KR20030045032A - 생물학적으로 활성인 인간 산성 섬유아세포 성장인자의제조방법과 맥관형성 촉진을 위한 그 용도 - Google Patents
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Abstract
인간 산성 섬유아세포 성장인자 155 (haFGF155) 유전자를 화학적 합성에 의해 수득한다. 문헌에 기술된 haFGF155 아미노산 서열을 기초로하여 haFGF155 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 유추한다. 합성된 haFGF155의 아미노산 서열은 문헌에 기재된 것과 차이가 없다. haFGF 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 앞서 기재된 것과 차이가 있다. haFGF155 유전자의 화학적 합성을 위해, 고도로 발현된 이.콜라이 단백질에서 이.콜라이에 의해 가장 빈번하게 사용되는 코돈을 사용했다. haFGF155 유전자를 가진 플라스미드(phaFGF155)를 얻고 이를 이용하여 이.콜라이를 형질전환시켰다. 람다 파아지의 용해를 느리게하는 조건하에 생산 균주를 배양하여 haFGF154 단백질을 생성했다. haFGF154 단백질은 람다 파아지에 의한 생산 균주세포의 용해로 인해 가용성 조건하에 배양배지에 축적되었다. haFGF154 단백질은 배양배지에 축적된 가용성 단백질의 20%를 차지했으며 이의 생물학적 활성을 신혈관 형성(맥관형성) 능력으로 평가했다. 단백질 합성도중 FGF155 단백질의 위치 1에서 개시 메티오닌 잔기를 완전히 제거하여 FGF154 아미노산 산물을 얻었다. 다른 형태의 haFGF 단백질을 생성하는 파아지-의존 방식의 용도에 관해서도 기재되어있다.
Description
섬유아세포 성장인자(FGF)는 구조적으로 관련된 9개의 폴리펩타이드이며, 세포 증식, 분화 및 일반적인 성장을 조절하는 강력한 조절자이다. 이는 종양형성과 전이의 병리학적 과정에도 관여한다 (Galzie et al. Biochem. Cell Biol. (1997) 75: 669-685). 이는 내피세포를 포함한 광범위한 중배엽 및 신경상피 유래 세포에 대한 강력한 유사분열물질이면서 분화 인자이다.
헤파린 프로테오글리칸, 헤파린 또는 헤파린 황산염은 FGF 수용체에 제시된 다수의 FGF 분자들과 복합체 형태로 결합한다. FGF 단백질은 자신의 수용체와 결합하여 단백질 티로신 키나제를 활성화시킨다. 이러한 티로신 키나제의 인산화는 새로운 mRNA의 전사를 포함한 다수의 신호를 개시한다.
염기성과 산성의 두 섬유아세포 성장인자가 맥관형성의 강력한 유도자로 공지되어있다(Friesel et al. (1995) FASEB J. 9: 919-925). 염기성과 산성 인자 모두가 혈관형성 제어와 함께 정상적 맥관형성과 병리학적 맥관형성에 관여한다 (Slavin, J. (1995) Cell Biology International 19(5): 431-444). 이들 인자는 이미 정제되어 아미노산 서열이 결정되어있으며 이들의 cDNA도 클로닝되어 서열분석되었다.
산성 섬유아세포 성장인자(aFGF)는 배아 신장-유래 맥관형성 인자 I, 성상교세포 성장인자 I, 내피세포 성장인자 (ECGF), 망막-유래 성장인자, 헤파린-결합 성장인자 부류 I, 내피 성장인자, 안구-유래 성장인자 II, 프로스타트로핀, 및 아교 성숙 인자를 포함한 다양한 명칭으로 공지되어있다(Gospodarowicz et al. (1987) Journal of Cellular Physiology supplement 5: 15-26). 클로닝, 뉴클레오타이드 서열 및 염색체 위치화도 공지되어있다 (Jaye et al. (1986) Science 233: 541-545).
aFGF 유전자는 염색체 5상에 위치한다. 이는 단일 복사본을 가지고 있으며 두개의 인트론에 의해 분리된 세개의 엑손을 암호화한다. 4.8 kb mRNA가 해독되어 155개 아미노산을 가진 aFGF 형태를 합성한다. 그러나, N-말단 메티오닌 잔기를 생체내에서 제거할 경우 154개 아미노산 형태가 얻어진다. aFGF의 이러한 154개 아미노산은 140개 및 134개 아미노산의 두가지 형태로 가공처리된다. aFGF 단백질은 분자량 15,000 내지 17,000 달톤의 음이온 유사분열물질이다.
aFGF 단백질은 뇌, 망막, 골기질 및 골육종에서 발견되고있다. 140개 및 134개 아미노산을 지닌 형태만이 조직으로부터 얻어졌다. 끝이 절단된 aFGF 형태는 aFGF 추출 및 분리도중에 특정 프로테아제에 의해 생성되는 인공산물인 것으로 제시되고 있다(Gospodarowicz et al. (1987) Journal of Cellular Physiology supplement 5: 15-26; Jaye et al. (1987) The Journal of Biological Chemistry 262 (34): 16612-16617).
헤파린이 aFGF 단백질의 생물학적 활성을 가능하게하는 것으로 제시되고 있다(Thornton et al. (1983) Science 222 (4624): 623-625). aFGF에 결합하는 헤파린이 관찰되었다(Maciag et al. (1984) Science 225 (4665): 932-935). 이러한 헤파린 결합 특성은 aFGF 단백질의 정제를 위한 친화성 크로마토그래피법으로 유용하게 이용되고 있다. 헤파린은 aFGF의 생물학적 활성을 가능케하고 aFGF-헤파린 복합체의 활성증진은 수배 내지 백배에 걸쳐 다양하다(Lobb et al. (1986) Anal. Biochem. 154:1-14).
본 발명 분야는 재조합 섬유아세포 성장인자 단백질의 제조방법과 맥관형성 촉진을 위한 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 여러 특성들은 바람직한 실시양태의 도면을 참조하여 기술될 것이지만 이는 설명을 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 함이 아니다.
도 1은 자연적으로 발견되는 코돈을 고도로 발현된 이.콜라이 단백질과 해독된 아미노산 서열(서열번호: 2)에서 발견되는 코돈으로 치환하여 변형시킴으로써 화학적으로 합성된 인간 산성 섬유아세포 성장인자의 뉴클레오타이드 서열 (155개 아미노산)(서열번호: 1)을 도시하고 있다.
도 2는 화학적으로 합성된 haFGF155 코돈에서 수행된 변형을 도시하고 있다. FGF fr HUMECGFB는 GenBank에서 얻은 서열이다(NCBI에서)(서열번호: 3). HaFGF155는 화학적으로 합성된 본 발명의 서열이다(서열번호: 1).
도 3은 화학적으로 합성된 haFGF155 유전자(서열번호: 1)를 함유하고 있는 pET24-155@rev 작제물을 도시하고 있다.
도 4는 재조합 haFGF154(서열번호: 8)를 함유하고 있는 배양배지의 정제를 도시하고 있다. 전기영동사진에서: 레인 1, 재조합 haFGF154를 함유하고 있는 조배지(225 mg FGF-1/ℓ); 레인 2, 헤파린-세파로스 컬럼 정제된 재조합 haFGF154; 레인 3, HPLC C-18 컬럼에 의한 haFGF154의 정제. 맨 좌측의 표지되지 않은 레인은 분자량 마커를 함유하고 있다.
도 5는 화학적으로 합성된 haFGF134 유전자(서열번호: 4)를 함유하고 있는 pET24-134@rev 작제물을 도시하고 있다.
도 6은 자연적으로 발견되는 코돈을 고도로 발현된 이.콜라이 단백질과 해독된 아미노산 서열(서열번호: 5)에서 발견되는 코돈으로 치환하여 변형시킴으로써화학적으로 합성된 인간 산성 섬유아세포 성장인자의 뉴클레오타이드 서열 (134개 아미노산)(서열번호: 4)을 도시하고 있다.
도 7은 화학적으로 합성된 haFGF140 유전자(서열번호: 6)를 함유하고 있는 pET24-140@rev 작제물을 도시하고 있다.
도 8은 자연적으로 발견되는 코돈을 고도로 발현된 이.콜라이 단백질과 해독된 아미노산 서열(서열번호: 7)에서 발견되는 코돈으로 치환하여 변형시킴으로써 화학적으로 합성된 인간 산성 섬유아세포 성장인자의 뉴클레오타이드 서열 (140개 아미노산)(서열번호: 6)을 도시하고 있다.
도 9는 본원에서 기술된 파아지-의존법에 의해 생성된 단백질을 함유하고 있는 12.5% SDS 폴리아크릴아마이드 겔을 도시하고 있다: 레인 1: 표준 분자량, 각각 2㎍; 레인 2: 재조합 FGF134 단백질을 함유하고 있는 40 ㎕의 배양배지; 레인 3: 재조합 FGF140 단백질을 함유하고 있는 40 ㎕의 배양배지; 레인 4: 재조합 인터페론 α2B를 함유하고 있는 40 ㎕의 배양배지; 레인 5: 재조합 FGF154 단백질을 함유하고 있는 40 ㎕의 배양배지; 레인 6: 재조합 인간 성장 호르몬을 함유하고 있는 40 ㎕의 배양배지; 레인 7: 재조합 메티오닌 아미노펩티다제를 함유하고 있는 40 ㎕의 배양배지; 레인 8: 이.콜라이의 β-갈락토시다제를 함유하고 있는 40 ㎕의 배양배지.
도 10은 본 발명에 따라 정제된 재조합 단백질을 함유하고 있는 12.5% SDS 폴리아크릴아마이드 겔을 도시하고 있다: 레인 1: 표준 분자량; 레인 2: 5 ㎍의 정제된 FGF134 단백질; 레인 3: 5 ㎍의 정제된 FGF140 단백질; 레인 4: 5 ㎍의 정제된 FGF146 단백질; 레인 5: 5 ㎍의 정제된 인터페론 α2B 단백질; 레인 6: 5 ㎍의 정제된 FGF154 단백질; 레인 7: 5 ㎍의 정제된 메티오닌 아미노 펩티다제 단백질; 및 레인 8: 표준 분자량.
도 11. FGF 처리 후 14일째에 병아리 배아 CAM 혈관. haFGF 단백질의 154개 아미노산 형태의 적용 후 4일째에 달걀 CAM 신혈관 형성. 3배 확대.
도 11a는 haFGF 단백질의 154개 아미노산 형태 1 ㎍m의 작용을 도시하고 있다. 적용된 혈관은 대부분 작고 방사상 성장을 보여주고 있다.
도 11b는 대조 샘플을 도시하고 있다.
바람직한 실시양태의 상세한 설명
기재된 실시양태는 본 발명의 바람직한 실시양태를 나타내지만, 당업계의 숙련인은 본 발명의 취지에서 벗어남이 없이 수정을 행할 수 있다. 따라서, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 결정되어진다.
haFGF155 유전자는 155개 아미노산 잔기를 함유하고 있는 단백질을 암호화한다(서열번호: 1과 2). haFGF155 서열의 첫번째 아미노산은 개시 메티오닌 잔기로서, 이는 일반적인 상황에서는 단백질 합성도중 제거되어 154개의 아미노산으로 이루어진 FGF 단백질을 생성한다(서열번호: 8). 그러나 조직 샘플로부터 이보다 짧은 두가지 형태의 aFGF를 분리할 수 있었다. 분리된 두가지 형태는 140개 및 134개 아미노산 잔기를 함유한다. 140개 아미노산을 함유하고 있는 aFGF 형태는 완전한 것으로 간주되지만, 134개 아미노산을 함유하고 있는 aFGF 형태는 끝이 절단된 형태로 여겨진다. 조직샘플로부터 155개 또는 154개 아미노산을 함유하고 있는 aFGF 형태를 추출해낼 수 없었다. 이러한 보다 짧은 동종형태가 세포 가공처리의 일반적인 구성요소인지 aFGF 추출공정에서 특정 프로테아제에 의한 분리 과정도중에 생성되는 인공적인 산물인지 여부에 관해서는 알려진 바가없다. 세가지 aFGF 형태에 대한 분리된 DNA 재조합 분자로부터 생성된 단백질의 웨스턴 블랏분석에 따르면, 140 및 134 형태는 높은 발현을 보여주었고 154 형태는 낮은 수준의 발현을 보여주었다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 인간 산성 섬유아세포 성장인자의 유전자는 aFGF 단백질의 154개 아미노산 형태를 암호화하며 화학적으로 합성된다(서열번호: 1). haFGF155 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 앞서 기술된 haFGF155 아미노산 서열(서열번호: 2)을 기초로 하여 유추되었다. 합성된 haFGF155 유전자의 아미노산 서열은 GenBank에서 얻은 서열번호 3의 인간 aFGF 뉴클레오타이드 서열의 해독된 서열과 같이 앞서 기술된 아미노산 서열과 차이가 없다. 그러나, haFGF 유전자의 바람직한 뉴클레오타이드 서열은 앞서 기술된 것과 차이가 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, haFGF155 유전자는 세균 단백질의 집중적인 합성을 위해 이.콜라이에서 가장 빈번하게 사용되는 코돈을 이용하여 화학적으로 합성되었다. 이.콜라이의 경우 바람직한 코돈 사용 빈도표가 익히 공지되어 있고 입수가능하다. 예를 들면, http:/pshche.uthct.edu/shaun/Sblack/codonuse.html을 참조하기 바란다. 폴리뉴클레오타이드의 화학적 합성은 익히 공지된 방법을 이용하여 수행되었다(Edge et al. (1983) Nucleic Acids Research 11(18): 6419-6435).
다른 방식으로, 본 발명의 실시에서 당업계의 숙련인은 익히 공지된 다른 형태의 haFGF 유전자, 예를 들면 당업계의 숙련인에게 공지된 154, 146, 140 및 134동종형태, 및 이들의 변형체, 유도체, 유사체 또는 분획을 포함한 다른 형태의 haFGF 단백질을 암호화하는 동물 조직으로부터 분리된 DNA를 사용할 수 있다. 인간 aFGF 단백질은 맥관형성을 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 실시에 의해 생성된 인간 aFGF는 적당한 약학적 담체와 함께 조성물에서 사용될 수도 있다. 이러한 담체는 식염수, 완충식염수, 물, 덱스트로스 및 이들의 조합물을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 바람직한 실시 양태에서는 TissucalTM(Baxter International, Duarte, CA)과 같은 피브린글루가 담체로 이용된다.
도 1은 본 발명자들에 의해 합성된 haFGF155 유전자의 완전한 뉴클레오타이드 서열을 도시하고 있다(서열번호: 1). GenBank에서 얻은 인간 산성 섬유아세포 성장인자 서열(서열번호: 3)을 화학적으로 합성된 도 1의 서열과 비교하였다. 이러한 비교를 도 2에서 도시하고 있다. 80개의 코돈이 상이하다.
발현 및 클로닝 벡터는 전형적으로 숙주 생물에 의해 인식되고 haFGF 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 프로모터는 작동가능하게 연결된 특정 핵산 서열, 예를 들면 haFGF 핵산 서열의 전사 및 해독을 통제하는 구조 유전자(일반적으로 100 내지 1000개 염기쌍)의 개시코돈에 대해 상류(5')에 위치하는 비해독 서열이다. 이러한 프로모터는 전형적으로 유도성과 구성성의 두가지 부류에 속한다. 유도성 프로모터는 배양조건에 있어 몇몇 변화, 예를 들어 영양소의 존재 또는 부재, 또는 온도변화에 반응하여 DNA로부터 높은 수준의 전사를 개시하는 프로모터이다. 현재까지, 원핵생물 숙주 세포에 의해 인식되는 다수의 프로모터가 공지되어있다. 이들 프로모터는 제한효소 절개에 의해 출처 DNA로부터 프로모터를 제거한 다음 분리된 프로모터 서열을 벡터안으로 삽입시킴으로써 haFGF-암호 DNA에 작동가능하게 연결된다.
당업계의 숙련인에게 공지된 프로모터는 β-갈락토시다제와 락토스 프로모터계(Chang et al. (1978) Nature 275:615; Goeddel et al. Nature (1979) 281: 544), 알칼라인 포스파타제, 및 트립토판(trp) 프로모터계(Goeddel (1980) Nucleic Acids Research 8: 4057; Ep36, 776)를 포함한다. 그러나, 공지된 다른 세균 프로모터도 적합하다. 가장 바람직한 프로모터는 T7 프로모터계이다. 당업계의 숙련인은 적절한 제한 부위를 제공하기 위해 적당한 링커 또는 연결기를 이용하여 프로모터를 haFGF DNA에 연결하는 방법을 숙지하고 있다. 프로모터는 보다 높은 수준의 발현을 위해 앞뒤로 연계되어 이용될 수도 있다.
본원에 기재된 벡터안으로 클로닝된 haFGF 유전자를 발현시키기 위해 임의 개수의 원핵생물 숙주 세포가 적당하다. 바람직한 원핵생물 숙주는 그램-음성 또는 그램-양성 생물과 같은 진정세균, 예를 들면 대장균과 같은 엔테르박테리아과를 포함한다. 가장 바람직한 원핵생물 숙주는 이.콜라이이다.
형질전환은 DNA가 염색체외 인자로서 혹은 염색체안으로 통합되어 복제를 수행할 수 있도록 DNA를 생물체안으로 도입하는 방식을 의미한다. 원핵생물 세포의 형질전환은 당업계의 숙련인에게 익히 공지된 기술, 예를 들면 CaCl2처리 또는 전기천공을 이용하여 수행된다.
생산 세포를 박테리오파아지로 감염시키는 중요한 이점은 파아지가 세균 숙주 세포에서 모든 거대분자 합성의 복잡한 재배열을 수행하는데 있다. 세균 유전자의 전사를 중단시킴으로써, 파아지는 목표 유전자의 복사를 증가시킬 수 있고, 이에 따라 원하는 산물의 생산량을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 최상의-생산 시스템의 일 실시양태에 따르면, 세균 용해를 지연시키는 앰버-돌연변이(예, Q-및 R-돌연변이)를 가진 파아지 λ를 파아지 λ에서 앰버-돌연변이를 회복시키는 억제자가 결여된 Su°로 명명된 이.콜라이 균주에 제공한다. 비-억제 이.콜라이 균주(Su°)를 얻기위해, 야생형 Su+집단으로부터 Su°클론을 선택한다. 바람직하게는 선택 마커, 예를 들면 테트라사이클린 또는 앰피실린 내성을 파아지 DNA에 삽입한다.
파아지 λcI857Nam7Nam53bla tet(이하, λbla N')을 이용하여 비-억제(Su°) 이.콜라이 균주, 예를 들어 이.콜라이 K802를 선택했다. 이.콜라이 균주 C600(λbla N')는 파아지의 출처로 작용했다. 이러한 파아지는 플라스미드 pCV11(bla tet)의 EcoRI 부위를 억제 유전자(cI857)에서 ts-돌연변이를 운반하는 단일-부위(EcoRI) 벡터 안으로 삽입시켜 얻어졌다. 이후, 두개의 앰버-돌연변이를 생체내 재조합에 의해 파아지 N 유전자 안으로 도입시켰다.
클론에서 파아지 λ가 없는 비-용원성을 시험했다. 파아지 λbla N' 이외에, 파아지 λcI857Qam117Ram54를 사용하여 억제자를 조사했다.
공지된 바와 같이, 파아지 λN' 돌연변이체는 숙주세포를 용해시킬 수 없으며 매우 불안정한 플라스미드 형태로 세포내에 존재한다. 숙주세포가 억제자를 함유하면, 앰버-돌연변이의 표현형이 회복되고, N 단백질이 합성되며 파아지가 용균 성장할 수 있다. λN'으로 감염된 Su+및 Su°세포의 생활력에 있어 이러한 차이는 이.콜라이 Su+세포 집단으로부터 자발적으로 나타나는 Su°복귀변이주의 선택을 위한 기초로 이용된다. 앰피실린과 테트라사이클린 내성 마커를 세포안으로 도입하는 삽입 플라스미드를 가진 파아지 λ를 이용하여 비용균 Su°세포에 의한 돌연변이체 조사 방해를 차단할 수 있었다. 파아지는 또한 이러한 파아지를 용균 성장시키는 억제 유전자에서 ts-돌연변이를 함유하고 있어 세포를 용해시킬 수 있다.
앰피실린과 테트라사이클린으로 보충된 배지에 파아지 λbla N'로 감염시킨 후 Su+배양균을 접종시키고 43℃에서 성장시킬 경우, 플라스미드 형태의 파아지 λbla N'를 함유한 단일 무억제 세포가 평판상에서 성장해야 한다. 파아지로부터 세포를 보존하기 위해, 모배양균(parent culture)의 Su°유도체를 얻어야 한다. 방법은 다수의 단계로 구분될 수 있다.
1.파아지 λbla N'를 이용한 배양균의 감염
이.콜라이 Su+배양균을 말토스를 지닌 37℃의 M9 배지상에서 격렬히 교반해가며 1-2 ×108세포/ml의 밀도가 되도록 성장시켰다. 세포를 5-10 입자/세포의 중복도로 파아지 λbla N'로 감염시킨 다음 20℃에서 20분간 배양시켰다. 주어진 조건하에 감염 효율은 약 100%이며, 파아지는 대부분의 Su+세포 이외에 단일 Su°세포도 감염시킨다.
2.마커 파아지를 함유하는 무억제 세포의 선택
감염 후, 세포를 테트라사이클린 12 γ/ml와 앰피실린 20 γ/ml로 보충된 아가 배지상에 도말하고 43℃에서 성장시켰다. 24시간 동안 단일 콜로니가 성장했으며, 이를 항생제가 존재하는 아가 배지상에 다시 도말한 다음 37℃에서 성장시켰다.
3.파아지 λbla N'로부터 선택된 클론의 보존
이.콜라이 Su°세포에서 파아지 λN'은 매우 불안정한 플라스미드 형태를 하고 있기 때문에, 파아지로부터 이를 보존하기 위해서는 선택된 클론을 항생제가 존재하지 않는 선택형 아가 배지상에 도말한 다음 37℃에서 성장시켰다. 항생제가 존재하지 않는 배지상에서 1회 계대시 파아지를 상실한 세포수는 12 내지 35%에 해당되었다. 항생제 내성 상실과 파아지 λ의 부재에 대한 감성 획득을 모니터링하여 이러한 세포를 선택했다.
4.억제자에 대한 세포 시험
앰버-돌연변이를 가진 파아지 λ가 보존된 클론의 론(lawn)상에서 플라크를 형성하는 능력을 조사했다. 모(parent) 이.콜라이 Su+균주의 동질유전자형 무억제 유도체는 파아지 λbla N'가 플라크를 형성하지 않고, 파아지 λcI857Qam117Ram54가 1-3×105PFU/ml를 생성하며 유전자 Q와 R에서 돌연변이를 가지지 않은 파아지 λcI857이 1 ×1010PFU/ml를 생성하는 클론이다.
이러한 방법을 이용하여, 본 출원인은 이.콜라이 K 802 Su+의 Su°복귀변이주를 얻었다. 감염순간 세포수와 이들 중 Su°복귀변이주의 개수를 기초로 하여 무억제 세포의 발생 빈도수는 3 ×10-7이었다.
바람직한 실시양태에서, 관련 유전자는 T7 프로모터의 통제하에 pET-24a(+) 안으로 클로닝된다. 바람직한 유전자는 인간 aFGF134 아미노산 형태, 인간 aFGF140 아미노산 형태, 인간 aFGF146 아미노산 형태 및 인간 aFGF155 아미노산 형태를 암호화 하는 유전자를 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 대체 실시양태에서, 관련 유전자는 적절한 프로모터의 통제하에 세균 플라스미드와 λ파아지 안으로 클로닝될 수 있다. 가장 바람직한 실시양태에서, 화학적으로 합성된 haFGF155 유전자(서열번호: 1)는 T7 프로모터의 통제하에 pET-24a(+) 안으로 클로닝된다.
T7 프로모터는 T7 RNA 폴리머라제에 의해서만 인식되고 이.콜라이의 RNA 폴리머라제에 의해서는 인식되지 않는다. haFGF 유전자를 가진 플라스미드를 이.콜라이 BL21(DE3) 안으로 형질전환시켰다. 이러한 균주는 T7 RNA 폴리머라제 유전자를 함유한다. T7 RNA 폴리머라제 유전자는 유도성 lac UV5 프로모터의 통제하에 있으며 이러한 단백질이 이.콜라이 세포에 유독한 경우와 같이 필요한 경우에만 T7 RNA 폴리머라제 합성을 유도한다. lac 프로모터는 IPTG를 영양 배지에 첨가하여 유도된다. haFGF 단백질을 얻기 위해, haFGF 유전자를 가진 재조합 플라스미드를 함유한 생산 균주를 20 내지 40℃의 온도에서 강한 호기성 조건하에 1 ml당 5 ×107내지 5 ×109세포의 세포밀도가 되도록 배양한다. 이후, 이를 세포당 0.1 내지 100 파아지체의 중복도로 ts-돌연변이 cI 억제유전자를 가진 람다 파아지로 감염시킨 다음 20 내지 37℃에서 2 내지 14시간 동안 연속적으로 배양한다. 파아지와 동시에 1 mM 농도의 IPTG를 첨가한다.
람다 파아지의 용균 성장을 느리게하는 조건하에 생산균주를 배양하여 haFGF 단백질을 생성했다. 이러한 조건은 낮은 배양온도와 함께 Q와 R 유전자와 같은 후기 람다 파아지 유전자에서 앰버 돌연변이의 사용을 포함한다.
haFGF 단백질은 람다 파아지에 의한 생산 균주세포의 용해로 인해 가용성 단백질의 형태로 배양배지에 축적되었다. 각 haFGF 단백질의 수율은 일반적으로 배양배지에 축적된 가용성 단백질의 20%를 차지했다. 세포 파편을 원심분리에 의해 배양배지로부터 제거했다. 이후, 하기의 과정, 예를 들면 적당한 정제 과정: 이온-교환 컬럼상에서 분별; 에탄올 침전, 역상 HPLC; 실리카상에서 크로마토그래피; 면역친화; SDS-PAGE; 황산 암모늄 침전; 및 겔 여과를 이용하여 가용성 오염 단백질과 폴리펩타이드로부터 haFGF를 정제했다. 일 실시양태에서, haFGF 재조합 단백질을 C18 HPLC 컬럼을 이용하여 정제했다. 또다른 실시양태에서, haFGF 재조합 단백질을 헤파린 세파로스에 적용하여 정제된 haFGF를 얻었다. 정제된 haFGF를 자동 아미노-말단 서열 분석을 15회 수행했다. 이러한 분석은 FGF155의 위치 1에서 모든 개시메티오닌이 합성도중 제거되어 154개 아미노산을 함유한 FGF 분자를 생성했음을 의미한다. 상기 분석의 2 내지 14회째에 검출된 아미노산은 FGF155의 위치 2-14와 일치했다.
신혈관 형성(맥관형성) 능력에 따라 정제된 haFGF 재조합 단백질의 생물학적 활성을 입증했다. 분석은 병아리 배아 장뇨막(CAM) 모델을 이용하여 신혈관 형성에 대한 haFGF의 작용에 관한 연구를 수반했다.
하기에서 본 발명을 보다 상세히 설명하고 있다. 상술된 실시양태는 본 발명의 바람직한 실시양태를 나타내지만, 당업계의 숙련인은 본 발명의 취지에서 벗어남이 없이 수정을 행할 수 있다. 따라서, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 결정되어진다.
일 실시양태에 따르면, 본 발명은 생물학적으로 활성인 인간 산성 섬유아세포 성장인자를 제조하는 방법에 관한 것으로, 본 방법은 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있으면서 생물학적으로 활성인 인간 산성 섬유아세포 성장인자 단백질을 암호화하는 발현성 유전자의 복사본을 하나 이상 가지고 있는 플라스미드로 이.콜라이(E.coli) 균주를 형질전환시키고;
형질전환된 세균 숙주 세포를 지연용균을 매개할 수 있는 박테리오파아지 λ로 감염시킨 다음;
상기 단백질을 원하는 수준으로 생성할 때까지 이.콜라이 숙주 세포의 용균 성장을 용균없이 유도하는 배양 조건하에 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하고,상기 단백질은 생물학적으로 활성인 가용성 인간 산성 섬유아세포 성장인자 단백질 형태로 생성된다.
바람직한 실시양태에서, 박테리오파아지 λ는 온도-민감성 돌연변이를 가진다. 좀더 바람직한 실시양태에서, 온도-민감성 돌연변이는 cI857이다.
바람직한 실시양태에서, 이.콜라이 숙주 세포는 배양단계 이전에 박테리오파아지 λ의 용균 성장을 억제하는 온도에서 성장한다.
바람직한 실시양태에서, 박테리오파아지 λ는 지연용균을 매개할 수 있는 하나 이상의 유전자에 돌연변이를 가진다. 좀더 바람직한 실시양태에서, 지연용균을 매개할 수 있는 하나 이상의 유전자는 N, Q 및 R로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 이.콜라이 균주는 앰버(amber) 돌연변이를 회복시키는 억제자를 생성한다.
대체 실시양태에서, 이.콜라이 균주에 앰버 돌연변이를 회복시키는 억제자가 결여되어있다.
바람직한 실시양태에서, 박테리오파아지 λ는 약 1 내지 약 100의 감염 중복도로 감염된다. 좀더 바람직한 실시양태에서, 박테리오파아지 λ는 약 10 내지 약 25의 감염 중복도로 감염된다.
바람직한 실시양태에서, 이.콜라이 균주의 박테리오파아지-매개 지연용균이 낮은 감염 중복도에 비해 높은 감염 중복도로 지연된다.
바람직한 실시양태에서, 생물학적으로 활성인 인간 산성 섬유아세포 성장인자 단백질은 154개의 아미노산을 함유한다. 좀더 바람직한 실시 양태에서, 인간 산성 섬유아세포 성장인자 단백질은 서열번호 8의 서열을 가진다.
바람직한 실시양태에서, 프로모터는 T7 폴리머라제 프로모터이고 이.콜라이 균주는 T7 RNA 폴리머라제 유전자를 발현시킬 수 있다. 좀더 바람직한 실시양태에서, T7 RNA 폴리머라제 유전자는 유도성 프로모터의 통제하에 놓인다. 좀더 바람직한 실시양태에서, 유도성 프로모터는 lac UV5 프로모터이다.
대체 실시양태에서, 생물학적으로 활성인 인간 산성 섬유아세포 성장인자 단백질은 146개의 아미노산을 함유한다.
또다른 실시양태에서, 생물학적으로 활성인 인간 산성 섬유아세포 성장인자 단백질은 140개의 아미노산을 함유한다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 생물학적으로 활성인 인간 산성 섬유아세포 성장인자 단백질은 134개의 아미노산을 함유한다.
바람직한 실시양태에서는
a) 온도-민감성 돌연변이를 가진 박테리오파아지 λ균주를 함유한 제1 이.콜라이 세포 균주를 성장시키고,
b) 온도를 조절하여 제1 이.콜라이 균주를 용해시켜 박테리오파아지 λ를 방출시킨 다음,
c) 유도성 프로모터의 통제하에 T7 폴리머라제 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있으면서 생물학적으로 활성인 인간 산성 섬유아세포 성장인자 단백질을 암호화하는 발현성 유전자의 복사본을 하나 이상 가지고 있는 플라스미드로 형질전환된 제2 이.콜라이 세포 균주를 유도제를 첨가하여 유도시켜 T7 RNA 폴리머라제 유전자를 발현시키고;
d) 제2 이.콜라이 세포 균주를 상기 제1 이.콜라이 세포 균주로부터 방출된 박테리오파아지 λ로 감염시킨 다음;
e) 감염된 제2 이.콜라이 세포 균주를 유도자를 함유한 배양배지에서 배양하여 제2 이.콜라이 세포균주의 용해시 생성된 단백질을 배양배지 안으로 방출시키는 단계를 포함하는 생물학적으로 활성인 인간 산성 섬유아세포 성장인자 단백질의 제조방법이 제공되며, 상기 단백질은 100 ㎍/ml 이상의 농도로 생물학적으로 활성인 가용성 단백질 형태로 생성된다.
본 발명의 또다른 측면은 서열번호 1의 서열을 가진 화학적으로 합성된 핵산을 포함한다.
종래 기술보다 우수한 본 발명의 이점들을 요약하기 위해 본 발명의 특정 목적과 이점들을 상술하였다. 물론, 이러한 목적 또는 이점을 본 발명의 특정 실시양태에 의해 모두 달성할 수 있는 것은 아니다. 이에 따라, 예를 들면, 당업계의 숙련인은 본원에서 교시되거나 제안된 다른 목적들 또는 이점들을 달성할 필요없이 본원에서 교시된 일 이점 또는 이점들을 달성하거나 최적화하는 방식으로 본 발명을 구현하거나 수행할 수 있음을 알 수 있을 것이다.
본 발명의 부가적인 측면, 특성 및 이점은 하기의 바람직한 실시양태의 상세한 설명을 통해 분명히 이해될 수 있을 것이다.
실시예 1
파아지-의존법에 의한 인간 aFGF154의 생성
이쉐리키아 콜라이(Escherichia coli) BL21(DE3) 배양균(NOVAGEN)을 인간 산성 섬유아세포 성장인자(155개 아미노산)(서열번호: 1)를 암호화하는 화학적으로 합성된 haFGF155 유전자의 복사본 하나를 함유하고 있는 플라스미드 pET24-155@rev(도 3)로 형질전환시켰다. BL21(DE3) 배양균은 세균 게놈에서 유도성 lac UV5 프로모터의 통제하에 T7 RNA 폴리머라제 유전자의 복사본을 하나 함유하고 있다(Studier et al, (1986) J. Mol. Biol. 189: 113-130). T7 프로모터의 통제하에 플라스미드 pET-24a(+)(NOVAGEN) 안으로 화학적으로 합성된 haFGF155 유전자(서열번호: 1)를 삽입하여 플라스미드 pET24-155@rev를 얻었다. haFGF155 유전자는 IPTG에 의한 lac UV5 프로모터의 유도를 통해 매개되는 세포에서 T7 폴리머라제의 출현후에 발현을 개시한다.
pET24-155@rev를 가진 이.콜라이 BL21(DE3) 배양균을 카나마이신 50㎍/ml를 함유하고 있는 37℃의 LB 배지에서 교반해가며 2 ×108세포/ml의 밀도로 성장시켰다. 이후, 세포를 약 10개의 파아지체/세균 세포의 중복도로 파아지 λcI857Qam117Ram54로 감염시키고 21℃에서 교반해가며 약 14시간 동안 배양시켰다. 파아지와 동시에 IPTG 1 mM을 배지에 첨가했다.
파아지 λcI857Qam117Ram54는 30℃의 LB 배지에서 강한 호기성 조건하에 대략 1 ×108세포/ml의 밀도로 성장된 용원성 이.콜라이 RLMI 배양균으로부터 제조되었다. 용원성 배양균을 43℃로 데운 다음 20분간 배양시켜 cI 억제자를 불활성화시켰다. 온도를 37℃로 감소시키고 60 내지 70분 후에 세균세포가 용해되면 1-2 ×1010PFU/ml의 파아지가 형성되었다.
파아지-감염 세포를 14시간 동안 배양한 후, 배양배지로부터 원심분리에 의해 세포파편을 제거했다. haFGF154 단백질을 함유한 배양배지를 헤파린 세파로스 컬럼에 적용시켜 순수한 haFGF154를 얻었다.
haFGF154를 함유한 배양배지를 변성 조건하에 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동으로 분석하고 쿠마시 블루로 염색했다. 도 4에서는 haFGF154 단백질을 함유한 배양배지의 전기영동사진을 정제된 haFGF 단백질과 비교하고 있다. 레인 1은 재조합 haFGF154를 함유한 조배지를 나타낸다(225 mg FGF-1/ℓ). 레인 2는 헤파린-세파로스 컬럼 정제된 재조합 haFGF154를 나타낸다. 레인 3은 HPLC C-18 컬럼에 의한 haFGF154의 정제를 보여준다. 맨 좌측의 표지되지 않은 레인은 분자량 마커를 함유한다. 총 정제수율은 약 65%였다. 생물활성을 두가지 다른 분석, 3T3 세포 증식 분석과 래트 후지절 맥관형성 분석으로 측정했다(미도시). 생물활성은 Sigma-Chem에서 얻은 FGF-1과 대등했다. 하기 실시예 7에서는 병아리 배아 장뇨막을 이용한 분석을 나타내고 있다.
파아지-감염 배양균에서 haFGF154 단백질의 생산량은 총 세포 단백질의 약 20%였다. 밀도 영상 마스터 VDS로 측정된 haFGF154의 분자량은 17,908 달톤이었다(자료 미도시). FGF154의 N-말단 서열 분석에 따라 최초 위치에 알라닌 잔기가 확인되었으며 개시 메티오닌은 검출되지 않았다.
실시예 2
파아지-의존법에 의한 인간 aFGF134 아미노산 형태의 생성
이쉐리키아 콜라이 BL21(DE3) 배양균(NOVAGEN)을 인간 aFGF134 아미노산 형태(도 6; 서열번호: 4)를 암호화하는 화학적으로 합성된 유전자의 복사본을 하나 함유하고 있는 플라스미드 pET24-134@rev(도 5)로 형질전환시켰다. 해독된 아미노산 서열은 서열번호 5로 도시되고 있다. BL21(DE3) 배양균은 세균 게놈에서 유도성 lac UV5 프로모터의 통제하에 T7 RNA 폴리머라제 유전자의 단일 복사본을 함유하고 있다(Studier et al. (1986) J.Mol.Biol. 189:113-130). T7 프로모터의 통제하에플라스미드 pET-24a(+)(NOVAGEN) 안으로 인간 aFGF134 아미노산 형태 유전자를 삽입시켰다. 인간 aFGF134 아미노산 형태 유전자는 IPTG에 의한 lac UV5 프로모터의 유도를 통해 매개되는 세포에서 T7 폴리머라제의 출현후에 발현을 개시한다.
pET24-134@rev를 가진 이.콜라이 BL21(DE3) 배양균을 카나마이신 50㎍/ml를 함유하고 있는 37℃의 LB 배지에서 교반해가며 2 ×108세포/ml의 밀도로 성장시켰다. 이후, 세포를 약 10개의 파아지체/세균 세포의 중복도로 파아지 λcI857Qam117Ram54로 감염시키고 21℃에서 교반해가며 약 14시간 동안 배양시켰다. 파아지와 동시에 IPTG 1 mM을 배지에 첨가했다.
파아지 λcI857Qam117Ram54는 30℃의 LB 배지에서 강한 호기성 조건하에 대략 1 ×108세포/ml의 밀도로 성장된 용원성 이.콜라이 RLMI 배양균으로부터 제조되었다. 용원성 배양균을 43℃로 데운 다음 20분간 배양시켜 cI 억제자를 불활성화시켰다. 온도를 37℃로 감소시키고 60 내지 70분 후에 세균세포가 용해되면 1-2 ×1010PFU/ml의 파아지가 형성되었다.
파아지-감염 세포를 14시간 동안 배양한 후, 배양배지로부터 원심분리에 의해 세포파편을 제거했다. haFGF134 아미노산 형태를 함유한 배양배지를 헤파린 세파로스 컬럼에 적용시켜 순수한 인간 aFGF134 아미노산 형태를 얻었다.
실시예 3
파아지-의존법에 의한 인간 aFGF140 아미노산 형태의 생성
이쉐리키아 콜라이 BL21(DE3) 배양균(NOVAGEN)을 인간 aFGF140 아미노산 형태(도 8; 서열번호: 6)를 암호화하는 화학적으로 합성된 유전자의 복사본을 하나 함유하고 있는 플라스미드 pET24-140@rev(도 7)로 형질전환시켰다. 상응하는 단백질은 서열번호 7로 도시되어 있다. BL21(DE3) 배양균은 세균 게놈에서 유도성 lac UV5 프로모터의 통제하에 T7 RNA 폴리머라제 유전자의 단일 복사본을 함유하고 있다(Studier et al. (1986) J.Mol.Biol. 189:113-130). T7 프로모터의 통제하에 플라스미드 pET-24a(+)(NOVAGEN) 안으로 인간 aFGF140 아미노산 형태 유전자를 삽입했다. 인간 aFGF140 아미노산 형태 유전자는 IPTG에 의한 lac UV5 프로모터의 유도를 통해 매개되는 세포에서 T7 폴리머라제의 출현후에 발현을 개시한다.
pET24-140@rev를 가진 이.콜라이 BL21(DE3) 배양균을 카나마이신 50㎍/ml를 함유하고 있는 37℃의 LB 배지에서 교반해가며 2 ×108세포/ml의 밀도로 성장시켰다. 이후, 세포를 약 10개의 파아지체/세균 세포의 중복도로 파아지 λcI857Qam117Ram54로 감염시키고 21℃에서 교반해가며 약 14시간 동안 배양시켰다. 파아지와 동시에 IPTG 1 mM을 배지에 첨가했다.
파아지 λcI857Qam117Ram54는 30℃의 LB 배지에서 강한 호기성 조건하에 대략 1 ×108세포/ml의 밀도로 성장된 용원성 이.콜라이 RLMI 배양균으로부터 제조되었다. 용원성 배양균을 43℃로 데운 다음 20분간 배양시켜 cI 억제자를 불활성화시켰다. 온도를 37℃로 감소시키고 60 내지 70분 후에 세균세포가 용해되면 1-2 ×1010PFU/ml의 파아지가 형성되었다.
파아지-감염 세포를 14시간 동안 배양한 후, 배양배지로부터 원심분리에 의해 세포파편을 제거했다. haFGF140 아미노산 형태를 함유한 배양배지를 헤파린 세파로스 컬럼에 적용시켜 순수한 인간 aFGF140 아미노산 형태를 얻었다.
상술된 방법에 따라 생성된 인간 aFGF140은 병아리 막분석에 기초한 생물학적 활성을 가졌다(실시예 6).
실시예 4
파아지-의존법에 의한 인간 aFGF146 아미노산 형태의 생성
이쉐리키아 콜라이 BL21(DE3) 배양균(NOVAGEN)을 인간 aFGF146 아미노산 형태를 암호화하는 화학적으로 합성된 유전자의 복사본을 하나 함유하고 있는 플라스미드 pET24-140@rev로 형질전환시켰다. BL21(DE3) 배양균은 세균 게놈에서 유도성 lac UV5 프로모터의 통제하에 T7 RNA 폴리머라제 유전자의 단일 복사본을 함유하고 있다(Studier et al. (1986) J.Mol.Biol. 189:113-130). T7 프로모터의 통제하에 플라스미드 pET-24a(+)(NOVAGEN) 안으로 인간 aFGF146 아미노산 형태 유전자를 삽입했다. 인간 aFGF146 아미노산 형태 유전자는 IPTG에 의한 lac UV5 프로모터의 유도를 통해 매개되는 세포에서 T7 폴리머라제의 출현후에 발현을 개시한다.
pET24-146@rev를 가진 이.콜라이 BL21(DE3) 배양균을 카나마이신 50㎍/ml를 함유하고 있는 37℃의 LB 배지에서 교반해가며 2 ×108세포/ml의 밀도로 성장시켰다. 이후, 세포를 약 10개의 파아지체/세균 세포의 중복도로 파아지 λcI857Qam117Ram54로 감염시키고 21℃에서 교반해가며 약 14시간 동안 배양시켰다. 파아지와 동시에 IPTG 1mM을 배지에 첨가했다.
파아지 λcI857Qam117Ram54는 30℃의 LB 배지에서 강한 호기성 조건하에 대략 1 ×108세포/ml의 밀도로 성장된 용원성 이.콜라이 RLMI 배양균으로부터 제조되었다. 용원성 배양균을 43℃로 데운 다음 20분간 배양시켜 cI 억제자를 불활성화시켰다. 온도를 37℃로 감소시키고 60 내지 70분 후에 세균 세포가 용해되면 1-2 ×1010PFU/ml의 파아지가 형성되었다.
파아지-감염 세포를 14시간 동안 배양한 후, 배양배지로부터 원심분리에 의해 세포파편을 제거했다. haFGF146 아미노산 단백질을 함유한 배양배지를 헤파린 세파로스 컬럼에 적용시켜 순수한 인간 aFGF146 아미노산 형태를 얻었다.
상술된 방법에 따라 생성된 인간 aFGF146은 병아리 막분석에 기초한 생물학적 활성을 가졌다(실시예 6).
실시예 5
haFGF의 정제
haFGF를 함유한 배양배지를 pH 7.0의 0.04M KH2PO4완충액 일 용적으로 희석하고 pH 7.0의 0.02 M KH2PO4로 평형화된 헤파린-세파로스 컬럼에 적용했다. 유동율을 80 ml/시간으로 조절한다. haFGF 단백질을 함유한 배양배지를 적용한 후, 컬럼을 pH 7.0의 0.02M KH2PO4완충액으로 세척한다. 이후, 컬럼을 pH 7.3의 0.6M NaCl을 함유한 0.02M KH2PO4완충액으로 세척한다. pH 7.5의 1.5M NaCl을 함유한 0.02M KH2PO4완충액을 이용하여 용출을 수행한다. 모든 단계를 4℃에서 수행한다.
실시예 6
파아지-의존법에 의해 생성된 재조합 단백질의 겔 분석
인간 aFGF134 아미노산 형태, 인간 aFGF140 아미노산 형태, 및 인간 aFGF154 아미노산 형태를 함유한 배양배지를 변성 조건하에 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 의해 분석한 다음 쿠마시 블루로 염색했다. 도 9에서 인간 aFGF134 아미노산 형태, 인간 aFGF140 아미노산 형태, 및 인간 aFGF146 아미노산 형태를 함유한 배양배지의 전기영동사진을 표준 분자량과 비교했다. 레인 2는 인간 aFGF134 아미노산 형태를 함유한 30㎕의 배양배지를 나타낸다. 레인 3은 재조합 FGF140 단백질을 함유한 30㎕의 배양배지를 나타낸다. 레인 5는 재조합 FGF154 단백질을 함유한 30㎕의 배양배지를 나타낸다. 레인 1은 각각의 표준 분자량 2㎍을 나타낸다(Amersham Pharmacia Biotech). 위쪽에서부터 표준 분자량은 94,000; 67,000; 43,000; 30,000; 20,100 및 14,400이다.
밀도 영상 마스터 VDS(Pharmacia Biotech)를 이용하여 폴리아크릴아마이드 겔상에서 염색된 단백질 밴드를 스캐닝하여 혼합물내의 인간 aFGF134 아미노산 형태, 인간 aFGF140 아미노산 형태, 및 인간 aFGF154 아미노산 형태를 정량했다. 파아지-감염 배양균에서 재조합 단백질의 생산량은 총 세포 단백질의 약 20%였다.
정제된 재조합 인간 aFGF134, haFGF140, haFGF146 및 haFGF154 단백질을 함유한 전기영동사진을 표준 분자량과 비교했다(도 10). 레인 2는 5㎍의 정제된 aFGF134 단백질을 나타낸다. 레인 3는 5㎍의 정제된 인간 aFGF140을 나타낸다. 레인 4는 5㎍의 정제된 인간 aFGF146 아미노산 형태를 나타낸다. 파아지-감염 배양균에서 인간 aFGF146 아미노산 형태의 생산량은 총 세포 단백질의 약 20%였다. 레인 6은 5㎍의 haFGF154 단백질을 나타낸다. 레인 1과 8은 각각 2㎍의 표준 분자량을 나타낸다(Amersham Pharmacia Biotech).
실시예 7
병아리 배아 장뇨막(CAM)에서 신혈관 형성에 대한 FGF의 작용 연구방법
병아리 배아 모델에서 맥관형성을 연구하는 방법(Thomas et al. (1985) Proc.Natl.Acad.Sci, USA 82:6409-6413)을 이용하여 맥관형성에 미치는 haFGF154, 146 및 140 재조합 단백질의 작용을 순수한 뇌-유래 산성 섬유아세포 성장인자와 비교해가며 측정했다. 순수한 뇌-유래 산성 섬유아세포 성장인자는 인터루킨과 서열 상동성을 가진 강력한 맥관형성 혈관 내피세포 유사분열물질이다.
3일간 자란 병아리 배아 껍질을 에틸 알콜로 멸균처리했다. 껍질과 껍질 안쪽 커버를 핀셋을 이용하여 공기실로부터 제거하고 알을 플라스틱 35mm 페트리 디쉬 바닥으로 덮었다. 배아를 37℃에서 5 내지 6일간 배양했다. 이 기간의 마지막 무렵에, 배아를 조사하고 충분히 성장된 CAM 혈관을 가진 알을 실험용으로 선택했다.
FGF를 함유한 용착 겔을 가진 여과지 디스크를 혈관으로 향하는 겔을 가진 알 CAM상에 놓고 자동 온도조절장치에서 37℃에서 3일간 또다시 배양했다. 겔은 하기의 방식으로 제조되었다: 시험량의 FGF를 30㎕의 이글 배지(용액 1)에 이어 30㎕의 이글 배지에 용해시키고, 헤파린 10 ㎍을 용해시킨 다음 2% 아가로스를 첨가했다(용액 2). 동일 분량의 용액 1과 2를 혼합하고 얻어진 혼합물 중 60㎕ 분취량을 12 mm 직경의 여과지 디스크상에 용착시켰다.
4일째에 여과지 디스크를 제거했다. 약 1ml 이하의 양의 CAM 하부에 농우유(10% 유지방)를 주입했다. 백색 바탕이 얻어졌으며 CAM 혈관이 쉽게 관찰되었다.
실험 결과를 컴퓨터와 비디오 카메라로 기록했다. FGF 작용하에 CAM 신혈관 형성을 하기 파라미터로 평가했다: 혈관 성장의 특성과 방향, 이의 양과 질(대, 중, 소), 문합의 존재 또는 부재 등. 이들 데이터를 FGF에 노출되지 않은 대조 샘플과 비교했다. 도 11은 본원에 기재된 파아지-의존 재조합 방식에 의해 생성된 다음 헤파린 세파로스상에서 정제된 FGF154로 처리한 후 14일째에 병아리 배아 혈관을 도시하고 있다.
도 11a는 재조합 FGF154 단백질의 적용과 신혈관 형성 사이의 상관관계를 설명해주고 있다. 1㎍의 FGF154를 적용한지 4일째에, 혈관은 대부분 작고 방사상 성장을 보여주고 있다(도 11a). FGF154의 양을 3㎍까지 증가시키면 이에 상응하여 혈관 크기가 증가된다(미도시). 방사상 성장에서는 중간 크기의 혈관이 관찰된다. FGF154의 적용량을 4㎍까지 추가로 증가시키면(미도시) 적용 후 4일째에 대, 중 및 소 크기의 혈관이 생성된다. 미처리 대조구는 도 11b에 도시되어있다.
당업계의 숙련인은 본 발명의 취지에서 벗어남이 없이 다수의 다양한 수정을행할 수 있다. 따라서, 상술된 본 발명의 형태들은 단지 설명을 위한 것이며 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아님을 분명히 이해할 필요가 있다.
Claims (22)
- 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있으면서 생물학적으로 활성인 인간 산성 섬유아세포 성장인자 단백질을 암호화하는 발현성 유전자의 복사본을 하나 이상 가지고 있는 플라스미드로 이. 콜라이 균주를 형질전환시키고;형질전환된 세균 숙주세포를 지연용균을 매개할 수 있는 박테리오파아지 λ로 감염시킨 다음;상기 단백질을 원하는 수준으로 생성할 때까지 이.콜라이 숙주 세포의 용균 성장을 용균없이 유도하는 배양 조건하에 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하며,상기 단백질을 생물학적으로 활성인 가용성 인간 산성 섬유아세포 성장인자 단백질 형태로 생성하는 것을 특징으로 하는 생물학적으로 활성인 인간 산성 섬유아세포 성장인자 단백질의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 박테리오파아지 λ가 온도-민감성 돌연변이를 갖는 방법.
- 제2항에 있어서, 온도-민감성 돌연변이가 cI857인 방법.
- 제2항에 있어서, 배양단계 이전에, 이.콜라이 숙주 세포를 박테리오파아지 λ의 용균 성장을 억제하는 온도에서 성장시키는 방법.
- 제1항에 있어서, 박테리오파아지 λ가 지연용균을 매개할 수 있는 하나 이상의 유전자에 돌연변이를 갖는 방법.
- 제5항에 있어서, 지연용균을 매개할 수 있는 하나 이상의 유전자가 N, Q 및 R로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
- 제1항에 있어서, 이.콜라이 균주가 앰버 돌연변이를 회복시키는 억제자를 생성하는 방법.
- 제1항에 있어서, 이.콜라이 균주에 앰버 돌연변이를 회복시키는 억제자가 결여되어 있는 방법.
- 제1항에 있어서, 박테리오파아지 λ를 약 1 내지 약 100의 감염 중복도로 감염시키는 방법.
- 제1항에 있어서, 박테리오파아지 λ를 약 10 내지 약 25의 감염 중복도로 감염시키는 방법.
- 제1항에 있어서, 이.콜라이 균주의 박테리오파아지-매개 지연용균을 낮은 감염 중복도에 비해 높은 감염 중복도로 지연시키는 방법.
- 제1항에 있어서, 생물학적으로 활성인 인간 산성 섬유아세포 성장인자 단백질이 154개의 아미노산을 함유하는 방법.
- 제12항에 있어서, 인간 산성 섬유아세포 성장인자 단백질이 서열번호 8의 서열을 가지는 방법.
- 제1항에 있어서, 프로모터가 T7 폴리머라제 프로모터이고 이.콜라이 균주가 T7 RNA 폴리머라제 유전자를 발현시킬 수 있는 방법.
- 제14항에 있어서, T7 RNA 폴리머라제 유전자가 유도성 프로모터의 통제하에 놓이는 방법.
- 제15항에 있어서, 유도성 프로모터가 lac UV5 프로모터인 방법.
- 제1항에 있어서, 생물학적으로 활성인 인간 산성 섬유아세포 성장인자 단백질이 146개의 아미노산을 함유하는 방법.
- 제1항에 있어서, 생물학적으로 활성인 인간 산성 섬유아세포 성장인자 단백질이 140개의 아미노산을 함유하는 방법.
- 제1항에 있어서, 생물학적으로 활성인 인간 산성 섬유아세포 성장인자 단백질이 134개의 아미노산을 함유하는 방법.
- 서열번호 1의 서열을 가진 화학적으로 합성된 핵산.
- a) 온도-민감성 돌연변이를 가진 박테리오파아지 λ균주를 함유한 제1 이.콜라이 세포 균주를 성장시키고,b) 온도를 조절하여 제1 이.콜라이 세포 균주를 용해시켜 박테리오파아지 λ를 방출시킨 다음,c) 유도성 프로머터의 통제하에 T7 폴리머라제 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있으면서 생물학적으로 활성인 인간 산성 섬유아세포 성장인자 단백질을 암호화하는 발현성 유전자의 복사본을 하나 이상 가지고 있는 플라스미드로 형질전환된 제2 이.콜라이 세포 균주를 유도자를 첨가하여 유도시켜 T7 RNA 폴리머라제 유전자를 발현시키고;d) 제2 이.콜라이 세포균주를 상기 제1 이.콜라이 세포균주로부터 방출된 박테리오파아지 λ로 감염시킨 다음;e) 감염된 제2 이.콜라이 세포균주를 유도자를 함유한 배양배지에서 배양하여 제2 이.콜라이 세포균주의 용해시 생성된 단백질을 배양배지 안으로 방출시키는단계를 포함하는 생물학적으로 활성인 인간 산성 섬유아세포 성장인자 단백질의 제조방법에 있어서, 상기 단백질을 100 ㎍/ml 이상의 농도로 생물학적으로 활성인 가용성 단백질 형태로 생성하는 방법.
- 서열번호 8의 서열을 가진 인간 산성 섬유아세포 성장인자 단백질.
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