JP5777025B2 - 緑藻イカダモ、該緑藻イカダモの培養工程を有する脂質の製造方法、及び該緑藻イカダモの乾燥藻体 - Google Patents
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Description
また、微細藻類の培養工程の終期において暗条件かつ嫌気性条件に切り換えて、藻体外
にエタノールを放出させるエタノール製造方法も開示されている(特許文献1参照)。
請求項1に記載の緑藻イカダモは、窒素含量が硝酸態窒素量で40mg/L以上である培養液中で脂肪酸系炭化水素を藻体内に蓄積しうるデスモデスムス(Desmodesmus)属プレイオモルファス(pleiomorphus)種 SUHL0708株(FERM P−21960)である。
請求項2に記載の脂質の製造方法は、請求項1に記載の緑藻イカダモの培養工程を有することを特徴とする。
請求項3に記載の脂質の製造方法は、請求項2において、窒素含量が硝酸態窒素量で40mg/L以上である培養液中で前記緑藻イカダモを培養する工程、および前記培養液中から前記緑藻イカダモを回収する工程を有することを特徴とする。
請求項4に記載の脂質の製造方法は、請求項2又は3において、前記脂質が脂肪酸系炭化水素を含むことを特徴とする。
請求項5に記載の脂質の製造方法は、請求項4において、前記脂肪酸系炭化水素が炭素数16〜18の脂肪酸系炭化水素を含むことを特徴とする。
請求項6に記載の乾燥藻体は、請求項1に記載の緑藻イカダモを乾燥して得られるものである。
本発明の脂質の製造方法によれば、より簡便な培養工程によって、高濃度の脂肪酸系炭化水素を蓄積した緑藻イカダモを得て、該脂肪酸系炭化水素を含有した脂質を製造することができる。該脂質は燃料又は食品・化学工業における原料として利用できる。
本発明の乾燥藻体は脂肪酸系炭化水素を含むため可燃性であり、燃料として利用できる。
前記窒素を含む栄養塩としては、例えば、硝酸イオン(NO3 −)を含む塩、亜硝酸イオン(NO2 −)を含む塩、およびアンモニウムイオン(NH4+)を含む塩が挙げられる。
前記リンを含む栄養塩としては、例えば、リン酸イオン(PO4 3−)を含む塩が挙げられる。
また、硝酸態窒素とは(NO3 −)硝酸の形で存在している窒素のことをいう。よって、硝酸態窒素量で40mg/L以上とは、硝酸イオン濃度が2.9mmol/L以上であることをいう。
<デスモデスムス属プレイオモルファス種に属する緑藻イカダモ>
本発明におけるデスモデスムス(Desmodesmus)属プレイオモルファス(pleiomorphus)種に属する緑藻イカダモ(以下、本発明の緑藻イカダモ)は、窒素含量が硝酸態窒素量で40mg/L以上である培養液中で脂肪酸系炭化水素を藻体内に蓄積しうるものである。
KW21(第一製網株式会社製)の0.1体積%溶液(窒素含量が硝酸態窒素量で40mg/L以上)を培養液とし、野外に上部開放型(無蓋型)の培養タンクを設置し、培養液を加えて通気攪拌して、増殖した微細藻類を回収した。回収された微細藻類の中から、野外増殖力と脂質生産性の両面に優れたものを選択し、クローン培養株を樹立した。さらに、培養容器を継代ごとに大きくすることにより、大量栽培を行った。具体的には、試験管培養から始めて、100L容、500L容、1000L容そして20t容から100t容円形水槽まで順次培養容器を大きくすることにより、大量栽培試験を実施して、選択されたクローン株の実用性を調べた。
図1は、SUHL0708株の光学顕微鏡写真である。4つの細胞体(藻体)が連なった4連細胞である。1個の細胞体の長径は約14μm、短径は約8μmであり、細胞体が良好に肥大した状態にある。晴天時の自然光のような比較的強い光照射条件で培養した場合に観察される。
図2は、SUHL0708株(冬期型細胞)の走査電子顕微鏡写真であり、(a)は2連細胞、(b)は4連細胞である。夏期型細胞に比べて、細胞体の体積が小さく、棘の長さが短く、棘の数が少ない。人工光や冬期の曇天時の自然光のような比較的弱い光照射条件で培養した場合に観察される形態である。
図3は、SUHL0708株(夏期型細胞)の走査電子顕微鏡写真であり、(a)は2連細胞、(b)は4連細胞である。冬期型細胞に比べて、細胞体の体積が大きく、棘の長さが長く、棘の数が多い。晴天時の自然光のような比較的強い光照射条件で培養した場合に観察される形態である。
増殖期にあるSUHL0708株をナイルレッド染色処理して蛍光顕微鏡で観察すると、藻体内に脂質(粗脂肪)が蓄積されていることが確認される(図4参照)。
前記脂質は、炭素数16〜18の脂肪酸および該炭素数16〜18の脂肪酸(アシル基)を分子内に有するトリグリセリド等の脂肪酸系炭化水素を含有する。
培養液の一部(10ml)を3000rpmで5分間遠心分離して藻体を回収し、ジクロロメタン:メタノール(混合比2:1)で黄色物質を、そしてエチルアルコールで緑色色素成分を抽出して800nmから300nmの範囲の吸収曲線を測定した。その結果を図5に示す。
本発明の緑藻イカダモの細胞壁はセネデスムス属の微細藻類とは異なり、ジクロロメタン:メタノール(混合比2:1)で主に抽出されるのはカロテノイド(Carotenoid)系黄色色素であった(図5(a))。緑色色素のクロロフィルaはアルコールで抽出された(図5(b))。なお、一度アルコールに溶解した緑色色素成分は、その後ヘキサンやキシレンに溶解する性状を示した。
尿素添加のギラード培地や完全な無機培地のCHU‐13*2で増殖できる。特に、市販の藻類培養液であるKW21(第一製網株式会社製)の0.1体積%溶液が適している。
0.1体積%に調製されたKW21培地の1Lには、緑藻イカダモの増殖に必要な栄養塩が豊富に含まれる。具体的には、前記KW21培地1L中、窒素含有物をNとして49mg、リン酸をPとして4mgを含む。また、前記KW21培地には、ホウ素、マンガン、鉄、コバルト、亜鉛、EDTA、複合アミノ酸(各種アミノ酸)、B1, B12, ビオチン等の複合ビタミン(各種ビタミン)が十分に含まれる。
さらに、2000〜3000μmol/m2/sの光を照射して15〜30℃の培養液の温度で、空気(CO2ガスを5体積%で混合)を通気攪拌して、栄養塩を十分に含むKW21培養液(0.1体積%)を用いて、常法に従って培養したところ、増殖期にあるSUHL0708株の藻体内には、乾燥藻体の単位重量当たり約50重量%の脂質が蓄積された。
従来公知の方法によって、SUHL0708株からDNAを抽出し、18S rDNAのITS−2領域の塩基配列解析を行った。得られた塩基配列を配列表の配列番号1に示す。
データベースと照合した結果、デスモデスムス属プレイオモルファス種に属する既知の緑藻イカダモの塩基配列と一致した。
文献A;Hegewald, E., Schumidt, A., Braband, A. & Tsarenko, P.(2005):Revision of the Desmodesmus(Sphaeropleales,Scenedesmaceae)species with lateral spines. 2.The multi-spined to spineless taxa. Arch.Hydrobiol./Algolog. Stud. 116:1-38.
さらに、本発明のSUHL0708株は、窒素含量が硝酸態窒素量で40mg/L以上である培養液中で、前記脂肪酸系炭化水素を含む油脂を藻体内に高濃度で含有しうる点で既知の緑藻イカダモとは相違することから、デスモデスムス属プレイオモルファス種に属する新しい株であると判断し、デスモデスムス属プレイオモルファス種 SUHL0708株と命名した。
本発明における脂質の製造方法は、本発明にかかる緑藻イカダモを培養し、藻体内に脂質を蓄積させることを特徴とする。具体的には、前述の本発明にかかる緑藻イカダモの培養工程を有することを特徴とする。
本発明の脂質の製造方法における主な工程としては、前記緑藻イカダモの培養工程と、その培養工程によって増殖させた緑藻イカダモを培養液中から回収する工程と、回収した緑藻イカダモの藻体から脂質を抽出する工程が挙げられる。
本発明の脂質の製造方法に用いる緑藻イカダモとしては、藻体中の脂質含有率が高く、容易に培養できる観点から、SUHL0708株が好ましい。
上記範囲であると、緑藻イカダモの増殖スピードが高めることができ、藻体内の脂質含有率を高めることができる。
このような利点を最大限に活かす観点から、本発明の脂質の製造方法では、前記培養工程において、栄養塩含有培養液から栄養塩欠乏培養液へ切り換える操作を行わないことが好ましい。つまり、窒素含有化合物等の栄養塩の豊富な培養液から、栄養塩が欠乏した培養液に切り換える操作を行うことなく、直接緑藻イカダモを回収することができる。
例えば、本発明の脂質の製造方法では、培養液を常に栄養塩が豊富な状態に保つことによって、培養工程および回収工程を並行して連続運転することができる。
前記緑藻イカダモを順調に増殖させつつ、該緑藻イカダモ中の脂質含有量を高める観点から、前記培養液の窒素含量としては、硝酸態窒素量で45mg/L以上がより好ましく、硝酸態窒素量で48mg/L以上がさらに好ましい。
ここで、窒素含量とは、培養液中の窒素のモル数に依存する量であり、培養液中の窒素含有化合物の種類には依らない。
前記培養液の窒素含量の上限値は、前記緑藻イカダモが順調に増殖する限り特に制限されないが、通常200mg/L以下であればよい。
前記緑藻イカダモから脂質を抽出する好適な方法としては、例えば藻体を凍結乾燥等して得られる乾燥藻体の粉末を加圧カラムに充填し、メチルアルコールが超臨界となる240℃、8MPa以上の反応条件で抽出とメチルエステル化を同時に進める方法が挙げられる。この方法によって、石油代替液体燃料として使用可能な高エネルギーの脂肪酸系炭化水素を生産できる。前記脂質のメチルアルコール抽出において、加熱加圧下(例えば、8MPa、150℃)で600W程度のマイクロウエーブを照射することによっても効率よくメチルエステル化を進める効果が得られる。
なお、脂肪酸系炭化水素は高温高圧でメタノールを添加することによってメチル化できる。
また、前記直鎖状不飽和脂肪酸は、水素添加による飽和炭化水素への変換によって、高エネルギーの炭化水素燃料へ誘導できる。
また、回収した緑藻イカダモは、風乾や凍結乾燥等の常法で乾燥させた乾燥藻体に加工することができる。該乾燥藻体は、前記脂肪酸系炭化水素を含有するため可燃性であり、そのまま燃焼用の燃料として利用することができる。
本発明における乾燥藻体は、脂肪酸系炭化水素を藻体内に蓄積しうるデスモデスムス属プレイオモルファス種に属する緑藻イカダモの藻体を乾燥させたものである。
前記緑藻イカダモとしては、藻体内の脂質含有率が高いSUHL0708株が好ましい。
前記緑藻イカダモを乾燥させる方法としては、藻体中の水分を除去できる方法であれば特に制限されず、乾燥雰囲気中で風乾させる方法や凍結乾燥する方法が挙げられる。
得られた乾燥藻体は脂肪酸系炭化水素を含むため可燃性であり、燃料として利用できる。火炎中で燃焼させる場合には、水気を切った生乾きの藻体を火炎中に投入してもよい。この場合、火炎中で該藻体が乾燥藻体になり燃焼する。
本発明にかかる緑藻イカダモを乾燥粉体として、あるいは該緑藻イカダモの藻体内から抽出精製して得られる脂質として、バイオマス燃料に利用することができる。
その結果を図7に示す。
・ 培養液の温度:25℃
・ 培養液の通気及び攪拌:空気(5体積%のCO2ガスを混合)を通気しつつ、藻体が沈殿しない程度に緩やかに攪拌
・ 光照射条件:自然光(日照時間:12時間,強度範囲:500〜3000μmol/m2/s,平均強度:1000μmol/m2/s)
・ 培養期間:シードとなる藻体を接種後、16日間
マイクロウェーブ抽出法を用いて行った。まず、メチルアルコール存在下でマイクロウェーブ照射することによって、藻体から脂質を抽出した。この抽出物を少量の重クロロホルムに溶解して、NMRで炭化水素鎖の水素核を測定する方法で行った。
培養期間中の脂質含有率の平均は、乾燥藻体の単位重量あたり約28重量%であった。
16日間(0〜384時間)の培養期間における、硝酸イオン濃度を図7に示した。また、同培養期間おいて、リン酸イオンは10μmol/L以上で含有されていた。つまり、培養期間における培養液は豊富な栄養塩を含んでいた。
Claims (6)
- 窒素含量が硝酸態窒素量で40mg/L以上である培養液中で脂肪酸系炭化水素を藻体内に蓄積しうるデスモデスムス(Desmodesmus)属プレイオモルファス(pleiomorphus)種 SUHL0708株(FERM P−21960)である緑藻イカダモ。
- 請求項1に記載の緑藻イカダモの培養工程を有する脂質の製造方法。
- 窒素含量が硝酸態窒素量で40mg/L以上である培養液中で前記緑藻イカダモを培養する工程、および前記培養液中から前記緑藻イカダモを回収する工程を有することを特徴とする請求項2に記載の脂質の製造方法。
- 前記脂質が脂肪酸系炭化水素を含むことを特徴とする請求項2又は3に記載の脂質の製造方法。
- 前記脂肪酸系炭化水素が炭素数16〜18の脂肪酸系炭化水素を含むことを特徴とする請求項4に記載の脂質の製造方法。
- 請求項1に記載の緑藻イカダモを乾燥して得られる乾燥藻体。
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