CN112512542A

CN112512542A - 抗诺如病毒剂

Info

Publication number: CN112512542A
Application number: CN201980050592.9A
Authority: CN
Inventors: 浅野真菜; 久野齐; 渥美欣也; 林京子; 河原敏男; 小松聪子
Original assignee: School Corp Chubu University; Denso Corp
Current assignee: KJ Bio Co.,Ltd.; Chubu University Educational Foundation
Priority date: 2018-07-31
Filing date: 2019-07-25
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2039-07-25
Also published as: JPWO2020026951A1; WO2020026951A1; JP7505696B2; EP3831399A1; CN112512542B; EP3831399A4

Abstract

本发明的课题在于提供在治疗诺如病毒引起的感染症、防止诺如病毒引起的感染症的扩散方面有效的新方法。本发明提供一种抗诺如病毒剂，其包含源自单细胞藻类的物质作为有效成分。

Description

抗诺如病毒剂

技术领域

本发明涉及抗诺如病毒剂。详细而言，本发明涉及使用源自微型藻类的物质的抗诺如病毒剂及其用途等。本申请主张基于2018年7月31日提出申请的日本专利申请第2018-143050号的优先权，并通过参照方式援引该专利申请的全部内容。

背景技术

诺如病毒为不具有包膜的单股正链RNA病毒，属于杯状病毒科诺如病毒属。近年，诺如病毒已成为感染性胃肠炎的主要原因，感染力极强且对表面活性剂、醇等表现出高抵抗性，频繁引起群体性感染。牡蛎等双壳贝类为主要的感染源，但是患者的吐泻物·排泄物引发的二次感染也成为大的问题。

现状是通过加热食品、对烹调器具进行消毒、手指消毒等应对诺如病毒的感染，另一方面也提出了以诺如病毒为目标的抗病毒剂、杀病毒剂(例如，参照专利文献1～3)。此外，到目前为止尚未实现诺如病毒的人工培养，这已成为开发疫苗、治疗药的障碍。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:日本特开2013-47196号公报

专利文献2:日本专利第6139813号公报

专利文献3:日本特开2009-292736号公报

发明内容

发明所要解决的技术问题

在以上背景下，本申请发明的课题在于，提供在治疗诺如病毒引起的感染症(感染性胃肠炎)、和/或、防止诺如病毒引起的感染症的扩散方面有效的新方法。

用于解决问题的技术方案

诺如病毒感染症的特征之一是：在症状消失后的数天～1周左右时间内，有感染力的病毒会被排出到患者的粪便中，这会引起二次感染扩散。本发明人等关注这一点而进行深入研究，结果表明：胶球藻属微型藻类的藻体及其提取物(含有单半乳糖甘油二酯的提取物)具有抑制诺如病毒增殖的作用，还具有促进病毒从体内排出/排除的作用，对诺如病毒感染症的治疗以及二次感染的预防或阻止非常有效。另外，发现在免疫功能降低时上述作用也是重要的。该事实显示：胶球藻属微型藻类的藻体及其提取物作为诺如病毒感染症的治疗药的有效成分是非常有效的。另一方面，通过进一步的研究明确了提取物中的有效成分即单半乳糖甘油二酯的结构。另外，得到了证明该提取物的利用价值非常高的进一步的见解。

另一方面，明确了：对于源自小球藻(Chlorella vulgaris)、微拟球藻(Nannochloropsis oculata)、钝顶节旋藻(Arthrospira platensis)(螺旋藻(Spirulina))和纤细裸藻(Euglena gracilis)的含有单半乳糖甘油二酯的提取物，也可预期与源自胶球藻属微型藻类的含有单半乳糖甘油二酯的提取物同样的效果。

主要基于上述成果和讨论，提供以下发明。

[1]一种抗诺如病毒剂，其含有源自单细胞藻类的物质作为有效成分。

[2]根据[1]记载的抗诺如病毒剂，其中，上述单细胞藻类为属于胶球藻属、小球藻属、微拟球藻属、节旋藻属或裸藻属的微型藻类。

[3]根据[1]记载的抗诺如病毒剂，其中，上述单细胞藻类为属于胶球藻属的微型藻类。

[4]根据[3]记载的抗诺如病毒剂，其中，上述微型藻类为胶球藻(Coccomyxa sp.)KJ株或其突变株。

[5]根据[1]～[4]中任一项记载的抗诺如病毒剂，其中，上述有效成分为上述单细胞藻类的含有单半乳糖甘油二酯的提取物。

[6]根据[5]记载的抗诺如病毒剂，其中，主要成分为单半乳糖甘油二酯。

[7]根据[6]记载的抗诺如病毒剂，其中，上述单半乳糖甘油二酯为选自以下(1)～(6)中的一种以上单半乳糖甘油二酯：

(1)构成脂肪酸为C16:3和C18:3的单半乳糖甘油二酯；

(2)构成脂肪酸为C16:2和C18:3的单半乳糖甘油二酯；

(3)构成脂肪酸为C18:3和C18:3的单半乳糖甘油二酯；

(4)构成脂肪酸为C16:2和C18:2的单半乳糖甘油二酯；

(5)构成脂肪酸为C18:3和C18:2的单半乳糖甘油二酯；以及

(6)构成脂肪酸为C16:1和C18:2的单半乳糖甘油二酯。

[8]根据[5]～[7]中任一项记载的抗诺如病毒剂，其中，上述有效成分为对上述单细胞藻类的乙醇提取物进行色谱纯化，提高单半乳糖甘油二酯的含量的物质。

[9]根据[5]～[8]中任一项记载的抗诺如病毒剂，其中，上述有效成分中的单半乳糖甘油二酯含量为70％(w/v)～99％(w/v)。

[10]根据[1]～[4]中任一项记载的抗诺如病毒剂，其中，上述有效成分为藻体。

[11]根据[1]～[4]中任一项记载的抗诺如病毒剂，其中，上述有效成分为藻体的干燥粉末。

[12]一种抗诺如病毒剂，其有效成分为选自以下(1)～(6)中的一种以上单半乳糖甘油二酯：

(1)构成脂肪酸为C16:3和C18:3的单半乳糖甘油二酯；

(2)构成脂肪酸为C16:2和C18:3的单半乳糖甘油二酯；

(3)构成脂肪酸为C18:3和C18:3的单半乳糖甘油二酯；

(4)构成脂肪酸为C16:2和C18:2的单半乳糖甘油二酯；

(5)构成脂肪酸为C18:3和C18:2的单半乳糖甘油二酯；以及

(6)构成脂肪酸为C16:1和C18:2的单半乳糖甘油二酯。

[13]根据[1]～[12]中任一项记载的抗诺如病毒剂，其发挥抑制诺如病毒增殖的作用，和/或，促进病毒从体内排出的作用。

[14]一种组合物，其包含[1]～[13]中任一项记载的抗诺如病毒剂。

[15]根据[14]记载的组合物，其为针对诺如病毒感染症的药物。

[16]根据[14]记载的组合物，其为食品或饲料。

附图说明

图1为使用胶球藻KJ株的藻体(干燥粉末)的实验的结果。表示无5-FU处理小鼠的诺如病毒(MNV)感染后的排泄物中的病毒量。

图2为使用胶球藻KJ株的藻体(干燥粉末)的实验的结果。表示无5-FU处理小鼠的MNV感染10～21天后的病毒量。

图3为使用胶球藻KJ株的藻体(干燥粉末)的实验的结果。表示5-FU处理小鼠的MNV感染后的排泄物中的病毒量。

图4为使用胶球藻KJ株的藻体(干燥粉末)的实验的结果。表示5-FU处理小鼠的MNV感染10～21天后的病毒量。

图5为使用胶球藻KJ株的藻体(干燥粉末)的实验的结果。比较病毒消失为止的经过天数。

图6为使用胶球藻KJ株的藻体(干燥粉末)的实验的结果。比较·评价感染21天后的血清中的中和抗体效价。**p<0.01相对于无5-FU处理对照组,##p<0.01相对于5-FU处理对照组

图7为使用胶球藻KJ株的MGDG制备物的实验的结果。表示无5-FU处理小鼠的MNV感染后的排泄物中的病毒量。

图8为使用胶球藻KJ株的MGDG制备物的实验的结果。表示无5-FU处理小鼠的MNV感染10～21天后的病毒量。

图9为使用胶球藻KJ株的MGDG制备物的实验的结果。表示5-FU处理小鼠的MNV感染后的排泄物中的病毒量。

图10为使用胶球藻KJ株的MGDG制备物的实验的结果。表示5-FU处理小鼠的MNV感染10～21天后的病毒量。

图11为使用胶球藻KJ株的MGDG制备物的实验的结果。比较病毒消失为止的经过天数。

图12为使用胶球藻KJ株的MGDG制备物的实验的结果。比较·评价感染21天后的血清中的中和抗体效价。***p<0.001,##p<0.01相对于对照。

图13为以猫杯状病毒(FCV)为靶的杀病毒活性试验的结果。利用10μg/ml、50μg/ml、200μg/ml的MGDG制备物处理病毒液0分钟～60分钟。

图14为小球藻属微型藻类的培养中使用的培养基的示例(C培养基)和微拟球藻属微型藻类的培养中使用的培养基的示例(ESM培养基)。

图15为节旋藻属微型藻类的培养中使用的培养基的示例(MA培养基)和裸藻属藻类的培养中使用的培养基的示例(HUT培养基)。

图16为有机物存在时的杀病毒活性试验的结果。使用猫杯状病毒(FCV)作为诺如病毒的替代物。

图17为MGDG制备物的含有成分(MGDG1)的分析结果(GC/FID的色谱图)。

图18为MGDG制备物的含有成分(MGDG2)的分析结果(GC/FID的色谱图)。

图19为MGDG制备物的含有成分(MGDG3)的分析结果(GC/FID的色谱图)。

图20为MGDG制备物的含有成分(MGDG4)的分析结果(GC/FID的色谱图)。

图21为MGDG制备物的含有成分(MGDG5)的分析结果(GC/FID的色谱图)。

图22为各MGDG级分(MGDG1～MGDG5)的杀病毒活性。比较MGDG1～MGDG5和MGDG制备物(混合品)对流感病毒、单纯疱疹病毒2型、猫杯状病毒和脊髓灰质炎病毒的杀病毒活性。

图23为各种生物(胶球藻KJ株、小球藻、微拟球藻、钝顶节旋藻(螺旋藻))的MGDG制备物的HPLC色谱图。MGDG-1～MGDG-5为源自KJ株MGDG制备物的峰，利用＊表示推定与其为相同结构的峰。

图24为各种生物(胶球藻KJ株、纤细裸藻(Inochi Euglena、BIO ZYME)、菠菜)的MGDG制备物的HPLC色谱图。MGDG-1～MGDG-5为源自KJ株MGDG制备物的峰，利用＊表示推定与其为相同结构的峰。

具体实施方式

1.术语、作用

抗诺如病毒剂为以诺如病毒为靶的抗病毒剂。如后述的实施例所示，可预期本发明的抗诺如病毒剂具有抑制诺如病毒增殖的作用，以及促进病毒从体内排出(排除)的作用(使诺如病毒尽快从体内排出的作用)。后一种作用在预防或阻止二次感染方面是非常有效且重要的。

2.抗诺如病毒剂的有效成分

本发明的抗诺如病毒剂以源自单细胞藻类的物质为有效成分。只要确认到抗诺如病毒活性，则单细胞藻类(共球藻纲(Trebouxiophyceae)、真眼点藻纲、蓝藻纲、裸藻纲等)没有特别限定。作为优选的单细胞藻类，可举出胶球藻属(Coccomyxa)微型藻类(具体例：胶球藻KJ株)、小球藻属(Chlorella)微型藻类(具体例：小球藻)、微拟球藻属(Nannochloropsis)微型藻类(具体例：微拟球藻)、节旋藻属(Arthrospira)微型藻类(具体例：钝顶节旋藻(螺旋藻))或裸藻属(Euglena)微型藻类(具体例：纤细裸藻)。其中，特别优选胶球藻属微型藻类。胶球藻属微型藻类没有特别限定，作为优选例，可举出胶球藻KJ株或其突变株。胶球藻KJ株(KJ DENSO)于2013年6月4日以保藏编号FERM P-22254保藏于国家高级工业科学技术学院国际专利生物保藏中心(NITE-IPOD)(千叶县木更津市KAZUSA镰足2-5-8 120号室)，并于2015年6月2日以保藏编号FERM BP-22254移交为符合布达佩斯条约规定的国际保藏。此外，在最新的分类中，以往的拟胶球藻(Pseudococcomyxa)也包括于胶球藻属(参考文献：PLoS One.2015Jun 16；10(6):e0127838.doi:10.1371/journal.pone.0127838.eCollection 2015.)。

胶球藻KJ株的突变株可通过紫外线、X射线、γ射线等的照射、诱变剂处理、重离子束照射、基因操作(外源基因的导入、基因破坏、通过基因组编辑进行的基因修饰等)等得到。只要能够得到产生显示抗诺如病毒活性的单半乳糖甘油二酯的突变株，则突变株的取得方法、特性等没有特别限定。

胶球藻属微型藻类的培养方法没有特别限定。作为用于培养胶球藻属微型藻类的培养基，为微型藻类的培养中通常使用的培养基即可，例如，可使用包含各种营养盐、微量金属盐、维生素等的公知的淡水产微型藻类用培养基、海水产微型藻类用培养基中的任一种。作为培养基，例如可举出AF6培养基。AF6培养基的组成(每100ml)如以下所示。

NaNO₃ 14mg

NH₄NO₃ 2.2mg

MgSO₄·7H₂O 3mg

KH₂PO₄ 1mg

K₂HPO₄ 0.5mg

CaCl₂·2H₂O 1mg

CaCO₃ 1mg

柠檬酸铁 0.2mg

柠檬酸 0.2mg

生物素 0.2μg

盐酸硫胺素 1μg

维生素B₆ 0.1μg

维生素B₁₂ 0.1μg

微量金属 0.5mL

蒸馏水 99.5mL

作为营养盐，例如可举出NaNO₃、KNO₃、NH₄Cl、尿素等氮源；K₂HPO₄、KH₂PO₄、甘油磷酸钠等磷源。另外，作为微量金属，可举出铁、镁、锰、钙、锌等，作为维生素，可举出维生素B1、维生素B12等。

培养方法可以在通气条件下，供给二氧化碳同时进行搅拌。此时，在利用荧光灯进行带有12小时的光照射、12小时的黑暗条件等明暗周期的光照射，或者，连续进行光照射下进行培养。培养条件只要是在对胶球藻属微型藻类的增殖不产生不良影响的范围内就没有特别限制，例如，培养液的pH设为3～9，培养温度设为10～35℃。

应予说明，关于胶球藻KJ株的培养方法，可参考日本特开2015-15918、WO2015/190116A1，Satoh,A.et al.,Characterization of the Lipid Accumulation in a NewMicroalgal Species,Pseudochoricystis ellipsoidea(Trebouxiophyceae)J.Jpn.Inst.Energy(2010)89:909-913.等。

作为有效成分，可使用单细胞藻类(特别优选属于胶球藻属的微型藻类)的含有单半乳糖甘油二酯的提取物(第1方式)、或者、藻体或其干燥粉末(第2方式)。以下对各方式进行说明。应予说明，通常，含有单半乳糖甘油二酯的提取物、或者、藻体或其干燥粉末中的任一者为有效成分，但是使用其中两者作为有效成分没有问题。

(1)含有单半乳糖甘油二酯的提取物

本发明的一个方式中，作为有效成分，使用“单细胞藻类(特别优选属于胶球藻属的微型藻类)的含有单半乳糖甘油二酯的提取物”。提取方法只要能够得到含有单半乳糖甘油二酯的提取物就没有特别限定。作为提取方法，例如可采用乙醇提取。优选使用在乙醇提取后进行纯化而提高单半乳糖甘油二酯的含量的物质作为“单细胞藻类(特别优选属于胶球藻属的微型藻类)的含有单半乳糖甘油二酯的提取物”。作为纯化方法的示例，可例示使用硅胶、氧化铝等填充剂的柱色谱、凝胶过滤色谱、浓缩等。

在提取之前，可以将回收的藻体供于干燥处理和/或破碎处理。换而言之，可以制备干燥藻体、干燥且破碎的藻体(典型的为干燥粉末)、或破碎藻体，并使用其进行提取操作。也可以获得预先对单细胞藻类进行加工处理的产物(例如，干燥藻体、其粉末/粉体、或者片剂(可以包含赋形剂等)等)，并供于提取操作。例如，对于小球藻、微拟球藻、钝顶节旋藻(螺旋藻)、纤细裸藻等，可购买其加工品。

有效成分中的单半乳糖甘油二酯含量只要使提取物显示抗诺如病毒活性就没有特别限定，例如为70％(w/v)～99％(w/v)，优选为80％(w/v)～99％(w/v)，进一步优选为90％(w/v)～99％(w/v)，更进一步优选为95％(w/v)～99％(w/v)(作为具体例，为96％(w/v)、97％(w/v)、98％(w/v))。原则上，单半乳糖甘油二酯的含量越高，则越可预期强的抗诺如病毒活性。“单半乳糖甘油二酯”为甘油糖脂之一，已知其为植物叶绿体的类囊体膜的构成成分。单半乳糖甘油二酯具有半乳糖与甘油进行β键合而得到的骨架。

本发明的抗诺如病毒剂中，优选单半乳糖甘油二酯成为主要成分。如果举出本发明的抗诺如病毒剂能够含有的单半乳糖甘油二酯的示例，则为：(1)构成脂肪酸为C16:3和C18:3的单半乳糖甘油二酯、(2)构成脂肪酸为C16:2和C18:3的单半乳糖甘油二酯、(3)构成脂肪酸为C18:3和C18:3的单半乳糖甘油二酯、(4)构成脂肪酸为C16:2和C18:2的单半乳糖甘油二酯、(5)构成脂肪酸为C18:3和C18:2的单半乳糖甘油二酯、以及(6)构成脂肪酸为C16:1和C18:2的单半乳糖甘油二酯。经鉴定，这些单半乳糖甘油二酯为显示抗诺如病毒活性的胶球藻属微型藻类提取物含有的成分(具体参见后述的实施例栏所示的“9.MGDG制备物中的成分的鉴定2”)。如果也考虑后述的实施例栏所示的“8.MGDG制备物中的成分的鉴定1”的解析结果，则上述(1)的构成脂肪酸C18:3优选为C18:3(n-3)，上述(3)的构成脂肪酸C18:3中的至少一者优选为C18:3(n-3)，上述(4)的构成脂肪酸C18:2优选为C18:2(n-6)，上述(5)的构成脂肪酸C18:3优选为C18:3(n-3)、C18:2优选为C18:2(n-6)。虽然并不排除单独含有特定的单半乳糖甘油二酯的情况，但是通常本发明的抗诺如病毒剂含有结构不同的两种以上单半乳糖甘油二酯，这种情况下的组合、含有比率等没有特别限定。本发明的抗诺如病毒剂优选含有上述(1)～(6)中的两种以上，进一步优选含有上述(1)～(6)中的三种以上，再进一步优选含有上述(1)～(6)中的四种以上，更加优选含有上述(1)～(6)中的五种以上，更进一步优选含有上述(1)～(6)中的全部。如后述实施例所示，可确认到(5)的单半乳糖甘油二酯(MGDG5)具有特别高的活性。因此，特别优选的实施方式的抗诺如病毒剂中，单独含有(5)的单半乳糖甘油二酯，或者，含有(5)的单半乳糖甘油二酯与(1)、(2)～(4)和(6)中的一种以上的组合。

被鉴定为显示抗诺如病毒活性的胶球藻属微型藻类提取物的主要含有成分的单半乳糖甘油二酯，其本身可预期抗诺如病毒活性。因此，本发明的一个方式提供一种抗诺如病毒剂，其有效成分为选自上述(1)～(6)中的一种以上的单半乳糖甘油二酯。以两种以上的单半乳糖甘油二酯为有效成分时的组合、含有比率等没有特别限定。在该方式中，也优选含有上述(1)～(6)中的两种以上，进一步优选含有上述(1)～(6)中的三种以上，再进一步优选含有上述(1)～(6)中的四种以上，更加优选含有上述(1)～(6)中的五种以上，更进一步优选含有上述(1)～(6)中的全部。如上述所示，可确认到(5)的单半乳糖甘油二酯(MGDG5)具有特别高的活性。因此，在特别优选的方式中，(5)的单半乳糖甘油二酯为有效成分的至少一种。

在此，存在包含各种脂肪酸(将脂肪酸的示例示于以下)作为构成脂肪酸的单半乳糖甘油二酯。如果考虑到本发明的启示，则可合理预期：包含公知的单半乳糖甘油二酯在内，单半乳糖甘油二酯通常能够发挥抗诺如病毒活性。

＜脂肪酸的示例＞

C12:0,C13:0,C14:0,C14:1,C14:2,C15:0,C15:1,C16:0,C16:1,C16:4,C17:0,C17:1,C18:0,C18:1,C18:4,C19:0,C19:1,C20:0,C20:1,C20:2,C20:3,C20:4,C20:5,C22:0,C22:5,C24:0

(2)藻体或其干燥粉末

在该方式中，不使用来自藻体的提取物，而使用藻体或其干燥粉末作为有效成分。干燥粉末可通过将回收的藻体供于干燥处理和破碎(粉碎)处理来制备。作为干燥处理，例如可采用转鼓干燥、喷雾干燥、冷冻干燥等。破碎处理可利用珠式破碎装置、均质机、弗氏压碎器、混合机/搅拌机、微粉碎机等。干燥处理和破碎处理的顺序没有限定。另外，也可以利用具备干燥和破碎功能的装置，同时进行干燥处理和破碎处理。

干燥粉末的粒径没有特别限定。例如，制成平均粒径为0.2μm～2mm，优选为0.4μm～400μm的干燥粉末。

3.抗诺如病毒剂的用途·使用方法

本发明的抗诺如病毒剂，典型地能够以包含其的组合物形式用于诺如病毒的感染对策。此处的组合物的示例为药物、食品、饲料。

作为本发明的抗诺如病毒剂的用途的具体例之一，可举出被诺如病毒污染的牡蛎的净化(参照后述的实施例)。该用途中，典型地准备抗诺如病毒剂的溶液，浸渍被诺如病毒污染的牡蛎(或者，有可能被污染的牡蛎)(例如，饲养数小时～数天左右即可)。

本发明的药物可对诺如病毒感染症发挥治疗效果或预防效果(将这两种效果统称为“药物效果”)。此处的药物效果包括：(1)阻止诺如病毒感染；(2)阻止、抑制或延迟诺如病毒感染症的发病；(3)缓解(减轻)诺如病毒感染症的特征性症状或伴随症状；(4)阻止、抑制或延迟诺如病毒感染症的特征性症状或相关症状的恶化等。应予说明，治疗效果和预防效果是部分重叠的概念，因此有时难以明确进行区分掌握，另外这样做的实际意义少。

药物的制剂化可按照常规方法进行。在制剂化的情况下，可含有制剂上可接受的其它成分(例如，载体、赋形剂、崩解剂、缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、止痛剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等)。作为赋形剂，可使用乳糖、淀粉、山梨糖醇、D-甘露醇、白糖等。作为崩解剂，可使用淀粉、羧甲基纤维素、碳酸钙等。作为缓冲剂，可使用磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐等。作为乳化剂，可使用阿拉伯胶、海藻酸钠、黄蓍胶等。作为悬浮剂，可使用单硬脂酸甘油、单硬脂酸铝、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、月桂基硫酸钠等。作为止痛剂，可使用苄醇、氯丁醇、山梨糖醇等。作为稳定剂，可使用丙二醇、抗坏血酸等。作为保存剂，可使用苯酚、苯扎氯铵、苄醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯等。作为防腐剂，可使用苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。

制剂化时的剂型也没有特别限定。剂型的示例为片剂、散剂、细粒剂、颗粒剂、胶囊剂、糖浆剂、注射剂、外用剂(软膏剂、膏剂、洗剂、液剂、凝胶剂、巴布剂、硬膏剂、胶带剂、气雾剂等)和栓剂。药物可根据其剂型而通过口服给药或非口服给药(对患部的局部注入、静脉内、动脉内、皮下、皮内、肌肉内、或腹腔内注射、经皮、经鼻、经粘膜等)应用于对象。另外，可根据对象而应用全身给药和局部给药。这些给药途径彼此不相互排斥，可并用任意选择的两种以上。

本发明的药物含有得到预期效果而必需的量(即治疗或预防上的有效量)的有效成分。本发明的药物中的有效成分量通常因剂型不同而不同，可将有效成分量例如在约0.1重量％～约99重量％的范围内设定，使其可达到期望的给药量。

可对本发明的药物的给药量进行设定，使其得到预期效果。在设定治疗或预防上的有效给药量时，通常考虑症状、患者的年龄、性别和体重等。本领域技术人员考虑上述事项就能够设定合适的给药量。如果示出给予量的示例，以成人(体重约60kg)为对象，可以按照每天的有效成分量达到1mg～20mg，优选2mg～10mg的方式来设定给予量。作为给药日程，例如可采用1天1次～数次、2天1次、或者3天1次等。在制作给药日程时，可考虑患者的状态、有效成分的效果持续时间等。

由以上记载可以明确，本申请还提供治疗或预防诺如病毒感染症的方法，其特征在于，对罹患诺如病毒感染症的对象或可能罹患诺如病毒感染症的对象，给药治疗或预防有效量的包含本发明的抗诺如病毒剂的药物。治疗或预防的对象典型地为人，也可以应用于人以外的哺乳动物(例如猴、牛、猪、绵羊、猫、兔、海豚等)、鸟类、爬行类等。

如上述所示，作为本发明的抗诺如病毒剂的利用方式之一，可举出包含本发明的抗诺如病毒剂的食品或饲料。作为本发明的食品的示例，可举出通常的食品(谷物、蔬菜、肉食类、各种加工食品、点心·甜点类、牛奶、清凉饮料、果汁饮料、咖啡饮料、蔬菜汁饮料、酒精饮料等)、营养辅助食品(补充剂、能量饮料等)、食品添加物、宠物用食品、宠物用营养辅助食品。在为营养辅助食品或食品添加物的情况下，能够以粉末、颗粒末、片剂、糊剂、液体等形状提供。通过以食品组合物的形态提供，容易日常摄取或持续摄取本发明的有效成分。

本发明的饲料的示例为饲料(例如家畜的饲料)、宠物食品。

本发明的食品或饲料优选含有可预期治疗或预防效果的量的有效成分。添加量可考虑使用其的对象的状态、年龄、性别、体重等来确定。

实施例

1.微型藻类胶球藻KJ株的干燥粉末(藻体)和提取物的制备、以及提取物的纯化

根据现有的方法培养胶球藻KJ株。具体而言，在AF6培养基中种植胶球藻KJ株后，通入2％CO₂(v/v)，一边照射光(300μmol/m²/s)一边在室温(25℃)下培养48小时。通过离心分离从培养液回收藻体。利用转鼓干燥器将回收的藻体干燥的同时，利用微粉碎机粉碎，制成粉末状(藻体的干燥粉末)。接着，在100g的干燥粉末中添加1l的乙醇使其分散，在暗处静置3天。静置后进行过滤，分离为1次滤液和残渣。在该残渣中，与上述相同添加1l的乙醇使其分散，静置3天后,再次过滤,分离为2次滤液和残渣。将该过滤操作再重复一次，得到3次滤液和残渣。

将1次滤液、2次滤液和3次滤液混合，利用蒸发器馏去乙醇，减压干燥制成乙醇提取物DE。接着，将DE供于DIAION HP-20(三菱化学(株)制造，3.5×57cm)柱色谱。依次利用H₂O、50％乙醇(EtOH)、EtOH以及丙酮进行洗脱，将各洗脱级分在室温下减压干燥(DE1,400.9mg；DE2,310.3mg；DE3,2.25g；DE4,4.86g)。将丙酮级分(DE4)供于硅胶柱(3×42cm)色谱。依次利用己烷、己烷-乙酸乙酯(AcOEt)(1:1)、AcOHt、AcOHt-丙酮(1:1)、丙酮以及甲醇(MeOH)进行洗脱，得到各洗脱级分：即DE4A(55.4mg)、DE4B(2.0g)、DE4C(89.0mg)、DE4D(1.01g)、DE4E(95.5mg)以及DE4F(177.1mg)。接着，将DE4D供于以AcOEt-丙酮为溶剂系统的硅胶柱(1.5×35cm)色谱，得到3个级分：DE4D1(49.9mg)、DE4D2(705.1mg)以及DE4D3(16.2mg)。接着，将DE4D2供于硅胶柱(1.5×35cm)色谱，利用CHCl₃-MeOH-H₂0(10:1:0.1)进行洗脱，得到DE4D2A(15.6mg)和DE4D2B(686.5mg)。其中，将DE4D2B供于以氯仿(CHCl₃)-MeOH(3:1)为溶剂系统的LH-20柱(Sigma Aldrich公司制造)色谱，得到DE4D2B1(11.6mg)和DE4D2B2(652.3mg)。将DE4D2B2供于硅胶柱(2×50cm)色谱，利用CHCl₃、CHCl₃-MeOH(20:1)以及CHCl₃-MeOH-H₂O(10：3：1)进行洗脱，得到4个级分：DE4D2B2A(4.8mg)、DE4D2B2B(3.5mg)、DE4D2B2C(25.1mg)以及DE4D2B2D(620.5mg)。最后，通过利用CHCl₃-MeOH-醋酸(AcOH)-H₂O(80:9:12:2)进行展开的制备液相色谱(PLC)将DE4D2B2D纯化，制成MGDG制备物(578.9mg)。

2.小鼠诺如病毒(MNV)感染实验1(胶球藻KJ株的藻体的效果)

人诺如病毒已成为感染性胃肠炎的主要原因。目前为止，尚未实现该诺如病毒的人工培养，这成为开发疫苗、治疗药的障碍。因此，作为探索感染症对策时的替代病原体，大多使用小鼠诺如病毒(MNV)。因此，使用MNV感染系统评价胶球藻KJ株的藻体(干燥粉末)对诺如病毒感染症的感染症治疗效果。已知当免疫功能降低时胃肠炎症状会重症化，因此还研究了免疫功能的差异对病毒排泄、抗体产生造成的影响。

＜方法＞

(1)对于各给药组，将BALB/c小鼠(6周龄)分为A和B，A(免疫功能正常组，n＝3)设为不给予5-氟尿嘧啶(5-FU)，B(免疫功能降低组，n＝3)从接种病毒7天前至21天后隔天皮下注射5-FU(0.25mg/天/小鼠)。

(2)口服接种MNV(1×10⁶PFU/0.2ml/小鼠)。

(3)按以下给药量在接种病毒7天前至21天后口服给药样品(藻体的干燥粉末)(9时和18时，1天2次)。

对照1A：给药灭菌水；无5-FU处理

对照1B：给药灭菌水；5-FU处置

试验区2A：藻体(干燥粉末)5mg/0.4ml/天；无5-FU处置

试验区2B：藻体(干燥粉末)5mg/0.4ml/天；5-FU处置

(4)8小时后、1天后、2天后、3天后、4天后、5天后、6天后、8天后、10天后、12天后、14天后、16天后、18天后、以及21天后，将每1只的粪便收集于5ml管中，在-80℃下保存(使小鼠放入空的饲养笼15～30分钟)。

(5)每1mg粪便添加PBS 10μl，进行超声波处理使其均匀分散。

(6)进行离心处理(3000rpm,15分钟,4℃)。

(7)利用PBS稀释上清(10⁰倍、10¹倍、10²倍、及10³倍)。

(8)对于前一天在24孔平板中培养的RAW 264.7细胞，在除去培养基后，添加(7)的各稀释液100μl/孔，在室温下感染1小时。

(9)除去病毒液后，叠加添加有1.5％SeaPlaque^TM琼脂糖的DMEM培养基。

(10)2天后，叠加中性红溶液500μl/孔，在37℃下处理1小时。

(11)除去中性红溶液后，立即在显微镜下测定噬菌斑数量。

(12)在感染21天后采集全血，离心处理(3000rpm、5分钟、4℃)，分离血清后，通过以下方法测定中和抗体效价。

(i)利用PBS稀释血清(10倍、50倍、200倍、1000倍和5000倍)。

(ii)将病毒(2000PFU/ml)100μl与上述稀释液100μl混合(200PFU/200μl/孔)(对照添加PBS代替血清)。

(iii)在37℃下处理1小时。

(iv)在24孔平板培养为单层状的RAW 264.7细胞中，添加上述混合液每孔100μl(＝约100PFU)，在室温下感染1小时。

(v)叠加添加有1.5％SeaPlaque^TM琼脂糖的DMEM(不含FBS)500μl/孔。

(vi)在2天～3天后添加中性红液约500μl/孔，在37℃下进行处理。

(vii)1小时后除去中性红液，在显微镜下计算噬菌斑数量。

(viii)将对照的噬菌斑数量作为基准(100％)，计算各稀释液的相对噬菌斑数量(％)。在图表中求出抑制50％噬菌斑形成的血清稀释倍数，将其作为中和抗体效价。

＜结果·研究＞

(1)粪便中的病毒量(图1～5)

病毒排泄量在感染1天后达到最大(图1、3)。5-FU处理组与无处理组相比，病毒排泄量多且长期排出(图1～4)。特别是，在对照组中，感染3周后仍检测出病毒(图4)。胶球藻KJ株的藻体在无5-FU处理组和5-FU处理组中均抑制病毒产生，与对照组相比，提前停止病毒排泄(图5)。

(2)中和抗体效价(图6)

无5-FU处理组中，通过给予胶球藻KJ株的藻体，抗体效价显著(p<0.01)上升。在5-FU处理时，两组与对应的无5-FU处理组相比，均为低值，但通过给予胶球藻KJ株的藻体，均可见显著的(p<0.01)抗体效价上升，且与无5-FU处理对照组相比变为高值。

以上结果可进行如下所示的讨论。

·免疫功能降低时，诺如病毒的经肠排泄时间长，推测这与中和抗体产生量低有关。

·胶球藻KJ株的藻体不论在免疫功能正常时还是降低时，都可确认到使肠道内的诺如病毒量减少，缩短病毒排泄时间的效果。认为这是中和抗体量增加的贡献。

3.小鼠诺如病毒(MNV)感染实验2(胶球藻KJ株的MGDG制备物的效果)

＜方法＞

通过与上述2.的实验系统的方法来实施。样品为MGDG制备物，以1mg/天的用量1天2次，口服给药。

对照1A：给予灭菌水；无5-FU处理

对照1B：给予灭菌水；5-FU处置

试验区2A：MGDG制备物1mg/0.4ml/天；无5-FU处置

试验区2B：MGDG制备物1mg/0.4ml/天；5-FU处置。

＜结果·讨论＞

在21天的观察中，接受5-FU注射处理的小鼠中的一部分发现轻度的软便，但未确认到体重减轻等，且全部存活。

(1)粪便中的病毒量(图7～11)

在免疫功能正常小鼠(无5-FU处理)的情况下(图7、8、11)，对照组中，感染1天后病毒量达到最大，此后逐渐减少，18天后检测不到。另一方面，MGDG制备物给予组中，感染1天后的病毒量减少至对照组的1/3，此后也自始至终为低值。而且，MGDG制备物给予组中，感染14天后粪便中的病毒消失。

在免疫功能降低小鼠(5-FU处理)的情况下(图9、10、11)，通过5-FU处置，病毒排泄量变多，排出时间也变长。特别是，对照组中，21天后仍能检测到病毒。另一方面，通过给予MGDG制备物，病毒量在21天中均减少。MGDG制备物给予组中，14天后检测不到病毒。

综上，通过给予MGDG制备物，肠道内的病毒增殖得到抑制，病毒排泄也提前停止。

(2)中和抗体效价(图12)

感染3周后测定中和抗体(使MNV的感染力消失的抗体)的量。在免疫功能正常小鼠(无5-FU处理)的情况下，MGDG制备物给药组中，与对照组相比，抗体效价显著(p<0.001)上升。另外，在免疫功能降低小鼠(5-FU处理)的情况下，与无5-FU处理组相比，对照组和MGDG制备物给药组的任一者的中和抗体效价均低。通过给予MGDG制备物，得到与对照组相比显著(p<0.01)高的抗体效价，其还高于无5-FU处理对照组的抗体效价。

由以上的结果推测，给予MGDG制备物引起的抗体量增加，导致肠道内的病毒增殖抑制。另外，在免疫功能降低的状态下，MGDG制备物也可提前停止病毒排出，因此对于MGDG制备物可预期阻止感染从感染者向周围扩大感染的效果。

4.以猫杯状病毒为靶的杀病毒活性

对于作为诺如病毒代替物而使用的猫杯状病毒(FCV)，评价MGDG制备物是否显示杀病毒活性。

＜方法＞

(1)利用PBS(磷酸缓冲生理盐水)稀释病毒(FCV)储备液，调整为2×10⁵PFU/ml。

(2)在1.5ml微型管中添加样品(特定浓度的MGDG制备物)0.5ml和病毒液0.5ml并进行混合。应予说明，对照添加PBS代替样品。

(3)将样品和病毒液的混合液置于室温下，在0分钟后、1分钟后、10分钟后、30分钟后和60分钟后各采集10μl，与990μl的PBS混合(稀释100倍)。应予说明，该稀释是为了在以下进行的剩余病毒量测定时防止样品造成影响。

(4)将100倍稀释液100μl添加于事先培养为单层状的宿主细胞(源自猫肾的CRFK细胞)，在室温下感染1小时。

(5)叠加噬菌斑测定用培养基，在37℃下培养2～3天。

(6)确认出现噬菌斑后，利用中性红液将细胞固定·染色，在显微镜下测定噬菌斑数量。

(7)将0小时的噬菌斑数量作为基准(100％)，算出各处理时间后的存活病毒量(相对噬菌斑数量)。

＜结果·讨论＞

MGDG制备物(10～200μg/ml)对FCV显示出浓度依赖性·时间依赖性的杀病毒(灭活)活性(图13)。

5.小球藻、微拟球藻、钝顶节旋藻(螺旋藻)和纤细裸藻的MGDG的制备

从小球藻、微拟球藻、钝顶节旋藻(螺旋藻)和纤细裸藻提取MGDG。各藻类的培养使用适应各自的培养基(例如，如果是小球藻，则为图14所示的C培养基；如果为微拟球藻，则为图14所示的ESM培养基；如果钝顶节旋藻(螺旋藻)，则为图15所示的MA培养基；如果是纤细裸藻，则为图15所示的HUT培养基)按照常规方法进行即可(可以采用与上述胶球藻KJ株相同的培养条件)。利用转鼓干燥对通过离心分离从培养液回收的藻体进行干燥，并利用微粉碎机进行粉碎，由此可得到各藻体的干燥粉末。可通过与胶球藻KJ株的情形相同的提取操作从干燥粉末得到各藻类的MGDG制备物。但是，在此次研究中，购买各藻类的加工品(小球藻为“小球藻干燥粉末”(株式会社葵制茶)、微拟球藻为“微拟球藻冷冻品”(Marinetech株式会社)、钝顶节旋藻(螺旋藻)为“Spirulina POWDER”(DIC LIFETEC株式会社)、纤细裸藻为“Inochi Euglena Extreme(いのちのユーグレナ極み)”(Sixth Sense Lab株式会社)和BIO ZYME(裸藻)，供于MGDG的提取(提取操作与胶球藻KJ株的情形相同)。将得到的各MGDG制备物用于以下研究。也从市售的菠菜(Spinacia oleracea)，在冷冻干燥后利用微粉碎机粉碎并提取MGDG，从而得到MGDG制备物。

6.以被牡蛎的浓缩的诺如病毒为靶的杀病毒活性(被诺如病毒污染的牡蛎的净化试验)

(1)污染牡蛎的制作

购买活牡蛎，在自来水流水下，使用刷子充分清洗壳表面后，在洁净室内静置，在紫外线下对壳表面杀菌。接着，将壳表面经过紫外线处理的牡蛎放入进行过滤(孔径0.2μm；Millipore公司制造)灭菌的海水(水温10℃)中，一边通气一边断食饲养1昼夜。接着，将预先制备的小鼠诺如病毒的储备液以终浓度达到2×10⁵PFU/ml的方式投入该过滤灭菌的海水中。然后再饲养1昼夜，由此制备被小鼠诺如病毒污染的牡蛎。

(2)包含MGDG制备物的海水的制备

在MGDG制备物(胶球藻KJ株MGDG制备物、小球藻MGDG制备物、微拟球藻MGDG制备物、钝顶节旋藻(螺旋藻)MGDG制备物、纤细裸藻MGDG制备物、菠菜MGDG制备物)或者将其纯化的MGDG中添加DMSO，均匀地悬浮(MGDG悬浮液)。接着，在过滤(孔径0.2μm；Millipore公司制造)灭菌海水10L中添加MGDG悬浮液，使MGDG的终浓度达到100ppm，得到白浊的包含MGDG的灭菌海水。

(3)净化试验

MGDG处理区将污染牡蛎逐个收纳于装入1L各种MGDG 100ppm的过滤灭菌海水的烧杯。对照区(无MGDG处理)中，在装入1L未添加MGDG的过滤灭菌海水的烧杯中收纳1个污染牡蛎作为对照。将海水温度设为10℃，一边通气一边饲养48小时。经过48小时后，将牡蛎从海水中取出，从壳中取出牡蛎肉，放在滤纸上充分拭去水分。然后放入塑料袋并于-80℃下冷冻保存。通过该操作，不会使蓄积于牡蛎的小鼠诺如病毒流出地进行保存。应予说明，实验数量设定为足以发现比较的显著差异的数量。

(4)存活小鼠诺如病毒的评价

小鼠诺如病毒在牡蛎的消化道中不增殖，因此，基本上可认为添加的小鼠诺如病毒全部被牡蛎摄入且蓄积于消化道内。将(3)中冷冻的牡蛎解冻，从牡蛎摘出消化道，利用一定量的磷酸缓冲生理盐水(PBS)清洗该消化道内，利用PBS稀释该洗涤液100倍。将该100倍稀释液100μl添加到事先培养为单层状的宿主细胞(小鼠巨噬细胞样细胞即RAW264.7细胞)中，在室温下感染1小时。然后叠加噬菌斑测定用培养基，在37℃下培养2～3天。确认出现噬菌斑后，利用中性红液将细胞固定·染色，在显微镜下测定噬菌斑数量。将初始小鼠诺如病毒的浓度2×10⁵PFU/ml作为基准(100％)，算出48小时后的牡蛎消化道中的生存病毒量(相对噬菌斑数量)。

MGDG处理区中，污染牡蛎的小鼠诺如病毒因与摄入的MGDG接触而丧失感染能力，可得到宿主细胞基本上没有产生噬菌斑的结果。

7.有机物存在下的杀病毒效果

诺如病毒感染者的吐泻物、粪便中包含诺如病毒，由其引起的二次感染成为问题。另外，诺如病毒在通常使用的醇系消毒剂中杀病毒效果低，主要使用氯系消毒剂。但是，氯会被吐泻物、粪便等所包含的有机物分解，因此氯系消毒剂中的杀病毒效果减弱。因此，决定研究MGDG制备物在有机物存在下是否发挥杀病毒效果。

＜使用的病毒·试剂等＞

病毒：使用猫杯状病毒(FCV)作为诺如病毒的替代物

使用药剂和浓度：次氯酸钠或胶球藻KJ株MGDG制备物各1000μg/ml

有机物：使用BSA(白蛋白)5％。

＜方法＞

(1)将猫杯状病毒(FCV)调整为2×10⁵PFU/ml。

(2)将MGDG制备物或次氯酸钠调整为最终检测浓度(1000μg/ml)的4倍浓度。

(3)将作为有机物的牛血清白蛋白(BSA)调整为最终浓度(5％)的4倍浓度。

(4)以病毒液：MGDG制备物或次氯酸钠：BSA＝2：1：1进行混合。添加PBS代替MGDG制备物或次氯酸钠的样品作为对照。

(5)室温下放置1分钟、10分钟、60分钟后，利用PBS稀释100倍。以100μl/培养皿的量添加到35mm培养皿中培养为单层状的CRFK细胞中，在室温下感染处理1小时。

(6)叠加添加有1％SeaPlaque琼脂糖的MEM培养基。

(7)2天后，利用结晶紫溶液将出现的噬菌斑固定·染色。

(8)在显微镜下计算噬菌斑数量。

＜结果＞

如图16所示，在不存在有机物(BSA)的情况下，次氯酸钠在1分钟内将病毒100％灭活。但是，在5％的有机物存在下，次氯酸钠的灭活效果显著减弱。另一方面，MGDG的灭活效果在有机物存在下几乎没有变化，与次氯酸钠相比显示出高灭活效果。

8.MGDG制备物中的成分的鉴定1

通过HPLC分析，推定胶球藻KJ株MGDG制备物中包含5种MGDG(称为MGDG1、MGDG2、MGDG3、MGDG4、MGDG5)。为了明确这些MGDG的结构，利用气相色谱(GC/FID)对脂肪酸组成进行分析。分析使用BPX90柱(长度100m×内径0.25mm、膜厚0.25μm)，以氢气为载气。鉴定用标准试样使用FAME Standard(F.A.M.E.Mix,C4-C24，SUPELCO公司制造)和MGDG(MGDG plant，Avanti公司制造)。

将各样品(MGDG1、MGDG2、MGDG3、MGDG4、MGDG5)的色谱图示于图17～21。在此，关于C6:0，通常常见的脂质的脂肪酸组成也一起包含相近的碳原子数(偶数)的脂肪酸，但是在此次分析中几乎没有检测到它们，因此认为该峰不是脂肪酸的可能性高。另外，未知1和未知2在这些峰的保留时间内检测到的脂肪酸在常见的脂质中难以预期，因此认为是脂肪酸以外的成分的可能性高。另一方面，由保留时间可推定未知3和未知4分别为C16:2和C18:2(n-6以外)。

将分析结果示于以下表1、表2。表1为以面积百分率法表示各样品的脂肪酸组成比。表2汇总排除C6:0和不明成分1、2(未知1、2)而算出的结果。应予说明，关于MGDG3，二个成分的面积比极端偏向3：1。这可解释为：脂肪酸残基的组合为(C18:2(n-6以外)和C18:2(n-6以外))与(C18:2(n-6以外)和C18:3n3)这2种MGDG以约1:1的比例混合。

[表1]

“-”表示未检测到。

[表2]

“-”表示未检测到。

如上述所示，明确了MGDG制备物含有(1)构成脂肪酸为C16:3和C18:3(n-3)的单半乳糖甘油二酯(MGDG1)，(2)构成脂肪酸为C16:2和C18:2的单半乳糖甘油二酯(MGDG2)，(3)构成脂肪酸为C18:2和C18:3(n-3)的单半乳糖甘油二酯(MGDG3)，(4)构成脂肪酸为C18:2和C18:2的单半乳糖甘油二酯(MGDG3)，(5)构成脂肪酸为C16:2和C18:2(n-6)的单半乳糖甘油二酯(MGDG4)，以及(6)构成脂肪酸为C18:2(n-6)和C18:3(n-3)的单半乳糖甘油二酯(MGDG5)。

9.MGDG制备物中的成分的鉴定2

使用三重四级杆LC/MS系统，进一步详细研究胶球藻KJ株MGDG制备物所包含的MGDG的结构。

＜解析条件＞

装置名称:三重四级杆LC/MS系统

LC柱:YMC Triart C-18(长度100mm×内径2.1mm，粒径1.9μm)

流动相：甲醇、乙腈、水、乙酸铵

离子源：ESI

测定模式：MS2 scan、Product ion scan。

＜结果＞

利用制备液相色谱(PLC)检测到的5种MGDG(参照8.MGDG制备物中的成分的鉴定1部分))以外，通过三重四级杆LC/MS解析，新检测第6个MGDG。对于这些MGDG(6个峰)，由MSscan和Product ion scan的结果，可鉴定构成各MGDG(峰1：MGDG1、峰2：MGDG2、峰3：MGDG3、峰4：MGDG4、峰5：MGDG5、峰6：MGDG6)的2种脂肪酸侧链。将各MGDG的脂肪酸侧链示于以下表。

[表3]

各MGDG的脂肪酸侧链

10.各MGDG级分的杀病毒活性

比较构成MGDG制备物的各MGDG(MGDG1～MGDG5)的杀病毒活性。

<方法>

(1)将源自胶球藻KJ株的MGDG制备物供于HPLC，通过对各峰进行分离，从而得到5种MGDG纯化物(MGDG1、MGDG2、MGDG3、MGDG4、MGDG5)。另外，准备了制备前的MGDG制备物(含有MGDG1～MGDG5)作为混合品。

(2)在各病毒液(2×10⁵PFU/ml)中混合各样品，使终浓度达到50μg/ml，在37℃下静置60分钟。将使用的病毒和宿主细胞示于表4。

[表4]

评价病毒和宿主细胞

评价病毒	宿主细胞
		甲型流感病毒(IFV)	MDCK细胞
单纯疱疹病毒2型(HSV-2)	Vero细胞
		猫杯状病毒(FCV)	CRFK细胞
脊髓灰质炎病毒1型(Pol-1)	Vero细胞

(3)利用不含胎牛血清的MEM培养基稀释(2)的混合液后，叠加噬菌斑测定用培养基，在37℃下培养2～3天。

(4)确认出现噬菌斑后，利用中性红液将细胞固定·染色，在显微镜下测定噬菌斑数量。以不添加样品时的病毒的出现数为基准(100％)，算出各样品的病毒存活率。由病毒存活率评价各样品的杀病毒性能。

<结果·讨论>

虽然靶病毒不同而使活性存在差异，但是MGDG制备物(混合品)和MGDG1～MGDG5均确认到杀病毒(灭活)活性(图22)。对流感病毒和单纯疱疹病毒2型，MGDG5与MGDG制备物(混合品)相比，显示出显著的灭活效果。在不具有包膜的猫杯状病毒和脊髓灰质炎病毒中，并未显示出显著高于其它样品的活性。以上结果证明MGDG制备物以及构成其的各MGDG具有杀病毒活性，并且表明MGDG5对流感病毒、单纯疱疹病毒2型等具有包膜的病毒发挥特别高的杀病毒活性。

11.各种MGDG制备物的成分比较

利用反相HPLC分析胶球藻KJ株MGDG制备物、小球藻MGDG制备物、微拟球藻MGDG制备物、钝顶节旋藻(螺旋藻)MGDG制备物、纤细裸藻MGDG制备物和菠菜MGDG制备物，比较含有成分(MGDG)。

＜HPLC分析条件＞

装置名：Alliance2695

柱：YMC-Actus Triart C18

流动相：甲醇、水、乙腈混合溶液

检测波长：205nm。

将HPLC的测定结果(色谱图)示于图23和图24。色谱图的纵轴进行了标准化，使各样品的峰最大值达到1。

·KJ株的MGDG制备物中，检测到至少5个峰。另一方面，KJ株以外的各生物的MGDG制备物中，也检测到至少一个与KJ株的MGDG制备物的保留时间一致或非常接近的峰。对于保留时间一致的峰，推测具有与源自KJ株的MGDG相同的化学结构。

·确认到源自KJ株MGDG制备物的5个峰对HSV-2、IFV和FCV的杀病毒活性(10.的实验、图22)。如上述所示，在KJ株以外的各生物的MGDG制备物中，确认到至少1个对应于源自KJ株MGDG制备物的5个峰的峰，因此推测同样具有杀病毒活性。即，可预期这些MGDG制备物与KJ株MGDG制备物相同的效果。应予说明，获知KJ株MGDG制备物的第5个峰对HSV-2、IFV具有高杀病毒活性(图22)。

产业上的可利用性

本发明的抗诺如病毒剂，除发挥抑制诺如病毒增殖的作用以外，还发挥促进病毒从体内排出/排除的作用，在治疗诺如病毒感染症以及二次感染的预防或阻止方面非常有效。另一方面，本发明的抗诺如病毒剂中，其有效成分为源自单细胞藻类(优选为微型藻类)的物质，因此也可预期高安全性。

本发明完全不限定与上述发明的实施方式和实施例的说明。不脱离权利要求书的记载，在本领域技术人员容易想到的范围内的各种变形方式也包括于本发明。关于本说明书中明示的论文、公开专利公报和专利公报等的内容，通过援引而引用其全部内容。

Claims

1.一种抗诺如病毒剂，其特征在于，

包含源自单细胞藻类的物质作为有效成分。

2.根据权利要求1所述的抗诺如病毒剂，其中，

所述单细胞藻类为属于胶球藻属、小球藻属、微拟球藻属、节旋藻属或裸藻属的微型藻类。

3.根据权利要求1所述的抗诺如病毒剂，其中，

所述单细胞藻类为属于胶球藻属的微型藻类。

4.根据权利要求3所述的抗诺如病毒剂，其中，

所述微型藻类为胶球藻KJ株或其突变株。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的抗诺如病毒剂，其中，

所述有效成分为所述单细胞藻类的含有单半乳糖甘油二酯的提取物。

6.根据权利要求5所述的抗诺如病毒剂，其中，

所述抗诺如病毒剂的主要成分为单半乳糖甘油二酯。

7.根据权利要求6所述的抗诺如病毒剂，其中，

所述单半乳糖甘油二酯为选自以下(1)～(6)中的一种以上的单半乳糖甘油二酯：

(1)构成脂肪酸为C16:3和C18:3的单半乳糖甘油二酯；

(2)构成脂肪酸为C16:2和C18:3的单半乳糖甘油二酯；

(3)构成脂肪酸为C18:3和C18:3的单半乳糖甘油二酯；

(4)构成脂肪酸为C16:2和C18:2的单半乳糖甘油二酯；

(5)构成脂肪酸为C18:3和C18:2的单半乳糖甘油二酯；以及

(6)构成脂肪酸为C16:1和C18:2的单半乳糖甘油二酯。

8.根据权利要求5～7中任一项所述的抗诺如病毒剂，其中，

所述有效成分为对所述单细胞藻类的乙醇提取物进行色谱纯化，提高单半乳糖甘油二酯的含量而得到的物质。

9.根据权利要求5～8中任一项所述的抗诺如病毒剂，其中，

所述有效成分中的单半乳糖甘油二酯含量为70％w/v～99％w/v。

10.根据权利要求1～4中任一项所述的抗诺如病毒剂，其中，

所述有效成分为藻体。

11.根据权利要求1～4中任一项所述的抗诺如病毒剂，其中，

所述有效成分为藻体的干燥粉末。

12.一种抗诺如病毒剂，其特征在于，有效成分为选自以下(1)～(6)中的一种以上的单半乳糖甘油二酯：

(1)构成脂肪酸为C16:3和C18:3的单半乳糖甘油二酯；

(2)构成脂肪酸为C16:2和C18:3的单半乳糖甘油二酯；

(3)构成脂肪酸为C18:3和C18:3的单半乳糖甘油二酯；

(4)构成脂肪酸为C16:2和C18:2的单半乳糖甘油二酯；

(5)构成脂肪酸为C18:3和C18:2的单半乳糖甘油二酯；以及

(6)构成脂肪酸为C16:1和C18:2的单半乳糖甘油二酯。

13.根据权利要求1～12中任一项所述的抗诺如病毒剂，其中，

所述抗诺如病毒剂发挥抑制诺如病毒增殖的作用，和/或，促进病毒从体内排出的作用。

14.一种组合物，其特征在于，包含权利要求1～13中任一项所述的抗诺如病毒剂。

15.根据权利要求14所述的组合物，其中，

所述组合物为针对诺如病毒感染症的药物。

16.根据权利要求14所述的组合物，其中，

所述组合物为食品或饲料。