨが３以上４以下（３．０以上４．０以下）という低いｐＨでも生育できることが有利である。すなわち、開放系培養であっても、他の微生物による汚染を防ぐことができるからである。

また、１０℃以上５０℃以下程度とすることができる。好ましくは２０℃以上４０℃以下である。

以上のような条件で培養すると、培養開始から６〜８日程度で、グリセリドが藻体内に生産され蓄積される。

培地としては、より具体的には、培養液には、独立行政法人国立環境研究所微生物系統保存施設の培地リストのサイト（http://mcc.nies.go.jp/02medium.html）において開示されるＡＦ−６培地（表３参照）（Kato, S. 1982 Laboratory culture and morphology of Colacium vesiculosum Ehrb. ( Euglenophyceae ). Jpn. J. Phycol., 30, 63-67 ( in Japanese with English summary ).をｐＨ３〜１１程度（好ましくは３〜７程度）に調整したものを用いることができる。この培養液に、ＳＴＴ株を殖菌し、２５℃、蛍光灯の光照射下（連続照明下又は明暗周期下）で静置又は振盪又は空気通気を行うことによって培養できる。また、空気中へ二酸化炭素を１〜５％程度付加すると、増殖が促進され、好ましい。また、既知の淡水産微細藻類用の培地も用いることが可能である。さらに、既知の淡水産微細藻類用の培地をベースに作成した寒天平板培地も利用可能である。

藻体内に蓄積されたグリセリドは、培養藻体を回収することにより得ることができる。培養藻体からのグリセリドの抽出方法は特に限定されないで、公知の手法を採用できる。例えば、回収した培養藻体をフレンチプレスやホモジナイザーなどの一般的な方法により細胞を破砕してからｎ−ヘキサンなどの有機溶媒によって抽出してもよいし、細胞をガラス繊維等のフィルター上に回収し、乾燥させてから、有機溶媒などによって抽出してもよい。さらに、細胞を遠心分離で回収し、凍結乾燥して粉末化し、その粉末から有機溶媒で抽出してもよい。することも可能である。さらに、抽出後の溶媒を、減圧又は常圧下で、また加温又は常温で揮散させることにより目的のグリセリドを得ることができる。なお、グリセリドからは、一般的な加水分解等によりエステルを解裂させて飽和又は不飽和脂肪酸を得ることができる。

以上のことから、本明細書に開示されるグリセリドの生産方法は、ＳＴＴ株が生産するグリセリドに由来する飽和又は不飽和脂肪酸の生産方法としても実施できる。

（微細藻類を用いる炭化水素の生産方法）
本明細書に開示される炭化水素の生産方法は、ＳＴＴ株を培養する工程を備えることができる。こうすることで、飽和若しくは不飽和脂肪酸又は脂肪族炭化水素を生産させ、取得することができる。例えば、炭素数が１７の飽和若しくは不飽和の脂肪族炭化水素を生産させることができる。また、こうした脂肪族炭化水素を他の脂肪族炭化水素等よりも優位に生産させ、取得することもできる。例えば、Ｃ１７脂肪族炭化水素であるｎ−ヘプタデカン若しくはｎ−ヘプタデセンを効率的に生産できる。なお、脂肪族炭化水素は、遊離の炭化水素として藻類内に生産される。

後述するように、窒素含有量によっては、ＳＴＴ株はエチレングリコール重合体を生産する傾向がある。こうした炭化水素の生産を意図する場合には、窒素十分条件を培養条件として採用することが好ましい。ここで、窒素十分条件とは、培地中、Ｎ／ＤＷが０．０７５超であることが好ましい。より好ましくは、Ｎ／ＤＷが０．１以上である。より具体的には、例えば、既述のＡＦ−６培地中の窒素濃度が挙げられる。適切な窒素濃度を得るには、藻類の培地等に用いられる公知の窒素成分を特に限定しないで、１又は２以上適宜組み合わせて用いることができる。また、好ましいＮ／ＤＷは、培地中の藻体量と窒素量とを適宜調節しながら、藻体から得られる炭化水素を定量することで、取得することができる。

なお、本生産方法において、ＳＴＴ株の培養条件は、窒素濃度以外については、既に説明したグリセリドの生産方法における各種態様を適用できる。また、炭化水素等の回収方法も既に説明した各種態様を適用できる。

（微細藻類を用いるエチレングリコール重合体の生産方法）
本明細書に開示されるエチレングリコール重合体の生産方法は、ＳＴＴ株を培養する工程を備えることができる。ＳＴＴ株は、グリセリド、炭化水素のほか、エチレングリコール重合体も生産できる。エチレングリコール重合体を優位に生産するには、窒素欠乏条件でＳＴＴ株を培養することが好ましい。窒素欠乏条件でＳＴＴ株を培養すると、ＳＴＴ株は、Ｃ１７脂肪族炭化水素であるｎ−ヘプタデカンやｎ−ヘプタデセンよりも優位にエチレングリコール重合体を生産する。エチレングリコール重合体は、医薬品や工業製品の原料となりうること等により、好ましい代謝産物である。なお、窒素欠乏条件では、グリセリドも生産されうる。

ここで、窒素欠乏条件とは、Ｎ／ＤＷが０．０７５以下であることが好ましい。さらに好ましくは、０．０５以下であり、一層好ましくは、０．０３以下であり、より一層好ましくは０．０２以下である。また、Ｎ／ＤＷは、０．０１５以上である。培地としては、例えば、既述のＡＦ−６培地から窒素成分を全て除去した培地を用いることができる。なお、こうした窒素欠乏条件は、通常の窒素含有量の培地でＳＴＴ株の培養を開始し、ＳＴＴ株が増殖してくることで、結果として窒素欠乏条件が成立する培養状態となることでも取得できる。あるいは、当初は、通常の窒素含有量の培地でＳＴＴ株を培養した後、窒素欠乏条件となる培地で培地交換することで取得してもよい。窒素欠乏条件が成立する培地としては、例えば、既述のＡＦ−６培地から窒素成分を全て除去した培地が挙げられる。

エチレングリコール重合体は、水溶性であり、同時に生産されるグリセリドとは異なる極性及び分配特性を有しているため、ヘキサンと水との二相分離系を用いることでこれらを容易に分離することができる点においても好ましい。

なお、本生産方法において、ＳＴＴ株の培養条件は、窒素濃度以外については、既に説明したグリセリドの生産方法における各種態様を適用できる。エチレングリコール重合体の回収方法は、培養藻体を回収以降、ヘキサンなどの非極性溶媒と水などの極性溶媒との二相分離系を用い、極性溶媒相を回収するようにすることで、エチレングリコール重合体を抽出できる。

以上のことから、本明細書によれば、ＳＴＴ株の培養工程におけるＮ／ＤＷを調節することで、グリセリド、炭化水素及びエチレングリコール重合体からなる群から選択される少なくとも１種又は２種を優位に生産する、ＳＴＴ株の培養方法も提供される。

以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものでない。

（レースウェイ・ポンドを用いた油脂生産）
室内に設置したレースウェイ・ポンド（面積３．７８５ｍ²）に、４９０Ｌの培養液（硫安８．３ｐｐｍ、リン１ｐｐｍ、カリウム１ｐｐｍ、マグネシウム０．３ｐｐｍ）を入れ、水温は２５℃前後、有効放射光量子密度は平均して３００μｍｏｌ／ｍ²／ｓに設定した。光については、１２ｈ／１２ｈの明暗サイクルに設定し、屋外での昼夜を再現するようにした。微細藻類の攪拌にはパドルを使い、１００％ＣＯ２を１５０ｍｌ／ｍｉｎで通気することで、培養水中のＣＯ₂濃度が１％前後になるように調整した。

ＳＴＴ株、シュードコリシスチスエリプソイディアＭＢＩＣ１１２０４株（本株は２００５年２月１５日付けで独立行政法人産業技術研究所特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）に受託番号ＦＥＲＭＰ−２０４０１として寄託され、２００６年１月１８日付けでブタペスト条約の規定下で受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１０４８４として国際寄託されている。以下、Ｏｂｉ株）、及びシュードコリシスチスエリプソイディアＭＢＩＣ１１２２０株（本株は２００６年１月１８日付けで独立行政法人産業技術研究所特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）にブタペスト条約の規定下で受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１０４８５として国際寄託されている。以下、Ｎ１株）をそれぞれ１０Ｌスケールで前培養し、窒素欠乏になっていない２〜３ｇ／Ｌ濃度の前培養液をそれぞれレースウェイ・ポンドに投入して培養を行った。

所定の時間で一定容量の微細藻類をサンプリングし、乾燥重量を測定することで藻体濃度を測定した。油脂蓄積量については、藻体サンプルを乾燥させた後、以下に示すパルスＮＭＲ分析条件で油脂蓄積量を測定した。油脂生産速度については、藻体が窒素欠乏状態になり、油脂が合成され始めてからの油脂蓄積速度を算出した。

（パルスＮＭＲ分析条件）
装置：ＭＱＣ２３−２７（オックスフォード社）
観測核：１Ｈ
磁石：熱的安定永久磁石０．５５Ｔ
検波方式：デュアルチャンネル位相検知検出器
データ取得レート：１０ＭＨｚまで、１２ビット
ＲＦパルス幅：２．１７μｓ（９０度パルス幅）
パルス間隔：１０μｓ
スキャン回数：６４
共鳴周波数：２３．４ＭＨｚ

２週間培養した時の藻体濃度を図１に、油脂蓄積量を図２に示す。図１及び図２に示すように、２週間後のＳＴＴ株の藻体濃度はＯｂｉ株（従来株）よりも約１０％高く、ＳＴＴ株の油脂蓄積量はＯｂｉ株（従来株）よりも約４０％高いことがわかった。

窒素欠乏状態になってからの油脂生産速度の結果を図３に示す。図３に示すように、ＳＴＴ株の油脂生産速度は、Ｏｂｉ株（従来株）よりも１８％高いことがわかる。

（光合成速度及び呼吸速度の測定）
光合成活性についてはクラーク型の酸素電極装置を用いて測定した。実施例１で培養中の微細藻類をサンプリングし、Ｏ．Ｄ．７２０ｎｍが１．０になるように培養液を調整し、調整した培養液４ｍをキュベットに入れた。光源の有効放射光量子密度を３００μｍｏｌ／ｍ²／ｓに設定し、炭素源として５００ｍＭ炭酸水素ナトリウムを１０μＬ添加してスターラー攪拌下で発生した酸素濃度を白金電極上での酸素の酸化反応を電流値として測定した。キュベット内の酸素濃度の増加速度を求めることで光合成速度を計算した。

呼吸速度についてもクラーク型酸素電極装置で測定した。溶存酸素量が飽和した後に、藻体の入ったキュベットを暗幕で覆い、スターラー攪拌下で発生した酸素濃度を白金電極上での酸素の酸化反応を電流値として測定した。キュベット内の酸素濃度の減少速度を求めることで呼吸速度を計算した。なお、培養経過途中でサンプリングした際には藻体濃度を測定し、培地に添加した窒素肥料の窒素濃度に対する乾燥藻体重量をＮ／ＤＷとして示した。

乾燥重量当たりの光合成速度を図４に、呼吸速度を図５に示す。図４に示すように、窒素が欠乏するのはＮ／ＤＷが０．０７５以下になる時であり、Ｎ／ＤＷが低下すると、酸素発生速度（光合成速度）も低下する傾向が観察された。

また、図４に示すように、ＳＴＴ株と従来株（Ｏｂｉ株、N1株）のＮ／ＤＷに対する酸素発生速度（光合成速度）を比較すると、ＳＴＴ株は、従来株（Ｏｂｉ株、N1株）よりも少ない窒素量で光合成できることがわかった。また、図５に示すように、ＳＴＴ株は、従来株（Ｏｂｉ株、N1株）よりも夜間での呼吸速度が低く、２５℃では、１４０μｍｏｌＯ₂／ｇ／ｈ以下であることがわかった。

以上の結果より、従来株（Ｏｂｉ株、N1株）に比べてＳＴＴ株は、より少ない窒素源（窒素肥料）でも光合成活性があり、より低い呼吸活性でも油脂を生産することができるため、エネルギー利用効率に優れた微細藻類であることがわかる。

（１８ＳｒＤＮＡの塩基配列決定）
ＳＴＴ株を３０ｍｌのＡＦ−６培地（ｐＨ３）で２週間培養（２５℃）し、遠心分離（２３００ｒｐｍ，１５ｍｉｎ）して細胞ペレットを得た。ペレットを−８０℃のフリーザーに入れて１５分間静置後、室温に１５分間静置する操作（凍結融解）を３回繰り返した。凍結融解後、ニッポン・ジーン社製ＤＮＡ抽出キット「ＩＳＯＰＬＡＮＴ」を用いてＤＮＡを抽出した。

前記ＤＮＡを用いて、１８ＳｒＤＮＡ遺伝子の増幅を行った。１８ＳｒＤＮＡ遺伝子を増幅するためのプライマーは、以下の表４に示したプライマーを用い、９４℃で２分間加熱後、９４℃で３０秒間、５８℃で１分間、７２℃で２分間を１サイクルとして、これを３０回繰り返し、７２℃で７分間加熱後、４℃で保冷することにより、ＰＣＲ反応を行った。反応後、アガロース電気泳動で確認したところ、１７５０ｂｐ付近に１８ＳｒＤＮＡ遺伝子断片が確認された。

得られたＰＣＲ産物をＧＥヘルスケア・ジャパン社製Ｅｘｏ−ＳＡＰＩＴを用いて精製し、ダイレクトシークエンス用のサンプルを調製し、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社製ＢｉｇＤｙｅ(R) Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔを用いてダイレクトシーケンス反応を行った。

ダイレクトシーケンス反応終了後、余分なＢｉｇＤｙｅなどを除去するため、セファデックスを用いて精製し、滅菌水を５０μｌ加えた後、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏＳｙｓｔｅｍ社製３７３０ｘｌＤＮＡＡｎａｌｙｚｅｒを用いて塩基配列を解析した。得られた配列より、表５に示すプライマーを設計し、同様の手法でダイレクトシーケンスを全長配列取得まで繰り返し行った。１８ＳｒＤＮＡの塩基配列を配列番号１に示す。配列番号１を用いてＮＣＩＢＩ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔｎでホモロジー検索を行った結果、コッコミクサ属（Ｃｏｃｃｏｍｙｘａ属）と相同性が高いことがわかった。検索結果を表６に示す。

（藻体中の炭化水素とエチレングリコール重合体の分析）
ＳＴＴ株を、ｐＨ３に調整したＡＦ−６培地２０ｍｌで２週間培養（２２〜２８℃）した後、培養液を二等分し、遠心して２つの細胞ペレットを得た。１つの細胞ペレットには、前記と同様のＡＦ−６培地（ｐＨ３）１０ｍｌ（窒素濃度０．０１６２％）を加え、もう一つの細胞ペレットには、窒素源が含まれないＡＦ−６培地（ｐＨ３）を加えて２５℃で２週間培養した。培養後、細胞ペレット５０ｍｇ（ウエット）をヘッドスペース分析用のバイアル瓶に入れ、ヘッドスペース−ガスクロマトグラフィー／質量分析（ＨＧＣ／ＭＳ）装置［アジレント社］を用いて細胞内の成分分析を行った。ＨＧＣ／ＭＳ分析条件を以下に示す。

サンプル加熱温度：１５０℃
カラム：ＤＢ−ＷＡＸ（６０ｍ×２５０μｍ×０．１８μｍ）
カラム温度：５０℃（１ｍｉｎ）−５０℃／ｍｉｎ→２５０℃（１５ｍｉｎ）
注入口温度：２５０℃
トランスファーライン温度：２５０℃
ガス：ヘリウム
カラム内流量：１ｍｌ／ｍｉｎ
スプリット比：５：１
イオン化法：電子イオン化法（ＥＩ）
質量範囲：５０〜６５０（２ｓｃａｎ／ｓｅｃ．）

窒素充分条件で培養した藻体と窒素欠乏条件で培養した藻体のＧＣ／ＭＳクロマトグラムを図６に示す。図６に示すように、窒素充分条件で培養した藻体は窒素欠乏条件で培養した藻体よりもヘプタデセンの量が多いことがわかった。一方、窒素欠乏条件で培養した藻体には、エチレングリコール重合体が多いことがわかった。

本実施例より、ＳＴＴ株を窒素充分条件で培養することにより、Ｃ１７炭化水素を採取することができ、窒素欠乏条件で培養することにより、エチレングリコール重合体を採取することができることがわかった。なお、窒素欠乏条件で培養すると、エチレングリコール重合体の他に多量の油脂も蓄積された。

（ｐＨと温度の培養特性）
ＳＴＴ株をＡＦ−６培地（ｐＨ３）で２週間培養した後、遠心して細胞のペレットを得た。得られたペレットにＯＤ７２０が０．０５となるように、各ｐＨ（ｐＨ３〜１１）のＡＦ−６培地を加えて細胞懸濁液を調製し、９６穴プレートの１ウエルに細胞懸濁液２００μｌを入れ、１０日間培養を行った。培養の温度は１５〜３５℃、光量は３０μｍｏｌ／ｍ²／ｓで行った。培養後、吸光度測定器（日本モレキュラーデバイス製ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘＰＬＵＳ）を用いてＡ７２０の吸光度を測定し、比増殖速度（μ）で増殖特性を評価した。

１５℃、２５℃、及び３５℃で培養した場合のｐＨ増殖特性を図７に示す。２５℃で培養した場合、ｐＨ３〜７の幅広いｐＨで増殖するのに対し、１５℃の低温ではｐＨ７、３５℃の高温ではｐＨ５で高い増殖性を示すことがわかった。ＣＯ₂ガスでバブリングさせながら藻類を培養した場合、培地のｐＨは酸性側に傾くが、ＳＴＴ株は３５℃の高温でもＣＯ₂ガスをバブリングさせながら培養が可能な微細藻類であることがわかった。

配列番号２〜９：プライマー

Claims

コッコミクサ・スピーシーズ（Coccomyxa sp.）に属するＳＴＴ株（受領番号ＦＥＲＭＡＰ−２２２５０）である微細藻類。
グリセリド生産能を有する、請求項１に記載の微細藻類。
炭化水素生産能を有する、請求項１又は２に記載の微細藻類。
エチレングリコール重合体生産能を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の微細藻類。
請求項１〜４のいずれかに記載の微細藻類を培養する工程を備える、グリセリドの生産方法。
請求項１〜４のいずれかに記載の微細藻類を培養する工程を備える、炭化水素の生産方法。
請求項１〜４のいずれかに記載の微細藻類を培養する工程を備える、エチレングリコール重合体の生産方法。
請求項１〜４のいずれかに記載の微細藻類を、２０℃以上４０℃以下、ｐＨが３以上７以下で培養する、微細藻類の培養方法。