KR101081334B1 - 바실러스 서브틸리스를 이용한 인간 ＢＭＰｓ 단백질의 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 이용한 인간 ＢＭＰs 단백질의 생산 방법으로 보다 상세하게는 인간 골형성 유도 단백질(rhBMPs)-2, 인간 골형성 유도 단백질(rhBMPs)-4, 인간 골형성 유도 단백질(rhBMPs)-7을 암호화하는 염기서열을 갖는 유전자를 포함하는 발현벡터를 이용하여 재조합된 사람의 골형성단백질을 바실러스 서브틸리스를 숙주로 이용하여 제조하는 방법을 제공하기 위한 것으로, 본 발명의 바실러스 서브틸리스를 기반으로 하는 rhBMPs 대량 생산 시스템은 안정적이고는 다른 미생물과 비교해서 단백질 분비능이 높으며, 배양시 저비용이 소요되어 골, 치골, 연골 등의 손상 및 상처 치료뿐만 아니라 이들을 유효성분으로 하는 보조치료제의 개발에 널리 이용할 수 있을 것이다.

바실러스 서브틸리스, 골형성 유도 단백질, 발현벡터

Description

바실러스 서브틸리스를 이용한 인간 ＢＭＰｓ 단백질의 생산 방법{Production method of Human BMPs by using Bacillus subtilis}

본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 이용한 인간 ＢＭＰs 단백질의 생산 방법으로 보다 상세하게는 인간 골형성 유도 단백질(rhBMPs)-2, 인간 골형성 유도 단백질(rhBMPs)-4, 인간 골형성 유도 단백질(rhBMPs)-7을 암호화하는 염기서열을 갖는 유전자를 포함하는 발현벡터를 이용하여 재조합된 사람의 골형성단백질을 바실러스 서브틸리스를 숙주로 이용하여 제조하는 방법에 관한 것이다.

골형성단백질(Bone Morphogenetic Proteins, BMPs)은 1965년 Urist가 발견하였으며, 골과 연골의 형성과 재생을 유도하는 강력한 조절인자로, 전환 성장인자 베타(Transforming growth factor-β, TGF-β) super family에 속한 펩타이드 성장인자이다. 현재까지 BMP는 20종류가 규명되었으며, BMP 중 BMP-2, -3, -4, -6, -7의 타입들은 골형성에 관여하는 것으로 보고되었다. 그 중에서, 포유류세포(CHO cell)로부터 재조합 DNA기술로 얻어지는 rhBMP-2 및 -7는 골 유도능이 가장 우수하다고 보고되었으며, 이를 이용하여 많은 연구가 이루어졌으며, 현재까지 주로 BMP-2 및 -7이 생산되어 연구 재료로 사용되고 있다.

그러나 기존의 포유류 세포에서 재조합 인간 골형성 유도단백질(rhBMP) 생산 방법은 배양액이 고가이며, 낮은 농도의 배지에서 골형성단백질의 분리, 농축을 위해 대규모의 분리 정제시설과 장비가 필요하여, 골형성단백질 생산에 고비용 소요될 뿐만 아니라, 대장균을 기반한 rhBMP 생산은 상대적으로 저비용이 소요되지만 낮은 단백질 발현율, 봉입체(inclusion bodies) 형성, 안정성 등이 문제가 되었다.

또한, 바실러스 속 균주를 이용할 경우, 외래 단백질의 생산수율이 낮을 뿐만 아니라, 생산된 외래 단백질의 안정성이 저하되는 현상이 빈번하게 관찰되고 있는 바, 이러한 현상의 주요원인은 바실러스 속 균주 자체에서 분비되는 단백질가수분해효소에 의한 외래 단백질의 분해이다. 예를 들어, 혈전용해제로 알려진 스타필로키나제의 경우, 자연계에서 포도상구균(Staphylococcus aureus)에서 극히 적은 양으로 생산되고 있으므로, 이를 바실러스 속 균주에서 대량으로 생산하려는 시도가 있었으나(참조: Behnke, D., and D. Gerlach., Mol. Gen. Genet., 210:528-534(1987); Schlott, B., et al., Bio/Technology., 12:185-189(1994); Lee, S. J. et al., Biotechnol. Lett., 20:113-116(1998)), 전기 균주의 단백질가수분해효소의 활성으로 인하여, 낮은 생산수율을 보였음은 물론, 생산된 스타필로키나제의 안정성이 저하됨이 알려졌다.

그러나 바실러스 속 균주(Bacillus sp.)는 인간에게 질병을 유발시키지 않으면서도, 단백질 분비기구가 잘 발달되어 있고, 전체 유전자 염기서열이 알려져 있는 등의 여러가지 장점을 가지고 있다. 또한, 그가 가지고 있는 내재성 분비신호 서열로 인하여, 매우 중요한 외래 단백질의 생산균주로 알려져 있어, 다른 미생물 과 달리 매우 활발히 연구가 진행되어 왔다.

본 발명은 상기 rhBMP 생산의 고비용(포유류세포 시스템), 안정성(대장균 시스템) 문제를 개선하고자, 바실러스 서브틸리스를 기반으로 하는 rhBMPd 대량 생산 시스템이 안정적이고 연속적으로 재조합 골형성 단백질 생산을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 다른 미생물과 비교해서 단백질 분비능이 높으며, 배양시 저비용이 소요되며, 안정성이 입증된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 숙주로 이용하여 안정적이고 연속적으로 인간 ＢＭＰs 단백질의 생산 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 인간 골형성 유도 단백질(rhBMPs)-2, 인간 골형성 유도 단백질(rhBMPs)-4, 인간 골형성 유도 단백질(rhBMPs)-7를 암호화하는 염기서열을 갖는 유전자 및 이를 포함하는 발현벡터를 제공한다.

본 발명은

1) 사람의 골형성단백질(human bone morphogenetic protein)을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제조하고;

2) 단계 1)의 재조합 폴리뉴클레오티드를 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 세포 발현용 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하고;

3) 단계 2)의 재조합 벡터로 바실러스 서브틸리스 세포를 형질전환하여 형질전환 바실러스 서브틸리스 세포를 얻고;

4) 단계 3)의 형질전환 바실러스 서브틸리스 세포로부터 사람의 골형성단백질을 생산 후 수득하는:

단계를 포함하는, 재조합된 사람의 골형성단백질의 생산방법.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 사람의 골형성단백질(human bone morphogenetic protein)을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제조한다. 상기 골형성 단백질은 rhBMPs-2, rhBMPs-4, rhBMPs-7인 것으로, 구체적인 예로 rhBMP-2는 인간 BMP2의 아미노산 서열 283에서 396까지 포합되는 DNA의 염기서열을 이용하여 제조하고, rhBMPs-4는 인간 BMP4의 아미노산 서열 293에서 408까지 포함되는 염기서열을 이용하며, rhBMP-7은 인간 BMP7의 아미노산 서열 293에서 431까지 포합되는 DNA의 염기서열을 이용하여 제조하였다.

상기 제조된 염기서열은 클로닝 벡터 또는 발현 벡터에 클로닝 한다. 상기 클로닝 벡터인 pGEMT-easy 을 이용하여 염기서열 분석을 수행하였으며, 상기 골형성단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 재조합 rhBMPs로 명명하였으며, 염기서열 분석 결과는 도 1을 참조한다.

상기 제조된 rhBMPs 단백질의 발현을 위하여 바실러스 발현 벡터인 pLip 벡터에 클로닝을 하였다. 구체적인 예로서는 pLip의 다중 클로닝 위치(multiple cloning site, MCS)에 적합한 제한효소인 KpnI(rhBMP-4, rhBMP-7), ECoRI(rhBMP-2), XhaI(rhBMP-2, rhBMP-4, rhBMP-7)들을 이용하여 pGEMT-easy 벡터에서 rhBMP-2, rhBMP-4, rhBMP-7을 한천 겔에서 겔 정제 키트(Qiagen)를 이용하여 DNA를 분리, 정제하여 각각의 rhBMPs DNA를 수득한다. 상기와 같은 제한효소로 pLip 벡터를 절단하여 한천 겔에서 겔 정제 키트(Qiagen)를 이용하여 DNA를 분리 정제한 후 제한효소로 절단되어 분리-정제된 rhBMPs와 pLip의 DNA T4 합성효소를 이용하여 16℃에 30시간 동안 반응하여 접합하였다. 상기 접합된 pLip-rhBMPs DNA을 대장균인 DH5a에 열충격 방식으로 형질 전환한 후, 형질 전환된 pLip-rhBMPs 대장균(DH5a)을 선별하였으며 pLip-rhBMPs가 형질 전환된 대장균(DH5a)에서 pLip-rhBMPs의 DNA 소량분리 키트(Qiagen)를 사용하여, DNA를 획득하였고, 이를 바실러스 서브틸리스에 형질 전환용 DNA로 이용하였다. 도 3을 참조한다.

상기 분리한 pLip-rhBMPs DNA를 전기형질전환 방법으로 바실러스 서브틸리스에 유전자 도입한 후 얻어진 재조합 인간 골형성 유도 단백질(rhBMPs)-2, 인간 골형성 유도 단백질(rhBMPs)-4, 인간 골형성 유도 단백질(rhBMPs)-7의 유전자가 형질 전환된 바실러스 서브틸리스를 선별하고, 선별된 형질전환 바실러스 서브틸리스를 경기도 수원시 권선구 서둔동 88-20 농업유전자원센터에 소재하는 국제기탁기관인 농업유전자원센터에 2009년 1월 21일자로 수탁하여 수탁번호 KACC 91435P를 부여받았다.

본 발명에 따른 형질전환 바실러스는 pH 5.5 내지 8 범위에서 성장이 증가 및 골형성단백질의 생산량이 증가하며 바람직하게는 pH 6에서 가장 생산량이 많았다. 구체적인 예로, 초기 pH에 따른 형질 전환된 바실러스 서브틸러스 성장 특성과 골형성단백질의 생산량을 확인하기 위하여 초기 pH가 5.5 내지 8범위의 배양액을 제조한 후 200rpm, 30℃에서 배양하면서 배양 0, 15, 21, 24, 28, 32, 36시간일 때 샘플을 채취한 후 흡광도, pH 및 배지내의 골형성 단백질의 생산량을 측정하였다. 그 결과 600nm에서 흡광도를 측정한 결과 배양 0 내지 18시간까지는 급격하게 증가하다가 감소하는 것을 알 수 있었다. pH측정기로 pH를 측정해본 결과 초기 pH가 pH 5.5와 pH 6 일때는 배양 0 내지 28시간까지 pH값이 증가하다가 감소하는 것을 볼 수 있고, pH 7과 pH 8일때는 0 내지 18시간까지는 pH값이 감소하다가 그 뒤로는 증가하는 것을 알 수 있었다. 그리고 배지내의 골형성단백질의 생산량은 초기 pH 6에서 약 53.4 pg/mL로 가장 많이 생산되었다. 도 5를 참조한다.

본 발명에 따른 형질전환 바실러스는 배양온도 28 내지 37℃에서 성장이 증가 및 골형성단백질의 생산량이 증가하며, 온도가 28℃ 이하 또는 37℃를 초과되는 경우에는 바실러스의 성장이 저해되었으며 바람직하게는 30℃에서 가장 생산량이 많았다. 구체적인 예로 배양온도에 따른 형질 전환된 바실러스 서브틸러스의 성장 특성과 골형성단백질의 생산량을 조사하기 위하여 30℃와 37℃에서 36시간동안 배양하였다. 본 배양은 pH 7로 맞추어 200rpm, 30℃ 와 200rpm, 37℃에서 배양하면서 0, 15, 21, 24, 28, 32, 36시간별로 흡광도를 측정하였고, 배지 내 골형성단백질의 생산량을 측정하였다. 그 결과 0 내지 13시간까지는 급격하게 증가하다가 그 후로는 서서히 증가하는 경향을 보였다. 그리고 배지 내 골형성단백질의 생산은 30℃에서는 배양 15시간에 최대 생산량(약 41.8 pg/mL)을 나타내었으며, 37℃에서는 배양 18시간부터 생산량이 점차 증가하다가 배양 36시간에 최대 생산량(약 37.5pg/mL)을 나타내었다. 도 6을 참조한다.

본 발명에 따른 형질전환 바실러스는 탄소원이 글루코스(glucose), 말토즈(maltose), 슈크로오스(sucrose), 콘 스팁 리커(corn steep liquor, CSL), 전분(starch) 및 락토즈(lactose)로부터 선택되는 1종 이상의 탄소원으로 바람직하게는 락토스(Lactose)가 첨가된 배지이다. 구체적인 예로서, 형질전환 바실러스 서브 틸리스에서 탄소원이 균주 성장과 골형성 유도 단백질의 생산에 미치는 영향을 조사하기 위하여 글루코스(glucose), 말토즈(maltose), 슈크로오스(sucrose), 콘 스팁 리커(corn steep liquor, CSL), 전분(starch)과 락토즈(lactose) 등을 항생제를 포함하는 LB배지에 최종 농도가 5g/L가 되도록 제조한 후, 활성화 시킨 전배양액 1%를 접종하여 200rpm, 30℃에서 배양하면서 4시간 간격으로 샘플의 흡광도, pH 및 배지 내 골형성단백질의 생산량을 측정한 결과, 배지 내 골형성단백질의 생산은 락토즈(lactose)를 첨가한 경우 32시간에서 약 343.5pg/mL로 가장 많이 생산되었다. 도 7을 참조한다.

본 발명에 따른 사람의 골형성단백질의 생산방법 즉, 락토스(Lactose), 효모 추출물(Yeast extract), 트립톤(Tryptone), 염화나트륨(NaCl)이 첨가된 배지에서 30℃, 32시간 동안 배양한 바실러스 서브틸리스 배양액으로부터 안정적이고 연속적으로 rhBMPs 대량 생산 시스템을 구축할 수 있었다.

본 발명의 인간 골형성 유도 단백질(rhBMPs)-2, 인간 골형성 유도 단백질(rhBMPs)-4, 인간 골형성 유도 단백질(rhBMPs)-7를 암호화하는 염기서열을 갖는 유전자 및 이를 포함하는 발현벡터를 이용하여 재조합된 사람의 골형성단백질은 기존 생산 시스템에 비해 안정성을 확보하고 생산 비용 저감효과를 기대할 수 있다.

본 발명의 바실러스 서브틸리스를 기반으로 하는 rhBMPs 대량 생산 시스템은 안정적이고는 다른 미생물과 비교해서 단백질 분비능이 높으며, 안전성의 확보로 골, 치골, 연골 등의 손상 및 상처 치료뿐만 아니라 이들을 유효성분으로 하는 보 조치료제의 개발에 널리 이용할 수 있어 의료산업의 고도화 및 첨단 의료기기 발전에 큰 기여를 할 것이다.

이하, 본 발명을 구체적인 실시 예에 의해 보다 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 아이디어와 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에 종사하는 업자에게는 명백한 것이다.

이 때, 사용되는 기술용어 및 과학용어에 있어 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미를 지닌다.

또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.

[제조예 1] 재조합 BMPs의 제조

인간 골육종 세포주인 U-2 OS(American Type Culture Collection, MD, USA; ATCC 68182)에서 Tri-Reagent을 이용하여 RNA를 분리하고, SuperScriptTM II RNase H-Reverse transcriptase(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 RNA에서 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA을 이용하여 각각의 재조합 rhBMPs을 제조하기 위해서 이에 적합한 올리고머를 제조하였다. rhBMP-2는 인간 BMP2의 아미노산 서열 283에서 396까지 포함되는 DNA의 염기서열을 이용하여 제조하였고, rhBMP-4는 인간 BMP4의 아미노산 서열 293에서 408까지 포합되는 DNA의 염기서열을 이용하여 제조하였으 며, rhBMP-7는 인간 BMP7의 아미노산 서열 293에서 431까지 포함되는 DNA의 염기서열을 이용하여 하기 표 1의 프라이머를 제조하였다. 이들 프라이머를 이용하여 합성된 cDNA를 주형으로 하여 PCR(중합효소연쇄반응) 실험을 수행하였다.

중합효소연쇄반응 실험 조건으로 95 ℃ 30초, 60 ℃ 30초, 72 ℃ 30초를 35회 반복 수행하였다. PCR(중합효소연쇄반응)에서 얻어진 rhBMP-2, -7의 생성물을 한천 겔에서 Gel extraction kit(Qiagen)을 이용하여 분리 정제하였다. 분리 정제된 rhBMP-2, -7의 DNA와 pGEMT-easy vector DNA를 3:1(75ng:25ng) 비율로 T4 합성효소(ligase)를 이용하여 4℃에 30시간 동안 반응하여 접합하였다. 접합된 pGEMT-rhBMPs를 대장균인 DH5a에 열충격 방식으로 형질 전환하여, LB에 암피실린(50ug/ml)이 첨가된 고체배지에 도말하여 형질 전환된 pGEMT-rhBMPs 대장균(DH5a)들을 선별하였다. 선별된 pGEMT-rhBMPs이 형질 전환된 대장균(DH5a)에서 pGEMT-rhBMPs의 DNA miniprep-Kit(Qiagen)를 사용하여, DNA를 획득하였고, 이를 이용하여 염기서열 분석을 수행하였으며, 이를 재조합 rhBMPs로 명명하였다.

[제조예 2]: 바실러스 발현 pLip-BMPs의 제조

제조예 1에서 획득된 rhBMPs를 바실러스 서브틸리스에서 단백질 발현을 위해서 바실러스 서브틸리스 단백질 발현 벡터인 pLip DNA vector(Bioleaders crop)에 rhBMPs를 클로닝하였다. 바실러스 서브틸리스에서 단백질 발현 벡터인 pLip의 다중 클로닝 위치(multiple cloning site, MCS)에 적합한 제한 효소인 KpnI(rhBMP-4, rhBMP-7)와 ECoRI(rhBMP-2), XhaI(rhBMP-4, rhBMP-2, -7)들을 이용하여 pGEMT-easy 벡터에서 rhBMP-2, rhBMP-4, rhBMP-7을 한천 겔에서 겔 정제 키트(Qiagen)을 이용하여 DNA을 분리한 후, 정제하였고, 각각의 rhBMPs DNA에 똑같은 제한 효소로 절단된 pLip(ECoRI/XhaI-rhBMP-2, KpnI/XhaI-rhBMP-4, KpnI/XhaI-rhBMP-7) 벡터를 한천 겔에서 겔 정제 키트(Qiagen)를 이용하여 DNA를 분리 정제하였다. 제한효소로 절단된 분리-정제된 rhBMPs와 pLip의 DNA를 3:1(75ng:25ng) 비율로 T4 합성효소(ligase)를 이용하여 16℃에 30시간 동안 반응하여 접합하였다. 접합된 pLip-rhBMPs DNA을 대장균인 DH5a에 열충격 방식으로 형질 전환하여, LB에 암피실린(50ug/ml)이 첨가된 다량의 고체배지에 도말하여 형질 전환된 pLip-rhBMPs 대장균(DH5a)을 선별하였다. 선별된 pLip-rhBMPs이 형질 전환된 대장균(DH5a)에서 pLip-rhBMPs의 DNA 소량분리 키트(Qiagen)를 사용하여, DNA를 획득하였고, 이를 바실러스에 형질 전환용 DNA로 이용하였다.

[제조예 3] rhBMPs의 단백질 발현되는 바실러스의 제조

rhBMPs의 단백질 발현되는 바실러스의 제조하기 위해서는 제조예 2에서 획득된 pLip-rhBMPs 들의 DNA로 사용하고, 형질 전환용 바실러스를 제조를 위해서 Ito And Nagane(Ito M, Nagane M. 2001. Biosci Biotechnol Biochem. 65:2773-2775)의 방법에 따라 일렉트로 바실러스 서브틸리스(Electrocompetent Bacillus subtilis) 에 제조하였다. pLip-rhBMPs의 DNA를 2ug을 형질전환용 일렉트로 바실러스 서브틸리스(Electrocompetent Bacillus subtilis) 100ul에 첨가하고 Gene-Pulser cuvette에 옮기고, Gene-Pulser(Bio-Rad)를 이용하여 형질 전환하였다. LB에 카나마이신(50ug/ml)이 첨가된 다량의 고체배지에 도말하여 형질 전환된 pLip-rhBMPs 바실러스(B. subtilis)를 선별하였다. 선별된 pLip-rhBMPs이 형질 전환된 바실러스(B. subtilis)를 초음파로 파쇄한 후 형질 전환된 pLip-rhBMPs의 DNA를 miniprep-Kit(Qiagen)를 사용하여, 획득하였고, 이를 주형 DNA로 이용하여 제조 예1의 표1에 제시된 프라이머들을 이용하여 PCR(중합효소연쇄반응)을 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 30초를 35회 반복 수행하여 얻어진 생성물을 0.8% 한천 겔에 전기 영동하여 pLip-rhBMPs가 바실러스 서브틸리스에 형질전환됨을 확인하였으며, 형질전환된 바실러스 서브틸리스를 경기도 수원시 권선구 서둔동 88-20 농업유전자원센터에 소재하는 국제기탁기관인 농업유전자원센터에 2009년 1월 21일자로 수탁하여 수탁번호 KACC 91435P를 부여받았다.

[실시예 1] 형질전환된 바실러스 서브틸러스의 배지조건에 따른 골형성단백질 생산

배지 조건에 따른 형질 전환된 바실러스 서브틸러스의 골형성단백질의 생산성을 확인하기 위하여 하기 표 2와 같이 바실러스용 배지, 바실러스용 배지에 글루코스(9g/L)를 첨가한 것, LB 배지, MS8 배지 등을 제조하였다. 형질 전환된 바실러스 서브틸러스의 균주를 활성화하기 위해 시험관 2개를 준비하고 LB+카나마이신 배지 5mL를 분주하였다. 저장해 두었던 형질 전환된 바실러스 서브틸러스의 단일 콜 로니를 접종하여 30℃, 200rpm으로 12시간 배양하였다. 본 배양은 플라스크 4개를 준비한 후 네 종류의 배양액(카나마이신 50ug/mL을 함유)을 플라스크에 각각 100ml씩 넣은 후 활성화 시킨 전배양액 1%를 접종한 후 200rpm, 30℃에서 배양하면서 4시간 간격으로 샘플을 채취한 후 분광광도계를 이용하여 600nm에서 흡광도를 측정하였고, ELISA를 이용하여 골형성단백질의 생산량을 측정하였다.

형질 전환된 바실러스를 바실러스용 배지, 바실러스용 배지+글루코스 9(g/L)첨가, LB 배지, MS8 배지에 200 rpm, 30℃의 조건에서 32시간 동안 배양하였다. 분광광도계를 이용하여 600 nm에서 흡광도를 측정한 결과 10 내지 24시간 사이에 증 가했다가 24시간 이후로는 급격히 감소하고 다시 증가한다는 것을 볼 수 있었다. 하지만 MS8 배지에서는 균주가 거의 성장하지 않았다(도4 a). ELISA 방법으로 분석한 배지내의 골형성단백질의 생산은 LB 배지에서만 생산되었으며, 이는 글루코스가 BMP7의 생산을 저해하는 것으로 판단된다(도4 b).

[실시예 2] 형질전환된 바실러스 서브틸러스의 pH조건에 따른 골형성단백질 생산

초기 pH에 따른 형질 전환된 바실러스 서브틸러스 성장 특성과 골형성단백질의 생산량을 확인하기위하여 초기 pH가 5.5 내지 8범위의 배양액을 제조하였다. 본배양은 플라스크 4개를 준비한 후 LB배지(kanamycin 50ug/mL을 함유)를 100 ml씩 넣고 5 N의 NaOH와 1N의 HCl을 사용하여 플라스크 각각을 pH 5.5, pH 6, pH 7, pH 8로 만든다. 그리고 활성화 시킨 전배양액 1%를 접종한다. 200rpm, 30℃에서 배양하면서 배양 0, 15, 21, 24, 28, 32, 36시간일 때 샘플을 채취한 후 분광광도계를 이용하여 600nm에서 흡광도를 측정하였고, pH측정기를 이용하여 pH를 측정하였으며 ELISA를 이용하여 배지내의 골형성 단백질의 생산량을 측정하였다. 초기 pH가 pH 5.5, pH 6, pH 7, pH 8인 LB 배지에서 200rpm, 30℃의 조건으로 36시간 동안 배양하였다. 600nm에서 흡광도를 측정한 결과 배양 0 내지 18시간까지는 급격하게 증가하다가 감소하는 것을 알 수 있었다(도5 a). pH측정기로 pH를 측정해본 결과 초기 pH가 pH 5.5와 pH 6일때는 배양 0 내지 28시간까지 pH 값이 증가하다가 감소하는 것을 볼 수 있고, pH 7과 pH 8일때는 0 내지 18시간까지는 pH 값이 감소하다가 그 뒤로는 증가하는 것을 알 수 있었다(도5 b). 그리고 배지내의 골형성단백질의 생산량은 초기 pH 6에서 약 53.4 pg/mL로 가장 많이 생산되었다(도5 c).

[실시예 3] 형질전환된 바실러스 서브틸러스의 온도에 따른 골형성단백질 생산

배양온도에 따른 형질 전환된 바실러스 서브틸러스의 성장 특성과 골형성단백질의 생산량을 조사하기위하여 30℃ 및 37℃에서 36시간동안 배양하였다. 본 배양은 플라스크 2개를 준비한 후 LB배지를 각각 100ml씩 넣고 PH는 5N의 NaOH와 1N의 HCl을 사용하여 pH 7로 맞추었다. 그리고 활성화 시킨 전배양액 1%를 접종한다. 각 플라스크를 200rpm, 30℃ 와 200rpm, 37℃에서 배양하면서 0, 15, 21, 24, 28, 32, 36시간일 때 샘플을 채취한 후 분광광도계를 이용하여 600nm에서 흡광도를 측정하였고, ELISA를 이용하여 배지 내 골형성단백질의 생산량을 측정하였다. 분광광도계를 이용하여 600nm에서 흡광도를 측정한 결과 0 내지 13시간까지는 급격하게 증가하다가 그 후로는 서서히 증가하는 경향을 보였다(도6 a). 그리고 배지내 골형성단백질의 생산은 30℃에서는 배양 15시간에 최대 생산량(약 41.8 pg/mL)을 나타내었으며, 37℃에서는 배양 18시간부터 생산량이 점차 증가하다가 배양 36시간에 최대 생산량(약 37.5pg/mL)을 나타내었다(도6 b).

[실시예 4] 형질전환된 바실러스 서브틸러스의 탄소원과 배양 시간에 따른 골형성단백질 생산

탄소원이 균주 성장과 BMP7 생산에 미치는 영향을 조사하기 위하여 글루코스(glucose), 말토즈(maltose), 슈크로오스(sucrose), 콘 스팁 리커(corn steep liquor, CSL), 전분(starch) 및 락토즈(lactose) 등을 항생제를 포함하는 LB배지에 최종 농도가 5g/L가 되도록 제조하였다. 본 배양은 플라스크 6개를 준비한 후 하나의 플라스크에는 100ml의 LB배지를 넣고 나머지 5개의 플라스크에는 90ml의 LB배지 를 넣은 후 탄소원의 최종농도가 5g/L가 되도록 혼합하였다. 각 배지(카나마이신 50ug/mL을 함유)에 활성화 시킨 전배양액 1%를 접종한 후 200rpm, 30℃에서 배양하면서 4시간 간격으로 샘플을 채취하여 분광광도계 600nm에서 흡광도를 측정하였고, pH측정기를 이용하여 pH를 측정하였으며 ELISA를 이용하여 배지내 골형성단백질의 생산량을 측정하였다. 배지 내 골형성단백질의 생산은 락토즈(lactose)를 첨가한 경우 32시간에서 약 343.5pg/mL로 가장 많이 생산되었다(도7).

[실시예 5] 바실러스에서 생산된 재조합 인간 BMPs 단백질의 분리 정제

상기 실시예 1에서 생산된 재조합 인간 BMPs 단백질의 분리-정제하기 위해서 250ml 용량의 저온원심분리기(한일, Supra 21K)를 이용하여 4℃, 6000rpm의 조건으로 30분간 처리하여, 바실러스 서브틸리스와 배양 배지를 분리하였다. 분리된 배양액을 동결 건조기(일신랩, FD5508S)를 이용하여 분말이 될 때까지 동결 건조하였다. 분말화된 시료를 PBS에 10ml에 녹인 후 0.05M PBS 용액을 이용하여 투석한 후, 이 용액을 0.02㎛ 필터로 여과하였다. 이 여과액을 단백질을 분리 정제하는 기기인 FPLC(Fast Protein Liquid Chromatography, KTApurifier, Amersham Pharmacia Biotech, USA) 시스템을 사용하였고, Sephacryl S-200 컬럼(Amersham Pharmacia Biotech, USA)을 이용하였다. 그리고 분리 용액으로는 pH 7.2의 0.05M PBS을 사용하여, 0.3ml/min의 유속으로 재조합 인간 BMPs 단백질의 분리 정제하였고, 분획은 용액 3ml씩 획득하였다. 분획된 재조합 인간 BMPs 단백질을 확인하기 위해서 인간 BMP 항체를 이용한 웨스턴블럿법(Western blot assay)을 수행하였다. 12% SDS phage gel에 분획된 단백질을 전기영동한 후 이 gel을 80 V로 1시간 동안, 니트로 세룰로즈 멤브레인(nitrocellose membrane)에 전이하였다. 전이된 멤브레인(membrane)에 BMP 항체(R&D system, 1:1000 희석)를 4℃에서 12시간 반응한 후, HRP가 결합된 2차 항체(anti-mouse IgG, Santacruz, 1:1000 희석)를 상온에서 4시간 반응하였다. 2차 항체가 결합된 멤브레인(membrane)을 ELC(Amersham Pharmacia, UK)를 처리한 후 X-ray 필름에 30분간 노출한 후 필름을 현상하였다.

[실시예 6] 바실러스에서 생산된 재조합 인간 BMPs 단백질의 효능 분석

상기 실시예 5에서 분리-정제된 BMPs 단백질들의 효능 분석을 위해 마우스 골모세포(mouse osteoblast) 세포주인 MC3T3-E1에 다양한 농도로 처리한 후 골분화 표지인자인 Alkaline phosphatase(ALP)를 측정하여 효과를 확인하였다. 마우스 골모세포(mouse osteoblast) 세포주인 MC3T3-E1를 minimum essential medium alpha modification(α-MEM; Gibco BRL) 배지에 10% fetal bovine serum(FBS; Gibco BRL)와 항생제 즉, 페니실린-G(penicillin-G) 100U/ml, 스트렙토마이신(streptomycin) 100ug/ml, Gibco BRL이 첨가된 배양액을 사용하여 24-웰 플레이트에서 5X10⁴ cells/well로 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 배양하였다. 배양된 MC3T3-E1에 분리 정제된 재조합 골형성 단백질들을 농도별 처리(100, 200, 300ng/ml)와 양성 대조군으로 R&D systems에서 구입한 BMP7 단백질을 100ng/ml 처리하여 3일간 처리하였다. 처리된 세포를 수득하여 Lowry et al. 방법으로 세포내 단위당 단백질의 양을 측정하고, 405nm에서 p-nitrophenol(PNP)의 양을 측정하여 Alkaline phosphatase(ALP)를 비교 분석한 결과 재조합 골형성 단백질-7의 농도별 처리 시 100ng/ml에서는 2.5배, 300ng/ml에서는 8.9배 정도 ALP의 발현이 증가됨을 확인하였다.

도 1은 본 발명의 제조예 1의 재조합 BMPs의 염기서열을 나타낸 것이다.

도 2는 인간 골육세포주(U2OS)의 rhBMP cDNA를 이용한 rhBMP-7 유전자, 단백질 발현벡터를 pLip의 제한효소로 처리하여 확인한 전기영동(a)과 rhBMP-7 유전자 blast X 검색결과(b)이고,

도 3는 바실러스 서브틸리스의 세포외 발현 단백질 방출 시스템인 pLip에 재조합 골형성 단백질-7이 삽입된 위치와 제한 효소를 보여주는 모식도이고,

도 4는 형질전환된 바실러스 서브틸러스의 배지조건에 따른 성장률(a)과 배지내의 골형성 단백질의 생산량을 보여주는 결과(b)이고,

도 5는 형질전환된 바실러스 서브틸러스의 배지의 pH조건에 성장률(a)과 배양시간에 따른 pH변화(b), 배지내의 골형성단백질의 생산량을 보여주는 결과(c)이고,

도 6은 형질전환된 바실러스 서브틸러스의 온도에 따른 성장률(a)과 배지내의 골형성 단백질의 생산량을 보여주는 결과(b)이고,

도 7은 형질전환된 바실러스 서브틸러스의 탄소원과 배양시간에 따른 단백질의 생산량을 보여주는 결과이고,

도 8은 바실러스 서브틸리스에서 발현된 재조합 골형성 단백질-7의 발현을 확인하기 위하여 웨스턴블랏법(Western blot analysis)을 수행한 결과이고,

도 9는 바실러스 서브틸리스에서 발현된 FPLC를 이용하여 분리 정제된 재조합 골형성 단백질-7의 활성을 확인한 결과이다.

<110> Industry Foundation of Chonnam National University <120> Production method of Human BMPs by using Bacillus subtilis <150> KR20080017704 <151> 2008-02-27 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rhBMP-2 forward primer <400> 1 aagagaattc atgcaagcca aacacaaaca gcgg 34 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rhBMP-2 reverse primer <400> 2 tacgtctaga ctagcgacac ccacaaccct ccac 34 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rhBMP-4 forward primer <400> 3 atggtaccat gtcacagcgg gccagg 26 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rhBMP-4 reverse primer <400> 4 attctagatc agcggcaccc acatcc 26 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rhBMP-7 forward primer <400> 5 atggtaccat gtccacgggg agcaaa 26 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rhBMP-7 reverse primer <400> 6 attctagact agtggcagcc acaggc 26

Claims (5)

1) 사람의 골형성단백질(human bone morphogenetic protein)을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제조하고;

2) 단계 1)의 재조합 폴리뉴클레오티드를 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 세포 발현용 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하고;

3) 단계 2)의 재조합 벡터로 바실러스 서브틸리스 세포를 형질 전환하여, 탄소원이 락토스(Lactose)가 첨가된 배지에서 배양된 형질전환 바실러스 서브틸리스 세포를 얻고;

4) 단계 3)의 형질전환 바실러스 서브틸리스 세포로부터 사람의 골형성단백질을 생산 후 수득하는:

단계를 포함하는, 재조합된 사람의 골형성단백질의 생산방법.

제 1항에 있어서,

상기 1) 단계의 골형성단백질은 rhBMPs-2, rhBMPs-4, rhBMPs-7인 사람의 골형성단백질의 생산방법.

제 1항에 있어서,

상기 2) 단계의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 세포 발현용 벡터는 pLip 벡터인 사람의 골형성단백질의 생산방법.

삭제

제 1항에 있어서,

상기 4) 단계의 사람의 골형성단백질은 pH 5.5 내지 8, 온도 28 내지 37℃, 락토스 시간 28 내지 36시간 동안 배양한 배양액으로부터 수득되는 것인 사람의 골형성단백질의 생산방법.

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