KR101380738B1 - 신규 분리한 바실러스 리체니포미스 및 이를 이용한 프로바이오틱스 - Google Patents

신규 분리한 바실러스 리체니포미스 및 이를 이용한 프로바이오틱스 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규 분리한 바실러스 리체니포미스 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

신규 분리한 바실러스 리체니포미스 및 이를 이용한 프로바이오틱스{A novel Bacillus licheniformis and its application as probiotics}
본 발명은 신규 프로바이오틱스 및 이의 용도에 관한 것이다.
세계 인구 증가와 생활 수준 향상에 따라 식품에 대한 공중위생 및 안정성에 대한 관심이 높아지고 있다. 따라서 가축의 성장 촉진과 사료 효율 향상을 목적으로 첨가되는 항균성 사료 첨가물의 잔류성 및 내성균 문제가 지속적인 논란의 대상이 되고 있으며, 이에 2011년 7월 1일부터 사료내 항생제와 항균제의 첨가가 전면으로 사용이 금지되었다.
사료내 항생제의 첨가가 전면 규제 됨에 따라 항생제 대체 소재에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
이중 면역증강제로서 프로바이오틱스(probiotics)가 가장 높은 관심을 받고 있다. 프로바이오틱스란 항생물질을 의미하는 항생제(antibiotics)와는 대립되는 어원적 의미를 가지는 것으로 장내의 미생물 균형에 도움을 주는 미생물 제제 또는 미생물 성분으로 정의되며, 락토바실러스균과 비피더스균 등 유산균이라고 총칭하는 균종이 대표적이다. 또한, 프로바이오틱스는 GRAS(Generally Recognized As Safe)로 분류되며, 사람과 동물에 대한 독성유전자를 보유하고 있지 않으며 병원성물질 또한 생산하지 않는다. 그리고 축산 생산성에 대한 개선 효능이 확인된 미생물이어야 한다.
프로바이오틱스의 효능은, 강력한 부착력으로 장점막에 붙어 장질환을 유발하는 병원균을 경쟁적으로 떨어뜨려 밖으로 배설시켜주며, 항생제 투여에 따른 장내균총의 파괴를 신속히 회복시켜준다. 또한 병원성 미생물의 감염에 대한 예방효과와 증식을 억제하며, 장내 유익균의 발육에 최적인 환경 및 증식을 촉진하고, 장내 유기산의 주요 구성성분인 젖산이나 아세트산을 생산하며, 장내 pH를 낮춰 줌으로써 유해 병원균의 발육을 억제한다. 이에 가지 복합적인 작용에 의해 투여 시 정상균총을 유지하고 가축의 생산성 향상을 도모할 수 있다.
주로 사용되고 있는 프로바이오틱스는 락토바실러스와 엔테로코커스 등 유산균과 바실러스이다. 이 중 바실러스는 그람양성의 간균으로 내생포자를 형성하며 프로바이오틱스로 사용되는 균 중 독특한 형태를 가지고 있다. 바실러스는 내생포자를 형성하지 않는 락토바실러스보다 내열성이 우수하다. 또한 위벽의 낮은 pH에도 생존하기 때문에 투여한 대부분의 균이 소장까지 도달할 수 있다. (Barbosa,T.M. et al. Appl . Environ. Microbiol. 71(2005)968-978; Spinosa, M. R. et al. Res . Microbiol. 151(2000) 361-368).
프로바이오틱스의 주요 기능 중 하나인 가축의 면역증강 목적으로 분리한 프로바이오틱스의 선행기술을 살펴보면 한국공개특허 제10-2011-035554호에는 신규한 바실러스 속 CMB L1 및 락토바실러스 속 CMB201의 혼합균주 및 이를 이용한 항암 및 면역증강용 식품 조성물 및 항균활성이 있는 미생물 제제가 개시되어 있으며, 대한민국등록특허 제10-0977407호에는 동물의 주요 탐식세포인 호중구의 각종 활성을 증가시키고 병원성 세균의 공격접종에 대한 비특이적인 방어능을 증진시키는 자이고사카로마이세스 바일리(Zygosaccharomyces bailii)의 용균 추출물을 함유하는 동물용 면역증강제, 백신보조제 첨가물, 보조치료제 및 사료첨가제를 개시하고 있다. 바실러스의 면역증강 효능에 대한 연구는 미비한 상태이다.
또한 프로바이오틱스에서의 젖산을 생산하는 것은 주로 락토바실러스의 주요한 특징으로 알려져 있으나, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 KJS-2의 균주가 젖산을 생산한다는 논문이 보고된 바 있다(Kim , K. M et al . J. Microbiol . Biotechnol ., 19(2009) 1013-1018).
이에 본 발명자들은 한국의 전통적인 발효식품인 된장에서 소화효소 생산 및 젖산을 생산하는 프로바이오틱스를 분리하고, 이들의 형태적, 생화학적 및 유전적 특성을 확인한 결과, 상기 프로바이오틱스가 내열성이 우수한 바실러스임을 확인하였으며, 상기 바실러스가 면역 마우스의 비장세포, 골수세포를 증식시키는 면역증강 효능 및 항체 생성을 증가시키는 백신 보조제의 효능뿐만 아니라 골수 이식 마우스에서의 골수 세포 증식 효능이 우수하다는 것을 확인하였다.
한국공개특허 제10-2011-035554호
Kim, K. M et al. J. Microbiol. Biotechnol., 19(2009) 1013-1018
본 발명의 목적은 소화효소 및 젖산을 생산하며, 면역증강 활성을 가지는 신규한 바실러스 리체니포미스 CJMPB361을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 바실러스 리체니포미스 CJMPB361의 배양액, 그의 농축액 및 그의 건조물로 이루어진 군으로부터 선택되는 배양물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 바실러스 리체니포미스 CJMPB361 또는 상기 배양물을 포함하는 프로바이오틱스 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 프로바이오틱스 제제를 포함하는 사료첨가제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 사료첨가제를 포함하는 사료를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 프로바이오틱스 제제를 포함하는 면역증강용 제제 또는 백신보조제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 프로바이오틱스 제제를 함유하는 면역 증강용 건강 기능성 식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태로, 소화효소 및 젖산을 생산하는 신규한 바실러스 리체니포미스 CJMPB361을 제공한다.
구체적으로 본 발명의 바실러스 리체니포미스 CJMPB361는 한국의 전통식품인 된장에서 분리하여 얻은 것이다. 본 발명의 균주의 형태학적 특징은 그람 양성 간균이며, 서열번호 1의 16s rDNA 염기서열을 가진다. 상기 염기서열을 분석한 결과 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)와 99% 상동성을 가지고 있었다. 이에 본 발명자들은 신규 분리한 바실러스 리체니포미스 CJMPB361을 2012년 3월 22일 한국 미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, 서울시 서대문구 홍제 1동 361-221)에 기탁번호 KCCM11269P으로 기탁하였다.
구체적으로 한국의 전통식품인 70~80일 사이의 된장을 채취하여, BHI(Brain heart infusion) 고체 배지에서 분리하였다. 분리균주는 아밀레이즈, 셀룰레이즈, 만나네이즈, 자일라네이즈와 같은 유용 소화효소 활성이 우수하며, 통성혐기 및 혐기조건에서 24시간 이상 배양 시 젖산을 생산하는 특징을 가지고 있다. 상기 균주의 배양 상등액은 마우스 비장내 non-T 세포, 마우스 골수, 사람의 말초혈액의 활성을 증가시킴에 따라 마우스 B 세포에 특이적으로 강한 면역증강 효능을 가지고 있으며, 배양 상등액의 분자량 1,000 KDa 이상의 분획을 항원과 같이 주사했을 경우, 항원에 의한 항체 생성의 보조효과를 나타내었다.
또한 상기 균주의 배양 상등액 중 분자량 1,000 kDa 이상을 분획하여 얻은 분획물을 방사선 조사한 마우스에 골수 이식한 후 투여하였을 때, 이식된 골수세포의 증식반응을 증가시켜 마우스의 생존율을 증가시키는 효과를 가지고 있었다.
다른 양태로서 본 발명의 신규 분리한 균주의 배양액, 그의 농축액, 그의 건조물로 이루어진 군으로부터 선택되는 배양물을 제공한다.
본 발명의 신규 분리한 균주는 통상적인 바실러스 균주의 배양방법을 통해 배양할 수 있다. 배지로는 천연배지 또는 합성배지를 사용할 수 있다. 배지의 탄소원으로는 예를 들어, 글루코오스, 수크로오스, 덱스트린, 글리세롤, 녹말 등이 사용될 수 있고, 질소원으로는 펩톤, 육류 추출물, 효모 추출물, 건조된 효모, 대두, 암모늄염, 나이트레이트 및 기타 유기 또는 무기 질소 함유 화합물이 사용될 수 있으나, 이러한 성분에 한정되는 것은 아니다. 배지에 포함되는 무기염으로는 마그네슘. 망간, 칼슘. 철, 칼륨 등이 사용될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 상기 탄소원, 질소원 및 무기염의 성분 이외에 아미노산, 비타민, 핵산 및 그와 관련된 화합물들이 배지에 첨가될 수 있다. 본원의 신규 분리한 균주의 배양온도 조건은 20~40℃의 온도 범위에서 12시간에서 4일간 배양할 수 있다.
구체적으로 신규 분리한 균주의 배양액은 균체를 포함한 배양 원액일 수 있으며, 또한 배양 상등액을 제거하거나 농축한 균체일 수 있다. 상기 배양액의 조성은 통상의 바실러스 배양에 필요한 성분뿐 아니라, 바실러스의 생장에 상승적으로 작용하는 성분을 추가적으로 포함할 수 있으며, 이에 따른 조성은 당업계의 통상의 기술을 가진 자에 의하여 용이하게 선택될 수 있다.
또한 균주의 상태는 액상상태 또는 건조상태일 수 있으며, 건조방법은 통풍건조, 자연건조, 분무건조 및 동결건조가 가능하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 양태로서 본 발명의 신규 분리한 균주 또는 배양물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스 제제를 제공한다.
프로바이오틱스는 장내의 소화관 벽에 정착하여 유해균이 정착하지 못하게 하며, 병원균의 증식을 억제한다. 또한 프로바이오틱스가 생산하는 유익한 소화효소는 영양소의 흡수와 이용을 용이하게 하여 사료의 요구율을 개선시킨다.
본 발명의 프로바이오틱스 제제는 5 x 104 내지 5 x 1010 CFU/ml의 바실러스 리체니포미스 CJMPB361을 포함하며, 바람직하게는 1 x 106내지 1 x 109 CFU/ml의 바실러스 리체니포미스 CJMPB361을 포함한다.
본 발명의 프로바이틱스 제제는 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화되어 식품 및 사료첨가제로 제공될 수 있다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다.
액상 용액으로 제제화되는 프로바이오틱스 제제에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 완충식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화 할 수 있다. 또한 프로바이오틱스 제제의 품질 저하를 방지하기 위하여 첨가하는 결착제, 유화제, 보존제 등이 있고, 효용 증대를 위하여 사료에 첨가하는 아미노산제, 비타민제, 효소제, 향미제, 비단백질태질소화합물, 규산염제, 완충제, 추출제, 올리고당 등이 있다. 그 외에도 사료 혼합제 등을 추가로 포함할 수 있으며 이에 한정된 것은 아니다.
본 발명의 프로바이오틱스 제제를 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화 할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화 하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 마니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활류를 포함할 수 있으며, 캡슐 제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 프로바이오틱스 제제를 유효성분으로 포함하는 사료 첨가제에 관한 것이다.
통상적으로 바실러스 종은 내생포자를 형성하여 열에 매우 안정적인 특징을 가지고 있다. 따라서 상기 신규 분리한 바실러스 리체니포미스 CJMPB361은 사료 첨가제 형태로 따로 제조하여 사료에 혼합시키거나, 사료 제조 시 직접 첨가시켜 제조할 수 있다. 본 발명의 사료 내 바실러스 리체니포미스 CJMPB361은 액상 또는 건조상태 일 수 있으며, 바람직하게는 건조된 분말형태이다. 건조방법은 통풍건조, 자연건조, 분무건조 및 동결건조가 가능하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 바실러스 리체니포미스 CJMPB361은 분말형태로 사료 중량의 0.05 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 1 중량%의 성분비로 혼합될 수 있다. 또한 상기 사료는 본 발명의 바실러스 리체니포미스 CJMPB361외에 사료의 보존성을 높일 수 있는 통상의 첨가제들을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 사료 첨가제는 농축액, 분말 및 과립으로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태로 제공될 수 있다. 상기 농축액은 사료 첨가제의 총 중량 중 본 발명에 따른 바실러스 리체니포미스 CJMPB361 균주, 그 배양액, 또는 그 건조물, 또는 프로바이오틱스 제제를 20 중량% 내지 90 중량%로 포함할 수 있다.
본 발명의 사료첨가제는 침지, 분무 또는 혼합하여 상기 동물사료에 첨가하여 이용될 수 있다.
본 발명의 사료첨가제를 첨가한 사료가 사용될 수 있는 동물은 예를 들어 돼지, 소, 양, 염소, 말, 토끼, 개, 고양이 등과 같은 가축, 닭, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기 등과 같은 가금류를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 사료첨가제를 포함한 동물용 사료의 배합 방법은, 상기 조성물을 동물 사료에 건조 중량기준으로 0.05 내지 0.5 중량%의 양으로 혼합한다. 본원에서 사용된 용어 "%"는 다른 정의가 없으면 중량%를 의미한다.
다른 양태로서 본 발명의 사료첨가제를 포함하는 사료를 제공하는 것이다.
본 발명에서의 바실러스 리체니포미스 CJMPB361을 포함하는 사료에는 식물성으로는 곡물류, 근과류, 식품가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 유지류, 전분류, 박류, 곡물부산물류 등이 있으며, 동물성으로는 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질, 동물성플랑크톤류, 어분 등이 있으며 이에 한정된 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 신규 균주 또는 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 제제 또는 백신보조 제제를 제공한다.
상기 바실러스 리체니포미스 CJMPB361(Bacillus licheniformis , CJMPB361; 기탁번호 KCCM11269P), 그의 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물은, 면역증강 활성을 갖는 분자량 100 내지 300 kDa 분획물 또는 1,000 kDa 이상의 분획물을 포함한다.
구체적인 실시예에서, 상기 바실러스 리체니포미스 CJMPB361의 배양상등액을 분자량 별로 분리한 후 림프구 증식 활성을 측정한 결과 1,000kDa 이상, 100~300kDa 사이의 분자량에서 마우스 비장세포의 증식이 우수 하였다(도 3). 특히, B 세포에서 배양상등액 농도에 의존적으로 증식반응을 나타냈으며, B 세포 외에도 non-T, non-B 세포의 증식반응을 증가시켰다. 증식의 효과는 분자량 1,000 kDa 이상에서 더 높았다(도 5 및 도 6). 특히, 상기 1,000 kDa이상의 배양 상등액은 항원에 의한 항체 생성에 보조제(adjuvant) 효과가 있음을 확인하였다.
또한, 7.5Gy 방사선량을 조사한 마우스에서 골수세포와 상기 1,000 kDa이상의 배양 상등액을 처리한 그룹에서는 100% 모두 생존하였다(도 8a). 9Gy로 조사한 경우에는 분획된 1,000 kDa이상의 배양 상등액을 투여한 그룹에서는 66%의 생존율을 보였다(도 8b). 이러한 결과는 상기 균주의 분획된 1,000 kDa이상의 배양 상등액이 이식된 골수세포의 증식을 유도하여 방사선 조사 마우스의 생존율을 증가시키기 때문이다. 따라서 백혈병 환자의 골수 이식세포의 증식반응 증강을 위해 사용 가능성을 제시할 수 있다.
본 발명의 면역증강용 제제 및 백신보조 제제는 조성물 총 중량에 대하여 상기 균주 또는 균주 배양액이나 농축액 또는 그의 건조물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.
본 발명의 면역증강 활성제제는 동물 또는 인간에게서 발생할 수 있는 면역저하증의 예방 또는 치료보조제로 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 백신보조제제는 항원과 함께 동물의 체내에 투여하여 항원에 대한 전신성 면역반응을 유도하기 위한 보조제제로 사용될 수 있다. 상기 항원은 진균, 방선균, 세균, 바이러스, 원충, 이들 미생물의 성분, 조직, 세포성분, 항원 단백, 항원 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 항원과 혼합하여 사용될 수 있다.
본 발명의 균주 또는 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물을 함유하는 면역증강용 제제 및 백신보조제제의 약학적 조성물의 제조에는 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 면역증강용 제제 또는 백신보조제제는 각각 통상의 방법에 따라 분산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용 될 수 있으며, 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질셀룰로스, 폴리비닐피를리돈, 물 및 광물유를 들 수 있다. 제제화를 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물에 적어도 하나 이상의 부형제를 혼합하여 제조된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드, 파라핀 이외에 여러 가지 부형제를 포함할 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사가 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 면역증강용 제제 및 백신보조제제의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 면역증강용 제제 및 백신보조제제를 1일 0.001내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001내지 10 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 면역증강용 제제 및 백신보조제제는 가축, 가금류, 인간, 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 방식은 경구, 근육, 피하, 정맥, 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 신규 균주 또는 프로바이오틱스 제제 또는 면역증강용 제제를 유효성분을 함유하는 면역 증강용 건강 기능성 식품을 제공한다.
본 발명의 프로바이오틱스 제제 또는 면역증강용 제제를 첨가할 수 있는 식품으로는 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 건강 기능성 식품류 등이 있다.
또한, 면역력 증강 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때 식품 또는 음료 중의 본 발명의 신규 균주 또는 프로바이오틱스 제제 또는 면역증강용 제제의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 50 중량%로 첨가 할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ml을 기준으로 0.05 내지 5 중량%로 첨가 할 수 있다. 본 발명의 건강 기능성 식품은 정제, 캡슐제, 액제 등의 형태를 포함한다.
본 발명의 건강 음료 조성물은 상기 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명의 신규 균주 또는 프로바이오틱스 제제 또는 면역증강용 제제를 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한점이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당, 말토스, 슈크로스, 텍스트린, 스클로텍스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 또한 향미제로는 타우린, 스테비아추출물 등과 같은 천연향미제 및 사카린, 아스파르탐 등의 합성 향미제를 사용할 수 있다.
상기 이외의 본 발명의 프로바이오틱스 제제 또는 면역증강용 제제는 여러가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 추출물은 천연과일주스 및 과일 주스 음료, 야채음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명은 신규 분리한 바실러스 리체니포미스 CJMPB361은 아밀레이즈, 셀룰레이즈, 만나네이즈, 자일라네이즈와 같은 소화효소 및 젖산 생산이 우수하며, 동물의 면역증강 활성과 항체를 생산하는 보조 효능이 우수하며, 백혈병 환자의 골수 이식세포 증식 반응 증강을 유도할 수 있는 효능을 가진다.
따라서 신규 분리한 바실러스 리체니포미스 CJMPB361은 프로바이오틱스로 이용 가능할 뿐 아니라, 동물의 면역증강용 제제 및 백신보조제제로 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 바실러스 리체니포미스 CJMPB361 균주의 전자현미경으로 쵤영한 균주 사진이다.
도 2는 본 발명의 바실러스 리체니포미스 CJMPB361의 용혈성 유무를 나타낸 그림이다.
도 3은 본 발명의 바실러스 리체니포미스 CJMPB361의 배양상등액을 분자량별 분획에 따른 마우스 림프구 증식반응을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 바실러스 리체니포미스 CJMPB361의 배양 상등액을 분자량별 분획에 따른 마우스 비장세포(림프구), 골수세포, 흉선세포의 증식반응을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 바실러스 리체니포미스 CJMPB361의 배양 상등액을 분자량별 분획에 따른 in vitro 조건에서 마우스 비장 B 세포 증식 반응을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 바실러스 리체니포미스 CJMPB361의 분획된 1,000kDa 이상의 배양상등액을 마우스 복강에 투여했을 때 생체 내 마우스 림프구 증식 반응을 나타낸 FACS 결과 그림이다. A는 isotype 대조구, B ~ E는 100kDa 이상의 배양상등액을 각각 0.67 mg, 1.35 mg. 2.7 mg, 5.4 mg으로 투여했을 때의 FACS 결과이다.
도 7은 본 발명의 바실러스 리체니포미스 CJMPB361의 분획된 1,000 kDa이상의 배양상등액을 항원과 투여시 항체 생성 보조 효과를 평가한 그래프 이다.
도 8은 본 발명의 바실러스 리체니포미스 CJMPB361의 분획된 1,000 kDa이상의 배양상등액을 골수 이식 후 세포 증식에 미치는 효과를 방사선 조사한 마우스에서 평가한 후 그 폐사율을 나타낸 그래프이다. A의 경우 7.5Gy로 방사선 조사한 마우스에서 평가한 그래프이며, B의 경우 9Gy로 방사선 조사한 마우스에서 평가한 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 이들 실시 예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 국한되는 것은 아니다.
실시예 1: 바실러스 리체니포미스 CJMPB361( Bacillus licheniformis CJMPB361) 균주의 분리 및 동정
(1) 시료 확보 및 균주 분리
한국의 전통식품인 70~80일 사이의 된장을 채취하고, 확보된 시료를 단계 희석하여 3% 염화나트륨이 첨가된 BHI 고체배지(Difco, USA)에 도말 후 37℃ 조건으로 24 시간 동안 배양하였다. 상기 시료에서 우점한 균주를 분리하였다. 선별된 콜로니는 3차에 걸쳐 새로운 배지에 옮겨 배양하는 방법으로 순수 분리 하였으며, 순수 배양된 균을 20% 글리세롤이 첨가된 배지에 담아 영하 70℃ 이하에서 보존하였다.
(2) 형태학적, 생화학적 특성 조사
상기 분리된 균주의 동정을 위하여, 일차적으로 형태학적, 생화학적 조사를 수행하였다. 형태적인 특징으로는 그람 염색결과 그람 양성이었으며, 전자현미경촬영결과 간균임을 확인하였다(도 1). 생화학적 특성을 분석하기 위하여 API 50 CHB system(Biomerieux, 프랑스)으로 균주의 당 발효 패턴을 분석하였다(표 1). 표 1의 결과를 종합한 결과, API 50 CHB system에 의하면 상기 분리된 균주는 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)와 99%의 상동성을 갖는 것으로 확인되었다.
[표 1] < 당 발효 패턴 분석결과>
Figure 112012027296788-pat00001
Figure 112012027296788-pat00002
+, 양성; -, 음성
(3) 균주 동정
균주의 보다 정확한 동정을 위하여, DNA 염기서열에 의한 분자계통분류학적 방법을 실시하였다. 염기서열분석은 PCR premix(바이오니아, 대한민국)와 유니버셜 프라이머 27F(5' AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3': 서열번호 2)와 1492R(5' GGTTACCTTGTTACGACTT3': 서열번호 3)를 사용하여 16s rDNA의 유전자 증폭을 시켰다. 유전자 증폭 시 총 반응액은 20 ㎕로 맞추어 94℃ 1분, 56℃ 1분, 72℃ 1분을 총 30회 반복하여, 증폭된 DNA 염기서열을 분석하였다. 분리 균주의 분석된 16s rDNA의 염기서열은 서열번호 1과 같다. 상기 분석결과, 바실러스 리체니포미스와 99% 상동성을 가지는 미생물로 동정되었다. 이에 상기 분리된 균주를 바실러스 리체니포미스 CJMPB361로 명명하였으며, 상기와 같은 방법으로 동정된 본 발명의 신규한 미생물은 한국미생물보존센터에 2012년 3월 22일자로 바실러스 리체니포미스 CJMPB361(Bacillus licheniformis CJMPB-361)으로 기탁하였다(기탁번호 KCCM11269P).
실시예 2: 바실러스 리체니포미스 CJMPB361 균주의 프로바이오틱스 특성 분석
(1) 분리균주의 소화 효소 활성
1) 조효소액 채취
상기 분리한 균주를 BHI 액체 배지에서 24시간 배양 후 배양액을 효소 활성 분석을 위한 조효소액으로 하여 아래와 같이 각 효소별 각각의 기질이 들어있는 배지를 사용하여 기질 분해 정도를 판정하였다.
2) 셀룰레이즈(Cellulase) 활성
1% CMC(carboxyl methyl cellulose) 기질이 첨가된 YM 배지를 제조하였다. 상기에서 채취한 조효소액 2 ㎕씩 기질배지에 분주한 후, 37℃에서 15시간 반응시킨 후, 0.2% congo red 수용액으로 30분 동안 염색하였으며, 1M NaCl 수용액으로 탈색하였다. 조효소액 주위의 기질이 분해되어 생기는 투명환(clear zone)의 형성 정도에 따라 효소의 활성능력을 측정하였다.
3) 아밀레이즈(Amylase) 활성
1% soluble starch 기질이 첨가된 YM 배지를 제조하였다. 상기에서 채취한 조효소액 2 ㎕씩 기질배지에 분주한 후, 37℃ 에서 15시간 반응시켰다. I2와 KI가 각각 0.1%, 2% 첨가된 수용액으로 염색한 후 조효소액 주위의 기질은 분해 되어 생기는 투명환(clear zone)의 형성 정도에 따라 효소의 활성능력을 측정하였다.
4) 자일라네이즈(xylanase) 활성
1% 자일란(xylan)이 첨가된 YM 배지를 제조하였다. 배양액 2㎕씩 기질배지에 분주하고, 37℃ 에서 15시간 반응 후, 0.2% congo red 수용액으로 30분 동안 염색하였으며, 1M NaCl 수용액으로 탈색하였다. 투명환 형성 정도에 따라 효소의 활성능력을 측정하였다.
5) 만나네이즈 활성
1% 만난(logust bean gum, sigma, USA)이 첨가된 기질배지(Yeast extract 3g/L, Peptone 5g/L, KH2PO4 1g/L, Agar 20g/L, pH5)를 제조하였다. 배양액 2 ㎕씩 기질배지에 분주한 후, 37℃에서 15시간 반응 후 투명환 형성 정도에 따라 효소의 활성능력을 측정하였다.
신규 분리한 균주 바실러스 리체니포미스 CJMPB361은 표 2와 같이 셀룰레이즈, 아밀레이즈, 자일라네이즈, 만나네이즈에 대한 소화효소 활성이 있었다. 특히, 자일라네이즈 및 만나네이즈에 대한 활성이 높았다.
[표 2] <소화효소 생산성>
Figure 112012027296788-pat00003
-: 활성없음, +; 활성 있음, ++: 활성우수, +++: 활성 매우 우수
(2) 젖산(lactic acid) 생산성
상기 분리균주의 젖산 생산을 평가하기 위하여 250 ml 마개가 있는 플라스크에 PSG 액체배지(폴리펩톤 10g/L, 효모추출물 10g/L, 포도당 20g/L, 제2인산칼륨 35g/L) 100 ml에 상기 분리균주를 1% 접종 후, 37℃, 200rpm에서 24시간 배양하였다. 배양 종료 후 배양 상등액에서의 젖산 생산량을 HPLC를 이용하여 정량하였다. 젖산의 전환율은 아래와 같이 계산하였다.
젖산의 전환율 = (젖산의 생산율 / 초기 당농도) x 100
상기 균주는 93.5%의 젖산을 전환하는 것으로 나타났다. 논문에 보고 된 바에 의하면 젖산을 생산하는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스의 젖산 전환율이 60.7%로 보고되었으며(Kim , K. M et al . J. Microbiol . Biotechnol ., 19(2009) 1013-1018), 상기 분리균주인 바실러스 리체니포미스 CJMPB361의 경우 더 많은 젖산을 전환하는 것으로 확인되었다. 따라서 분리균주인 바실러스 리체니포미스 CJMPB361은 젖산을 생산하는 특징을 가지고 있음을 알 수 있었다.
(3) 내생포자 형성능
바실러스는 필수 영양원들 중에 한 개 이상의 영양원이 고갈되는 등의 스트레스를 받으면 생존하기 위해 내생포자를 형성한다. 내생포자는 자외선, 고온, 저온 건조 및 고압 등의 극한 환경에 저항성을 가지기 때문에 바실러스의 생존율을 유지하는데 있어서 내생포자의 형성은 중요하다. 따라서 바실러스 리체니포미스 CJMPB361을 장시간 배양하여 내생포자 형성능을 확인하였다.
BHI 액체배지에 균을 0.1% 접종하여, 37℃, 200 rpm에서 24시간, 48시간 배양하였다. 각 시간대 별 배양액을 BHI 고체 배지에 도말하여 총 균수를 측정하고, 95℃에서 10분간 열처리한 배양액을 BHI 고체 배지에 도말하여 내생포자 수를 측정하였다.
표 3에 나타난 바와 같이 바실러스 리체니포미스 CJMPB361을 24시간 배양하였을 때 약 0.3%가 내생포자를 형성하였으며, 48시간 배양하였을 때 78% 내생포자를 형성하는 것을 알 수 있었다. 본 발명의 바실러스 리체니포미스 CJMPB-361은 48시간 이상 배양 시 높은 내생포자 형성능을 가지고 있어 프로바이오틱스로 사용 시 생존율을 높게 유지할 수 있는 특성이 될 수 있다.
[표 3] < 내생포자 형성능>
Figure 112012027296788-pat00004
(4) 용혈성(β-hemolysis)
β-용혈이란 유해균 중 인지질 효소를 생산하여 적혈구에 의해서 공급되는 인지질을 가수분해하여 적혈구를 용혈시키는 작용이다.
분리균주의 용혈성을 알아보기 위하여 5% 양혈액(sheep blood, 기산바이오텍, 대한민국)이 함유되어 있는 TSA(Difco, USA)를 제조하였다. 제조된 혈액한천배지에 선형 접종(streaking)한 후, 37℃에서 24시간 배양하여 용혈 여부를 확인한 결과, 도 2와 같이 용혈성을 나타내지 않았음을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 바실러스 리체니포미스 CJMPB361 균주의 면역증강 활성
(1) 림프구 증식반응 검사
6 ~ 7주령 사이의 BALB/c 마우스(오리엔트㈜, 대한민국)를 호흡마취기를 통하여 희생시킨 후 비장을 채취하고 비장을 멸균된 슬라이드 글라스 두 장으로 가볍게 압축하여 림프구를 유리시켰다. 분리한 림프구는 세포배양 배지인 RPMI 1640(Invitrogen, USA)으로 3회 세척하였다. 또한 세포 부유액 내에 있는 적혈구를 제거한 후 10% 우태아 혈청이 함유된 RPMI 1640 배지에 2x106 cell/ml로 부유시켰다. 시험 시료인 바실러스 리체니포미스 CJMPB361을 24시간 동안 배양한 상등액을 PRMI1640 배지로 1:20으로 1차 희석 후, 2배씩 단계 희석 하였다.
상기 부유시킨 림프구를 96 well 플레이트에 100 ㎕씩 분주하고, 준비된 시료를 100 ㎕씩 첨가 하였다. 상기 플레이트는 37℃, 5% CO2 배양기에서 2일간 배양한 후, tritiated thymidine(3H TdR)(New England Nuclear, Boston) 10 ㎕를 각각의 well에 첨가하여 6시간 연장 배양하였다. 배양된 세포는 glass fiber filter에 흡착시키고 실온에서 24시간 동안 건조한 후 Melt-on scintillator sheet(MeltLexTM A, Wallac)를 filtermat 위에 올려놓고 항온기 위에서 1~4분간 녹였다. Liquid scintillation counter(Microbeta 1450, Tailux)에 의해 세포 내 흡수된 3H TdR의 양을 측정한 결과 상기 바실러스 리체니포미스 CJMPB361이 림프구를 증식하는 것을 확인 하였다. 따라서 상기 균주의 배양상등액을 분자량 별로 분리한 후 상기 방법과 동일하게 림프구 증식 활성을 측정한 결과 도 3과 같이 1,000kDa 이상, 100~300kDa 사이의 분자량에서 마우스 비장세포의 증식이 우수 하였다.
(2) 골수세포 및 흉선세포의 증식반응
골수 세포의 분리는 상기의 BALB/c 마우스의 넙적다리를 가위로 양쪽 끝을 절단하고 RPMI1640 배지가 담긴 10 ml 주사기 바늘을 절단한 넙적다리에 넣어 골수 세포를 유리 시켰다. 또한 흉선세포의 분리는 비장세포 분리와 동일하게 시행하여 흉선으로부터 분리하였다. 골수세포 및 흉선세포의 증식반응은 상기 비장세포의 증식반응 시험과 동일하게 진행하였다.
시험 결과 바실러스 리체니포미스 CJMPB361 배양 상등액의 분자량 1,000 kDa 이상, 100~300 kDa 사이의 분획이 비장 림프구 및 골수 세포를 증식시켰으며, 흉선세포에서는 증식반응을 보이지 않았다. 따라서 상기 분획이 T 세포의 증식에는 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다(도 4).
(3) in vitro 에서 마우스 비장 B 세포에 미치는 효과
분자량별 분획한 바실러스 리체니포미스 CJMPB361의 배양 상등액 중 어떤 분자량의 물질이 비장세포의 증식반응을 유도하는 지 알기 위하여 마우스 비장 림프구에서 B-세포와 non-B세포를 분리하였다. 일반적으로 정상 마우스 비장세포의 T 세포, B 세포, non-T 세포, non-B 세포의 비율을 FACS로 분석하여 조사한 결과 표 4에 제시한 것과 같이 나타내었다. 이 비장 림프구에서 B 세포를 magnetic cell 선택방법을 이용하여 분리하고 FACS로 분석하면 T세포, B 세포, non-B 세포 및 non-T 세포 비율이 0.1%, 94.6%, 4.7%로 분리한 B 세포는 매우 높은 순도를 나타내었으며, 비장 림프구에서 B 세포를 분리한 나머지 non-B 세포에는 T 세포, B 세포, non-B 세포 및 non-T 세포가 46.8%, 22.3%, 27%로 나타났다(표 4).
[표 4] < 마우스 비장세포에서 분리한 B 세포와 non-B 세포에 대한 FACS 분석>
Figure 112012027296788-pat00005
상기에서 분리된 B 세포와 non-B 세포에 3가지 분획된 분자량의 바실러스 리체니포미스 CJMPB361을 넣어 상기 비장세포의 증식반응과 동일한 방법으로 배양한 결과 도 5와 같이 분자량 1,000 kDa 이상과 분자량 100-300 kDa 분획에서 B 세포의 증식반응이 나타났으며, B 세포 외에도 non-T, non-B 세포의 증식반응을 증가시켰다. 증식의 효과는 분자량 1,000 kDa 이상에서 더 높았다(도 5).
(4) in vivo 에서 마우스 비장 B 세포에 미치는 효과
생체 내에서 면역증강 물질이 마우스 림프구 및 골수 세포 증식과 면역반응에 미치는 효과를 알아보기 위해 복강으로 바실러스 리체니포미스 CJMPB361의 분획된 1,000 kDa 이상의 배양상등액을 투여하였다. 투여 2일 및 3일 후 마우스를 도살하여 비장을 분리하였다. 분리된 비장의 무게를 측정하였으며, 비장 림프구 수량의 변화를 FACS로 측정하였다. 면역증강 물질을 마우스 복강으로 0.67 mg, 1.35 mg, 2.7 mg 및 5.4 mg 투여한 경우 비장의 크기가 각각 15%, 20%, 98%, 51%로 증가하였다. 비장 림프구의 FACS 분석에서는 0.67 mg 투여군의 B 세포 비율에는 변화가 없으나, 1.35 mg 투여군에서는 B 세포의 비율이 41%에서 45.3%로 증가하였으며 2.7 mg 투여군에서는 47.6%, 5.4 mg 투여군에서는 49.7% 증가하는 양상을 보였다. 따라서 B 세포는 바실러스 리체니포미스 CJMPB361의 분획된 1,000 kDa이상의 배양상등액 농도에 의존적으로 증식반응을 나타내는 것으로 나타났다(도 6).
(5) 항체 생성 증가에 미치는 보조제 효과
바실러스 리체니포미스 CJMPB361의 분획된 100kDa이상의 배양 상등액이 항원에 의한 항체생성에서 보조제 역할을 할 수 있는지 조사하였다. BALB/c 마우스를 3 그룹으로 나누고, 다음과 같이 오브알부민(OVA)과 바실러스 리체니포미스 CJMPB361의 분획된 1,000 kDa이상의 배양상등액을 투여하였다. A 그룹은 생리식염수, B 그룹은 OVA 100 ㎍을 등 피하로 주사, C 그룹은 OVA 100 ㎍을 등 피하로 주사 후 2일째마다 상기 균주의 분획된 1,000 kDa 이상의 배양 상등액을 복강 주사하는 그룹으로 나누었다. 면역은 항원인 OVA 100 ㎕(1 mg/ml)를 마우스 피하로 주사하였고, 균주의 분획된 1,000 kDa 이상의 배양 상등액은 복강으로 100 ㎕(2.7mg) 주사하였다. 항체 측정을 위해 최종 주사 3일 후에 마우스 하대 정맥으로부터 혈액을 채취하여 혈청을 분리하였고 OVA에 대한 특이항체는 ELISA 방법으로 측정하였다. 먼저 OVA를 코팅 buffer(0.03M Na2CO3, 0.068M NaHCO3, pH9.4~9.8)에 2 ㎍/ml의 농도로 희석하여 96 well 플레이트에 100 ㎕씩 첨가한 후 4℃에서 15시간 반응시켰다. 0.1% Tween 20이 첨가된 인산완충용액(세척 buffer)으로 3회 세척하였다. 세척된 플레이트를 1% 소 혈청 알부민이 포함된 용액으로 비 특이적인 결합을 차단하기 위해 1시간 동안 반응시켰다. 플레이트를 세척 buffer로 5회 세척 후 준비된 마우스 혈청을 단계희석 하여 첨가한 후 2시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후 플레이트를 세척 buffer로 5회 세척한 후 2차 항체(goat anti-mouse polyvalent immunoglobulins peroxidase conjugate)를 희석하여 첨가한 후 1시간 반응시켰다. 5회 plate를 다시 세척한 후 TMB 기질을 첨가한 후 30분간 발색 후 0.12M H2SO4용액을 넣어 반응을 중지시키고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 7에서 제시된 바와 같이 생리식염수만 투여한 처리구에서는 OVA에 대한 특이 항체가 측정되지 않았으며, OVA만을 투여한 처리구에서는 IBA에 대한 특이항체가 생성되나, 항체가는 낮게 나타났다. OVA와 상기 균주의 분획된 1,000 kDa이상의 배양 상등액을 함께 투여한 처리구에서는 OVA만을 투여한 처리구에 비해 항체가가 매우 크게 증가됨을 확인할 수 있었다. 따라서 상기 균주의 분획된 1,000 kDa이상의 배양 상등액이 항원에 의한 항체 생성에 보조제(adjuvant) 효과가 있음을 의미한다.
(6) 골수 이식 후 세포 증식에 미치는 효과
바실러스 리체니포미스 CJMPB361의 분획된 1,000 kDa이상의 배양 상등액이 B 세포는 물론 골수세포 및 비장의 non-T, non-B 세포의 증식반응을 증가시키는 사실에 따라 이 면역물질이 방사선 조사를 받은 마우스에 이식한 골수세포의 증식 여부를 확인해 보고자 하였다. 마우스 골수세포를 파괴하기 위해 마우스를 방사선 조사 하였다. 정상인 마우스를 10일 이내 사망 시킬 수 있는 최소의 cobalt 방사선 감마량을 조사하고자 7.5, 9, 10, 12Gy의 감마량으로 조사한 후 생존율을 비교하였으며, 7.5Gy 조사 시 평균 수명은 약 9~10일, 9Gy로 조사 하였을 때 8~9일, 10Gy로 조사하였을 때 7일, 12Gy로 조사하였을 때 6일로 나타났다. 상기 결과를 기초로 하여 방사선을 조사한 마우스에 동종의 골수세포를 이식하고 상기 균주의 분획된 100 kDa이상의 배양 상등액을 투여 또는 비투여 하여 생존율을 비교하였다. BALB/c 마우스에 7.5Gy 또는 9Gy로 방사선을 조사하고, 조사된 마우스는 각각 3 그룹으로 나누었다. 1 그룹은 생리식염수를 투여, 2 그룹은 동종의 정상 마우스로부터 얻은 골수 세포(1x107 cell/mouse)를 이식하였다. 그룹 3은 동일한 골수 세포를 같은 방법으로 이식하고 2.7 mg의 상기 균주의 분획된 1,000 kDa이상의 배양 상등액을 복강으로 투여하였다. 생리식염수 및 골수세포는 모두 마우스 꼬리 정맥으로 투여하였으며, 상기 분획된 1,000 kDa 이상의 배양상등액은 복강으로 투여하였다. 이러한 투여는 모두 방사선 조사 후 2시간 이내에 시행 하였으며 실험 후 마우스 생존율은 30일간 관찰하였다. 도 8과 같이 방사선량을 7.5Gy 조사한 마우스에서 생리식염수를 투여한 그룹에서는 8~11일 사이에 모두 폐사하였으며, 골수 세포만을 이식한 그룹에서는 66% 생존율을 나타내었다. 이에 반하여 골수세포와 상기 균주의 분획된 1,000 kDa이상의 배양 상등액을 처리한 그룹에서는 100% 모두 생존하였다(도 8A). 한편 방사선량을 더 증사시켜 9Gy로 조사한 경우에는 생리식염수만 투여한 그룹은 6~9일 모두 사망하였고, 골수세포만을 이식한 그룹에서는 33%의 생존율을 나타나는데 비하여, 골수세포 이식과 함께 상기 균주의 분획된 1,000 kDa이상의 배양 상등액을 투여한 그룹에서는 66%의 생존율을 보였다(도 8B). 13일까지 생존하는 마우스는 30일간 관찰에서도 모두 생존하였으며, 정상체중에 도달하는 시간은 12일 정도 소요되었다. 이러한 결과는 상기 균주의 분획된 1,000 kDa이상의 배양 상등액이 이식된 골수세포의 증식을 유도하여 방사선 조사 마우스의 생존율을 증가시키기 때문이다. 따라서 백혈병 환자의 골수 이식세포의 증식반응 증강을 위해 사용 가능성을 제시할 수 있다.
본 발명은 신규 분리한 바실러스 리체니포미스 CJMPB361은 아밀레이즈, 셀룰레이즈, 만나네이즈, 라이페이즈와 같은 소화효소 및 젖산 생산이 우수하며, 동물의 면역증강 활성과 항체를 생산하는 보조 효능이 우수하며, 백혈병 환자의 골수 이식세포 증식 반응 증강을 유도할 수 있는 효능을 가진다. 따라서 신규 분리한 바실러스 리체니포미스 CJMPB361은 프로바이오틱스로 이용 가능할 뿐 아니라, 동물의 면역증강용 제제 및 백신보조제제로 이용될 수 있다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM11269P 20120322
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Claims (11)

  1. 셀룰레이즈, 아밀레이즈, 자일라네이즈 및 만나네이즈 중 1 종 이상의 소화효소 및 젖산을 생산하며, 면역증강 활성을 가지는 바실러스 리체니포미스 CJMPB361(Bacillus licheniformis, CJMPB361; 기탁번호 KCCM11269P).
  2. 바실러스 리체니포미스 CJMPB361(Bacillus licheniformis CJMPB361, 기탁번호 KCCM11269P)의 배양액, 그의 농축액 및 그의 건조물로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 바실러스 리체니포미스 CJMPB361의 배양물.
  3. 제1항의 바실러스 리체니포미스 CJMPB361(기탁번호 KCCM11269P) 또는 제2항의 배양물을 포함하는 프로바이오틱스 제제.
  4. 제3항의 프로바이오틱스 제제를 포함하는 사료 첨가제.
  5. 제4항에 있어서, 상기 사료 첨가제는 20 내지 90% 고농축액, 분말 및 과립으로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태인 사료 첨가제.
  6. 제4항에 따른 사료 첨가제를 포함하는 사료.
  7. 바실러스 리체니포미스 CJMPB361(Bacillus licheniformis, CJMPB361; 기탁번호 KCCM11269P), 그의 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물을 포함하거나, 바실러스 리체니포미스 CJMPB361(Bacillus licheniformis, CJMPB361; 기탁번호 KCCM11269P), 그의 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 하는 프로바이오틱스 제제를 포함하는, 면역저하증의 예방 또는 치료 보조 제제.
  8. 제7항에 있어서, 상기 바실러스 리체니포미스 CJMPB361(Bacillus licheniformis, CJMPB361; 기탁번호 KCCM11269P), 그의 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물이, 면역증강 활성을 갖는 분자량 100 내지 300 kDa 분획물 또는 1,000 kDa 이상의 분획물을 포함하는, 면역저하증의 예방 또는 치료 보조 제제.
  9. 바실러스 리체니포미스 CJMPB361(Bacillus licheniformis, CJMPB361; 기탁번호 KCCM11269P), 그의 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물을 포함하거나, 바실러스 리체니포미스 CJMPB361(Bacillus licheniformis, CJMPB361; 기탁번호 KCCM11269P), 그의 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물을 포함하는 프로바이오틱스 제제를 포함하는, 면역 증강용 건강 기능성 식품.
  10. 제9항에 있어서, 상기 식품이 분말, 과립, 정제, 캡슐 및 음료로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태인 건강 기능성 식품.
  11. 바실러스 리체니포미스 CJMPB361(Bacillus licheniformis, CJMPB361; 기탁번호 KCCM11269P), 그의 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물을 포함하거나, 바실러스 리체니포미스 CJMPB361(Bacillus licheniformis, CJMPB361; 기탁번호 KCCM11269P), 그의 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 하는 프로바이오틱스 제제를 포함하는, 백신보조 제제.
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