KR101661745B1 - 효소 생성능을 갖는 신규한 바실러스 서브틸리스 gcb-13-001 균주 및 이를 이용한 클로스트리듐 속 세균 독소 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

효소 생성능을 갖는 신규한 바실러스 서브틸리스 gcb-13-001 균주 및 이를 이용한 클로스트리듐 속 세균 독소 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 효소 생성능을 갖는 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 균주; 상기 균주의 배양균액 또는 배양상층액; 상기 균주, 배양균액 또는 배양상층액을 유효성분으로 포함하는 클로스트리듐 속(Clostridium sp.) 세균 또는 세균 독소의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 신규한 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 균주, 이의 배양균액 또는 배양상층액은 효소 생성능이 우수하여, 상기 균주, 이의 배양균액 또는 배양상층액은 클로스트리듐 속 세균의 증식을 억제시키고, 상기 세균의 독소에 우수한 항균 및 항독소로서 작용하는 효과가 있어, 이를 상기 클로스트리듐 속 세균에 의해 발생되는 독소원성 소화기질병의 예방 및 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

효소 생성능을 갖는 신규한 바실러스 서브틸리스 GCB-13-001 균주 및 이를 이용한 클로스트리듐 속 세균 독소 예방 또는 치료용 조성물{Composition comprising novel bacillus subtilis GCB-13-001 having enzymatic profile for treating or preventing Clostridium sp. bacterial toxin}
본 발명은 효소 생성능을 갖는 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 균주; 상기 균주의 배양균액 또는 배양상층액; 상기 균주, 배양균액 또는 배양상층액을 유효성분으로 포함하는 클로스트리듐 속(Clostridium sp.) 세균 또는 세균 독소의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
병원성 세균에 의한 질병 발생 기전은 크게 셋으로 나눌 수 있다. 첫번째 발병 기전으로는 살모넬라 속(Salmonella sp.) 및 증식성회장염균인 로소니아 인트라셀루라리스(Lawsonia intracellularis)과 같이 조직 침습성세균이 세포 및 조직 내에 침투하여 염증, 조직파괴 등을 유발하는 것이다. 두번째 발병 기전으로는 대장균(E. coli), 장독혈증균인 클로스트리듐 퍼푸린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리듐 보투리즘(Clostridium botulinum) 및 파상풍균인 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani)와 같이 독소를 생성하여 설사를 일으키거나 전신적인 신경증상을 유발하는 것이다. 또한, 세번째 발병 기전으로는 포도상구균(Staphylococcus sp.)및 연쇄상구균(Streptococcus sp.)처럼 침습성과 독소 생성능을 모두 갖고 병증을 유발하는 것이다.
클로스트리듐 퍼푸린겐스(Clostridium perfringens type A, C)가 생성하는 독소(alpha, beta toxin)에 의하여 닭과 각종 동물에 괴사성장염이 발병하며 침울, 식욕결핍, 활력감퇴 및 설사 등의 임상증상을 보이면서 급사하는 경우가 많다. 병변은 주로 소장의 괴사, 위막형성 및 출혈 등이 나타난다. 또한, 상기 괴사성장염은 송아지 및 자돈의 경우 1주령 이하의 신생자축에서 다발적으로 발생하고, 닭에서는 주로 2-3 주령의 닭에서 발생하나 3-6개월령의 산란계에서도 발생하기도 하여, 거의 모든 일령의 닭에서 발생할 수 있다. 상기 괴사성장염의 일반적인 발병율은 5-40%이나, 콕시듐 감염이나 고섬유사료 급여시에는 발병율이 크게 증가한다. 자돈이나 닭이 괴사성장염에 감염되면 성장율과 사료효율이 현저히 감소하고 폐사가 발생하므로 양돈 및 양계산업에 커다란 피해를 준다.
또한, 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile)은 항생제 사용과 관련하여 장염을 유발하는 것으로 알려져 있으며 사람을 포함해서 대부분의 동물에서 발생하고 있다. 미국에서는 상기 균으로 인하여 사람의 사망이 지속적으로 발생하고 있어, 상기 균을 사람의 생명을 위협하는 설사병 원인균으로 주목하고 있으며, 이로 인해 매년 1억달러 정도의 의료비용이 발생하는 것으로 보고되었다.
상기 두번째 발병기전 특징을 갖는 대부분의 독소원성 세균성전염병의 예방을 위하여, 세균체 성분이나 톡소이드를 항원으로 하여 제조한 백신으로 질병예방을 하고 있으나, 세균독소를 다량으로 생산 및 정제하기가 어렵고, 괴사성장염이나 돼지 부종병은 소화기질병이기 때문에 백신을 주사하여도 점막면역의 부적정으로 큰 효과를 볼 수 없는 등의 문제가 있어, 국내에서는 이에 대한 백신이 생산되고 있지 않다. 또한, 린코마이신, 버지니아마이신, 콜리스틴 및 겐타마이신 등 일반적인 항생제로 치료는 가능하나 점차 내성균의 확산으로 효과가 감소하는 양상을 보이고 있으며, 2011년 7월부터 가축사료에 항생제 첨가사용을 전면 금지하고 있어 종전처럼 항생제 사용으로 세균성전염병을 예방하는 것이 어려운 실정이다. 더구나, 독소에 의해 증상이 나타난 경우에는 항생제로 치료할 수 없기 때문에 적절한 예방 및 치료대책이 없는 실정이다.
이에 본 발명자들은 클로스트리듐 속 균의 독소의 예방 및 치료에 대해 연구하던 중, 효소 생성능을 갖는 신규한 바실러스 서브틸리스 GCB-13-001 배양균액 또는 배양상층액의 효소가 클로스트리듐 속 균의 독성을 고도면역혈청과 유사하게 중화하고, 이를 치료하며, 클로스트리듐 속 균의 증식을 억제시키는 효과가 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
KR 101108472 KR 101081334 KR 1020110032375 JP-P-1999-00338829 JP-P-2008-317425
본 발명의 목적은 바실러스 서브티리스 GCB-13-001(기탁번호: KCTC 12595BP) 균주를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 상기 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 균주의 배양균액 또는 배양상층액을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 상기 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 균주, 이의 배양균액 또는 배양상층액을 유효성분으로 포함하는, 클로스트리듐 속(Clostridium sp.) 세균 또는 세균 독소의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 상기 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 균주, 이의 배양균액 또는 배양상층액을 유효성분으로 포함하는, 클로스트리듐 속(Clostridium sp.) 세균 또는 세균 독소의 예방 또는 개선용 사료용 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 상기 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 균주, 이의 배양균액 또는 배양상층액을 유효성분으로 포함하는, 클로스트리듐 속(Clostridium sp.) 세균 또는 세균 독소의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 바실러스 서브티리스 GCB-13-001(기탁번호: KCTC 12595BP) 균주를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 균주의 배양균액 또는 배양상층액을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 균주, 이의 배양균액 또는 배양상층액을 유효성분으로 포함하는, 클로스트리듐 속(Clostridium sp.) 세균 또는 세균 독소의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 균주, 이의 배양균액 또는 배양상층액을 유효성분으로 포함하는, 클로스트리듐 속(Clostridium sp.) 세균 또는 세균 독소의 예방 또는 개선용 사료용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 균주, 이의 배양균액 또는 배양상층액을 유효성분으로 포함하는, 클로스트리듐 속(Clostridium sp.) 세균 또는 세균 독소의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 신규한 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 균주, 이의 배양균액 또는 배양상층액은 효소 생성능이 우수하여, 상기 균주, 이의 배양균액 또는 배양상층액은 클로스트리듐 속 세균의 증식을 억제시키고, 상기 세균의 독소에 우수한 항균 및 항독소로서 작용하는 효과가 있어, 이를 상기 클로스트리듐 속 세균에 의해 발생되는 독소원성 소화기질병의 예방 및 치료에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 각 균의 프로테아제 효소 생성능을 확인한 것을 나타낸 도이다(33; 바실러스 서브티리스 GCB-13-005 배양상층액, 34; 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 배양상층액, 35; 바실러스 서브티리스 GCB-13-006 배양상층액, 37; 합성효소제(1% 액), 73; 상업용 환경개선제 배양균액, 74; 바실러스 서브티리스 GCB-13-005 배양상층액, 75; 바실러스 서브티리스 GCB-13-006 배양상층액, 76; 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 배양상층액).
도 2는 각 균의 아밀라아제 효소 생성능을 확인한 것을 나타낸 도이다(5 및 6; 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 배양상층액, 7; 바실러스 스패리쿠스 배양균액, 8; 바실러스 스패리쿠스 배양상층액, 41; 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 배양상층액, 42; 합성 효소제, 43; 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 배양상층액, 44; 바실러스 윱첸긴스 배양상층액).
도 3은 각 균의 리파아제 효소 생성능을 확인한 것을 나타낸 도이다(13; 바실러스 서브티리스 GCB-13-016 배양상층액, 14 및 15; 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 배양균, 16; 패니바실러스 알지노라이티쿠스 배양균, 17; 패니바실러스 알지노라이티쿠스 배양상층액, 18; 락토바실러스 루테리 배양균, 19; 락토바실러스 루테리 배양상층액, 20 및 21; 패니바실러스 키토노라이티쿠스 배양균 22; 바실러스 리케니포미스 배양균, 23; 락토바실러스 카세이 배양균, 24; 락토바실러스 카세이 배양상층액)
도 4는 클로스트리듐 독소에 의해 생존 및 폐사한 마우스(A), 및 바실러스 서브티리스 GCB-13-001의 배양균액 또는 배양상층액을 접종하는 것(B)을 나타낸 도이다.
도 5는 면양혈액평판배지상에 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 배양균액과 클로스트리듐 퍼푸린겐스 A형을 혼합처리하고(A), 이의 대조군으로 상기 배양균액을 혼합처리하지 않은 클로스트리듐 퍼푸린겐스 A형(B)의 발육 정도를 확인한 도이다(A3; 바실러스 서브트리스 GCB-13-001 배양균액 및 클로스트리듐 퍼푸린겐스 A형 혼합처리, A22; 배양균액으로 처리하지 않은 클로스트리듐 퍼푸린겐스 A형의 정상집락 및 용혈상, C22; 클로스트리듐균을 첨가하지 않고 배양균액만이 있는 음성 대조군)
도 6은 면양혈액평판배지상에 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 및 006 배양균액과 클로스트리듐 퍼푸린겐스 A형을 혼합처리하고((A)의 A22), 이의 대조군으로 상기 배양균액을 혼합처리하지 않은 클로스트리듐 퍼푸린겐스 A형(((A)의 A22)의 발육 정도(집락 및 용혈상)를 확인한 도이다(바실러스 서브트리스 GCB-13-005 배양균액 처리(A1); 바실러스 서브트리스 GCB-13-006 배양균액 처리(A2);바실러스 서브트리스 GCB-13-001 배양균액 처리(A3); 패니바실러스 키토노라이티쿠스(Paenibacillus chitonolyticus) 배양균액 처리(A4); 바실러스 서브트리스GCB-13-005 및 바실러스 서브트리스 GCB-13-006 배양균 혼합액 처리(A7); 바실러스 서브트리스GCB-13-005 및 바실러스 서브트리스 GCB-13-001 배양균 혼합액 처리(A8))
도 7은 면양혈액평판배지상에 바실러스 서브티리스 GCB-13-005 및 006 배양균액과 클로스트리듐 퍼푸린겐스 C형을 혼합처리하고(A), 이의 대조군으로 상기 배양균액을 혼합처리하지 않은 클로스트리듐 퍼푸린겐스 C형(B)의 발육 정도를 확인한 도이다(C1: (바실러스 서브트리스 GCB-13-005 배양균액 및 클로스트리듐 퍼푸린겐스 C형 혼합처리 후 면양혈액평판배지상의 클로스트리듐 퍼푸린겐스 C 형 발육, C2; 바실러스 서브트리스 GCB-13-006 배양균액과 클로스트리듐 퍼푸린겐스 C형 혼합처리 후 면양혈액평판배지상의 클로스트리듐 퍼푸린겐스 C형 발육).
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 바실러스 서브티리스 GCB-13-001(기탁번호: KCTC 12595BP) 균주를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서는 흙, 볏짚 실험동물 깔짚 등에서 효소 활성 및 생성능이 우수한 균주를 분리 및 선별하였다.
보다 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 상기 선별한 균주의 16S rDNA의 염기서열을 분석하고 유전자원 은행 데이타베이스(Genebank database)를 통해 검색한 결과, 바실러스 서브티리스와 99%의 상동성을 가지는 것을 확인하였다. 이에, 상기 균주는 바실러스 속인 것으로 동정하였으며 '바실러스 서브티리스 GCB-13-001'로 명명하였다. 상기 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 균주는 2014년 05월 20일자로 국제기탁기관인 한국생명공학연구원내 유전자 은행에 기탁하였으며(기탁번호; KCTC 12595BP), 상기 균주의 16S rDNA의 염기서열은 서열번호 3으로 나타내었다. 이 외에도, 바실러스 서브티리스 GCB-13-005 및 바실러스 서브티리스 GCB-13-006 균주를 선발하였다.
또한, 본 발명의 일실시예를 통하여, 상기 바실러스 서브티리스 GCB-13-001, GCB-13-005 및 GCB-13-006 균주는 그람 양성 간균이고, 카탈라아제(catalase) 양성, VP test 양성, 시트라아제(Citrate) 양성, 니트라아제(Nitrate) 양성, 인돌(Indol) 음성, 당(글루코스(Glucose), 아라비노즈(Arabinose), 자일로즈(Xylose), 만니톨(Mannitol)) 분해능 양성, 전분(카제인(Casein), 겔라틴(Gelatin), 전분(Starch)) 분해능 양성 등의 성상을 갖는 특징이 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명의 일실시예를 통하여, 상기 바실러스 서브티리스 GCB-13-001는 프로테아제(protease), 아밀라아제(amylase) 및 리파아제(lipase) 등을 포함하는 효소생성능을 가지며, 상기 바실러스 서브티리스 GCB-13-001의 배양균액 또는 배양상층액과 1 내지 10 Lo의 클로스트리듐 퍼푸린겐스 A, C형 및 1 내지 10 MLD 클로스트리듐 디피실을 혼합하여 마우스의 미정맥에 접종한 후, 마우스 폐사 여부를 관찰한 결과, 본 발명에 따른 바실러스 서브티리스 GCB-13-001에 의해 상기 클로스트리듐 퍼푸린겐스 A, C형 및 클로스트리듐 디피실의 독소를 효과적으로 중화시킴을 확인하였다. 또한, 마우스에 클로스트리듐 퍼푸린겐스 A, C형 및 클로스트리듐 디피실을 접종한 후, 바실러스 서브티리스 GCB-13-001의 배양균액 또는 배양상층액을 접종하여 마우스의 폐사 여부를 관찰한 결과, 본 발명에 따른 바실러스 서브티리스 GCB-13-001에 의해 상기 균의 독성을 효과적으로 치료함을 확인하여, 본 발명에 따른 신규한 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 균주의 배양균액 또는 배양상층액은 클로스트리듐 속 세균에 대한 우수한 항독소 작용을 가지고 있음을 확인하였다.
상기 "LO"는 클로스트리듐 퍼푸린겐스 A 및 C형 독소의 독력은 국제표준기관인 미국 National Animal Disease Center(NADC)에서 독소와 항독소를 표준화하고 있으며, 독소 1Lo는 표준항독소 1.0AU(antitoxin unit)로 중화되는 독소량을 의미한다.
상기 "MLD"는 Minimal lethal Dose의 약자이며 이는 최소치사량을 의미하며, 클로스트리듐 디피실 독소에 대한 표준량은 NADC에서 정해져 있지 않아, 본 발명의 발명자들은 클로스트리듐 디피실 독소를 2진 희석하여 각 희석배수별 독소 0.5ml를 마우스 미정맥에 접종하고 48시간 후의 마우스가 모두 폐사한 최소 희석배수의 독소량을 1MLD로 정하여 이를 사용하였다.
또한, 본 발명의 일실시예를 통하여, 바실러스 서브티리스 GCB-13-001, GCB-13-005 및 GCB-13-006 배양균과 클로스트리듐 퍼푸린겐스 A 및 C형 배양균을 37℃, 18시간 혼합처리한 후, 면양혈액배지 평판에 접종하여 클로스트리듐균 집락과 이에 따른 용혈양상으로 시험한 결과, 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 균주가 직접적으로 클로스트리듐균 증식을 억제하는 효과가 뛰어남을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 따른 신규한 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 균주의 배양균액 또는 배양상층액은 클로스트리듐 속 세균에 의해 발생되는 독소원성 소화기질병의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
또한 본 발명은 상기 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 균주의 배양균액 또는 배양상층액을 제공한다.
본 발명에서 용어 "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다.
상기 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 균주는 통상의 배지에서 생육 가능하며, 일 예로 뉴트리엔트 브로스(Nutrient broth) 배지에서 배양할 수 있다. 상기 배지는 특정 미생물을 배양하기 위하여 배양대상 즉 배양체가 되는 미생물이 필요로 하는 영양물질을 포함하는 것으로 특수한 목적을 위한 물질이 추가로 첨가되어 혼합된 것일 수 있다. 상기 배지는 배양기 또는 배양액이라고도 하며, 천연배지, 합성배지 또는 선택배지를 모두 포함하는 개념이다. 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 균주는 통상의 배양방법에 따라 배양할 수 있다.
배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.
또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 균주, 이의 배양균액 또는 배양상층액을 유효성분으로 포함하는 클로스트리듐 속(Clostridium sp.) 세균 또는 세균 독소의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 클로스트리듐 속 세균은 클로스트리듐 퍼푸린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile), 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 클로스트리듐 바이예링키아이(Clostridium beijerinckii), 클로스트리듐 사카로부틸리쿰(Clostridium saccharobutylicum), 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰(Clostridium saccharoperbutylacetonicum), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 클로스트리듐 부티리쿰(Clostridium butyricum), 클로스트리듐 부틸리쿰(Clostridium butylicum), 클로스트리듐 클루이베리(Clostridium kluyveri), 클로스트리듐 타이로부틸리쿰(Clostridium tyrobutylicum) 및 클로스트리듐 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum) 군으로부터 선택된 1종 이상이나, 바람직하게는 클로스트리듐 퍼푸린겐스, 클로스트리듐 디피실이고, 더욱 바람직하게는 클로스트리듐 퍼푸린겐스 타입 A, C형 및 클로스트리듐 디피실이다.
본 발명의 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 균주, 이의 배양균액 또는 배양상층액을 약학적 조성물로 사용할 경우, 상기 약학적 조성물은 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 균주, 이의 배양균액 또는 배양상층액을 단독으로 포함하거나, 상기 클로스트리듐 속 독소의 예방 또는 치료에 효과가 있는 물질을 유효성분으로 더 포함할 수 있고, 상기 유효성분 외에도 제형, 사용방법 및 사용목적에 따라 추가성분, 즉, 약제학적으로 허용되거나 영양학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 또는 부성분을 추가로 포함할 수 있다.
보다 상세하게는 상기 약학적 조성물은 상기 유효성분 외에 추가로 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다.
상기 담체, 부형제 및 희석제로는 통상의 것을 모두 사용 가능하고, 일 예로 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 칼슘카보네이트, 덱스트린, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀 및 생리식염수로 이루어진 군에서 선택된 1 이상 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 성분들은 유효성분 즉, 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 균주, 이의 배양균액 또는 배양상층액에 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체로는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 개체의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 균주, 이의 배양균액 또는 배양상층액의 일일 투여량은 0.01 내지 10000 ㎎/㎏이며, 바람직하게는 0.1 내지 10 ml/㎏이며, 더욱 바람직하게는 경구로 투여시는 1-10ml/kg, 비경구로 투여시는 0.1-2.0ml/㎏로서, 하루 1회 내지 3회에 나눠 투여하는 것이 바람직하다.
또한 본 발명은 상기 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 균주, 이의 배양균액 또는 배양상층액을 유효성분으로 포함하는, 클로스트리듐 속(Clostridium sp.) 세균 또는 세균 독소의 예방 또는 개선용 사료용 조성물을 제공한다.
상기 사료로는 돼지고기, 소고기 및 닭고기 등의 부산물을 비롯하여 옥수수, 쌀, 일반 볏짚, 야초, 목초, 앤시리지, 건초, 산야초 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 가축의 사육에 사용되는 사료이면 무방하다. 이러한 사료에 본 발명의 바실러스 서브티리스 GCB-13-001의 배양균액 또는 배양상층액을 배합하는 방법으로는 기계적 혼합, 흡착, 흡장 등의 방법이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 본 발명은 상기 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 균주, 이의 배양균액 또는 배양상층액을 유효성분으로 포함하는, 클로스트리듐 속(Clostridium sp.) 세균 또는 세균 독소의예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 균주, 이의 배양균액 또는 배양상층액을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 균주, 이의 배양균액 또는 배양상층액을 그대로 첨가하거나, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 혼합하여 사용되는 등 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 본 발명의 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 균주, 이의 배양균액 또는 배양상층액을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료, 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 식품 조성물이 음료로 제조될 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등의 추가 성분을 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물로는 포도당, 과당 등의 모노사카라이드; 말토오스, 수크로오스 등의 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린 등의 천연 감미제나 사카린, 아스파르탐 등의 합성 감미제 등이 사용될 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 본 발명의 식품 조성물 총 중량에 대하여 0.01~10중량%, 바람직하게는 0.1~0.1중량%로 포함되는 것이다.
상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 상기의 첨가제 비율은 크게 제한되지는 않으나, 본 발명의 식품 조성물 총 중량에 대하여 0.01~0.1중량% 범위내로 포함되는 것이 좋다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 균주의 분리, 선별 및 동정
실시예 1-1. 균주의 분리 및 선별
효소 활성 및 생성능이 우수한 균주를 분리 및 선별하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 다양한 효소를 생성하는 것으로 알려진 바실러스균 속 중 바실러스 서브티리스(Bacillus subtilis)를 분리하기 위하여, 상기 균이 많이 분포하고 있는 환경재료를 위주로 분리를 시도하였다. 녹십자 수의약품㈜의 실험동물사 주변의 흙, 실험동물 깔짚, 볏짚 등을 수거하여 잘게 마쇄하고 생리식염수에 1/10 량을 넣고 실온에서 하룻밤 진탕하여 상층액을 뉴트리엔트 브로스와 뉴트리엔트 아가 배지에 접종하고 37oC, 24-48시간 호기 배양하였다. 뉴트리엔트 브로스 배양물은 다시 뉴트리엔트 아가에 접종하여 증식한 집락의 형태별로 그람염색을 하여 그람 양성 간균을 1차 선별하고, API 키트(Biomerieux)를 이용하여 생화학적 성상을 확인한 결과, 카탈라아제(catalase) 양성, VP test 양성, 시트라아제(Citrate) 양성, 니트라아제(Nitrate) 양성, 인돌(Indol) 음성, 당(글루코스(Glucose), 아라비노즈(Arabinose), 자일로즈(Xylose), 만니톨(Mannitol)) 분해능 양성, 전분(카제인(Casein), 겔라틴(Gelatin), 전분(Starch)) 분해능 양성 등의 성상을 보인 바실러스 서브티리스로 추정되는 균을 분리하였다.
실시예 1-2. 바실러스 서브티리스 추정 균의 16S rDNA의 염기서열 분석
상기 실시예 1-1에서 선별한 바실러스 서브티리스 추정 균의 16S rDNA의 염기서열을 분석하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 상기 실시예 1-1에서 분리된 바실러스 서브티리스 추정균의 DNA를 분리한 후 16S rDNA의 염기서열 분석을 위하여 Bsub5F(5'-AAGTCGAGCGGACAGATGG-3', 서열번호 1) 및 Bsub3R(5'-CCAGTTTCCAATGACCCTCCCC-3', 서열번호 2)인 2개의 올리고 뉴클레오티드를 프라이머로 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)법을 실시하였으며, 이 과정은 95 ℃에서 0.5분간 열변성(denaturation), 65 ℃에서 2분간 결합(annealing), 72℃에서 2분간 신장(extention)하는 조건에서 효소적인 방법으로 상기 DNA를 증폭시켰다. 상기 증폭된 DNA는 순수 정제 후 염기서열을 분석하였다. EzTaxon을 이용한 표준 균주와의 염기서열 비교 분석결과, 바실러스 서브티리스와 가까운 근연관계를 가지고 있음을 확인할 수 있었고, 이를 "바실러스 서브티리스 GCB-13-001(Bacillus subtilis GCB-13-001)"로 명명하였다. 상기 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 균주는 2014년 05월 20일자로 대한민국 특허균주 기탁기관인 한국생명공학연구소 내 미생물자원센터에 기탁하여 기탁번호 KCTC 12595BP를 부여받았으며, 이의 16S rDNA의 염기서열은 서열번호 3으로 나타내었다. 또한, 상기 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 이외에도, 바실러스 서브티리스 추정균을 각 "바실러스 서브티리스 GCB-13-005" 및 "바실러스 서브티리스 GCB-13-006"으로 명명하였다.
실시예 2. 다양한 균주의 효소 활성 및 효소 생성능을 확인
상기 실시예 1에서 분리한 바실러스 서브티리스 GCB-13-001, 바실러스 서브티리스 GCB-13-005, 바실러스 서브티리스 GCB-13-006 및 다른 균주의 프로테아제(protease), 아밀라아제(amylase) 및 리파아제(lipase) 효소 활성 및 효소 생성능을 확인하고 우수한 효소 생성 균주를 선발하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 상기 실시예 1에서 분리한 바실러스 서브티리스 GCB-13-001, 바실러스 서브티리스 GCB-13-005, 바실러스 서브티리스 GCB-13-006 뿐만 아니라, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 바실러스 아미로리퀘파시엔스(B. amyloliquefaciens), 바실러스 리케니포미스(B. licheniformis), 바실러스 푸미루스(B. pumilus), 얄로비아 리포라이티카(Yarrowia lipolytica), 마크로코커스 카시오라이티쿠스(Macrococcus caseolyticus), 패니바실러스 키토노라이티쿠스(Paenibacillus chitonolyticus), 패니바실러스 알지노라이티쿠스(Paenibacillus alginolyticus) 및 패니바실러스아미로라이티쿠스(Paenibacillus amylolyticus)의 총 11 균을 실험에 이용하였다.
상기 균들을 뉴트리엔트 브로스(Nutrient broth)에 접종하고 37℃에서 24시간 배양하였다. 상기 배양이 끝난 각 균의 배양균액 또는 배양상층액을 원심분리(8000rpm, 20분)하여 수득한 상층액을 효소생성시험에 사용하였다. 상기 균들의 프로테아제, 아밀라아제, 리파아제 효소 생성능을 시험하기 위하여, 뉴트리엔트 아가배지에 상기 효소활성을 검사할 수 있는 기질로서, 프로테아제 검사용 기질은 1% 탈지분유를, 아밀라아제 검사용 기질은 1% 전분을, 리파아제 검사용 기질은 1% 난황액을 이용하였다. 상기 기질을 각 페트리디쉬(petri dishes)에 분주하여 응고시킨 후, 직경 2mm의 구멍(hole)을 만들어 세균 여과한 균 배양 상층액 20㎕를 넣고 37℃에서 24시간 반응시키고 기질이 분해되어 형성된 원의 직경을 측정하여 효소활성을 조사하였다.
또한, 각 균의 직접적인 효소생성능을 확인하기 위하여, 각 균의 배양균을 수집하고 멸균 인산완충액(PBS, pH 7.2)으로 3회 세척한 뒤, 균액 농도를 맥팔랜드스케일(MacFarland scale) 1.0으로 조정하였다. 그 후, 상기 균액 20㎕를 각 홀(hole)에 넣고 상기와 같은 방법으로 효소생성능을 조사하였다. 그 결과를 도 1 내지 3 및 하기 표 1에 나타내었다.
균 주 기질분해환 직경(mm)
Protease Amylase Lipase
1. Bacillus subtilis(GCB-13-006) 배양균액 22mm 12mm 17mm
2. Bacillus subtilis(GCB-13-006) 배양상층액 28 12 18
3. Bacillus subtilis(GCB-13-005) 배양균액 27 10 11
4. Bacillus subtilis(GCB-13-005) 배양상층액 22 11 10
5. Bacillus subtilis(GCB-13-001) 배양균액 30 14 11
6. Bacillus subtilis(GCB-13-001) 배양상층액 28 21 11
7. Bacillus amyloliquefaciens 배양균액 28 NT 10
8. Bacillus amyloliquefaciens 배양상층액 NT* 0 NT
9. Bacillus licheniformis 배양균액 19 0 0
10. Bacillus pumilus 배양균액 21 23 0
11. Yarrowia lipolytica 배양균액 26 0 0
12. Yarrowia lipolytica 배양상층액 19 10 10
13. Macrococcus caseolyticus 배양균액 10 0 0
14. Macrococcus caseolyticus 배양상층액 8 0 0
15. Paenibacillus chitonolyticus 배양균액 25 0 0
16.Paenibacillus chitonolyticus 배양상층액 23 0 0
17. Paenibacillus alginolyticus 배양균액 22 0 0
18.Paenibacillus alginolyticus 배양상층액 21 0 7
19. Paenibacillus amylolyticus 배양균액 27 0 0
20. Paenibacillus amylolyticus 배양상층액 16 0 0
21. 양성대조(chitinase, 20U/l) 34 36 NT
도 1 내지 3 및 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 총 11 균주 중 바실러스 서브티리스 GCB-13-001, GCB-13-005 및 GCB-13-006의 배양균액 및 배양상층액이 상기 3종 효소를 많이 생성하는 것으로 확인되었으며, 특히, 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 배양균액 및 배양상층액이 3종 효소를 가장 많이 생성하는 것으로 확인되었다.
실시예 3. 클로스트리듐 퍼푸린겐스 타입 A, C 및 클로스트리듐 디피실독소 중화능 확인
상기 실시예 1에서 효소 생성능이 우수한 3 균주의 바실러스 서브티리스(GCB-13-001, GCB-13-005, GCB-13-006), 바실러스 아미로리퀘파시엔스(B. amyloliquefaciens), 바실러스 스패리쿠스(B. sphaericus) 및 바실러스 윱첸긴스(B. yupchengins)의 배양상층액을 이용하여, 클로스트리듐 퍼푸린겐스 A, C형 및 클로스트리듐 디피실에 대한 독소 중화능을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 도 4에 나타낸 바와 같이, 정제한 C형 독소 10Lo와 상기 실시예 1에서 효소 생성능이 우수한 상기 균주의 10Lo 배양상층액을 혼합하여 실온(room temperature)에서 1시간 작용시킨 후, 체중 20g의 ICR 마우스 미정맥으로 0.2ml를 접종하였다. 또한, 정제한 클로스트리듐 퍼푸린겐스 A형 독소는 2Lo 독성의 독소와 상기 실시예 1에서 효소 생성능이 우수한 상기 균주의 2Lo 배양상층액을 혼합하여 실온에 1시간 작용시킨 후, 마우스 미정맥으로 0.5ml를 접종하였다. 또한, 클로스트리듐 디피실 정제 독소는 4MLD 독성의 독소와 상기 실시예 1에서 효소 생성능이 우수한 상기 균주의 4MLD 배양상층액을 혼합하여 실온에서 1시간 작용시킨 후, 마우스 미정맥으로 0.2ml를 접종하였다. 독소의 중화여부는, 클로스트리듐 퍼푸린겐스 C형은 24시간, 클로스트리듐 퍼푸린겐스 A형 및 클로스트리듐 디피실은 24시간 관찰한 후 마우스 폐사여부로 확인하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
균 배양상층액 독소중화능(%)
A형 독소
(2L0)		 C형 독소
(10Lo)		 클로스트리듐디피실
독소(4MLD)
1. Bacillus subtilis(GCB-13-006) 3/3(0) 0/3(100%) 1/3(66.6%)
2. Bacillus subtilis(GCB-13-005) 3/3(0) 3/3(0) NT
3. Bacillus subtilis(GCB-13-001) 0/3(100) 0/3(100) 1/3(66.6%)
4. Bacillus amyloliquefaciens NT* 0/3(100) 2/3(33.3%)
5. Bacillus sphaericus 3/3(0) 3/3(0) NT
6. Bacillus yupchengins 2/3(33.3) 1/3(66.6) NT
7. Control 3/3(0) 3/3(0) 3/3(0)
표 2에 나타낸 바와 같이, 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 배양상층액은 A형 독소(2L0) 및 C형 독소(10Lo)를 모두 중화하였고 클로스트리듐 디피실 독소는 66.6%의 중화능을 보여, 다른 균주를 접종했을 때 보다 마우스 생존율(66.6~100%)이 가장 높음을 확인하였다.
또한, 바실러스 아미로리퀘파시엔스 배양상층액은 시험한 C형 독소를 100%, 클로스트리듐 디피실 독소는 33.3% 중화하였고, 바실러스 서브티리스 GCB-13-006 배양상층액은 C형 독소는 100% 방어하였으나 A형 독소는 전혀 중화하지 못하였으며 클로스트리듐 디피실 독소는 66.6%의 중화능을 보였다. 바실러스 윱첸긴스 배양상층액은 A형 독소 33.3%와 C형 독소 66.6%의 중화능을 보인 반면, 바실러스 서브티리스 GCB-13-005와 바실러스 스패리쿠스 배양상층액은 두 독소 모두에 중화능을 나타내지 않는 등 균속, 균종, 균주별로 독소 중화능에 차이를 보임을 확인하였다.
실시예 4. 마우스에서 바실러스균 배양상층액의 클로스트리듐 퍼푸린겐스A형 독소 치료효과
클로스트리듐 퍼푸린겐스 A형 독소에 대한 상기 실시예 1에서 효소 생성능이 우수한 3 균주의 바실러스 서브티리스(GCB-13-001, GCB-13-005, GCB-13-006)의 배양상층액을 이용한 독소 치료 효과를 시험하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 체중 20g의 ICR 마우스에 클로스트리듐 퍼푸린겐스 A형 독소를 1L0와 2L0를 마우스 미정맥에 0.5ml 접종하고 30분후에 선발한 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 등의 배양상층액 0.5ml를 미정맥에 접종하고 48시간 관찰하면서 생존마우스 수를 조사하여 클로스트리듐 퍼푸린겐스 A형의 독소 치료효과를 조사하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
균 배양상층액 독소 농도별 치료효과(%)
1L0 2L0
1. B. subtilis(GCB-13-001) 0/3(100) 1/3(66.6)
2. B. subtilis(GCB-13-005) 2/3(33.3) 3/3(0)
3. B. subtilis(GCB-13-006) 0/3(100) 2/3(33.3)
4. Control 3/3(0) 3/3(0)
표 3에 나타낸 바와 같이, 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 배양상층액으로 치료한 마우스의 생존율이 가장 우수하여 2MLD 량의 독소접종 마우스는 100% 생존하였고 4MLD 량의 독소접종 마우스는 66.6%의 생존을 보였다. 바실러스 서브티리스 GCB-13-006을 배양상층액으로 치료한 마우스의 경우 2MLD 독소량을 접종 마우스는 100% 생존하였으나 4MLD 량의 독소를 접종한 마우스는 33.3%의 마우스만이 생존하였다. 바실러스 서브티리스 GCB-13-005 배양상층액으로 치료한 마우스의 생존율이 가장 낮아, 2MLD 량의 독소접종 마우스는 33.3%의 치료율을 보였으나 4MLD 독소량을 접종한 마우스에서는 치료효과를 볼 수 없었다.
실시예 5. 마우스에서 바실러스 서브트리스균 배양상층액의 클로스트리듐 퍼푸린겐스 C형 독소 치료효과
클로스트리듐 퍼푸린겐스 C형 독소에 대한 상기 실시예 1에서 효소 생성능이 우수한 3 균주의 바실러스 서브티리스(GCB-13-001, GCB-13-005, GCB-13-006)의 배양상층액을 이용한 독소 치료 효과를 시험하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 체중 20g의 ICR 마우스에 클로스트리듐 퍼푸린겐스 C형 독소를 4L0와 2L0를 마우스 미정맥에 0.2ml 접종하고 30분후에 선발한 바실러스균 배양상층액 0.2ml를 미정맥에 접종하고 24시간 관찰하면서 생존마우스 수를 조사하여 클로스트리듐 퍼푸린겐스 C형 독소 치료효과를 조사하였다. 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
균 배양상층액 독소 농도별 치료효과(%)
4L0 2L0
1. B. subtilis(GCB-13-001) 3/3(0) 0/3(100)
2. B. subtilis(GCB-13-005) 3/3(0) 1/3(66.6)
3. B. subtilis(GCB-13-006) 3/3(0) 2/3(33.3)
4. Control 3/3(0) 3/3(0)
표 4에 나타낸 바와 같이, 고농도(4L0)의 독소를 접종한 마우스의 경우, 3종균 배양상층액 모두에서 치료효과를 나타내지 않았으나, 저농도(2L0)의 독소를 접종한 마우스의 경우, 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 배양상층액으로 치료한 마우스의 생존율이 가장 우수하여 100% 생존하였고 바실러스 서브티리스 GCB-13-005 배양상층액으로 치료한 마우스는 생존율이 66.6% 였고, 바실러스 서브티리스 GCB-13-006 배양상층액으로 치료한 마우스의 생존율이 33.3%로 가장 낮음을 확인하였다.
실시예 6. 바실러스 서브티리스 배양균액의 클로스트리듐 퍼푸린겐스 A 및 C형 증식 억제 효과
클로스트리듐 퍼푸린겐스 A 및 C형에 대한 상기 실시예 1에서 효소 생성능이 우수한 3 균주의 바실러스 서브티리스(GCB-13-001, GCB-13-005, GCB-13-006)의 배양상층액을 이용한 증식 억제 효과를 시험하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 클로스트리듐 퍼푸린겐스 배양균액(2x108cfu/ml) 1ml와 각 바실러스 서브티리스 배양균액(1x108cfu/ml) 0.1ml를 혼합하여 cooked meat 배지 9ml에 접종하고 37℃, 24시간 배양하였다. 상기 배양물을 생리식염수로 10진 희석하여 희석배수별로 면양혈액한천평판배지에 0.1ML를 떨어뜨리고 멸균 초자봉으로 도말한 후, 37℃, 24시간 혐기 배양하고 클로스트리듐균 집락수와 용혈양상을 확인하였다. 그 결과를 하기 도 5 내지 7, 표 5에 나타내었다.
균 배양상층액 클로스트리듐 배양균 수(cfu/ml)
A 형 C 형
1. B. subtilis(GCB-13-001) 11 x104 3x102
2. B. subtilis(GCB-13-005) 29x104 34x102
3. B. subtilis(GCB-13-006) 23x104 22x103
4. Control 43x105 12x104
표 5에 나타낸 바와 같이, 바실러스균 서브티리스 배양균액을 첨가 배양한 클로스트리듐 퍼푸린겐스 A형 균의 수는 대조군(43x105)에 비하여 전반적으로 적었으며, 바실러스 서브티리스 GCB-13-001을 첨가 배양한 것이 클로스트리듐 퍼푸린겐스 A형 균의 수가 가장 적음을 확인하였다(11x104). 클로스트리듐 퍼푸린겐스 C형 균의 경우도 대조군(12x104)에 비하여 전반적으로 적었으며, 바실러스 서브티리스 GCB-13-001을 첨가 배양한 것이 클로스트리듐 퍼푸린겐스 C형 균의 수가 가장 적음을 확인하였다(3x102).
또한, 도 5 내지 7에 나타낸 바와 같이, 클로스트리듐 퍼푸린겐스 A, C형및 바실러스 서브티리스 GCB-13-001 배양균액과 혼합처리한 것은, 상기 배양균액을 혼합처리 하지 않은 대조군; 및 다른 바실러스 서브티리스 GCB-13-005 및 GCB-13-005 균주를 혼합한 것보다 클로스트리듐 퍼푸린겐스 A 및 C의 집락수 및 용혈 정도가 효과적으로 감소하는 것을 확인하였다.
이하 본 발명의 약학적 조성물, 사료용 조성물 및 식품 조성물의 제제예를 설명하나, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 약학적 조성물의 제조
1-1. 산제의 제조
바실러스 서브티리스 GCB-13-001의 배양균액 또는 배양상층액
20 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
1-2. 정제의 제조
바실러스 서브티리스 GCB-13-001의 배양균액 또는 배양상층액
10 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
1-3. 캡슐제의 제조
바실러스 서브티리스 GCB-13-001의 배양균액 또는 배양상층액
10 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
1-4. 주사제의 제조
바실러스 서브티리스 GCB-13-001의 배양균액 또는 배양상층액
10 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO42H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
1-5. 액제의 제조
바실러스 서브티리스 GCB-13-001의 배양균액 또는 배양상층액
20 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 2. 사료용 조성물의 제조
바실러스 서브티리스 GCB-13-001의 배양균액 또는 배양상층액
0.1 ~ 20% 중량부
지방분해효소(Lipase) 0.001 ~ 0.01% 중량부
제 3 인산칼슘 1 ~ 20% 중량부
비타민 E 0.01 ~ 0.1% 중량부
효소 분말 1 ~ 10% 중량부
포도당 20 ~ 90% 중량부
바실러스 서브티리스 GCB-13-001의 배양균액 또는 배양상층액을 포도당과 혼합하여 중량을 맞추고 여기에 기타 조성물인 지방분해효소, 제3인산칼슘, 비타민 E 및 효소 분말을 상기와 같은 조성으로 넣는다. 그 후, 전체 중량이 100%가 되도록 포도당을 섞은 후, 믹서기를 이용하여 충분히 혼합을 한다.
제제예 3. 식품 조성물의 제조
3-1. 건강 식품 제조
바실러스 서브티리스 GCB-13-001의 배양균액 또는 배양상층액 100㎎, 비타민 혼합물 적량, 비타민 A 아세테이트 70g, 비타민 E 1.0㎎, 비타민 B1 0.13㎎, 비타민 B2 0.15㎎, 비타민 B6 0.5㎎, 비타민 B12 0.2g, 비타민 C 10㎎, 비오틴 10g, 니코틴산아미드 1.7㎎, 엽산 50g, 판토텐산 칼슘 0.5㎎, 무기질 혼합물 적량, 황산제1철 1.75㎎, 산화아연 0.82㎎, 탄산마그네슘 25.3㎎, 제1인산칼륨 15㎎, 제2인산칼슘 55㎎, 구연산칼륨 90㎎, 탄산칼슘 100㎎ 및 염화마그네슘 24.8㎎을 혼합한 다음, 과립을 제조하고 통상의 방법에 따라 건강식품을 제조하였다. 이때, 상기 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
3-2. 건강 음료 제조
통상의 건강음료 제조방법에 따라 바실러스 서브티리스 GCB-13-001의 배양균액 또는 배양상층액 100㎎, 비타민 C 15g, 비타민 E(분말) 100g, 젖산철 19.75g, 산화아연 3.5g, 니코틴산아미드 3.5g, 비타민 A 0.2g, 비타민 B1 0.25g, 비타민 B2 0.3g 및 정량의 물을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85?에서 교반 가열한 후 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관하여 건강음료를 제조하였다. 이때, 상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
한국생명공학연구원 생물자원센터 KCTC12595BP 20140520
<110> GREEN CORSS VETERINARY PORDUCTS CO., LTD <120> Composition comprising novel bacillus subtilis GCB-13-001 having enzymatic profile for treating or preventing Clostridium sp. bacterial toxin <130> 1-12 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bsub5F forward primer <400> 1 aagtcgagcg gacagatgg 19 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bsub3R reverse primer <400> 2 ccagtttcca atgaccctcc cc 22 <210> 3 <211> 438 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S rDNA sequence of Bacillus subtilis GCB-13-001 <400> 3 cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta 60 ccaggtcttg acatcctctg acaatcctag agataggacg tccccttcgg gggcagagtg 120 acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac 180 gagcgcaacc cttgatctta gttgccagca ttcagttggg cactctaagg tgactgccgg 240 tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gacctgggct 300 acacacgtgc tacaatgggc agaacaaagg gcagcgaaac cgcgaggtta agccaatccc 360 acaaatctgt tctcagttcg gatcgcagtc tgcaactcga ctgcgtgaag ctggaatcgc 420 tagtaatcgc ggatcaca 438

Claims (8)

  1. 바실러스 서브티리스 GCB-13-001(Bacillus subtilis GCB-13-001)(기탁번호: KCTC 12595BP) 균주, 상기 균주의 배양균액 또는 배양상층액을 유효성분으로 포함하는, 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile), 클로스트리듐 퍼푸린겐스(Clostridium perfringens) A형 및 클로스트리듐 퍼푸린겐스 C형으로 이루어진 1종 이상의 세균; 또는 상기 세균 독소로 인한 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 프로테아제(protease), 아밀라아제(amylase) 및 리파아제(lipase) 효소 생성능을 갖는 것을 특징으로 하는, 클로스트리듐 디피실, 클로스트리듐 퍼푸린겐스 A형 및 클로스트리듐 퍼푸린겐스 C형으로 이루어진 1종 이상의 세균; 또는 상기 세균 독소로 인한 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 바실러스 서브티리스 GCB-13-001(Bacillus subtilis GCB-13-001)(기탁번호: KCTC 12595BP) 균주, 상기 균주의 배양균액 또는 배양상층액을 유효성분으로 포함하는, 클로스트리듐 디피실, 클로스트리듐 퍼푸린겐스 A형 및 클로스트리듐 퍼푸린겐스 C형으로 이루어진 1종 이상의 세균; 또는 상기 세균 독소로 인한 감염증의 예방 또는 개선용 사료용 조성물.
  8. 바실러스 서브티리스 GCB-13-001(Bacillus subtilis GCB-13-001)(기탁번호: KCTC 12595BP) 균주, 상기 균주의 배양균액 또는 배양상층액을 유효성분으로 포함하는, 클로스트리듐 디피실, 클로스트리듐 퍼푸린겐스 A형 및 클로스트리듐 퍼푸린겐스 C형으로 이루어진 1종 이상의 세균; 또는 상기 세균 독소로 인한 감염증의 예방 또는 개선용 식품 조성물.

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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11285378A (ja) * 1997-12-01 1999-10-19 Eisai Co Ltd 抗菌作用を有する新規枯草菌
US7218827B2 (en) 2004-06-18 2007-05-15 Adc Telecommunications, Inc. Multi-position fiber optic connector holder and method
KR101081334B1 (ko) 2008-02-27 2011-11-08 전남대학교산학협력단 바실러스 서브틸리스를 이용한 인간 ＢＭＰｓ 단백질의 생산 방법
KR101647143B1 (ko) 2009-09-22 2016-08-10 지에스칼텍스 주식회사 클로스트리듐 속 미생물 유전자를 불활성화시키는 방법
KR101108472B1 (ko) 2009-10-13 2012-01-31 주식회사 제일바이오 바실러스 서브틸리스 ｃｂｓ 및 이를 포함하는 생균제
KR101156161B1 (ko) * 2010-04-29 2012-06-27 대한민국 메밀 속성장으로부터 유래된 저영양성 바실러스 서브틸리스 에이치제이18-4 균주 및 이를 이용한 발효식품의 제조방법
KR101370942B1 (ko) * 2012-04-05 2014-03-12 씨제이제일제당 (주) 신규 바실러스 서브틸리스

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101370941B1 (ko) 2012-04-05 2014-03-12 씨제이제일제당 (주) 신규 바실러스 서브틸리스

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