KR20110050316A - Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ 와 Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ 혼합 배양물을 이용한 청보리 발효사료 및 그 제조방법 - Google Patents

Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ 와 Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ 혼합 배양물을 이용한 청보리 발효사료 및 그 제조방법 Download PDF

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박도연
박중국
김지애
유정숙
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Abstract

(가) 기술분야
미생물제제를 이용한 양돈용 청보리 발효사료 제조기술
(나) 해결하고자 하는 과제
단위가축에 있어서는 난 소화성 사료인 청 보리의 사료효율을 증진시켜 가축의 생산성 증진, 사료 비 절감 그리고 환경 개선 효과를 얻고자 함.
(다) 과제의 해결수단
본 발명은 발효사료 제조에 적합한 균주를 선별하기 위해 각 균주별로 가장
적합한 액상 배양 배지에서 배양 후 섬유소 효소 활력을 측정 후 청 보리에 사용할 균주들을 선별하는 과정, 청 보리를 배지로 하는 고상 배양 조건 하에서
가장 우수한 발효사료용 균주를 선별하는 과정, 단백질 정량 분석을 통해 효소의 정량적 가치를 평가하여 가장 우수한 균주를 선별하는 과정 및 선발된 균주를 다양한 수분 함량 및 시간대별 고상 배양을 진행, 섬유소 분해력 및 일반성분을 측정 후 발효사료 제조에 있어 최적 수분 함량, 배양시간대를 선정 한 후 사료 성상 변 화와 전장 소화율 그리고 대장 발효 성상 분석을 통해 발효사료제조에 가장 적합한 균주의 정보를 제공.
(라) 효과 등
본 발명은 청 보리를 이용, 단위 가축이 이용하기 어려운 섬유질사료의 소화율 및 이용성을 향상시킬 수 있는 발효사료의 제조 방법을 제공하는 효과가 있다.
청보리, 발효사료, 섬유질, 전장소화율, 대장 발효 성상

Description

Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ 와 Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ 혼합 배양물을 이용한 청보리 발효사료 및 그 제조방법{The whole crop barley fermented feed treated with Bacillus licheniformis and Aspergillus niger mix culture manufacturing method}
본 발명은 Bacillus licheniformis 및 Aspergillus niger 균주를 청보리 사료에 이용하여 발효사료를 제조하는 방법으로, 더욱 상세하게는 가축이 이용하기 어렵고 단위가축에 있어서는 난소화성 사료인 청보리를 발효사료로 제조하여 공급함으로써 가축의 생산성 증진, 사료비 절감, 환경 개선 효과를 기대할 수 있다. 뿐만 아니라 청보리 사료 외에도 농업부산물이나 식품 부산물 등 다양한 고 섬유성 사료에도 적용할 수 있어 수입곡물을 대체에 따른 사료비 절감 효과 및 농가에서 더욱 다양한 사료자원 활용을 기대할 수 있는 제조 기술이다.
[문헌 1] J. Dairy Sci., Effects of grain source and enzyme additive on site and extent of nutrient digestion in dairy cows. Beauchemin, K.A., Yang, W. Z. and Rode, L. M., 1999, vol 82, 378-390쪽.
[문헌 2] Animal. Feed Sci. Technol, Approach to the energetic importance of fibre digestion in pigs. I. Importance of fermentation in the overall energy supply., Dierick, N. A., Vervaeke, I. J., Demeyera,
D.I. and Decuyperea, 1989., vol 23, 141-167쪽
[문헌 3] J. Nutr., Effects of Dietary Fiber and Protein Concentration on Growth, Feed Efficiency, Visceral Organ Weights and Large Intestine Microbial Populations of Swine., Friday O. I. Anugwa, Vincent H.Varel, James S. Dickson, Wilson G. Pond and Lennart P. Krook., 1989., vol 119, 879-886쪽
[문헌 4] J. Anim. Sci., Intraruminal supplementation with increasing levels of exogenous polysaccharide degrading enzymes: effects on nutrient digestion in cattle fed a barley grain diet., Hristov, A. N., McAllister, T. A. and Cheng, K. J., 2000., vol 78, 477-487쪽
[문헌 5] J. Anim. Sci., Effect of exogenous enzymes on digestibility of barley silage and growth performance of feedlot cattle. Can.,McAllister, T. A., Oosting, S. J., Popp, J. D., Mir, Z., Yanke, L. J., Hristov, A. N., Treacher, R. J. and Cheng, K. J., 1999., vol 79, 353-360쪽
[문헌 6] Anim. Feed Sci. Technol., Processing of barley and enzyme supplementation in diets for young pigs., Medel, P., Baucells, F., Gracia, M.I., de Blas, C., Mateos, G.G., 2002., vol 95, 113-122쪽
[문헌 7] J. Anim. Nut., Probiotics in pig diets., Pollman, D. S., 1986., 193-205쪽
국내 발효사료 개발에 관한 연구는 오래 전부터 많은 연구가 수행되어 담자균을 이용한 발효사료 (홍재식 등, 1985), 남은 음식물발효사료 (박 등, 1999), 농산폐기물을 이용한 발효사료 (이와 이, 1975; 이와 고, 1975; 안 등, 2000), 대두피를 이용한 발효사료 (이 등, 1972), 국균 발효사료 (김 등, 1964), 볏짚 발효사료 (홍 등, 1988), Aspergilus와 Saccharomyces를 첨가한 맥주박 발효사료 (신 등, 2005; 박 등, 2005, 2006), 육림부산물 발효사료(문 등, 2002), 포도발효사료 (정 등, 2006), 알코올 발효사료 (신 등, 2007) 등의 연구가 수행되었으며, 이들 대부분의 발효사료연구는 반추동물에 대해 수행된 것으로 국내 양돈용 발효사료는 남은 음식물을 이용한 발효사료(박 등, 2004, 2005; 정 등, 2001), 키토산 발효사료 (김, 2004), 톱밥 발효사료 (이 등, 1997)에 대한 연구보고가 있으며, 조사료로 호맥 사 일리지에 대한 연구가 수행되었고 청보리 사일리지를 돼지에 적용한 연구가 진행되고 있으나, 청보리를 이용한 섬유질 이용율 개선과 돈분뇨 악취저감을 할 수 있는 양돈용 발효사료의 개발에 대한 연구는 전무한 실정임
1. 청보리 발효사료 제조에 이용될 가장 강력한 섬유소 분해 균주의 선발 .
2. 청보리 발효사료 제조에 가장 적합한 배양기간 및 수분함량의 설정.
3. 전장소화율 및 대장발효성상 분석을 통한 발효사료의 사료 이용성 증진 효과에 대한 정보를 제공.
4. 양돈용 청보리 발효사료 제조기술 제공.
본 발명은 청보리를 이용, 가축이 이용하기 어려운 섬유질사료의 소화율 및 이용성을 향상 시킬 수 있는 발효사료의 제조 방법을 제공하는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 현재 시판중인 다양한 Bacillus licheniformis 와 Aspergillus niger 중 상기 청보리에 가장 적합한 균주를 제안해 주고 있다.
또한, 본 발명은 In-vitro 전장소화율 및 대장발효성상 분석을 통해 발효사료의 이용성 증진 효과를 증명하여 주고 있다.
또한, 본 발명은 청보리 외에도 다양한 섬유질 사료에 적용이 가능해, 축산 농가의 사료비 절감 및 다양한 사료 자원의 이용성을 증진 시켜줄 수 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 발명의 특징은,
발효사료 제조에 적합한 균주를 선별하기 위해 각 균주별로 가장 적합한 배양배지에서 배양 후 섬유소 효소활력을 측정 후 청보리에 사용할 균주들을 선별하는 과정을 거치는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 특징은,
청보리에, 1차 선별된 균주를 배양 하여, 섬유소 분해효소 활력을 측정 후 청보리를 배지로 하는 고상 배양 조건 하에서 가장 우수한 발효사료용 균주를 선별하는 과정을 거치는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 특징은,
상기 단계에서 선발된 균주들의 더욱 정확한 섬유소 분해효소 생산 능력을 확인하기 위해 단백질 정량 분석을 통해 효소의 정량적 가치를 평가하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 특징은,
상기 균주들의 청보리 고상배양 조건하의 최적 섬유소 분해효소 분비 시점을 확립하기 위해 다양한 시간대로 배양하여 섬유소 분해력을 측정한 결과를 통해 발효사료 제조에 있어 최적 배양시간대의 제공을 특징으로 한다.
발명의 또 다른 특징은,
상기 균주들의 청보리 고상배양 조건하의 최적 섬유소 분해효소 분비 조건을 확립하기 위해 다양한 수분 함량대로 배양하여 섬유소 분해력을 측정한 결과를 통해 발효사료 제조에 있어 최적 수분 함량의 제공을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 특징은,
In vitro 전장소화율 실험을 통해 소화율을 측정, 본 발효사료의 소화율 개선 효과 및 발효사료 제조에 있어 가장 적합한 균주의 제공을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 특징은,
대장에서 대부분의 섬유소 소화가 이루어지는 단위동물의 특성에 따라 추가로 in vitro 대장 발효 실험을 진행, 본 발효사료의 소화율 개선 효과 및 발효성상 분석을 통해 발효사료 제조에 있어 가장 적합한 균주의 제공을 특징으로 한다.
<실험예1>
11종의 Bacillus licheniformis 및 17종의 Aspergillus niger를 30℃ shaking incubator에서 액상배양 후 효소활력을 측정한 결과, Bacillus licheniformis는 [표 1]에 나타난 바와 같이 KCCM 11378과 40934에서 xylanase와 CMCase가 높게 나타났다. 또한 KCCM 41412 역시, 상기 두 균주와 비교했을 때는 낮은 수치였지만 다른 균주들과 비교하여 비교적 높은 CMCase를 보여주었다. Aspergillus niger는 [표2]에서와 같이 KCCM 31213, 60357, 11885, 60317, 60332 등에서 xylanase와 CMCase가 높게 나타났다. 본 실험을 통해 섬유소 분해력이 높은 균주를 선별, 3종의 Bacillus licheniformis와 10종의 Aspergillus niger가 청보리 고상발효용 균주로 1차 선정되었다.
<실험예2>
1차 선별된 균주를 60% 수분함량, 2mm로 분쇄한 청보리에 30℃에서 5일간 고상배양 후 효소활력을 측정한 결과 [표 3]에 나타난 바와 같이 Bacillus licheniformis는 KCCM 11378, 40934에서 xylanase와 CMCase가 높게 나타났다. Aspergillus niger는 KCCM 11885, 60382, 32005 등에서 xylanase와 CMCase가 높게 나타났다. 본 실험을 통해 청보리를 배지로 하는 고상 배양 조건 하에서 가장 우수한 발효사료용 균주로 Bacillus licheniformis는 KCCM 11378, 40934 2종이, Aspergillus niger는 KCCM 60315, 60357, 11885, 60317, 12693, 60382, 32005 7종이 선별 되었다.
<실험예3>
청보리를 배지로 상기 실험 2와 같은 방법으로 고상배양 후 선발되어진 9종의 균주들은 단백질 정량 분석을 통해 효소의 정량적 가치를 평가하였으며, 그 결과는 [표 4]에서 보여주고 있다. xylanase와 CMCase가 가장 높은 Bacillus licheniformis KCCM 11378, 40934와 Aspergillus niger KCCM 12693, 32005, 60357이 선택되었다.
<실험예4>
상기 단계에서 선발된 균주들은 최적 배양시간대를 확립하고자 3, 4, 5일로 나누어 각각 배양 하여 효소활력을 측정하였으며, 그 결과는 [표 5]에서 보여주고 있다. 각 측정 항목 또는 균주 종류에 따라 모두 다른 경향을 보여 주었다. 본 실험에서는 배양기간의 증가에 따른 농가의 경제적 손실을 감안하여 3일 배양이 적합하다고 볼 수 있다.
<실험예5>
상기 실험을 통해 최종적으로 Bacillus licheniformis KCCM 40934와 Aspergillus niger KCCM 60357이 선발되었다. 본 실험은 발효사료 제조에 있어 최적 수분함량 조건을 확립하고자 최종 선발된 Bacillus licheniformis와 Aspergillus niger 그리고 두 균주를 혼합 하여 50, 60, 70%로 수분 함량을 나누어 3일간 배양 후 효소활력을 측정하였으며, 그 결과는 [표 6]에서 보여주고 있다. Bacillus licheniformis는 50%, Aspergillus niger 및 혼합균주의 경우 60%의 수분 함량에서 가장 높은 효소활력이 측정 되었다.
<실험예6>
미생물이 청보리 사료 성상변화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 3일간 배양하여 제조 된 발효사료의 일반성분 분석을 진행하였다. 그 결과는 [표 7]과 같다. 본 실험에서는 Aspergillus niger 및 혼합균주 발효사료에서 조단백질 및 조지방이, Bacillus licheniformis를 배양한 발효사료에서는 조단백질 함량이 증진되는 효과를 보여 주고 있다.
<실험예7>
가축에 있어 실질적인 이용성을 확인하기 위하여 in vitro 전장 소화율 측정 실험을 진행하였다. 그 결과는 [표 8]과 같다. 본 실험에서는 Bacillus licheniformis를 배양한 발효사료에서 소화율이 증진되는 효과를 보여 주고 있다.
<실험예8>
대장발효 산물 중 xylanase 농도를 측정한 결과가 [표 9]와 같다. Aspergillus niger와 혼합 배양 사료에서 가장 높은 효소활력이 확인 되었으며, Bacillus licheniformis를 배양한 발효사료 역시 효소 활력이 증진되는 효과를 보여 주었다.
<실험예9>
대장에서의 소화율 개선 효과를 확인하기 위해 in vitro 대장발효 실험을 진행하였 다. 그 결과는 [표 10]과 같다. 본 실험에서는 Aspergillus niger와 혼합 배양 사료에서 소화율이 증진되는 효과를 보여 주었다.
[표 1] 액상배양에서의 Bacillus licheniformis의 효소활력
배양시간 KCCM No.
 효소활력(μM/min/ml)
CMCase Xylanase Avicelase




48h




 12145 0.20 1.29 0.56
41412 5.30 61.57 0.36
11237 2.54 32.20 1.04
11851 4.26 1.27 0.67
11378 20.79 146.16 0.36
11775 0.62 2.75 1.01
40934 18.29 133.30 0.61
11379 1.10 30.94 0.76
12670 0.18 1.10 0.30
11560 0.27 0.67 0.22
[표 2] 액상배양에서의 Aspergillus niger의 효소활력
배양시간 KCCM No. 효소활력(μM/min/ml)
CMCase Xylanase Avicelase








96h







 60315 65.58 127.93 17.21
31213 54.69 268.35 8.37
11489 43.75 58.51 8.13
60143 37.28 135.09 6.71
60357 64.83 207.63 8.28
11885 70.29 259.35 3.87
11240 47.07 132.71 3.46
60317 50.67 209.95 16.85
11241 51.39 224.14 26.39
60381 49.17 186.47 16.66
32318 35.76 133.48 5.14
60318 63.44 179.76 6.93
60332 71.64 234.75 23.15
60391 57.06 118.22 8.82
12693 43.45 218.73 26.07
60382 59.18 196.79 18.08
32005 62.85 139.12 11.94
[표 3] 청보리 고상배양에서의 효소활력
배양시간
 미생물 KCCM No.
 효소활력(μM/min/ml)
CMCase Xylanase Avicelase






120h





 Bacillus
licheniformis
 41412 21.04 48.07 28.67
11378 71.98 205.03 39.06
40934 109.57 382.88 4.10




Aspergillus
niger



 60315 46.74 307.24 7.98
60357 70.62 244.14 8.72
11885 44.54 377.90 8.60
60317 32.82 202.70 6.29
11241 48.26 318.79 1.34
31213 47.20 246.33 1.21
60332 46.63 288.46 6.92
12693 74.92 290.16 18.18
60382 49.48 372.11 13.29
32005 67.14 364.11 15.73
[표 4] 청보리 고상배양에서의 효소의 정량적 가치 평가
배양시간
 미생물 KCCM No.
 효소활력(IU/g)
CMCase Xylanase Avicelase




120h



 Bacillus
licheniformis		 11378 289.89 825.75 157.30
40934 359.25 1255.34 13.43


Aspergillus
niger


 60315 46.59 306.22 7.96
60357 823.98 2848.73 101.74
11885 75.91 644.10 14.65
60317 27.62 170.58 5.30
12693 435.31 1686.02 105.61
60382 54.48 409.68 14.63
32005 49.24 267.10 11.53
[표 5] 청보리 고상배양에서의 시간대별 효소활력 평가
효소활력
(μM/min/ml)
 배양시간
(hour)		 Aspergillus niger Bacillus licheniformis
KCCM No. KCCM No.
12693 32005 60357 11378 40934

CMCase
 72 97.69 42.53 56.09 97.18 75.15
96 95.32 40.16 53.72 60.99 57.58
120 30.88 25.85 60.61 96.67 71.64

Xylanase
 72 102.13 144.02 105.43 150.60 199.13
96 196.96 199.57 129.60 158.30 136.87
120 138.44 136.89 134.55 247.71 257.62

Avicelase
 72 21.39 19.74 20.26 10.58 36.23
96 19.02 11.88 23.13 12.45 31.37
120 12.09 14.38 12.76 37.18 30.66
[표 6] 청보리 고상 배양에서의 수분함량별 효소 활력 평가

효소활력
(μM/min/ml)
수분함량(%)
 처리구
Aspergillus niger Bacillus
licheniformis 		Mixture

CMCase		 50 33.92 48.37 17.64
60 23.29 92.15 16.38
70 20.26 18.23 18.37

Xylanase		 50 161.21 139.11 157.69
60 187.81 199.34 158.44
70 117.28 277.68 108.08

Avicelase		 50 32.26 33.17 21.89
60 13.40 72.29 9.65
70 2.03 57.52 8.39
[표 7] 미생물 처리에 따른 사료성상 변화 분석 (건물기준, %)
처리구
control Aspergillus niger Bacillus
licheniformis 		Mixture
조단백질 6.81 7.52 7.07 7.77
조지방 1.08 2.26 1.67 1.86
조섬유 27.61 29.33 20.32 32.85
NDF 61.53 63.10 62.70 63.21
ADF 34.09 38.80 39.51 38.56
조회분 3.77 3.73 3.85 3.62
[표 8] In vitro 전장 소화율 실험
처리구

control
Aspergillus niger 		Bacillus
licheniformis
Mixture

45.65 %
38.12 %
49.61 %
37.46 %
[표 9] In vitro 대장발효 xylanase 활력측정 실험 (μM/min/ml)
처리구

control
Aspergillus niger 		Bacillus
licheniformis
Mixture

1.63
7.43
5.93
7.16
[표 10] In vitro 대장발효 소화율 실험
처리구

control
Aspergillus niger 		Bacillus
licheniformis
Mixture

43.73 %
55.00 %
43.54 %
57.42 %

Claims (8)

  1. 가축용 청보리 발효사료 제조방법에 있어서
    a) 2mm로 청보리를 세절 후 수분함량을 50~70%로 조절하는 청보리 가공 단계,
    b) 상기 a) 단계에서 청보리에 Bacillus lichenifomis와 Aspergillus niger를 발효미생물로 사용하는 균주 선발 단계,
    c) 상기 b) 단계에서 균주를 500μ씩 접종하는 균주 접종 단계,
    d) 상기 c) 단계에서 균주를 30℃에서 3~5일간 배양하는 발효 단계,
    e) 상기 d)단계에서 발효사료를 사료 성상 변화 및 전장소화율 그리고 대장 성상 변화를 통한 사료 이용성 증진효과 확인 단계,
    f) 상기 e)단계를 통해 단위동물이 이용하기 어려운 섬유소를 분해시켜 청보리 발효사료를 제조하는 단위가축용 청보리 발효사료 제조 방법.
  2. 상기 균주가 Bacillus lichenifomis KCCM 40934와 Aspergillus niger KCCM 60357임을 특징으로 하는 가축용 발효사료 제조방법
  3. 배양기간을 3일로 하는 가축용 발효사료 제조 방법
  4. 수분함량을 60%로 하는 가축용 발효사료 제조 방법
  5. Bacillus lichenifomis KCCM 40934와 Aspergillus niger KCCM 60357의 혼합배양을 특징으로 하는 가축용 발효사료 제조방법
  6. Bacillus lichenifomis KCCM 40934은 107CFU/ml, Aspergillus niger KCCM 60357은 103CFU/ml을 특징으로 하는 가축용 발효사료 제조 방법
  7. in-vitro 전장 소화율 및 대장성상 변화 측정기술을 이용한 가축용 발효사료의 사료이용성 증진효과에 대한 정보 제공
  8. 단위가축의 사료이용성 증진효과가 확인된 가축용 발효사료의 제조 방법
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2013151363A1 (ko) * 2012-04-05 2013-10-10 씨제이제일제당(주) 신규 분리한 바실러스 리체니포미스 및 이를 이용한 프로바이오틱스
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