KR20130138940A

KR20130138940A - 관중 추출물 또는 이로부터 분리된 플로로글루시놀 유도체를 함유하는 코로나 바이러스 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20130138940A
Application number: KR1020120062489A
Authority: KR
Inventors: 오원근; 당타이중; 이승철; 유성식; 김은희
Original assignee: 조선대학교산학협력단; 주식회사 중앙백신연구소
Priority date: 2012-06-12
Filing date: 2012-06-12
Publication date: 2013-12-20
Also published as: KR101427096B1

Abstract

본 발명은 관중(Dryopteris crassirhizoma) 추출물 및 이로부터 분리된 플로로글루시놀 유도체 화합물을 함유하는 코로나 바이러스 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 코로나 바이러스를 저해하는 효과가 뛰어나 바이러스성 감기 또는 장염의 치료제로 사용될 수 있으며, 화장품, 건강식품, 소독제, 동물사료, 동물약품 산업 등에도 응용될 수 있다.

Description

관중 추출물 또는 이로부터 분리된 플로로글루시놀 유도체를 함유하는 코로나 바이러스 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물 {Composition comprising extract of Dryopteris crassirhizoma or phloroglucinol derivatives isolated therefrom for treating or preventing Corona virus related disease}

본 발명은 관중 추출물 또는 이로부터 분리된 플로로글루시놀 유도체를 함유하는 코로나 바이러스 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

코로나 바이러스(Corona virus)는 1937년 닭에서 처음 발견된 뒤 개·돼지·조류 등의 동물을 거쳐 1965년에는 사람에게서도 발견되었다. 개기일식(皆旣日蝕) 때 태양의 광구(光球)가 달에 가려졌을 때 그 둘레에서 하얗게 빛나는 현상인 코로나 현상과 생김새가 비슷해 이런 이름이 붙었다. 코로나 바이러스는 사람에게 감염될 때에는 감기, 상기도감염, 호흡기 질환, 어린이의 설사, 기타 장질환 등을 일으키지만, 위험성이 높지는 않은 것으로 알려져 있었으며, 주로 개·돼지·소 등의 동물에 감염되는 병원균으로 인식되어 왔다. 그러나 2003년 3월 중순 처음으로 발생해 세계적으로 100명이 넘는 사망자와 3,000여 명의 환자를 발생시킨 중증급성호흡기증후군(severe acute respiratory syndrome, SARS, 사스)의 원인균이 신종(변종) 코로나 바이러스인 것으로 알려지면서 주목받기 시작하였다. 상기 중증급성호흡기증후군의 원인 바이러스는 SARS-Corona virus이며, 2002년 11월에서 2003년 6월 사이에 크게 유행하여 8,096명의 감염자가 발생하고 774명이 사망한 바 있다. 코로나 바이러스는 개·돼지·소·조류 등 일부 동물의 경우에는 때로 발열·호흡곤란·구토·설사·탈수 등을 유발해 치명적인 병원균으로 작용하기도 한다. 또 전염성이 강하고 다른 병원균과 결합하는 능력이 뛰어나 증상을 더욱 악화시키는 바이러스로 알려져 있다. 이런 결합 능력을 이용해 중증급성호흡기증후군을 유발하는 신종 코로나 바이러스 역시 동물의 몸 속에 있던 코로나 바이러스가 변형되어 사람의 몸 속으로 들어와 질병을 일으킨 것으로 전문가들은 추정하고 있다. 즉 높은 결합률이 평범한 코로나 바이러스를 치명적인 것으로 변화시켰다는 것이다.

개·돼지 등 동물의 경우에는 이미 코로나 바이러스에 대한 백신이 나와 있으나, 2003년 현재 신종 코로나 바이러스 백신은 미개발 상태이고, 효과적인 치료제도 없다. 현재까지 코로나 바이러스는 3개군 13종이 알려져 있다(출처: 코로나 바이러스, 네이버 백과사전)

한편, 코로나 바이러스는 농장 동물들에 여러 가지 질병을 일으키기 때문에, 주로 바이러스가 발견된 동물 종의 이름을 따라 명명되었다(Elsevier, 2008, 554). 가장 일반적인 코로나 바이러스로는 돼지의 장염을 일으키는 것으로 알려진 PEDV(porcine epidemic diarrhea virus), 개와 고양이의 여러 질환의 원인이 되는 것으로 알려진 CCV(canine corona virus), 조류의 호흡기 질환을 일으키고, 알 생산량의 감소를 일으키는 것으로 알려진 IBV(avian infectious bronchitis virus), 돼지와 사람의 장염을 일으키는 것으로 알려진 TGEV(transmissible gastroenteritis corona virus) 등이 있다.

코로나 바이러스는 주로 어린이들이나 어린 동물들에게 감염되기 쉽다(Elsevier, 2008, 554 ; Advances in Virus Research, 2006, 66, 193~232). 한편, CCV는 대부분 그 증세가 약하거나 증상이 전혀 없는 경우가 많지만, 때로 심각한 장염을 일으키기도 한다. PEDV(porcine epidemic diarrhea virus)는 설사, 탈수증, 구토, 사망 등을 일으키는 돼지 유행성 설사의 주요 원인 바이러스이다(Am. J. Vet. Res., 1980, 41, 219~223). PEDV 바이러스의 감염은 양돈산업에 큰 영향을 미치고 있고, 많은 나라에 경제적인 손실을 입히고 있다(Arch. Tierheilkd, 1987, 129, 437~442).

한편, PEDV에 대해서는 일본에서 제작된 P-5V 등의 다양한 종류의 백신이 개발되기도 하였지만, 이러한 백신들은 면역활성을 크게 높이지 못하는 것으로 나타났다(J. Jpn. Vet. Med. Assoc., 1998, 51, 652~655). 예를 들어, 한국등록특허 제502008호에 DR13이라는 경구용 백신이 개시되어 있지만, 상기 백신 역시 항바이러스 활성이 명백하지 않은 것으로 확인되었다(Virus Genes., 2012, 44, 167~175).

관중(Dryopteris crassirhizoma)은 고사리과(Polypodiaceae) 식물에 속하며, 고사리는 양치식물 고사리목 고사리과의 여러해살이풀로 우리나라 각지의 산과 들의 양지바른 곳에서 자라는 식물이다. 생약으로 이용하는 것은 관중의 뿌리 부분이며, 생약명은 Crassirhizomae Rhizoma라고 한다. 관중의 잇몸은 달걀 모양의 삼각형이고 길이가 20~100cm, 폭이 17~70cm이며 깃꼴로 갈라지고 뾰족하며 표면은 녹색이다. 봄에 잎이 아직 피지 않은 것을 삶아서 나물로 먹거나 국의 재료로 쓰고, 뿌리줄기에서 녹말을 채취하기도 한다. 한방에서는 어린순을 약재로 쓰는데, 위와 장에 있는 열독을 풀어 주고 가벼운 이뇨 작용이 있는 것으로 알려지고 있으며 북반구의 온대 지방과 한대 지방에 널리 분포하는 자원이 풍부한 식물이다. 관중은 외상 치료제, 수렴제, 구충제, 항염제, 항균제, 출혈 치료제, 자궁출혈이나 볼거리의 치료제 등으로도 이용되었다(Kyo-Hak Publishing Co.: Seoul, 2000, p25). 또한, 드리오프레리스(Dryopteris) 속 식물로부터 분리된 플로로글루시놀 유도체들(albaspidins, norflavaspidic acids, flavaspidic acids, deaspidins, para-aspidins, filixic acids 등)이 항산화, 항바이러스, 항암 활성이 있다고 알려진 바 있다(Biol. Pharm. Bull., 2003, 26, 1354~1356 ; Yakhak Hoeji, 1996, 40, 478~482 ; Cancer Lett., 1996, 105, 161~165).

한편, 본 발명자들은 항바이러스 활성이 있는 천연물에 대한 연구를 하던 중, 상기 관중 추출물 및 이로부터 분리한 플로로글루시놀 유도체가 코로나 바이러스에 대한 항바이러스 활성이 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.

한국등록특허 제502008호 (약독화된 돼지 유행성설사병 바이러스, 그를 포함하는 면역원성 조성물 및 상기 바이러스를 검출하는 방법, 2005.07.08. 등록)

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본 발명의 목적은 관중 추출물 또는 이로부터 분리된 플로로글루시놀 유도체를 함유하는 코로나 바이러스 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명은 하기 화학식 1의 알바스피딘-PP(albaspidin-PP, 화합물 1), 알바스피딘-PB (albaspidin-PB, 화합물 2), 노르플라바스피딘산-AB(norflavaspidic acid-AB, 화합물 3) 및 메틸렌-비스-메틸플로로부티로페논(methylene-bis-methylphlorobutyrophenone, 화합물 4)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 플로로글루시놀(phloroglucinol) 유도체 화합물이 포함된 관중 추출물을 함유하는 코로나 바이러스 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

상기 관중(Dryopteris crassirhizoma) 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4개의 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름 또는 이들의 혼합용매로 추출하여 제조할 수 있다.

상기 코로나 바이러스 관련 질환은 감기 또는 장염일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 알바스피딘-PP(albaspidin-PP, 화합물 1), 알바스피딘-PB (albaspidin-PB, 화합물 2), 노르플라바스피딘산-AB(norflavaspidic acid-AB, 화합물 3) 및 메틸렌-비스-메틸플로로부티로페논(methylene-bis-methylphlorobutyrophenone, 화합물 4)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 플로로글루시놀(phloroglucinol) 유도체 화합물이 포함된 관중 추출물을 함유하는 코로나 바이러스 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.

본 발명은, 또한, 상기 화학식 1의 알바스피딘-PP(albaspidin-PP, 화합물 1), 알바스피딘-PB (albaspidin-PB, 화합물 2), 노르플라바스피딘산-AB(norflavaspidic acid-AB, 화합물 3) 및 메틸렌-비스-메틸플로로부티로페논(methylene-bis-methylphlorobutyrophenone, 화합물 4)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 플로로글루시놀 유도체 화합물을 함유하는 코로나 바이러스 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

한편, 본 발명은 상기 관중 추출물 및 이로부터 분리된 플로로글루시놀 유도체 화합물을 함유하는 코로나 바이러스 관련 질환의 예방, 치료 또는 개선용 동물약품이나 사료 첨가제를 제공한다. 또한, 본 발명에서는 상기 관중 추출물 및 이로부터 분리된 플로로글루시놀 유도체 화합물을 함유하는 코로나 바이러스 관련 질환의 예방 또는 개선용 천연 소독제를 제공할 수도 있다.

이하 본 발명을 자세하게 설명한다.

본 발명의 관중 추출물은, 관중 중량의 2~50배(w/v)의 물, 탄소수 1 내지 4개의 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름 또는 이들의 혼합용매로 추출하여 제조할 수 있다. 상기 저급 알코올은 에탄올, 메탄올, 프로판올, 이소프로판올 및 부탄올 중에서 선택될 수 있다.

또한, 본 발명의 관중 추출물을 유기용매(알코올, 알코올 수용액, 에틸아세테이트, 아세톤, 클로로포름 등)에 의한 추출, 헥산과 물의 분배, 디아이온 HP-20 레진과 같은 흡착수지 사용방법, 칼럼크로마토그래피에 의한 방법 등 식물체 성분의 분리 추출에 이용되는 공지된 방법을 단독 또는 적합하게 조합하여 본 발명의 활성 화합물을 용이하게 얻을 수가 있다.

바람직하게는, 상기 관중 추출물에 상기 추출물 중량의 2~50배(w/v)의 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 등을 순차적으로 가하여 이를 정제 분획한 뒤, 크로마토그래피 등을 이용하여 항바이러스 활성이 있는 화합물들을 분리할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 크로마토그래피에는 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 엘에이취-20 칼럼 크로마토그래피(LH-20 column chromatography), 박층 크로마토그래피(TLC; thin layer chromatography) 및 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등이 이용될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 관중 추출물 및 이로부터 분리된 플로로글루시놀 유도체 화합물의 활성 측정은, 관중을 물, 탄소수 1 내지 4개의 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름 또는 이들의 혼합용매로 추출한 후 헥산 및 에틸아세테이트로 순차적으로 분획하는 단계; 플로로글루시놀 유도체 화합물을 크로마토그래피를 이용하여 순수 분리 정제하는 단계; 분리된 활성 화합물의 화학구조를 통해 플로로글루시놀 유도체 화합물을 확인하는 단계; 및, 상기 플로로글루시놀 유도체 화합물의 코로나 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 측정하는 단계;를 통해 확인할 수 있다.

또한, 본 발명은 관중 추출물 및 이로부터 분리된 플로로글루시놀 유도체 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 관중 추출물 및 이로부터 분리된 플로로글루시놀 유도체 화합물을 포함하는 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 관중 추출물 및 이로부터 분리된 플로로글루시놀 유도체 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 관중 추출물 및 이로부터 분리된 플로로글루시놀 유도체 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 관중 추출물 및 이로부터 분리된 플로로글루시놀 유도체 화합물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 0.1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명의 관중 추출물 및 이로부터 분리된 플로로글루시놀 유도체 화합물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 관중 추출물 및 이로부터 분리된 플로로글루시놀 유도체 화합물은 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

또한, 본 발명은 상기 관중 추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제가 포함된 코로나 바이러스 관련 질환의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품을 제공한다. 본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성식품류 등이 있다.

본 발명은 관중(Dryopteris crassirhizoma) 추출물 및 이로부터 분리된 플로로글루시놀 유도체 화합물을 함유하는 코로나 바이러스 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 코로나 바이러스를 저해하는 효과가 뛰어나 바이러스성 감기 또는 장염의 치료제로 사용될 수 있으며, 화장품, 소독제, 건강식품, 동물사료, 동물약품 산업 등에도 응용될 수 있다.

도 1은 바이러스 타이터 측정을 통해 PEDV(도 1A)와 CCV(도 1B)에 대한 화합물 4의 농도의존적인 항바이러스 활성을 확인한 결과이다.
도 2는 세포병변효과 회복 어세이 결과로서, 도 2A는 10㎍/㎖의 화합물 1~4를 처리한 PEDV 감염 VERO 세포에서 세포 생존이 회복되는 것을 확인한 결과이며, 도 2B는 PEDV 감염 VERO 세포에서의 화합물 4의 농도별 CPE(cytopathic effect, %)를 확인한 결과이다.
도 3은 세포병변효과 회복 어세이를 수행한 세포의 모양을 나타내는 사진으로서, 도 3A는 PEDV 비감염 VERO 세포를 나타내며, 도 3B는 PEDV에 감염된 VERO 세포를 나타내고, 도 3C 및 3D는 화합물 3 및 4를 처리한 PEDV에 감염된 VERO 세포를 나타낸다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

<실시예 1 : 관중으로부터 활성 화합물의 용매 추출조건 확인>

본 발명에 이용된 관중(고사리의 뿌리)은 광주의 지역시장에서 구입하였다. 상기 관중을 건조한 후, 건조된 관중 1kg을 증류수, 에탄올, 메탄올, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름 등의 용매 50㎖을 사용하여 4시간 동안 3회에 걸쳐 환류 추출하였다. 이 후, 고형분을 제거한 추출액을 감압 농축하여 각 추출물 당 70~150g의 추출물을 얻었다(단, 물 추출물은 90℃에서 8시간 추출한 후 여액을 동결건조함). 그리고, 실시예 4의 PEDV 및 실시예 5의 방법을 이용하여 각각의 추출물의 항바이러스 활성을 확인하였고 이에 대한 결과는 표 1에 나타내었다. 표 1의 결과를 참고하면, 관중 추출물은 모든 조건에서 그 활성이 모두 좋았으나, 메탄올 또는 에탄올 추출물의 활성이 가장 높아 이를 최적 추출조건으로 설정하였다.

추출물	농도 (㎍/㎖)	무처리군과 비교한 PEDV에 대한 항바이러스 활성
70% 에탄올 추출물	50	23.2%
70% 메탄올 추출물	50	35.1%
에탄올 추출물	50	40.5%
메탄올 추출물	50	47.1%
아세톤 추출물	50	27.3%
에틸아세테이트 추출물	50	25.2%
클로로포름 추출물	50	22.3%
증류수 추출물	50	1.2%

< 실시예 2 : 관중 추출물의 제조 및 플로로글루시놀 유도체 화합물의 분리 및 정제>

실시예 1의 건조된 관중 1kg을 잘게 부순 후 메탄올 4ℓ에 1주일간 침지하여 실온에서 추출하였다. 상기 메탄올 추출물(100g)을 감압농축한 후 이 추출물을 물 2ℓ로 현탁한 후 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올로 순차적으로 분획한 다음 각각의 분획물에 대하여 PEDV에 대한 항바이러스 활성을 측정한 결과, 헥산 분획물 및 에틸아세테이트 분획에서 강한 억제활성을 나타내었다(50㎍/㎖에서 각각 90.0%, 92.0% 억제활성).

헥산 분획물(32g)을 헥산-클로로포름(9:1 → 0:1)의 용매구배 조건으로 실리카겔 컬럼크로마토그래피(10×30cm; 63~200μm particle size)를 실시하여 TLC 패턴에 따라 나뉘어진 8개의 소분획물을 얻었다(Hfr.1-8). 소분획 Hfr.2(3.5g, 헥산-클로로포름(8:2) 조건으로 용출됨)에 대하여 헥산-디클로로메탄-메탄올(30:10:0.5) 용매조건으로 실리카겔 컬럼크로마토그래피(6.5×35cm; 63~200μm particle size)를 실시하여 4개의 소분획물을 얻었다. 활성이 가장 강하게 나타난 Hfr.2-1 소분획물 0.8g에 대하여 아세토니트릴-물 혼합용매를 6:4, 7:3, 8:2 및 10:0의 단계적 구배 조건으로 역상(RP-18) 컬럼크로마토그래피(3.5×30cm; LiChroprep RP-18 40~63μm particle size)를 실시하여 다시 4개의 소분획물을 얻었다. Hfr.2-1-1(220㎎) 소분획물에 대하여 아세토니트릴-물(94:6)을 이동상으로 HPLC[YMC J-sphere ODS-H80 column 20×150㎜; 4μm 입자 크기 5㎖/min; UV detection: 254nm]를 실시하여 화합물 1(11㎎, t _R=36.5~39.8min), 화합물 2(23㎎, t _R=42.0~46.0min)를 얻었다.

한편, 에틸아세테이트 분획물(26g)도 헥산-클로로포름-에탄올 (10:10:0.1 → 9:9:2)의 용매구배 조건을 이용하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피(10×30cm; 63~200μm particle size)를 실시하였다. TLC 패턴에 따라 나뉘어진 6개의 분획 중 EAfr.1 소분획물에서 PEDV에 대한 가장 강한 항바이러스 활성(30㎍/㎖에서 91.0% 억제활성)이 나타났으므로, 이 소분획물 8g에 대하여 클로로포름-메탄올(40:1→1:10)의 용매구배 조건으로 다시 실리카겔 컬럼크로마토그래피(9.5×17cm; 63~200μm particle size)를 실시한 결과, 4개의 소분획물을 얻을 수 있었다. 이 중 EAfr.1-2 소분획물 4.1g을 아세토니트릴-물 혼합용매를 35:65, 40:60, 50:50, 60:40 및 70:30의 단계적 구배 조건을 이용하여 역상(RP-18) 컬럼크로마토그래피(3.5×30cm; LiChroprep RP-18 40~63μm particle size)를 실시하였으며, 그 결과 화합물 3(27㎎)이 분리되었다. EAfr.1-3(2.2g, 클로로포름-메탄올[8:2→7:3]으로 용출됨)에 대해서도 아세토니트릴-물(33:67)의 용매조건으로 역상 컬럼 HPLC를 실시하여 화합물 4(38㎎, t _R=25~35 min)를 분리하였다.

< 실시예 3 : 플로로글루시놀 유도체 화합물의 물리화학적 특성 및 화학구조 분석>

상기 관중으로부터 분리한 화합물들의 질량분석 및 핵자기공명 측정 결과는 하기와 같다.

실시예 3-1 : 알바스피딘 - PP (화합물 1)

albaspidin-PP

ESI-MS m/z : 431 [M - H]⁺, 455 [M + Na]⁺

¹H-NMR (400MHz, CDCl₃) : 1.18 (6H, t, J = 7.2Hz, H-10, -10'), 1.48 (6H, s, H-12, -12'), 1.55 (6H, s, H-13, -13'), 3.22 (4H, m, H-9, -9'), 3.32 (2H, br s, H-7)

실시예 3-2 : 알바스피딘 - PB (화합물 2)

albaspidin-PB

ESI-MS m/z : 445 [M - H]⁺, 469 [M + Na]⁺

¹H-NMR (400MHz, CD₃OD) : 1.02 (3H, t, J = 7.2Hz, H-11), 1.18 (3H, t, J=7.2Hz, H-10), 1.48, 1.49 (each 3H, s, H-12, -12'), 1.55, 1.56 (each 3H, s, H-13, -13), 1.70 (2H, m, H-10), 3.17 (2H, m, H-9), 3.23 (2H, m, H-9), 3.32 (2H, br s, H-7)

실시예 3-3 : 노르플라바스피딘산 - AB (화합물 3)

norflavaspidic acid-AB

ESI-MS m/z : 403 [M - H]⁺, 427 [M + Na]⁺

¹H-NMR (400MHz, CD₃OD) : 0.99 (3H, t, J = 7.2Hz, H-11), 1.25 (6H, br s, H-12, -13), 1.68 (2H, m, H-10), 2.43 (3H, s, H-9), 3.10 (2H, m, H-9), 3.45 (2H, br s, H-7), 5.81 (1H, s, H-5)

실시예 3-4 : 메틸렌- 비스 - 메틸플로로부티로페논 (화합물 4)

methylene-bis-methylphlorobutyrophenone

ESI-MS m/z : 431 [M - H]⁺, 455 [M + Na]⁺

¹H-NMR (400 MHz, acetone-d6) : 0.95 (6H, t, J = 7.2Hz, H-11, -11'), 1.67 (4H, m, H-10, -10'), 1.92 (6H, s, H-12, -12'), 3.10 (4H, m, H-9, -9'), 3.46 (2H, br s, H-7).

< 실시예 4 : 코로나 바이러스의 준비>

CCV(Canine Corona Virus)와 PEDV(porcine epidemic diarrhea virus)는 SPF(Specific-Pathogen Free) 수정란을 호스트(host)로 하여 배양하였다. 각각의 바이러스는 10일령의 SPF 수정란의 요막강(Allantoic Cavity)에 접종하고 2일 후 채독하여 바이러스를 A-72 또는 Vero 세포(host로 사용됨)에 접종하여 5일간 배양하여 원심분리 후 상등액층의 배양액을 항바이러스 활성 측정에 사용하였다. A-72 또는 Vero 세포는 5% FBS(fetal bovine serum)가 포함된 MEM(minimal essential medium)에서 배양 유지되었다. 항바이러스 시험을 위한 바이러스 증식에 사용된 세포는 세포 증식용 용기에서 80%이상 증식된 상태의 것을 사용하였다. 이를 위해, CCV는 A-72 세포에 접종하였으며, PEDV는 VERO 세포에 접종하고 80% CPE(cytopathic effect)가 일어났을 때 배양액을 수거하였다. 수거된 배양액은 원심분리하여 세포 펠렛(cell pellet)을 제거 후 상층액을 사용하여 바이러스 함량을 측정하였다. 바이러스 함량 측정을 위해서는, 5% FBS가 포함된 MEM배지를 이용하여 96웰 플레이트(96 well plate)에 10배씩 단계 희석하여 100㎕씩 분주하였다. 분주된 각 웰(well)에 소화된 각각의 감수성 있는 증식된 세포(A-72 또는 Vero 세포)를 100㎕씩 넣고 5일간 배양하였고, 5일간 배양 후 각 바이러스의 세포 변성 효과(CPE, cytopathic effect)를 관찰하여 총 바이러스 함유량을 확인하였다. 바이러스 함량이 확인된 상층액은 분주 및 동결하여 항바이러스 활성 측정에 사용하였다.

< 실시예 5 : 항바이러스 활성 측정>

항바이러스 활성은 바이러스의 타이터(titer)를 확인(end point titration technique, titer reduction assay)하여 측정하였으며, 시료를 처리하지 않은 대조군과의 바이러스 타이터의 차이를 확인하였다. 타이터의 확인은 96웰 마이크로타이터 플레이트(96-well microtiter plate)에서 한계희석법(limit dilution method)으로 확인하였고(Bulletin Institute Pasteur., 1986, 84, 101~147), 바이러스의 타이터는 바이러스의 세포 감염이 50%가 되는 농도(TCID₅₀/㎖)로서 측정하였다. 이를 위해, 한계희석법으로 바이러스를 희석하여 Vero 혹은 A-72 세포에 접종하였고(CCV는 A-72 세포에 접종하였으며, PEDV는 VERO 세포에 접종), 각각의 시료들을 1시간 후에 처리해 3일 또는 5일 동안 37℃에서 세포배양한 후, 세포의 상태를 현미경으로 확인하였으며, 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

조건	농도 (㎍/㎖)	Virus titer*
조건	농도 (㎍/㎖)	PEDV	CCV
대조군	-	6.0	5.5
Albaspidin-PP (화합물 1)	25	3.5	3.5
Albaspidin-PB (화합물 2)	25	3.5	4.5
Norflavaspidic acid-AB (화합물 3)	25	4.0	2.5
Methylene-bis-methylphlorobutyrophenone (화합물 4)	25	2.5	2.0
*Virus Titer :		Log₁₀TCID₅₀/㎖

상기 표 2를 참고하면, 각각의 추출물 및 화합물들이 25㎍/㎖의 농도에서 바이러스의 복제가 강하게 억제되고, 바이러스에 감염된 세포의 생존률이 증가하는 것으로 확인되었다. 특히 본 발명의 화합물 1~4에 대한 결과를 자세히 확인하면, CCV의 대조군의 타이터는 10^5.5 TCID₅₀/㎖인 반면, 화합물 1~4(25㎍/㎖)의 타이터는 각각 10^3.5, 10^4.5, 10^2.5, 10^2.0 TCID₅₀/㎖였다. PEDV에 대한 결과도 이와 비슷하였는데, 대조군의 타이터는 10^6.0TCID₅₀/㎖이었으며, 화합물 1~4(25㎍/㎖)의 타이터는 각각 10^3.5, 10^3.5, 10^4.0, 10^2.5 TCID₅₀/㎖이었다. 또한, 도 1을 참고하면, 화합물 4가 PEDV와 CCV를 농도의존적으로 저해하고 있음을 확인할 수 있다.

< 실시예 6 : 세포병변효과 회복 어세이 >

VERO 세포에 PEDV를 감염시킨 후, 바이러스에 의한 세포병변이 처리한 화합물 1~4에 의하여 세포가 회복되는 정도를 평가하는 세포병변효과 회복 어세이(cytopathic effect reduction assay, CPE reduction assay)를 수행하였다. CPE는 바이러스 감염으로 인한 세포 모양의 변화(morphological change)를 나타내며, 세포 모양의 퇴행성 변화는 바이러스들의 감염과 관련이 있다(Semin. Neurol., 1999, 19, 113~127 ; J. Virol. Methods, 2002, 106, 71~79).

이를 위해, 우선 96-웰(well) 플레이트에 1×10⁴세포/웰의 밀도로 VERO 세포를 분주하여 5% FBS(fetal bovine serum), 1% PS(penicillin+streptomycin) 및 L-글루타민(L-glutamine, 500㎖ 배지 기준 2㎖ 첨가)을 포함한 DMEM 배양액에서 하루 동안 증식시킨 뒤 배양액을 PBS(phosphate buffer saline) 용액으로 세척하였다. 이후, 감염 배지(infection media:DMEM+0.5% BSA+1㎍/㎖ trypsin)에 PEDV를 50 TCID₅₀/100㎕/well의 농도로 100㎕를 접종한 후 화합물 1~4를 처리하고, 3~5일간 추가적으로 배양하여 바이러스에 의한 세포독성을 측정하였다.

CPE 효과 측정을 위해서는, 배양한지 5일이 지난 후 VERO 세포의 생존여부를 측정하기 위하여 MTT 실험을 실시하였다. MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma M-2128 1G) 시약은 담황색의 기질로서, 살아 있는 세포의 미토콘드리아 내의 호흡 효소에 의해 개열하여 암청색의 포마잔(formazan)을 생성한다. 바이러스의 감염에 의하여 죽은 VERO 세포나 물질 자체의 세포독성 때문에 죽은 세포에서는 MTT 반응이 일어나지 않는다. 따라서 물질자체의 세포독성과 바이러스에 의한 세포독성을 생성한 포마잔을 550nm의 흡광도에서 각각 측정하는 방법을 이용하여 화합물의 효능을 평가 하였다. 즉 화합물에 의한 VERO 세포독성이 없는 화합물의 농도를 구하고, 감염된 돼지 인플루엔자 바이러스에 의한 PEDV 세포의 변성차이를 측정하여, 화합물의 농도에 따른 CPE 효과를 확인하여 도 2에 나타내었다.

도 2A를 참고하면, 세포병변효과 회복 어세이를 수행한 5일 후, 200 TCID₅₀/100㎕의 PEDV에 의해 VERO 세포가 대부분 손상되어 있는 것으로 확인되었으나, 10㎍/㎖의 화합물 1~4를 처리한 PEDV 감염 VERO 세포는 60~95% 내외로 세포 생존이 회복되는 것이 확인되었다. 또한, 도 2B를 참고하면, PEDV 감염 VERO 세포에서의 화합물 4의 농도별 CPE(%)를 확인할 수 있는데, 화합물 4에 대해 농도 의존적으로 강한 항바이러스 활성이 있는 것으로 나타났다. 또한, 상기 화합물 4의 IC₅₀(the half maximal inhibitory concentration)은 1.13±0.18㎍/㎖로 확인되어, 4.43±0.27㎍/㎖의 IC₅₀을 갖는다고 알려진 리바비린(ribavirin, Sigma-Aldrich Co. R9644)보다 항바이러스 활성이 뛰어난 것을 알 수 있었다. 상기 리바비린은 10㎍/㎖의 농도에서 PEDV에 감염된 VERO의 생존률이 80% 정도인 것으로 나타났었다(도 2A 참조). 또한, 세포병변효과 회복 어세이를 수행한 4일 후, 세포의 모양을 현미경을 통해 확인하면, PEDV에 감염된 VERO 세포(도 3B)의 모양이 PEDV 비감염 VERO 세포인 대조군(도 3A)과 확연하게 달라지는 것을 확인할 수 있었으나, 2㎍/㎖의 화합물 3 및 4를 처리한 PEDV에 감염된 VERO 세포(도 3C 및 3D)에서는 대조군과 유사하게 세포 모양이 회복되는 것으로 확인되었다.

< 실시예 7 : 독성실험>

실시예 7-1. 급성독성

관중 메탄올 추출물과 화합물 1~4를 단기간에 과량을 섭취하였을 때의 급성적(24시간 이내)으로 동물 체내에 미치는 독성을 조사하고, 치사율을 결정하기 위하여 본 실험을 수행하였다. 일반적인 마우스인 ICR 마우스를 60마리를 준비하였고, 각 군별로 10마리씩 배정하였다. 대조군에는 30% PEG-400만을 투여하고, 실험군은 관중 메탄올 추출물 및 화합물 1~4를 1.0g/㎏의 농도로 각각 경구 투여하였다. 투여 24시간 후에 각각의 치사율을 조사한 결과, 대조군과 1.0g/㎏ 농도의 관중 에탄올 추출물과 화합물 1~4를 투여한 실험군에서는 모두 생존하였다.

실시예 7-2. 실험군 및 대조군의 장기 및 조직 독성 실험

장기 독성 실험은 C57BL/6J 생쥐를 대상으로 동물의 각 장기(조직)에 미치는 영향을 조사하기 위하여 관중 메탄올 추출물 및 화합물 1~4를 1.0g/㎏의 농도로 1회 투여한 실험군과 용매만을 투여한 대조군의 동물들로부터 8주 후 혈액을 채취하여 GPT(glutamate-pyruvate transferase) 및 BUN(Blood Urea Nitrogen)의 혈액 내 농도를 Select E(Vital Scientific NV, Netherland) 기기를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 간독성과 관계있는 것으로 알려진 GPT와 신장독성과 관계있는 것으로 알려진 BUN의 경우, 대조군과 비교하여 실험군은 별다른 차이를 보이지 않았다. 또한, 각 동물로부터 간과 신장을 절취하여 통상적인 조직절편 제작과정을 거쳐 광학현미경으로 조직학적 관찰을 시행하였으며 특이한 이상이 관찰되지 않았다.

< 사용예 1 : 약학적 제제예 >

1-1. 정제의 제조

본 발명의 관중 메탄올 추출물 200g을 락토오스 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

1-2. 주사액제의 제조

본 발명의 관중 메탄올 추출물 1g, 염화나트륨 0.6g 및 아스코르브산 0.1g을 증류수에 용해시켜서 100㎖를 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.

< 사용예 2 : 식품 제조예 >

2-1. 조리용 양념의 제조

본 발명의 관중 메탄올 추출물을 0.2~10 중량%로 조리용 양념에 첨가하여 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.

2-2. 밀가루 식품의 제조

본 발명의 관중 메탄올 추출물을 0.1~5.0 중량%로 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

2-3. 스프 및 육즙( gravies )의 제조

본 발명의 관중 메탄올 추출물을 0.1~1.0 중량%로 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.

2-4. 유제품( dairy products )의 제조

본 발명의 관중 메탄올 추출물을 0.1~1.0 중량%로 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

< 사용예 3 : 음료 제조예 >

3-1. 야채주스 제조

본 발명의 관중 메탄올 추출물 0.5g을 토마토 또는 당근 주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 야채주스를 제조하였다.

3-2. 과일주스 제조

본 발명의 관중 메탄올 추출물 0.1g을 사과 또는 포도 주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 과일주스를 제조하였다.

< 사용예 4 : 사료첨가제 제조예 >

본 발명의 관중 메탄올 추출물 10.0g을 사료용 부형제 50.0g과 섞어 사료첨가제를 제조하였다. 그러나, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 사료 조성물 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하여 제조에 사용할 수 있다.

< 사용예 5 : 소독물의 제조예 >

본 발명의 관중 메탄올 추출물 또는 이로부터 분리된 플로로글루시놀 유도체 화합물 3.0g을 첨가한 후 정제수를 1,000㎖에 가하여 무방부제용 천연 소독제를 제조하였다.

Claims

하기 화학식 1의 알바스피딘-PP(albaspidin-PP, 화합물 1), 알바스피딘-PB (albaspidin-PB, 화합물 2), 노르플라바스피딘산-AB(norflavaspidic acid-AB, 화합물 3) 및 메틸렌-비스-메틸플로로부티로페논(methylene-bis-methylphlorobutyrophenone, 화합물 4)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 플로로글루시놀(phloroglucinol) 유도체 화합물이 포함된 관중 추출물을 함유하는 코로나 바이러스 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
[화학식 1]
제1항에 있어서,
상기 관중(Dryopteris crassirhizoma) 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4개의 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름 또는 이들의 혼합용매로 추출하여 제조하는 것을 특징으로 하는 코로나 바이러스 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 코로나 바이러스 관련 질환은 감기 또는 장염인 것을 특징으로 하는 코로나 바이러스 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
하기 화학식 1의 알바스피딘-PP(albaspidin-PP, 화합물 1), 알바스피딘-PB (albaspidin-PB, 화합물 2), 노르플라바스피딘산-AB(norflavaspidic acid-AB, 화합물 3) 및 메틸렌-비스-메틸플로로부티로페논(methylene-bis-methylphlorobutyrophenone, 화합물 4)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 플로로글루시놀(phloroglucinol) 유도체 화합물이 포함된 관중 추출물을 함유하는 코로나 바이러스 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
[화학식 1]
제4항에 있어서,
상기 관중(Dryopteris crassirhizoma) 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4개의 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름 또는 이들의 혼합용매로 추출하여 제조하는 것을 특징으로 하는 코로나 바이러스 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
제4항에 있어서,
상기 코로나 바이러스 관련 질환은 감기 또는 장염인 것을 특징으로 하는 코로나 바이러스 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
하기 화학식 1의 알바스피딘-PP(albaspidin-PP, 화합물 1), 알바스피딘-PB (albaspidin-PB, 화합물 2), 노르플라바스피딘산-AB(norflavaspidic acid-AB, 화합물 3) 및 메틸렌-비스-메틸플로로부티로페논(methylene-bis-methylphlorobutyrophenone, 화합물 4)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 플로로글루시놀 유도체 화합물을 함유하는 코로나 바이러스 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
[화학식 1]
제7항에 있어서,
상기 코로나 바이러스 관련 질환은 감기 또는 장염인 것을 특징으로 하는 코로나 바이러스 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
하기 화학식 1의 알바스피딘-PP(albaspidin-PP, 화합물 1), 알바스피딘-PB (albaspidin-PB, 화합물 2), 노르플라바스피딘산-AB(norflavaspidic acid-AB, 화합물 3) 및 메틸렌-비스-메틸플로로부티로페논(methylene-bis-methylphlorobutyrophenone, 화합물 4)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 플로로글루시놀(phloroglucinol) 유도체 화합물이 포함된 코로나 바이러스 관련 질환의 예방 또는 치료용 동물 약품.
[화학식 1]
하기 화학식 1의 알바스피딘-PP(albaspidin-PP, 화합물 1), 알바스피딘-PB (albaspidin-PB, 화합물 2), 노르플라바스피딘산-AB(norflavaspidic acid-AB, 화합물 3) 및 메틸렌-비스-메틸플로로부티로페논(methylene-bis-methylphlorobutyrophenone, 화합물 4)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 플로로글루시놀(phloroglucinol) 유도체 화합물이 포함된 코로나 바이러스 관련 질환의 예방 또는 개선용 동물 사료 첨가제.
[화학식 1]
하기 화학식 1의 알바스피딘-PP(albaspidin-PP, 화합물 1), 알바스피딘-PB (albaspidin-PB, 화합물 2), 노르플라바스피딘산-AB(norflavaspidic acid-AB, 화합물 3) 및 메틸렌-비스-메틸플로로부티로페논(methylene-bis-methylphlorobutyrophenone, 화합물 4)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 플로로글루시놀(phloroglucinol) 유도체 화합물이 포함된 코로나 바이러스 관련 질환의 예방 또는 개선용 소독제.
[화학식 1]