JP2015513911A - 新たに分離したバチルス・リケニフォルミス及びそれを利用したプロバイオティクス - Google Patents

Abstract

本発明は、新たに分離したバチルス・リケニフォルミス菌株とその用途に関するものである。【選択図】図１

Description

本発明は、新たなプロバイオティクス及びその用途に関するものである。

世界人口の増加と生活水準の向上に従い、食品に対する公衆衛生と安定性に関する関心が高まっている。よって、家畜の成長促進と飼料効率向上を目的として添加される抗菌性飼料添加物の残留性と耐性菌の問題が持続的に論争され、２０１１年７月１日からは飼料内に抗生剤と抗菌剤の添加が全面禁止になった。

飼料内への抗生剤添加が全面禁止になることにより、抗生剤の代替素材に関する研究が活発に行われている。

その中、免疫増強剤としてプロバイオティクス（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ）が最も高い関心を受けている。プロバイオティクスは、抗生物質を意味する抗生剤（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）と反対の語源的意味を有するものであり、腸内微生物の均衡に役立つ微生物製剤、又は微生物成分と定義され、ラクトバチルス菌とビフィズス菌などの乳酸菌と称される菌種が代表的である。また、プロバイオティクスはＧＲＡＳ（ＧｅｎｅｒａｌｌｙＲｅｃｏｇｎｉｚｅｄ Ａｓ Ｓａｆｅ）に分類され、人間と動物に対する毒性遺伝子がなく、病原性物質も生産しない。さらに、畜産生産性に対する改善効果が確認された微生物である必要がある。

プロバイオティクスの効能は、強力な付着力で腸粘膜にくっつき腸疾患を誘発する病原菌を競争的に落として体外に排泄させ、抗生剤の投与による腸内菌叢の破壊を速く回復させる。また、病原性微生物の感染に対する予防と増殖抑制、腸内有益菌の発育に最適な環境と増殖の促進、腸内有機酸の主要構成成分である乳酸や酢酸の生産、腸内ｐＨを低下させることによる有害病原菌の発育抑制などの効果がある。さらに、様々な複合的作用により、投与したときにおける正常菌叢の維持と家畜の生産性向上を図ることができる。

主に用いられるプロバイオティクスは、ラクトバチルスとエンテロコッカスなどの乳酸菌とバチルスである。その中で、バチルスはグラム陽性の桿菌であり、内生胞子を形成し、プロバイオティクスとして用いられる菌の中で独特な形態を有する。バチルスは、内生胞子を形成しないラクトバチルスより耐熱性が優秀である。また、胃壁の低いｐＨにも生存するため投与した大部分の菌が小腸まで達することができる（非特許文献１）。

プロバイオティクスの主要機能の一つである家畜の免疫増強の目的で分離したプロバイオティクスの先行技術を調べると、韓国公開特許第１０−２０１１−０３５５５４号（特許文献１）には新たなバチルス属ＣＭＢＬ１とラクトバチルス属ＣＭＢ２０１の混合菌株、これを利用した抗癌・免疫増強用の食品組成物及び抗菌活性を有する微生物製剤が開示されていて、韓国登録特許第１０−０９７７４０７号（特許文献２）には動物の主要貪食細胞である好中球の各種活性の増加と病原性細菌の攻撃接種に対する非特異的な防御能の増進効果を有するチゴサッカロミセス・バイリー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｂａｉｌｉｉ）溶菌抽出物を含有する動物用の免疫増強剤、ワクチン補助剤添加物、補助治療剤、及び飼料添加剤を開示している。バチルスの免疫増強効果に対する研究は多くなされていないのが現状である。

また、プロバイオティクスによる乳酸の生産は、主にラクトバチルスの主要な特徴として知られているが、バチルス・ポリファーメンチカスＫＪＳ−２菌株の乳酸生産を報告した論文がある（非特許文献２）。

よって、本発明者らは、韓国の伝統的発酵食品であるテンジャンから消化酵素と乳酸を生産するプロバイオティクスを分離し、これらの形態的・生化学的・遺伝的特性を確認した。その結果、前記プロバイオティクスが耐熱性に優れているバチルスであることと、前記バチルスは、免疫マウスの脾臓細胞・骨髄細胞を増殖させる免疫増強効果と抗体生成を増加させるワクチン補助剤の効果だけでなく、骨髄移植マウスにおいて骨髄細胞の増殖効果が優秀であることを確認した。

韓国公開特許第１０−２０１１−０３５５５４号 韓国登録特許第１０−０９７７４０７号

Ｂａｒｂｏｓａ， Ｔ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ７１（２００５） ９６８−９７８；Ｓｐｉｎｏｓａ， Ｍ． Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｓ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５１（２０００） ３６１−３６８ Ｋｉｍ， Ｋ． Ｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １９（２００９） １０１３−１０１８

本発明の目的は、消化酵素と乳酸を生産し、免疫増強活性を有する新たなバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１を提供することである。

本発明の他の目的は、前記バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１の培養液、その濃縮液、及びその乾燥物からなる群より選択される培養物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１、又は前記培養物を含むプロバイオティクス製剤を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記プロバイオティクス製剤を含む飼料添加剤を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記飼料添加剤を含む飼料を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記プロバイオティクス製剤を含む免疫増強用製剤、又はワクチン補助製剤を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記プロバイオティクス製剤を含有する免疫増強用健康機能性食品を提供することである。

本発明のある実施態様において、消化酵素と乳酸を生産する新たなバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１が提供される。

具体的に、本発明のバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１は、韓国の伝統食品であるテンジャンから分離して得られた。本発明の菌株の形態学的特徴は、グラム陽性桿菌であり、配列番号１の１６ｓｒＤＮＡ塩基配列を有する。前記塩基配列の分析結果、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）と９９％の相同性を有していた。よって、本発明者らは、新たに分離したバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１を２０１２年３月２２日に、韓国微生物保存センター（ＫｏｒｅａｎＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、ソウル市西大門区弘濟１洞３６１−２２１）に寄託番号ＫＣＣＭ１１２６９Ｐとして寄託した。

具体的に、韓国の伝統食品である７０〜８０日目のテンジャンを採取し、ＢＨＩ（Ｂｒａｉｎｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ）固体培地から分離した。分離菌株は、アミラーゼ、セルラーゼ、マンナーゼ、キシラナーゼなどの有用な消化酵素活性が優秀であり、通性嫌気と嫌気条件で２４時間以上培養したとき、乳酸を生産する特徴を有している。前記菌株の培養上澄液は、マウス脾臓内のｎｏｎ−Ｔ細胞、マウス骨髄、人間末梢血液の活性を増加させてマウスＢ細胞に特異的に強い免疫増強効果があり、培養上澄液の分子量１、０００ＫＤａ以上の分画を抗原と共に注射した場合、抗原による抗体生成の補助効果があった。

また、前記菌株の培養上澄液から分子量１，０００ｋＤａ以上を分画して得た分画物を、放射線照射したマウスに骨髄移植した後投与した場合、移植された骨髄細胞の増殖反応を増加させ、マウスの生存率が高くなる効果があった。

他の実施態様において、本発明の新たに分離した菌株の培養液、その濃縮液、その乾燥物からなる群より選択される培養物が提供される。

本発明の新たに分離した菌株は、通常的なバチルス菌株の培養方法により培養することができる。培地は、天然培地、又は合成培地を用いることができる。培地の炭素源は、例えば、グルコース、スクロース、デキストリン、グリセロール、デンプンなどがあり、窒素源としてペプトン、肉類抽出物、酵母抽出物、乾燥された酵母、大豆、アンモニウム塩、硝酸塩、及びその他の有機・無機窒素含有化合物などがあるが、これらの成分に限らない。培地に含まれる無機塩は、マグネシウム、マンガン、カルシウム、鉄、カルシウムなどがあるが、これらの成分に限らない。前記炭素源、窒素源、及び無機塩の成分以外に、アミノ酸、ビタミン、核酸、及びそれに関わる化合物が培地に添加され得る。本発明の新たに分離した菌株は、２０〜４０℃の温度条件範囲で１２時間〜４日間培養することができる。

具体的に、新たに分離した菌株の培養液は菌体を含む培養原液であることもできるし、前記培養原液から培養上澄液を除去した液、及び／又は、それの濃縮液であり得る。前記培養液の組成には通常のバチルス培養に必要な成分だけでなく、バチルスの成長に上昇的に作用する成分をさらに含むこともでき、それによる組成は当該技術分野において通常の知識を有する者により容易に選択できる。

また、菌株の状態は、液状状態、又は乾燥状態であり得る。乾燥方法は、通風乾燥、自然乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥ができるが、これらに限らない。

また他の実施態様において、本発明の新たに分離した菌株、又は培養物を有効成分として含むプロバイオティクス製剤が提供される。

プロバイオティクスは、腸内の消化管の壁に定着し、有害菌の定着と病原菌の増殖を抑制する。また、プロバイオティクスが生産する有益な消化酵素は栄養素の吸収と利用を容易にすることで飼料要求率を改善する。

本発明のプロバイオティクス製剤は、５×１０^４ないし５×１０^１０ＣＦＵ／ｍｌのバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１を含み、好ましくは１×１０^６ないし１×１０^９ＣＦＵ／ｍｌのバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１を含む。

前記プロバイオティクス製剤は薬学的に許容される担体をさらに含むことができ、前記担体と共に製剤化されて、食品及び飼料添加剤として提供できる。

本発明において用語“薬学的に許容される担体”は、生物体を刺激せず投与化合物の生物学的活性・特性を阻害しない担体、又は希釈剤を意味する。

液状溶液として製剤化されるプロバイオティクス製剤に許容できる薬学的担体として、滅菌と生体に適合するものは、食塩水、滅菌水、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、及びこれらの成分の一つ以上を混合して用いることができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、及び潤滑剤を付加的に添加し、水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒、又は錠剤に製剤化することができる。また、プロバイオティクス製剤の品質低下を防止するため添加する決着剤、乳化剤、保存剤、効果増大のため飼料に添加するアミノ酸剤、ビタミン剤、酵素剤、香味剤、非タンパク質態窒素化合物、ケイ酸塩剤、緩衝剤、抽出剤、オリゴ糖などがある。その他、飼料混合剤などをさらに含むこともできるが、これらに限定されない。

本発明のプロバイオティクス製剤を有効成分として含む経口投与用剤形は、例えば、錠剤、トローチ、ローゼンジ、水溶性又は油性懸濁液、調剤粉末、又は顆粒、エマルション、ハード又はソフトカプセル、シロップ、又はエリキシル剤に製剤化することができる。錠剤、及びカプセルなどの剤形として製剤化するために、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アミロペクチン、セルロース、又はゼラチンなどの結合剤、ジカルシウムホスフェートなどの賦形剤、トウモロコシ澱粉、又はサツマイモ澱粉などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ナトリウムステアリルフマラート、又はポリエチレングリコールワックスなどの潤滑剤を含むことができ、カプセル剤形の場合上述した物質以外にも脂肪油などの液体担体をさらに含むことができる。

さらに他の実施態様において、本発明は前記プロバイオティクス製剤を有効成分として含む飼料添加剤に関するものである。

通常的に、バチルス種は内生胞子を形成し、熱に非常に安定的特徴がある。したがって、新たに分離した前記バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１は、飼料添加剤形態に別に製造して飼料に混合するか、飼料製造のときに直接添加して製造することができる。本発明の飼料内のバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１は、液状、又は乾燥状態であることができ、好ましくは乾燥された粉末形態である。乾燥方法は、通風乾燥、自然乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥ができるが、これらに限定されない。本発明のバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１は粉末形態で、飼料重量の０．０５ないし１０重量％、好ましくは０．１ないし１重量％の成分比で混合できる。また、前記飼料は、本発明のバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１の他に飼料の保存性を高められる通常の添加剤をさらに含むことができる。

本発明の飼料添加剤は、濃縮液、粉末、及び顆粒からなる群より選択される形態で提供することができる。前記濃縮液は、飼料添加剤の総重量の中、本発明のバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１菌株、その培養液、又はその乾燥物、又はプロバイオティクス製剤を２０重量％ないし９０重量％で含むことができる。

本発明の飼料添加剤は、浸漬、噴霧、又は混合して、前記動物飼料に添加して利用することができる。

本発明の飼料添加剤を添加した飼料が使用できる動物は、例えば、豚、牛、羊、ヤギ、馬、ウサギ、犬、猫などの家畜、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、七面鳥、ウズラなどの家禽類が含まれるが、これらに限らない。

本発明の飼料添加剤を含む動物用飼料の配合方法は、前記組成物を動物飼料に、乾燥重量を基準として０．０５ないし０．５重量％混合する。本発明に用いられた用語“％”は、特に定義がなければ重量％を意味する。

他の実施態様において、本発明の飼料添加剤を含む飼料が提供される。

本発明のバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１を含む飼料には、植物性として、穀物類、根果類、食品加工副産物類、藻類、繊維質類、油脂類、澱粉類、フクベ類、穀物副産物類など、動物性としてタンパク質類、無機物類、油脂類、鉱物性類、油脂類、単細胞タンパク質、動物性プランクトン類、魚粉などがあるが、これらに限定されない。

本発明のさらに他の目的は、前記新たな菌株、又は、培養液、その濃縮液、又はその乾燥物を有効成分として含む免疫増強用製剤、又はワクチン補助製剤を提供することである。

前記バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、ＣＪＭＰＢ３６１；寄託番号ＫＣＣＭ１１２６９Ｐ）、その培養液、その濃縮液、又はその乾燥物は、分子量１００ないし３００ｋＤａの分画物、又は１，０００ｋＤａ以上の免疫増強活性を有する分画物を含む。

具体的実施例において、前記バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１の培養上澄液を分子量別に分離した後リンパ球増殖活性を測定した結果、１，０００ｋＤａ以上、１００〜３００ｋＤａの分子量でマウス脾臓細胞の増殖が優秀であった（図３）。とりわけ、Ｂ細胞で培養上澄液の濃度依存的な増殖反応を示し、Ｂ細胞の他にもｎｏｎ−Ｔ、ｎｏｎ−Ｂ細胞の増殖反応を増加させた。増殖効果は分子量１，０００ｋＤａ以上の範囲でより高かった（図５、図６）。特に、前記１，０００ｋＤａ以上の培養上澄液は、抗原による抗体精製に補助剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）効果があることを確認した。

また、７．５Ｇｙ放射線量を照射したマウスにおいて、骨髄細胞と前記１，０００ｋＤａ以上の培養上澄液を処理したグループは、１００％生存した（図８ａ）。９Ｇｙを照射した場合には分画された１，０００ｋＤａ以上の培養上澄液を投与したグループで、６６％の生存率を示した（図８ｂ）。この結果は、前記菌株の分画された１，０００ｋＤａ以上の培養上澄液が移植された骨髄細胞の増殖を誘導し、放射線照射マウスの生存率を高めるためである。したがって、白血病患者の骨髄移植細胞の増殖反応を増強するための使用可能性を提示することができる。

本発明の免疫増強用製剤、及びワクチン補助製剤は、組成物の総重量に対して、前記菌株、又は菌株培養液、濃縮液、又はその乾燥物を０．１ないし５０重量％含む。

本発明の免疫増強活性製剤は、動物、又は人間に発生できる免疫低下症の予防、又は治療補助剤として使用できる。また、本発明のワクチン補助製剤は、抗原と共に動物の体内に投与し抗原に対する全身性免疫反応を誘導するための補助製剤として使用できる。前記抗原は、真菌、放線菌、細菌、ウイルス、原虫、これら微生物の成分、組織、細胞成分、抗原蛋白、抗原ペプチドからなされる群より選択される一つ、又は二つ以上の抗原と混合して使用することができる。

本発明の菌株、又は培養液、その濃縮液、又はその乾燥物を含む免疫増強用の製剤、及びワクチン補助製剤の薬学的組成物の製造には通常的に用いる適切な担体、賦形剤、及び希釈剤をさらに含むことができる。

本発明の免疫増強用製剤、又はワクチン補助製剤は、各々通常の方法により、分散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルション、シロップ、エアゾールなどの経口剤形、外用剤、座剤、滅菌注射溶液の形態で剤形化して使用することができ、培養液、その濃縮液、又はその乾燥物を含む組成物に含まれることができる担体、賦形剤、及び希釈剤としてラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、鉱物油などがある。製剤化の場合には通常用いられる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤、又は賦形剤を用いて調剤される。経口投与用の固形製剤には錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などがあり、これらの固形製剤は前記培養液、その濃縮液、又はその乾燥物に少なくとも一つの賦形剤を混合して製造する。経口用の液状製剤には、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などがあり、よく使用される単純希釈剤である水、リクイッド、パラフィンの他様々な賦形剤を含むことができる。非経口投与用の製剤には滅菌された水溶液、非水溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤などがある。非水溶剤、懸濁剤にはプロピレングリコール、ポリエチレングリコールオリーブオイルなどの植物性油、エチルオレートなどの注射可能なエステールなどが用いられる。座剤の基剤にはウイテプソル、マクロゴール、ＴＷＥＥＮ６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが用いられる。

本発明の免疫増強用製剤とワクチン補助製剤の好ましい投与量は患者の状態、体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路、期間によって異なるが、当業者により適宜選択される。しかし、好ましい効果のため、本発明の免疫増強用製剤とワクチン補助製剤を一日当たり０．００１ないし１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．００１ないし１０ｍｇ／ｋｇを投与ことが良い。投与は、一日に一回することも、数回に分けて投与することもできる。前記投与量はいかなる面においても本発明の範囲を限定するものではない。

本発明の免疫増強用製剤とワクチン補助製剤は、家畜、家禽類、人間、哺乳動物に多様な経路で投与できる。投与方法は、経口、筋肉、皮下、静脈、注射により投与できる。

本発明の他の目的は、前記新たな菌株、又はプロバイオティクス製剤、又は免疫増強用製剤を有効成分として含有する免疫増強用の健康機能性食品を提供することである。

本発明のプロバイオティクス製剤、又は免疫増強用製剤を添加する食品として各種食品類、飲料、ガム、茶、健康機能性食品類などがある。

また、免疫力増強効果を目的として食品、又は飲料に添加することができる。この際、食品又は飲料の中において、本発明の新たな菌株、又はプロバイオティクス製剤、又は免疫増強用製剤の量は、全食品重量の０．０１ないし５０重量％で添加することができ、健康飲料組成物は１００ｍｌを基準として０．０５ないし５重量％で添加することができる。本発明の健康機能性食品は、錠剤、カプセル剤、液剤などの形態がある。

本発明の健康飲料組成物は、上述の割合で必須成分として本発明の新たな菌株、又はプロバイオティクス製剤、又は免疫増強用製剤を含有する以外に、他の成分として特に限定されず、通常の飲料のように様々な香味剤、天然炭水化物などを追加成分として含むことができる。前記天然炭水化物は、ブドウ糖、果糖、マルトース、スクロース、デキストリン、シクロデキストリンなどの通常の糖、及びキシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールである。また、香味剤としてタウリン、ステビア抽出物などの天然香味剤、及びサッカリン、アスパルテ−ムなどの合成香味剤を使用することができる。

前述したもの以外の本発明のプロバイオティクス製剤、又は免疫増強用製剤は、様々な栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、風味剤、着色剤、及び香味増進剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸とその塩、アルギン酸とその塩、有機酸、保護コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭酸化剤などを含むことができる。そのほか、本発明の抽出物は、天然フルーツジュース、及びフルーツジュース飲料、野菜飲料の製造のための果肉を含むことができる。これらの成分は、一つ、又は二つ以上を組合わせて用いることができる。

本発明の新たに分離したバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１は、アミラーゼ、セルラーゼ、マンナーゼ、キシラナーゼなどの消化酵素と乳酸の生産に優れていて、動物の免疫増強活性と抗体を生産する補助効果が優秀であり、白血病患者の骨髄移植細胞の増殖反応増強を誘導できる効果を有する。

したがって、新たに分離したバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１はプロバイオティクスとして利用できるだけでなく、動物の免疫増強用製剤とワクチン補助製剤として利用することができる。

図１は、本発明のバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１菌株を電子顕微鏡で撮影した菌株の写真である。 図２は、本発明のバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１の溶血性有無を示す図である。 図３は、本発明のバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１の培養上澄液を分子量別分画によりマウスリンパ球の増殖反応を示すグラフである。 図４は、本発明のバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１の培養上澄液の分子量別分画により、マウス脾臓細胞（リンパ球）、骨髄細胞、胸腺細胞の増殖反応を示すグラフである。 図５は、本発明のバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１の培養上澄液の分子量別分画により、ｉｎｖｉｔｒｏ条件においてマウス脾臓Ｂ細胞増殖反応を示すグラフである。 図６は、本発明のバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１の分画された１，０００ｋＤａ以上の培養上澄液をマウス腹腔に投与したとき、生体内のマウスリンパ球増殖反応を示すＦＡＣＳ結果である。Ａはｉｓｏｔｙｐｅ対照区、Ｂ〜Ｅは１００ｋＤａ以上の培養上澄液を各々０．６７ｍｇ、１．３５ｍｇ、２．７ｍｇ、５．４ｍｇ投与したときのＦＡＣＳ結果である。 図７は、本発明のバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１の分画された１，０００ｋＤａ以上の培養上澄液を抗原と投与したとき、抗体生成補助効果を評価したグラフである。 図８は、本発明のバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１の分画された１，０００ｋＤａ以上の培養上澄液を、骨髄移植後において細胞増殖に与える効果を放射線照射したマウスで評価した後、その斃死率を示すグラフである。Ａは７．５Ｇｙで放射線照射したマウスから評価したグラフであり、Ｂは９Ｇｙで放射線照射したマウスから評価したグラフである。

下記において、実施例により本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するもので、本発明の範囲がこれらの実施例に限られることではない。

実施例１：バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１（ＢａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓＣＪＭＰＢ３６１）菌株の分離と同定
（１）試料の用意と菌株の分離
韓国の伝統食品である７０〜８０日目のテンジャンを採取し、用意した試料を段階的に希釈し、３％塩化ナトリウムが添加されたＢＨＩ固体培地（Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ）に塗抹した後、３７℃の条件で２４時間培養した。前記試料で優占した菌株を分離した。選別されたコロニーは３回にわたって新しい培地に移して培養する方法で純粋分離し、純粋培養された菌を２０％グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）が添加された培地に入れて−７０℃以下で保存した。

（２）形態学的、生化学的特性の調査
前記分離された菌株を同定するため、１次的に形態学的、生化学的調査を行った。形態的特徴は、グラム染色の結果グラム陽性であり、電子顕微鏡撮影の結果桿菌であることを確認した（図１）。生化学的特性を分析するためＡＰＩ５０ＣＨＢ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ、フランス）で菌株の糖発酵パターンを分析した（表１）。表１の結果をまとめた結果、ＡＰＩ５０ＣＨＢ ｓｙｓｔｅｍによると、前記分離された菌株はバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）と９９％の相同性を有することが確認された。

＋：陽性； −：陰性

（３）菌株の同定
菌株のより正確な同定のため、ＤＮＡ塩基配列による分子系統分類学的方法を行った。塩基配列分析はＰＣＲｐｒｅｍｉｘ（バイオニア、韓国）とユニバーサルプライマー２７Ｆ（５’ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣMＴＧＧＣＴＣＡＧ３’：配列番号２）、及び１４９２Ｒ（５’ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ３’：配列番号３）を用いて、１６ｓ ｒＤＮＡの遺伝子を増幅した。遺伝子増幅の際、総反応液は２０μｌに合わせて、９４℃で１分、５６℃で１分、７２℃で１分を３０回繰り返し、増幅されたＤＮＡ塩基配列を分析した。分離菌株の分析された１６ｓｒＤＮＡの塩基配列は配列番号１に示す。前記分析の結果、バチルス・リケニフォルミスと９９％の相同性を有する微生物として同定された。よって、分離された前記菌株を、バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１に命名し、前述の方法により同定された本発明の新たな微生物は、２０１２年３月２２日、韓国微生物保存センターに、バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＣＪＭＰＢ−３６１）として寄託された（寄託番号ＫＣＣＭ１１２６９Ｐ）。

実施例２：バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１菌株のプロバイオティクス特性を分析
（１）分離菌株の消化酵素活性
１）助酵素液の採取
前記分離した菌株をＢＨＩ液体培地で、２４時間培養した後、培養液を酵素活性の分析のための助酵素液に用いて、下記の通り各酵素別に各々の基質が入っている培地を用いて、基質分解の程度を判定した。

２）セルラーゼ（Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ）活性
１％ＣＭＣ（ｃａｒｂｏｘｙｌ ｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）基質が添加されたＹＭ培地を製造した。上記で採取した助酵素液を２μｌずつ基質培地に分株し、３７℃で１５時間反応した後、０．２％のコンゴーレッド（Ｃｏｎｇｏｒｅｄ）水溶液で３０分間染色し、１Ｍ ＮａＣｌ水溶液で脱色した。助酵素液周囲の基質が分解されて生じる透明環（ｃｌｅａｒ ｚｏｎｅ）の形成程度により酵素の活性能力を測定した。

３）アミラーゼ（Ａｍｙｌａｓｅ）活性
１％の可溶性デンプン（ｓｏｌｕｂｌｅ ｓｔａｒｃｈ）基質が添加されたＹＭ培地を製造した。上記で採取した助酵素液を２μｌずつ基質培地に分株し、３７℃で１５時間反応した。Ｉ_２とＫＩが各々０．１％、２％添加された水溶液で染色した後、助酵素液周囲の基質が分解されて生じる透明環（ｃｌｅａｒｚｏｎｅ）の形成程度により酵素の活性能力を測定した。

４）キシラナーゼ（ｘｙｌａｎａｓｅ）活性
１％キシラン（ｘｙｌａｎ）が添加されたＹＭ培地を製造した。培養液を２μｌずつ基質培地に分株し、３７℃で１５時間反応した後、０．２％コンゴーレッド水溶液で３０分染色し、１ＭＮａＣｌ水溶液で脱色した。透明環の形成程度により酵素の活性能力を測定した。

５）マンナーゼ活性
１％マンナン（ｌｏｇｕｓｔ ｂｅａｎ ｇｕｍ、ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）が添加された基質培地（Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ３ｇ／Ｌ、Ｐｅｐｔｏｎｅ ５ｇ／Ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４ １ｇ／Ｌ、Ａｇａｒ２０ｇ／Ｌ、ｐＨ５）を製造した。培養液を２μｌずつ基質培地に分株し、３７℃で１５時間反応した後、透明環の形成程度により酵素の活性能力を測定した。

新たに分離した菌株バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１は表２に示したとおり、セルラーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、マンナーゼに対する消化酵素活性があった。特に、キシラナーゼとマンナーゼに対する活性が高かった。

−：活性無し、＋；活性有り、＋＋：活性優秀、＋＋＋：活性非常に優秀

（２）乳酸（ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）の生産性
前記分離菌株の乳酸生産を評価するため、２５０ｍｌのフタがあるフラスコにＰＳＧ液体培地（ポリペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、ブドウ糖２０ｇ／Ｌ、第２リン酸カリウム３５ｇ／Ｌ）１００ｍｌに前記分離菌株を１％接種して、３７℃、２００ｒｐｍで２４時間培養した。培養の終了後、培養上澄液においての乳酸生産量をＨＰＬＣを利用し定量した。乳酸の転換率は下記のように計算した。
乳酸の転換率＝（乳酸の生産率／初期の糖濃度）×１００

前記菌株は９３．５％の乳酸を転換したことを示した。論文報告によると、乳酸を生産するバチルス・ポリファーメンチカスの乳酸転換率が６０．７％であると報告し（Ｋｉｍ、Ｋ． Ｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９（２００９） １０１３−１０１８）、前記分離菌株のバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１がより多くの乳酸を転換することを確認した。よって、前記分離菌株であるバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１は乳酸生産の特徴を有することがわかった。

（３）内生胞子の形成能力
バチルスは、必須栄養源の中で一つ以上の栄養源が枯渇するなどのストレスを受けると生存のため内生胞子を形成する。内生胞子は、紫外線、高温、低温、乾燥、及び高圧などの極限環境に抵抗性を有するため、内生胞子の形成はバチルスの生存率を維持することにおいて非常に重要である。よって、バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１を長時間培養し、内生胞子の形成能を確認した。

ＢＨＩ液体培地に菌を０．１％接種し、３７℃、２００ｒｐｍで２４時間、４８時間培養した。各時間帯別に培養液をＢＨＩ固体培地に塗抹して総菌数を測定し、９５℃で１０分間熱処理した培養液をＢＨＩアガー（Ａｇａｒ）培地に塗抹して、内生胞子の数を測定した。

上記表３に示した通り、バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１を２４時間培養したとき、約０．３％が内生胞子を形成し、４８時間培養したとき７８％が内生胞子を形成した。本発明のバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１は、４８時間以上培養したとき高い内生胞子形成能を有し、プロバイオティクスとして使用したら、高い生存率の特性を維持することができる。

（４）溶血性（β−ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ）
β−溶血は、有害菌の中でリン脂質酵素を生産し赤血球により供給されるリン脂質を加水分解して赤血球を溶血させる作用がある。

分離菌株の溶血性を調べるため５％の羊血液（ｓｈｅｅｐ ｂｌｏｏｄ、ギサンバイオテック、韓国）が含まれているＴＳＡ（Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ）を製造した。製造された前記血液寒天培地に画線接種（ｓｔｒｅａｋｉｎｇ）した後、３７℃で２４時間培養し溶血有無を確認した結果、図２に示したとおり、溶血性を表さないことを確認することができた。

実施例３：バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１菌株の免疫増強活性
（１）リンパ球の増殖反応の検査
６〜７週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（オリエント（株）、韓国）を吸入麻酔器により殺して脾臓を採取し、脾臓を滅菌したスライドグラス２枚で軽く圧縮しリンパ球を遊離させた。分離したリンパ球は細胞培養培地であるＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）で３回洗浄した。また、細胞浮遊液内にある赤血球を除去した後、１０％ウシ胎児血清が含有されたＲＰＭＩ１６４０培地で２ｘ１０^６ｃｅｌｌ／ｍｌを浮遊させた。試験試料のバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１を２４時間培養した上澄液をＰＲＭＩ１６４０培地で１：２０の割合で１次希釈した後、２倍ずつ段階希釈した。

浮遊させた前記リンパ球を９６ウェル（ｗｅｌｌ）プレートに１００μｌずつ分株し、用意した試料を１００μｌずつ添加した。前記プレートは３７℃、５％のＣＯ_２培養器で二日間培養した後、ｔｒｉｔｉａｔｅｄｔｈｙｍｉｄｉｎｅ（３Ｈ ＴｄＲ、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ、Ｂｏｓｔｏｎ）１０μｌを各々のウェルに添加し６時間延長培養した。培養した細胞は、グラスファイバーフィルター（ｇｌａｓｓｆｉｂｅｒ ｆｉｌｔｅｒ）に吸着させて室温で２４時間乾燥した後、Ｍｅｌｔ−ｏｎｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｏｒ ｓｈｅｅｔ（ＭｅｌｔＬｅｘＴＭＡ、 Ｗａｌｌａｃ）をｆｉｌｔｅｒｍａｔ上に載せて恒温器の上で１〜４分間溶かした。Ｌｉｑｕｉｄｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ１４５０、Ｔａｉｌｕｘ）により細胞内に吸収された３Ｈ ＴｄＲの量を測定した結果、前記バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１がリンパ球を増殖することを確認した。前記菌株の培養上澄液を分子量別に分離した後、上記の方法と同様にリンパ球の増殖活性を測定した結果、図３の通り、１，０００ｋＤａ以上、１００〜３００ｋＤａの分子量でマウス脾臓細胞の増殖が優秀であった。

（２）骨髄細胞と胸腺細胞の増殖反応
骨髄細胞の分離は前記ＢＡＬＢ／ｃマウスの大腿部をハサミで両末端を切断し、ＲＰＭＩ１６４０培地の入った１０ｍｌ注射器の注射針を切断した大腿部に差し込み骨髄細胞を遊離させた。また、胸腺細胞は、脾臓細胞の分離と同じ方法で胸腺から分離した。骨髄細胞と胸腺細胞の増殖反応は前記脾臓細胞の増殖反応試験と同様に行った。

＊試験結果：バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１培養上澄液の分子量が１，０００ｋＤａ以上、１００〜３００ｋＤａの分画が、脾臓リンパ球と骨髄細胞を増殖させ、胸腺細胞では増殖反応を示さなかった。したがって、前記分画がＴ細胞の増殖には影響しないことを分かった（図４）。

（３）ｉｎ ｖｉｔｒｏでマウス脾臓のＢ細胞への効果
分子量別に分画したバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１の培養上澄液の中でどの分子量の物質が脾臓細胞の増殖反応を誘導するか否かを調べるため、マウス脾臓のリンパ球からＢ−細胞とｎｏｎ−Ｂ細胞を分離した。一般的な正常マウス脾臓細胞のＴ細胞、Ｂ細胞、ｎｏｎ−Ｔ細胞、ｎｏｎ−Ｂ細胞の割合をＦＡＣＳ分析して調査した結果は表４に示す。この脾臓リンパ球からＢ細胞をマグネティックセル（ｍａｇｎｅｔｉｃｃｅｌｌ）選択方法を利用して分離し、ＦＡＣＳ分析すると、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ｎｏｎ−Ｂ細胞、及びｎｏｎ−Ｔ細胞の割合が０．１％、９４．６％、４．７％であり、分離したＢ細胞は非常に高い純度を示し、脾臓リンパ球からＢ細胞を分離した残りのｎｏｎ−Ｂ細胞にはＴ細胞、Ｂ細胞、ｎｏｎ−Ｂ細胞、ｎｏｎ−Ｔ細胞が、各々、４６．８％、４％、２２．３％、２７％であった（表４）。

上記の分離されたＢ細胞とｎｏｎ−Ｂ細胞に３つの分画された分子量のバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１を入れ、前記脾臓細胞の増殖反応と同一方法により培養した結果、図５に示したとおり分子量が１，０００ｋＤａ以上と分子量１００−３００ｋＤａの分画でＢ細胞の増殖反応を示し、Ｂ細胞の他にｎｏｎ−Ｔ、ｎｏｎ−Ｂ細胞も増殖反応を増加させた。増殖の効果は分子量１，０００ｋＤａ以上でもっとも高かった（図５）。

（４）ｉｎ ｖｉｖｏでマウス脾臓のＢ細胞への効果
生体内において、免疫増強物質がマウスリンパ球と骨髄細胞増殖の免疫反応に及ぶ効果を調べるため、バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１の分画された１，０００ｋＤａ以上の培養上澄液を腹腔を通じて投与した。投与２日後と３日後にマウスを殺して脾臓を分離した。分離された脾臓の重さを測定し、脾臓リンパ球の数の変化をＦＡＣＳで測定した。免疫増強物質をマウスの腹腔を通じて、０．６７ｍｇ、１．３５ｍｇ、２．７ｍｇ、５．４ｍｇを投与した場合、脾臓のサイズが各々１５％、２０％、９８％、５１％増加した。脾臓リンパ球のＦＡＣＳ分析において、０．６７ｍｇ投与群のＢ細胞の割合には変化がなかったが、１．３５ｍｇ投与群ではＢ細胞の割合が４１％から４５．３％に増加し、２．７ｍｇ投与群では４７．６％、５．４ｍｇ投与群では４９．７％に増加した。したがって、Ｂ細胞はバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１の分画された１，０００ｋＤａ以上の培養上澄液の濃度に依存的に増殖反応を表すことを示した（図６）。

（５）抗体生成増加に及ぶ補助剤効果
バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１の分画された１００ｋＤａ以上の培養上澄液が、抗原による抗体生成において補助剤の役割ができるかを調べた。ＢＡＬＢ／ｃマウスを３グループに分けて、以下のようにオボアルブミン（ＯＶＡ）とバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１の分画された１，０００ｋＤａ以上の培養上澄液を投与した。Ａグループは生理食塩水、ＢグループはＯＶＡ１００μｇを背皮下に注射、ＣグループはＯＶＡ１００μｇを背皮下に注射後２日ごとに前記菌株の分画された１，０００ｋＤａ以上の培養上澄液を腹腔注射した。免疫は抗原であるＯＶＡ１００μｌ（１ｍｇ／ｍｌ）をマウスの皮下に注射し、菌株の分画された１，０００ｋＤａ以上の培養上澄液は腹腔に１００μｌ（２．７ｍｇ）注射した。抗体を測定するため最終注射の３日後にマウスの下大静脈から血液を採取して血清を分離し、ＯＶＡに対する特異抗体はＥＬＩＳＡ方法で測定した。先ず、ＯＶＡをコーティングバッファー（０．０３ＭＮａ_２ＣＯ_３、０．０６８Ｍ ＮａＨＣＯ_３、ｐＨ９．４〜９．８）に２μｇ／ｍｌの濃度に希釈して９６ウェルプレートに１００μｌずつ添加した後、４℃で１５時間反応した。０．１％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）の添加されたリン酸緩衝溶液（洗浄バッファー）で３回洗浄した。洗浄したプレートを１％ウシ血清アルブミンが含まれた溶液で非特異的結合を遮断するため１時間反応した。プレートを洗浄バッファーで５回洗浄した後、用意したマウス血清を段階希釈して添加し２時間反応した。反応が終わったら、プレートを洗浄バッファーで５回洗浄した後、２次抗体（ｇｏａｔａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を希釈して添加し、１時間反応した。さらにプレートを５回洗浄してＴＭＢ基質を添加し、３０分間発色した後、０．１２ＭのＨ_２ＳＯ_４溶液を入れて反応を止めて４５０ｎｍで吸光度を測定した。

図７に示したとおり、生理食塩水だけ投与した処理区では、ＯＶＡに対する特異抗体が測定されず、ＯＶＡだけ投与した処理区ではＩＢＡに対する特異抗体が生成されるが抗体価が低かった。ＯＶＡと前記菌株の分画された１，０００ｋＤａ以上の培養上澄液を共に投与した処理区ではＯＶＡだけ投与した処理区に比べ抗体価が相当増加することを確認した。これは、前記菌株の分画された１，０００ｋＤａ以上の培養上澄液が、抗原による抗体生成に補助剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）の効果があることを意味する。

（６）骨髄移植後において細胞増殖に及ぶ効果
バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１の分画された１，０００ｋＤａ以上の培養上澄液がＢ細胞だけでなく骨髄細胞と脾臓のｎｏｎ−Ｔ、ｎｏｎ−Ｂ細胞の増殖反応を増加させることを確認し、この免疫物質が放射線照射を受けたマウスに移植した骨髄細胞の増殖有無を調べた。マウスの骨髄細胞を破壊するためマウスを放射線照射した。正常マウスを１０日以内に死亡させ得る最小のコバルト（ｃｏｂａｌｔ）放射線ガンマ量を照射するため、７．５、９、１０、１２Ｇｙのガンマ量で照射した後の生存率を比較し、７．５Ｇｙを照射したとき平均寿命は約９〜１０日、９Ｇｙは８〜９日、１０Ｇｙは７日、１２Ｇｙは６日であった。上記結果に基づいて放射線を照射したマウスに同種の骨髄細胞を移植し、前記菌株の分画された１００ｋＤａ以上の培養上澄液を投与、又は非投与し生存率を比較した。ＢＡＬＢ／ｃマウスに７．５Ｇｙ、又は９Ｇｙの放射線を照射し、照射されたマウスは、各々３つのグループに分けた。１グループは生理食塩水を投与、２グループは同種の正常マウスから得た骨髄細胞（１ｘ１０^７ｃｅｌｌ／ｍｏｕｓｅ）を移植した。グループ３は同じ骨髄細胞を同じ方法で移植し、前記菌株の分画された１，０００ｋＤａ以上の培養上澄液を腹腔に２．７ｍｇ投与した。生理食塩水と骨髄細胞は、マウスの尾静脈から投与し、前記分画された１，０００ｋＤａ以上の培養上澄液は腹腔に投与した。この投与は全て放射線照射した後２時間以内に行い、実験後のマウス生存率は３０日間観察した。図８に示したとおり、放射線量を７．５Ｇｙ照射したマウスにおいて、生理食塩水を投与したグループは８〜１１日の間に全て斃死し、骨髄細胞だけを移植したグループは６６％生存率を表した。一方、骨髄細胞と前記菌株の分画された１，０００ｋＤａ以上の培養上澄液を処理したグループでは１００％生存した（図８Ａ）。また、放射線量を更に増加して９Ｇｙ照射した場合には、生理食塩水だけ投与したグループは６〜９日に全て死亡し、骨髄細胞だけを移植したグループは３３％の生存率を示したことに対し、骨髄細胞移植と共に前記菌株の分画された１，０００ｋＤａ以上の培養上澄液を投与したグループの生存率は６６％であった（図８Ｂ）。１３日目まで生存したマウスは３０日間観察しても全て生存し、正常体重に到達するまで１２日程度の時間がかかった。この結果は、前記菌株の分画された１，０００ｋＤａ以上の培養上澄液が、移植された骨髄細胞の増殖を誘導し放射線照射マウスの生存率を高めるためである。したがって、白血病患者の骨髄移植細胞の増殖反応を増強するための使用可能性がうかがえる。

本発明の新たに分離したバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１は、アミラーゼ、セルラーゼ、マンナーゼ、リパーゼなどの消化酵素と乳酸の生産が優秀であり、動物の免疫増強活性と抗体生産の補助効果が優秀であり、白血病患者の骨髄移植細胞の増殖反応を増強することが誘導できる効果がある。したがって、新たに分離したバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１はプロバイオティクスとして利用が可能であるだけでなく、動物の免疫増強用の製剤とワクチン補助製剤として利用できる。

世界人口の増加と生活水準の向上に従い、食品に対する公衆衛生と安全性に関する関心が高まっている。よって、家畜の成長促進と飼料効率向上を目的として添加される抗菌性飼料添加物の残留性と耐性菌の問題が持続的に論争され、２０１１年７月１日からは飼料内に抗生剤と抗菌剤の添加が全面禁止になった。

本発明のさらに他の目的は、前記バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１, その培養液またはプロバイオティクス製剤を含む飼料添加剤を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１, その培養液または飼料添加剤を含む飼料を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１, その培養液,その濃縮液、その乾燥物またはプロバイオティクス製剤を含む免疫増強用製剤、又はワクチン補助製剤を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１, その培養液,その濃縮液、その乾燥物またはプロバイオティクス製剤を含有する免疫増強用健康機能性食品を提供することである。

さらに他の実施態様において、本発明は前記バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１, その培養液またはプロバイオティクス製剤を有効成分として含む飼料添加剤に関するものである。

他の実施態様において、本発明のバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１, その培養液または飼料添加剤を含む飼料が提供される。

本発明のバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１を含む飼料には、植物性として、穀物類、根果類、食品加工副産物類、藻類、繊維質類、油脂類、澱粉類、フクベ類、穀物副産物類など、動物性としてタンパク質類、無機物類、油脂類、鉱物性類、単細胞タンパク質、動物性プランクトン類、魚粉などがあるが、これらに限定されない。

前記バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１(寄託番号ＫＣＣＭ１１２６９Ｐ)の培養液、その濃縮液、又はその乾燥物は、分子量１００ないし３００ｋＤａの分画物、又は１，０００ｋＤａ以上の免疫増強活性を有する分画物を含む。

本発明の免疫増強用製剤、又はワクチン補助製剤は、各々通常の方法により、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルション、シロップ、エアゾールなどの経口剤形、外用剤、座剤、滅菌注射溶液の形態で剤形化して使用することができ、培養液、その濃縮液、又はその乾燥物を含む組成物に含まれることができる担体、賦形剤、及び希釈剤としてラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、鉱物油などがある。製剤化の場合には通常用いられる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤、又は賦形剤を用いて調剤される。経口投与用の固形製剤には錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などがあり、これらの固形製剤は前記培養液、その濃縮液、又はその乾燥物に少なくとも一つの賦形剤を混合して製造する。経口用の液状製剤には、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などがあり、よく使用される単純希釈剤である水、リクイッド、パラフィンの他様々な賦形剤を含むことができる。非経口投与用の製剤には滅菌された水溶液、非水溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤などがある。非水溶剤、懸濁剤にはプロピレングリコール、ポリエチレングリコールオリーブオイルなどの植物性油、エチルオレートなどの注射可能なエステールなどが用いられる。座剤の基剤にはウイテプソル、マクロゴール、ＴＷＥＥＮ６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが用いられる。

前述したもの以外の本発明の健康機能性食品が含有するプロバイオティクス製剤、又は免疫増強用製剤は、様々な栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、風味剤、着色剤、及び香味増進剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸とその塩、アルギン酸とその塩、有機酸、保護コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭酸化剤などを含むことができる。そのほか、本発明の健康飲料組成物は、天然フルーツジュース、及びフルーツジュース飲料、野菜飲料の製造のための果肉を含むことができる。これらの成分は、一つ、又は二つ以上を組合わせて用いることができる。

図１は、本発明のバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１菌株を電子顕微鏡で撮影した菌株の写真である。 図２は、本発明のバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１の溶血性有無を示す図である。 図３は、本発明のバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１の培養上澄液を分子量別分画によりマウスリンパ球の増殖反応を示すグラフである。 図４は、本発明のバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１の培養上澄液の分子量別分画により、マウス脾臓細胞（リンパ球）、骨髄細胞、胸腺細胞の増殖反応を示すグラフである。 図５は、本発明のバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１の培養上澄液の分子量別分画により、ｉｎｖｉｔｒｏ条件においてマウス脾臓Ｂ細胞増殖反応を示すグラフである。 図６は、本発明のバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１の分画された１，０００ｋＤａ以上の培養上澄液をマウス腹腔に投与したとき、生体内のマウスリンパ球増殖反応を示すＦＡＣＳ結果である。Ａはｉｓｏｔｙｐｅ対照区、Ｂ〜Ｅは１，０００ｋＤａ以上の培養上澄液を各々０．６７ｍｇ、１．３５ｍｇ、２．７ｍｇ、５．４ｍｇ投与したときのＦＡＣＳ結果である。 図７は、本発明のバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１の分画された１，０００ｋＤａ以上の培養上澄液を抗原と投与したとき、抗体生成補助効果を評価したグラフである。 図８は、本発明のバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１の分画された１，０００ｋＤａ以上の培養上澄液を、骨髄移植後において細胞増殖に与える効果を放射線照射したマウスで評価した後、その斃死率を示すグラフである。Ａは７．５Ｇｙで放射線照射したマウスから評価したグラフであり、Ｂは９Ｇｙで放射線照射したマウスから評価したグラフである。

（３）菌株の同定
菌株のより正確な同定のため、ＤＮＡ塩基配列による分子系統分類学的方法を行った。塩基配列分析はＰＣＲｐｒｅｍｉｘ（バイオニア、韓国）とユニバーサルプライマー２７Ｆ（５’ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣMＴＧＧＣＴＣＡＧ３’：配列番号２）、及び１４９２Ｒ（５’ＧＧＹＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ３’：配列番号３）を用いて、１６ｓ ｒＤＮＡの遺伝子を増幅した。遺伝子増幅の際、総反応液は２０μｌに合わせて、９４℃で１分、５６℃で１分、７２℃で１分を３０回繰り返し、増幅されたＤＮＡ塩基配列を分析した。分離菌株の分析された１６ｓｒＤＮＡの塩基配列は配列番号１に示す。前記分析の結果、バチルス・リケニフォルミスと９９％の相同性を有する微生物として同定された。よって、分離された前記菌株を、バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１に命名し、前述の方法により同定された本発明の新たな微生物は、２０１２年３月２２日、韓国微生物保存センターに、バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＣＪＭＰＢ−３６１）として寄託された（寄託番号ＫＣＣＭ１１２６９Ｐ）。

５）マンナーゼ活性
１％マンナン（ｌｏｃｕｓｔ ｂｅａｎ ｇｕｍ、ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）が添加された基質培地（Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ３ｇ／Ｌ、Ｐｅｐｔｏｎｅ ５ｇ／Ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４ １ｇ／Ｌ、Ａｇａｒ２０ｇ／Ｌ、ｐＨ５）を製造した。培養液を２μｌずつ基質培地に分株し、３７℃で１５時間反応した後、透明環の形成程度により酵素の活性能力を測定した。

（２）乳酸（ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）の生産性
前記分離菌株の乳酸生産を評価するため、２５０ｍｌのフタがあるフラスコにＰＹＧ液体培地（ポリペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、ブドウ糖２０ｇ／Ｌ、第２リン酸カリウム３５ｇ／Ｌ）１００ｍｌに前記分離菌株を１％接種して、３７℃、２００ｒｐｍで２４時間培養した。培養の終了後、培養上澄液においての乳酸生産量をＨＰＬＣを利用し定量した。乳酸の転換率は下記のように計算した。
乳酸の転換率＝（乳酸の生産率／初期の糖濃度）×１００

実施例３：バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１菌株の免疫増強活性
（１）リンパ球の増殖反応の検査
６〜７週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（オリエント（株）、韓国）を吸入麻酔器により殺して脾臓を採取し、脾臓を滅菌したスライドグラス２枚で軽く圧縮しリンパ球を遊離させた。分離したリンパ球は細胞培養培地であるＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）で３回洗浄した。また、細胞浮遊液内にある赤血球を除去した後、１０％ウシ胎児血清が含有されたＲＰＭＩ１６４０培地で２ｘ１０^６ｃｅｌｌ／ｍｌを浮遊させた。試験試料のバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１を２４時間培養した上澄液をＲＰＭＩ１６４０培地で１：２０の割合で１次希釈した後、２倍ずつ段階希釈した。

（４）ｉｎ ｖｉｖｏでマウス脾臓のＢ細胞への効果
生体内において、免疫増強物質がマウスリンパ球と骨髄細胞増殖の免疫反応に及ぶ効果を調べるため、バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１の分画された１，０００ｋＤａ以上の培養上澄液を腹腔を通じて投与した。投与２日後と３日後にマウスを殺して脾臓を分離した。分離された脾臓の重さを測定し、脾臓リンパ球の数の変化をＦＡＣＳで測定した。免疫増強物質をマウスの腹腔を通じて、０．６７ｍｇ、１．３５ｍｇ、２．７ｍｇ、５．４ｍｇを投与した場合、脾臓のサイズが各々１５％、２０％、９８％、５１％増加した。脾臓リンパ球のＦＡＣＳ分析において、０．６７ｍｇ投与群のＢ細胞の割合には変化がなかったが、１．３５ｍｇ投与群ではＢ細胞の割合が４１％から４５．３％に増加し、２．７ｍｇ投与群では４７．６％、５．４ｍｇ投与群では４９．７％に増加した。したがって、Ｂ細胞は分画された１，０００ｋＤａ以上の培養上澄液の濃度に依存的に増殖反応を表すことを示した（図６）。

（６）骨髄移植後において細胞増殖に及ぶ効果
バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１の分画された１，０００ｋＤａ以上の培養上澄液がＢ細胞だけでなく骨髄細胞と脾臓のｎｏｎ−Ｔ、ｎｏｎ−Ｂ細胞の増殖反応を増加させることを確認し、この免疫物質が放射線照射を受けたマウスに移植した骨髄細胞の増殖有無を調べた。マウスの骨髄細胞を破壊するためマウスを放射線照射した。正常マウスを１０日以内に死亡させ得る最小のコバルト（ｃｏｂａｌｔ）放射線ガンマ量を照射するため、７．５、９、１０、１２Ｇｙのガンマ量で照射した後の生存率を比較し、７．５Ｇｙを照射したとき平均寿命は約９〜１０日、９Ｇｙは８〜９日、１０Ｇｙは７日、１２Ｇｙは６日であった。上記結果に基づいて放射線を照射したマウスに同種の骨髄細胞を移植し、前記菌株の分画された１，０００ｋＤａ以上の培養上澄液を投与、又は非投与し生存率を比較した。ＢＡＬＢ／ｃマウスに７．５Ｇｙ、又は９Ｇｙの放射線を照射し、照射されたマウスは、各々３つのグループに分けた。１グループは生理食塩水を投与、２グループは同種の正常マウスから得た骨髄細胞（１ｘ１０^７ｃｅｌｌ／ｍｏｕｓｅ）を移植した。グループ３は同じ骨髄細胞を同じ方法で移植し、前記菌株の分画された１，０００ｋＤａ以上の培養上澄液を腹腔に２．７ｍｇ投与した。生理食塩水と骨髄細胞は、マウスの尾静脈から投与し、前記分画された１，０００ｋＤａ以上の培養上澄液は腹腔に投与した。この投与は全て放射線照射した後２時間以内に行い、実験後のマウス生存率は３０日間観察した。図８に示したとおり、放射線量を７．５Ｇｙ照射したマウスにおいて、生理食塩水を投与したグループは８〜１１日の間に全て斃死し、骨髄細胞だけを移植したグループは６６％生存率を表した。一方、骨髄細胞と前記菌株の分画された１，０００ｋＤａ以上の培養上澄液を処理したグループでは１００％生存した（図８Ａ）。また、放射線量を更に増加して９Ｇｙ照射した場合には、生理食塩水だけ投与したグループは６〜９日に全て死亡し、骨髄細胞だけを移植したグループは３３％の生存率を示したことに対し、骨髄細胞移植と共に前記菌株の分画された１，０００ｋＤａ以上の培養上澄液を投与したグループの生存率は６６％であった（図８Ｂ）。１３日目まで生存したマウスは３０日間観察しても全て生存し、正常体重に到達するまで１２日程度の時間がかかった。この結果は、前記菌株の分画された１，０００ｋＤａ以上の培養上澄液が、移植された骨髄細胞の増殖を誘導し放射線照射マウスの生存率を高めるためである。したがって、白血病患者の骨髄移植細胞の増殖反応を増強するための使用可能性がうかがえる。

本発明の新たに分離したバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１は、アミラーゼ、セルラーゼ、マンナーゼ、キシラナーゼなどの消化酵素と乳酸の生産が優秀であり、動物の免疫増強活性と抗体生産の補助効果が優秀であり、白血病患者の骨髄移植細胞の増殖反応を増強することが誘導できる効果がある。したがって、新たに分離したバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１はプロバイオティクスとして利用が可能であるだけでなく、動物の免疫増強用の製剤とワクチン補助製剤として利用できる。

Claims (10)

1. 消化酵素と乳酸を生産し、免疫増強活性を有するバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、ＣＪＭＰＢ３６１；寄託番号ＫＣＣＭ１１２６９Ｐ）
2. バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＣＪＭＰＢ３６１、寄託番号ＫＣＣＭ１１２６９Ｐ）の培養液、その濃縮液及びその乾燥物からなる群より選択された一種以上の、バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１の培養物。
3. 請求項１に記載のバチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１（寄託番号ＫＣＣＭ１１２６９Ｐ）、又は請求項２に記載の培養物を含む、プロバイオティクス製剤。
4. 請求項３に記載のプロバイオティクス製剤を含む、飼料添加剤。
5. 前記飼料添加剤は、２０ないし９０％の高濃縮液、粉末及び顆粒からなる群より選択される形態である、請求項４に記載の飼料添加剤。
6. 請求項４又は請求項５に記載の飼料添加剤を含む、飼料。
7. バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、ＣＪＭＰＢ３６１；寄託番号ＫＣＣＭ１１２６９Ｐ）、その培養液、その濃縮液、又はその乾燥物を含むか、
   バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、ＣＪＭＰＢ３６１；寄託番号ＫＣＣＭ１１２６９Ｐ）、その培養液、その濃縮液、又はその乾燥物を有効成分とするプロバイオティクス製剤を含む、免疫増強用の製剤又はワクチン補助製剤。
8. 前記バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、ＣＪＭＰＢ３６１；寄託番号ＫＣＣＭ１１２６９Ｐ）、その培養液、その濃縮液又はその乾燥物が、分子量１００ないし３００ｋＤａの分画物又は１，０００ｋＤａ以上の免疫増強活性を有する分画物を含む、
   請求項７に記載の免疫増強用の製剤又はワクチン補助製剤。
9. バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、ＣＪＭＰＢ３６１；寄託番号ＫＣＣＭ１１２６９Ｐ）、その培養液、その濃縮液、又はその乾燥物を含むか、
   バチルス・リケニフォルミスＣＪＭＰＢ３６１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、ＣＪＭＰＢ３６１；寄託番号ＫＣＣＭ１１２６９Ｐ）、その培養液、その濃縮液、又はその乾燥物が含まれたプロバイオティクス製剤を含む、免疫増強用の健康機能性食品。
10. 前記食品は、粉末、顆粒、錠剤、カプセル及び飲料からなる群より選択される形態である、請求項９に記載の健康機能性食品。

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