JP2003189865A - 繊維芽細胞成長因子をコードする組み換えベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 組み換え繊維芽細胞成長因子を大量に効率よ
く発現できる手段を提供すること。 【解決手段】 ヒト塩基性繊維芽細胞成長因子のＮ末端
に少なくとも１個以上のアミノ酸を付加した融合蛋白質
をコードする遺伝子を含有する組換えベクターを構築し
た。形質転換した大腸菌による組み換え繊維芽細胞成長
因子の発現量は、該融合蛋白質の形態の方がそのままの
形態で発現させるよりも有意に増大することを明らかに
した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、繊維芽細胞成長因
子をコードする組み換えベクター、並びにそれを用いた
繊維芽細胞成長因子の製造方法に関する。より詳細に
は、本発明は、塩基性繊維芽細胞成長因子をコードする
遺伝子の上流に少なくとも１個以上のアミノ酸をコード
する塩基配列を付加した核酸配列を含有する組み換えベ
クター、並びにそれを用いた繊維芽細胞成長因子の製造
方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】繊維芽細胞成長因子(ＦＧＦ)はペプチド
性細胞成長因子の一種であり、等電点が塩基性であるｂ
ＦＧＦと酸性であるａＦＧＦの２種類があり、これらの
全アミノ酸配列は明らかにされている［F. Eschら：Pro
c. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ８５：6507（1985）および
K.A.Thomasら：Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ８２：6
409 (1985)］。ＦＧＦは、in vitro では３Ｔ３細胞や
血管内皮細胞を含む中胚葉由来細胞に対して増殖促進作
用を示し、またin viro では血管新生作用を示すことが
知られている［D．Gospodarowiczら：Endocrine Review
s ８：95(1987)］。

【０００３】ＦＧＦは、その血管新生作用を利用するこ
とにより、損傷，火傷の治療薬，血栓症，動脈硬化症、
心筋梗塞などの治療・予防薬として用いることができ
る。さらに、ヒト塩基性FGFが、ラット胎児の海馬体神
経細胞における神経細胞の生存および神経突起の伸長を
増大させることも見出されている（Walicke, P., et a
l, Proc Natl Acad Sci (USA) (1986) 83：3012-301
6）。従って、ヒト塩基性FGFは、アルツハイマー病およ
びパーキンソン病のような退化神経学的疾病の予防及び
治療にも有用である。

【０００４】天然に存在するＦＧＦは微量であるため、
これを精製して取得することは困難であった。また、遺
伝子組換え技術を用いた製造法が開発されている。遺伝
子組換え技術を用いたbＦＧＦ及びaＦＧＦの製造につい
ては、Biochem. Biophys. Res. Commun. １４６：470(1
987), Biotechnology ５：960(1987), The Journal of
BiologicalChemistry ２６３：16471（1988）, The Jou
rnal of Biological Chemistry ２６３：18452(1988),
The Journal of Biological Chemistry ２６３：16297
(1988)などに記載されている。しかしながら、天然型Ｆ
ＧＦの発現量は少ないため、多量の組み換え繊維芽細胞
成長因子を取得するためには、形質転換体である細菌ま
たは細胞を大量に培養する必要があった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した従
来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とし
た。即ち、本発明は、組み換え繊維芽細胞成長因子を大
量に効率よく発現できる手段を提供することを解決すべ
き課題とした。本発明はまた、組み換え繊維芽細胞成長
因子を純粋に汚染されていない形態で取得できる手段を
提供することを解決すべき課題とした。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意検討し、先ず、ヒト塩基性繊維芽
細胞成長因子のＮ末端に少なくとも１個以上のアミノ酸
を付加した融合タンパク質をコードする遺伝子を含有す
る組み換えベクターを構築し、大腸菌に形質転換し、当
該融合タンパク質の発現量を検討した。その結果、上記
したような融合タンパク質の形態で発現させた場合の方
が、そのままの形態で発現させた場合よりも発現量が有
意に増大することが判明した。本発明はこれらの知見に
基づいて完成したものである。

【０００７】即ち、本発明によれば、塩基性繊維芽細胞
成長因子をコードする遺伝子の上流に少なくとも１個以
上のアミノ酸をコードする塩基配列を付加した核酸配列
を含有する組み換えベクターが提供される。好ましく
は、本発明のベクターは、発現ベクターである。好まし
くは、本発明のベクターは、塩基性繊維芽細胞成長因子
をコードする遺伝子の上流に１から２０個のアミノ酸を
コードする塩基配列を付加した核酸配列を含有する。好
ましくは、本発明のベクターは、塩基性繊維芽細胞成長
因子をコードする遺伝子の上流に１〜６個のヒスチジン
を付加した核酸配列を含有する。好ましくは、塩基性繊
維芽細胞成長因子はヒト塩基性繊維芽細胞成長因子であ
る。

【０００８】本発明の別の側面によれば、上記した本発
明の組み換えベクターで形質転換した大腸菌株が提供さ
れる。本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発
明の大腸菌株を培地で培養し、発現した組み換えタンパ
ク質を回収することを含む、塩基性繊維芽細胞成長因子
の製造方法が提供される。本発明のさらに別の側面によ
れば、上記した製造方法により得られる、塩基性繊維芽
細胞成長因子のＮ末端に少なくとも１個以上のアミノ酸
を付加した組み換えタンパク質が提供される。本発明の
さらに別の側面によれば、上記した本発明の組み換えベ
クターを用いてin vitro translation法により組み換え
タンパク質を発現させることを含む、塩基性繊維芽細胞
成長因子の製造方法が提供される。本発明のさらに別の
側面によれば、上記した製造方法により得られる、塩基
性繊維芽細胞成長因子のＮ末端に少なくとも１個以上の
アミノ酸を付加した組み換えタンパク質が提供される。

【０００９】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施態様及び実施
方法について詳細に説明する。１．塩基性繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）をコードする
遺伝子 本発明の組み換えベクターは、塩基性繊維芽細胞成長因
子（ＦＧＦ）のＮ末端に少なくとも１個以上のアミノ酸
を付加した融合タンパク質をコードする遺伝子を含有す
るものである。先ず、本発明で用いる塩基性繊維芽細胞
成長因子をコードする遺伝子について説明する。

【００１０】本発明ではヒト、ウシ、ラットなど任意の
哺乳動物由来の塩基性繊維芽細胞成長因子をコードする
遺伝子を使用することができる。これらの塩基性繊維芽
細胞成長因子のアミノ酸配列は、特開平５−７６３５６
号公報、特開平１１−１０３８７６号公報、及びこれら
公報に引用された文献に記載されている。塩基性繊維芽
細胞成長因子は、一般に１４６個のアミノ酸を含むが、
１３１個のアミノ酸から成る短い塩基性繊維芽細胞成長
因子も存在し、さらに上流まで伸長した型も存在する。
これらのＦＧＦは、多数の塩基性アミノ酸残基（リジ
ン、アルギニン、ヒスチジン）を含み、中性ｐＨ下で陽
イオン性を示すので、塩基性ＦＧＦと呼ばれる。

【００１１】本発明では、ヒトの塩基性繊維芽細胞成長
因子をコードする遺伝子を使用することが特に好まし
い。ヒトの塩基性繊維芽細胞成長因子の塩基配列とアミ
ノ酸配列を配列表の配列番号１及び２に記載する。

【００１２】本発明では、天然型の塩基性ＦＧＦのみな
らず、これに変異を加えた改変体の塩基性ＦＧＦをコー
ドする遺伝子を使用することもできる。即ち、天然型塩
基性ＦＧＦの生物学的活性が実質的に保持される限り、
１以上のアミノ酸残基を欠失、置換、挿入及び／又は付
加させることにより得られる改変体の塩基性ＦＧＦをコ
ードする遺伝子を使用してもよい。なお、天然型塩基性
ＦＧＦの生物学的活性の一例としては、ウシの脳および
副腎皮質由来の毛細血管内皮細胞、ヒトの臍静脈内皮細
胞、ウシの副腎皮質ステロイド産生細胞、顆粒膜細胞お
よび脈管平滑筋細胞などの培養細胞を用いたインビトロ
分析において有糸分裂活性を示すことが挙げられる。こ
れらの細胞培養を用いるインビトロ分析は、Gospodarow
icz，D.,ら、J Cell Physiol(1985) 122：323-332；お
よび Gospodarowicz，D.ら、J Cell Biol (1983)97：16
77-1685に記載されている。従って、これらインビトロ
分析を利用することにより、天然型塩基性ＦＧＦの生物
学的活性が実質的に保持されている改変体の塩基性ＦＧ
Ｆを調製することができる。

【００１３】２．本発明の組み換えベクター 本発明においては、塩基性繊維芽細胞成長因子をコード
する遺伝子の上流に少なくとも１個以上のアミノ酸をコ
ードするＤＮＡ配列が付加されている。付加するアミノ
酸の数は１個以上であり、タンパク質の発現量に有意な
悪影響を与えない限り、上限は特には限定されない。好
ましくは、付加するアミノ酸の数は１〜２０個であり、
より好ましくは１〜１５個であり、さらに好ましくは１
〜１０個であり、最も好ましくは１〜６個である。

【００１４】付加するアミノ酸の種類は特に限定され
ず、タンパク質の発現量に有意な悪影響を与えない限
り、任意のアミノ酸（即ち、天然の２０種のアミノ酸で
ある、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロ
イシン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタ
ミン酸、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニ
ン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、チロ
シン、トリプトファン、ヒスチジン、又はプロリン）を
選択することができる。また、２以上のアミノ酸を付加
する場合、全て同一のアミノ酸を付加してもよいし、異
なる種類のアミノ酸を付加してもよい。本発明の好まし
い態様によれば、１〜６個のヒスチジンを付加すること
ができる。

【００１５】塩基性繊維芽細胞成長因子をコードする遺
伝子の上流に少なくとも１個以上のアミノ酸をコードす
る塩基配列を付加した核酸配列は、当業者に公知の方法
で取得することができる。例えば、塩基性繊維芽細胞増
殖因子をコードする遺伝子を適当なクローニングベクタ
ー（例えば、pBluescriptIISK-など）の適当な制限酵素
部位にサブクローニングする。次いで、得られたベクタ
ーに対して、付加するアミノ酸をコードする塩基配列を
有するアッパープライマー、およびローワープライマー
を用いて、ＰＣＲ反応を行うことにより、塩基性繊維芽
細胞成長因子をコードする遺伝子の上流に少なくとも１
個以上のアミノ酸をコードする塩基配列を付加した核酸
配列を含む核酸断片を取得することができる。あるい
は、塩基性繊維芽細胞増殖因子をコードする遺伝子と、
それに付加するアミノ酸をコードする塩基配列とを別個
に調製し、ＤＮＡリガーゼなどを用いて連結してもよ
い。

【００１６】上記にように取得した核酸配列を所望のベ
クター中にクローニングすることにより、本発明の組み
換えベクターを構築することができる。本発明で用いる
ベクターの種類は特に限定されず、クローニングベクタ
ーでも発現ベクターでもよいが、好ましくは、発現ベク
ターであり、特に好ましくは大腸菌で発現可能な発現ベ
クターである。

【００１７】本発明で好ましく用いることができるベク
ターとしては、宿主（好ましくは、大腸菌）に適合した
複製開始起点、選択可能なマーカーおよび発現制御配列
を含むプラスミドベクターが挙げられる。選択可能なマ
ーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイ
クリン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子などが挙げ
られる。

【００１８】発現制御配列とは、DNA配列に適切に連結
した場合、このような配列に適合した宿主において、そ
のＤＮＡ配列を発現させることができる配列を意味す
る。発現制御配列には、少なくともブロモーターが含ま
れる。例えば、大腸菌を宿主とする場合には、リボソー
ム結合部位配列、所望により存在するオペレーター、及
び転写開始のためのプロモーターを発現制御配列として
含むベクターを使用することができる。プロモーターと
しては、ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクト
ース（lac）プロモータ系、トリプトファン（trp）プロ
モーター系、ラムダ由来のＰ_Lプロモーター、およびＮ
遺伝子リボソーム結合部位、ならびにtrp-lac(trc)プロ
モーター系、Ｔ７プロモーターなどの当分野で常用され
るプロモーターを使用することができる。

【００１９】本発明の組み換えベクターにおいては、上
記した発現制御配列は、塩基性繊維芽細胞成長因子をコ
ードする遺伝子の上流に少なくとも１個以上のアミノ酸
をコードする塩基配列を付加した核酸配列に作動可能な
状態で連結することにより、該核酸配列によりコードさ
れるアミノ酸配列を発現させることができる。

【００２０】本発明では、市販のベクターを使用するこ
ともでき、具体例としては、例えば、大腸菌用としてpQ
E70、pQE60、pQE-9（Qiagen）、pBS、phagescript、psi
X174、pBluescript SK、pBsKS、pNH8a、pNH16a、pNH18
a、pNH46a（Stratagene）、pTRC99A、pKK223-3、pKK233
-3、pDR540、pRIT5（Pharmacia）、pET（NOVAGEN）、pI
VEX（Roche）などが挙げられる。

【００２１】３．本発明の組み換えベクターで形質転換
した大腸菌株 本発明はさらに、上記した組み換えベクターで形質転換
した大腸菌株にも関する。宿主として用いる大腸菌の種
類は、組み換えベクター中に挿入した核酸配列を発現で
きるものであれば特に限定されず、MC1061、DH1、DH
５、RR1、B、C600hf1、K803、HB101、JA221、JM101、JM
109、BL21などのE.coli株を用いることができる。形質
転換は、当業者に公知の方法に従い行なうことができ、
リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE−デキス
トラン仲介トランスフェクション、又はエレクトロポレ
ーション等によって行なうことができる。

【００２２】４．塩基性繊維芽細胞成長因子の製造方法 本発明はさらに、上記の形質転換した大腸菌株を培地で
培養し、発現した組み換えタンパク質を回収することを
含む、塩基性繊維芽細胞成長因子の製造方法にも関す
る。本発明は、本発明の組み換えベクターを用いてin v
itro translation法により組み換えタンパク質を発現さ
せることを含む、塩基性繊維芽細胞成長因子の製造方法
にも関する。in vitro translation法は、大腸菌の抽出
物などを用いて行なうことができ、例えば、S30ライセ
ートなどロッシュ社、プロメガ社又は東洋紡などから市
販されているキットを使用して行うことができる。本発
明では、大腸菌の形質転換株を適当な条件下で培養する
ことにより、Ｎ末端に少なくとも１個以上のアミノ酸を
付加した塩基性繊維芽細胞成長因子を発現させることが
できる。

【００２３】本発明の形質転換体である大腸菌を培養す
る培地は、該微生物が資化し得る炭素源（例えば、グル
コース、フラクトース、スクロース、これらを含有する
糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化
物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロ
パノールなどのアルコール類が）、窒素源（例えば、ア
ンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸
アンモニウム、リン酸アンモニウム、等の各種無機酸や
有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並び
に、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープ
リカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水
分解物、各種発酵菌体およびその消化物等）、無機塩類
（リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マ
グネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸
第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等）等
を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であ
れば天然培地、合成培地のいずれでもよい。

【００２４】培養は、振盪培養または深部通気撹拌培養
などの好気的条件下で行うことが好ましい。培養温度は
15〜40℃がよく、培養時間は、通常16時間〜7日間であ
る。培養中pHは、3.0〜9.0に保持する。pHの調整は、無
機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシ
ウム、アンモニアなどを用いて行う。また培養中必要に
応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質
を培地に添加してもよい。

【００２５】プロモーターとして誘導性のプロモーター
を用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する
ときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加し
てもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベク
ターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロ
ピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)等を、trp
プロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生
物を培養するときにはインドールアクリル酸(IAA)等を
培地に添加してもよい。

【００２６】本発明の形質転換体の培養物から、本発明
のタンパク質（Ｎ末端に少なくとも１個以上のアミノ酸
を付加した塩基性繊維芽細胞成長因子）を単離精製する
には、通常のタンパク質の単離、精製法を用いればよ
い。

【００２７】典型的には、細胞を遠心分離によって収集
し、物理的又は化学的手段によって破壊し、得られた粗
抽出物をさらなる精製のために確保する。本発明のポリ
ペプチドは、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸
抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、
ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水相互作用ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレク
チンクロマトグラフィーを含む従来の方法によって、組
換え細胞培養から回収、精製できる。最終的な精製段階
として、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）を使用
することができる。

【００２８】５．本発明の組み換えベクターを用いて得
られる塩基性繊維芽細胞成長因子 本発明はさらに、本発明の組み換えベクターを発現させ
ることにより得られる、Ｎ末端に少なくとも１個以上の
アミノ酸を付加した塩基性繊維芽細胞成長因子にも関す
る。本発明の塩基性繊維芽細胞成長因子は、血管内皮細
胞の成長を促進することができるので、種々の疾患状態
（例えば血栓症、動脈硬化、その他の心血管病）による
虚血組識の再血管化を刺激するための処置に使用でき
る。本発明の塩基性繊維芽細胞成長因子は、血管形成と
四肢再生の刺激にも使用できる。本発明の塩基性繊維芽
細胞成長因子は、けが、火傷、手術後の組識修復及び潰
瘍による創傷の処置にも使用できる。本発明の塩基性繊
維芽細胞成長因子は、ニューロン成長の刺激や、ある種
のニューロン障害又は神経変性病（アルツハイマー病、
パーキンソン病及びAIDS関連合併症など）で起こるニュ
ーロン損傷の治療及び予防にも使用できる。また、本発
明の塩基性繊維芽細胞成長因子は、細胞培養を促進させ
るための試薬として用いることができる。

【００２９】本発明の塩基性繊維芽細胞成長因子を医薬
として用いるには、そのまま粉末として、または他の薬
理学的に許容されうる担体,賦形剤,希釈剤とともに医薬
組成物 (例えば、注射剤,錠剤,カプセル剤,液剤,軟膏)
として、哺乳温血動物(例、ヒト,マウス,ラット,ハムス
ター,ウサギ,犬,ネコ)に対して非経口的または経口的に
投与することができる。注射剤の製剤化はたとえば生理
食塩水またはブドウ糖やその他の補助薬を含む水溶液を
用い、常法に従って行なわれる。錠剤,カプセル剤等の
医薬組成物も常法に従って調製しうる。

【００３０】本発明の塩基性繊維芽細胞成長因子を上記
した医薬として用いる場合には、例えば、上記した温血
動物に、投与ルート,症状などを考慮して、１日量約１n
g／kgから１００μg／kgの範囲内で適宜選択される。以
下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、以
下の実施例は本発明を例示するためのものであり、本発
明の範囲を限定するものではない。

【００３１】

【実施例】実施例１：組み換えヒト塩基性繊維芽細胞増
殖因子（ｂＦＧＦ）を発現するベクターの構築 ヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）の翻訳領域
（ＯＲＦ）（配列番号１）をpBluescriptIISK-のマルチ
クローニングサイトのNotI、XhoIサイト間にサブクロー
ニングした。このクローニングベクターは、ｂＦＧＦの
５’側がNotIサイト側にクローニングされている。この
ベクターに対して以下のアッパープライマーおよびロー
ワープライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ産
物をNcoI、BglIで切断した。Ｔ５プロモーター、ＲＢＳ
配列の下流にNcoIおよびBglIサイトを有し、その下流に
ターミネーター配列を有する発現ベクター（具体的に
は、ｐＱＥ（キアゲン）をNcoIおよびBglIで切断したベ
クター）に、上記のＰＣＲ産物をライゲーションした。

【００３２】アッパープライマー Nco-bFGF(pET)-U GAG ATA TAC CAT GGC AGC CGG GAG CAT CAC CAC GC (35
mer)（配列番号３） Nco-bFGF(1xHis)-NU TAT ATA TAC CAT GGG ACA TAT GGC AGC CGG GAG CAT CA
C CAC GC (44mer)（配列番号４） Nco-bFGF(2xHis)-NU TAT ATA TAC CAT GGG ACA TCA TAT GGC AGC CGG GAG CA
T CAC CAC GC (47mer)（配列番号５） Nco-bFGF(3xHis)-NU TAT ATA TAC CAT GGG ACA TCA TCA TAT GGC AGC CGG GA
G CAT CAC CAC GC (50mer)（配列番号６） Nco-bFGF(4xHis)-NU TAT ATA TAC CAT GGG ACA TCA TCA TCA TAT GGC AGC CG
G GAG CAT CAC CAC GC(53mer)（配列番号７） Nco-bFGF(6xHis)-NU TAT ATA TAC CAT GGG ACA TCA TCA TCA TCA TCA TAT GG
C AGC CGG GAG CAT CAC CAC GC (59mer)（配列番号８） Nco-bFGF(MGT)-NU TAT ATA TAC CAT GGG AAC AAT GGC AGC CGG GAG CAT CA
C CAC GC (44mer)（配列番号９） Nco-bFGF(146)-U GAG ATA TAC CAT GGG GCC CGC CTT GCC CGA GGA TGG C
(37mer)（配列番号１０） ローワープライマー Bgl-bFGF(2xStop)-L GCT AGC AGA TCT TTA TCA GCT CTT AGC AGA CAT TGG AA
G (39mer)（配列番号１１）

【００３３】作成した発現ベクターは以下の８種類であ
る。ヒスチジン６個にｂＦＧＦが連結した6ｘHis-bFGF
を発現するp6HbFGF；ヒスチジン４個にｂＦＧＦが連結
した4ｘHis-bFGFを発現するp4HbFGF；ヒスチジン３個に
ｂＦＧＦが連結した3ｘHis-bFGFを発現するp3HbFGF；ヒ
スチジン２個にｂＦＧＦが連結した2ｘHis-bFGFを発現
するp2HbFGF；ヒスチジン１個にｂＦＧＦが連結した1ｘ
His-bFGFを発現するp1HbFGF；メチオニン、グリシン及
びスレオニンの配列にｂＦＧＦが連結したMGH-bFGFを発
現するpMGHbFGF；ｂＦＧＦを発現するpbFGF；及びｂＦ
ＧＦ配列の前半部１０アミノ酸を欠いたｂＦＧＦを発現
する146-bFGFを発現するp146bFGF：

【００３４】実施例２：組み換えヒトｂＦＧＦの大腸菌
での発現 実施例１で構築した発現ベクターを大腸菌コンピテント
セルＪＭ１０９（東洋紡）またはＤＨ５（東洋紡）など
の適当な宿主細胞に形質転換した。得られた形質転換細
胞は、Ａｍｐ耐性菌としてクローン化した。Ｏ．Ｄ．が
０．５〜０．６になる対数増殖期より４〜２４時間、１
ｍＭのＩＰＴＧ（アマシャムファルマシアバイオテク）
を含むＬＢ／Ａｍｐ培地で生長させた（ＩＰＴＧはｌａ
ｃオペレーターによって制御される制御配列に対する標
準の誘導物質である）。生長した細胞を氷冷下で集菌
し、Laemmli法（Nature, 227, 680 (1979)）により菌体
内のタンパク質を可溶化した。可溶化した総タンパク液
はＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（ゲル濃度：５〜
２０％）により分画後、ウエスタンブロッティング法に
よりナイロンメンブレン（HybondP+、アマシャムファル
マシアバイオテク）に転写した。得られたメンブレンに
対し、抗ｂＦＧＦ抗体（ｓｃ−７９１１、サンタクルー
ズバイオテクノロジー）およびＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギ
ＩｇＧを反応させ、化学発光法により組み換えｂＦＧＦ
を検出、ルミノイメージアナライザー（ＬＡＳ−１００
０、富士写真フイルム）によって、その発現量を定量し
た。結果を図１および表１に示す。

【００３５】

【表１】

【００３６】上記の結果より、ｂＦＧＦのＮ末端を修飾
することにより、非修飾組み換えヒトｂＦＧＦに比べ、
約３０〜３００倍の産生量の向上が見られた。

【００３７】実施例３：組み換えヒトｂＦＧＦの精製方
法 実施例２で４〜２４時間生長した細胞を氷冷下で集め、
溶菌バッファー（１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．
０）で再懸濁し、超音波処理により細胞を溶菌した。遠
心操作によって不溶画分を取り除き、上清すなわち可溶
性画分をアフィニティカラム（p6HbFGF、p4HbFGF、p3Hb
FGFはNi-キレートカラム（キアゲン）、その他はヘパリ
ン−セファロース（HiTrap Heparin、アマシャムファル
マシアバイオテク））に通して粗精製を行い、マイクロ
ＢＣＡ法（バイオラッド、米国特許第4,839,295号）に
より精製タンパク質の定量を行なった。結果を表２に示
す。

【００３８】

【表２】

【００３９】実施例４：組み換えヒトｂＦＧＦの細胞増
殖活性測定 実施例３で得られた粗精製ヒト組み換えｂＦＧＦの活性
は、正常ヒト真皮繊維芽細胞（ＨＤＦ、ニッスイ）およ
び正常ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、ニッス
イ）を用いた細胞増殖試験（ＷＳＴ−１アッセイ、和光
純薬工業、Mosmonn, T.J.Immunol.Methods, 65, 55 (19
83)）により測定した。結果を表３に示す。

【００４０】

【表３】

【００４１】

【発明の効果】本発明により、組み換え繊維芽細胞成長
因子を大量に効率よく発現することが可能になった。ま
た、本発明によれば、組み換え繊維芽細胞成長因子を純
粋に汚染されていない形態で取得することができる。

【００４２】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Fuji Photo Film Co.Ltd., <120> A recombinant vector encoding fibroblast growth factor <130> A11616MA <160> 11

【００４３】 <210> 1 <211> 478 <212> DNA <213> human <400> 1 atggcagccg ggagcatcac cacgctgccc gccttgcccg aggatggcgg cagcggcgcc 60 ttcccgcccg gccacttcaa ggaccccaag cggctgtact gcaaaaacgg gggcttcttc 120 ctgcgcatcc accccgacgg ccgagttgac ggggtccggg agaagagcga ccctcacatc 180 aagctacaac ttcaagcaga agagagagga gttgtgtcta tcaaaggagt gtgtgctaac 240 cgttacctgg ctatgaagga agatggaaga ttactggctt ctaaatgtgt tacggatgag 300 tgtttctttt ttgaacgatt ggaatctaat aactacaata cttaccggtc aaggaaatac 360 accagttggt atgtggcact gaaacgaact gggcagtata aacttggatc caaaacagga 420 cctgggcaga aagctatact ttttcttcca atgtctgcta agagctga 478

【００４４】 <210> 2 <211> 155 <212> PRT <213> human <400> 2 Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Phe Ala Leu Phe Glu Asp Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu 20 25 30 Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg 35 40 45 Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu 50 55 60 Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn 65 70 75 80 Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys 85 90 95 Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr 100 105 110 Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys 115 120 125 Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Phe Gly Gln Lys 130 135 140 Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 145 150 155

【００４５】 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 gagatatacc atggcagccg ggagcatcac cacgc 35

【００４６】 <210> 4 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 tatatatacc atgggacata tggcagccgg gagcatcacc acgc 44

【００４７】 <210> 5 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 tatatatacc atgggacatc atatggcagc cgggagcatc accacgc 47

【００４８】 <210> 6 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 tatatatacc atgggacatc atcatatggc agccgggagc atcaccacgc 50

【００４９】 <210> 7 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 tatatatacc atgggacatc atcatcatat ggcagccggg agcatcacca cgc 53

【００５０】 <210> 8 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 tatatatacc atgggacatc atcatcatca tcatatggca gccgggagca tcaccacgc 59

【００５１】 <210> 9 <211> 440 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 tatatatacc atgggaacaa tggcagccgg gagcatcacc acgc 44

【００５２】 <210> 10 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 gagatatacc atggggcccg ccttgcccga ggatggc 37

【００５３】 <210> 11 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 11 gctagcagat ctttatcagc tcttagcaga cattggaag 39

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の組み換えヒトｂＦＧＦベクタ
ーの大腸菌における発現量を定量した結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｐ 7/02 // Ａ６１Ｋ 38/22 17/02 Ａ６１Ｐ 7/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 17/02 Ａ６１Ｋ 37/24 (72)発明者 須藤 幸夫 埼玉県朝霞市泉水３−11−46 富士写真フ イルム株式会社内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA02 DA06 HA01 4B064 AG13 CA02 CA19 CC24 DA01 4B065 AA26 AB01 BA02 CA24 CA44 4C084 AA06 BA01 BA08 BA22 CA53 DB54 ZA02 ZA16 ZA40 ZA45 ZA89 4H045 AA10 AA20 BA10 BA41 CA40 DA20 EA23 EA28 FA74

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 塩基性繊維芽細胞成長因子をコードする
   遺伝子の上流に少なくとも１個以上のアミノ酸をコード
   する塩基配列を付加した核酸配列を含有する組み換えベ
   クター。
2. 【請求項２】 発現ベクターである、請求項１に記載の
   組み換えベクター。
3. 【請求項３】 塩基性繊維芽細胞成長因子をコードする
   遺伝子の上流に１から２０個のアミノ酸をコードする塩
   基配列を付加した核酸配列を含有する、請求項１または
   ２に記載の組み換えベクター。
4. 【請求項４】 塩基性繊維芽細胞成長因子をコードする
   遺伝子の上流に１〜６個のヒスチジンを付加した核酸配
   列を含有する、請求項１から３の何れかに記載の組み換
   えベクター。
5. 【請求項５】 塩基性繊維芽細胞成長因子がヒト塩基性
   繊維芽細胞成長因子である、請求項１から４の何れかに
   記載の組み換えベクター。
6. 【請求項６】 請求項１から５の何れかに記載の組み換
   えベクターで形質転換した大腸菌株。
7. 【請求項７】 請求項６に記載の大腸菌株を培地で培養
   し、発現した組み換えタンパク質を回収することを含
   む、塩基性繊維芽細胞成長因子の製造方法。
8. 【請求項８】 請求項７に記載の製造方法により得られ
   る、塩基性繊維芽細胞成長因子のＮ末端に少なくとも１
   個以上のアミノ酸を付加した組み換えタンパク質。
9. 【請求項９】 請求項１から５の何れかに記載の組み換
   えベクターを用いてin vitro translation法により組み
   換えタンパク質を発現させることを含む、塩基性繊維芽
   細胞成長因子の製造方法。
10. 【請求項１０】 請求項９に記載の製造方法により得ら
    れる、塩基性繊維芽細胞成長因子のＮ末端に少なくとも
    １個以上のアミノ酸を付加した組み換えタンパク質。