JP2016065037A

JP2016065037A - 抗ウイルス剤の製法及び該製法によって得られた抗ウイルス剤

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Publication number: JP2016065037A
Application number: JP2015110250A
Authority: JP
Inventors: 孝行小松; Takayuki Komatsu; 剛志杉山; Tsuyoshi Sugiyama; 伸夫森; Nobuo Mori; 修末野; Osamu Sueno; 亮鷲見; Akira Washimi
Original assignee: Nikken Sohonsha Corp
Current assignee: Nikken Sohonsha Corp
Priority date: 2014-09-17
Filing date: 2015-05-29
Publication date: 2016-04-28

Abstract

【課題】脂質の残存量が少なく、新型及び季節性のヒトインフルエンザウイルスやコロナウイルス及びノロウイルスに対して、抗ウイルス活性と免疫活性とが強化された、微細藻類から得られる抗ウイルス剤の製造方法及び該方法により得られる抗ウイルス剤の提供。【解決手段】上記ウイルスに対する高められた抗ウイルス活性を有する抗ウイルス剤の製法であって、微細藻類のコッコミクサ又はクロレラと、ベンゼン：メタノール（２：１）若しくは、エタノール、アセトン、ヘキサンからなる揮発性溶剤とを一緒にして超音波振とう、高圧ホモジナイズ、羽根攪拌のうち一つ又は複数を組み合わせて遠心分離を行なう脱脂操作を複数回行なう工程と、脱脂工程後に所要量の水を加え所要時間に亘って加熱し熱湯抽出する工程と、熱湯抽出物を遠心分離により固液分離した液層を濃縮し乾燥する工程とからなる抗ウイルス剤の製法。【選択図】なし

Description

本発明は、コッコミクサ藻体または緑藻類のクロレラより抽出した多糖体を用いて、ヒトインフルエンザウイルスやコロナウイルス等のエンベロープを有するウイルスに抗ウイルス活性を有する抗ウイルス剤の製法及び該製法によって得られた抗ウイルス剤に関するものである。

この種のコッコミクサ藻体より抽出した抗ウイルス剤としては、同一出願人に係る発明が公知になっている。この公知の抗ウイルス剤の抽出に用いたコッコミクサ藻体は、緑色植物門（Chlorophyta）、緑藻綱（Chlorophyceae）、クロロコッカム目（Chlorococcales）、クロロコッカム科（Chlorococcaceae）に属するコッコミクサ・ミノール（Coccomyxa minor）又はコッコミクサ・グロエオボトリディフォルミス（Coccomyxa gloeobotrydiformis）とする乾燥したコッコミクサ藻体にイオン交換水を加え、還流下で加熱抽出を行って得た抽出液を遠心分離し、上清を減圧濃縮して抽出物（ＣＥ）を得て、該抽出物を蒸留水による溶出画分し、および、蒸留水による溶出後の無機塩溶液による溶出画分した多糖体画分（ＣＥ−１、ＣＥ−２、ＣＥ−３）を有効成分とするものである（特許文献１）。

そして、この抗ウイルス剤は、Ｒｉｂ（リボース）、Ｇａｌ（ガラクトース）、Ｇｕｌ（グルコース）、Ｒｈａ（ラムノース）が主たる成分になっており、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトコロナウイルス等のＲＮＡ型ウイルスを主とし、ＤＮＡ型ウイルスに対しても高い抗ウイルス活性を示すというものである。

また、緑藻類のクロレラまたはコッコミクサ藻体から抽出した酸性多糖よりなる抗癌性物質も公知になっている。微細藻類から酸性多糖を抽出するには、微細藻類を熱水に懸濁して抽出処理し、遠心分離によりエキス分とウエットストラッジに分離し、ウエットストラッジに水を加えて撹拌しながら、アルカリ性基材によりｐＨを１０以上に調整してエキス分を抽出し、このエキス分を遠心分離し、分離したエキス分を撹拌しながらｐＨを３〜４に調整して酸性多糖の沈殿物を析出させて得られるものである（特許文献２）。

この酸性多糖よりなる抗癌性物質をマウスに投与して実験したところ、免疫の初期活性として、マクロファージ活性を有意に示し、中性多糖より活性能があることが明らかになり、また、マウスにＭＮＵ単独経口投与により３０週で前胃偏平上皮癌の発生が見られたが、酸性多糖の抗癌性物質を投与することによって前胃偏平上皮癌の抑制効果が明らかになったとしている。

特開２００６−２４７７５７号公報特開２００１−２８８１０２号公報

前記公知例の抗ウイルス剤においては、イオン交換水を加えて加熱抽出した抽出物を蒸留水で溶出画分を行ったもの、さらにその溶出したものを無機塩溶液で溶出画分したものであるが、加熱抽出時に得られる抽出物は、遠心分離した上清を減圧濃縮して得た抽出物であって、リボース、ガラクトース、グルコース、ラムノースが主たる成分になっており、脂質の除去を行っていないので高純度とはえいないのである。

また、前記酸性多糖よりなる抗癌性物質は、その成分については明確にしていないが、この種の微細藻類に含まれる多糖類はβ−グルカンが多いが、このβ−グルカンは、熱水で抽出される中性多糖であり、これには酸性多糖はほとんど含まれていないとしている。そのために、最初に９０℃の熱水で抽出処理して中性可溶画分を除外し、次に７０℃の熱水で撹拌処理しアルカリ性に調整してエキス分を抽出して分離し、分離したエキス分を別のタンクに移して撹拌しながら１Ｎ塩酸でｐＨ４調整して酸性多糖の析出を起こさせ、析出した酸性多糖を回収するというものであり、その成分は不明であるが、あくまでも抗癌性物質の範囲である。

従って、公知の技術は熱水による抽出物が主体であるが、何故か新型及び季節性のヒトインフルエンザウイルスやコロナウイルス等のエンベロープを有するウイルスに対して、抗ウイルス活性を強化する効果が弱いので、その効果を高めること、即ち、不純物を取り除いて高純度の抽出物にすることに解決課題を有している。

本発明者等は、種々研究の結果、微細藻類のコッコミクサおよびクロレラより抽出された多糖体画分を有効成分とするものであるが、抽出の仕方によって抽出物の成分の相違と高純度にすること、および両者をミックスすることによって、抗ウイルス活性と免疫活性とを向上させる相乗効果を見出して本発明を完成するに至った。

本発明の第１の発明に係る抗ウイルス剤の製法は、エンベロープを有するＡ型ヒトインフルエンザウイルスやコロナウイルス、及びノロウイルスに対する抗ウイルス活性を有する抗ウイルス剤の製法であって、微細藻類のコッコミクサおよびクロレラを、ベンゼン：メタノール（２：１）もしくは、エタノール、アセトン、ヘキサンからなる揮発性溶剤を一緒にして超音波振とう、高圧ホモジナイズ、羽根攪拌のうち一つまたは複数を組み合わせて遠心分離を行なう脱脂操作を複数回行なう工程と、脱脂工程後に所要量の水を加え所要時間に亘って加熱し熱湯抽出する工程と、熱湯抽出物を遠心分離により固液分離した液層を濃縮し乾燥する工程とにより得られた多糖体からなることを特徴とするものである。

さらに、もう１つの抗ウイルス剤の製法は、前記第１の発明において、固液分離された固層に所要量の水と所要のアルカリ溶液とを加えてアルカリ性に調整し撹拌して抽出を行なう工程と、抽出を行なった後に遠心分離にて固液を分離して液層を回収する工程と、回収した液層に所要の酸性溶液を加えて酸性に調整し所要時間静置して沈殿物を生成させる工程と、該沈殿物を遠心分離して固形物として回収すると共に、回収された固形物の複数回洗浄操作を行なう工程と、洗浄後の沈殿物を凍結乾燥させる工程とからなることを特徴とするものである。

本発明の第２の発明に係る抗ウイルス剤は、前記請求項１乃至２のいずれかによって得られた微細藻類のコッコミクサまたはクロレラより抽出された多糖体画分を有効成分とするものであって、該有効成分中の大半の脂質が除去されたものであり、少なくとも新型（２００９年新型）及び季節性のＡ型ヒトインフルエンザウイルスやコロナウイルス等のエンベロープを有するＲＮＡウイルス、及びノロウイルスに対する抗ウイルス活性と免疫活性とを有することを特徴とするものである。

前記第２の発明に係る抗ウイルス剤は、前記コッコミクサ及びクロレラ多糖体を所要比率で配合したこと、を付加的な構成要件として含むものである。

本発明に係る製法の発明は、揮発性溶剤を使用して超音波振とう、高圧ホモジナイズ、羽根攪拌等のうち一つまたは複数の組み合わせを行うことによって、成分中の脂質を除去し易くすると共に、繰り返しの脂質除去工程を行うことによって大半の脂質が除去できるのであり、純度の高い抽出物を得ることができ、新型及び季節性のＡ型ヒトインフルエンザウイルスやコロナウイルス等のエンベロープを有するウイルスに対する高い抗ウイルス活性を有するので、例えば、健康食品の補助剤または飼料、医薬品、或いは消毒剤として使用できるという優れた効果を奏する。

更に、本発明に係る抗ウイルス剤は、微細藻類のコッコミクサまたはクロレラより抽出された多糖体画分を有効成分とするものであって、両者を所要比率で配合することにより、新型及び季節性のＡ型ヒトインフルエンザウイルスやコロナウイルス等のエンベロープを有するウイルスまたはエンベロープを有しないノロウイルスに対する高い抗ウイルス活性と免疫活性とを有するという優れた効果を奏する。

（１）図は、本発明に係るコッコミクサ多糖体の試験において、赤血球凝集試験の手順を示す説明図であり、（２）図は赤血球凝集試験の原理を解り易く略示的に示した説明図である。本発明に係るコッコミクサ多糖体の細胞毒性（傷害性）試験において、高濃度の範囲まで細胞毒性（傷害性）が全くないことを示すグラフである。本発明に係るコッコミクサ多糖体の試験に供した新型インフルエンザおよび現在流行中の季節性インフルエンザそれぞれのウイルス株に対する増殖阻害効果を示したグラフである。ヒトＡ型インフルエンザウイルスの全て（３つ）の亜型への有効性を検討するために、３種類の古典的インフルエンザウイルス株を使用し、コッコミクサ多糖体の増殖阻害効果を調べたグラフである。本発明に係るコッコミクサ多糖体の試験に供した一般的に風邪と言われるパラインフルエンザウイルス増殖抑制評価を示すグラフである。本発明に係るコッコミクサ多糖体の添加時間による抗ウイルス効果への影響を調べるために、ウイルス感染過程の様々な時間に抗ウイルス剤を添加した、その添加、存在時間を示した図である。同コッコミクサ多糖体の添加、存在時間による抗ウイルス効果への影響をＭＤＣＫ細胞の細胞傷害度で評価したグラフである。同コッコミクサ多糖体の添加、存在時間による抗ウイルス効果への影響を生成ウイルス量、即ちＨＡテストで評価したグラフである。同コッコミクサ多糖体の濃度による動物（マウス）パラインフルエンザウイルス増殖抑制率評価を示すグラフである。同コッコミクサ多糖体に係るマウス鼻腔内噴射による動物パラインフルエンザの肺感染炎症抑制評価を示すグラフである。同コッコミクサ多糖体とインフルエンザウイルスの相互作用によるＨＡ活性の阻害機序を解り易く示した説明図である。インフルエンザワクチン、既存の抗ウイルス剤の阻害機序を解り易く模擬的に示した説明図である。同コッコミクサ多糖体における動物（マウス）ノロウイルス増殖抑制評価を示すグラフである。本発明に係るクロレラ多糖体による、（Ａ）はＴＬＲ２を介した活性試験結果と、（Ｂ）はＴＬＲ４を介した活性試験とを示すグラフである。同クロレラ多糖体と自然免疫受容体リガンドと、（Ａ）はＴＦＮ−αの比較し、（Ｂ）はＩＬ−６の比較例をそれぞれ示したグラフである。同クロレラ多糖体と自然免疫受容体リガンドとのＮＯ産生誘導を比較したグラフである。

本発明に係る抗ウイルス剤の原料としては、微細藻類の一種である乾燥したコッコミクサ藻体または緑藻類のクロレラが用いられる。なお、抽出の仕方や処理においては両者とも同じに行うので、その一方の藻体について説明する。
この乾燥したコッコミクサ藻体を揮発性の溶剤と一緒に超音波振とう、高圧ホモジナイズ、羽根攪拌等のうち一つまたは複数を組み合わせて遠心分離を行なうと共に、この操作を複数回行って大半の脂質を脱脂し、その後、所要時間に亘り熱湯抽出し、該熱湯抽出物を遠心分離により固液分離し、分離した液層を濃縮し凍結乾燥して第１の発明に係る中性の熱水抽出物を得る。

さらに、上記分離して得られた固層に所要量の水を加え、アルカリ性に調整し所要時間撹拌して抽出を行ない、遠心分離にて液層を回収し、該回収した液層を酸性に調整し低温にて所要時間静置して沈殿物を生成させ、該沈殿物を遠心分離して固形物として回収し、複数回の洗浄操作を行なって、もう１つの実施の形態に係るアルカリ抽出物を得る。得られた抽出物は揮発性溶剤で複数回の脱脂操作を行った後、凍結乾燥するものである。

［実施例等］
次に、実施例及び試験例により本発明を更に詳細に且つ具体的に説明する。
[コッコミクサまたはクロレラの水溶性多糖体の抽出方法]
乾燥したコッコミクサ藻体（または緑藻類のクロレラ）２ｇに１００ｍｌのベンゼン：メタノール（２：１）からなる揮発性溶剤を入れ、超音波処理を１０分行った後、５０℃に加温した状態で３時間振とう及び遠心分離を行なった後に、同様の揮発性溶剤、即ち、ベンゼン：メタノール（２：１）を１００ｍｌ入れて脱脂操作を少なくとも３回繰り返して行ない、遠心分離により溶剤を除去する。
この脱脂後のパウダー状になったものに１００ｍｌの水を加え、９０℃に加熱して３時間撹拌抽出した。所要時間保冷後に遠心分離（３０００ｒｐｍ）を行って固液分離した。分離して回収した液層は濃縮し、該濃縮液を凍結乾燥して中性多糖体(推定)の乾燥粉末を得た。コッコミクサ多糖類であるＣoccomyxa Ｐolysaccharidesまたはクロレラ多糖類であるＣhlorella Ｐolysaccharides（ＣｍＰＳ)は、中性多糖体（ＮＰＳ）及び酸性多糖体（ＡＰＳ）が確認されており、特に、中性多糖体（ＮＰＳ）はヘルペスウイルス、コロナウイルス、ＨＩＶの増殖抑制効果が確認されている。そして、乾燥粉末の中性多糖体、つまり、コッコミクサまたはクロレラから略０．２６ｇの熱水抽出物（ＣｍＮＥ）を得た。
凍結乾燥物をＰＢＳに溶解し、除タンパク及び脂質除去を行なった後透析チューブにて透析し、透析チューブ内試料を凍結乾燥した。
なお、複数回の脱脂処理を行うことによって有効成分中の大半の脂質が除去される。

[コッコミクサまたはクロレラのアルカリ抽出多糖体の抽出方法]
前記水溶性多糖体の抽出工程で遠心分離後に得られた固層（含水率７５％）に水１Ｌを加え、所要のアルカリ溶液、例えば、１０％ＫＯＨにてｐＨ９〜１１に調整した。調整した液を６０℃に加温して３０分間撹拌抽出を行なった。所要時間保冷後に遠心分離（１５０００ｒｐｍ）し液層を回収した。回収した液に所要の酸性溶液、例えば、１０％ＨＣｌを添加しｐＨ４に調整し浮遊物を確認した後、沈殿物を得るために４℃で１２時間静置した。沈殿物は遠心分離（１５０００ｒｐｍ）し固形物として回収した。この固形物の回収操作、即ち、加水、撹拌洗浄、遠心分離を３回繰り返して得られた洗浄後の沈殿物を凍結乾燥し、酸性多糖体（推定）を得た。つまり、コッコミクサまたはクロレラから略０．１ｇのアルカリ抽出物（ＣｍＡＥ）を得た。
その後、凍結乾燥物をＰＢＳに溶解し、除タンパク及び脂質除去を行なった後透析チューブにて透析し、透析チューブ内試料を凍結乾燥した。
乾燥物を、Ｔｒｉｓ-ＨＣｌに懸濁し、クロロホルム：メタノールで脱脂処理を行った後、ＤＥＡＥカラムにて分画処理した。
抽出物の有効成分は、コッコミクサから得られた多糖体は、ラムノース、ガラクトース、マンノース、グルコース、キシロース、Ｎ-アセチルグルコサミン、フコース等であり、少量のリボースを含む脱脂された純度の高い多糖体である。
また、クロレラから得られた多糖体は、ラムノース、ガラクトース、マンノース、グルコース、Ｎ-アセチルグルコサミン、アラビノース、リボース等である。

抽出されたクロレラ多糖体（CmPS）は、自然免疫活性の働きを有し、コッコミクサ多糖体及びクロレラ多糖体は、抗ウイルス作用（活性）を有するため、コッコミクサ多糖体とクロレラ多糖体とをミックス（混合）することにより、両者の糖組成における特性を生かした相乗効果によって免疫活性と抗ウイルス作用（活性）とを増強させることができたのである。
そこで、コッコミクサ多糖体の特性である抗ウイルス作用と、クロレラ多糖体の特性である免疫活性とについて説明する。

[試験]
検体として、まず、本発明で得たコッコミクサ抽出物（ＣｍＡＥ）を用いて、抗インフルエンザウイルス活性を検証した。そのアルカリ抽出物をＤＰＢＳ（-）で高濃度（１０ｍｇ／ｍｌ）溶液を調整し、該溶液を段階的に希釈することで試験した。

ウイルス株について：
試験のために入手したＡ型ヒトインフルエンザウイルス（ＩＦＶ）については、第１グループとして、2009年新型及び現在流行中の季節性インフルエンザウイルスと、第２グループとして過去に流行した季節性インフルエンザウイルスとに分けられる。
第１グループ：
Ａ/Ｃalifornia/０７/２００９(Ｈ1Ｎ1)pdm : Ｈ1Ｎ1亜型（２００９年新型）
Ａ/Ｎarita/１/２００９(Ｈ1Ｎ1)pdm : Ｈ1Ｎ1亜型（２００９年新型）
Ａ/Ｂrisbane/５９/２００７(Ｈ1Ｎ1) : Ｈ1Ｎ1亜型（流行中の季節性）
Ａ/Ｕruguai/７１６/２００７(Ｈ3Ｎ2) : Ｈ3Ｎ2亜型（流行中の季節性）
第２グループ：
1）Ａ/ＷＳＮ/１９３３/Ｈ1Ｎ1 : Ｈ1Ｎ1亜型（古典的な季節性）
2）Ａ/ＵＳＳＲ/１９７７/Ｈ1Ｎ1 : Ｈ1Ｎ1亜型（古典的な季節性）
3）Ａ/Ａdachi/１９５７/Ｈ2Ｎ2 : Ｈ2Ｎ2亜型（古典的な季節性）
4) Ａ/Ａichi/１９６８/Ｈ3Ｎ2 : Ｈ3Ｎ2亜型（古典的な季節性）

細胞株として：
インフルエンザウイルス（ＩＦＶ）の感染実験で繁用される成犬の腎臓から樹立された上皮様細胞株であるＭＤＣＫ（Mardin-Darby canine kindney ）細胞と、マウス肺によるパラインフルエンザウイルスに対するin vitro評価を行った。使用した犬の腎臓細胞は１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ液体培地で３７℃、５％ＣＯ_２で継代培養したものを使用し、マウス肺については、１匹分の肺を１ｍｌの培養液ＭＥＭに懸濁後ホモジナイザーにて粉砕し、感染価を評価した。
また、インフルエンザと同様に集団感染が問題となり、食中毒型風邪ウイルスと言われるノロウイルスに対する有用性の評価についても検討した。

細胞傷害性試験：
ＭＤＣＫ細胞を９６well plate（ウェルプレート）へ播種し、１２時間培養して細胞を吸着させた後、新鮮なＭＥＭ−１０％ＦＢＳに培地交換した。その際、高濃度に調整したアルカリ抽出物の溶液を各終濃度になるように添加した。溶液添加後、３７℃の５％ＣＯ_２インキュベーターで４８時間培養した時点で終濃度５００μｇ／ｍｌとなるようＭＴＴを添加し、同条件のインキュベーター内で３時間培養し色素を取り込ませた。その後、色素を含む培地を取り除き、ＤＭＳＯ（１００μｌ／well）を加え沈殿を溶解し５７０ｎｍの吸光度を測定した。予め作成しておいた検量線を元に細胞のviabiltyを決定した。

抗ウイルス活性の測定：
４８well plate(ウェルプレート) に培養したＭＤＣＫ細胞を前記アルカリ抽出物の溶液（１０−２０００μｇ／ｍｌ）で２時間処理後、６ＰＦＵ（プラーク形成単位）／細胞でインフルエンザウイルスを感染させ、感染４８時間後に収穫した。ウイルス量は鶏赤血球凝集試験（ＨＡ test）にて測定し、赤血球濃度からウイルス粒子数を換算し、増殖阻止活性を評価した。

赤血球凝集試験（ＨＡ test）の手順：
図１（1）に示したように、９６ウェルを１２列８行（Ａ〜Ｈ）に整列して並べて、
各ウェルに生理食塩水を５０μｌずつ添加する。
前記第１と第２グループの８種類の各ウイルスサンプル液５０μｌを採って、第１列Ａから順にＨ行まで添加する。第１列のウェルＡ〜Ｈだけが計１００μｌとなる。
２倍段階希釈：第１列の各ウェルの溶液をピペッティングにより混和した後、５０μｌだけ吸い取り、これを次の第２列のウェルに加える。第２列のウェルが１００μｌになるが、第１列と同様にピペッティングで混和した後、５０μｌだけ吸い取りこれを次の第３列のウェルに加える。この操作を第３列以降のウェルについても順次行うことにより、２倍段階希釈列を作成する。
１％鶏赤血球を５０μｌずつ第１２列から第１列まで加える。ＡからＨ行全てについて行なう。
血球凝集を起こしたサンプル希釈液の最大希釈倍数をもってそのサンプル原液のＨＡ価（血球凝集価）とする。

赤血球凝集試験（ＨＡ test）の原理については、図１（2）に示したように、赤血球の数とウイルスの数とによって、赤血球が凝集する状態を理解し易いように示したものであり、第７列目まではウイルスの数が勝って凝集しており、第８列目も赤血球の数とウイルスの数とが同数でかろうじて凝集し、第９列目以降は赤血球の数が多いので凝集しないことを示している。そして、結果の解釈としては、次のとおりである。
ＨＡ価（血球凝集価）：血球凝集を起こしたサンプル希釈液の最大希釈倍数をもってそのサンプル原液のＨＡ価とする。
即ち、上記のＨＡ価は、２^８＝２５６となる。
１％ｃＲＢＣ＝（１×１０^７ cells／ml）を使用して上記結果を得た場合、サンプル原液のウイルス濃度は、２^８×（１×１０^７）＝２５６×１０^７＝２．６×１０^９粒子／mlとなる。

前記細胞傷害試験において、アルカリ抽出物（ＣｍＡＥ）は、図２に示したように、４０００μｇ／ｍｌまで全く細胞毒性を示さなかった。また、熱水抽出物（ＣｍＮＥ）についても同様の試験（データは示していない）を行なったが、アルカリ抽出物と同様に細胞毒性は無かった。

また、アルカリ抽出物（ＣｍＡＥ）は、図３及び図４に示したように、第１及び第２グループの各ヒトインフルエンザウイルス（ＩＦＶ）に対して、１０μｇ／ｍｌ以上で有意な抗ウイルス活性を示し、１００μｇ／ｍｌ以上で未処理の１／１００以下にウイルス増殖を抑制したことが明確になった。また、熱水抽出物（ＣｍＮＥ）についてもほぼ同等の抗ウイルス活性（データは示していない）が認められた。
さらに、ＮＰＳ及びＡＰＳのマウスパラインフルエンザウイルス（ＳｅＶ）に対する抗ウイルス効果を評価した結果は、図５に示したように、１００μｇ／ｍｌ以上で有意なウイルス増殖抑制が認められた。なお、ＣｍＰＳ１００μｇ／ｍｌのウイルス増殖抑制は、国際単位のＩＦＮ−α、１０IＵ／ｍｌに相当する。

さらに、アルカリ抽出物（ＣｍＡＥ）の抗ウイルス効果の作用機序を調べるために、抽出物の添加時間（time of addition）のウイルス増殖への影響を次のI〜Vに従って調べた。
I. ＭＤＣＫ細胞をＣｍＡＥでウイルス感染前に３時間処理した場合。
II. ウイルス感染中のみにＣｍＡＥが培地中に存在した場合。
III. ウイルス感染中から４８時間後にＣｍＡＥが存在した場合。
IV. 感染処理後３時間以降にＣｍＡＥが培地中に存在した場合。
V. 感染処理後６時間以降にＣｍＡＥが倍地中に存在した場合。

図６は、ウイルス感染に対するＣｍＡＥの添加時間による有効性を示したもので、ウイルス感染時を-1hpiとした場合（-1hpiで吸着開始し0hpiで侵入開始）に、I．感染3時間前に添加し感染時に除去、II．感染時に添加し１時間後に除去、III．感染時に添加しその後ずっと存在、IV．感染4時間後に添加しその後ずっと存在、V．感染7時間後に添加しその後ずっと存在、の条件で実験した。そして、ＩＦＶの増殖過程をＭＤＣＫ細胞の細胞障害度、つまり、ウイルスの細胞傷害活性で評価したところ、図７に示したように、ウイルスの侵入時にアルカリ抽出物が存在することによって、血球（細胞）へのウイルス吸着がなされないこと、即ち、抗ウイルス活性を示すことが明らかになった。

次に、ＨＡテストでアルカリ抽出物の添加時間におけるウイルス増殖への影響を培養液中に回収されるウイルス量で評価したところ、図７に示したように、前記II．とIII．のウイルス吸着、ウイルス侵入時に加えて、前記IV．とV．のウイルス吸着及びウイルス侵入後であっても、アルカリ抽出物が存在することによって、ウイルスの増殖が抑制され続け、回収時まで存在しているとその間抗ウイルス効果を示すことが判明した。

図７と図８の結果の相違はＣｍＡＥに赤血球凝集を抑制する効果があると推定されたので、アルカリ抽出物のインフルエンザウイルス（ＩＦＶ）の鶏赤血球凝集活性（ＨＡ活性）への影響を調べたところ、鶏赤血球（ｃＲＢＣ）とＩＦＶを混合する際に、ＣｍＡＥを添加すると濃度依存性にインフルエンザウイルスの鶏赤血球凝集活性を抑制することが明らかになった。

また、同様にマウスモデルでの増殖抑制評価を行った。
細胞評価において、ＣｍＰＳがウイルスと同時に存在し接触していることが重要と考えられるため、ウイルス感染前にウイルス懸濁液と混和させてから経鼻摂取した。試験試料は、微細藻類のコッコミクサを熱水にて抽出した抽出液を乾燥させた粉末ＮＰＳをデキストランにて１０％及び１％に調整した。供試ウイルスは、mouse parainfluenza virus type1 Z strain 別名Sendai Virus type1 Z（ＳｅＶ）を用い、供試マウスは、３週齢ＩＣＲ雄マウスを１群３〜４匹に群分けして用いた。ＳｅＶ懸濁液５００μｌ（２×１０^７感染ウイルス粒子）と、ＮＰＳ２ｍｇ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．０２ｍｇ／ｍｌ溶液５００μｌとを混和し、室温に３０分間放置後、５０μｌ（１×１０^６ウイルス粒子相当）をマウスに経鼻摂取させた。

試験群は、次のＡ〜Ｆの６群に分け、ＮＰＳ濃度におけるウイルス増殖率を観察した。
Ａ：ＳｅＶ＋ＰＢＳ
Ｂ：ＳｅＶ＋ＮＰＳ５０μｇ（１ｍｇ／ｍｌＮＰＳ）
Ｃ：ＳｅＶ＋ＮＰＳ５μｇ（０．１ｍｇ／ｍｌＮＰＳ）
Ｄ：ＳｅＶ＋ＮＰＳ０．５μｇ（０．０１ｍｇ／ｍｌＮＰＳ）
Ｅ：１ｍｇ／ｍｌＮＰＳ
Ｆ：ＰＢＳ
感染３日後にマウス肺を摘出し、１匹分の肺を１ｍｌの培養液ＭＥＭに懸濁後ホモジナイザーにて粉砕し、感染価を評価した。

結果として、図９に示したように、１×１０^６のウイルスをマウスに経鼻感染させ、ＮＰＳの有無及び濃度による感染の減少で評価すると、ＳｅＶ＋ＮＰＳ５０μｇ摂取群は、ＳｅＶ＋ＰＢＳと比較して１／１００に減少することを示した。また、ＮＰＳ５μｇ摂取群では約１／５に減少したが、ＮＰＳ０．５μｇでは有効性が見られなかった。さらに、図１０に示したように、肺の炎症の重症度もＳＥＶの増殖程度に相関していた。そして、ＮＰＳのみの経鼻摂取においての肺の炎症は見られなかった。
これらの結果により、ＮＰＳは肺への炎症性がなく、濃度依存的にＳｅＶの感染及び増殖を抑制する働きがあることが確認された。

図１１は、ＣｍＰＳまたはＣｍＡＥの赤血球凝集抑制機構の推定図であって、ＩＦＶは自身のＨＡ蛋白質によって鶏赤血球（ｃＲＢＣ）表面のシアロ糖鎖と次々に結合しＩＦＶ−ｃＲＢＣネットワークを形成することによって赤血球凝集を起こすのである。しかし、その際に、ＣｍＡＥが存在するとＩＦＶとｃＲＢＣの相互作用を何らかの要因でネットワーク形成を阻害するために赤血球凝集を抑制すると考えられる。

一般に、インフルエンザウイルス（ＩＦＶ）は、図１２に示すように、自身のＨＡ（赤血球凝集素）タンパク質によって、動物細胞表面のシアロ糖鎖と結合して細胞に吸着後、細胞内に侵入して増殖を開始する。この活性は鶏赤血球（ｃＲＢＣ）においては、インフルエンザウイルスと鶏赤血球との凝集体（集合体）を形成する鶏赤血球凝集活性（ＨＡ活性）に置き換えられると推定される。つまり、抗ウイルス剤は、ＩＦＶが受容体に結合し細胞に吸着・侵入する過程を阻害し抗ウイルス効果を発揮すると考えられる。

今回の実験結果からして、ＣｍＰＳまたはＣｍＡＥの有する赤血球凝集抑制効果から、ＣｍＡＥの抗ウイルス効果はＩＦＶのＨＡ蛋白質と細胞のシアロ糖鎖の相互作用を何らかの機構で阻害するために細胞内へのエントリーを阻止することによって発揮されたと考えられる。

以上の結果から、ＣｍＰＳまたはＣｍＡＥが予め存在すれば、ＩＦＶの細胞への侵入を阻止できるし、ＩＦＶの増殖時に存在しても、放出された仔ウイルスの新たな未感染細胞への感染を阻止できるため、予防・治療の両方に使用可能であると考えられる。

さらに、微細藻類のコッコミクサからの抽出物（ＣｍＰＳ）がノロウイルスに対する有用性の評価について、気道や呼吸器以外で腸に感染し、未だに各種薬剤に対する効果が十分見られていない食中毒型風邪ウイルスに対する有用性を検討するために、マウスノロウイルス（ＭＮＶ）感染に対する増殖抑制効果の検討を行った。
ヒトノロウイルス（ＨｕＮｏＶ）に形態学的にも遺伝学的にも類似し細胞培養が可能なウイルスの中で、ＨｕＮｏＶに最も近縁なウイルスであることから、代替えウイルスとして注目を集めているマウスノロウイルスを用いてＮＰＳのウイルス増殖抑制効果を評価した。
供試ウイルスは、マウスノロウイルス（ＭＮＶ：ＡＴＣＣ）を用い、培養細胞はＲＡＷ２６４．７細胞を用いた。

９６穴プレートに１０^４Ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、３７℃にて３時間培養を行った後にＮＰＳにて処理し、ＭＮＶ感染を行った。
それぞれのサンプルを１０ｍｇ／ｍｌに加熱溶解後フィルター滅菌し、サンプル溶液とした。このサンプル溶液を用いて、ＲＡＷ２６４．７細胞を最終濃度５μｇ〜３００μｇになるように処理した後、ＭＮＶ感染を行った。
感染力価の評価方法としては、ＲＡＷ２６４．７細胞を用いてTissue Culture infection Dose５０％（ＴＣＩＤ５０）法にて感染力価を評定した。
結果として、図１３に示したように、ＮＰＳ濃度２０μｇ／ｍｌ以上で、対照のＳｅＶ＋ＰＢＳに比較しウイルス濃度を約６５％減少させる有意なＳｅＶ増殖抑制作用を示した。
この結果により、ＮＰＳは、マウスノロウイルス（ＭＮＶ）に対して増殖を抑制する効果があることが判明したのである。

また、本発明の抗ウイルス剤、即ち、コッコミクサから得られた抽出物（ＣｍＰＳ）がコロナウイルスに対する抗ウイルス活性の評価について、ヒト胎児肺由来のＭＲＣ−５細胞を宿主細胞として用いた。
このＭＲＣ−５細胞を４８穴プレートに培養し、０．００１ＴＣＩＤ_５０（５０％培養細胞感染量）／細胞で感染後、前記抗ウイルス剤（ＣＥ及びＣＥ−１〜ＣＥ−３）の０．８〜５００μｇ／ｍｌの存在下で処理した。３日後に収穫して、この検体を適宜希釈して、９６穴プレートに別に用意したＭＲＣ−５細胞に感染させ、５日間培養する。細胞変性効果（ＣＰＥ）の有無を判定して、Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法によって、５０％ＣＰＥ阻止濃度（ＩＣ_５０）を算出した。また、９６穴プレートに別に用意したＭＲＣ−５細胞を培養すると同時に抗ウイルス剤を添加し、抗ウイルス剤の無添加ＭＲＣ−５細胞数を１００％とした時の増殖率をそれぞれ求め、５０％細胞増殖阻止濃度（ＣＣ_５０）を算出した。

次に、ＣＣ_５０／ＩＣ_５０の値を計算して、抗ウイルス活性の強弱を比較した。この数値が大きいほど選択的なウイルス増殖阻害効果が強いといえる。その結果（コロナウイルスに対する抗ウイルス活性）を下記表に示す。
なお、コロナウイルスを細胞に感染させると同時に抽出物（抗ウイルス剤）を添加したＡ区及び、細胞に感染させた後に抽出物（抗ウイルス剤）を添加したＢ区において、その増殖制御を５０％ウイルス阻止濃度（ＣＣ_５０）及び細胞変性効果（ＯＰＥ）の有無の判定により５０％ＣＰＥ阻止濃度（ＩＣ_５０）を算出し、その選択指数（ＣＣ_５０／ＩＣ_５０）値より、ウイルス増殖抑制活性を評価した。
［表]コロナウイルスに対する抗ウイルス活性

前記表からして、選択指数が１０以上であれば抗ウイルス活性があると判断できる。その結果、コロナウイルスに対するコッコミクサ多糖体の抗ウイルス活性が高いことが確認されたのである。

次に、クロレラ多糖体における自然免疫活性について調べた。マクロファージは、ウイルスなどの感染を認識し炎症性サイトカイン（ＴＮＦ-α、ＩＬ-６等）や一酸化窒素（ＮＯ）を産生することで自然免疫を活性化させる。クロレラ多糖体は、図１４に示したように、ＴＬＲ2およびＴＬＲ4を発現させることで、図１５に示したように、ＴＮＦ-α、ＩＬ-６のサイトカインを産生すると共に、図１６に示したように、一酸化窒素（ＮＯ）を産生誘導し自然免疫を活性化させた。

培養細胞：
マウス由来マクロファージ様細胞株（ＲＡＷ２６４）は、３７℃、５％ＣＯ_２存在下で、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を加えたＲＰＭＩ−１６４０培地にて９０ｍｍのセディカルチャーディッシュにて培養した。ディッシュからスクレイパーを使用して細胞を剥離し、培養液を加え均一な細胞懸濁液として９６ウェルプレートに播種し、実験に使用した。

マウス由来マクロファージ様細胞Ｊ７７４は、３７℃、５％ＣＯ_２存在下で、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を加えたＲＰＭＩ−１６４０培地にて７５ｍｌ細胞培養フラスコに培養した。実験に使用する時は、セルスクレイパーで剥離し溶液を遠心分離後に除去し、培地を加え均一な細胞懸濁液として９６ウェルプレートに播種した。

クロレラ多糖体のＴＬＲ（トール様受容体）活性測定：
ＴＬＲを発現していないＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎細胞）に、ＴＬＲ−２、ＴＬＲ−４の発現プラスミドと転写因子としてＮＦ−κＢのルシフェラーゼレポーター遺伝子を導入し、クロレラ多糖体を添加して刺激した。２４時間後に細胞内に発現したレポーター遺伝子をルシフェラーゼアッセイにて測定した。その結果、図１４に示したように、クロレラ多糖体は、ＴＬＲ−２のリガンドであるＰａｍ３ＣＳＫ4 に比べてやや低値であるが、ＡＳＰ（クロレラ多糖体）ＡＰＳ−ＤＥＡＥ（クロレラ多糖体精製物）とも、リガンドとして働きＴＬＲ−２活性が見られた。また、ＴＬＲ−４では、リガンドであるＬＰＳに比べクロレラ多糖体およびその精製物が低値であるが、リガンドとして働き、その活性が認められた。

サイトカイン産生に及ぼすクロレラ多糖体の生理活性測定：
ＲＡＷ２６４細胞を９６ウェルプレートにて培養し、培養液にクロレラ多糖体を添加して、２４時間後の培養上清中の炎症性サイトカインＴＮＦ−α及びＩＬ−６をエリーサ法にて定量した。その結果、図１５に示したように、サイトカインＴＮＦ−α及びＩＬ−６産生の比較を行ったところ各種クロレラ多糖体は濃度依存的にサイトカイン産生を誘導した。

ＮＯ（一酸化窒素）測定：
１ウェル当たり２×１０^５個のＲＡＷ２６４またはＪ７７４細胞を９６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ_２存在下にて一晩培養し、翌日クロレラ多糖体及びＴＬＲリガンドを含んだ培養液に交換し、３７℃、５％ＣＯ_２存在下で２４時間培養し、その上清中のＮＯ_２−の量をＮＯ産生量としてグリース法にて測定した。グリース法は、ＮＯが酸化されて生ずるＮＯ_２−をナフチルニチレンジアミン溶液Ｎ−（１−ナフチル）エチレンジアミン二塩酸塩と反応させ生成したアゾ化合物の吸収度を測定する方法で、グリース試薬１００μｌを、培養上清１００μｌに加え室温で１０分間インキュベートした後５４０ｍｍの吸光度を測定した。
なお、ＫＮＯ_２溶液を標準液とし同様の測定方法から検量線を作成し、ＮＯ_２−の濃度を決定した。その結果、図１６に示したように、自然免疫受容体リガンドであるＬＰＳでのＮＯ（一酸化窒素）生成誘導を比較すると、各クロレラ多糖体は、濃度依存的にＮＯ産生を誘発した。

以上説明したように、クロレラ中性多糖体１００μｇ／ｍｌでのＮＯ産生量が約２３μＭであるが、同条件でコッコミクサ中性多糖体のＮＯ産生量を比べると１００μｇ／ｍｌで約４５μＭであったことから、配合（ミックス）の目安として、コッコミクサ多糖体は、２倍量のクロレラ多糖体に匹敵する免疫活性の有用性があると認められる。なお、抗ウイルス活性については、クロレラ多糖体とコッコミクサ多糖体とは、どちらも同濃度（１００μｇ／ｍｌ）での有効性が示されている。従って、コッコミクサ多糖体とクロレラ多糖体とを、それぞれ単独で使用しても、抗ウイルス活性を有する抗ウイルス剤として使用できるが、両者を所要の配合比、例えば、２：１〜１：２の範囲でミックスすることによって、両者の特性である相乗効果によって、抗ウイルス活性と免疫活性とを有する抗ウイルス剤が提供できるのである。

本発明に係るコッコミクサ多糖体またはクロレラ多糖体は、それぞれ単独でも、インフルエンザウイルス（ＩＦＶ）の細胞へのエントリーという最も基本的なステップを阻害するため、実験に供したウイルス株だけでなく、他のウイルスに対しても抗ウイルス効果を奏する可能性が考えられる。例えば、同様のステップを辿るパラインフルエンザウイルス、ムンプウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ＳＡＲＳウイルス、コロナウイルス、ヘルペスウイルス、ＨＩＶウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスまたはノロウイルス等にも有効に抗ウイルス効果を発揮するものと考えられ、さらには鳥インフルエンザウイルスや、ＰＥＤウイルス等の家畜に感染するウイルス等にも抗ウイルス効果が発揮されると考えられるので、健康食品または医薬品や飼料、消毒剤として広く利用できるのである。
また、本願発明に係るコッコミクサ多糖体またはクロレラ多糖体を所要の配合比でミックスすることによって、両者の特性による相乗効果により抗ウイルス作用と免疫活性の強化が増大した抗ウイルス剤が提供できるのである。
さらに、コッコミクサ多糖体またはクロレラ多糖体は、抽出物中の脂質除去による抗ウイルス効果について、ＩＦＶはエンベロープ（外套）という脂質をまとった構造物であり、該エンベロープという脂質と好んで相互作用するように、抽出物中の抗ＩＦＶ活性物質における脂質をできるだけ多く除去しておくことで、両者間の相互作用がより有効に活性化するのであり、また、ＩＦＶ以外の脂質にも作用するはずであるから、他のウイルスにも有効に作用すると考えられる。さらに、エンベロープを持たないウイルスに対しても、有効に作用するのであるから、広い範囲のウイルスに対しても有効に抗ウイルス効果を発揮するものである。

なし

Claims

エンベロープを有するＡ型ヒトインフルエンザウイルスやコロナウイルス、及びノロウイルスに対する抗ウイルス活性を有する抗ウイルス剤の製法であって、
微細藻類のコッコミクサまたはクロレラと、ベンゼン：メタノール（２：１）もしくは、エタノール、アセトン、ヘキサンからなる揮発性溶剤とを一緒にして超音波振とう、高圧ホモジナイズ、羽根攪拌のうち一つまたは複数を組み合わせて遠心分離を行なう脱脂操作を複数回行なう工程と、
脱脂工程後に所要量の水を加え所要時間に亘って加熱し熱湯抽出する工程と、
熱湯抽出物を遠心分離により固液分離した液層を濃縮し乾燥する工程とからなること
を特徴とする抗ウイルス剤の製法。
前記請求項１で固液分離された固層に所要量の水と所要のアルカリ溶液とを加えてアルカリ性に調整し撹拌して抽出を行なう工程と、
抽出を行なった後に遠心分離にて固液を分離して液層を回収する工程と、
回収した液層に所要の酸性溶液を加えて酸性に調整し所要時間静置して沈殿物を生成させる工程と、
該沈殿物を遠心分離して固形物として回収すると共に、回収された固形物を複数回洗浄操作を行なう工程と、
洗浄後の沈殿物を凍結乾燥させる工程とからなること
を特徴とする抗ウイルス剤の製法。
前記請求項１乃至２のいずれかによって得られた微細藻類のコッコミクサまたはクロレラより抽出された多糖体画分を有効成分とするものであって、
該有効成分中の大半の脂質が除去されたものであり、少なくとも新型（２００９年新型）及び季節性のＡ型ヒトインフルエンザウイルスやコロナウイルス等のエンベロープを有するＲＮＡウイルス、及びノロウイルスに対する抗ウイルス活性と免疫活性とを有すること
を特徴とする抗ウイルス剤。
前記コッコミクサ及びクロレラ多糖体を所要比率で配合したこと
を特徴とする請求項３に記載の抗ウイルス剤。