KR102345933B1 - 느릅나무속 식물 유래 카테킨 배당체 고함량 추출물을 유효성분으로 포함하는 항바이러스용 조성물 - Google Patents

느릅나무속 식물 유래 카테킨 배당체 고함량 추출물을 유효성분으로 포함하는 항바이러스용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 느릅나무속 식물 유래 카테킨 배당체 고함량 추출물을 유효성분으로 포함하는 항바이러스용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 느릅나무속 식물 초임계 추출박의 추출물을 포함하는 조성물은 카테킨 배당체를 높은 수준으로 포함하며, 안전하면서도 효과적인 항바이러스 활성을 기반으로 면역증진 및 바이러스 감염질환의 예방, 개선 또는 치료를 위해 관련 의약품, 건강기능식품, 동물 사료 및 의약외품 등의 다양한 용도로 활용될 수 있을 것이다.

Description

느릅나무속 식물 유래 카테킨 배당체 고함량 추출물을 유효성분으로 포함하는 항바이러스용 조성물{Antiviral composition containing extract of high content of catechin glycoside derived from Ulmus species as an active ingredient}
본 발명은 느릅나무속 식물 유래 카테킨 배당체 고함량 추출물을 유효성분으로 포함하는 항바이러스용 조성물에 관한 것이다.
바이러스(virus)는 라틴어로 독성 물질을 의미하며, 세균여과지(0.22㎛)를 통과하는 일군의 감염형 병원성 입자이다. 바이러스는 숙주세포의 종류에 따라 박테리오파지, 식물 바이러스, 동물 바이러스로 분류하기도 하며, 핵산의 종류에 따라 DNA 바이러스, RNA 바이러스로 분류할 수 있다. 바이러스는 살아있는 세포 즉, 감염된 숙주세포 내에서만 자가복제를 통해 증식할 수 있으며, 감기, 편도염, 설사, 구토와 같이 흔하고 경미한 질환에서부터 공수병, 인간면역결핍 바이러스 감염 및 후천성 면역결핍 증후군 같은 치명적인 질환까지 매우 다양한 질병을 유발한다. 대표적으로 인플루엔자 바이러스(Influenza virus)는 오한, 발열, 근육통, 기침을 동반하는 급성 호흡기 질환을 유발하며, 이로 인해 전 세계적으로 매년 25~50만 명이 사망한다고 보고되고 있다. 더욱이 인플루엔자 바이러스는 RNA 바이러스로서 항원 변이가 상대적으로 쉽기 때문에 대유행 대책을 세워도 집단 내에서의 반복적인 재감염이 가능하여 사회적인 우려와 파장이 줄어들지 않고 있다. 또한, 2019년 12월 중국 우한에서 최초로 발생한 코로나바이러스 SARS-CoV-2 감염에 의해 유발되는 코로나19 감염증(COVID-19)은 현재에도 전 세계적인 팬데믹(Pandemic) 상황이며, 바이러스 감염증으로 인한 확진자 및 사망자의 발생과 감염 우려에서 비롯한 인적 및 물적 활동의 통제가 국가/세계 경제에 큰 타격을 입히고 있다. 이외에도 조류독감 및 구제역 등 다양한 바이러스 질병이 과거부터 현재까지 사회경제적으로 큰 문제를 일으켜오고 있는바, 바이러스 증식을 억제하고 감염에 의한 질병을 예방 및 치료할 수 있는 효과적인 대책이 필요한 상황이다.
현재 바이러스성 질병을 예방하기 위한 가장 좋은 방법은 백신 접종이다. 그러나 바이러스에 의한 질병의 경우, 대체로 많은 바이러스 혈청형(아형) 생성 등에 따른 백신의 효율성 문제가 중요하게 제기되고 있다. 따라서 이러한 백신의 문제점을 보완하고, 예방되지 못한 바이러스 감염질환 치료를 위한 효과적인 치료제의 개발 및 보급이 중요하다.
이러한 바이러스 감염질환을 치료하는 약물인 항바이러스제는 특정한 바이러스 감염에 의한 질환을 치료하는 약물로서, 독감, 헤르페스바이러스 감염질환, B형간염, C형간염, 에이즈 등에 대하여 개발되어 있다. 그러나 내성 바이러스의 출현, 약제 부작용, 높은 생산비용 등의 문제점을 극복하기 위해 지속적인 개발이 요구되고 있다. 예컨대, 현재 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 바람직한 치료법으로써 뉴라미니다아제(neuraminidase) 억제제인 오셀타미비르(oseltamivir)와 자나미비르(zanamivir)가 이용되고 있으나, 오셀타미비르는 심각한 구토증세가 나타나는 부작용이 있다고 보고된바 있다. 또한 자나미비르는 항바이러스 효과는 높지만 생체 이용률이 낮고 신장에서의 배출이 빠르다는 단점이 있으며, 내성 바이러스 균주의 출현으로 인해 한계가 있다는 단점이 있다.
따라서 이와 같은 상기 항바이러스제의 문제점을 해결하기 위한 하나의 시도로써 이미 국내를 비롯하여 아시아 및 유럽을 중심으로 약용식물을 기반으로 하는 항바이러스 물질의 발굴 및 개발에 대한 연구가 꾸준히 이루어져 왔으나, 아직까지 큰 성과는 없는 실정이다.
한편, 느릅나무속(Ulmus)은 장미목 느릅나무과에 속하며 낙엽성이거나 반낙엽성 나무로, 시베리아에서 인도네시아, 멕시코, 일본에 이르는 북반구에서 볼 수 있다. 느릅나무속에는 약 30~40종의 나무가 포함되며, 우리나라에는 느릅나무, 혹느릅나무, 당느릅나무, 참느릅나무, 비술나무, 난티나무 및 왕느릅나무 7종이 서식한다. 느릅나무는 나무 및 뿌리 껍질, 잎, 꽃, 열매 및 종자를 모두 약용하며, 대표적으로 참느릅나무, 느릅나무, 왕느릅나무의 줄기 및 뿌리 껍질인 유백피 및 유근피는 이뇨작용, 항염증, 불면증 해소, 변비예방, 소화촉진, 항산화 효과 등이 알려져 있다.
그러나 아직까지 느릅나무속 식물 추출물 및 이의 유효물질의 항바이러스 활성에 대하여 구체적으로 보고된 바는 없는 상태이다.
한국공개특허 제10-2016-0112825호
상기와 같은 배경하에, 본 발명자들은 안전하면서도 바이러스 감염에 대한 우수한 저해 활성을 나타내는 물질을 찾기 위해 연구 노력한 결과, 느릅나무속 식물로부터 카테킨 배당체를 높은 수준으로 함유하는 추출물을 제조 및 수득하였으며, 상기 추출물이 독성이 없고 우수한 항바이러스 활성을 나타냄을 구체적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 느릅나무속 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 항바이러스용 약학적 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 느릅나무속 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 항바이러스용 식품 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 느릅나무속 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 항바이러스용 사료 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 느릅나무속 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 항바이러스용 의약외품 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 느릅나무속 식물 추출물을 이용하여 동물의 항바이러스 활성을 증진시키는 방법을 제공하기 위한 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 이 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 느릅나무속 식물 초임계 추출박의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 항바이러스용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 느릅나무속 식물 초임계 추출박의 추출물은 (a) 느릅나무속 식물을 초임계 추출하여 초임계 추출박을 얻는 단계; 및 (b) 상기 얻어진 느릅나무속 식물 초임계 추출박에 대해 추출물을 얻는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.
단계 (a): 느릅나무속 식물을 초임계 추출하여 초임계 추출박을 얻는 단계
상기 단계 (a)는 본 발명의 느릅나무속 식물 초임계 추출박의 추출물을 제조하기 위해, 먼저 느릅나무속 식물의 초임계 추출박을 제조하는 단계이다.
본 발명에서, 느릅나무속 식물의 초임계 추출박(supercritical extract residue)은 느릅나무속 식물을 초임계 추출방법에 의해 추출하고 남은 잔여물(residue)을 의미한다.
본 발명의 초임계 추출박 제조에 사용되는 느릅나무속(Ulmus) 식물은 장미목 느릅나무과의 식물을 포함하며, 예를 들어 당느릅나무(Ulmus davidiana), 느릅나무(Ulmus davidiana var. japonica), 혹느릅나무(Ulmus davidiana var. japonica for. Suberosa), 참느릅나무(Ulmus parvifolia), 비술나무(Ulmus pumila), 난티나무(Ulmus laciniata) 및 왕느릅나무(Ulmus macrocarpa) 등을 포함한다. 바람직하게는 느릅나무(Ulmus davidiana var. japonica), 왕느릅나무(Ulmus macrocarpa) 및 당느릅나무(Ulmus davidiana)를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 느릅나무속 식물은 느릅나무속 식물의 전체; 또는 가지, 줄기, 뿌리, 잎, 꽃, 열매 및 씨앗으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 느릅나무속 식물의 일부를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 느릅나무속 식물의 가지, 줄기 또는 뿌리를 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 초임계 추출 공정 전에 느릅나무속 식물의 전체 또는 일부를 건조 및/또는 분쇄하여 사용할 수 있다.
본 발명에서, 초임계 추출(supercritical extraction) 방법은 초임계 상태의 유체를 사용하여 천연물에 함유된 향, 색소, 유지류 또는 기능성 물질을 변성 없이 추출하는 방법을 의미한다.
상기 초임계 상태의 유체는 임계점(supercritical point)의 일정한 고온 고압의 한계점을 넘어 기체와 액체의 구별이 되지 않는 상태의 유체를 의미한다. 상기 초임계 유체는 초임계 이산화탄소(supercritical carbon dioxide)를 예로 들 수 있다. 상기 초임계 이산화탄소는 임계온도(31℃) 및 임계압력(7.5MPa)을 초과한 상태의 이산화탄소로서 기체와 액체의 성질을 동시에 가진 유체이다.
본 발명에서의 초임계 추출법은 예를 들어 초임계 유체와 용질의 혼합물을 추출온도와 같은 온도에서 감압하여 팽창시켜 초임계 유체의 용해력이 감소되면서 용질이 분리되는 압력변화법 방식; 또는 초임계 유체의 온도를 높여서 용해력을 감소시킴으로서 초임계 유체와 용질을 분리하는 온도 변화법 방식으로 행해질 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 상기 초임계 유체와 함께 보조용매를 사용할 수 있으며, 보조용매는 이 기술분야에서 통상적으로 이용되는 극성 용매를 포함하며, 바람직하게는 알코올, 물, 에틸렌 글라이콜, 폴리에틸렌글라이콜, 프로필렌카보네이트, 포름산, 아세트산, 아세토니트릴, 클로로디플루오로메탄 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 초임계 추출용 용기는 온도와 압력이 조절될 수 있으며, 추출원료와 초임계 유체가 접촉하도록 구성된 용기이면 특별히 한정되지 않는다.
본 발명에서 초임계 추출에서의 압력은 100-600 bar 범위일 수 있고, 초임계 추출에서의 온도는 10-100℃ 범위일 수 있으며, 초임계 추출에서의 초임계 유체 및 보조용매의 유속은 10-100g/분일 수 있다. 당업계의 통상의 기술자는 초임계 추출에서 압력, 온도, 유체 및 보조용매의 유속을 상기 범위 내에서 적절하게 조절하여 사용할 수 있다.
상기와 같이 느릅나무속 식물을 초임계 추출한 뒤 발생하는 진여물인 초임계 추출박을 수집하고, 수집된 초임계 추출박을 다음의 용매 추출의 원료로 사용한다.
단계 (b): 상기 얻어진 느릅나무속 식물의 초임계 추출박의 추출물을 얻는 단계
상기 단계 (b)는 상기 수집된 느릅나무속 식물의 초임계 추출박에 대해 용매 추출 방법을 통해 느릅나무속 식물 초임계 추출박의 추출물을 얻는 단계이다.
본 명세서에서 느릅나무속 식물 초임계 추출박의 추출물을 언급하면서 사용되는 용어 “추출물”은 느릅나무속 식물 초임계 추출박에 추출 용매를 처리하여 얻은 추출 결과물뿐만 아니라, 느릅나무속 식물 초임계 추출박의 추출물 자체를 개체(subject)에 투여할 수 있도록 제형화(예컨대, 분말화)된 추출물의 가공물도 포함하는 의미를 갖는다.
본 발명의 느릅나무속 식물 초임계 추출박의 추출물은 천연물로부터 추출물을 추출하는 이 기술분야에 공지된 통상적인 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도, 압력의 조건하에서 통상적인 용매를 사용하여 분리할 수 있다.
느릅나무속 식물의 초임계 추출박에 대해 추출용매를 처리하여 추출물을 얻는 경우에는, 다양한 추출용매가 이용될 수 있다. 구체적으로는, 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용할 수 있다. 극성 용매로서 적합한 것은, (i) 물, (ⅱ) 알코올 (예를 들어, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜), (ⅲ) 아세트산, (ⅳ) DMF (dimethylformamide) 및 (v) DMSO (dimethyl sulfoxide)를 포함한다. 비극성 용매로서 적합한 것은, 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸아세테이트, 메틸아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF (tetrahydrofuran)를 포함한다.
보다 구체적으로, 본 발명에서 이용되는 추출용매는 (a) 물, (b) 알코올, (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 부틸아세테이트, (h) 1,3-부틸렌글리콜, (i) 헥산 및 (j) 디에틸에테르를 포함한다.
일 구현예에 따르면, 상기 알코올은 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올 등)일 수 있으며, 바람직하게는 에탄올일 수 있다.
다른 구현예에 따르면, 상기 에탄올은 구체적으로 10~90% 에탄올일 수 있고, 바람직하게는 20~80%, 더욱 바람직하게는 30~80%, 40~70%, 50~70%, 55~65%일 수 있으며, 가장 바람직하게는 60% 에탄올일 수 있다.
또 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 추출물은 상기 용매 추출물에 대해 다시 용매를 사용하여 추가 분획하여 얻은 분획물도 포함할 수 있다.
바람직하게는 상기 용매 추출은 느릅나무속 식물의 초임계 추출박을 추출용매와 접촉시키는 공정을 통해 수행된다. 구체적으로 추출용매를 이용해 추출물을 추출하는 방법은 상온 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 추출, 마이크로웨이브 추출 및 초음파 추출로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 방법을 당업자가 적절히 선택하여 이용할 수 있다.
본 발명에서 용매추출 공정은 추출물 제조 이후 여과하거나 농축 또는 건조과정을 통해 추출 용매를 부분적으로 또는 완전히 제거할 수 있다. 부분적 제거는 상당한 양의 유기용매가 없는 수성 농축물이 얻어질 때까지 농축하는 것을 의미하며, 완전한 제거에 의해서는 건조 잔류물을 얻을 수 있다. 예컨대, 여과는 여과지를 이용하거나 감압여과기를 이용할 수 있으며, 농축은 감압 농축기, 건조는 동결건조법 등을 수행할 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 “추출물”은 상술한 바와 같이 이 기술분야에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 상기 조추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함하는 의미이다. 상기 용매에 의한 분획은 상기 용매를 사용한 추가적인 추출 공정을 통해 수행될 수 있다.
본 발명에서 느릅나무속 식물 초임계 추출박의 추출물은 하기 화학식 1로 표시되는 카테킨 배당체, 7-O-β-D-아피오푸란노사이드(catechin 7-O-β-D-apiofuranoside)를 포함한다.
[화학식 1]
Figure 112021065438430-pat00001
본 발명에서 느릅나무속 식물 초임계 추출박의 추출물은 카테킨 7-O-β-D-아피오푸란노사이드를 30 - 200㎍/㎖의 함량으로 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로 40 - 200㎍/㎖, 50 - 190㎍/㎖, 60 - 190㎍/㎖, 60 - 180㎍/㎖, 70 - 180㎍/㎖, 80 - 180㎍/㎖, 80 - 170㎍/㎖, 90 - 170㎍/㎖, 90 - 160㎍/㎖, 100 - 160㎍/㎖, 100 - 150㎍/㎖, 또는 100 - 140㎍/㎖의 함량으로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어 “유효성분으로 포함하는”이란, 본 발명의 추출물이 항바이러스 효능을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 용어 “항바이러스(antiviral) 활성”이란, 바이러스 입자 생성을 억제하는 능력, 즉 숙주세포에서 바이러스의 형성 및/또는 복제를 효과적으로 억제하여 바이러스의 활성을 저해하는 능력을 의미한다.
본 발명에 따른 느릅나무속 식물 초임계 추출박의 추출물이 항바이러스 활성을 나타내는 바이러스는 코로나바이러스과(Coronaviridae) 또는 오르토믹소바이러스과(Orthomyxoviridae)에 속하는 것일 수 있고, 바람직하게는 돼지 전염성 설사 바이러스(PEDV, porcine epidemic diarrhea virus), 돼지 전염성 위장염 바이러스(TGEV, porcine transmissible gastroenteritis virus), 돼지 호흡기질환 코로나바이러스(PRCV, porcine respiratory coronavirus), 인간 호흡기질환 코로나바이러스(Human respiratory coronavirus) 및 인플루엔자 바이러스(Influenza viruses)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서의 구체적인 일 실시예에서는, 본 발명에 따른 조성물에 포함된 느릅나무속 식물 초임계 추출박의 추출물이 각각 Vero 세포에서 코로나 계열의 바이러스인 돼지 전염성 설사바이러스(PEDV), Huh7 세포에서 인간 코로나바이러스 229E형, A549 세포에서 인플루엔자 A/PR8/34(H1N1)형의 바이러스 활성을 저해함으로써, 돼지 및 인간에서 감염을 유발하는 코로나바이러스 및 인플루엔자 바이러스에 의한 질병의 예방, 치료, 개선 효과가 있는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 추출물은 바이러스 감염에 대한 항바이러스 제제 용도로 사용될 수 있다.
본 발명의 항바이러스용 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물에서 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육내 주입, 복강내 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-10,000㎎/㎏이다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 상기 약학적 조성물의 제제 형태는 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 피부외용제 또는 캅셀제 등일 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 조성물이 피부외용제인 경우, 상기 피부외용제로 사용되는 적합한 제형으로는 예를 들면, 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고 또는 스프레이의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.
본 발명의 항바이러스용 약학적 조성물은 박테리아 감염성 질병 또는 바이러스 감염성 질병의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다. 본 발명의 항바이러스용 약학적 조성물은 유효성분으로 느릅나무속 식물 추출물 외에 다른 약학적 활성 성분을 함께 포함하거나, 또는 다른 유효성분을 포함하는 약학적 조성물과 혼합되어 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항바이러스용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 박테리아 감염성 질병 또는 바이러스 감염성 질병의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항바이러스용 약학적 조성물의 박테리아 감염성 질병 또는 바이러스 감염성 질병의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 느릅나무속 식물 초임계 추출박의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항바이러스용 식품 또는 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 느릅나무속 식물 초임계 추출박의 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 식품 또는 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 식품 또는 건강기능식품 조성물은 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 더 포함할 수 있다. 본 발명에 이용될 수 있는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제는 포도당, 과당, 말토오스, 수크로스, 덱스트린, 시클로덱스트린과 같은 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올과 같은 천연 탄수화물, 타우마틴, 스테비아 추출물 등의 천연 향미제, 사카린, 아스파르탐산 등의 합성 향미제, 착색제, 펙트산 또는 그의 염, 알긴산 또는 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산화제 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 식품 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 캔디, 츄잉검, 젤리 및 음료로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태일 수 있다. 상기 식품 조성물 중의 느릅나무속 식물 추출물의 함량은 식품의 형태, 풍미, 맛 등을 고려하여 적절하게 선택될 수 있으며, 예를 들어 식품 전체중량에 대하여 0.01~30중량%의 범위일 수 있다. 본 발명에 따른 식품 조성물의 형태, 조성 및 제조방법 등은 기술분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있음이 통상의 기술자에게 명백하다.
상기 본 발명의 항바이러스용 식품 조성물 또는 면역증강용 식품 조성물은 앞서 언급한 화학식 1로 표시되는 카테킨 배당체, 7-O-β-D-아피오푸란노사이드(catechin 7-O-β-D-apiofuranoside)를 포함한다.
이에 대한 구체적인 설명은 앞서 언급한 내용과 동일하므로 생략한다.
또한, 본 발명은 느릅나무속 식물 초임계 추출박의 추출물을 포함하는 항바이러스용 사료 조성물을 제공한다.
상기 항바이러스용 사료 조성물 중의 느릅나무속 식물 초임계 추출박의 추출물의 함량은 급여 가축의 종, 주령, 체중, 및 사육 조건 등에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 사료 조성물 전체 중량에 대하여 0.01~95중량%, 바람직하게는 0.1~80중량%의 비율일 수 있다. 본 발명의 항바이러스용 사료 조성물은 기술분야에 공지된 사료 제조방법에 따라 제조될 수 있으며, 예를 들어, 각종 사료 원료 또는 배합사료와 본 발명의 느릅나무속 식물의 초임계 추출박의 추출물을 혼합한 후, 추가적인 가공 공정, 예를 들어 펠렛 형태로의 성형 또는 과립 등의 형태로의 절단 단계 등을 더 수행함으로써 제조될 수 있다. 본 발명의 항바이러스용 사료 조성물의 구성성분, 조성, 제조방법, 급여방법 등은 기술분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있음이 통상의 기술자에게 명백하다.
또한, 본 발명은 느릅나무속 식물 초임계 추출박의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 항바이러스용 의약외품 조성물을 제공한다.
상기 “의약외품”이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 아니하며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품 등을 의미하며, 예컨대 여기에는 소독제, 살균 세정제, 및 개인위생용품 등이 포함된다.
본 발명에 있어서, 의약외품 조성물은 소독제, 세정제 등의 용도로 이용될 수 있다. 상기 소독제는 본 발명의 느릅나무속 식물 초임계 추출박의 추출물을 그대로 사용하거나 적합한 농도가 되도록 피부학적 및 약리학적으로 허용되는 희석제 또는 용매로 희석하여 제조할 수 있다. 상기 소독제는 생물체의 표면, 바람직하게는 포유동물의 피부, 가장 바람직하게는 인간의 피부에 사용될 수 있다. 예를 들면, 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태로 제조되어 사용될 수 있다. 또한, 상기 소독제는 무생물체의 표면, 예를 들면 나무, 금속, 유리, 세라믹, 플라스틱, 종이 및 천의 표면에 사용될 수 있다. 상기 소독제는 침지, 면봉, 분무 및 브러싱을 포함하는 방법을 사용하여 상기 생물체 또는 무생물체의 표면에 처리할 수 있다. 바람직하게는, 상기 소독제는 상처표면, 수술 전 피부소독, 수술기구의 소독, 도관 소독 등의 용도로 병원과 일반 가정에서 사용할 수 있다. 상기 살균 세정제의 경우에는 본 발명에 따른 느릅나무속 식물 초임계 추출박의 추출물 외에 세정제의 제조 분야에서 일반적으로 사용되는 하나 이상의 부형제 및 첨가제를 포함하여 당 분야의 공지의 방법에 따라 용이하게 제조될 수 있다. 상기 세정제는 주방용 또는 식품용으로 사용될 수 있으며, 주방용 세정제에는 가공된 시트라콘산 무수물 외에 음이온계 계면활성제, 비이온계 계면활성제, 양쪽성 계면활성제 등을 추가로 포함할 수 있다. 식품용 세정제의 경우에는 본 발명에 따른 느릅나무속 식물 초임계 추출박의 추출물에 식품학적으로 허용되는 용매 또는 희석제를 추가로 첨가하여 적절한 농도로 희석함으로써 제조할 수 있으며, 예를 들면, 과일류, 어류 및 육류 등의 살균 및 세척에 사용될 수 있다. 또한, 상기 의약외품 조성물은 개인위생용품일 수 있으며, 예를 들면, 비누, 화장품, 물티슈, 샴푸, 피부 크림, 얼굴 크림, 치약, 또는 세정 겔 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 인간을 제외한 선천면역 증진이 필요한 동물에 느릅나무속 식물 초임계 추출박의 추출물을 투여하는 것을 특징으로 하는 동물의 항바이러스 활성의 증진 방법을 제공한다.
본 발명의 동물의 항바이러스 활성 증진에 있어서, 느릅나무속 식물 초임계 추출박의 추출물의 투여량, 투여 경로, 투여 시기 등은 기술분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있음이 통상의 기술자에게 명백하다.
본 발명의 느릅나무속 식물 초임계 추출박의 추출물은 카테킨 배당체를 고함량으로 포함하며, 세포에서 독성을 유발하지 않으면서 바이러스 활성 저해 효과가 우수함을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 느릅나무속 식물 초임계 추출박의 추출물을 포함하는 조성물은 안전하면서도 효과적인 항바이러스 활성을 기반으로 면역증진 및 바이러스 감염질환의 예방, 개선 또는 치료를 위해 관련 의약품, 건강기능식품, 동물 사료 및 의약외품 등의 다양한 용도로 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예인 느릅나무 가지 초임계 추출박에 대한 에탄올 추출물(USCFR)을 추출하는 과정을 보여주는 모식도이다.
도 2a는 표준물질인 카테킨 7-O-β-D-아피오푸란노사이드의 HPLC 분석결과이다.
도 2b는 느릅나무 가지 초임계 추출박에 대한 에탄올 추출물 내에서 카테킨 7-O-β-D-아피오푸란노사이드를 HPLC 정량분석한 결과이다.
도 3a는 느릅나무 카테킨 배당체 고함량 추출물의 실험 사용농도 0.4-100/ml에서 Vero 세포에 대한 세포 독성을 실험한 결과이다.
도 3b는 느릅나무 카테킨 배당체 고함량 추출물의 실험 사용농도 0.4-50/ml에서 Huh7 세포에 대한 세포 독성을 실험한 결과이다.
도 3c는 느릅나무 카테킨 배당체 고함량 추출물의 실험 사용농도 0.4-50/ml 또는 오셀타미비르(Osel, Oseltamivir) 0.4-50uM에서 A549 세포에 대한 세포 독성을 실험한 결과이다.
도 4는 코로나바이러스 계열인 돼지 전염성 설사 바이러스(PEDV, Porcine epidemic diarrhea virus)에 대한 느릅나무 카테킨 배당체 고함량 추출물의 항바이러스 활성을 실험한 결과이다.
도 5는 코로나바이러스 229E형에 대한 느릅나무 카테킨 배당체 고함량 추출물의 항바이러스 활성을 실험한 결과이다.
도 6은 인플루엔자 A/PR8/34(H1N1)형에 대한 느릅나무 카테킨 배당체 고함량 추출물의 항바이러스 활성을 실험한 결과이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
[실시예]
실시예 1. 실험 방법
(1) 느릅나무 초임계 추출박의 알코올 추출물 제조
느릅나무(Ulmus davidiana) 가지를 서울약령시장에서 구입하여 이물질을 제거하고 세척한 후, 음건하여 실험재료로 사용하였다. 느릅나무 가지의 초임계 추출은 초임계유체 추출 생산용 장비(SCFE-P400, Ilsin Autoclave, Daejeon, Korea)를 사용하여 실시하였다. 건조된 시료 100kg을 200 메쉬(mesh)의 분쇄망을 통과하도록 분쇄하고, 추출조의 온도를 50℃로 조절하여 온도를 유지시켰다. 온도가 안정화되면 분쇄된 느릅나무 가지 시료를 넣고 CO2 가스를 등압으로 유지시킨 다음, 고압펌프를 이용하여 라인(line)을 통해 실험압력 조건인 400 bar에 도달할 때까지 컨트롤 밸브(Control valve)를 조절하여 주입하였다. 설정 압력에 도달하면 추출조 하부로 에탄올(주정: 식용 알콜)을 분당 0.5~0.6L씩 160분 동안 총 60~80L를 투입하여 추출을 진행하였으며, 시료에 남아있는 잔존 에탄올을 제거하기 위해 설정된 압력과 온도로 60~120분 동안 고압펌프를 이용하여 CO2를 흘려보내며 추출을 완료하였다.
위와 같은 과정을 통해 느릅나무 가지를 초임계 추출한 후, 얻어진 느릅나무 초임계 추출박 시료 100kg을 음건하고 60％ 에탄올을 이용해 실온에서 1회 추출한 후 여과하였다. 이를 통해 얻어진 추출액을 감압농축 및 동결건조하여 최종 4.81kg을 확보하였으며, 하기 실험에 사용하였다. 이하, 본 명세서에서 느릅나무 가지 초임계 추출박의 에탄올 추출물을 “USCFR(Ulmus davidiana supercritical fluid residue Ethanolic extract)”로 표기하였다(도 1 참조).
(2) HPLC 분석
느릅나무 가지 초임계 추출박의 에탄올 추출물에 포함된 카테킨 7-O-β-D-아피오푸란노사이드(catechin 7-O-β-D-apiofuranoside)의 함량을 HPLC로 분석하기 위해, Waters 2695 separation module을 사용하였고, 검출기로는 Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector를 사용하였다. 컬럼은 SkyPak C18 column(250 X 4.6mm)을 사용하였고, 컬럼 온도는 25℃로 세팅하였다. 이동상으로는 D.W.(A), 아세토니트릴(B)을 이용하였으며, 다음과 같은 Gradient program을 사용하여 분석을 진행하였다.
Time(분) % A % B
0 95 5
5 90 10
7 85 15
30 75 25
31 95 5
35 95 5
(3) 바이러스, 세포주 및 시약
코로나바이러스과(Coronaviridae)에 속하는 돼지 전염성 설사 바이러스(porcine epidemic diarrhea virus), 인간 코로나바이러스 229E형(HCoV-229E) 및 인플루엔자 A/PR8/34(H1N1)형은 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구매하였으며, 각각 순서대로 Vero, Huh-7, A549 세포에서 37℃ 조건하에 증식시켰다.
원숭이 폐 세포주인 Vero 및 인간 폐암 세포주인 A549는 ATCC에서 구입하였고, 인간 간암 세포주인 Huh-7은 한국세포주은행에서 구입하였다. Vero 및 A549 세포는 DMEM 배지에, Huh-7 세포는 RPMI1640 배지에 각각 10% FBS와 1% 항생제를 첨가하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터(SANYO Electric Co, Osaka, Japan)에서 배양하였다.
항바이러스 화합물은 디메틸설폭사이드(DMSO, dimethylsulfoxide) 용매에 용해시켜 DMEM 또는 RPMI1640 배지에 희석하여 처리하였다. DMSO의 최종 농도는 세포배양에 영향이 없도록 최대 농도를 0.1%로 사용하였고, 0.1% DMSO를 세포 대조군으로 사용하였다. 96-웰 세포배양 플레이트는 Corning사 제품을 사용하였고, 설포로다민 B(SRB, sulforhodamine B)는 Sigma-Aldrich에서 구입하였으며, 항생제와 trypsin-TPCK, FBS, DMEM 배지는 Gibco사에서 구입하여 사용하였다.
(4) 세포 독성 실험(MTT assay)
본 실험에서 Vero 세포에 대한 샘플들의 처리 농도를 결정하기 위해 MTT 어세이를 이용하였는데, 이 정량법은 Mosmann의 방법을 변형하여 실시하였다. MTT 분석법은 노란색의 수용성 기질인 MTT를 진청색의 비수용성인 포르마잔(formazan)으로 변화시키는 살아있는 세포의 미토콘드리아 탈수소효소(mitochondria dehydrogenase)의 능력을 이용한 방법으로, 생성된 포르마잔의 양은 살아있는 세포 수에 비례한다.
구체적으로, 세포를 배양한 후 96-웰 플레이트에 각 웰 당 1 × 105개의 세포를 배지와 함께 180㎕의 양으로 분주하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24~48시간 동안 배양한 다음, MTT 용액(0.5mg/ml) 50㎕를 첨가하고 4시간 동안 추가로 배양하였다. 이후 상층액을 제거하고, 포르마잔 침전물에 150㎕의 DMSO를 넣어 15분간 실온에서 방치하여 포르마잔을 용해시킨 다음 570nm의 파장에서 ELISA 리더로 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 계산하였다. 결과는 대조군(control)에 대한 (%)로 나타내었다.
Viability (% of control) = A570sampls/ A570control * 100
A570 : Absorbance at 570nm
(5) 항바이러스 활성 분석(SRB assay)
본 발명에서는 카테킨 배당체 고함량 추출물의 항바이러스 활성과 Huh7 및 A549세포에 대한 독성 여부를 측정하기 위하여 공지된 방법 (권두한 등, 국내 등록특허 10-0682069)에 의거하여 SRB(sulforhodamine B) 어세이를 실시하였다. 구체적으로, 하기 방법에 따라 카테킨 배당체 고함량 추출물의 돼지 전염성 설사 바이러스(PEDV), 코로나바이러스 229E형 및 인플루엔자 A/PR8/34(H1N1)형 각각에 대한 바이러스 활성 저해 효과를 측정하였다.
먼저, 96-웰 마이크로플레이트(96-well microplate)의 각 웰에 각 바이러스에 감수성을 갖는 세포(PEDV: Vero, Corona 229E: Huh7, 인플루엔자 A/PR8/34: A549 세포)를 4 × 104 (100㎕/well)의 수로 분주하여 약 24시간 동안 배양한 후 96-웰 배양 플레이트에 각각의 세포가 90% 이상 자랐을 때 실험에 이용하였다. 각 웰에서 기존 배양액을 제거하고, 인산 완충액(PBS)으로 1~2회 세척하였다. 다음으로, PEDV의 경우 TCID50의 농도로 조장된 PEDV 용액을 Vero 세포가 있는 각 웰에 넣고, 본 발명에 따른 카테킨 배당체 고함량 추출물을(USCFR) DMSO에 용해시켜 0.4, 0.8, 20, 100㎍/㎖의 농도로 각 웰에 처리하였다. 인플루엔자 A/PR8/34(H1N1)형은 2㎍/㎖ trypsin-TPCK를 DMEM에 넣어주어 상기 바이러스가 포함된 90㎕의 DMEM을 A549 세포에 처리하고, 코로나바이러스 229E형은 RPMI1640에 2㎍/㎖ trypsin을 첨가하여 상기 바이러스가 포함된 90㎕의 RPMI1640을 Huh7 세포에 처리한 후 각각 0.4, 2, 10 및 50㎍/㎖ 농도의 USCFR 10㎕을 각 웰에 첨가하였다. 이때, 인플루엔자 A/PR8/34(H1N1)형에 대해서는 양성대조군으로 상기 추출물 대신 인플루엔자바이러스 A 및 B에 대한 항바이러스제인 오셀타미비르(Osel, Oseltamivir)를 0.4, 2, 10 및 50uM 농도로 처리하였다. 또한 각 세포에 대하여 바이러스를 처리하지 않고 USCFR 또는 Osel만을 각 농도 조건으로 처리하여 이에 의한 세포 독성 여부를 평가하였다. 이후 37℃ 또는 33℃, 5% CO2의 조건으로 48시간 동안 배양하였고, 위상차현미경(Axiovert 10; Zeiss, Wetzlar, Germany)으로 세포의 형태를 관찰하여 항바이러스 효과를 1차적으로 평가하였다.
다음으로, 각 웰에 70% 아세톤을 100㎕씩 첨가한 후 1시간 동안 -20℃에 방치하고 건조기에서 건조시킨 후 1%(v/v) 아세트산에 용해시킨 0.4%(w/v) SRB(sulforhodamine B) 용액 100㎕를 첨가해 30분 동안 염색시킨 후 세포와 결합하지 않은 SRB 염색액을 1%(v/v) 아세트산으로 4회 세척한 다음 다시 건조시켰다. 각 웰 바닥에 세포와 결합되어 있는 염색제를 10mM 트리스 용액(pH 10.5) 100㎕를 각 웰에 가하여 녹인 후 562nm에서 흡광도를 측정하여 바이러스 저해 효과를 대조군과 비교하였다. 이때, DMSO만 처리한 세포(Ctrl)와 DMSO 및 각 바이러스를 처리한 세포(Veh)를 대조군으로 사용하여 비교한 본 발명의 화합물이 나타내는 각 바이러스 저해 효과를 결정하였다.
(6) 통계 처리
모든 실험은 3회 반복 실시하여 평균값과 표준편차를 제시하였다. 또한 SPSS(Statistical Package for Social Science, ver. 18, IBM, Chicago IL. USA)를 이용하여 P < 0.05 수준에서 실험군과 대조군의 평균치를 Students t-test로 유의성을 검증하였다.
실시예 2. 실험 결과
(1) HPLC 분석 결과 크로마토그램
본 발명의 느릅나무 초임계 추출박에 대한 추출물에서 카테킨 7-O-β-D-아피오푸란노사이드 함량을 HPLC로 정량분석하였다. 도 2a는 표준물질인 카테킨 7-O-β-D-아피오푸란노사이드의 HPLC 분석결과이고, 도 2b는 느릅나무 가지 초임계 추출박의 에탄올 추출물(USCFR)에서 카테킨 7-O-β-D-아피오푸란노사이드를 HPLC로 정량분석한 결과이다. 구체적으로, 본 발명의 추출물에서 측정된 카테킨 7-O-β-D-아피오푸란노사이드 함량을 아래의 표 2에 기재하였다.
시료명 RT(min.) 함량(㎍/ml)
카테킨 7-O-β-D-아피오푸란노사이드 14.449±0.14 -
느릅나무 카테킨 배당체 고함량 추출물(USCFR) 14.482±0.16 131.45±0.18
(3) 카테킨 배당체 고함량 추출물의 세포 독성 평가
본 발명에 따른 카테킨 배당체 고함량 추출물의 항바이러스 활성을 평가하기 전에 상기 추출물 자체가 세포 독성을 나타내는지를 확인하기 위하여, 먼저 전술한 바와 같이 Vero 세포에 카테킨 배당체 고함량 추출물(USCFR)을 다양한 농도(0.4, 0.8, 20, 100㎍/㎖)로 처리한 후 MTT 어세이를 실시하여 세포 생존율을 측정하였다. 그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이 본 발명의 카테킨 배당체 고함량 추출물은 상기 실험 사용농도 모두에서 Vero 세포에 특별한 세포 독성을 유발하지 않는 것을 확인하였다.
또한, 각각 코로나바이러스 229E형 및 인플루엔자 A/PR8/34(H1N1)형에 대한 항바이러스 활성을 검증하기 전에 상기 바이러스들을 감염시킬 Huh7 세포 및 A549 세포에 USCFR을 다양한 처리 농도(0.4, 2, 10, 50㎍/㎖)로 단독 처리한 후 SRB 어세이를 통해 세포 독성 여부를 관찰하였다. 이때, A549 세포의 경우에는 양성대조군인 오셀타미비르(Osel, Oseltamivir)를 동일한 조건으로 단독 처리하여 세포 독성을 관찰하였다. 그 결과, 도 3b 및 도 3c에서 각각 볼 수 있는 바와 같이 본 발명의 카테킨 배당체 고함량 추출물은 상기 실험 사용농도 모두에서 Huh7 세포 및 A549 세포에 세포 독성을 유발하지 않았으며, 오셀타미비르를 처리한 A549 세포에서도 역시 세포 독성이 전혀 나타나지 않은 것을 확인하였다.
(4) 코로나바이러스 PEDV에 대한 저해 효과
먼저, 코로나바이러스의 일종인 PEDV에 대한 카테킨 배당체 고함량 추출물의 저해 효과를 분석한 결과, 도 4에서 볼 수 있는 바와 같이 Vero 세포에 DMSO만 처리한 Ctrl, DMSO와 PEDV를 처리한 Veh와 비교하여, 본 발명에 따른 카테킨 배당체 고함량 추출물(USCFR)을 처리한 세포들에서 처리 농도에 비례하여 우수한 항바이러스 활성이 나타난 것을 확인하였다.
특히, 한국등록특허 제10-0720151호(“항바이러스 활성을 갖는 플라보노이드 화합물”)에서 공개된 바와 같이, 이미 알려진 항바이러스 제제 즉, 리바비린(ribavirin), 아사이클로비르(acyclovir), 아만타딘(amantadine), 아지도타이미딘(azidothymidine), 오셀타미비르(oseltamivir, 상품명: Tamiflu), 자나미비르(zanamivir, 상품명; Relenza) 각각의 항바이러스 활성을 살펴보면, Vero 세포에서의 코로나바이러스 계열인 PEDV에 대한 최대 용량인 100㎍/ml에서 50% 억제능을 나타내지 못하고 있다.
본 발명의 상기 USCFR 실험 결과와 비교해 보면, 본 발명에 따른 카테킨 배당체 고함량 추출물 0.4㎍/㎖의 농도에서는 49.5±2.02%, 0.8㎍/㎖의 농도에서는 62.4±3.18%, 20㎍/㎖의 농도에서는 99.2±4.58%, 100㎍/㎖의 농도에서는 104.8±1.48%의 활성이 확인되어 천연물 유래 항바이러스 효능이 매우 우수함을 알 수 있다.
또한 상기 특허 문헌에 기재된 퀘세틴-7-람노사이드의 IC50 값은 7.143㎍/㎖임을 알 수 있는 반면에 본 발명의 실험 결과 USCFR의 IC50 값은 0.42㎍/㎖로 확인되었다. 이러한 결과를 보았을 때, 본 발명에 따른 카테킨 배당체 고함량 추출물은 매우 강력한 항바이러스 효능이 있다는 것을 객관적으로 확인할 수 있었다.
(5) 코로나바이러스 229E형에 대한 저해 효과
상기 느릅나무속 식물 유래 카테킨 배당체 고함량 추출물의 PEDV에 대한 항바이러스 활성을 확인한 것에 더하여, 본 발명자들은 코로나바이러스 229E형에 대한 저해 효과를 평가하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 Huh7 세포에 DMSO만 처리한 Ctrl, DMSO와 상기 바이러스(Corona 229E)를 처리한 Veh와 비교하여, 본 발명에 따른 카테킨 배당체 고함량 추출물(USCFR)을 0.4~10㎍/㎖의 농도로 처리한 군에서는 40% 이하의 항바이러스 활성이 나타났다. 이에 반해 실험 최고 농도인 50㎍/㎖의 USCFR이 처리된 세포에서는 평균 98.2%에 해당하는 매우 강력한 항바이러스 활성이 나타난 것을 확인하였다.
따라서 본 발명의 카테킨 배당체 고함량 추출물은 인간유래 코로나바이러스인 229E형에 대해서도 일정 농도 이상에서 매우 강력한 항바이러스 효능이 있는 것을 알 수 있었다.
(6) 인플루엔자 A/PR8/34(H1N1)형에 대한 저해 효과
다음으로, 인간에서 감염을 유발하는 또 다른 바이러스인 인플루엔자 A/PR8/34(H1N1)형에 대한 느릅나무속 식물 유래 카테킨 배당체 고함량 추출물의 저해 효과를 평가하였다.
그 결과, 도 6에서 볼 수 있는 바와 같이 A549 세포에 DMSO만 처리한 Ctrl, DMSO와 상기 바이러스(PR8)를 처리한 Veh와 비교하여, 먼저 양성대조군인 오셀타미비르(Osel)를 0.4~50uM 농도로 처리한 결과 모든 처리 농도에서 98.4~99.2%에 해당하는 매우 강력한 항바이러스 활성이 확인되었다. 이와 비교하여 USCFR을 처리한 군에서는 0.4 및 2㎍/㎖ 두 가지 농도에서 뚜렷한 항바이러스 활성이 나타나지는 않았지만, 10㎍/㎖의 농도에서는 80.7% 항바이러스 효과가 나타났고, 실험 최고 농도인 50㎍/㎖의 농도에서는 99.6% 항바이러스 효과가 확인되어 양성대조군과 유사 동등 이상의 강력한 항바이러스 활성이 있는 것을 알 수 있었다.
[제조예]
제조예 1. 주사제
상기 실시예 1에서 제조한 느릅나무 가지의 초임계 추출박의 에탄올 추출물: 100㎎
소듐 메타비설파이트: 3.0㎎
메틸파라벤: 0.8㎎
프로필파라벤: 0.1㎎
주사용 멸균 증류수: 적량
상기 성분을 혼합하고 통상의 방법으로 최종 부피가 2 ㎖이 되도록 제조하여, 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조하였다.
제조예 2. 정제
상기 실시예 1에서 제조한 느릅나무 가지 초임계 추출박의 에탄올 추출물: 200㎎
감자 전분: 100㎎
락토오스: 100㎎
콜로이드성 규산: 16㎎
스테아린산 마그네슘: 적량
통상의 정제 제조방법에 따라 상기 성분을 혼합하고 타정하고 정제를 제조하였다.
제조예 3. 캡슐제
상기 실시예 1에서 제조한 느릅나무 가지 초임계 추출박의 에탄올 추출물: 100㎎
유당: 50㎎
전분: 50㎎
탈크: 2㎎
스테아린산 마그네슘: 적량
통상의 캡슐 제조방법에 따라 상기 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
제조예 4. 환제
상기 실시예 1에서 제조한 느릅나무 가지 초임계 추출박의 에탄올 추출물: 120㎎
옥수수 전분: 100㎎
멸균 증류수: 적량
상기 성분을 혼합하고, 통상의 환제 제조방법에 따라 적절한 크기를 갖는 구형으로 제환하여 환제를 제조하였다.
제조예 5. 식품
1) 건강 음료
올리고당(2%), 액상과당(0.5%), 설탕(2%), 식염(0.5%), 물(75%) 등의 음료 재료에 상기 실시예 1에서 제조된 느릅나무 가지의 초임계 추출박의 에탄올 추출물을 적량 혼합하여, 살균함으로써 음료를 제조하였다.
2) 기능성 식품
상기 실시예 1에서 제조된 느릅나무 가지 초임계 추출박의 에탄올 추출물을 각종 비타민 및 미네랄 함유 기능성 식품에 적량 혼합하여 느릅나무 가지 초임계 추출박의 에탄올 추출물이 함유된 기능성 식품을 제조하였다.
제조예 6. 사료 조성물
동물용 배합 사료에 상기 실시예 1에서 제조된 느릅나무 가지 초임계 추출박의 에탄올 추출물을 적량 혼합하여, 사료 조성물을 제조한 후, 펠렛화 및 과립화하였다.
제조예 7. 소독용 조성물
상기 실시예 1에서 제조된 느릅나무 가지 초임계 추출박의 에탄올 추출물 또는 이로부터 분리한 카테킨 배당체 화합물 0.1 내지 1.0g을 정제수 1,000㎖에 가하여 무방부제용 천연 소독제를 제조하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (10)

  1. 느릅나무속 식물 초임계 추출박의 추출물로 카테킨 7-O-β-D-아피오푸란노사이드(catechin 7-O-β-D-apiofuranoside)를 30 - 200㎍/㎖의 함량으로 포함하며,
    상기 느릅나무속 식물은 느릅나무 가지인 항바이러스용 약학적 조성물로서, 상기 바이러스는 돼지 전염성 설사 바이러스(PEDV, porcine epidemic diarrhea virus), 인간 호흡기질환 코로나바이러스(Human respiratory coronavirus) 229E형 및 인플루엔자 바이러스(Influenza viruses) A/PR8/34(H1N1형)인 것을 특징으로 하는 항바이러스용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 느릅나무속 식물 초임계 추출박의 추출물은,
    (a) 느릅나무 가지를 초임계 추출하여 초임계 추출박을 얻는 단계; 및
    (b) 상기 얻어진 느릅나무속 식물의 초임계 추출박에 대해 추출물을 얻는 단계;를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인, 조성물.
  3. 제1항에서 있어서,
    상기 느릅나무속 식물 초임계 추출박의 추출물은 에탄올 용매로 추출된 것인, 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 느릅나무속 식물 초임계 추출박의 추출물을 유효성분으로 포함하며, 상기 느릅나무속 식물 초임계 추출박의 추출물은 카테킨 7-O-β-D-아피오푸란노사이드(catechin 7-O-β-D-apiofuranoside)를 30 - 200㎍/㎖의 함량으로 포함하는, 항바이러스용 건강기능식품 조성물로서, 상기 느릅나무속 식물은 느릅나무 가지이고, 상기 바이러스는 돼지 전염성 설사 바이러스(PEDV, porcine epidemic diarrhea virus), 인간 호흡기질환 코로나바이러스(Human respiratory coronavirus) 229E형 및 인플루엔자 바이러스(Influenza viruses) A/PR8/34(H1N1형)인 것을 특징으로 하는 항바이러스용 건강기능식품.

  8. 느릅나무속 식물 초임계 추출박의 추출물을 유효성분으로 포함하며, 상기 느릅나무속 식물 초임계 추출박의 추출물은 카테킨 7-O-β-D-아피오푸란노사이드(catechin 7-O-β-D-apiofuranoside)를 30 - 200㎍/㎖의 함량으로 포함하는, 항바이러스용 사료 조성물로서, 상기 느릅나무속 식물은 느릅나무 가지이고, 상기 바이러스는 돼지 전염성 설사 바이러스(PEDV, porcine epidemic diarrhea virus), 인간 호흡기질환 코로나바이러스(Human respiratory coronavirus) 229E형 및 인플루엔자 바이러스(Influenza viruses) A/PR8/34(H1N1형)인 것을 특징으로 하는 항바이러스용 사료 조성물.
  9. 느릅나무속 식물 초임계 추출박의 추출물을 유효성분으로 포함하며, 상기 느릅나무속 식물 초임계 추출박의 추출물은 카테킨 7-O-β-D-아피오푸란노사이드(catechin 7-O-β-D-apiofuranoside)를 30 - 200㎍/㎖의 함량으로 포함하는 항바이러스용 의약외품 조성물로서, 상기 느릅나무속 식물은 느릅나무 가지이고, 상기 바이러스는 돼지 전염성 설사 바이러스(PEDV, porcine epidemic diarrhea virus), 인간 호흡기질환 코로나바이러스(Human respiratory coronavirus) 229E형 및 인플루엔자 바이러스(Influenza viruses) A/PR8/34(H1N1형)인 것을 특징으로 하는 항바이러스용 의약외품 조성물.
  10. 느릅나무속 식물 초임계 추출박의 추출물을, 인간을 제외한 면역증강이 필요한 동물에게 투여하는 동물의 항바이러스 활성 증진 방법으로, 상기 느릅나무속 식물 초임계 추출박의 추출물은 카테킨 7-O-β-D-아피오푸란노사이드(catechin 7-O-β-D-apiofuranoside)를 30 - 200㎍/㎖의 함량으로 포함하는 동물의 항바이러스 활성 증진 방법으로, 상기 느릅나무속 식물은 느릅나무 가지이고, 상기 바이러스는 돼지 전염성 설사 바이러스(PEDV, porcine epidemic diarrhea virus), 인간 호흡기질환 코로나바이러스(Human respiratory coronavirus) 229E형 및 인플루엔자 바이러스(Influenza viruses) A/PR8/34(H1N1형)인 것을 특징으로 하는 동물의 항바이러스 활성 증진 방법.
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