WO2020026945A1 - 殺ウイルス剤 - Google Patents

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WO2020026945A1
WO2020026945A1 PCT/JP2019/029296 JP2019029296W WO2020026945A1 WO 2020026945 A1 WO2020026945 A1 WO 2020026945A1 JP 2019029296 W JP2019029296 W JP 2019029296W WO 2020026945 A1 WO2020026945 A1 WO 2020026945A1
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virus
monogalactosyldiacylglycerol
mgdg
fatty acids
constituent fatty
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PCT/JP2019/029296
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真菜 浅野
久野 斉
欣也 渥美
京子 林
敏男 河原
さと子 小松
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株式会社デンソー
学校法人中部大学
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    • A61P31/20Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22Antivirals for DNA viruses for herpes viruses

Definitions

  • the present invention relates to a virus killer. More specifically, the present invention relates to a virucidal agent containing a microalgal extract or a component thereof as an active ingredient, and uses thereof.
  • This application claims the priority based on Japanese Patent Application No. 2018-143049 filed on Jul. 31, 2018, the entire content of which is incorporated by reference.
  • Viral infections are diseases caused by pathogenic viruses such as HIV (human immunodeficiency virus) and influenza virus.
  • pathogenic viruses such as HIV (human immunodeficiency virus) and influenza virus.
  • HIV human immunodeficiency virus
  • influenza virus a virus that virus grows in a virus.
  • infectious diseases for which vaccines are being developed are limited, and if antigenic mutation occurs on the virus side, efficacy will be lost.
  • antiviral drugs have problems such as a limited number of target infectious diseases, the occurrence of side effects, the emergence of drug-resistant viruses, and an increase in economic burden.
  • the emergence of drug-resistant viruses is a serious problem that shortens the life of the drug. Resistance is caused by the fact that most antiviral drugs target viral enzymes. That is, it acts in an inhibitory manner on the virus growth stage in the cell.
  • Non-Patent Document 1 shows that monogalactosyldiacylglycerol contained in a herbal medicine (Clinacanthus) exhibited an antiherpes activity.
  • Non-Patent Document 2 shows that monogalactosyldiacylglycerol derived from seaweed has anti-HSV-1 activity and anti-HSV-2 activity.
  • Non-Patent Document 3 reports the anti-HSV-1 and anti-HSV-2 activities of monogalactosyldiacylglycerol contained in a herbal medicine (Clinacanthus).
  • the main object of the present invention is to provide a virucidal agent which is excellent in practical use and can be used for a wide range of uses including application to human infectious diseases.
  • a virus killer comprising a monogalactosyldiacylglycerol-containing extract of a single-cell algae as an active ingredient.
  • One or more monogalactosyldiacylglycerols as active ingredients selected from the group consisting of the following (1) to (6): (1) monogalactosyldiacylglycerol whose constituent fatty acids are C16: 3 and C18: 3; (2) monogalactosyldiacylglycerol whose constituent fatty acids are C16: 2 and C18: 3; (3) monogalactosyldiacylglycerol whose constituent fatty acids are C18: 3 and C18: 3; (4) monogalactosyldiacylglycerol whose constituent fatty acids are C16: 2 and C18: 2; (5) Monogalactosyldiacylglycerol whose constituent fatty acids are C18: 3 and C18: 2; and (6) Monogalactosyldiacylglycerol whose constituent fatty acids are C16: 1 and C18: 2.
  • a composition comprising the virucidal agent according to any one of [1] to [12].
  • HSV-2 herpes simplex virus type 2
  • the virus growth rates of test groups 1 to 10 are shown in order from the left.
  • Time-of-addition experiments targeting influenza virus (IFV) For each concentration of the MGDG preparation (10 ⁇ g / ml, 25 ⁇ g / ml, 50 ⁇ g / ml), the virus growth rates of test groups 1 to 10 are shown in order from the left.
  • the virus solution was treated with the material for 0 to 360 minutes.
  • MGDG preparation of 0 ⁇ g / ml (control), 0.01 ⁇ g / ml, 0.025 ⁇ g / ml, 0.1 ⁇ g / ml, 0.25 ⁇ g / ml, 1 ⁇ g / ml, 2.5 ⁇ g / ml, 10 ⁇ g / ml, 25 ⁇ g / ml, 50 ⁇ g / ml
  • the virus solution was treated with the material for 0 to 360 minutes.
  • Transmission electron microscope (TEM) image showing that the envelope of influenza virus (IFV) is disrupted by the action of MGDG preparation.
  • the virus solution was treated with MGDG preparations of 10 ⁇ g / ml, 50 ⁇ g / ml, and 200 ⁇ g / ml for 0 to 60 minutes.
  • Virucidal activity test in-vivo experiment
  • results Lesion-score.
  • Mice were inoculated after treating the virus solution with MGDG preparations of 10 ⁇ g / ml, 50 ⁇ g / ml, and 250 ⁇ g / ml for 30 minutes.
  • Results of virus killing activity test (in vivo test) (virus amount 3 days after infection). * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01, *** p ⁇ 0.001 vs.
  • TEM transmission electron microscope
  • MGDG-1 to MGDG-5 are peaks derived from the KDG strain MGDG preparation, and peaks presumed to have the same structure as these are indicated by *.
  • HPLC chromatograms of MGDG preparations of various organisms Comixa sp. KJ strain, Euglena gracilis (Euglena of life, Biozyme), spinach.
  • MGDG-1 to MGDG-5 are peaks derived from the KDG strain MGDG preparation, and peaks presumed to have the same structure as these are indicated by *.
  • virulence agent is an agent that exhibits virucidal activity against the target virus.
  • Virucidal activity is a direct inactivating effect on viruses, and is excellent in preventing infection / preventing spread of infection, treating infectious diseases, and the like. Inactivation is roughly classified into reversible inactivation and irreversible inactivation. The latter, ie, irreversible inactivation, inactivates the virus to an irreversible state, and its effect, significance, etc. are crucially different from the former.
  • the virucidal agent of the present invention an irreversible inactivating action due to destruction of virus particles can be expected (see Examples described later). If the mechanism of action is the destruction of virus particles, it is likely that the target specificity is low (ie, the target is not limited to a particular virus).
  • the active ingredients of the virucidal agent of the present invention are norovirus, an RNA virus having no envelope, herpes simplex virus type 2 (HSV-2), a DNA virus having an envelope, and influenza, an RNA virus having an envelope.
  • HSV-2 herpes simplex virus type 2
  • influenza an RNA virus having an envelope.
  • the fact that they exhibited virucidal activity against viruses supports the versatility of the virucidal agents of the present invention.
  • the action of "destruction of virus particles” it is possible to kill viruses that are not in the growth cycle, and it is extremely effective and also effective in preventing drug resistance of viruses.
  • the virucidal agent of the present invention contains a monogalactosyldiacylglycerol-containing extract of unicellular algae as an active ingredient.
  • the monogalactosyldiacylglycerol-containing extract has a virucidal activity
  • the unicellular algae Tebouxia algae, Escherichia coli, cyanobacteria, Euglena algae, etc.
  • Coccomyxa microalgae specific examples are Coccomixa sp.
  • microalgae of the genus Kokkomikusa are particularly preferred.
  • a monogalactosyldiacylglycerol-containing extract of a microalga of the genus Kokkomikusa is used as an active ingredient.
  • the microalgae of the genus Kokkomikusa are not particularly limited, but preferred examples include Kokkomikusa sp. Strain KJ and mutants thereof. Co., Ltd. sp. KJ shares (KJ Denso) was established on June 4, 2013 by the National Institute of Technology and Evaluation, National Institute of Technology and Evaluation Biotechnology Center Patent Organism Depositary Center (NITE-IPOD) (2-5 Kazusa Kamasa, Kisarazu-shi, Chiba) No. 8120) and deposited under accession number FERM BP-22254 on 2 June 2015 under the provisions of the Putavest Treaty on June 2, 2015.
  • NITE-IPOD National Institute of Technology and Evaluation Biotechnology Center Patent Organism Depositary Center
  • Pseudococcus genus (Pseudococcomyxa) is to be included in the genus Pseudococcus in the latest classification (Reference: PLoS One. 2015 Jun 16; 10 (6): e0127838. Doi: 10.1371 / journal. pone.0127838. eCollection 2015.).
  • Mutants of the strain KJ can be obtained by irradiation with ultraviolet rays, X-rays, gamma rays, mutagen treatment, heavy beam irradiation, genetic manipulation (introduction of foreign genes, gene disruption, gene modification by genome editing, etc.), etc. be able to.
  • the method for obtaining the mutant, the characteristics, and the like are not particularly limited.
  • the method for cultivating Microalgae of the genus Kokkomushi is not particularly limited.
  • the medium for cultivating the microalgae of the genus Kokkomikusa may be any of those commonly used for culturing microalgae.For example, various nutrients, trace metal salts, known media for freshwater microalgae containing vitamins, etc. Any medium for marine microalgae can be used. Examples of the medium include AF6 medium.
  • the composition of AF6 medium (per 100 ml) is as follows.
  • the nutrients include nitrogen sources such as NaNO 3 , KNO 3 , NH 4 Cl and urea, and phosphorus sources such as K 2 HPO 4 , KH 2 PO 4 and sodium glycerophosphate.
  • the trace metals include iron, magnesium, manganese, calcium, zinc and the like, and the vitamins include vitamin B1, vitamin B12 and the like.
  • stirring may be performed while supplying carbon dioxide under aeration conditions.
  • the cells are cultured by irradiating with a fluorescent lamp for 12 hours, irradiating with light and dark cycles such as 12 hours of dark conditions, or irradiating with continuous light.
  • the culture condition is not particularly limited as long as it does not adversely affect the growth of the microalgae of the genus Kompani.
  • the pH of the culture solution is 3 to 9, and the culture temperature is 10 to 35 ° C.
  • Unicellular algae other than Microalgae of the genus Kokkomikusa can also be cultured by conventional methods.
  • the medium used for culturing each algae is not particularly limited.
  • a common medium for culturing freshwater algae or a common medium for culturing saltwater algae can be used.
  • An example of a suitable medium is C It is a culture medium (FIG. 11).
  • a suitable medium is ESM medium. (FIG. 11).
  • a common medium for culturing freshwater algae or a common medium for culturing saltwater algae can be used.
  • One example of a suitable medium is MA medium ( FIG. 12).
  • the method for extracting the active ingredient of the virucidal agent of the present invention that is, the "monogalactosyldiacylglycerol-containing extract of unicellular algae (particularly preferably microalgae belonging to the genus Kokkomikusa)" is described in the following.
  • ethanol extraction can be adopted as the extraction method.
  • a product obtained by purifying after ethanol extraction and increasing the content of monogalactosyldiacylglycerol is used as a “monogalactosyldiacylglycerol-containing extract of unicellular algae (particularly preferably microalgae belonging to the genus Kokkomikusa)”.
  • the purification method include column chromatography using a filler such as silica gel and alumina, gel filtration chromatography, and concentration.
  • the collected algal cells may be subjected to a drying treatment and / or a crushing treatment.
  • a dried alga body, a dried and crushed alga body (typically, a dry powder), or a crushed alga body may be prepared, and an extraction operation may be performed using the prepared alga body.
  • a single-cell algae that has been processed in advance (for example, a dried alga body, its powder / powder, or a tablet (which may contain an excipient, etc.)) is obtained and subjected to an extraction operation.
  • You may.
  • processed products of Chlorella vulgaris, Nannochloropsis oculata, Arthrospira platensis (spirulina), Euglena gracilis and the like are commercially available.
  • the content of monogalactosyldiacylglycerol in the active ingredient is not particularly limited as long as the extract shows a virucidal activity.
  • Monogalactosyldiacylglycerol is one of glyceroglycolipids and is known as a component of the chloroplast thylakoid membrane of plants.
  • Monogalactosyldiacylglycerol has a skeleton in which galactose is ⁇ -linked to glycerol.
  • monogalactosyldiacylglycerol is a main component.
  • monogalactosyldiacylglycerol that can be contained in the virus killer of the present invention include: (1) constituent fatty acids are C16: 3 and C18: 3 monogalactosyldiacylglycerol, (2) constituent fatty acids are C16: 2 and C18.
  • the constituent fatty acids C18: 3 of (1) above are preferably C18: 3 (n- 3), at least one of the constituent fatty acids C18: 3 of the above (3) is preferably C18: 3 (n-3), and the constituent fatty acids C18: 2 of the above (4) are preferably C18: 2 (n -6), and the constituent fatty acid C18: 3 of the above (5) is preferably C18: 3 (n-3), and the C18: 2 is preferably C18: 2 (n-6).
  • the virucidal agent of the present invention contains two or more monogalactosyldiacylglycerols having different structures, and a combination in that case.
  • the content ratio and the like are not particularly limited.
  • the virucidal agent of the present invention is preferably two or more of the above (1) to (6), more preferably three or more of the above (1) to (6), and still more preferably the above (1) ) To (6), more preferably 5 or more of the above (1) to (6), and still more preferably all of the above (1) to (6).
  • the monogalactosyldiacylglycerol (MGDG5) of (5) showed a particularly high virucidal activity. Therefore, a particularly preferred embodiment of the virus killer contains the monogalactosyldiacylglycerol (5) alone or in combination with one or more of (1), (2) to (4) and (6). Will be.
  • Monogalactosyldiacylglycerol which has been identified as a main component of the extract of Microalgae belonging to the genus Komicha, exhibiting a virucidal activity, can be expected to have its own virucidal activity.
  • a virucidal agent comprising one or more monogalactosyldiacylglycerols as an active ingredient selected from the group consisting of the above (1) to (6).
  • the combination, content ratio, and the like are not particularly limited.
  • the monogalactosyldiacylglycerol (MGDG5) of (5) showed a particularly high virucidal activity. Therefore, in a particularly preferred embodiment, the monogalactosyldiacylglycerol (5) is at least one of the active ingredients.
  • monogalactosyldiacylglycerol containing various fatty acids fatty acids are shown below.
  • monogalactosyldiacylglycerols including known monogalactosyldiacylglycerols, will generally be able to exert virucidal activity.
  • Target virus As mentioned above, the mechanism of action of the virucidal agent of the present invention, and the active ingredients of the virucidal agent of the present invention are norovirus, feline calicivirus (FCV), herpes simplex virus type 2 (HSV-2) And the fact that they exhibited virucidal activity against influenza virus (IFV) supports the versatility of the virucidal agents of the present invention.
  • Norovirus, feline calicivirus, herpes virus and influenza virus can be exemplified as target viruses for which the virus killer of the present invention is particularly effective.
  • Norovirus is an RNA virus without an envelope and belongs to Caliciviridae in terms of virus classification. Norovirus shows high resistance to detergents and alcohols.
  • Feline calicivirus is a virus of the Caliciviridae family, and is known as a pathogen of feline calicivirus infection, which is a feline infection. It is an RNA virus that has no envelope and shows similar properties to norovirus. Therefore, it has been used in experiments as an alternative to norovirus.
  • Herpes virus is a virus that has double-stranded DNA as its genome. Herpesviruses are classified into three types of herpesvirinae ( ⁇ -herpesvirinae, ⁇ -herpesvirinae, and ⁇ -herpesvirinae).
  • the herpes simplex virus type 1 (HSV-1), herpes simplex virus type 2 (HSV-2) and varicella-zoster virus (VZV) belong to the alpha-herpesvirinae, and the cytomegalovirus belongs to the beta-herpesvirinae.
  • CMV human herpesvirus 6
  • HHV-7 human herpesvirus 7
  • HHV-8 Another name: Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV).
  • Influenza virus is a single-stranded RNA virus, and is roughly classified into three genera having different proteins, antigenicity, morphology, etc. constituting virus particles, namely, influenza A virus, influenza B virus and influenza C virus.
  • Influenza A virus uses humans, birds, horses, pigs, and the like as hosts, and the symptoms (pathology) of the infection are generally more serious than those of other types. Influenza A causes an epidemic every year. In addition, there is a concern about a pandemic, and measures are urgently needed. Influenza A virus is divided into two groups according to the type of HA molecule, namely, H2, H5, H1, H6 (H1 cluster; H1a), H13, H16, and H11 (H1 cluster; H1b).
  • influenza A viruses include H1N1, H1N2, H2N2, H3N2, H5N1, H5N2, H6N1, H7N2, H7N3, H7N7, H7N9, H9N2 and H9N1. Can be.
  • various DNA viruses having an envelope eg, smallpox virus
  • various RNA viruses having an envelope eg, measles virus, rubella virus, mumps virus, coronavirus
  • various DNA viruses having no envelope eg, Adenovirus, papilloma virus
  • various RNA viruses having no envelope eg, poliovirus, rotavirus, norovirus
  • compositions herein are pharmaceuticals (therapeutic or prophylactic), disinfectants, germicidal cleaners, foods, baits.
  • composition of the present invention may be added to acyclovir, ganciclovir, valacyclovir, vitarabine, foscarnet, trifluridine, oseltamivir phosphate (trade name Tamiflu), zanamivir hydrate (trade name Relenza), peramivir Antivirals such as hydrate (trade name Rapiacta), laninamivir octanoate hydrate (trade name Inavir), valoxavir marboxil (trade name Zofluza), benzalkonium chloride, cetylpyridinium chloride, phenoxyethanol, isopropylmethyl
  • An antibacterial or antibacterial component such as phenol and chlorhexidine gluconate may be contained.
  • One specific example of the use of the virus killer of the present invention is the purification of oysters contaminated with norovirus (see Examples below).
  • a solution of a virucidal agent is prepared, and oysters contaminated with norovirus (or oysters that may be contaminated) are immersed (for example, when raised for several hours to several days). Good).
  • the medicine of the present invention is used for treatment or prevention of viral infection.
  • the medicament of the present invention can exert a therapeutic effect or a prophylactic effect on viral infections (these two effects are collectively referred to as “pharmaceutical effects”).
  • the medicinal effects here include (1) prevention of viral infection, (2) prevention, suppression or delay of the onset of viral infection, (3) alleviation of symptoms or accompanying symptoms characteristic of viral infection (mildness ), (4) prevention, suppression or delay of deterioration of symptoms or accompanying symptoms characteristic of viral infections, and the like. It should be noted that since the therapeutic effect and the preventive effect are partially overlapping concepts, it may be difficult to distinguish them clearly and the benefits of doing so are small.
  • Pharmaceutical formulation can be carried out according to a conventional method.
  • other pharmaceutically acceptable components eg, carriers, excipients, disintegrants, buffers, emulsifiers, suspensions, soothing agents, stabilizers, preservatives, preservatives, physiological Saline, etc.
  • an excipient lactose, starch, sorbitol, D-mannitol, sucrose and the like can be used.
  • a disintegrant starch, carboxymethyl cellulose, calcium carbonate and the like can be used. Phosphates, citrates, acetates and the like can be used as buffers.
  • As the emulsifier gum arabic, sodium alginate, tragacanth and the like can be used.
  • glycerin monostearate, aluminum monostearate, methyl cellulose, carboxymethyl cellulose, hydroxymethyl cellulose, sodium lauryl sulfate, and the like can be used.
  • Benzyl alcohol, chlorobutanol, sorbitol and the like can be used as a soothing agent.
  • propylene glycol, ascorbic acid, or the like can be used.
  • phenol, benzalkonium chloride, benzyl alcohol, chlorobutanol, methyl paraben and the like can be used.
  • benzalkonium chloride, paraoxybenzoic acid, chlorobutanol and the like can be used.
  • the dosage form in the case of formulating is not particularly limited.
  • dosage forms include tablets, powders, fine granules, granules, capsules, syrups, injections, and external preparations (ointments, creams, lotions, solutions, gels, cataplasms, plasters, tapes) , Aerosols, etc.) and suppositories.
  • the drug is administered orally or parenterally (local injection into the affected area, intravenous, intraarterial, subcutaneous, intradermal, intramuscular or intraperitoneal injection, transdermal, transnasal, transmucosal, etc.) Applied to the subject.
  • Systemic administration and local administration are also adapted to the subject. These administration routes are not mutually exclusive, and arbitrarily selected two or more can be used in combination.
  • the medicament of the present invention contains an active ingredient in an amount necessary for obtaining the expected effect (ie, a therapeutically or prophylactically effective amount).
  • the amount of the active ingredient in the medicament of the present invention generally varies depending on the dosage form, but the amount of the active ingredient is set, for example, in the range of about 0.1% by weight to about 99% by weight to achieve a desired dose.
  • the dosage of the medicament of the present invention is set so as to obtain the expected effect.
  • symptoms, the age, sex, and weight of the patient are generally considered. Those skilled in the art can determine an appropriate dose in consideration of these matters.
  • the dose can be set so that the daily amount of the active ingredient is 1 mg to 20 mg, preferably 5 mg to 10 mg for an adult (body weight: about 60 kg).
  • the administration schedule may be, for example, once to several times a day, once every two days, or once every three days. In preparing the administration schedule, the condition of the patient, the duration of the effect of the active ingredient, and the like can be considered.
  • acyclovir for example, acyclovir, ganciclovir, valacyclovir, vitarabine, foscarnet, trifluridine, oseltamivir phosphate (trade name Tamiflu), zanamivir hydrate (trade name) Relenza), peramivir hydrate (trade name Rapiacta), laninamivir octanoate hydrate (trade name Inavir), or an antiviral agent such as valoxavir @ marboxil (trade name Zofluza).
  • a combined action / effect can be obtained.
  • the therapeutic effect can be increased.
  • the present application is characterized in that a therapeutic agent or a prophylactically effective amount of a medicament containing the virucidal agent of the present invention is administered to a subject suffering from or possibly having a viral infection.
  • a method for treating or preventing various viral infections is typically a human, but a mammal other than a human (eg, monkey, cow, pig, horse, goat, sheep, dog, cat, rabbit, etc.), bird (chicken, quail, turkey) , Geese, ducks, ostriches, ducks, parakeets, birds, etc.).
  • the disinfectant or disinfectant cleaning agent of the present invention includes, for example, disinfecting or disinfecting cleaning of living rooms (including sick rooms), cooking rooms, toilets, washrooms, bathrooms, etc., tableware, cutlery (knife) , Fork, spoon, etc.), disinfecting or disinfecting and cleaning of cooking utensils (knives, knives, pots, mixers, microwave ovens, ovens, etc.), medical instruments and equipment, and disinfecting or disinfecting of hands, fingertips, oral cavity, etc. .
  • the disinfectant or the disinfectant cleaning agent of the present invention is formed, for example, in a liquid (for example, a spray or a lotion), a gel, or a solid (for example, a powder), and is applied by coating, spraying, or spraying.
  • a liquid for example, a spray or a lotion
  • a gel for example, a powder
  • the disinfectant or the germicidal detergent of the present invention may be carried or adhered to a carrier (for example, a sheet) made of a natural fiber or a synthetic fiber to obtain a product used for wiping or the like, a mask for preventing infection, or the like.
  • Antibacterial or antibacterial components such as benzalkonium chloride, cetylpyridinium chloride, phenoxyethanol, isopropylmethylphenol, chlorhexidine gluconate, etc., pH adjusters, surfactants, adsorbents, carriers and the like are used as disinfectants or sterilizing detergents of the present invention. It may be added.
  • the disinfectant or the disinfectant cleaning agent of the present invention contains an effective ingredient in an amount that can be expected to have a disinfecting or disinfecting and cleaning effect.
  • the amount of addition can be determined in consideration of its use, form, and the like.
  • Foods and baits examples include general foods (cereals, vegetables, meat, various processed foods, confectionery and desserts, milk, soft drinks, fruit juice drinks, coffee drinks, vegetable juice drinks, alcoholic drinks, etc. ), Dietary supplements (supplements, nutritional drinks, etc.), food additives, pet food for pets, and dietary supplements for pets.
  • dietary supplements or food additives they can be provided in the form of powders, granules, tablets, pastes, liquids and the like.
  • feed of the present invention examples are feed (eg, feed for livestock and poultry) and pet food.
  • the food or feed of the present invention contains an active ingredient in an amount that can be expected to have a therapeutic or preventive effect.
  • the amount to be added can be determined in consideration of the condition, age, sex, weight, and the like of the person to whom it is used.
  • the primary filtrate, the secondary filtrate, and the tertiary filtrate were mixed, ethanol was distilled off using an evaporator, and the residue was dried under reduced pressure to obtain an ethanol extract DE.
  • the DE was subjected to DIAION HP-20 (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation, 3.5 ⁇ 57 cm) column chromatography. Elution was performed with H 2 O, 50% ethanol (EtOH), EtOH and acetone in that order, and each eluted fraction was dried at room temperature under reduced pressure (DE1, 400.9 mg; DE2, 310.3 mg; DE3, 2.25 g; DE4, 4.86 g).
  • the acetone fraction (DE4) was subjected to silica gel column (3 ⁇ 42 cm) chromatography.
  • DE4D2 silica gel column (1.5 x 35 cm) chromatography, CHCl 3 -MeOH-H 2 0 DE4D2A by eluting with (10: 1: 0.1) and (15.6 mg) DE4D2B a (686.5 mg) Obtained.
  • DE4D2B was subjected to LH-20 column (Sigma-Aldrich) chromatography using chloroform (CHCl 3 ) -MeOH (3: 1) as a solvent system to obtain DE4D2Bl (11.6 mg) and DE4D2B2 (652.3 mg). Obtained.
  • Virucidal activity targeting herpes virus and influenza virus To evaluate the virucidal activity of the MGDG preparation, a time-of-addition experiment and a virucidal activity test were performed.
  • the target viruses were HSV-2 and influenza A virus.
  • Test zone 1 3 hours before virus infection
  • Test zone 2 1 hour before virus infection
  • Test zone 3 Only during virus infection (1 hour at room temperature)
  • Test zone 4 From 3 hours before virus infection to 24 hours after test 5: From 1 hour to 24 hours after virus infection
  • Test plot 6 From 24 hours after virus infection
  • Test plot 7 From immediately after virus infection to 24 hours post
  • Test plot 8 From 1 hour to 24 hours after virus infection
  • Test plot 9 From 3 hours to 24 hours after virus infection
  • Test plot 10 From 6 hours to 24 hours after virus infection (3) Culture harvested 24 hours after infection, and cells prepared separately in a 35 mm culture dish Perform a plaque assay using. (4) Using the number of plaques of a control to which a solvent (MEM medium) was added instead of the MGDG preparation as a reference (100%), calculate the virus growth rate in each test plot.
  • MEM medium solvent
  • test results (average of two measurements) are shown in FIG. 1 (HSV-2 target) and FIG. 2 (influenza virus target). HSV-2 proliferation was inhibited in a concentration-dependent manner with the MGDG preparation (FIG. 1). At all concentrations, the effect of test plot 3 (the sample was present only during virus infection) appeared to be strong. This seems to be due to the MGDG preparation inhibiting the virus adsorption and entry stage into the host cells, but in the other test plots (test plots 4, 5, and 6) where samples are present at the same time. This step cannot be considered as a target of action for MGDG preparations since similar results were not obtained. In addition, since no significant inhibitory effect was observed during the time when virus protein and gene synthesis was performed in the cells (test groups 8, 9, and 10), the MGDG preparation was It is unlikely that it will act selectively on the growth stage.
  • influenza virus IVF
  • the concentration-dependent virus growth inhibitory effect of the MGDG preparation was not significant compared to HSV-2 (FIG. 2). In other respects, a similar trend was observed with HSV-2.
  • Virucidal activity test A virus inactivating effect (virucidal activity) that cannot be directly evaluated from the above Time-of-addition experiment was examined.
  • ⁇ Method> (1) Add 0.1 ml of virus solution (2 x 10 5 PFU / ml) and 0.1 ml of double-concentration sample solution (MGDG preparation with a concentration of 0.01 to 50 ⁇ g / ml after mixing) to a 1.5 ml tube and mix. And place at 37 ° C. (2) After 0 to 6 hours, collect 10 ⁇ l of each tube, transfer to ice, add 990 ⁇ l of PBS and dilute 100-fold.
  • FIG. 3 HSV-2 target
  • FIG. 4 influenza virus target
  • the control MGDG preparation concentration 0 ⁇ g / ml
  • the MGDG preparation killed the virus more than the control in a concentration-dependent manner.
  • the virucidal activity was extremely strong, and at a concentration of 50 ⁇ g / ml, the infectivity was reduced by half when mixed with the virus.
  • Even at very low concentrations of 0.01 ⁇ g / ml (10 ng / ml) the MGDG preparation showed a higher virus inactivating effect than the control.
  • the MGDG preparation also killed the influenza virus (IFV) in a concentration-dependent manner compared to the control (FIG. 4).
  • ISV influenza virus
  • the MGDG preparation showed strong virucidal activity at concentrations of 10 ⁇ g / ml and higher.
  • it took more time to inactivate the virus compared to HSV-2, it took more time to inactivate the virus.
  • influenza virus IVF
  • MGDG preparation 50 ⁇ g / ml
  • MGDG preparations were evaluated for their inactivating effect on mouse norovirus (MNV).
  • MNV mouse norovirus
  • the virus (MNV) stock is diluted with PBS (phosphate buffered saline) to prepare 2 ⁇ 10 5 PFU / ml.
  • PBS phosphate buffered saline
  • 0.5 ml of a sample (MGDG preparation having a predetermined concentration) and 0.5 ml of a virus solution are placed in a 1.5 ml microtube and mixed.
  • control adds PBS instead of a sample.
  • the cells are fixed and stained with neutral red solution, and the number of plaques is measured under a microscope.
  • the number of plaques at 0 hour as a reference (100%) calculate the amount of residual virus (the number of relative plaques) after each treatment time.
  • MGDG preparations (1-100 ⁇ g / ml) showed virucidal activity against MNV in a concentration-dependent and time-dependent manner (FIG. 6).
  • FCV feline calicivirus
  • the cells are fixed and stained with neutral red solution, and the number of plaques is measured under a microscope.
  • the number of plaques at 0 hour as a reference (100%) calculate the amount of residual virus (the number of relative plaques) after each treatment time.
  • MGDG preparations (10-200 ⁇ g / ml) showed virucidal (inactivating) activity against FCV in a concentration-dependent and time-dependent manner (FIG. 7).
  • Test plot (MGDG preparation): MGDG preparation at double concentration (20 ⁇ g / ml, 100 ⁇ g / ml, 500 ⁇ g / ml) was used in the same amount of virus solution (HSV-2 (UW268 strain), 4 ⁇ 10 4 PFU / 20 ⁇ l) ) (2 ⁇ 10 4 PFU / 20 ⁇ l / mouse final viral load) and treat for 30 minutes at room temperature. (3) Three days after infection, the genitals are washed with PBS (100 ⁇ l / mouse), and the virus in the washing solution is quantified by plaque assay. (4) Up to 14 days after infection, the degree of onset is observed, and evaluation is made with six scores from 0 to 5 of the score. (5) Record the life and death of mice until 14 days after infection.
  • the HUT medium shown in FIG. 12 may be used in a conventional manner (using the same culture conditions as for the above-mentioned strain of Kokkomixa sp. KJ). May be).
  • Dried powder of each alga body can be obtained by drying the alga body collected from the culture solution by centrifugal separation with a drum dryer and pulverizing with a pulverizer.
  • An MGDG preparation of each algae can be obtained from the dried powder by the same extraction operation as in the case of Kokkomixa sp. KJ.
  • the obtained MGDG preparations were used for the following examinations: Commercially available spinach (Spinacia oleracea) was also finely dried and freeze-dried. The MGDG preparation was obtained by crushing with a crusher and extracting MGDG.
  • Virucidal activity targeting norovirus concentrated in oysters (1) Production of contaminated oysters Purchase live oysters, wash the surface of the shell with a brush under running tap water, and then sterilize the shell surface under ultraviolet light by leaving it in a clean bench. Next, oysters whose shell surfaces have been subjected to ultraviolet treatment are put into filtered (sterilized 0.2 ⁇ m; Millipore) seawater (water temperature: 10 ° C.), and fasted and bred all day and night with ventilation. Next, a mouse norovirus stock prepared in advance is added to the filter-sterilized seawater so as to have a final concentration of 2 ⁇ 10 5 PFU / ml. Then, the oysters are bred for a whole day and night to produce oysters contaminated with mouse norovirus.
  • MGDG-prepared seawater MGDG preparation Kkkomikusa sp. KJ strain MGDG preparation, Chlorella vulgaris MGDG preparation, Nannochloropsis oculata MGDG preparation, Arthrospira platensis (spirulina) MGDG preparation, Euglena Gracilis MGDG preparation, spinach MGDG preparation
  • purified MGDG is added with DMSO and suspended homogeneously (MGDG suspension).
  • an MGDG suspension is added to 10 L of sterilized seawater (filtration: 0.2 ⁇ m; manufactured by Millipore) so that the final concentration of MGDG is 100 ppm, to obtain an opaque MGDG-prepared sterilized seawater.
  • mouse norovirus does not proliferate in the digestive tract of oysters, it is basically considered that all the added mouse norovirus is taken up by oysters and accumulated in the digestive tract.
  • the oysters frozen in (3) are thawed, the digestive tract is extracted from the oysters, the inside of the digestive tract is washed with a certain amount of phosphate buffered saline (PBS), and the washing solution is diluted 100 times with PBS.
  • 100 ⁇ l of the 100-fold diluted solution is added to host cells (RAW264.7 cells, which are mouse macrophage-like cells), which have been cultured in a monolayer in advance, and infected at room temperature for 1 hour.
  • a plaque assay medium is overlaid and cultured at 37 ° C. for 2 to 3 days. After confirming the appearance of plaque, the cells are fixed and stained with neutral red solution, and the number of plaques is measured under a microscope. Using the initial mouse norovirus concentration of 2 ⁇ 10 5 PFU / ml as a reference (100%), the amount of viable virus (relative plaque count) in the digestive tract of oysters after 48 hours is calculated.
  • Norovirus is contained in the stool and feces of Norovirus infected persons, and secondary infection by these causes a problem.
  • norovirus is considered to have a low virucidal effect with a commonly used alcohol-based disinfectant, and a chlorine-based disinfectant is mainly used.
  • chlorine is decomposed by organic substances contained in vomit, feces and the like, so that the chlorine-based disinfectant attenuates the virus killing effect. Therefore, it was determined whether the MGDG preparation exhibited a virucidal effect even in the presence of an organic substance.
  • Virus Feline calicivirus (FCV) is used as a substitute for norovirus Drugs and concentrations used: Sodium hypochlorite or Kokkomikusa sp. KJ strain MGDG preparation 1,000 ⁇ g / ml each Organic substance: BSA (albumin) 5% ⁇ Method> (1) Feline calicivirus (FCV) is prepared at 2 ⁇ 10 5 PFU / ml. (2) Prepare MGDG preparation or sodium hypochlorite to a concentration 4 times the final assay concentration (1,000 ⁇ g / ml). (3) Bovine serum albumin (BSA) is prepared as an organic substance at a concentration four times the final concentration (5%).
  • BSA bovine serum albumin
  • Table 3 shows the fatty acid composition ratio of each sample by the area percentage method.
  • Table 4 summarizes the calculation results excluding C6: 0 and unknown components 1 and 2 (Unknown 1 and 2).
  • the area ratio of the two components is extremely biased at 3: 1.
  • the combinations of fatty acid residues are (C18: 2 (other than n-6) and C18: 2 (other than n-6)) and (C18: 2 (other than n-6) and C18: 3 n3)
  • "-" Represents non-detection.
  • "-" Represents non-detection.
  • the constituent fatty acids are C16: 3 and C18: 3 (n-3) monogalactosyldiacylglycerol (MGDG1), and (2) the constituent fatty acids are C16: 2 and C18: 2.
  • MGDG2 Monogalactosyldiacylglycerol
  • MGDG3 monogalactosyldiacylglycerol
  • MGDG4 monogalactosyldiacylglycerol
  • MGDG5 monogalactosyldiacylglycerol
  • MGDG1 to MGDG5 The virucidal activity of each MGDG (MGDG1 to MGDG5) constituting the MGDG preparation was compared.
  • Methodhod> (1) The MGDG preparation derived from Kokkomixa sp. KJ strain was subjected to HPLC, and each peak was collected to obtain five kinds of purified MGDG (MGDG1, MGDG2, MGDG3, MGDG4, MGDG5).
  • MGDG preparations (containing MGDG1 to MGDG5) before fractionation were prepared as Mix products.
  • each sample was mixed with each virus solution (2 ⁇ 10 5 PFU / ml) to a final concentration of 50 ⁇ g / ml, and allowed to stand at 37 ° C. for 60 minutes. Table 6 shows the viruses and host cells used.
  • (3) After diluting the mixed solution of (2) with a MEM medium containing no fetal bovine serum, a plaque assay medium was overlaid and cultured at 37 ° C. for 2 to 3 days.
  • the cells were fixed and stained with neutral red solution, and the number of plaques was measured under a microscope. Using the number of appearances of the virus when no sample was added as a reference (100%), the virus remaining rate of each sample was calculated. The virucidal performance of each sample was evaluated from the virus residual rate.
  • HPLC measurement results are shown in FIGS.
  • the vertical axis of the chromatogram is normalized so that the peak maximum value in each sample is 1.
  • -At least 5 peaks were detected in the MGJ preparation of the KJ strain.
  • the MGDG preparations of each organism other than the KJ strain at least one peak whose retention time was the same as or very close to that of the MGJ preparation of the KJ strain was detected. It is presumed that the peak having the same retention time has the same chemical structure as MGDG derived from the KJ strain.
  • -Virucidal activity against HSV-2, IFV and FCV is observed in five peaks derived from the KJ strain MGDG preparation (Experiment 12; Fig. 21).
  • the MGDG preparation of each organism other than the KJ strain has at least one peak corresponding to the five peaks derived from the KJ strain MGDG preparation, it is presumed to have virusicidal activity as well. You. That is, these MGDG preparations can be expected to have the same effects as those of the KJ strain MGDG preparation.
  • the fifth peak of the KJ strain MGDG preparation is known to have high virucidal activity against HSV-2 and IFV (FIG. 21).
  • the virucidal agent of the present invention can be expected to have an irreversible inactivating effect due to destruction of virus particles, and exhibits a killing effect not only on a specific virus but also on a plurality of viruses.
  • the virucidal agent of the present invention is expected to be used for a wide range of uses (for example, prevention and treatment of infectious diseases such as norovirus, herpes simplex virus, and influenza virus).
  • the virucidal agent of the present invention can be expected to have high safety because the active ingredient is a substance derived from a single-cell algae (preferably a microalgae).

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Abstract

実用性に優れ、ヒトの感染症への適用も含め、広範な用途に使用可能な殺ウイルス剤を提供することを課題とする。単細胞藻類のモノガラクトシルジアシルグリセロール含有抽出物を有効成分として含む殺ウイルス剤が提供される。

Description

殺ウイルス剤
 本発明は殺ウイルス剤に関する。詳細には、微細藻類の抽出物又はその成分を有効成分とした殺ウイルス剤及びその用途等に関する。本出願は、2018年7月31日に出願された日本国特許出願第2018-143049号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願の全内容は参照により援用される。
 ウイルス感染症はHIV(ヒト免疫不全ウイルス)やインフルエンザウイルスなどの病原性ウイルスによる疾患である。これまでのウイルス感染症対策としては、ワクチンと抗ウイルス薬の開発が中心であった。しかし、ワクチンが開発されている感染症は限定されており、ウイルス側に抗原変異が生じれば効力を失ってしまう。また、抗ウイルス薬については、対象感染症が限定されている上に、副作用や薬剤耐性ウイルスの出現、経済的負担の増大などの問題を抱えている。特に、薬剤耐性ウイルスの出現は、その薬剤の寿命を縮める深刻な問題である。耐性が生じる原因としては、ほとんどの抗ウイルス薬がウイルス酵素を標的としていることにある。つまり、細胞内でのウイルス増殖段階に阻害的に作用するのである。このことから、薬剤耐性を回避するには、細胞内でのウイルス増殖ではなく、細胞外に存在するウイルス粒子そのものを標的にすればよいと考えられる。このような作用はウイルス粒子の感染力を失わせることであり、殺ウイルス活性(virucidal effect)、或いは不活化効果(inactivation)等と呼ばれている。これまでに開発ないし提案された殺ウイルス剤の例を以下に示す(特許文献1~3)。また、モノガラクトシルジアシルグリセロールの抗ウイルス活性に関する論文も以下に示す(非特許文献1~3)。非特許文献1には、漢方薬(Clinacanthus)が含有するモノガラクトシルジアシルグリセロールが抗ヘルペス活性を発揮したことが示されている。一方、非特許文献2では海藻由来のモノガラクトシルジアシルグリセロールに抗HSV-1活性及び抗HSV-2活性があることが示されている。また、非特許文献3は、漢方薬(Clinacanthus)が含有するモノガラクトシルジアシルグリセロールの抗HSV-1活性及び抗HSV-2活性を報告する。
特開2013-47196号公報 特開2014-55128号公報 国際公開第2014/115860号パンフレット
Phytochemistry. 2003 Dec;64(7):1253-64. Mar Drugs. 2012 Apr; 10(4): 918-931. Asian Pac J Trop Biomed 2016; 6(3): 192-197
 これまでにも殺ウイルス剤の報告はあるものの、活性ないし効果の点、或いは安全性の点などにおいて克服すべき課題や改善の余地があり、実用性に優れた殺ウイルス剤に対するニーズは依然として高い。また、特定のウイルスだけでなく、複数のウイルスに対して殺傷作用を示す殺ウイルス剤の開発に対するニーズは大きい。そこで本発明は、実用性に優れ、ヒトの感染症への適用も含め、広範な用途に使用可能な殺ウイルス剤を提供することを主たる課題とする。
 上記課題に鑑み研究を進める中、コッコミクサ属(Coccomyxa)微細藻類のモノガラクトシルジアシルグリセロールを含有する抽出物が優れた殺ウイルス活性を示すことが判明した。特筆すべきことに、当該抽出物は特定のウイルスだけでなく、複数種類のウイルスに対して殺ウイルス活性を発揮した。一方、更なる検討によって、抽出物中の有効成分であるモノガラクトシルジアシルグリセロールの構造が明らかになった。また、当該抽出物の利用価値が極めて高いことを裏付ける更なる知見が得られた。
 一方、クロレラ・ブルガリス、ナンノクロロプシス・オキュラータ、アルスロスピラ・プラテンシス(スピルリナ)及びユーグレナ・グラシリス由来のモノガラクトシルジアシルグリセロール含有抽出物にも、コッコミクサ属微細藻類由来のモノガラクトシルジアシルグリセロール含有抽出物と同様の効果を期待できることが明らかとなった。
 主として上記の成果及び考察に基づき、以下の発明が提供される。
 [1]単細胞藻類のモノガラクトシルジアシルグリセロール含有抽出物を有効成分として含む殺ウイルス剤。
 [2]前記単細胞藻類がコッコミクサ属、クロレラ属、ナンノクロロプシス属、アルスロスピラ属又はミドリムシ属に属する微細藻類である、[1]に記載の殺ウイルス剤。
 [3]前記単細胞藻類がコッコミクサ属に属する微細藻類である、[1]に記載の殺ウイルス剤。
 [4]前記微細藻類がコッコミクサ sp. KJ株又はその変異株である、[3]に記載の殺ウイルス剤。
 [5]主成分がモノガラクトシルジアシルグリセロールである、[1]~[4]のいずれか一項に記載の殺ウイルス剤。
 [6]前記モノガラクトシルジアシルグリセロールが、以下の(1)~(6)からなる群より選択される、一以上のモノガラクトシルジアシルグリセロールである、[5]に記載の記載の殺ウイルス剤:
 (1)構成脂肪酸がC16:3とC18:3のモノガラクトシルジアシルグリセロール;
 (2)構成脂肪酸がC16:2とC18:3のモノガラクトシルジアシルグリセロール;
 (3)構成脂肪酸がC18:3とC18:3のモノガラクトシルジアシルグリセロール;
 (4)構成脂肪酸がC16:2とC18:2のモノガラクトシルジアシルグリセロール;
 (5)構成脂肪酸がC18:3とC18:2のモノガラクトシルジアシルグリセロール;及び
 (6)構成脂肪酸がC16:1とC18:2のモノガラクトシルジアシルグリセロール。
 [7]前記有効成分が、前記単細胞藻類のエタノール抽出物をクロマトグラフィー精製し、モノガラクトシルジアシルグリセロールの含有量を高めたものである、[1]~[6]のいずれか一項に記載の殺ウイルス剤。
 [8]前記有効成分中のモノガラクトシルジアシルグリセロール含有量が70%(w/v)~99%(w/v)である、[1]~[7]のいずれか一項に記載の殺ウイルス剤。
 [9]以下の(1)~(6)からなる群より選択される、一以上のモノガラクトシルジアシルグリセロールが有効成分の殺ウイルス剤:
 (1)構成脂肪酸がC16:3とC18:3のモノガラクトシルジアシルグリセロール;
 (2)構成脂肪酸がC16:2とC18:3のモノガラクトシルジアシルグリセロール;
 (3)構成脂肪酸がC18:3とC18:3のモノガラクトシルジアシルグリセロール;
 (4)構成脂肪酸がC16:2とC18:2のモノガラクトシルジアシルグリセロール;
 (5)構成脂肪酸がC18:3とC18:2のモノガラクトシルジアシルグリセロール;及び
 (6)構成脂肪酸がC16:1とC18:2のモノガラクトシルジアシルグリセロール。
 [10]標的のウイルスが、エンベロープを持つウイルスである、ヘルペスウイルス又はインフルエンザウイルスである、[1]~[9]のいずれか一項に記載の殺ウイルス剤。
 [11]標的のウイルスが、エンベロープを持たないウイルスである、ノロウイルス又はネコカリシウイルスである、[1]~[9]のいずれか一項に記載の殺ウイルス剤。
 [12]不可逆的不活化作用により殺ウイルス活性を示す、[1]~[11]のいずれか一項に記載の殺ウイルス剤。
 [13][1]~[12]のいずれか一項に記載の殺ウイルス剤を含む組成物。
 [14]ウイルス感染症に対する医薬である、[13]に記載の組成物。
 [15]消毒剤又は殺菌洗浄剤である、[13]に記載の組成物。
 [16]食品又は餌である、[13]に記載の組成物。
単純ヘルペスウイルス2型(HSV-2)を標的としたTime-of-addition実験の結果。MGDG調製物の濃度毎(10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml)、左から順に試験区1~10のウイルス増殖率が示される。 インフルエンザウイルス(IFV)を標的としたTime-of-addition実験の結果。MGDG調製物の濃度毎(10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml)、左から順に試験区1~10のウイルス増殖率が示される。 HSV-2を標的とした殺ウイルス活性試験の結果。0μg/ml(コントロール)、0.01μg/ml、0.025μg/ml、0.1μg/ml、0.25μg/ml、1μg/ml、2.5μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/mlのMGDG調製物でウイルス液を0分~360分処理した。 インフルエンザウイルス(IFV)を標的とした殺ウイルス活性試験の結果。0μg/ml(コントロール)、0.01μg/ml、0.025μg/ml、0.1μg/ml、0.25μg/ml、1μg/ml、2.5μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/mlのMGDG調製物でウイルス液を0分~360分処理した。 MGDG調製物の作用によってインフルエンザウイルス(IFV)のエンベロープが崩壊していることを示す透過電子顕微鏡(TEM)像。左はMGDG作用前(IFVを滅菌水で30分間、室温処理)、右はMGDG作用後(IFVをMGDG(50 μg/ml)で30分間、室温処理)。日立製透過型電子顕微鏡H-800を使用した(加速電圧200 kV)。 ノロウイルスを標的とした殺ウイルス活性試験の結果。1μg/ml、10μg/ml、100μg/mlのMGDG調製物でウイルス液を0分~30分処理した。 ネコカリシウイルス(FCV)を標的とした殺ウイルス活性試験の結果。10μg/ml、50μg/ml、200μg/mlのMGDG調製物でウイルス液を0分~60分処理した。 殺ウイルス活性試験(in vivo実験)の結果(Lesion score)。10μg/ml、50μg/ml、250μg/mlのMGDG調製物でウイルス液を30分処理した後、マウスに接種した。 殺ウイルス活性試験(in vivo実験)の結果(感染3日後のウイルス量)。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. コントロール MGDG調製物の滴下によってヘルペスウイルスのエンベロープが崩壊していることを示す透過電子顕微鏡(TEM)像。 クロレラ属微細藻類の培養に使用する培地の例(C培地)とナンノクロロプシス属微細藻類の培養に使用する培地の例(ESM培地)。 アルスロスピラ属微細藻類の培養に使用する培地の例(MA培地)とミドリムシ属藻類の培養に使用する培地の例(HUT培地)。 有機物存在下での殺ウイルス活性試験の結果。ノロウイルスの代替としてネコカリシウイルス(FCV)を使用した。 口唇ヘルペスに対する効果(患者1:45歳女性)。MGDG調製物を配合したクリームを患部に毎日3回塗布し、経過を観察した。 口唇ヘルペスに対する効果(患者2:25歳男性)。MGDG調製物を配合したクリームを患部に毎日塗布し、経過を観察した。 MGDG調製物の含有成分(MGDG1)の分析結果(GC/FIDのクロマトグラム)。 MGDG調製物の含有成分(MGDG2)の分析結果(GC/FIDのクロマトグラム)。 MGDG調製物の含有成分(MGDG3)の分析結果(GC/FIDのクロマトグラム)。 MGDG調製物の含有成分(MGDG4)の分析結果(GC/FIDのクロマトグラム)。 MGDG調製物の含有成分(MGDG5)の分析結果(GC/FIDのクロマトグラム)。 各MGDG画分(MGDG1~MGDG5)の殺ウイルス活性。インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス2型、ネコカリシウイルス及びポリオウイルスに対するMGDG1~MGDG5及びMGDG調製物(Mix品)の殺ウイルス活性を比較した。 各種生物(コッコミクサ sp. KJ株、クロレラ・ブルガリス、ナンノクロロプシス・オキュラータ、アルスロスピラ・プラテンシス(スピルリナ))のMGDG調製物のHPLCクロマトグラム。MGDG-1からMGDG-5はKJ株MGDG調製物由来のピークであり、これらと同構造と推定されるピークを*で示す。 各種生物(コッコミクサ sp. KJ株、ユーグレナ・グラシリス(いのちのユーグレナ、バイオザイム)、ホウレンソウ)のMGDG調製物のHPLCクロマトグラム。MGDG-1からMGDG-5はKJ株MGDG調製物由来のピークであり、これらと同構造と推定されるピークを*で示す。
1.用語、作用
 殺ウイルス剤とは、標的のウイルスに対して殺ウイルス活性を示す剤である。殺ウイルス活性はウイルスに対する直接的な不活化作用であり、感染予防/感染拡大の阻止、感染症の治療等に優れた効果を発揮する。不活化作用は、可逆的不活化と不可逆的不活化に大別される。後者、即ち不可逆的不活化は、回復不可能な状態にウイルスを不活化するものであり、その効果、意義等は前者と決定的に相違する。
 本発明の殺ウイルス剤によれば、ウイルス粒子の破壊による不可逆的不活化作用を期待できる(後述の実施例を参照)。作用メカニズムがウイルス粒子の破壊であれば標的特異性が低い(即ち標的が特定のウイルスに限定されない)と考えられる。事実、本発明の殺ウイルス剤の有効成分がエンベロープ(外被)を持たないRNAウイルスのノロウイルス、エンベロープを持つDNAウイルスの単純ヘルペスウイルス2型(HSV-2)、及びエンベロープを持つRNAウイルスのインフルエンザウイルスに対して殺ウイルス活性を示した事実は、本発明の殺ウイルス剤の汎用性の高さを裏付ける。一方、「ウイルス粒子の破壊」という作用によれば、増殖サイクルにないウイルスを殺傷することができ、極めて効果的であることはもとより、ウイルスの薬剤耐性化の阻止にも有効である。
2.殺ウイルス剤の有効成分
 本発明の殺ウイルス剤は、単細胞藻類のモノガラクトシルジアシルグリセロール含有抽出物を有効成分とする。そのモノガラクトシルジアシルグリセロール含有抽出物に殺ウイルス活性が認められる限り、単細胞藻類(トレボウクシア藻綱、真正眼点藻綱、藍藻綱、ユーグレナ藻綱等)は特に限定されない。好ましい単細胞藻類として、コッコミクサ属(Coccomyxa)微細藻類(具体例はコッコミクサ sp.KJ株)、クロレラ属(Chlorella)微細藻類(具体例はクロレラ・ブルガリス)、ナンノクロロプシス属(Nannochloropsis)微細藻類(具体例はナンノクロロプシス・オキュラータ)、アルスロスピラ属(Arthrospira)微細藻類(具体例はアルスロスピラ・プラテンシス(スピルリナ))又はミドリムシ属(Euglena)微細藻類(具体例はユーグレナ・グラシリス)を挙げることができる。この中でも、コッコミクサ属微細藻類は特に好ましい。換言すれば、本発明の特に好ましい一態様では、コッコミクサ属微細藻類のモノガラクトシルジアシルグリセロール含有抽出物を有効成分とする。そのモノガラクトシルジアシルグリセロール含有抽出物に殺ウイルス活性が認められる限り、コッコミクサ属微細藻類は特に限定されないが、好ましい例として、コッコミクサ sp. KJ株又はその変異株を挙げることができる。コッコミクサ sp. KJ株(KJデンソー)は、2013年6月4日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター 特許生物寄託センター(NITE-IPOD)(千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室)に受託番号FERM P-22254として寄託され、2015年6月2日付でプタベスト条約の規定下で受託番号FERM BP-22254として国際寄託に移管されている。尚、以前のシュードココミクサ属(Pseudococcomyxa)は、最新の分類ではコッコミクサ属に含まれることになった(参考文献:PLoS One. 2015 Jun 16;10(6):e0127838. doi: 10.1371/journal.pone.0127838. eCollection 2015.)。
 コッコミクサ sp. KJ株の変異株は、紫外線、X線、γ線などの照射、変異原処理、重ビーム照射、遺伝子操作(外来遺伝子の導入、遺伝子破壊、ゲノム編集による遺伝子改変等)等によって得ることができる。殺ウイルス活性を示すモノガラクトシルジアシルグリセロールを産生する変異株が得られる限りにおいて、変異株の取得方法、特性等は特に限定されない。
 コッコミクサ属微細藻類の培養方法は特に限定されない。コッコミクサ属微細藻類を培養するための培地としては、微細藻類の培養に通常使用されているものでよく、例えば、各種栄養塩、微量金属塩、ビタミン等を含む公知の淡水産微細藻類用の培地、海産微細藻類用の培地のいずれも使用可能である。培地としては、例えば、AF6培地が挙げられる。AF6培地の組成(100mlあたり)は以下のとおりである。
 NaNO3  14mg
 NH4NO3  2.2mg
 MgSO4・7H2O  3mg
 KH2PO4  1mg
 K2HPO4  0.5mg
 CaCl2・2H2O  1mg
 CaCO3  1mg
 Fe-citrate  0.2mg
 Citric acid  0.2mg
 Biotin  0.2μg
 Thiamine HCl  1μg
 Vitamin B6  0.1μg
 Vitamin B12  0.1μg
 Trace metals  0.5ml
 Distilled water  99.5ml
 栄養塩としては、例えば、NaNO3、KNO3、NH4Cl、尿素などの窒素源、K2HPO4、KH2PO4、グリセロリン酸ナトリウムなどのリン源が挙げられる。また、微量金属としては、鉄、マグネシウム、マンガン、カルシウム、亜鉛等が挙げられ、ビタミンとしてはビタミンB1、ビタミンB12等が挙げられる。
 培養方法は、通気条件で二酸化炭素の供給とともに攪拌を行えばよい。その際、蛍光灯で12時間の光照射、12時間の暗条件などの明暗サイクルをつけた光照射、又は、連続光照射して培養する。培養条件も、コッコミクサ属微細藻類の増殖に悪影響を与えない範囲内であれば特に制限はされないが、例えば培養液のpHは3~9とし、培養温度は10~35℃にする。
 尚、コッコミクサ sp. KJ株の培養方法に関しては、特開2015-15918、WO 2015/190116 A1、Satoh, A. et al., Characterization of the Lipid Accumulation in a New Microalgal Species, Pseudochoricystis ellipsoidea (Trebouxiophyceae) J. Jpn. Inst. Energy (2010) 89:909-913.等が参考になる。
 コッコミクサ属微細藻類以外の単細胞藻類についても常法で培養することができる。各藻類の培養に使用する培地は特に限定されない。例えば、クロレラ属(Chlorella)微細藻類の培養には、淡水産藻類の培養に一般的な培地、又は塩水産藻類の培養に一般的な培地を使用することができ、好適な培地の一例はC培地(図11)である。同様に、ナンノクロロプシス属微細藻類の培養には、海産藻類の培養に一般的な培地、又は汽水産藻類の培養に一般的な培地を使用することができ、好適な培地の一例はESM培地(図11)である。アルスロスピラ属微細藻類の培養についても同様であり、淡水産藻類の培養に一般的な培地、又は塩水産藻類の培養に一般的な培地を使用することができ、好適な培地の一例はMA培地(図12)である。ミドリムシ属藻類の培養についても同様であり、淡水産藻類の培養に一般的な培地、又は塩水産藻類の培養に一般的な培地を使用することができ、好適な培地の一例はHUT培地(図12)である。
 本発明の殺ウイルス剤の有効成分、即ち、「単細胞藻類(特に好ましくはコッコミクサ属に属する微細藻類)のモノガラクトシルジアシルグリセロール含有抽出物」の抽出方法は、モノガラクトシルジアシルグリセロールを含有する抽出物が得られる限り、特に限定されない。抽出方法として例えばエタノール抽出を採用することができる。好ましくは、エタノール抽出後に精製し、モノガラクトシルジアシルグリセロールの含有量を高めたものを「単細胞藻類(特に好ましくはコッコミクサ属に属する微細藻類)のモノガラクトシルジアシルグリセロール含有抽出物」として用いる。精製方法の例として、シリカゲル、アルミナ等の充填剤を用いたカラムクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、濃縮等を例示することができる。
 抽出に先立ち、回収した藻体を乾燥処理及び又は破砕処理に供してもよい。言い換えれば、乾燥した藻体、乾燥且つ破砕された藻体(典型的には乾燥粉末)、又は破砕された藻体を調製し、これを用いて抽出操作を行うことにしてもよい。単細胞藻類が予め加工処理されたもの(例えば、乾燥した藻体、その粉末/粉体、或いは錠剤(賦形剤等が含まれていても良い)等)を入手し、抽出操作に供することにしてもよい。例えば、クロレラ・ブルガリス、ナンノクロロプシス・オキュラータ、アルスロスピラ・プラテンシス(スピルリナ)、ユーグレナ・グラシリス等についてはその加工品が市販されている。
 有効成分中のモノガラクトシルジアシルグリセロールの含有量は、抽出物が殺ウイルス活性を示す限り特に限定されず、例えば70%(w/v)~99%(w/v)、好ましくは80%(w/v)~99%(w/v)、更に好ましくは90%(w/v)~99%(w/v)より一層好ましくは95%(w/v)~99%(w/v)(具体例として96%(w/v)、97%(w/v)、98%(w/v))である。原則、モノガラクトシルジアシルグリセロールの含有量が高い程、強い殺ウイルス活性を期待できる。「モノガラクトシルジアシルグリセロール」とは、グリセロ糖脂質の一つであり、植物の葉緑体チラコイド膜の構成成分として知られる。モノガラクトシルジアシルグリセロールはガラクトースがグリセロールにβ結合した骨格を有する。
 好ましくは、本発明の殺ウイルス剤ではモノガラクトシルジアシルグリセロールが主成分となる。本発明の殺ウイルス剤が含有し得るモノガラクトシルジアシルグリセロールの例を挙げると、(1)構成脂肪酸がC16:3とC18:3のモノガラクトシルジアシルグリセロール、(2)構成脂肪酸がC16:2とC18:3のモノガラクトシルジアシルグリセロール、(3)構成脂肪酸がC18:3とC18:3のモノガラクトシルジアシルグリセロール、(4)構成脂肪酸がC16:2とC18:2のモノガラクトシルジアシルグリセロール、(5)構成脂肪酸がC18:3とC18:2のモノガラクトシルジアシルグリセロール及び(6)構成脂肪酸がC16:1とC18:2のモノガラクトシルジアシルグリセロールである。これらのモノガラクトシルジアシルグリセロールは、殺ウイルス活性を示すコッコミクサ属微細藻類抽出物が含有するものとして同定された(詳細は後述の実施例の欄に示した「11.MGDG調製物中の成分の同定2」)。後述の実施例の欄に示した「10.MGDG調製物中の成分の同定1」の解析結果も考慮すれば、上記の(1)の構成脂肪酸C18:3は好ましくはC18:3(n-3)であり、上記(3)の構成脂肪酸C18:3の少なくとも片方は好ましくはC18:3(n-3)であり、上記(4)の構成脂肪酸C18:2は好ましくはC18:2(n-6)であり、上記(5)の構成脂肪酸C18:3は好ましくはC18:3(n-3)、同C18:2は好ましくはC18:2(n-6)である。特定のモノガラクトシルジアシルグリセロールを単独で含有することを除外するものではないが、通常、本発明の殺ウイルス剤には、構造の異なる2種類以上のモノガラクトシルジアシルグリセロールが含有され、その場合の組合せ、含有比率などは特に限定されない。本発明の殺ウイルス剤は、好ましくは上記(1)~(6)の中の二つ以上、更に好ましくは上記(1)~(6)の中の三つ以上、更に更に好ましくは上記(1)~(6)の中の四つ以上、一層好ましくは上記(1)~(6)の中の五つ以上、より一層好ましくは上記(1)~(6)の全て、を含有する。後述の実施例に示す通り、(5)のモノガラクトシルジアシルグリセロール(MGDG5)には特に高い殺ウイルス活性が認められた。そこで、特に好ましい態様の殺ウイルス剤には、(5)のモノガラクトシルジアシルグリセロールが単独又は(1)、(2)~(4)及び(6)の中の一つ以上との組合せで含有されることになる。
 殺ウイルス活性を示すコッコミクサ属微細藻類抽出物の主要な含有成分として同定されたモノガラクトシルジアシルグリセロールはそれ自体に殺ウイルス活性を期待できる。そこで本発明の一態様では、上記(1)~(6)からなる群より選択される、一以上のモノガラクトシルジアシルグリセロールが有効成分の殺ウイルス剤が提供される。2種類以上のモノガラクトシルジアシルグリセロールを有効成分とする場合の組合せ、含有比率等は特に限定されない。この態様においても、好ましくは上記(1)~(6)の中の二つ以上、更に好ましくは上記(1)~(6)の中の三つ以上、更に更に好ましくは上記(1)~(6)の中の四つ以上、一層好ましくは上記(1)~(6)の中の五つ以上、より一層好ましくは上記(1)~(6)の全て、を含有する。上記の通り、(5)のモノガラクトシルジアシルグリセロール(MGDG5)には特に高い殺ウイルス活性が認められた。そこで、特に好ましい態様では、(5)のモノガラクトシルジアシルグリセロールが有効成分の少なくとも一つとなる。
 ここで、各種脂肪酸(脂肪酸の例を以下に示す)を構成脂肪酸として含むモノガラクトシルジアシルグリセロールが存在する。本発明の教示を考慮すれば、公知のモノガラクトシルジアシルグリセロールを含め、モノガラクトシルジアシルグリセロールが一般に殺ウイルス活性を発揮し得ることを合理的に期待できる。
<脂肪酸の例>
 C12:0, C13:0, C14:0, C14:1, C14:2, C15:0, C15:1, C16:0, C16:1, C16:4, C17:0, C17:1, C18:0, C18:1, C18:4, C19:0, C19:1, C20:0, C20:1, C20:2, C20:3, C20:4, C20:5, C22:0, C22:5, C24:0
3.標的のウイルス
 上でも言及したように、本発明の殺ウイルス剤の作用メカニズム、並びに本発明の殺ウイルス剤の有効成分がノロウイルス、ネコカリシウイルス(FCV)、単純ヘルペスウイルス2型(HSV-2)及びインフルエンザウイルス(IFV)に対して殺ウイルス活性を示した事実は、本発明の殺ウイルス剤の汎用性の高さを裏付ける。本発明の殺ウイルス剤が特に有効である標的ウイルスとして、ノロウイルス、ネコカリシウイルス、ヘルペスウイルス及びインフルエンザウイルスを例示することができる。ノロウイルスは外被(エンベロープ)を持たないRNAウイルスであり、ウイルス分類上はカリシウイルス科に属する。ノロウイルスは界面活性剤やアルコール等に対して高い抵抗性を示す。ネコカリシウイルスはカリシウイルス科のウイルスであり、ネコの感染症であるネコカリシウイルス感染症の病原体として知られている。外被(エンベロープ)を持たないRNAウイルスであり、ノロウイルスと類似した特性を示す。そのため、ノロウイルスの代替として実験に用いられている。
 ヘルペスウイルスは二本鎖DNAをゲノムとしてもつウイルスである。ヘルペスウイルスは、3種類のヘルペスウイルス亜科(αヘルペスウイルス亜科、βヘルペスウイルス亜科、γヘルペスウイルス亜科)に分類される。αヘルペスウイルス亜科には単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)、単純ヘルペスウイルス2型(HSV-2)、水痘・帯状疱疹ウイルス(VZV)が属し、βヘルペスウイルス亜科にはサイトメガロウイルス(CMV)、ヒトヘルペスウイルス6(HHV-6)、ヒトヘルペスウイルス7(HHV-7)が属し、γヘルペスウイルス亜科にはエプスタイン・バール・ウイルス(EBV)、ヒトヘルペスウイルス8(HHV-8、別名:カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス(KSHV))が属する。
 インフルエンザウイルスは一本鎖RNAウイルスであり、ウイルス粒子を構成するタンパク質、抗原性、形態などが異なる、3つの属、即ち、A型インフルエンザウイルス、B型インフルエンザウイルス及びC型インフルエンザウイルスに大別される。A型インフルエンザウイルスはヒト、鳥類、ウマ、ブタなどを宿主とし、一般にその感染による症状(病態)は他の型の場合よりも重篤である。A型インフルエンザは毎年、大流行(エピデミック)を引き起こす。また、世界的大流行(パンデミック)が懸念されており、その対策が急務となっている。A型インフルエンザウイルスはHA分子の型によって二つのグループ、即ち、H2、H5、H1、H6(以上、H1クラスター;H1a)、H13、H16及びH11(以上、H1クラスター;H1b)からなるグループ1と、H8、H12、H9(以上、H9クラスター)、H4、H14、H3(以上、H3クラスター)、H15、H7及びH10(以上、H7クラスター)からなるグループ2に大別される。A型インフルエンザウイルスの種類として、H1N1型、H1N2型、H2N2型、H3N2型、H5N1型、H5N2型、H6N1型、H7N2型、H7N3型、H7N7型、H7N9型、H9N2型及びH9N1型を例示することができる。
 上記の各ウイルスの他、エンベロープを持つ各種DNAウイルス(例えば天然痘ウイルス)、エンベロープを持つ各種RNAウイルス(例えば麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ムンプスウイルス、コロナウイルス)、エンベロープを持たない各種DNAウイルス(例えばアデノウイルス、パピローマウイルス)、エンベロープを持たない各種RNAウイルス(例えばポリオウイルス、ロタウイルス、ノロウイルス)等も、本発明の殺ウイルス剤の標的となり得る。
4.殺ウイルス剤の用途・使用方法
 本発明の殺ウイルス剤はそれを含む組成物として各種用途に用いることができる。ここでの組成物の例は医薬(治療薬又は予防薬)、消毒剤、殺菌洗浄剤、食品、餌である。その用途を考慮しつつ、本発明の組成物に、アシクロビル、ガンシクロビル、バラシクロビル、ビタラビン、ホスカルネット、トリフルリジン、オセルタミビルリン酸塩(商品名タミフル)、ザナミビル水和物(商品名リレンザ)、ペラミビル水和物(商品名ラピアクタ)、ラニナミビルオクタン酸エステル水和物(商品名イナビル)、バロキサビル マルボキシル(商品名ゾフルーザ)等の抗ウイルス剤、塩化ベンザルコニウム、塩化セチルピリジニウム、フェノキシエタノール、イソプロピルメチルフェノール、グルコン酸クロルヘキシジン等の抗菌ないし除菌成分等を含有させてもよい。
 本発明の殺ウイルス剤の用途の具体例の一つとして、ノロウイルスに汚染された牡蠣の浄化を挙げることができる(後述の実施例を参照)。当該用途では、典型的には、殺ウイルス剤の溶液を用意し、ノロウイルスに汚染された牡蠣(または、汚染の可能性がある牡蠣)を浸漬する(例えば、数時間から数日程度、飼育するとよい)。
(1)医薬
 本発明の医薬はウイルス感染症の治療又は予防に用いられる。本発明の医薬はウイルス感染症に対して治療的効果又は予防的効果(これら二つの効果をまとめて「医薬効果」と呼ぶ)を発揮し得る。ここでの医薬効果には、(1)ウイルス感染の阻止、(2)ウイルス感染症の発症の阻止、抑制又は遅延、(3)ウイルス感染症に特徴的な症状又は随伴症状の緩和(軽症化)、(4)ウイルス感染症に特徴的な症状又は随伴症状の悪化の阻止、抑制又は遅延、等が含まれる。尚、治療的効果と予防的効果は一部において重複する概念であることから、明確に区別して捉えることは困難な場合があり、またそうすることの実益は少ない。
 医薬の製剤化は常法に従って行うことができる。製剤化する場合には、製剤上許容される他の成分(例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など)を含有させることができる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、D-マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛化剤としてはベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。
 製剤化する場合の剤形も特に限定されない。剤形の例は錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤、外用剤(軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、液剤、ゲル剤、パップ剤、プラスター剤、テープ剤、エアゾール剤等)、及び座剤である。医薬はその剤形に応じて経口投与又は非経口投与(患部への局所注入、静脈内、動脈内、皮下、皮内、筋肉内、又は腹腔内注射、経皮、経鼻、経粘膜など)によって対象に適用される。また、全身的な投与と局所的な投与も対象により適応される。これらの投与経路は互いに排他的なものではなく、任意に選択される二つ以上を併用することもできる。
 本発明の医薬には、期待される効果を得るために必要な量(即ち治療又は予防上有効量)の有効成分が含有される。本発明の医薬中の有効成分量は一般に剤形によって異なるが、所望の投与量を達成できるように有効成分量を例えば約0.1重量%~約99重量%の範囲内で設定する。
 本発明の医薬の投与量は、期待される効果が得られるように設定される。治療又は予防上有効な投与量の設定においては一般に症状、患者の年齢、性別、及び体重などが考慮される。当業者であればこれらの事項を考慮して適当な投与量を設定することが可能である。投与量の例を示すと、成人(体重約60kg)を対象として一日当たりの有効成分量が1 mg~20 mg、好ましくは5 mg~10 mgとなるよう投与量を設定することができる。投与スケジュールとしては例えば一日一回~数回、二日に一回、或いは三日に一回などを採用できる。投与スケジュールの作成においては、患者の状態や有効成分の効果持続時間などを考慮することができる。
 本発明の医薬による治療又は予防に並行して他の医薬(例えば、アシクロビル、ガンシクロビル、バラシクロビル、ビタラビン、ホスカルネット、トリフルリジン、オセルタミビルリン酸塩(商品名タミフル)、ザナミビル水和物(商品名リレンザ)、ペラミビル水和物(商品名ラピアクタ)、ラニナミビルオクタン酸エステル水和物(商品名イナビル)、バロキサビル マルボキシル(商品名ゾフルーザ)等の抗ウイルス剤)による処置を施すことにしてもよい。本発明の有効成分と作用機序の異なる薬剤を併用すれば、複合的な作用/効果が得られ、例えばウイルス感染症の治療に適用した場合には治療効果の増大を図ることができる。
 以上の記述から明らかな通り本願は、ウイルス感染症に罹患した対象又は罹患するおそれのある対象に対して、本発明の殺ウイルス剤を含む医薬を、治療又は予防上有効量投与することを特徴とする、各種ウイルス感染症を治療又は予防する方法も提供する。治療又は予防の対象は典型的にはヒトであるが、ヒト以外の哺乳動物(例えばサル、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、等)、鳥類(ニワトリ、ウズラ、七面鳥、ガチョウ、アヒル、ダチョウ、カモ、インコ、文鳥等)等に適用することにしてもよい。
(2)消毒剤、殺菌洗浄剤
 本発明の消毒剤又は殺菌洗浄剤は、例えば、居室(病室を含む)、調理室、トイレ、洗面所、浴室等の消毒又は殺菌洗浄、食器、カトラリー(ナイフ、フォーク、スプーン等)、調理器具(包丁、ナイフ、鍋、ミキサー、電子レンジ、オーブン等)、医療器具・装置等の消毒又は殺菌洗浄、手、指先や口腔等の消毒又は殺菌洗浄に用いられる。本発明の消毒剤又は殺菌洗浄剤は、例えば、液状(例えばスプレー剤、ローション)、ゲル状、固形状(例えば粉末)に構成され、塗布、噴霧、散布等によって適用される。天然繊維や合成繊維等からなる担体(例えばシート状)に本発明の消毒剤又は殺菌洗浄剤を担持ないし付着させ、拭き取り用途等に使用される製品や感染予防用マスク等としてもよい。
 塩化ベンザルコニウム、塩化セチルピリジニウム、フェノキシエタノール、イソプロピルメチルフェノール、グルコン酸クロルヘキシジン等の抗菌ないし除菌成分、pH調整剤、界面活性剤、吸着剤、担体等を本発明の消毒剤又は殺菌洗浄剤に添加することにしてもよい。
 本発明の消毒剤又は殺菌洗浄剤には、消毒又は殺菌洗浄効果が期待できる量の有効成分が含有される。添加量は、その用途や形態等を考慮して定めることができる。
(3)食品、餌
 本発明の食品の例として一般食品(穀類、野菜、食肉、各種加工食品、菓子・デザート類、牛乳、清涼飲料水、果汁飲料、珈琲飲料、野菜汁飲料、アルコール飲料等)、栄養補助食品(サプリメント、栄養ドリンク等)、食品添加物、愛玩動物用食品、愛玩動物用栄養補助食品を挙げることができる。栄養補助食品又は食品添加物の場合、粉末、顆粒末、タブレット、ペースト、液体等の形状で提供することができる。食品組成物の形態で提供することによって、本発明の有効成分を日常的に摂取したり、継続的に摂取したりすることが容易となる。
 本発明の餌の例は、飼料(例えば家畜、家禽などの餌)、ペットフードである。
 本発明の食品又は餌には、治療的又は予防的効果が期待できる量の有効成分が含有される。添加量は、それが使用される対象となる者の状態、年齢、性別、体重などを考慮して定めることができる。
1.微細藻類コッコミクサ sp. KJ株の抽出物の調製、及び抽出物の精製
 既報の方法に準じてコッコミクサ sp. KJ株を培養した。具体的には、AF6培地にコッコミクサ sp. KJ株を植藻した後、2%CO2(v/v)を通気し、光(300μmol/m2/s)を照射しながら室温(25℃)で48時間培養した。培養液から遠心分離により藻体を回収した。回収した藻体をドラムドライヤで乾燥させるとともに微粉砕機で粉砕し、粉末状とした(藻体の乾燥粉末)。次に、100gの乾燥粉末に対して1 lのエタノールを添加して分散させ、暗所で3日間静置した。静置後、ろ過して、1次ろ液と残渣とに分離した。この残渣に上記と同様に1 lのエタノールを添加して分散させ、3日間静置した後、再度ろ過して2次ろ液と残渣とに分離した。このろ過操作をもう一度繰り返し、3次ろ液と残渣とを得た。
 1次ろ液、2次ろ液、及び3次ろ液を混合し、エバポレーターでエタノールを留去し、減圧乾燥してエタノール抽出物DEとした。次に、DEをDIAION HP-20(三菱化学(株)製、3.5 x 57 cm)カラムクロマトグラフィーに供した。H2O、50%エタノール (EtOH)、EtOH及びアセトンで順次溶出し、各溶出フラクションを室温で減圧乾燥した(DE1, 400.9 mg; DE2, 310.3 mg; DE3, 2.25 g; DE4, 4.86 g)。アセトンフラクション(DE4)をシリカゲルカラム(3 x 42 cm)クロマトグラフィーに供した。ヘキサン、ヘキサン-酢酸エチル (AcOEt) (1:1)、AcOHt、AcOHt-アセトン (1:1)、アセトン及びメタノール (MeOH)で順次溶出し、各溶出フラクション、DE4A (55.4 mg)、DE4B (2.0 g)、DE4C (89.0 mg)、DE4D (1.01 g)、DE4E (95.5 mg)及びDE4F (177.1 mg)を得た。次に、DE4Dを、AcOEt-アセトンを溶媒系としたシリカゲルカラム(1.5 x 35 cm)クロマトグラフィーに供し、3フラクション、DE4D1 (49.9 mg)、DE4D2 (705.1 mg)及びDE4D3 (16.2 mg)を得た。続いて、DE4D2をシリカゲルカラム(1.5 x 35 cm)クロマトグラフィーに供し、CHCl3-MeOH-H20 (10:1:0.1)で溶出することでDE4D2A (15.6 mg)とDE4D2B (686.5 mg)を得た。この内、DE4D2Bを、クロロホルム (CHCl3)-MeOH (3:1)を溶媒系としたLH-20カラム(シグマアルドリッチ社製)クロマトグラフィーに供し、DE4D2Bl (11.6 mg)とDE4D2B2 (652.3 mg)を得た。DE4D2B2をシリカゲルカラム(2 x 50 cm)クロマトグラフィーに供し、CHCl3、CHCl3-MeOH (20:1)及びCHCl3-MeOH-H20(10:3:1)で溶出することで4フラクション、DE4D2B2A (4.8 mg)、DE4D2B2B (3.5 mg)、DE4D2B2C (25.1 mg)及びDE4D2B2D (620.5 mg)を得た。最後に、CHCl3-MeOH-酢酸 (AcOH)-H20 (80:9:12:2)で展開した分取液体クロマトグラフィー(PLC)でDE4D2B2Dを精製し、MGDG調製物 (578.9 mg)とした。
2.ヘルペスウイルス及びインフルエンザウイルスを標的とした殺ウイルス活性
 MGDG調製物の殺ウイルス活性を評価するため、Time-of-addition実験と殺ウイルス活性試験を実施した。標的ウイルスはHSV-2及びA型インフルエンザウイルスとした。
2-1.Time-of-addition実験
<方法>
(1)48ウェルプレートに細胞(Vero細胞又はMDCK細胞)を単層状に培養する。
(2)MGDG調製物(10μg/ml、25μg/ml又は50μg/ml)を以下の添加時間で培地へ添加する。
 試験区1:ウイルス感染前の3時間
 試験区2:ウイルス感染前の1時間
 試験区3:ウイルス感染中(室温で1時間)のみ
 試験区4:ウイルス感染3時間前から24時間後まで
 試験区5:ウイルス感染1時間前から24時間後まで
 試験区6:ウイルス感染中から24時間後まで
 試験区7:ウイルス感染直後から24時間後まで
 試験区8:ウイルス感染1時間後から24時間後まで
 試験区9:ウイルス感染3時間後から24時間後まで
 試験区10:ウイルス感染6時間後から24時間後まで
(3)感染24時間後に培養物を収穫し、別に35 mm培養皿に準備した細胞を用いてプラークアッセイを行う。
(4)MGDG調製物の代わりに溶媒(MEM培地)を加えたコントロールのプラーク数を基準(100%)とし、各試験区のウイルス増殖率を算出する。
<結果・考察>
 試験結果(2回の測定値の平均)を図1(HSV-2が標的)及び図2(インフルエンザウイルスが標的)に示す。MGDG調製物の濃度依存的にHSV-2増殖は阻害された(図1)。いずれの濃度においても、試験区3(ウイルス感染中のみサンプルが存在する)の効果が強いようであった。これは、ウイルスの宿主細胞への吸着・侵入段階をMGDG調製物が阻害しているかのようであるが、同時期にサンプルが存在する他の試験区(試験区4、5、6)においては、同様の結果が得られなかったことから、この段階をMGDG調製物の作用標的とみなすことはできない。また、ウイルスのタンパクや遺伝子の合成が細胞内で行なわれている時期(試験区8、9、10)において顕著な阻害効果がみられなかったことから、MGDG調製物は宿主細胞内でのウイルス増殖段階に選択的に作用するとは考えにくい。
 一方、インフルエンザウイルス(IFV)を標的とした場合は、HSV-2に比べて、MGDG調製物の濃度依存的なウイルス増殖阻害効果は顕著ではなかった(図2)。他の点では、HSV-2の場合に似た傾向が認められた。
2-2.殺ウイルス活性試験
 上記のTime-of-addition実験からは直接的に評価できないウイルス不活化作用(殺ウイルス活性)を検討した。
<方法>
(1)ウイルス液(2 x 105 PFU/ml)0.1 mlと2倍濃度のサンプル液(混合後の濃度を0.01~50μg/mlとしたMGDG調製物)0.1 mlを1.5 ml チューブに加えて混合し、37℃に置く。
(2)0~6時間後に、各チューブから10μlずつ採取して氷上に移し、PBS 990μlを加えて100倍希釈する。
(3)直ちに、この希釈液0.1 mlを、別に準備した宿主細胞(35 mm培養皿)に感染させる(室温、1時間)。
(4)プラークアッセイ用培地を重層する。
(5)2日後にプラークの出現を確認し、クリスタルバイオレット液で細胞を固定・染色する。
(6)プラーク数を測定する。
(7)ウイルス液と希釈液(PBS)とを混合した直後(0分)のプラーク数を基準(100%)とし、各試験区の相対プラーク数(%)を算出する。
<結果・考察>
 試験結果(2回の測定値の平均)を図3(HSV-2が標的)及び図4(インフルエンザウイルスが標的)に示す。HSV-2を標的とした場合(図3)、コントロール(MGDG調製物濃度0μg/ml)は、6時間の処理時間中に感染力を約40%にまで徐々に低下させた。MGDG調製物は、濃度依存的にコントロールよりもウイルスを死滅させた。特に、10μg/ml以上の濃度で殺ウイルス活性が極めて強く、50μg/mlの濃度ではウイルスと混合した時点で感染力を半減させた。0.01μg/ml (10 ng/ml)の極めて低濃度でも、MGDG調製物はコントロールに比べて高いウイルス不活化効果を示した。
 一方、MGDG調製物はインフルエンザウイルス(IFV)に対しても、濃度依存的にコントロールよりもウイルスを死滅させた(図4)。HSV-2の場合と同様に、MGDG調製物は10μg/ml以上の濃度で強い殺ウイルス活性を示した。但し、HSV-2に比べて、ウイルス不活化には時間を要した。
 以上の二つの試験結果から、MGDG調製物は2種類のウイルス(HSV-2、IFV)のいずれに対しても殺ウイルス活性をもたらすことが明らかになった。
 図5に示す通り、インフルエンザウイルス(IFV)をMGDG調製物(50μg/ml)で処理(30分間、室温)し、形態観察した結果、ウイルスエンベロープの崩壊が認められ、MGDG調製物が不可逆的な不活性作用を示したことが明らかとなった。
3.ノロウイルスを標的とした殺ウイルス活性
 エンベロープを持たないウイルスに対してもMGDG調製物が殺ウイルス活性を示すか否かを評価した。MGDG調製物について、マウスノロウイルス(MNV)に対する不活化作用を評価した。
<方法>
(1)ウイルス(MNV)のストックをPBS (リン酸緩衝生理食塩水)で希釈して2×105 PFU/mlに調製する。
(2)1.5 mlマイクロチューブにサンプル(所定濃度のMGDG調製物)0.5mlとウイルス液0.5 mlを入れて混合する。尚、コントロールは、サンプルの代わりにPBSを加える。
(3)サンプルとウイルス液の混合液を室温に置き、0分後、1分後、10分後及び30分後に10μlずつ採取して990μlのPBSと混合する(100倍希釈)。尚、この希釈は、以下で行う残存ウイルス量の測定時にサンプルの影響が出る事を防止するためである。
(4)100倍希釈液100μlを、前もって単層状に培養しておいた宿主細胞(マウスマクロファージ様細胞であるRAW264.7細胞)に加え、室温で1時間感染させる。
(5)プラークアッセイ用培地を重層し、37℃で2~3日間培養する。
(6)プラークの出現を確認後、ニュートラルレッド液で細胞を固定・染色し、顕微鏡下でプラーク数を測定する。
(7)0時間のプラーク数を基準(100%)とし、各処理時間後の残存ウイルス量(相対プラーク数)を算出する。
<結果・考察>
 MGDG調製物(1~100μg/ml)は、濃度依存的・時間依存的にMNVに対して殺ウイルス活性を示した(図6)。
4.ネコカリシウイルスを標的とした殺ウイルス活性
 ノロウイルスの代替として用いられるネコカリシウイルス(FCV)に対してもMGDG調製物が殺ウイルス活性を示すか否かを評価した。
<方法>
(1)ウイルス(FCV)のストックをPBS (リン酸緩衝生理食塩水)で希釈して2×105 PFU/mlに調製する。
(2)1.5 mlマイクロチューブにサンプル(所定濃度のMGDG調製物)0.5mlとウイルス液0.5 mlを入れて混合する。尚、コントロールは、サンプルの代わりにPBSを加える。
(3)サンプルとウイルス液の混合液を室温に置き、0分後、1分後、10分後、30分後及び60分後に10μlずつ採取して990μlのPBSと混合する(100倍希釈)。尚、この希釈は、以下で行う残存ウイルス量の測定時にサンプルの影響が出る事を防止するためである。
(4)100倍希釈液100μlを、前もって単層状に培養しておいた宿主細胞(ネコ腎由来のCRFK細胞)に加え、室温で1時間感染させる。
(5)プラークアッセイ用培地を重層し、37℃で2~3日間培養する。
(6)プラークの出現を確認後、ニュートラルレッド液で細胞を固定・染色し、顕微鏡下でプラーク数を測定する。
(7)0時間のプラーク数を基準(100%)とし、各処理時間後の残存ウイルス量(相対プラーク数)を算出する。
<結果・考察>
 MGDG調製物(10~200μg/ml)は、濃度依存的・時間依存的にFCVに対して殺ウイルス(不活化)活性を示した(図7)。
5.ヘルペスウイルスを標的とした殺ウイルス活性の不可逆性の検討(実験動物を用いたin vivo実験)
 上記の通り、MGDG調製物がHSV-2を不活化することを、培養細胞を用いたin vitroアッセイで確認した。この不活化が、生体内で不可逆的に維持されて、ウイルス感染症(性器ヘルペス)を抑制できるのかを評価した。具体的には、MGDG調製物で処理したウイルスを性器に接種し、感染3日後のウイルス量、ヘルペス症状の程度(lesion scores)、死亡率を検討した。
<方法>
(1)BALB/cマウス(6週齢、雌)に、ウイルス接種6日前及び1日前に、medroxyprogesterone (3 mg/0.1 ml/mouse)を皮下注射する。
(2)0日目に、下記のように処理したウイルス液(20μl/mouse)を、マウスの性器に接種する。
 コントロール: 溶媒(PBS)を同量のウイルス液(HSV-2(UW268株)、4 x 104 PFU/20 μl)(最終ウイルス量 2 x 104 PFU/20μl/mouse)と混合して、30分間、室温で処理する。
 試験区(MGDG調製物): 2倍濃度(20μg/ml、100μg/ml、500μg/ml)のMGDG調製物を同量のウイルス液(HSV-2(UW268株)、4 x 104 PFU/20μl)(最終ウイルス量 2 x 104 PFU/20 μl/mouse)と混合して、30分間、室温で処理する。
(3)感染3日後に、性器をPBS(100μl/mouse)で洗浄し、洗浄液中のウイルスをプラークアッセイで定量する。
(4)感染14日後まで、発症の程度を観察し、0~5の6段階のlesion scoresで評価する。
(5)感染14日後まで、マウスの生死を記録する。
<結果・考察>
(1)発症の時間的経過及び死亡例(図8、表1)
 コントロール群は、感染10日後までに全例(5匹中5匹)が死亡した。これに対して、250μg/ml及び50μg/mlのMGDG濃度でウイルスを前処理した場合には、全てのマウスでヘルペス症状はみられず、全例生存した。10μg/mlでの処理時には、5匹中3匹に発症が認められて死亡し、2匹は無症状で経過して生存した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
(2)感染3日後のウイルス量(図9)
 250μg/ml及び50μg/mlの濃度でウイルスを前処理した場合には、全てのマウスでウイルスは検出されなかった(***p<0.001)。10μg/mlの濃度では、5匹中4匹にウイルスが検出され、その平均値は、コントロール群に比べて有意に(*p<0.05)低かった。
 以上の結果とin vitroでの殺ウイルス活性試験の結果(上記の項目2.)とを考え合わせると、MGDG調製物はHSV-2に対して不可逆的な不活化作用を及ぼすことが明らかになった。この結果は、形態的観察によってウイルスのエンベロープが破壊されていると推察された結果(図10)と矛盾しない。
 in vitroとin vivoでのMGDG調製物の殺ウイルス活性の評価結果を以下の表2にまとめて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
6.クロレラ・ブルガリス、ナンノクロロプシス・オキュラータ、アルスロスピラ・プラテンシス(スピルリナ)及びユーグレナ・グラシリスのMGDGの調製
 クロレラ・ブルガリス、ナンノクロロプシス・オキュラータ、アルスロスピラ・プラテンシス(スピルリナ)及びユーグレナ・グラシリスからMGDGを抽出する。各藻類の培養は、各々に適した培地(例えば、クロレラ・ブルガリスであれば、図11に示すC培地、ナンノクロロプシス・オキュラータであれば、図11に示すESM培地、アルスロスピラ・プラテンシス(スピルリナ)であれば、図12に示すMA培地、ユーグレナ・グラシリスであれば、図12に示すHUT培地)を用い、常法で行えばよい(上記コッコミクサ sp. KJ株と同様の培養条件を採用してもよい)。培養液から遠心分離により回収した藻体をドラムドライヤで乾燥させるとともに微粉砕機で粉砕することにより、各藻体の乾燥粉末を得ることができる。乾燥粉末からコッコミクサ sp. KJ株の場合と同様の抽出操作によって、各藻類のMGDG調製物を得ることができる。但し、今回の検討では、各藻類の加工品(クロレラ・ブルガリスは「クロレラ・ブルガリス乾燥粉末」(株式会社葵製茶)、ナンノクロロプシス・オキュラータは「ナンノクロロプシス・オキュラータ凍結品」(マリンテック株式会社)、アルスロスピラ・プラテンシス(スピルリナ)は「スピルリナパウダー」(DICライフテック株式会社)、ユーグレナ・グラシリスは「いのちのユーグレナ極み」(シックスセンスラボ株式会社)とバイオザイム(ユーグレナ)を購入し、MGDGの抽出に供した(抽出操作はコッコミクサ sp. KJ株の場合と同様)。得られた各MGDG調製物を以下の検討に用いる。市販のホウレンソウ(Spinacia oleracea)からも、凍結乾燥後に微粉砕機で粉砕し、MGDGを抽出することによってMGDG調製物を得た。
7.牡蠣に濃縮されたノロウイルスを標的とした殺ウイルス活性(ノロウイルスに汚染された牡蠣の浄化試験)
(1)汚染牡蠣の作出
 活牡蠣を購入し、水道水流水下、ブラシを使って殻の表面をよく洗浄した後、クリーンベンチ内に静置して紫外線下で殻表面を殺菌する。次に、ろ過(穴径0.2μm;ミリポア社製)滅菌した海水(水温10℃)に殻の表面を紫外線処理した牡蠣を入れ、通気しながら1昼夜絶食飼育する。次いで、あらかじめ調製しておいたマウスノロウイルスのストックを、このろ過滅菌海水に終濃度で2×10PFU/mlになるように投入する。そして、さらに1昼夜飼育し、マウスノロウイルスに汚染された牡蠣を作出する。
(2)MGDG調製海水の作製
 MGDG調製物(コッコミクサ sp. KJ株MGDG調製物、クロレラ・ブルガリスMGDG調製物、ナンノクロロプシス・オキュラータMGDG調製物、アルスロスピラ・プラテンシス(スピルリナ)MGDG調製物、ユーグレナ・グラシリスMGDG調製物、ホウレンソウMGDG調製物)又はそれを精製したMGDGにDMSOを添加して均質に懸濁する(MGDG懸濁液)。ついで、ろ過(穴径0.2μm;ミリポア社製)滅菌海水10Lに対してMGDGの終濃度が100ppmになるようにMGDG懸濁液を添加し、白濁したMGDG調製滅菌海水を得る。
(3)浄化試験
 MGDG処理区は汚染牡蠣を各種MGDG 100ppmのろ過滅菌海水1L入りのビーカーに1個ずつ収容する。対照区(MGDG処理なし)ではMGDG未添加のろ過滅菌海水1L入りビーカーに1個収容して比較とする。海水温を10℃に設定し通気しながら48時間飼育する。48時間経過後、牡蠣を海水から取りあげ、殻から身を取り出し、ろ紙に乗せ、水分をよくふき取る。そして、ビニール袋に入れて-80℃で冷凍保存する。この操作により、牡蠣に蓄積するマウスノロウイルスが流出することなく保存される。尚、実験数は、比較による有意差を見出すに十分な数を設定する。
(4)残存マウスノロウイルスの評価
 牡蠣の消化管中でマウスノロウイルスは増殖しないので、基本的には、添加したマウスノロウイルスはすべて牡蠣に取り込まれ消化管に蓄積するものと考えられる。(3)で凍結した牡蠣を解凍し、牡蠣から消化管を摘出し、この消化管内を一定量のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、その洗浄液をPBSで100倍に希釈する。この100倍希釈液100μlを、前もって単層状に培養しておいた宿主細胞(マウスマクロファージ様細胞であるRAW264.7細胞)に添加し、室温で1時間感染させる。そして、プラークアッセイ用培地を重層し、37℃で2~3日間培養する。プラークの出現を確認後、ニュートラルレッド液で細胞を固定・染色し、顕微鏡下でプラーク数を測定する。初期のマウスノロウイルスの濃度2×105 PFU/mlを基準(100%)とし、48時間後の牡蠣消化管中の生存ウイルス量(相対プラーク数)を算出する。
 MGDG処理区では、牡蠣汚染したマウスノロウイルスは、取り込まれたMGDGとの接触により感染能力が失われ、宿主細胞からはほとんどプラークが発生しないとの結果が得られる。
8.有機物存在下における殺ウイルス効果
 ノロウイルス感染者の吐しゃ物や糞便中にはノロウイルスが含まれ、これらによる二次感染が問題となる。また、ノロウイルスは一般に用いられるアルコール系消毒剤では殺ウイルス効果が低いとされ、主に塩素系の消毒剤が使用される。しかし、塩素は吐しゃ物や糞便等に含まれる有機物により分解されることから、塩素系消毒剤では殺ウイルス効果が減衰してしまう。そこで、MGDG調製物が有機物存在下でも殺ウイルス効果を発揮するか検討することにした。
<使用したウイルス・試薬等>
 ウイルス:ノロウイルスの代替としてネコカリシウイルス(FCV)を使用
 使用薬剤と濃度:次亜塩素酸ナトリウム又はコッコミクサ sp. KJ株MGDG調製物 各1,000μg/ml
 有機物:BSA(アルブミン) 5%を使用
<方法>
(1)ネコカリシウイルス(FCV)を2×105 PFU/mlに調製する。
(2)MGDG調製物または次亜塩素酸ナトリウムを、最終検定濃度(1,000μg/ml)の4倍濃度に調製する。
(3)有機物としてウシ血清アルブミン(BSA)を最終濃度(5%)の4倍濃度に調製する。
(4)ウイルス液:MGDG調製物または次亜塩素酸ナトリウム:BSA=2:1:1で混合する。MGDG調製物または次亜塩素酸ナトリウムの代わりにPBSを加えたサンプルをコントロールとした。
(5)室温にて1分、10分、60分間放置後、PBSで100倍希釈する。35mm培養皿に単層状に培養したCRFK細胞へ100μl/培養皿の量を加えて、室温で1時間、感染処理する。
(6)1% SeaPlaque Agarose添加MEM培地を重層する。
(7)2日後に、出現したプラークをクリスタルバイオレット液で固定・染色する。
(8)顕微鏡下でプラーク数を計算する。
<結果>
 図13示す通り、次亜塩素酸ナトリウムは有機物(BSA)が存在しない場合、1分間でウイルスを100%不活化した。しかし、5%の有機物存在下では不活化効果が著しく減弱した。一方で、MGDGの不活化効果は有機物存在下でもほとんど変化がなく、次亜塩素酸ナトリウムと比較して高い不活化効果を示した。
9.口唇ヘルペスに対する効果
 MGDG調製物の口唇ヘルペスに対する効果を検証した。
<方法>
(1)ハンドクリーム(moina、デンソー製) 30gを準備する。
(2)オリーブ油((株)J-オイルミルズ社製)0.610gにコッコミクサ sp. KJ株MGDG調製物を0.165g加え、混練し溶解させる(MGDG溶解物)。
(3)(1)で用意したハンドクリームに対し、均一になるよう混錬しながらMGDG溶解物を少量ずつ加え、全てを加え終えたものを塗布用サンプルとする。
(4)口唇ヘルペス発症した患者(以下の2名の患者を被験者とした)の患部に対し、毎日(1~3回)適量を塗り込み、患部の様子を経時的に観察する。
 患者1:45歳女性;口唇ヘルペスの発症経験(複数回)あり。普段はビダラビンを有効成分とする市販薬アラセナS(佐藤製薬株式会社)を使用して治療し、治癒までに2~3週間を要する。
 患者2:25歳男性;口唇ヘルペスの発症経験(複数回)あり。普段は薬を使用せず(自然に治癒するのを待つ)、2~3週後には目立たない程度に回復する。
<結果・考察>
 観察結果を図14(患者1)と図15(患者2)に示す。患者1では塗布3日目には明らかな改善を認め、塗布5日目には完治に近い状態になった(図14)。また、患者2の場合、塗布2日目から治療効果が認められ、塗布8日目にはほぼ完治した。このように、口唇ヘルペスに対してMGDG調製物は優れた治療効果を発揮した。特筆すべきは、市販薬を凌駕するともいえる驚くべき治療効果が示されたこと(患者1)である。
10.MGDG調製物中の成分の同定1
 HPLC分析により、コッコミクサ sp. KJ株MGDG調製物には5種類のMGDG(MGDG1、MGDG2、MGDG3、MGDG4、MGDG5と呼称する)が含まれていると推定された。これらのMGDGの構造を明らかにすべく、ガスクロマトグラフィー(GC/FID)を利用して脂肪酸組成を分析した。分析にはBPX90カラム(長さ100m×内径0.25mm、膜厚0.25μm)を使用し、水素をキャリアガスとした。同定用標準試料にはFAME Standard(F.A.M.E. Mix, C4-C24, SUPELCO社製)とMGDG(MGDG plant, Avanti社製)を用いた。
 各サンプル(MGDG1、MGDG2、MGDG3、MGDG4、MGDG5)のクロマトグラムを図16~20に示す。ここで、C6:0については、一般的な脂質の脂肪酸組成は近接した炭素数(偶数)の脂肪酸も合わせて含まれていることが通常であるところ、今回の分析ではそれらがほとんど検出されなかったため、同ピークは脂肪酸ではない可能性が高いと考えられた。また、Unknown1とUnknown2は、これらのピークの保持時間に検出される脂肪酸は一般的な脂質では想定し難いため、脂肪酸以外の成分である可能性が高いと考えられた。一方、保持時間から、Unknown3及びUnknown4はそれぞれC16:2及びC18:2(n-6以外)と推定された。
 分析の結果を以下の表3、表4に示す。表3は、各サンプルの脂肪酸組成比を面積百分率法で示したものである。表4はC6:0と不明成分1、2(Unknown1, 2)を除外して算出した結果をまとめたものである。尚、MGDG3については、二つの成分の面積比が3:1と極端に偏っている。これは、脂肪酸残基の組み合わせが、(C18:2(n-6以外)とC18:2(n-6以外))と(C18:2(n-6以外)とC18:3 n3)である2種のMGDGがおよそ1:1の割合で混合していると解釈できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
「-」は不検出を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
「-」は不検出を表す。
 以上の通り、MGDG調製物には、(1)構成脂肪酸がC16:3とC18:3(n-3)のモノガラクトシルジアシルグリセロール(MGDG1)、(2)構成脂肪酸がC16:2とC18:2のモノガラクトシルジアシルグリセロール(MGDG2)、(3)構成脂肪酸がC18:2とC18:3(n-3)のモノガラクトシルジアシルグリセロール(MGDG3)、(4)構成脂肪酸がC18:2とC18:2のモノガラクトシルジアシルグリセロール(MGDG3)、(5)構成脂肪酸がC16:2とC18:2(n-6)のモノガラクトシルジアシルグリセロール(MGDG4)、及び(6)構成脂肪酸がC18:2(n-6)とC18:3(n-3)のモノガラクトシルジアシルグリセロール(MGDG5)が含有されていることが明らかとなった。
11.MGDG調製物中の成分の同定2
 トリプル四重極LC/MSシステムを用い、コッコミクサ sp. KJ株MGDG調製物に含まれるMGDGの構造を更に詳細に調べた。
<解析条件>
 装置名:トリプル四重極LC/MSシステム
 LCカラム:YMC Triant C-18(長さ100mm×内径2.1mm、粒子径1.9μm)
 移動相:メタノール、アセトニトリル、水、酢酸アンモニウム
 イオン源:ESI
 測定モード:MS2 scan、Product ion scan
<結果>
 分取液体クロマトグラフィー(PLC)で検出した5種のMGDGに加え(10.MGDG調製物中の成分の同定1の欄を参照))、トリプル四重極LC/MS解析により、新たに6個目のMGDGを検出した。これらのMGDG(6個のピーク)について、MS scanとProduct ion scanの結果から、各MGDG(ピーク1:MGDG1、ピーク2:MGDG2、ピーク3:MGDG3、ピーク4:MGDG4、ピーク5:MGDG5、ピーク6:MGDG6)を構成する2つの脂肪酸側鎖を同定することができた。各MGDGの脂肪酸側鎖を以下の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
12.各MGDG画分の殺ウイルス活性
 MGDG調製物を構成する各MGDG(MGDG1~MGDG5)の殺ウイルス活性を比較した。
<方法>
(1)コッコミクサ sp. KJ株由来のMGDG調製物をHPLCに供し、各ピークを分取することで5種のMGDG精製物(MGDG1、MGDG2、MGDG3、MGDG4、MGDG5)を得た。また、分取前のMGDG調製物(MGDG1~MGDG5を含有する)をMix品として準備した。
(2)各ウイルス液(2×105 PFU/ml)に対し、終濃度50μg/mlとなるように各サンプルを混合し、37℃にて60分間静置した。使用したウイルス及び宿主細胞を表6に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
(3)(2)の混合液をウシ胎児血清不含MEM培地で希釈後、プラークアッセイ用培地を重層し、37℃で2~3日間培養した。
(4)プラークの出現を確認後、ニュートラルレッド液で細胞を固定・染色し、顕微鏡下でプラーク数を測定した。サンプルを添加しなかった場合のウイルスの出現数を基準(100%)とし、各サンプルのウイルス残存率を算出した。ウイルス残存率から各サンプルの殺ウイルス性能を評価した。
<結果・考察>
 標的のウイルスによって活性の違いはあるものの、MGDG調製物(Mix品)及びMGDG1~MGDG5の全てについて殺ウイルス(不活化)活性が認められた(図21)。インフルエンザウイルスと単純ヘルペスウイルス2型に対して、MGDG5はMGDG調製物(Mix品)と比較した有意な不活化効果を示した。エンベロープを持たないネコカリシウイルス及びポリオウイルスでは他のサンプルよりも有意に高い活性を示すものはなかった。以上の結果は、MGDG調製物及びそれを構成する各MGDGに殺ウイルス活性があることを裏付けるとともに、MGDG5がインフルエンザウイルスや単純ヘルペスウイルス2型等、エンベロープを持つウイルスに対して特に高い殺ウイルス活性を発揮することを示す。
13.各種MGDG調製物の成分比較
 コッコミクサ sp. KJ株MGDG調製物、クロレラ・ブルガリスMGDG調製物、ナンノクロロプシス・オキュラータMGDG調製物、アルスロスピラ・プラテンシス(スピルリナ)MGDG調製物、ユーグレナ・グラシリスMGDG調製物及びホウレンソウMGDG調製物を逆相HPLCで分析し、含有成分(MGDG)を比較した。
<HPLC分析条件>
 装置名:Alliance2695
 カラム:YMC-Actus Triart C18
 移動相:メタノール、水、アセトニトリル混合溶液
 検出波長:205nm
 HPLCの測定結果(クロマトグラム)を図22及び図23に示す。クロマトグラムの縦軸は、各サンプルにおけるピーク最大値が1となるように規格化している。
 ・KJ株のMGDG調製物には、少なくとも5本のピークが検出された。一方、KJ株以外の各生物のMGDG調製物にも、KJ株のMGDG調製物と保持時間が一致するか、または非常に近いピークが少なくとも1本検出された。保持時間が一致するピークについてはKJ株由来のMGDGと同じ化学構造を有すると推定される。
 ・KJ株MGDG調製物由来の5本のピークにはHSV-2、IFV及びFCVに対する殺ウイルス活性が認められている(12.の実験、図21)。上記の通り、KJ株以外の各生物のMGDG調製物には、KJ株MGDG調製物由来の5本のピークに対応するピークが少なくとも1本認められるため、同様に殺ウイルス活性を有すると推察される。即ち、これらのMGDG調製物にもKJ株MGDG調製物と同様の効果を期待できる。尚、KJ株MGDG調製物の5番目のピークはHSV-2、IFVに対し、高い殺ウイルス活性を持つことがわかっている(図21)。
 本発明の殺ウイルス剤は、ウイルス粒子の破壊による不可逆的不活化作用を期待できるものであり、特定のウイルスだけでなく、複数のウイルスに対して殺傷作用を示す。本発明の殺ウイルス剤には、広範な用途(例えばノロウイルス、単純ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス等の感染症の予防や治療)への利用が期待される。一方、本発明の殺ウイルス剤には、その有効成分が単細胞藻類(好ましくは微細藻類)由来の物質であるが故に高い安全性も期待できる。
 この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。

Claims (16)

  1.  単細胞藻類のモノガラクトシルジアシルグリセロール含有抽出物を有効成分として含む殺ウイルス剤。
  2.  前記単細胞藻類がコッコミクサ属、クロレラ属、ナンノクロロプシス属、アルスロスピラ属又はミドリムシ属に属する微細藻類である、請求項1に記載の殺ウイルス剤。
  3.  前記単細胞藻類がコッコミクサ属に属する微細藻類である、請求項1に記載の殺ウイルス剤。
  4.  前記微細藻類がコッコミクサ sp. KJ株又はその変異株である、請求項3に記載の殺ウイルス剤。
  5.  主成分がモノガラクトシルジアシルグリセロールである、請求項1~4のいずれか一項に記載の殺ウイルス剤。
  6.  前記モノガラクトシルジアシルグリセロールが、以下の(1)~(6)からなる群より選択される、一以上のモノガラクトシルジアシルグリセロールである、請求項5に記載の記載の殺ウイルス剤:
     (1)構成脂肪酸がC16:3とC18:3のモノガラクトシルジアシルグリセロール;
     (2)構成脂肪酸がC16:2とC18:3のモノガラクトシルジアシルグリセロール;
     (3)構成脂肪酸がC18:3とC18:3のモノガラクトシルジアシルグリセロール;
     (4)構成脂肪酸がC16:2とC18:2のモノガラクトシルジアシルグリセロール;
     (5)構成脂肪酸がC18:3とC18:2のモノガラクトシルジアシルグリセロール;及び
     (6)構成脂肪酸がC16:1とC18:2のモノガラクトシルジアシルグリセロール。
  7.  前記有効成分が、前記単細胞藻類のエタノール抽出物をクロマトグラフィー精製し、モノガラクトシルジアシルグリセロールの含有量を高めたものである、請求項1~6のいずれか一項に記載の殺ウイルス剤。
  8.  前記有効成分中のモノガラクトシルジアシルグリセロール含有量が70%(w/v)~99%(w/v)である、請求項1~7のいずれか一項に記載の殺ウイルス剤。
  9.  以下の(1)~(6)からなる群より選択される、一以上のモノガラクトシルジアシルグリセロールが有効成分の殺ウイルス剤:
     (1)構成脂肪酸がC16:3とC18:3のモノガラクトシルジアシルグリセロール;
     (2)構成脂肪酸がC16:2とC18:3のモノガラクトシルジアシルグリセロール;
     (3)構成脂肪酸がC18:3とC18:3のモノガラクトシルジアシルグリセロール;
     (4)構成脂肪酸がC16:2とC18:2のモノガラクトシルジアシルグリセロール;
     (5)構成脂肪酸がC18:3とC18:2のモノガラクトシルジアシルグリセロール;及び
     (6)構成脂肪酸がC16:1とC18:2のモノガラクトシルジアシルグリセロール。
  10.  標的のウイルスが、エンベロープを持つウイルスである、ヘルペスウイルス又はインフルエンザウイルスである、請求項1~9のいずれか一項に記載の殺ウイルス剤。
  11.  標的のウイルスが、エンベロープを持たないウイルスである、ノロウイルス又はネコカリシウイルスである、請求項1~9のいずれか一項に記載の殺ウイルス剤。
  12.  不可逆的不活化作用により殺ウイルス活性を示す、請求項1~11のいずれか一項に記載の殺ウイルス剤。
  13.  請求項1~12のいずれか一項に記載の殺ウイルス剤を含む組成物。
  14.  ウイルス感染症に対する医薬である、請求項13に記載の組成物。
  15.  消毒剤又は殺菌洗浄剤である、請求項13に記載の組成物。
  16.  食品又は餌である、請求項13に記載の組成物。
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